DE60206499T2

DE60206499T2 - Verfahren zur herstellung von d-pantothensäure und/oder salzen davon

Info

Publication number: DE60206499T2
Application number: DE60206499T
Authority: DE
Inventors: Thomas Hermann; Birgit Witteck; Mechthild Rieping
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-06-13
Filing date: 2002-05-23
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2022-05-24
Also published as: WO2002101065A2; US20030124681A1; AU2002345769A1; AU2002314098A1; WO2002101066A2; WO2002101062A2; DK1395661T3; WO2002101066A3; US20030109012A1; DE60206622T2; AU2002312930A1; DE60206498D1; WO2002101062A3; WO2002101055A2; WO2002101064A2; WO2002101054A3; EP1395660A2; US20030087404A1; WO2002101064A3; US20030124682A1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und deren Salzen oder diese enthaltenden Gemischen unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen wenigstens das Gen pepB überexprimiert wird.
Stand der Technik
Pantothensäure wird weltweit in einer Größenordnung von mehreren tausend Tonnen pro Jahr produziert. Sie wird unter anderem in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und in der Lebensmittelindustrie verwendet. Ein großer Teil der produzierten Pantothensäure wird für die Ernährung von Nutztieren wie Geflügel und Schweine verwendet.
Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige Vorstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt, und in weiteren Verfahrensschritten wird das racemische Gemisch separiert, das D-Pantolacton wird mit β-Alanin kondensiert und so D-Pantothensäure erhalten.
Die typische Handelsform ist das Calcium-Salz der D-Pantothensäure. Das Calcium-Salz des racemischen Gemischs der D,L-Pantothensäure ist ebenfalls gebräuchlich.
Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der gewünschten stereoisomeren Form, nämlich der D-Form, die frei von L-Pantothensäure ist.
Verschiedene Arten von Bakterien, wie z.B. Escherichia coli (E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen, wie z.B. Debaromyces castellii, können wie in der EP-A 0 493 060 gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren. Die EP-A 0 493 060 zeigt weiterhin, dass bei E. coli durch Amplifikation von Pantothensäure-Biosynthesegenen aus E. coli, die auf den Plasmiden pFV3 und pFV5 enthalten sind, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, die Bildung von D-Pantothensäure verbessert wird.
Die EP-A 0 590 857 und das US-Patent 5,518,906 beschreiben vom E. coli Stamm IFO3547 abgeleitete Mutanten, wie FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069, die Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite wie Salicylsäure, α-Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure, O-Methylthreonin und α-Ketoisovaleriansäure tragen. Sie produzieren in einer Nährlösung, die Glucose enthält, Pantoinsäure, und in einer Glucose- und β-Alanin-haltigen Nährlösung D-Pantothensäure. In der EP-A 0 590 857 und dem US-Patent 5,518,906 wird weiterhin angegeben, dass nach Amplifikation der Pantothensäure-Biosynthesegene panB, panC und panD, die auf dem Plasmid pFV31 enthalten sein sollen, in den oben genannten Stämmen die Produktion von D-Pantoinsäure in glucosehaltigen Nährlösungen und die Produktion von D-Pantothensäure in einer Nährlösung, die Glucose und β-Alanin enthält, verbessert wird.
Weiterhin wird in der WO97/10340 über die förderliche Wirkung der Verstärkung des ilvGM-Operons auf die Produktion von D-Pantothensäure berichtet. In der EP-A-1001027 wird schließlich über die Wirkung der Verstärkung des panE-Gens auf die Bildung der D-Pantothensäure berichtet.
Nach dem Stand der Technik wird die D-Pantothensäure oder das entsprechende Salz aus der Fermentationsbrühe isoliert und gereinigt (EP-A-0590857 und WO96/33283) und dementsprechend in gereinigter Form verwendet, oder die D-Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe wird insgesamt getrocknet (EP-A-1050219) und insbesondere als Futtermitteladditiv verwendet.
Suzuki H. et al. (Journal of fermentation and bioengineering, Bd. 82, Nr. 4, 1996, Seiten 392–397) offenbaren Escherichia coli Stamm SH949, der ein Peptidase B überproduzierender E. coli K12 Stamm ist, der mit dem das pepB-Gen enthaltenden Plasmid pNS42 transformiert ist.
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen und diese enthaltenden Tierfuttermitteladditiven bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Wenn im Folgenden D-Pantothensäure oder Pantothensäure oder Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freien Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure, wie z.B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz, gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits D-Pantothensäure produzieren und in denen wenigstens eine das pepB-Gen kodierende, bevorzugt endogene Nucleotidsequenz überexprimiert wird.
Unter „endogenen Genen" oder „endogenen Nucleotidsequenzen" versteht man die in der Population einer Spezies vorhandenen Gene oder Nucleotidsequenzen.
Insbesondere handelt es sich um ein Verfahren, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

a) Fermentation von D-Pantothensäure produzierenden Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen wenigstens das pepB-Gen überexprimiert wird; das die Peptidase B kodierende Gen und gegebenenfalls Allele dieses Gens werden unter für die Bildung des Genprodukts geeigneten Bedingungen überexprimiert; gegebenenfalls werden gleichzeitig weitere Gene des Pantothensäure-Biosyntheseweges abgeschwächt oder überexprimiert, um die Produktion der Pantothensäure zu erhöhen;
b) die Fermentation erfolgt gegebenenfalls in Gegenwart von Erdalkalimetallverbindungen, wobei diese in vorzugsweise stöchiometrischen Mengen kontinuierlich oder diskontinuierlich der Fermentationsbrühe hinzugefügt werden;
c) Konzentration der D-Pantothensäure bzw. des entsprechenden Salzes im Medium oder der Fermentationsbrühe oder gegebenenfalls in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae; und
d) nach Abschluss der Fermentation Isolierung der D-Pantothensäure und/oder (der) des entsprechenden Salze(s).

Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren, bei dem nach Abschluss der Fermentation die Biomasse teilweise oder insgesamt (≥ 0 bis 100%) in der Fermentationsbrühe verbleibt, und die so erhaltene Brühe gegebenenfalls nach dem Konzentrieren zu einem festen D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Gemisch, das bevorzugt weitere Bestandteile aus der Fermentationsbrühe enthält, verarbeitet wird.
Bei diesen weiteren Bestandteilen handelt es sich vor allem um die gelösten Verbindungen, die aus dem Zufütterungsmedium stammen, und entstandene lösliche organische Verbindungen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem beispielsweise die Kopiezahl des Gens oder der Gene, des ORF (Open Reading Frame) oder der ORFs erhöht, ein starker Promotor verwendet wird und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert werden.
Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Enzyms oder Proteins im Allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 900% oder 500%, bis maximal 1000% oder 2000%, bezogen auf die des Wildtyp-Proteins oder Wildtyp-Enzyms oder die Aktivität oder Konzentration des Proteins oder Enzyms im Ausgangs-Mikroorganismus, erhöht.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können D-Pantothensäure aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerol und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattung Escherichia. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Spezies Escherichia coli zu nennen. Innerhalb der Spezies Escherichia coli sind die so genannten K-12 Stämme, wie z.B. die Stämme MG1655 oder W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D. C.)) oder der Escherichia coli Wildtypstamm IFO3547 (Institute of Fermentation, Osaka, Japan) und davon abgeleitete Mutanten geeignet, die die Fähigkeit besitzen, D-Pantothensäure zu produzieren.
Geeignete D-Pantothensäure-produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Spezies Escherichia coli, sind beispielsweise
Escherichia coli FV5069/pFV31
Escherichia coli FV5069/pFV202
Escherichia coli FE6/pFE80 und
Escherichia coli KE3
Es wurde gefunden, dass Enterobacteriaceae nach Überexpression des pepB-Gens in verbesserter Weise D-Pantothensäure produzieren. Die Verwendung endogener Gene wird bevorzugt.
Die Nucleotidsequenzen der Gene oder offenen Leserahmen (ORF) von Escherichia coli gehören zum Stand der Technik und können ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453–1462 (1997)) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden.

Dem Stand der Technik können unter anderem folgende Angaben zum pepB-Gen entnommen werden:

Bezeichnung:	Peptidase B
Referenz:	Hermsdorf et al., International Journal of Peptide and Protein Research 13: 146–51 (1979); Suzuki et al. Journal of Fermentation and Bioengineering 82: 392–397 (1996)
Accession-Nr.:	AE000339

Das in der angegebenen Textstelle beschriebene Gen kann erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele des Gens oder offene Leserahmen verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ergeben, wobei die Aktivität des Proteins im Wesentlichen nicht verändert wird.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopiezahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlauf der fermentativen D-Pantothensäure-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhindern des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität erhöht. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopiezahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Verändern der Medienzusammensetzung und Kultivierungsmethode erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet die fachkundige Person unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141–1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347–353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183–190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187–193 (1993)), in PCT/US97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222–224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161–169 (1989)), bei Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617–4622 (1989), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Es können in Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie z.B. von pACYC184 abgeleitete Klonierungsvektoren (Bartolomé et al.; Gene 102, 75–78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301–315 (1988)) oder pSC101-Derivate (Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Science USA 80 (21): 6557–6561 (1983)) verwendet werden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann ein mit einem oder mehreren Plasmidvektoren transformierter Stamm eingesetzt werden, wobei der (die) Plasmidvektoren) wenigstens eine das Gen pepB kodierende Nucleotidsequenz trägt/tragen.
Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des Gens pepB eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• dem die Acetohydroxysäure-Synthase II kodierenden ilvGM-Operon (WO 97/10340),
• dem die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierenden panB-Gen (US-A-5,518,906),
• dem die Ketopantoat-Reduktase kodierenden panE-Gen (EP-A-1001027),
• dem die Aspartat-Decarboxylase kodierenden panD-Gen (US-A-5,518,906),
• dem die Pantothenat-Synthetase kodierenden panC-Gen (US-A-5,518,906),
• dem die Serinhydroxymethyltransferase kodierenden glyA-Gen (Plamann et al., Nucleic Acids Research 11 (7): 2065–2075 (1983)),
• den das Glycin-Spaltungssystem kodierenden Genen gcvT, gcvH und gcvP (Okamura-Ikeda et al., European Journal of Biochemistry 216, 539–548 (1993)),
• dem die Phosphoglycerinsäure-Dehydrogenase kodierenden serA-Gen (Tobey und Grant, Journal of Biological Chemistry 261: 12179–12183 (1986)),
• dem die „feed back" resistenten Varianten der Phosphoglycerinsäure-Dehydrogenase kodierenden serA(FBR)-Allel (DE-A-4232468),
• dem die Phosphoserin-Transaminase kodierenden serC-Gen (Duncan und Coggins, Biochemical Journal 234: 49–57 (1986)),
• dem das Bacterioferrin kodierenden bfr-Gen (Andrews et al., Journal of Bacteriology 171: 3940–3947 (1989)),
• dem das DNA-Bindeprotein HLP-II kodierenden hns-Gen (Referenz: Pon et al., Molecular and General Genetics 212: 199–202 (1988)),
• dem die Phosphoglucomutase kodierenden pgm-Gen (Lu und Kleckner, Journal of Bacteriology 176: 5847–5851 (1994)),
• dem die Malat-Dehydrogenase kodierenden mdh-Gen (Sutherland und McAlister-Henn, Journal of Bacteriology 1985 163: 1074–1079 (1985)),
• dem die Cystein-Synthase-A kodierenden cysK-Gen (Boronat et al., Journal of General Microbiology 130: 673–685 (1984)),
• dem die Fructose-Bisphosphat-Aldolase (Klasse II) kodierenden fda-Gen (Alefounder et al., Biochemical Journal 257: 529–534 (1989)),
• dem die NADH-abhängige Lipoamid-Dehydrogenase kodierenden dldH-Gen (Referenz: Stephens et al., European Journal of Biochemistry 135: 519–527 (1983)),
• dem die NADP-abhängige Aldehyd-Dehydrogenase kodierenden aldH-Gen (Heim und Strehler, Gene 99: 15–23 (1991)) und
• dem die Adenylat-Kinase kodierende adk-Gen (Brune et al., Nucleic Acids Research 13: 7139–7151 (1985)),

Schließlich kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des Gens pepB eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• dem die Transaminase C kodierenden avtA-Gen (EP-A-1001027)
• dem die Pyruvat-Oxidase kodierenden poxB-Gen (Grabau und Cronan, Nucleic Acids Research. 14 (13), 5449–5460 (1986))
• dem die PEP-Carboxykinase kodierenden pckA-Gen (Medina et al., Journal of Bacteriology 172, 7151–7156 (1990)),

Der Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem beispielsweise ein schwacher Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet wird, das ein entsprechendes Enzym oder Protein mit einer niedrigen Aktivität kodiert oder das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert, und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert werden.
Durch die Maßnahmen der Abschwächung, einschließlich der Verringerung der Expression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins oder der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus herabgesenkt.
Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure vorteilhaft sein, neben der Überexpression des pepB-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Bakterien eingesetzt werden, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der D-Pantothensäure verringern.
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im Batch-Verfahren (Batch-Kultur), im Fed-Batch- (Zulaufverfahren) oder im Repeated-Fed-Batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung bekannter Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) enthalten.
Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlenhydrate, wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie z.B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie z.B. Glycerol und Ethanol, und organische Säuren, wie z.B. Essigsäure, verwendet werden. Diese Substanzen können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wachstumssubstanzen wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Substanzen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies Vorstufen der Pantothensäure wie Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder Pantoinsäure und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt werden. Die genannten Ausgangssubstanzen können zur Kultur in Form eines einzelnen Ansatzes gegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugeführt werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur können basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt werden.
Es ist gleichfalls möglich, zur Herstellung der Erdalkalimetallsalze der Pantothensäure, insbesondere des Calciumsalzes oder Magnesiumsalzes, während der Fermentation die Suspension oder Lösung einer erdalkalimetallhaltigen anorganischen Verbindung, wie beispielsweise Calciumhydroxid oder MgO, oder einer organischen Verbindung, wie das Erdalkalimetallsalz einer organischen Säure, beispielsweise Calciumacetat, kontinuierlich oder diskontinuierlich zuzusetzen. Zu diesem Zweck wird das zur Herstellung des gewünschten Erdalkalimetallsalzes der D-Pantothensäure nötige Kation direkt in der gewünschten Menge, bevorzugt in einer Menge von 0,95 bis 1,1 Äquivalenten, in die Fermentationsbrühe eingeleitet.
Die Salze können jedoch auch nach Abschluss der Fermentation durch Zugabe der anorganischen oder organischen Verbindungen zur Fermentationsbrühe gebildet werden, aus der gegebenenfalls die Biomasse zuvor entfernt wurde.
Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z.B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Substanzen, z.B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasgemische, wie z.B. Luft, in die Kultur eingeleitet. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Der pH-Wert liegt im Allgemeinen zwischen 5,0 und 8,0, vorzugsweise zwischen 5,5 und 7,6. Die Fermentation wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an D-Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die in der Fermentationsbrühe enthaltene D-Pantothensäure bzw. die entsprechenden Salze der D-Pantothensäure können anschließend nach dem Stand der Technik isoliert und gereinigt werden.
Es ist ebenso möglich, die D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Fermentationsbrühen vorzugsweise zunächst durch bekannte Separationsmethoden, wie zum Beispiel durch Zentrifugieren, Filtrieren, Dekantieren oder eine Kombination davon, vollständig oder zum Teil von der Biomasse zu befreien. Es ist jedoch auch möglich, die Biomasse gänzlich in der Fermentationsbrühe zu belassen. Im Allgemeinen wird die Suspension oder Lösung vorzugsweise konzentriert und anschließend beispielsweise mit Hilfe eines Sprühtrockners oder einer Gefriertrocknungsanlage zu einem Pulver aufgearbeitet. Anschließend wird dieses Pulver im Allgemeinen durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren, z.B. auch Aufbaugranulation, in ein gröberkörniges, rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt mit einer Korngrößenverteilung von bevorzugt 20 bis 2000 μm, insbesondere 100 bis 1400 μm überführt. Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen oder Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivate oder ähnliche Substanzen, die üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futtermittelverarbeitung als Binde-, Gelier- oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Substanzen, wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate oder Stearate.
Alternativ kann das Fermentationsprodukt mit oder ohne weitere der üblichen Fermentationsbestandteile auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff, wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken, Zucker oder andere, aufgezogen, insbesondere aufgesprüht, und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.
Diese die Trägerstoffe enthaltenden Gemische können ebenso durch Granulationsverfahren zu einem Produkt mit der gewünschten Korngrößenverteilung verarbeitet werden.
Gegebenenfalls wird in einer geeigneten Verfahrensstufe während oder nach der Fermentation D-Pantothensäure und/oder das gewünschte Salz der D-Pantothensäure oder eine diese Verbindungen enthaltende Formulierung hinzugefügt, um den in dem Produkt gewünschten Gehalt an Pantothensäure oder dem gewünschten Salz zu erzielen bzw. einzustellen.
Der gewünschte Gehalt an Pantothensäure und/oder dem gewünschten Salz liegt im Allgemeinen im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% (bezogen auf die Trockenmasse).
Die Konzentration der Pantothensäure kann mit bekannten chemischen (Velisek; Chromatographic Science 60, 515–560 (1992)) oder mikrobiologischen Verfahren, wie z.B. dem Lactobacillus plantarum Test (DIFCO MANUAL, 10^th Edition, S. 1100–1102; Michigan, USA), bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Verwendete Minimal- (M9) und Vollmedien (LB) für Escherichia coli werden von J. H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Ligation, Klenow- und alkalischen Phosphatasebehandlung werden nach Sambrook et al. (Molecular Cloning – A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli wird nach Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1989) 86: 2172–2175) oder nach Chuang et. al. (Nucleic Acids Research (1995) 23: 1641) durchgeführt.
Beispiel 1
Konstruktion des Expressionsplasmids pTrc99A-pepB
Das pepB-Gen aus E. coli K12 wird mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und synthetischen Oligonucleotiden amplifiziert. Ausgehend von der Nucleotidsequenz des pepB-Gens in E. coli K12 MG1655 (Accession-Nr. AE000339, Blattner et al. (Science 277, 1453–1462 (1997)) werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland). Die 5'-Enden der Primer werden mit Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme und zwei bis vier zusätzlichen Basen verlängert. Dieser Teil des Primers ist in der nachfolgenden Darstellung durch einen Bindestrich (–) gekennzeichnet. Für den 5'-Primer wird die Erkennungssequenz für BamHI und für den 3'-Primer die Erkennungssequenz für SalI ausgewählt, die in der unten dargestellten Nucleotidsequenz durch Unterstreichen markiert sind:
Primer pepB5': 5'-CGCGGRTCC-AACTGGCGGCCCTTT-3' (SEQ ID Nr. 1)
Primer pepB3': 5'-ACGCGTCGRC-CTGATGCGCTACGCT-3' (SEQ ID Nr. 2)
Die für die PCR eingesetzte chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA wird nach Herstellerangaben mit „Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ca. 800 bp großes DNA-Fragment kann mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mit der Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird den Herstellerangaben entsprechend mit dem Vektor pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und in den E. coli Stamm TOP10 transformiert. Die Selektion plasmidtragender Zellen erfolgt auf LB Agar, der mit 50 μg/ml Kanamycin versetzt ist. Nach der Plasmid-DNA- Isolierung wird der Vektor pCR-Blunt II-TOPO-pepB mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI gespalten und das pepB-Fragment wird nach der Auftrennung im 0,8%igen Agarosegel mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pTrc99A (Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland) wird mit den Enzymen BamHI und SalI gespalten, anschließend mit alkalischer Phosphatase entsprechend den Herstellerangaben (Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland) dephosphoryliert und mit dem isolierten pepB-Fragment ligiert. Der E. coli Stamm XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit dem Ligationsansatz transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB Agar, der mit 50 μg/ml Ampicillin versetzt ist, selektiert. Die erfolgreiche Klonierung kann nach der Plasmid-DNA-Isolierung durch Kontrollspaltung mit den Enzymen BamHI und SalI, EcoRV und PvuI nachgewiesen werden. Das Plasmid wird als pTrc99A-pepB (1) bezeichnet.
Beispiel 2
Herstellung der Stämme FE6-1/pTrc99A und FE6-1/pTrc99A-pepB
Der E. coli Stamm FE6 ist eine Valin-resistente Mutante von E. coli K12 MG1655 (US-B-6171845) und als DSM12379 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) hinterlegt. Ausgehend von FE6 werden nach der Inkubation bei 37°C auf Minimalagar, der mit 2 g/l Glucose und 1 g/l β-Hydroxyasparaginsäure versetzt ist, Spontanmutanten isoliert. Eine ausgewählte β-Hydroxyasparaginsäure-resistente Einzelkolonie wird anschließend auf Minimalagar, der 2 g/l Glucose und 0,2 g/l O-Methylthreonin enthält, bei 37°C inkubiert. Eine als FE6-1 bezeichnete Mutante ist nach diesem Schritt resistent gegen L-Valine, α-Ketoisovaleriansäure, β-Hydroxyasparaginsäure und O-Methylthreonin. Eine Reinkultur des Stammes FE6-1 wurde am 8. September 2000 als DSM13721 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.
Die Plasmide pTrc99A und pTrc99A-pepB werden einzeln in den Stamm FE6-1 transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB Agar, der mit 50 μg/ml Ampicillin versetzt ist, selektiert. Die erhaltenen Stämme werden als FE6-1/pTrc99A und FE6-1/pTrc99A-pepB bezeichnet.
Beispiel 3
Herstellung von D-Pantothensäure mit von FE6-1 abgeleiteten Stämmen
Die Pantothenat-Produktion der E. coli Stämme FE6-1/pTrc99A und FE6-1/pTrc99A-pepB wird in Batch-Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeyerkolben enthalten sind, überprüft. Dazu werden 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄·7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin, mit einer Einzelkolonie beimpft und 20 Stunden lang bei 33°C und 200 rpm auf einem ESR Inkubator der Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. Je 200 μl dieser Vorkultur werden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄·7H₂O, 0,03 g/l FeSO₄·7H₂O, 0,018 g/l MnSO₄·1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 20 g/l β-Alanin, 250 mg/l Thiamin) überimpft, und der Ansatz wird 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer von Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.
Anschließend wird die Konzentration an gebildetem D-Pantothenat im abzentrifugierten Kulturüberstand mittels Hochleistungsflüssigchromatographie bestimmt [Säule: Reversed Phase MZ-Aqua Perfect (Durchmesser 4,6 mm), mobile Phase 25 mM Acetatpuffer mit 10% Methanol, Flussrate 1 ml/min, RI Detektor].
In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
Tabelle 1
Kurze Beschreibung der Figur:
1: Karte des das pepB-Gen enthaltenden Plasmids pTrc99A-pepB.
Längenangaben sind als Zirkaangaben zu verstehen. Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:

Amp:: Ampicillinresistenzgen
lacI:: Gen für das Repressorprotein des trc-Promotors
Ptrc:: trc-Promotorregion, IPTG-induzierbar
pepB:: Kodierregion des pepB-Gens
5S:: 5S rRNA-Region
rrnBT:: rRNA-Terminator-Region
bps: Basenpaare

Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme haben folgende Bedeutung:

BamHI:: Restriktionsendonuclease aus Bacillus amyloliquefaciens
EcoRV:: Restriktionsendonuclease aus Escherichia coli B946
PvuI:: Restriktionsendonuclease aus Proteus vulgaris
SalI:: Restriktionsendonuclease aus Streptomyces albus

SEQUENZPROTOKOLI

Claims

Verfahren zur Herstellung von Futtermitteladditiven, umfassend D-Pantothensäure und/oder deren Salze, durch Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, wobei wenigstens die das pepB-Gen kodierende(n) Nucleotidsequenz(en) überexprimiert wird/werden, unter für die Bildung des pepB-Genprodukts Peptidase B geeigneten Bedingungen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Überexpression durch Erhöhen der Kopienzahl des pepB-Gens oder durch Verknüpfen eines Promotors mit dem genannten Gen erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei a) die D-Pantothensäure und/oder deren Salze in der Fermentationsbrühe oder in den Zellen der Mikroorganismen angereichert wird, und b) das/die gewünschte(n) Produkt(e) nach Abschluss der Fermentation isoliert wird/werden, wobei die Biomasse und/oder weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe in einer Menge von 0 bis 100% abgetrennt wird/werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae der Gattung Escherichia angehören.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikroorganismen von der Spezies Escherichia coli abstammen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zusätzlich eines oder mehrere der bevorzugt endogenen Gene überexprimiert wird/werden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Folgendem: a) dem die Acetohydroxysäure-Synthase II kodierenden ilvGM-Operon, b) dem die Ketopantoat-Hydroxymethyl-Transferase kodierenden panB-Gen, c) dem die Ketopantoat-Reduktase kodierenden panE-Gen, d) dem die Aspartat-Decarboxylase kodierenden panD-Gen, e) dem die Pantothenat-Synthetase kodierenden panC-Gen, f) den das Glycin-Spaltungssystem kodierenden Genen gcvT, gcvH und gcvP, einzeln oder gemeinsam, g) dem die Serinhydroxymethyltransferase kodierenden glyA-Gen, h) dem die Phosphoglycerinsäure-Dehydrogenase kodierenden serA-Gen, i) den die „feed back" resistenten Varianten der Phosphoglycerinsäure-Dehydrogenase kodierenden serA(FBR)-Allelen, j) dem die Phosphoserin-Transaminase kodierenden serC-Gen, k) dem das Bacterioferrin kodierenden bfr-Gen, l) dem das DNA-Bindeprotein HLP-II kodierenden hns-Gen, m) dem die Phosphoglucomutase kodierenden pgm-Gen, n) dem die Malat-Dehydrogenase kodierenden mdh-Gen, o) dem die Cystein-Synthase-A kodierenden cysK-Gen, p) dem die Fructose-Bisphosphat-Aldolase (Klasse II) kodierenden fda-Gen, q) dem die NADH-abhängige Lipoamid-Dehydrogenase kodierenden dldH-Gen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Mikroorganismen eingesetzt werden, in denen eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der folgenden Gruppe, ausgeschaltet ist/sind: a) das die Transaminase C kodierende avtA-Gen, b) das die PEP-Carboxykinase kodierende pckA-Gen und c) das die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen.
Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Futtermitteladditiven nach Anspruch 1, wobei a) aus einer durch Fermentation der Mikroorganismen gewonnenen D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Fermentationsbrühe die Biomasse und/oder ein Teil der Bestandteile in einer Menge von 0 bis 100 abgetrennt wird/werden, b) das so erhaltene Gemisch optional konzentriert (Konzentration) wird, c) das so erhaltene, die Pantothensäure und/oder das Pantothenat enthaltende Gemisch durch bekannte Maßnahmen in ein feinteiliges Pulver umgewandelt wird, und d) ein rieselfähiges Tierfuttermitteladditiv mit einer Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 μm daraus gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 8 mit einem Gehalt an D-Pantothensäure und/oder deren Salzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Magnesium- oder Calciumsalz, wobei die Fermentation in Gegenwart von Ca-Hydroxid oder MgO oder Ca- oder Mg-Salzen einer organischen Säure durchgeführt wird, wobei diese kontinuierlich oder diskontinuierlich zugeführt werden und ein Ca- oder Mg-Salz der D-Pantothensäure enthaltendes oder daraus bestehendes Produkt gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 8 mit einem Gehalt an D-Pantothensäure und/oder deren Salzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Magnesium- oder Calciumsalz, wobei der Fermentationsbrühe nach der Fermentation Ca-Hydroxid oder MgO oder Calcium- oder Magnesiumsalze einer organischen Säure zugesetzt werden, nach der Abtrennung von 0 bis 100% der gebildeten Biomasse.
Verfahren nach Anspruch B, wobei der Fermentationsbrühe vor oder nach der Konzentration D-Pantothensäure oder eines oder mehrere der genannten Pantothensäuresalze zugesetzt wird/werden, wobei die Menge der zugesetzten Verbindungen so bemessen ist, dass deren Gesamtkonzentration im Tierfuttermitteladditiv im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse) liegt.
Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 11, wobei aus der Fermentationsbrühe ein Tierfuttermitteladditiv mit der gewünschten Korngröße gewonnen wird durch a) Trocknen und Kompaktieren oder b) Sprühtrocknen oder c) Sprühtrocknen und Granulieren oder d) Sprühtrocknen und Aufbaugranulieren.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Fermentationsbrühe nach dem Entfernen der Biomasse (0 bis 100%) auf einen anorganischen oder organischen Hilfsstoff oder Träger aufgebracht wird.