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Bereich der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
D-Pantothensäure
und deren Salzen oder diese enthaltenden Gemischen unter Verwendung
von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen wenigstens
das Gen adk überexprimiert
wird.
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Stand der
Technik
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Pantothensäure wird
weltweit in einer Größenordnung
von mehreren tausend Tonnen pro Jahr produziert. Sie wird unter
anderem in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und
in der Lebensmittelindustrie verwendet. Ein großer Teil der produzierten Pantothensäure wird
für die
Ernährung
von Nutztieren wie Geflügel
und Schweine verwendet.
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Pantothensäure kann
durch chemische Synthese oder biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen
in geeigneten Nährlösungen hergestellt
werden. Bei der chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine
wichtige Vorstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus Formaldehyd,
Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt, und in weiteren Verfahrensschritten
wird das racemische Gemisch separiert, das D-Pantolacton wird mit β-Alanin kondensiert
und so D-Pantothensäure
erhalten.
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Die
typische Handelsform ist das Calcium-Salz der D-Pantothensäure. Das Calcium-Salz des racemischen
Gemisches der D,L-Pantothensäure
ist ebenfalls gebräuchlich.
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Der
Vorteil der fermentativen Herstellung durch Mikroorganismen liegt
in der direkten Bildung der gewünschten
stereoisomeren Form, nämlich
der D-Form, die frei von L-Pantothensäure ist.
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Verschiedene
Arten von Bakterien, wie z.B. Escherichia coli (E. coli), Arthrobacter
ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes
und auch Hefen, wie z.B. Debaromyces castellii, können wie
in der EP-A 0 493 060 gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren.
Die EP-A 0 493 060 zeigt weiterhin, dass bei E. coli durch Amplifikation
von Pantothensäure-Biosynthesegenen
aus E. coli, die auf den Plasmiden pFV3 und pFVS enthalten sind, in
einer Nährlösung, die
Glucose, DL-Pantoinsäure
und β-Alanin
enthält,
die Bildung von D-Pantothensäure verbessert
wird.
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Die
EP-A 0 590 857 und das US-Patent 5,518,906 beschreiben vom E. coli
Stamm IFO3547 abgeleitete Mutanten, wie FV5714, FV525, FV814, FV521,
FV221, FV6051 und FV5069, die Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite
wie Salicylsäure, α-Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure, O-Methylthreonin und α-Ketoisovaleriansäure tragen.
Sie produzieren in einer Nährlösung, die
Glucose enthält,
Pantoinsäure, und
in einer Glucose- und β-Alanin-haltigen
Nährlösung D-Pantothensäure. In
der EP-A 0 590 857 und dem US-Patent 5,518,906 wird weiterhin angegeben,
dass nach Amplifikation der Pantothensäure-Biosynthesegene panB, panC
und panD, die auf dem Plasmid pFV31 enthalten sein sollen, in den
oben genannten Stämmen die
Produktion von D-Pantoinsäure in glucosehaltigen
Nährlösungen und
die Produktion von D-Pantothensäure
in einer Nährlösung, die
Glucose und β-Alanin
enthält,
verbessert wird.
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Weiterhin
wird in der WO97/10340 über
die förderliche
Wirkung der Verstärkung
des ilvGM-Operons auf die Produktion von D-Pantothensäure berichtet.
In der EP-A-1001027
wird schließlich über die
Wirkung der Verstärkung
des panE-Gens auf die Bildung der D-Pantothensäure berichtet.
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Nach
dem Stand der Technik wird die D-Pantothensäure oder das entsprechende
Salz aus der Fermentatiansbrühe
isoliert und gereinigt (EP-A-0590857 und WO96/33283) und dementsprechend
in gereinigter Form verwendet, oder die D-Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe wird
insgesamt getrocknet (EP-A-1050219) und insbesondere als Futtermitteladditiv
verwendet.
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Brune
M. et al. (Nucleic Acids Research, Bd. 13, Nr. 19, 1995, Seiten
7139–7151)
zeigen, dass die Klonierung des adk-Gens zu einer Überexpression
von Adenylat-Kinase in den transformierten E. coli Stämmen führt.
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Aufgabe der
Erfindung
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Aufgabe
der Erfindung ist es, neue Maßnahmen
zur verbesserten fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder
deren Salzen und diese enthaltenden Tierfuttermitteladditiven bereitzustellen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Wenn
im Folgenden D-Pantothensäure
oder Pantothensäure
oder Pantothenat erwähnt
werden, sind damit nicht nur die freien Säuren, sondern auch die Salze
der D-Pantothensäure,
wie z.B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz, gemeint.
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Gegenstand
der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder
deren Salzen unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae,
die insbesondere bereits D-Pantothensäure produzieren und in denen
wenigstens eine das adk-Gen kodierende, bevorzugt endogene Nucleotidsequenz überexprimiert
wird.
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Unter „endogenen
Genen" oder „endogenen
Nucleotidsequenzen" versteht
man die in der Population einer Spezies vorhandenen Gene oder Nucleotidsequenzen.
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Insbesondere
handelt es sich um ein Verfahren, das durch die folgenden Schritte
gekennzeichnet ist:
- a) Fermentation von D-Pantothensäure produzierenden
Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen wenigstens
das adk-Gen überexprimiert
wird;
das die Adenylat-Kinase kodierende Gen und gegebenenfalls
Allele dieses Gens werden unter für die Bildung des Genprodukts
geeigneten Bedingungen überexprimiert;
gegebenenfalls
werden gleichzeitig weitere Gene des Pantothensäure-Biosyntheseweges abgeschwächt oder überexprimiert,
um die Produktion der Pantothensäure
zu erhöhen;
- b) die Fermentation erfolgt gegebenenfalls in Gegenwart von
Erdalkalimetallverbindungen, wobei diese in vorzugsweise stöchiometrischen
Mengen kontinuierlich oder diskontinuierlich der Fermentationsbrühe hinzugefügt werden;
- c) Konzentration der D-Pantothensäure bzw. der entsprechenden
Salze im Medium oder der Fermentationsbrühe oder gegebenenfalls in den
Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae; und
- d) nach Abschluss der Fermentation Isolierung der D-Pantothensäure und/oder
(der) des entsprechenden Salze(s).
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Gegenstand
der Erfindung ist ebenso ein Verfahren, bei dem nach Abschluss der
Fermentation die Biomasse teilweise oder insgesamt (≥ 0 bis 100%)
in der Fermentationsbrühe verbleibt,
und die so erhaltene Brühe
gegebenenfalls nach dem Konzentrieren zu einem festen D-Pantothensäure und/oder
deren Salze enthaltenden Gemisch, das bevorzugt weitere Bestandteile
aus der Fermentationsbrühe
enthält,
verarbeitet wird.
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Bei
diesen weiteren Bestandteilen handelt es sich vor allem um die gelösten Verbindungen,
die aus dem Zufütterungsmedium
stammen, und entstandene lösliche
organische Verbindungen.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Der
Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Erhöhung
der intrazellulären
Aktivität
eines oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Mikroorganismus,
die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem beispielsweise
die Kopiezahl des Gens oder der Gene, des ORF (Open Reading Frame) oder
der ORFs erhöht,
ein starker Promotor verwendet wird und gegebenenfalls diese Maßnahmen
kombiniert werden.
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Durch
die Maßnahmen
der Verstärkung,
insbesondere Überexpression,
wird die Aktivität
oder Konzentration des entsprechenden Enzyms oder Proteins im Allgemeinen
um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder
500%, bis maximal 1000% oder 2000%, bezogen auf die des Wildtyp-Proteins
oder Wildtyp-Enzyms oder die Aktivität oder Konzentration des Proteins
oder Enzyms im Ausgangs-Mikroorganismus, erhöht.
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Die
Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind,
können
D-Pantothensäure aus
Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose
oder aus Glycerol und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter
der Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattung Escherichia. Bei
der Gattung Escherichia ist insbesondere die Spezies Escherichia
coli zu nennen. Innerhalb der Spezies Escherichia coli sind die
so genannten K-12 Stämme,
wie z.B. die Stämme
MG1655 oder W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella.
Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D. C.)) oder
der Escherichia coli Wildtypstamm IFO3547 (Institute of Fermentation,
Osaka, Japan) und davon abgeleitete Mutanten geeignet, die die Fähigkeit
besitzen, D-Pantothensäure
zu produzieren.
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Geeignete
D-Pantothensäure-produzierende
Stämme
der Gattung Escherichia, insbesondere der Spezies Escherichia coli,
sind beispielsweise
Escherichia coli FV5069/pFV31
Escherichia
coli FV5069/pFV202
Escherichia coli FE6/pFE80 und
Escherichia
coli KE3
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Es
wurde gefunden, dass Enterobacteriaceae nach Überexpression des adk-Gens
in verbesserter Weise D-Pantothensäure produzieren.
Die Verwendung endogener Gene wird bevorzugt.
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Die
Nucleotidsequenzen der Gene oder offenen Leserahmen (ORF) von Escherichia
coli gehören
zum Stand der Technik und können
ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453–1462 (1997))
publizierten Genomsequenz von Escherichia coli entnommen werden.
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Dem
Stand der Technik können
unter anderem folgende Angaben zum adk-Gen entnommen werden:
Beschreibung:
Adenylat-Kinase
Alternativer Genname: plsA, dnaW
EC-Nr.:
2.7.4.3
Referenz: Brune et al., Nucleic Acids Research 13:
7139–7151
(1985), Holmes und Singer, Journal of Biological Chemistry. 248
(6): 2014–2021
(1973)
Accession-Nr.: AE000153
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Das
in der angegebenen Textstelle beschriebene Gen kann erfindungsgemäß verwendet
werden. Weiterhin können
Allele. des Gens oder offene Leserahmen verwendet werden, die sich
aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale
Sinnmutationen ergeben, wobei die Aktivität des Proteins im Wesentlichen
nicht verändert
wird.
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Zur
Erzielung einer Überexpression
kann die Kopiezahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die
Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle,
die sich stromaufwärts des
Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken
Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut
werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlauf
der fermentativen D-Pantothensäure-Produktion
zu steigern. Durch Maßnahmen
zur Verlängerung der
Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert.
Weiterhin wird durch Verhindern des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls
die Enzymaktivität
erhöht.
Die Gene oder Genkonstrukte können
entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopiezahl vorliegen
oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann
weiterhin eine Überexpression
der betreffenden Gene durch Verändern
der Medienzusammensetzung und Kultivierungsmethode erreicht werden.
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Anleitungen
hierzu findet die fachkundige Person unter anderem bei Chang und
Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141–1156 (1978)), bei Hartley
und Gregori (Gene 13: 347–353
(1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183–190 (1985)), bei de Broer
et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 80: 21–25
(1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187–193 (1993)),
in PCT/US97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222–224 (1991)),
bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161–169 (1989)), bei Hamilton
(Journal of Bacteriology 171: 4617–4622 (1989), bei Jensen und
Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998) und in bekannten
Lehrbüchern
der Genetik und Molekularbiologie.
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Es
können
in Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie z.B. von
pACYC184 abgeleitete Klonierungsvektoren (Bartolomé et al.;
Gene 102, 75–78
(1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301–315 (1988)) oder pSC101-Derivate
(Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Science
USA 80 (21): 6557–6561
(1983)) verwendet werden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann ein mit
einem oder mehreren Plasmidvektoren transformierter Stamm eingesetzt
werden, wobei der (die) Plasmidvektor(en) wenigstens eine das Gen
adk kodierende Nucleotidsequenz trägt/tragen.
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Weiterhin
kann es für
die Produktion von D-Pantothensäure
mit Stämmen
der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression
des Gens akd eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus
- • dem
die Acetohydroxysäure-Synthase
II kodierenden ilvGM-Operon
(WO 97/10340),
- • dem
die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierenden panB-Gen (US-A-5,518,906),
- • dem
die Ketopantoat-Reduktase kodierenden panE-Gen (EP-A-1001027),
- • dem
die Aspartat-Decarboxylase kodierenden panD-Gen (US-A-5,518,906),
- • dem
die Pantothenat-Synthetase kodierenden panC-Gen (US-A-5,518,906),
- • dem
die Serinhydroxymethyltransferase kodierenden glyA-Gen (Plamann et al.,
Nucleic Acids Research 11 (7): 2065–2075 (1983)),
- • den
das Glycin-Spaltungssystem kodierenden Genen gcvT, gcvH und gcvP
(Okamura-Ikeda et al., European Journal of Biochemistry 216, 539–548 (1993)),
- • dem
die Phosphoglycerinsäure-Dehydrogenase
kodierenden serA-Gen (Tobey und Grant, Journal of Biological Chemistry
261: 12179–12183
(1986)),
- • dem
die „feed
back" resistenten
Varianten der Phosphoglycerinsäure-Dehydrogenase
kodierenden serA(FBR)-Allel
(DE-A-4232468),
- • dem
die Phosphoserin-Transaminase kodierenden serC-Gen (Duncan und Coggins,
Biochemical Journal 234: 49–57
(1986)),
- • dem
das Bacterioferrin kodierenden bfr-Gen (Andrews et al., Journal
of Bacteriology 171: 3940–3947 (1989)),
- • dem
das DNA-Bindeprotein HLP-II kodierenden hns-Gen (Referenz: Pon et
al., Molecular and General Genetics 212: 199–202 (1988)),
- • dem
die Phosphoglucomutase kodierenden pgm-Gen (Lu und Kleckner, Journal
of Bacteriology 176: 5847–5851
(1994)),
- • dem
die Malat-Dehydrogenase kodierenden mdh-Gen (Sutherland und McAlister-Henn,
Journal of Bacteriology 1985 163: 1074–1079 (1985)),
- • dem
die Cystein-Synthase-A kodierenden cysK-Gen (Boronat et al., Journal
of General Microbiology 130: 673–685 (1984)),
- • dem
die Fructose-Bisphosphat-Aldolase (Klasse II) kodierenden fda-Gen
(Alefounder et al., Biochemical Journal 257: 529–534 (1989)),
- • dem
die NADH-abhängige
Lipoamid-Dehydrogenase kodierenden dldH-Gen (Referenz: Stephens
et al., European Journal of Biochemistry 135: 519–527 (1983)),
- • dem
die Peptidase B kodierenden pepB-Gen (Hermsdorf et al., International
Journal of Peptide and Protein Research 13: 146–151 (1979); Suzuki et al.,
Journal of Fermentation and Bioengineering 82: 392–397 (1996);
Suzuki et at., Journal of Bacteriology 183 (4): 1489–1490, (2001))
und
- • dem
die NADP-abhängige
Aldehyd-Dehydrogenase kodierenden aldH-Gen (Heim und Strehler, Gene
99: 15–23
(1991)),
einzeln oder gemeinsam zu überexprimieren. Die Verwendung
endogener Gene wird bevorzugt.
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Schließlich kann
es für
die Produktion von D-Pantothensäure
mit Stämmen
der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression
des Gens adk eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus
- • dem
die Transaminase C kodierenden avtA-Gen (EP-A-1001027)
- • dem
die Pyruvat-Oxidase kodierenden poxB-Gen (Grabau und Cronan, Nucleic
Acids Research. 14 (13), 5449–5460
(1986))
- • dem
die PEP-Carboxykinase kodierenden pckA-Gen (Medina et al., Journal
of Bacteriology 172, 7151–7156
(1990)),
einzeln oder gemeinsam abzuschwächen, insbesondere
auszuschalten oder auf niedrigem Niveau zu exprimieren.
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Der
Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines
oder mehrerer Enzyme oder Proteine in einem Mikroorganismus, die durch
die entsprechende DNA kodiert werden, indem beispielsweise ein schwacher
Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet wird, das ein
entsprechendes Enzym oder Protein mit einer niedrigen Aktivität kodiert
oder das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert, und
gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert
werden.
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Durch
die Maßnahmen
der Abschwächung,
einschließlich
der Verringerung der Expression, wird die Aktivität oder Konzentration
des entsprechenden Proteins im Allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis
50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration
des Wildtyp-Proteins
oder der Aktivität
oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus herabgesenkt.
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Weiterhin
kann es für
die Produktion von D-Pantothensäure
vorteilhaft sein, neben der Überexpression des
adk-Gens unerwünschte
Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction
of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press,
London, UK, 1982). In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Bakterien
eingesetzt werden, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise
ausgeschaltet sind, die die Bildung der D-Pantothensäure verringern.
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Die
erfindungsgemäß hergestellten
Mikroorganismen können
im Batch-Verfahren (Batch-Kultur), im Fed-Batch- (Zulaufverfahren) oder im Repeated-Fed-Batch-Verfahren
(repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung
bekannter Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik
1. Einführung
in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))
oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen
(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) enthalten.
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Das
zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der
jeweiligen Stämme
genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen
sind im Handbuch "Manual
of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology
(Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker
und Kohlenhydrate, wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose,
Maltose, Melasse, Stärke
und Cellulose, Öle
und Fette, wie z.B. Sojaöl,
Sonnenblumenöl,
Erdnussöl und
Kokosfett, Fettsäuren,
wie z.B. Palmitinsäure,
Stearinsäure
und Linolsäure,
Alkohole, wie z.B. Glycerol und Ethanol, und organische Säuren, wie
z.B. Essigsäure,
verwendet werden. Diese Substanzen können einzeln oder als Gemisch
verwendet werden.
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Als
Stickstoffquelle können
organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können
einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
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Als
Phosphorquelle können
Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die
entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium
muss weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z.B. Magnesiumsulfat
oder Eisensulfat, die für
das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wachstumssubstanzen
wie Aminosäuren
und Vitamine zusätzlich
zu den oben genannten Substanzen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies
Vorstufen der Pantothensäure
wie Aspartat, β-Alanin,
Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure
oder Pantoinsäure
und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt werden. Die genannten Ausgangssubstanzen
können
zur Kultur in Form eines einzelnen Ansatzes gegeben oder in geeigneter
Weise während
der Kultivierung zugeführt
werden.
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Zur
pH-Kontrolle der Kultur können
basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak
bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder
Schwefelsäure
in geeigneter Weise eingesetzt werden.
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Es
ist gleichfalls möglich,
zur Herstellung der Erdalkalimetallsalze der Pantothensäure, insbesondere des
Calciumsalzes oder Magnesiumsalzes, während der Fermentation die
Suspension oder Lösung
einer erdalkalimetallhaltigen anorganischen Verbindung, wie beispielsweise
Calciumhydroxid oder MgO, oder einer organischen Verbindung, wie
das Erdalkalimetallsalz einer organischen Säure, beispielsweise Calciumacetat, kontinuierlich
oder diskontinuierlich zuzusetzen. Zu diesem Zweck wird das zur
Herstellung des gewünschten Erdalkalimetallsalzes
der D-Pantothensäure
nötige
Kation direkt in der gewünschten
Menge, bevorzugt in einer Menge von 0,95 bis 1,1 Äquivalenten,
in die Fermentationsbrühe
eingeleitet.
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Die
Salze können
jedoch auch nach Abschluss der Fermentation durch Zugabe der anorganischen oder
organischen Verbindungen zur Fermentationsbrühe gebildet werden, aus der
gegebenenfalls die Biomasse zuvor entfernt wurde.
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Zur
Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie
z.B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt
werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Substanzen, z.B. Antibiotika,
hinzugefügt
werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder sauerstoffhaltige Gasgemische, wie z.B. Luft, in die Kultur
eingeleitet. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise
bei 30°C
bis 40°C.
Der pH-Wert liegt im Allgemeinen zwischen 5,0 und 8,0, vorzugsweise
zwischen 5,5 und 7,6. Die Fermentation wird so lange fortgesetzt, bis
sich ein Maximum an D-Pantothensäure
gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden
bis 160 Stunden erreicht.
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Die
in der Fermentationsbrühe
enthaltene D-Pantothensäure
bzw. die entsprechenden Salze der D-Pantothensäure können anschließend nach
dem Stand der Technik isoliert und gereinigt werden.
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Es
ist ebenso möglich,
die D-Pantothensäure
und/oder deren Salze enthaltenden Fermentationsbrühen vorzugsweise
zunächst
durch bekannte Separationsmethoden, wie zum Beispiel durch Zentrifugieren,
Filtrieren, Dekantieren oder eine Kombination davon, vollständig oder
zum Teil von der Biomasse zu befreien. Es ist jedoch auch möglich, die Biomasse
gänzlich
in der Fermentationsbrühe
zu belassen. Im Allgemeinen wird die Suspension oder Lösung vorzugsweise
konzentriert und anschließend
beispielsweise mit Hilfe eines Sprühtrockners oder einer Gefriertrocknungsanlage
zu einem Pulver aufgearbeitet. Anschließend wird dieses Pulver im
Allgemeinen durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren, z.B. auch
Aufbaugranulation, in ein gröberkörniges,
rieselfähiges,
lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt mit einer Korngrößenverteilung
von bevorzugt 20 bis 2000 μm,
insbesondere 100 bis 1400 μm überführt. Vorteilhaft
bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen
organischen oder anorganischen Hilfsstoffen oder Trägern wie
Stärke,
Gelatine, Cellulosederivate oder ähnliche Substanzen, die üblicherweise
in der Lebensmittel- oder Futtermittelverarbeitung als Binde-, Gelier-
oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Substanzen,
wie zum Beispiel Kieselsäuren,
Silikate oder Stearate.
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Alternativ
kann das Fermentationsprodukt mit oder ohne weitere der üblichen
Fermentationsbestandteile auf einen in der Futtermittelverarbeitung
bekannten und üblichen
organischen oder anorganischen Trägerstoff, wie zum Beispiel
Kieselsäuren,
Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken, Zucker oder andere, aufgezogen,
insbesondere aufgesprüht,
und/oder mit üblichen
Verdickungs- oder Bindemitteln stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele
und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik
132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.
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Diese
die Trägerstoffe
enthaltenden Gemische können
ebenso durch Granulationsverfahren zu einem Produkt mit der gewünschten
Korngrößenverteilung
verarbeitet werden.
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Gegebenenfalls
wird in einer geeigneten Verfahrensstufe während oder nach der Fermentation
D-Pantothensäure
und/oder das gewünschte
Salz der D-Pantothensäure
oder eine diese Verbindungen enthaltende Formulierung hinzugefügt, um den
in dem Produkt gewünschten
Gehalt an Pantothensäure
oder dem gewünschten
Salz zu erzielen bzw. einzustellen.
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Der
gewünschte
Gehalt an Pantothensäure
und/oder dem gewünschten
Salz liegt im Allgemeinen im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% (bezogen
auf die Trockenmasse).
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Die
Konzentration der Pantothensäure
kann mit bekannten chemischen (Velisek; Chromatographic Science
60, 515–560
(1992)) oder mikrobiologischen Verfahren, wie z.B. dem Lactobacillus
plantarum Test (DIFCO MANUAL, 10th Edition,
S. 1100–1102;
Michigan, USA), bestimmt werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert.
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Verwendete
Minimal- (M9) und Vollmedien (LB) für Escherichia coli werden von
J. H. Miller (A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold
Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Die Isolierung von Plasmid-DNA
aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Ligation,
Klenow- und alkalischen Phosphatasebehandlung werden nach Sambrook
et al. (Molecular Cloning – A
Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) durchgeführt. Die
Transformation von Escherichia coli wird nach Chung et al. (Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America
(1989) 86: 2172–2175)
oder nach Chuang et. al. (Nucleic Acids Research (1995) 23: 1641)
durchgeführt.
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Beispiel 1
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Konstruktion des Expressionsplasmids
pTrc99A-adk
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Das
adk-Gen aus E. coli K12 wird mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und synthetischen
Oligonucleotiden amplifiziert. Ausgehend von der Nucleotidsequenz
des adk-Gens in
E. coli K12 MG1655 (Accession-Nr. AE000153, Blattner et al. (Science
277, 1453–1462
(1997)) werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg,
Deutschland). Die 5'-Enden
der Primer werden mit Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme und zwei
bis vier zusätzlichen
Basen verlängert.
Dieser Teil des Primers ist in der nachfolgenden Darstellung durch
einen Bindestrich (-) gekennzeichnet. Für den 5'-Primer wird die Erkennungssequenz für BamHI
und für
den 3'-Primer die
Erkennungssequenz für
SalI ausgewählt,
die in der unten dargestellten Nucleotidsequenz durch Unterstreichen
markiert sind:
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-
Die
für die
PCR eingesetzte chromosomale E. coli K12 MG1655 DNA wird nach Herstellerangaben
mit „Qiagen
Genomic-tips 100/G" (QIAGEN,
Hilden, Deutschland) isoliert. Ein ca. 800 bp großes DNA-Fragment kann
mit den spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis
et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications,
Academic Press) mit der Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison,
USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird den Herstellerangaben entsprechend
mit dem Vektor pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit,
Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und in den E. coli Stamm
TOP10 transformiert. Die Selektion plasmidtragender Zellen erfolgt
auf LB Agar, der mit 50 μg/ml
Kanamycin versetzt ist. Nach der Plasmid-DNA- Isolierung wird der Vektor pCR-Blunt
II-TOPO-adk mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI gespalten
und das adk-Fragment
wird nach der Auftrennung im 0,8%igen Agarosegel mit Hilfe des QIAquick
Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor
pTrc99A (Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland) wird mit den
Enzymen BamHI und SalI gespalten, anschließend mit alkalischer Phosphatase
entsprechend den Herstellerangaben (Amersham Biosciences, Freiburg,
Deutschland) dephosphoryliert und mit dem isolierten adk-Fragment
ligiert. Der E. coli Stamm XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit
dem Ligationsansatz transformiert und plasmidtragende Zellen werden
auf LB Agar, der mit 50 μg/ml
Ampicillin versetzt ist, selektiert. Die erfolgreiche Klonierung
kann nach der Plasmid-DNA-Isolierung durch Kontrollspaltung mit
den Enzymen BamHI und SalI, EcoRI und BstEII nachgewiesen werden.
Das Plasmid wird als pTrc99A-adk (1) bezeichnet.
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Beispiel 2
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Herstellung der Stämme FE6-1/pTrc99A
und FE6-1/pTrc99A-adk
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Der
E. coli Stamm FE6 ist eine Valin-resistente Mutante von E. coli
K12 MG1655 (US-B-6171845) und als DSM12379 bei der Deutschen Sammlung
für Mikroorganismen
und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) hinterlegt. Ausgehend
von FE6 werden nach der Inkubation bei 37°C auf Minimalagar, der mit 2 g/l
Glucose und 1 g/l β-Hydroxyasparaginsäure versetzt
ist, Spontanmutanten isoliert. Eine ausgewählte β-Hydroxyasparaginsäure-resistente
Einzelkolonie wird anschließend
auf Minimalagar, der 2 g/l Glucose und 0,2 g/l O-Methylthreonin
enthält,
bei 37°C
inkubiert. Eine als FE6-1 bezeichnete Mutante ist nach diesem Schritt resistent
gegen L-Valine, α-Ketoisovaleriansäure, β-Hydroxyasparaginsäure und
O-Methylthreonin. Eine Reinkultur des Stammes FE6-1 wurde am 8.
September 2000 als DSM13721 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) hinterlegt.
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Die
Plasmide pTrc99A und pTrc99A-adk werden einzeln in den Stamm FE6-1
transformiert und plasmidtragende Zellen werden auf LB Agar, der
mit 50 μg/ml
Ampicillin versetzt ist, selektiert. Die erhaltenen Stämme werden
als FE6-1/pTrc99A und FE6-1/pTrc99A-adk bezeichnet.
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Beispiel 3
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Herstellung von D-Pantothensäure mit
von FE6-1 abgeleiteten Stämmen
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Die
Pantothenat-Produktion der E. coli Stämme FE6-1/pTrc99A und FE6-1/pTrc99A-adk
wird in Batch-Kulturen von 10 ml, die in 100 ml Erlenmeyerkolben
enthalten sind, überprüft. Dazu
werden 10 ml Vorkulturmedium der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l
Hefeextrakt, 10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l KH2PO4, 0,5 g/l MgSO4·7H2O, 15 g/l CaCO3,
20 g/l Glucose, 50 mg/l Ampicillin, mit einer Einzelkolonie beimpft
und 20 Stunden lang bei 33°C
und 200 rpm auf einem ESR Inkubator der Kühner AG (Birsfelden, Schweiz)
inkubiert. Je 200 μl dieser
Vorkultur werden in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH4)2SO4, 2 g/l KH2PO4, 1 g/l MgSO4·7H2O, 0, 03 g/l FeSO4·7H2O, 0, 018 g/l MnSO4·1H2O, 30 g/l CaCO3,
20 g/l Glucose, 20 g/l β-Alanin,
250 mg/l Thiamin) überimpft,
und der Ansatz wird 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation
wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer
von Dr. Lange (Düsseldorf,
Deutschland) bei einer Messwellenlänge von 660 nm bestimmt.
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Anschließend wird
die Konzentration an gebildetem D-Pantothenat im abzentrifugierten Kulturüberstand
mittels Nochleistungsflüssigchromatographie
bestimmt [Säule: Reversed
Phase MZ-Aqua Perfect (Durchmesser 4,6 mm), mobile Phase 25 mM Acetatpuffer
mit 10% Methanol, Flussrate 1 ml/min, RI Detektor].
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In
Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
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Kurze Beschreibung der
Figur:
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1:
Karte des das adk-Gen enthaltenden Plasmids pTrc99A-adk.
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Längenangaben
sind als Zirkaangaben zu verstehen. Die verwendeten Abkürzungen
und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung:
- • Amp: Ampicillinresistenzgen
- • lacI:
Gen für
das Repressorprotein des trc-Promotors
- • Ptrc:
trc-Promotorregion, IPTG-induzierbar
- • adk:
Kodierregion des adk-Gens
- • 5S:
5S rRNA-Region
- • rrnBT:
rRNA-Terminator-Region
- • bps
Basenpaare
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Die
Abkürzungen
für die
Restriktionsenzyme haben folgende Bedeutung:
- • BamHI:
Restriktionsendonuclease aus Bacillus amyloliquefaciens
- • BstEII:
Restriktionsendonuclease aus Bacillus stearothermophilus ET
- • EcoRI:
Restriktionsendonuclease aus Escherichia coli
- • SalI:
Restriktionsendonuclease aus Streptomyces albus
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