SK18862001A3 - Gény Corynebacterium glutamicum kódujúce proteíny metabolických dráh - Google Patents

Description

Gény Corynebacteríum glutamicum kódujúce proteíny metabolických dráh

Oblasť techniky

Vynález sa týka génov Corynebacteríum glutamicum kódujúce proteíny metabolických dráh.

Príbuzné prihlášky

Táto prihláška si nárokuje prioritu z predošlej americkej predbežnej patentovej prihlášky č. 60/141031, podanej 25. júna 1999, americkej predbežnej patentovej prihlášky č. 60/142101, podanej 2. júla 1999, americkej predbežnej patentovej prihlášky č. 60/148613, podanej 12. augusta, 1999, a tiež z americkej predbežnej patentovej prihlášky č. 60/187970, podanej 9. marca 2000. Predložená prihláška si tiež nárokuje prioritu z nemeckej patentovej prihlášky č. 19930476.9, podanej 1. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931415.2, podanej 8. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931418.7, podanej 8. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931419.5, podanej 8. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931420.9, podanej 8. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931424.1, podanej 8. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky

19931428.4,	podanej	8.	júla,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
19931434.9,	podanej	8.	júla,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
19931435.7,	podanej	8.	júla,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
19931443.8,	podanej	8.	júla,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
19931453.5,	podanej	8.	júla,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
19931457.8,	podanej	8.	júla,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky

č. 19931465.9, podanej 8. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č.19931478.0, podanej 8. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931510.8, podanej 8.júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931541.8, podanej 8. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931573.6, podanej 8. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931592.2, podanej 8. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931632.5, podanej 8. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky

č. 19931634.1,	podanej	8.	júla,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19931636.8,	podanej	8.	júla,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19932125.6,	podanej	9.	júla,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19932126.4,	podanej	9.	júla,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky

19932130.2,	podanej	9. júla,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
19932186.8,	podanej	9. júla,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
19932206.6,	podanej	9. júla,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
19932227.9,	podanej	9. júla,	1999,	nemeckej patentovej prihlášky č.

19932228.7, podanej 9. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932229.5, podanej 9. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932230.9, podanej 9. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932922.2, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932926.5, podanej 14. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932928.1, podanej 14. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19933004.2, podanej 14. júla, 1999, nemeckej patentovej prihlášky

č. 19933005.0,	podanej	14. júla, 1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19933006.9,	podanej	14. júla, 1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19940764.9,	podanej	27	augusta,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19940765.7,	podanej	27	augusta,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19940766.5,	podanej	27	augusta,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19940832.7,	podanej	27	augusta,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19941378.9,	podanej	31	augusta,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19941379.7,	podanej	31	augusta,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19941380.0,	podanej	31	augusta,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19941394.0,	podanej	31	augusta,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19941396.7,	podanej	31	augusta,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19942076.9,	podanej	3.	septembra,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19942077.7,	podanej	3.	septembra,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19942079.3,	podanej	3.	septembra,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19942086.6,	podanej	3.	septembra,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19942087.4,	podanej	3.	septembra,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19942088.2,	podanej	3.	septembra,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky
č. 19942095.5,	podanej	3.	septembra,	1999,	nemeckej	patentovej	prihlášky

č. 19942124.2, podanej 3. septembra, 1999, a nemeckej patentovej prihlášky č. 19942129.3, podanej 3. septembra, 1999. Celý obsah všetkých vyššie uvedených prihlášok je tu týmto výslovne začlenený formou odkazu.

Doterajší stav techniky

Určité produkty a vedľajšie produkty prirodzených metabolických pochodov v bunkách majú široké priemyselné uplatnenie, vrátane potravinárskeho, krmovinárskeho, kozmetického a farmaceutického priemyslu. Do tejto skupiny molekúl súhrnne nazývaných ako „špeciálne chemikálie („fine chemicals“) patria organické kyseliny, aminokyseliny proteínového, respektíve neproteínového pôvodu, nukleotidy a nukleozidy, lipidy a mastné kyseliny, dioly, sacharidy, aromatické zlúčeniny, vitamíny a kofaktory, a enzýmy. Ich produkcia sa najvhodnejšie uskutočňuje prostredníctvom veľkého počtu kultúr baktérií vyvinutých na výrobu a sekréciu veľkého množstva konkrétne požadovanej molekuly. Jedným predovšetkým vhodným organizmom na tieto účely je grampozitívna, nepatogénna baktéria Corynebacterium glutamicum. Pomocou kmeňovej selekcie sa vyvinulo mnoho mutantných kmeňov, ktoré produkujú veľké množstvo požadovaných zlúčenín. Avšak selekcia kmeňov so zvýšenou produkciou danej molekuly je časovo náročný a ťažký proces.

Podstata vynálezu

Predmetom predloženého vynálezu sú nové molekuly bakteriálnych nukleových kyselín, ktoré majú rôznorodé použitia. Tieto zahŕňajú identifikáciu mikroorganizmov, ktoré sa dajú využiť na produkciu špeciálnych chemikálií, na moduláciu produkcie špeciálnych chemikálií v C. glutamicum alebo v príbuzných baktériách, na klasifikáciu alebo identifikáciu C. glutamicum alebo príbuzných baktérii, ako referenčné body pri mapovaní genómu C. glutamicum a ako markéry transformácie. Tieto nové molekuly nukleových kyselín kódujú proteíny, označované v tomto dokumente ako proteíny metabolických dráh (MP, metabolic pathway proteins).

C. glutamicum je grampozitívna aeróbna baktéria, ktorá sa bežne používa na priemyselnú výrobu rôznych špeciálnych chemikálií vo veľkom rozsahu a tiež na degradáciu uhľovodíkov (ako napríklad v prípadoch ropných únikov) a na oxidáciu terpenoidov. Molekuly MP nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sa preto dajú využiť na identifikáciu mikroorganizmov, ktoré sa môžu použiť na produkciu špeciálnych chemikálií, napríklad pomocou fermentačných procesov. Modulácia expresie MP nukleových kyselín podľa tohto vynálezu alebo modifikácia sekvencie MP molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sa môžu použiť na moduláciu produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z mikroorganizmu (napríklad na zlepšenie výťažku alebo produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z druhov Corynebacterium alebo Brevibacteríum).

MP nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu, sa dajú tiež použiť na identifikáciu takého organizmu akým je Corynebacterium glutamicum alebo veľmi príbuzného druhu, alebo na identifikáciu prítomnosti C. glutamicum alebo príbuzného druhu v zmiešanej populácii mikroorganizmov. Vynález poskytuje sekvencie nukleových kyselín mnohých génov C. glutamicum. Skúmaním extrahovanej genómovej DNA jednotnej kultúry alebo zmiešanej populácie mikroorganizmov v stringentných podmienkach so zameraním sa na takú oblasť C. glutamicum génu, ktorá je charakteristická pre tento organizmus, sa dá zistiť, či je tento organizmus prítomný. Hoci Corynebacterium glutamicum samotná je nepatogénna, dáva sa do súvisu s takými humánnymi patogénnymi druhmi ako Corynebacterium diphtheriae (spôsobujúcimi záškrt); detekcia takýchto organizmov má signifikantný klinický význam.

Molekuly MP nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sú aj referenčnými bodmi pri mapovaní C. glutamicum genómu alebo genómov príbuzných organizmov. Podobne sú tieto molekuly alebo ich variantné formy alebo ich časti markérmi pri génových manipuláciách s druhmi Corynebacterium alebo Brevibacteríum. MP proteíny kódované novými molekulami nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu sú napríklad schopné uskutočňovať enzýmový krok, ktorý je zapojený do metabolizmu určitých špeciálnych chemikálií, vrátane aminokyselín, vitamínov, kofaktorov, „nutraceutík”, nukleotidov, nukleozidov a trehalózy. Tým, že sa v Corynebacterium glutamicum môžu použiť klonovacie vektory, tak ako to opisujú Sinskey a kol. v americkom patentovom spise US 4,649,119, a metódy génovej manipulácie C. glutamicum a príbuzných druhov Brevibacteríum (napr. lactofermentum) (Yoshihama a kol., J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985); Katsumata a kol., J. Bacteriol. 159: 306- 311 (1984); a Santamaria a kol., J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246 (1984)), môžu sa molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu využiť pri génových manipuláciách tohto organizmu s cieľom zlepšiť alebo zefektívniť produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií.

Zvýšená produkcia alebo účinnosť produkcie špeciálnej chemikálie sa dá dosiahnuť priamou manipuláciou s génom podľa tohto vynálezu alebo nepriamym účinkom takejto manipulácie. Konkrétne, zmeny v C. glutamicum metabolických dráhach aminokyselín, vitamínov, kofaktorov, nukleotidov a trehalózy môžu mať priamy účinok na celkovú produkciu jednej alebo viacerých požadovaných zlúčenín z tohto organizmu. Napríklad optimalizáciou aktivity proteínu biosyntetickej dráhy lyzínu alebo znižovaním aktivity proteínu degradačnej dráhy lyzínu sa môže dosiahnuť zvýšenie výťažku alebo účinnosti produkcie lyzínu z takéhoto geneticky manipulovaného organizmu. Premenami proteínov zapojených do týchto metabolických dráh sa dá tiež nepriamo vplývať na produkciu alebo účinnosť produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie. Napríklad sa môže eliminovať reakcia, ktorá je kompetitívna pokiaľ ide o medziprodukt, potrebný na produkciu požadovanej molekuly, alebo sa môže optimalizovať dráha, potrebná na produkciu príslušného medziproduktu pre požadovanú zlúčeninu. Ďalej, moduláciami biosyntézy alebo degradácie, napríklad aminokyseliny, vitamínu alebo nukleotidu, sa môže zvýšiť celková schopnosť mikroorganizmu rýchle rásť a deliť sa, a tým sa zvýši množstvo a/alebo produkčné kapacity mikroorganizmu v kultúre a týmto spôsobom sa zvyšuje možný výťažok požadovanej špeciálnej chemikálie.

Molekuly nukleovej kyseliny a molekuly proteínu podľa tohto vynálezu sa môžu využiť na priame zvýšenie produkcie alebo účinnosti produkcie jednej alebo viacerých požadovaných špeciálnych chemikálií z Corynebacterium glutamicum. Použitím metód genetickej rekombinácie, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky, sa môže podľa tohto vynálezu jeden alebo viac biosyntetických alebo degradačných enzýmov aminokyselín, vitamínov, kofaktorov, „nutraceutík”, nukleotidov, nukleozidov alebo trahelózy manipulovať tak, že sa moduluje ich funkcia. Napríklad sa môže zvýšiť účinnosť biosyntetického enzýmu alebo sa jeho alostericky regulovaná oblasť môže poškodiť tak, že sa zabráni inhibícii produkcie zlúčeniny spätnou väzbou. Podobne sa degradačný enzým môže tiež deletovať alebo modifikovať pomocou substitúcie, delécie alebo adície, takže jeho degradačná aktivita sa zníži pre požadovanú zlúčeninu bez poškodenia životaschopnosti bunky. V každom prípade sa môže zvýšiť celkový výťažok alebo rýchlosť produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie.

Tiež je možné, že takéto zmeny v proteínových a nukleotidových molekulách podľa tohto vynálezu môžu okrem aminokyselín, vitamínov, kofaktorov, „nutraceutík“, nukleotidov, nukleozidov a trehalózy zvýšiť aj produkciu ďalších špeciálnych chemikálií nepriamymi mechanizmami. Metabolizmus každej jednej zlúčeniny je nevyhnutne poprepletaný s ďalšími biosyntetickými a degradačnými dráhami vo vnútri bunky a potrebné kofaktory, medziprodukty alebo substráty v jednej dráhe sú pravdepodobne dodávané alebo limitované inou takouto dráhou. A tak sa pomocou modulácie aktivity jedného alebo viacerých proteínov podľa tohto vynálezu môže ovplyvniť produkcia alebo účinnosť aktivity ďalšej biosyntetickej alebo degradačnej dráhy špeciálnej chemikálie. Napríklad, aminokyseliny sú štruktúrnymi jednotkami všetkých proteínov, avšak intracelulárne sa môžu nachádzať v množstvách, ktoré limitujú syntézu proteínov; a preto sa pomocou zvyšovania účinnosti produkcie alebo výťažkov jednej alebo viacerých aminokyselín vo vnútri bunky sa môžu oveľa ľahšie syntetizovať proteíny, ako napríklad biosyntetické alebo degradačné proteíny. Rovnako, takou zmenou v enzýmovej metabolickej dráhe, že príslušná bočná reakcia sa stáva viac alebo menej výhodnou, sa dá dosiahnuť zvýšená alebo znížená produkcia jednej alebo viacerých zlúčenín, ktoré sa využívajú ako medziprodukty alebo substráty na produkciu požadovanej špeciálnej chemikálie.

Predložený vynález poskytuje nové molekuly nukleovej kyseliny, ktoré kódujú proteíny označené v tomto dokumente ako proteíny metabolických dráh (MP), ktoré sú napríklad schopné uskutočňovať enzýmový krok zapojený do metabolizmu molekúl dôležitých pre normálne fungovanie buniek, ako napríklad aminokyselín, vitamínov, kofaktorov, nukleotidov a nukleozidov alebo trehalózy. Molekuly nukleovej kyseliny, ktoré kódujú MP proteín sa označujú v tomto dokumente ako MP molekuly nukleovej kyseliny. Vo výhodnom uskutočnení MP proteín uskutočňuje enzýmový krok týkajúci sa metabolizmu jednej alebo viacerých: aminokyselín, vitamínov, kofaktorov, „nutraceutík“, nukleotidov, nukleozidov a trehalózy. Príkladmi takýchto proteínov sú tie, ktoré sú kódované génmi uvedenými v tabuľke 1.

Vynález sa ďalej týka molekúl izolovaných nukleových kyselín (napr. cDNA, DNA alebo RNA) s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou MP proteín alebo jeho biologicky aktívne časti, ako aj fragmentov nukleových kyselín, ktoré sú vhodnými primérmi alebo hybridizačnými sondami na určenie alebo amplifikáciu MP kódujúcich nukleových kyselín (napr. DNA alebo mRNA). V predovšetkým výhodných uskutočneniach obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny jednu z nukleotidových sekvencií, ktorá je uvedená s nepárne očíslovanými sekvenciami

SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname (Sequence Listing) (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ...) alebo kódujúcu oblasť alebo komplementárny úsek jednej z týchto nukleotidových sekvencií. V ďalších predovšetkým výhodných uskutočneniach obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu nukleotidovú sekvenciu, ktorá sa hybridizuje na alebo je najmenej asi na 50 %, výhodne najmenej asi na 60 %, výhodnejšie najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % alebo dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológna s nukleotidovou sekvenciou uvedenou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 ...) alebo jej časťou. V iných výhodných uskutočneniach kóduje molekula izolovanej nukleovej kyseliny jednu z aminokyselinových sekvencií uvedených s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname napr. (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO;8 ...). Výhodné MP proteíny podľa tohto vynálezu majú tiež výhodne aspoň jednu z MP aktivít opísaných v tomto dokumente.

V ďalšom uskutočnení kóduje molekula izolovanej nukleove[kyseliny proteín alebo jeho časť, pričom proteín alebo jeho časť obsahuje takú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. takou, ktorá má párne očíslovanú sekvenciu SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), ktorá je napr. dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu tak, že proteín alebo jeho časť si udržuje MP aktivitu. Výhodne si proteín, alebo jeho časť, kódovaný molekulou nukleovej kyseliny, zachováva schopnosť uskutočniť enzýmovú reakciu v metabolickej dráhe pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu. V jednom uskutočnení je proteín kódovaný molekulou nukleovej kyseliny najmenej asi na 50 %, výhodne najmenej asi na 60 %, predovšetkým výhodne najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % a najvýhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s celou sekvenciou aminokyselín vybratou zo sekvencií s párne očíslovanými SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V inom výhodnom uskutočnení má proteín úplnú dĺžku proteínu C. glutamicum, ktorá je v podstate homológna s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (kódovanou systémom otvoreného čítania súboru uvedeného v príslušnom Sekvenčnom zázname s nepárne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...).

V ďalšom výhodnom uskutočnení je molekula izolovanej nukleovej kyseliny odvodená z C. glutamicum a kóduje proteín (napr. MP fúzny proteín), ktorý obsahuje biologicky aktívnu doménu, ktorá je najmenej asi na 50 % alebo viac homológna s jednou z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. s jednou sekvenciou z párne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) a má schopnosť katalyzovať reakciu v metabolickej dráhe pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu alebo má jednu alebo viac aktivít, ktoré sú uvedené v tabuľke 1, a ktoré tiež obsahujú heterológne sekvencie nukleových kyselín kódujúcich heterológne polypeptidové alebo regulačné oblasti.

V ďalšom uskutočnení má izolovaná molekula nukleovej kyseliny dĺžku aspoň 15 nukleotidov a hybridizuje sa v stringentných podmienkach s molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu podľa tohto vynálezu (napr. s nepárne očíslovanou sekvenciou v Sekvenčnom zázname). Výhodne sa izolovaná molekula nukleovej kyseliny zhoduje s prirodzene sa vyskytujúcou molekulou nukleovej kyseliny. Ešte výhodnejšie kóduje izolovaná nukleová kyselina prirodzene sa vyskytujúci MP proteín C. glutamicum alebo jeho biologicky aktívnu časť.

Vynález sa ďalej týka vektorov, napr. rekombinantných expresných vektorov obsahujúcich molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, a hostiteľských buniek, do ktorých sa takéto vektory zaviedli. V jednom uskutočnení sa takáto hostiteľská bunka použila na produkciu MP proteínu, a to kultiváciou hostiteľskej bunky vo vhodnom médiu. MP proteín sa potom môže izolovať z média alebo z hostiteľskej bunky.

Vynález sa ďalej ešte týka geneticky zmeneného mikroorganizmu, do ktorého sa zaviedol, alebo v ktorom sa modifikoval MP gén. V jednom uskutočnení sa zmenil genóm mikroorganizmu zavedením molekuly nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, kódujúcej „divý“ (wild) typ sekvencie alebo zmutovanej MP sekvencie ako transgénu. V ďalšom uskutočnení bol endogénny MP gén v rámci genómu mikroorganizmu zmenený, napr. funkčne narušený homológnou rekombináciou so zmeneným MP génom. V ďalšom uskutočnení sa endogénny alebo zavedený MP gén v mikroorganizme menil mutáciami, deléciami alebo inverziami v jednom alebo viacerých bodoch, ale stále kódoval funkčný MP proteín.

V ešte ďalšom uskutočnení sa jedna alebo viac regulačných oblasti (napr. promótor, represor alebo induktor) MP génu v mikroorganizme zmenila (napr. deléciou, trunkáciou, inverziou alebo bodovou mutáciou) tak, že expresia MP génu sa modulovala. Vo výhodnom uskutočnení patrili mikroorganizmy do rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium, pričom rod Corynebacterium glutamicum bol predovšetkým výhodný. Vo výhodnom uskutočnení sa mikroorganizmus tiež použil na produkciu požadovanej zlúčeniny, napríklad aminokyseliny, predovšetkým výhodne lyzínu.

Vynález sa ďalej týka spôsobu na identifikáciu prítomnosti alebo aktivity Corynebacterium diphtheriae v subjekte. Tento spôsob sa týka detekcie jednej alebo viacerých sekvencií nukleových kyselín alebo aminokyselín podľa tohto vynálezu (napr. sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname ako SEQ ID NO: 1 až 1156) v subjekte, čím sa deteguje prítomnosť alebo aktivita Corynebacterium diphtheriae v subjekte.

Vynález sa ešte ďalej týka izolovaného MP proteínu alebo jeho časti, napr. jeho biologicky aktívnej časti. Vo výhodnom uskutočnení izolovaný MP proteín alebo jeho časť môže katalyzovať enzýmovú reakciu zapojenú do jednej alebo viacerých metabolických dráh pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu. V inom výhodnom uskutočnení je izolovaný MP proteín alebo jeho časť dostatočne homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s párne očíslovanou sekvenciou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), takže proteín alebo jeho časť si udržiava schopnosť katalyzovať enzýmovú reakciu zapojenú do jednej alebo viacerých metabolických dráh pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu.

Vynález tiež poskytuje izolovaný preparát MP proteínu. Vo výhodných uskutočneniach má MP proteín aminokyselinovú sekvenciu podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciu s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname).

V inom výhodnom uskutočnení sa vynález týka celej dĺžky izolovaného proteínu,

1ο ktorý je v podstate homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) (ktorá je kódovaná otvoreným systémom čítania prislúchajúcou SEQ ID NO: uvedenou s nepárnym očíslovaním v Sekvenčnom zázname). V ešte inom uskutočnení je proteín najmenej asi na 50 %, výhodne najmenej asi na 60 % a výhodnejšie najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % a najvýhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológny s úplnou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. so sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V iných uskutočneniach má izolovaný MP proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je homológna najmenej na 50 % alebo viac s aminokyselinovými sekvenciami podľa tohto vynálezu (napr. so sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) a je schopný katalyzovať enzýmovú reakciu metabolickej dráhy pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu alebo má jednu alebo viac aktivít, ktoré sú uvedené v tabuľke 1.

Alternatívne môže izolovaný MP proteín obsahovať takú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach alebo je najmenej asi na 50 %, výhodne najmenej asi na 60 % a výhodnejšie najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % a dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológne s jednou nukleotidovou sekvenciou z párne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO uvedených v Sekvenčnom zázname. Je tiež výhodné, ak výhodné formy MP proteínov majú tiež jednu alebo viac MP bioaktivít, ktoré sa uvádzajú v tomto dokumente.

MP polypeptid alebo jeho biologicky aktívna časť sa môže funkčne spojiť s peptidom, ktorý nemá MP aktivitu za vzniku fúzneho proteínu. Vo výhodných uskutočneniach má tento fúzny proteín odlišné aktivity v porovnaní so samotným MP proteínom. V ďalších výhodných uskutočneniach spôsobuje tento fúzny proteín po zavedení do C. glutamicum metabolickej dráhy pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“ zvýšené výťažky a/alebo účinnosť produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie z C. glutamicum. V predovšetkým výhodných uskutočneniach sa integrovaním tohto fúzneho proteínu do metabolickej dráhy pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu v hostiteľskej bunke moduluje produkcia požadovanej zlúčeniny z bunky.

Vynález sa ďalej týka spôsobu skríningu molekúl, ktoré modulujú aktivitu MP proteínu buď pomocou interakcie so samotným proteínom alebo substrátom alebo väzobným partnerom MP proteínu alebo pomocou modulácie transkripcie alebo translácie molekuly MP nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu.

Vynález sa ďalej týka spôsobu produkcie špeciálnej chemikálie. Tento spôsob spočíva v kultivácii bunky obsahujúcej vektor, ktorý riadi expresiu molekuly MP nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu tak, aby sa produkovala špeciálna chemikália. Vo výhodnom uskutočnení tento spôsob v ďalšom zahŕňa krok získavania bunky obsahujúcej takýto vektor, pričom pri tomto spôsobe sa bunka transfekuje s vektorom riadiacim expresiu MP nukleovej kyseliny. V inom výhodnom uskutočnení zahŕňa okrem toho tento spôsob krok získavania špeciálnej chemikálie z kultúry. V predovšetkým výhodnom uskutočnení sa použila bunka rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium, alebo sa vybrala z kmeňov, ktoré sú uvedené v tab. 3.

Vynález sa ďalej týka spôsobov modulovania produkcie molekuly z mikroorganizmu. Takéto spôsoby zahŕňajú spôsoby kontaktovania bunky s agensom, ktorý moduluje aktivitu MP proteínu alebo expresiu MP nukleovej kyseliny tak, že bunková aktivita sa mení v porovnaní s rovnakou aktivitou v neprítomnosti agensa. Vo výhodnom uskutočnení sa bunka moduluje na jednu alebo viac C. glutamicum metabolických dráh pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu tak, že výťažky alebo rýchlosť produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie týmto mikroorganizmom sa zvýšia. Agensom, ktorý moduluje aktivitu MP proteínu môže byť agens, ktorý stimuluje aktivitu MP proteínu alebo expresiu MP nukleovej kyseliny. Príkladmi agensov, ktoré stimulujú aktivitu MP proteínu alebo expresiu MP nukleovej kyseliny sú malé molekuly, aktívne MP proteíny a nukleové kyseliny kódujúce MP proteíny, ktoré boli zavedené do bunky. Príkladmi agensov, ktoré inhibujú MP aktivitu alebo expresiu sú malé molekuly a nezmyselné (antisense) molekuly MP nukleovej kyseliny.

2

Vynález sa ďalej týka spôsobov modulovania výťažkov požadovanej zlúčeniny z bunky, medzi ktoré patrí zavádzanie „divého“ typu alebo mutovaného MP génu do bunky, buď udržiavaného na separátnom plazmide alebo integrovaného do genómu hostiteľskej bunky. Pri integrácii do genómu môže nastať náhodná integrácia alebo homológna rekombinácia, takže natívny gén sa nahradí zavedenou kópiou a spôsobí produkciu požadovanej zlúčeniny bunkou, ktorá sa má modulovať. Vo výhodnom uskutočnení sa uvedené výťažky zvyšujú. V inom výhodnom uskutočnení je vyššie uvedenou chemikáliou špeciálna chemikália. V predovšetkým výhodnom uskutočnení je vyššie uvedenou špeciálnou chemikáliou aminokyselina. V obzvlášť výhodných uskutočneniach je uvedenou aminokyselinou L-lyzín.

Podrobný opis vynálezu

Predložený vynález poskytuje molekuly MP nukleovej kyseliny a molekuly MP proteínu, ktoré sú zapojené do metabolizmu určitých špeciálnych chemikálií v Corynebacterium glutamicum, vrátane aminokyselín, vitamínov, kofaktorov, „nutraceutík“, nukleotidov, nukleozidov a trehalózy. Molekuly podľa tohto vynálezu sa môžu využiť na moduláciu produkcie špeciálnych chemikálií z mikroorganizmov, ako napríklad C. glutamicum, a to buď priamo (napr. tam, kde modulácia aktivity proteínu biosyntézy lyzínu má priamy vplyv na produkciu alebo účinnosť produkcie lyzínu z toho organizmu) alebo môžu mať nepriamy vplyv, ktorý predsa však spôsobuje zvýšený výťažok alebo účinnosť produkcie požadovanej zlúčeniny (napr. tam, kde modulácia aktivity proteínu biosyntézy nukleotidov má vplyv na produkciu organickej kyseliny alebo mastnej kyseliny z baktérie, snáď v dôsledku zvýšeného rastu alebo zvýšeného dodávania potrebných ko-faktorov, energetických zlúčenín alebo prekurzorových molekúl). Aspekty vynálezu sú vysvetlené v ďalšom texte.

I. Špeciálne chemikálie

Pojem „špeciálne chemikálie“ je zaužívaný technický pojem a zahŕňa molekuly produkované organizmom, ktoré majú rôznorodé priemyselné použitia, v takých priemyselných odvetviach, ale nielen v nich, akými sú farmaceutický, poľnohospodársky a kozmetický priemysel. Tieto zlúčeniny zahŕňajú také organické kyseliny, ako kyselinu vínnu, kyselinu itakonovú a kyselinu diaminopimelovú, aminokyseliny proteínového aj neproteínového pôvodu, purínové a pyrimidínové bázy, nukleozidy a nukleotidy (ako sa to opisuje napr. v Kuninaka, A. (1966), Nucleotides and related compounds, str. 561-612, v Biotechnology vol. 6, Rehm a kol., eds. VCH, Weinheim a v odkazoch tam uvedených), lipidy, nasýtené aj nenasýtené mastné kyseliny (napr. kyselinu arachidonovú), dioly (napr. propándiol a butándiol), sacharidy (napr. kyselinu hyalurónovú a trehalózu), aromatické zlúčeniny (napr. aromatické amíny, vanilín a indigo), vitamíny a kofaktory (podľa opisu v Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, „Vitamins“, str.. 443-613 (1996) VCH: Weinheim, a v odkazoch tam uvedených), a v Ong, A.S., Niki, E.& Packer, L. (1995) „Nutrition, Lipids, Health and Disease“ Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and Society for Free Radical Research - Asia, konanej 1. - 3. septembra 1994 v Penang, Malajzia, AOCS Press, (1995)), enzýmy, polyketidy (Čane a kol., (1998) Science 282, 63-68) a všetky ďalšie chemikálie opísané v Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 a v odkazoch tam uvedených. Metabolizmus a použitie určitých špeciálnych chemikálií sa vysvetľuje v ďalšom texte.

A. Metabolizmus aminokyselín a použitia

Základnými štruktúrnymi jednotkami všetkých proteínov sú aminokyseliny a ako také sú esenciálne pre normálnu bunkovú činnosť vo všetkých organizmoch. Pojem „aminokyselina“ je zaužívaný technický pojem. Aminokyseliny proteínového pôvodu, ktorých je 20 druhov, sú štruktúrnymi jednotkami proteínov, v ktorých sú viazané peptidovými väzbami, kým aminokyseliny neproteínového pôvodu (ktorých sú známe stovky) sa spravidla nevyskytujú v proteínoch (pozri Ulmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, str. 57-97 VCH, Weinheim (1985)). Aminokyseliny môžu byť v D- alebo L-optickej konfigurácii, i keď L- aminokyseliny sú vo všeobecnosti jediný druh, ktorý sa zistil v prirodzene sa vyskytujúcich proteínoch. Biosyntetické a degradačné dráhy každej z 20 aminokyselín proteínového pôvodu sú dobre charakterizované v prokaryotických ako aj v eukaryotických bunkách (pozri napr. Stryer, L. Biochemistry, 3. vydanie, strany 578-590 (1988)). „Esenciálne“ aminokyseliny (histidín, izoleucín, leucín, lyzín, metionín, fenylalanin, treonín, tryptofán a valín), ktoré sa takto nazývajú, pretože sú všeobecnou nutritívnou požiadavkou z dôvodu zložitosti ich biosyntéz, sa ľahko jednoduchými biosyntetickými dráhami menia na ostatných 11 „neesenciálnych“ aminokyselín (alanín, arginín, asparagín, aspartát (kyselina asparágová), cysteín, glutamát (kyselina glutámová), glutamín, glycín, prolín, serín atyrozín). Vyššie živočíchy si udržiavajú schopnosť syntetizovať niektoré z týchto aminokyselín, ale esenciálne aminokyseliny sa musia dodať výživou, aby mohla prebiehať normálna biosyntéza. proteínov.

Bez ohľadu na ich funkciu v biosyntéze proteínov, sú tieto aminokyseliny zaujímavé chemikálie so sebe vlastnými schopnosťami a mnohé našli uplatnenie v rôznych aplikáciách v potravinárskom, krmovinárskom, chemickom, kozmetickom, poľnohospodárskom a farmaceutickom priemysle. Lyzin je dôležitá aminokyselina nielen vo výžive ľudí, ale aj monogastrických živočíchov ako hydiny a ošípaných. Glutamát sa najčastejšie používa ako chuťová prísada (glutamát sodný), (mono-sodium glutamate, MSG) a používa sa vo veľkom rozsahu v rámci potravinárskeho priemyslu, tak ako aj aspartát, fenylalanín, glycín a cysteín. Glycín, L-metionín a tryptofán sa využívajú vo farmaceutickom priemysle. Glutamín, valín, leucín, izoleucín, histidín, arginín, prolín, serín a alanín sa používajú aj vo farmaceutickom aj v kozmetickom priemysle. Treonín, tryptofán a D/L-metionín sú bežnými kŕmnymi aditívami (Leuchtenberger, W. (1996) Amino aids - technical production and use, str. 466-502 v Rehm a kol., (eds.) Biotechnology vol. 6, chapter 14a, VCH, Weinheim), Okrem toho sa zistilo, že tieto aminokyseliny sú vhodnými prekurzormi na syntézu syntetických aminokyselín a proteínov, ako N-acetylcysteínu, S-karboxymetyl-L-cysteínu, (S)-5hydroxytryptofánu a ďalších, ktoré sa opisujú v Ulmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, str.. 57-97, VCH, Weinheim, 1985.

Biosyntéza týchto prírodných aminokyselín, takými organizmami schopnými ich produkcie ako sú baktérie, je dobre známa (pozri prehľad o bakteriálnej biosyntéze aminokyselín a jej regulácii Umbarger, H. E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47, 533-606). Glutamát sa syntetizuje redukčnou amináciou a-ketoglutarátu, medziproduktu v cykle kyseliny citrónovej. Glutamín, aj prolín a arginín vznikajú potom z glutamátu. Biosyntéza serínu je trojkrokový proces, ktorý sa začína od 3fosfoglycerátu (medziproduktu pri glykolýze) a končí touto aminokyselinou po kroku oxidácie, transaminácie a hydrolýzy. Aj cysteín aj glycín vznikajú zo serínu; cysteín kondenzáciou homocysteínu so serínom a glycín prenosom bočného reťazca βuhlíkového atómu na tetrahydrofolát reakciou, ktorú katalyzuje seríntranshydroxymetyláza. Fenylalanín a tyrozín sa syntetizujú z glykolytických a pentózofosfátových prekurzorov erytrózo-4-fosfátu a fosfoenolpyruvátu 9krokovou biosyntetickou dráhou, ktorá sa líši len v konečných dvoch krokoch po syntéze prefenátu. Tryptofán vzniká tiež z týchto dvoch počiatočných molekúl, ale jeho syntéza je 11- kroková dráha. Tyrozín sa môže tiež syntetizovať z fenylalanínu reakciou, ktorú katalyzuje fenylalanínhydroxyláza. Alanín, valín a aj leucín sú biosyntetické produkty pyruvátu, konečného produktu glykolýzy. Aspartát vzniká z oxalacetátu, medziproduktu cyklu kyseliny citrónovej. Asparagín, metionín, treonín a aj lyzín vznikajú konverziou aspartátu. Izoleucín vzniká z treonínu. Zložitá 9-kroková cesta končí vznikom histidínu z 5-fosforibozyl-1-pyrofosfátu, aktivovaného sacharidu.

Viac aminokyselín ako je potrebných na syntézu proteínov sa nemôže uchovávať v bunke a namiesto toho sa degradujú, pričom poskytujú medziprodukty pre hlavné metabolické dráhy bunky (pozri prehľad Stryer, L. Biochemistry 3. ed., Ch. 21 „Amino Acid Degradation and Urea Cycle“str. 495-516 (1988)). Hoci bunka je schopná premieňať nežiaduce aminokyseliny na užitočné metabolické medziprodukty, je produkcia aminokyselín z energetického hľadiska náročná, vyžaduje prekurzorové molekuly a enzýmy na ich syntézu. Tak nie je prekvapujúce, že biosyntéza aminokyselín je regulovaná inhibíciou spätnou väzbou, pri ktorej prítomnosť určitej aminokyseliny spôsobí spomalenie alebo celkom zastavenie jej produkcie (pozri súhrn o mechanizmoch spätnej väzby v aminokyselinových biosyntetických dráhach v Stryer, L. Biochemistry, 3. ed. Ch. 24: Biosynthesis of Amino Acids and Heme‘'str. 575-600 (1988)). Takto je produkcia každej jednotlivej aminokyseliny limitovaná množstvom tej aminokyseliny, ktorá je prítomná v bunke.

B. Metabolizmus vitamímov, kofaktorov a „nutraceutík“ a použitia

Vitamíny, kofaktory a nutraceutiká predstavujú ďalšiu skupinu molekúl, ktorých schopnosť syntézy vyššie živočíchy stratili, a tak sa musia prijímať potravou, i keď iné organizmy, napríklad baktérie, ich ľahko syntetizujú. Tieto molekuly sú buď bioaktívnymi látkami, alebo sú prekurzormi biologicky aktívnych látok, ktoré sú prenášačmi elektrónov alebo sú medziproduktami v rozmanitých metabolických dráhach. Okrem ich nutritívnej hodnoty majú tieto zlúčeniny tiež signifikantnú priemyselnú hodnotu ako farbivá, antioxidanty a katalyzátory alebo iné technologické pomocné látky. (Pozri napr. súhrn o štruktúre, aktivite a priemyselných aplikáciách týchto zlúčenín v Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, „Vitamins“ vol. A27, str. 443-613, VCH, Weinheim, 1966). Pojem „vitamín“ je zaužívaný technický pojem a zahŕňa živiny, ktoré organizmus potrebuje na normálne fungovanie, ale ktoré si organizmus nevie sám syntetizovať. Do skupiny vitamínov možno zahrnúť kofaktory a „nutraceutické“ zlúčeniny. Pojem „kofaktor“ predstavuje zlúčeniny neproteínového pôvodu, ktoré sú potrebné na normálnu enzymatickú aktivitu. Tieto zlúčeniny môžu byť organické alebo anorganické; kofaktorové molekuly v predloženom vynáleze sú výhodne organické. Pojem „nutraceutikum“ zahŕňa potravinové doplnky, ktoré majú užitočný vplyv na zdravotný stav rastlín, zvierat a hlavne ľudí. Príkladmi takýchto molekúl sú vitamíny, antioxidanty a tiež niektoré lipidy (napr. polynenasýtené mastné kyseliny).

Biosyntéza týchto molekúl v organizmoch, ktoré sú schopné ich produkcie, napríklad v baktériách, je zoširoka opísaná (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, „Vitamins“ vol. A27,str. 443-613, VCH, Weinheim, 1966; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways, An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A. S., Niki, E & Packer, L (1995) „Nutrition, Lipids, Health and Disease“ Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research - Asia, konanej 1,- 3. septembra 1994 v Penang, Malajzia, AOCS Press, Champaign, ILX, 374 S).

Tiamín (vitamín B^ sa tvorí chemickým viazaním podielov pyrimidínu a tiazolu. Riboflavín (vitamín B₂) sa syntetizuje z guanozín-5'-trifosfátu (GTP) a ribóza-5'-fosfátu. Riboflavín sa využíva na syntézu flavínmononukleotidu (FMN) a flavínadeníndinukleotidu (FAD). Rodina zlúčenín so spoločným názvom „vitamín B₆ (napr. pyridoxín, pyridoxamín, pyridoxal-5'-fosfát a komerčne používaný pyridoxín hydrochlorid) sú všetko deriváty spoločnej štruktúrnej jednotky, 5hydroxy-6-metylpyridínu. Pantotenát (kyselina pantoténová, (R)-(+)-N-(2,4dihydroxy-3,3-dimetyl-1-oxobutyl)-3-alanín) sa môže vyrábať buď chemickou syntézou alebo fermentačne. Konečné kroky pri biosyntéze kyseliny pantoténovej pozostávajú z ATP-riadenej kondenzácie β-alanínu a kyseliny pantoovej. Enzýmy zodpovedné za biosyntetické kroky konverzie na kyselinu pantoovú, β-alanín a za kondenzáciu na kyselinu pantoténovú sú známe. Metabolický aktívna forma pantotenátu je koenzým A, ktorého biosyntéza je 5 krokový enzymatický postup. Pantotenát, pyridoxal-5'-fosfát, cysteín aATP sú prekurzory koenzýmu A. Tieto enzýmy, nielenže katalyzujú tvorbu pantotenátu, ale tiež produkujú kyselinu (R)pantoovú, (R)-pantolaktón, (R)-pantenol (provitamín B₅.), pantetein (a jeho deriváty) a koenzým A.

Biosyntéza biotínu z prekurzorovej molekuly pimeloyl-CoA v mikroorganizmoch sa detailne študovala a identifikovali sa niektoré gény zapojené do tohto procesu. Zistilo sa, že mnohé príslušné proteíny sú tiež zapojené do syntézy Fe-clasteru a sú členmi nifS triedy proteínov. Kyselina lipoová je odvodená z kyseliny oktánovej a je koenzýmom v energetickom metabolizme, ktorý je súčasťou pyruvátdehydrogenázového komplexu a aketoglutarátdehydrogenázového komplexu. Foláty sú skupinou látok, ktoré sú všetky derivátmi kyseliny listovej, ktorá je samotná odvodená z kyseliny Lglutámovej, p-aminobenzoovej kyseliny a 6-metylpterínu. Biosyntéza kyseliny listovej a jej derivátov, začínajúca sa od metabolických medziproduktov guanozín5'-trifosfátu (GTP), L- glutámovej kyseliny a kyseliny p-aminobenzoovej, sa podrobne skúmala v určitých mikroorganizmoch.

Korinoidy (ako kobalamíny a predovšetkým vitamín B₁₂) a porfyríny patria do skupiny chemikálií vyznačujúcich sa tetrapyrolovým kruhovým systémom. Biosyntéza vitamínu B₁₂ je tak zložitá, že nie je úplne charakterizovaná, ale mnohé enzýmy a substráty zapojené do biosyntézy sú už známe. Kyselina nikotínová (nikotinát) a nikotínamid sú pyridínové deriváty, ktoré sa tiež označujú ako „niacín“. Niacín je prekurzorom dôležitých koenzýmov NAD (nikotínamidadeníndinukleotidu) a NADP (nikotínamidadeníndinukleotidfosfátu) a ich redukovaných foriem.

Výroba týchto chemikálií vo veľkom rozsahu je väčšinou odkázaná na bezbunkové chemické syntézy, i keď niektoré tieto chemikálie, ako riboflavín, vitamín Bô, pantotenát a biotín, sa tiež vyrobili kultiváciou mikroorganizmov vo veľkom rozsahu. Len vitamín B₁₂ sa vyrába výhradne fermentačne, a to kvôli zložitosti jeho syntézy. In vitro metodológie vyžadujú značné materiálové vstupy a čas, často pri vysokých nákladoch.

8

C. Metabolizmus purínov, pyrimidínov, nukleozidov a nukleotidov a použitia

Gény metabolizmu purínov a pyrimidínov a im prislúchajúce proteíny sú významými cieľmi terapie nádorových ochorení a vírusových infekcií. Pojem „purín alebo pyrimidín“ označuje dusíkaté bázy, ktoré sú zložkami nukleových kyselín, koenzýmov a nukleotidov. Názov „nukleotid“ zahrňuje základné štruktúrne jednotky molekúl nukleových kyselín, ktoré pozostávajú z dusíkatej bázy, pentózového sacharidu (v prípade RNA je sacharidom ribóza; v prípade DNA je sacharidom Ddeoxyribóza) a kyseliny fosforečnej. Pojem „nukleozid“ zahŕňa molekuly, ktoré sú prekurzormi nukleotidov, ale ktoré neobsahujú ako zložku kyselinu fosforečnú, túto obsahujú nukleotidy. Inhibovaním biosyntézy týchto molekúl, alebo ich aktivovaním na tvorbu molekúl nukleových kyselín, sa dá inhibovať syntéza RNA a DNA; inhibovaním tejto aktivity spôsobom cieleným na karcinogénne bunky sa môže inhibovať schopnosť nádorových buniek deliť sa a replikovať sa. Navyše sú to nukleotidy, ktoré nevytvárajú molekuly nukleových kyselín, ale skôr fungujú ako energetické zásoby (t.j. AMP) alebo ako koenzýmy (t.j. FAD a NAD).

Niekoľko publikácií opisuje použitie týchto chemikálií na lekárske indikácie pomocou ovplyvňovania purínového a /alebo pyrimidínového metabolizmu (napr. Christopherson, R. I. and Lyons, S. D. (1990) „Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents“ Med. Res. Reviews, 10, 505-548). Výskumy enzýmov zapojených do purínového a pyrimidínového metabolizmu sa zamerali na vývoj nových liečiv, ktoré by sa mohli použiť napríklad ako imunosupresíva alebo antiproliferatiká (Smith, J. L., (1995) „Enzymes in nucleotide synthesis“ Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 752-757; (1995) Biochem Soc. Transact. 23, 877-902). Avšak purínové a pyrimidínové bázy, nukleozidy a nukleotidy majú ďalšie využitia: ako medziprodukty pri biosyntéze viacerých špeciálnych chemikálií (napr. tiamínu, S-adenozyl-metionínu, folátov alebo riboflavínu), ako bunkové energetické prenášače (napr. ATP alebo GTP) a ako samotné chemikálie sa bežne používajú ako prostriedky na zvýraznenie chuti a vône (napr. IMP alebo GMP) alebo vo viacerých lekárskych aplikáciách (pozri napr. Kunianaka, A. (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology, vol.6, Rehm a kol., VCH, Weiheim, str. 561-612). Taktiež enzýmy, podieľajúce sa na metabolizme purínov, pyrimidínov, nukleozidov alebo nukleotidov čoraz viac slúžia ako ciele, proti ktorým boli vyvinuté chemikálie na ochranu poľnohospodárskych plodín ako fungicidy, herbicídy a insekticídy.

Metabolizmus týchto zlúčenín sa charakterizoval v baktériách (pozri napr. prehľad Zalkin, H. and Dixon, J. E. (1992) „de novo purine nucleotíde biosynthesis“, v Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, vol. 42, Academic Press, str. 259-287; a Michal, G. (1999) „Nucleotides and Nucleosides“, Chapter8 v Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York). Purínový metabolizmus bol predmetom intenzívneho výskumu a je esenciálny pre normálne fungovanie bunky. Oslabený purínový metabolizmus môže u vyšších živočíchov spôsobovať závažné choroby ako napríklad dnu. Purínové nukleotidy sa syntetizujú z ribóza- 5-fosfátu sériovými krokmi cez medziproduktovú zlúčeninu inozín-5'-fosfát (IMP), končiacimi vznikom guanozín5'-monofosfátu (GMP) alebo adenozín-5'-monofosfátu (AMP), z ktorých sa ľahko vytvárajú trifosfátové formy využiteľné ako nukleotidy. Tieto zlúčeniny sa tiež využívajú ako energetické zásoby, pretože ich degradácia poskytuje energiu pre mnoho rôznych biochemických procesov v bunke. Biosyntéza pyrimidínov pokračuje tvorbou urídín-5'-monofosfátu (UMP) z ribóza-5'-fosfátu. UMP sa zase konvertuje na cytidín-5'-trifosfát (CTP). Deoxy-formy všetkých týchto nukleotidov vznikajú jednokrokovou redukčnou reakciou z difosfátribózovej formy nukleotidu na difosfátdeoxyribózovú formu nukleotidu. Na základe fosforylácie sú tieto molekuly schopné podieľať sa na syntéze DNA.

D. Metabolizmus trehalózy a použitia

Trehalóza pozostáva z dvoch glukózových molekúl spojených α,α-1,1 väzbou. Zvyčajne sa používa v potravinárskom priemysle ako sladidlo, aditívum pre sušené alebo mrazené potraviny a v nápojoch. Ale uplatňuje sa tiež vo farmaceutickom, kozmetickom a biotechnologickom priemysle (pozri napr. Nishimoto a kol., (1998) americký patentový spis č. US 5,759,610; Singer, M.A. and Lindquist, S. (1998) Trends Biotech., 16, 460-467; Paiva, C.L.A. a Panek, A:D. (1996) Biotech. Ann. Rev., 2., 293 - 314; a Shiosaka, M. (1977) J. Japan 172, 97 102). Trehalózu produkujú pomocou enzýmov mnohé mikroorganizmy a prirodzene sa vylučuje do okolitého média, z ktorého sa môže izolovať metódami známymi v danej oblasti techniky.

II. Pojmy a spôsoby vynálezu

Predložený vynález je založený, aspoň sčasti, na objave nových molekúl, uvádzaných v tomto dokumente ako molekuly MP nukleovej kyseliny a molekuly MP proteínu, ktoré zohrávajú úlohu alebo majú funkciu v jednej alebo viacerých bunkových metabolických dráhach. V jednom uskutočnení katalyzujú MP molekuly enzýmovú reakciu zapojenú do metabolických dráh pre jednu alebo viaceré aminokyseliny, vitamíny, kofaktory, „nutraceutiká”, nukleotidy, nukleozidy alebo trehalózu. Vo výhodnom uskutočnení má aktivita MP molekúl podľa predloženého vynálezu v jednej alebo viacerých C. glutamicum metabolických dráhach aminokyselín, vitamínov, kofaktorov, „nutraceutík”, nukleotidov, nukleozidov alebo trehalózy vplyv na produkciu požadovanej špeciálnej chemikálie týmto organizmom. V predovšetkým výhodnom uskutočnení sú MP molekuly podľa tohto vynálezu modulované na aktivitu tak, že metabolické dráhy v C. glutamicum, do ktorých sú MP proteíny podľa tohto vynálezu zapojené, sú modulované na účinnosť alebo výkon, ktorý buď priamo alebo nepriamo moduluje produkciu alebo účinnosť produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie z C. glutamicum.

Pojem „MP“ proteín“ alebo „MP polypeptid“ zahrňuje proteíny, ktoré sa podieľajú t.j. katalyzujú enzýmovú reakciu v jednej alebo viacerých C. glutamicum metabolických dráhach aminokyselín, vitamínov, kofaktorov, „nutraceutík”, nukleotidov, nukleozidov alebo trehalózy. Príklady MP proteínov zahrňujú tie, ktoré sú kódované MP génmi, uvedenými v tabuľke 1 a tie, ktoré sú kódované nepárne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO. Pojmy „MP gén“ alebo „MP sekvencia nukleovej kyseliny“ zahŕňajú sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce MP proteín, ktoré sa skladajú z kódujúcej oblasti a tiež príslušných netranslatovaných 5'-a 3'sekvenčných oblastí. Príklady MP génov sú uvedené v tabuľke 1. Pojmy „produkcia“ alebo „produktivita“ sú známe v danej oblasti techniky a zahŕňajú koncentráciu fermentačného produktu (napríklad požadovanej špeciálnej chemikálie), ktorý sa vytvoril za stanovený čas a v stanovenom fermentačnom objeme (napr. kg produktu za hodinu na liter). Pojem „účinnosť produkcie“ znamená čas, ktorý je potrebný na to, aby sa dosiahla príslušná produkcia (napríklad, ako dlho trvá bunke dosiahnutie príslušnej rýchlosti produkovania špeciálnej chemikálie). Pojem „výťažok“ alebo „výťažok produkt/uhlík“ je známy v danej oblasti techniky a znamená účinnosť konverzie zdroja uhlíka na produkt (t.j.

špeciálnu chemikáliu). Toto sa bežne uvádza napríklad ako kg produktu na kg zdroja uhlíka. Zvyšovaním výťažku alebo produkcie zlúčeniny sa množstvo získaných molekúl alebo úspešne získaných molekúl tejto zlúčeniny v stanovenom množstve kultúry v stanovenom čase zvyšuje. Pojmy „biosyntéza“ alebo „biosyntetická dráha“ sú známe v danej oblasti techniky a znamenajú syntézu zlúčeniny, výhodne organickej zlúčeniny, bunkou z medziproduktových zlúčenín, čo môže byť viackrokový a vysoko regulovaný proces. Pojmy „degradácia“ alebo „degradačná dráha“ sú známe v danej oblasti techniky a znamenajú rozklad zlúčeniny, výhodne organickej zlúčeniny, bunkou na degradačné produkty (všeobecne povedané, menšie alebo menej zložité molekuly), ktorý môže byť viackrokový a vysoko regulovaný proces. Pojem „metabolizmus“ je známy v danej oblasti techniky a znamená súhrn biochemických reakcií, ktoré sa uskutočňujú v organizme. Metabolizmus príslušnej zlúčeniny (napr. metabolizmus aminokyseliny glycínu) zahrňuje potom celkové biosyntetické, modifikačné a degradačné dráhy v bunke týkajúce sa tejto zlúčeniny.

V ďalšom uskutočnení sú MP molekuly podľa tohto vynálezu schopné modulovať produkciu požadovanej molekuly, ako napríklad špeciálnej chemikálie, v takom mikroorganizme ako je C. glutamicum. Použitím metód genetickej rekombínácie sa môže podľa tohto vynálezu jeden alebo viac biosyntetických alebo degradačných enzýmov aminokyselín, vitamínov, kofaktorov, „nutraceutík”, nukleotidov, nukleozidov alebo trehalózy manipulovať tak, že sa moduluje ich funkcia. Napríklad sa môže zvýšiť účinnosť biosyntetického enzýmu alebo sa jeho alostericky regulovaná oblasť môže poškodiť tak, že sa zabráni inhibícii produkcie zlúčeniny spätnou väzbou. Podobne sa degradačný enzým môže tiež deletovať alebo modifikovať pomocou substitúcie, delécie alebo adície, takže jeho degradačná aktivita sa zníži pre požadovanú zlúčeninu bez poškodenia životaschopnosti bunky. V každom prípade sa môže zvýšiť celkový výťažok alebo rýchlosť produkcie jednej z týchto požadovaných špeciálnych chemikálii.

Tiež je možné, že takéto zmeny v proteínových a nukleotidových molekulách podľa tohto vynálezu môžu okrem aminokyselín, vitamínov, kofaktorov, „nutraceutík“, nukleotidov, nukleozidov a trehalózy zvýšiť aj produkciu ďalších špeciálnych chemikálií. Metabolizmus každej jednej zlúčeniny je nevyhnutne poprepletaný s ďalšími biosyntetickými a degradačnými dráhami vo vnútri bunky a potrebné kofaktory, medziprodukty alebo substráty v jednej dráhe sú vhodne dodávané alebo limitované inou takouto dráhou. A tak sa pomocou modulácie aktivity jedného alebo viacerých proteínov podľa tohto vynálezu môže ovplyvniť produkcia alebo účinnosť aktivity ďalšej biosyntetickej alebo degradačnej dráhy špeciálnej chemikálie. Napríklad, aminokyseliny sú štruktúrnymi jednotkami všetkých proteínov, avšak intracelulárne sa môžu nachádzať v množstvách, ktoré limitujú syntézu proteínov; a preto sa pomocou zvyšovania účinnosti produkcie alebo výťažkov jednej alebo viacerých aminokyselín vo vnútri bunky môžu oveľa ľahšie syntetizovať proteíny, ako napríklad biosyntetické alebo degradačné proteíny. Podobne, takou zmenou v enzýmovej metabolickej dráhe, že príslušná bočná reakcia sa stáva viac alebo menej výhodnou, sa dá dosiahnuť zvýšená alebo znížená produkcia jednej alebo viacerých zlúčenín, ktoré sa využívajú ako medziprodukty alebo substráty na produkciu požadovanej špeciálnej chemikálie.

Sekvencie izolovaných nukleových kyselín, ktoré sú predmetom tohto vynálezu sú zahrnuté v genóme kmeňa Corynebacteríum glutamicum dostupného prostredníctvom americkej zbierky kultúr „Američan Type Culture Collection“ pod označením ATCC 13032. Nukleotidové sekvencie izolovaných C. glutamicum MP DNA sú uvedené v Sekvenčnom zázname s nepárne očíslovanými SEQ ID NO a predpokladané aminokyselinové sekvencie C. glutamicum MP proteínov sú uvedené v Sekvenčnom zázname s párne očíslovanými SEQ ID NO. Uskutočnili sa komputerové analýzy, ktoré klasifikujú a/alebo identifikujú tieto nukleotidové sekvencie ako sekvencie, ktoré kódujú proteíny metabolických dráh.

Predložený vynález sa tiež týka proteínov, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je v podstate homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s párne očíslovanou sekvenciou SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname). Tak ako sa v tomto dokumente uvádza, proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu v podstate homológnu s vybranou sekvenciou aminokyselín je najmenej asi na 50 % homológny s vybranou aminokyselinovou sekvenciou, napr. celou vybranou aminokyselinovou sekvenciou. Proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je v podstate homológna s vybranou aminokyselinovou sekvenciou, môže byť tiež najmenej asi na 50-60 %, výhodne najmenej asi na 60-70 % a výhodnejšie najmenej asi na 70-80 %, 80-90 % alebo 90-95 % a najvýhodnejšie najmenej asi na 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológny s vybranou sekvenciou aminokyselín.

MP proteín alebo jeho biologicky aktívna časť alebo jeho fragment podľa tohto vynálezu môže katalyzovať enzýmovú reakciu v jednej alebo viacerých metabolických dráhach pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu alebo má jednu alebo viac aktivít, ktoré sú uvedené v tabuľke 1.

Rôzne aspekty vynálezu sa detailnejšie opisujú v nasledujúcich odstavcoch:

A. Molekuly izolovaných nukleových kyselín

Vynález sa týka molekúl izolovaných nukleových kyselín, ktoré kódujú MP polypeptidy alebo ich biologicky aktívne časti, ako aj fragmentov nukleových kyselín vhodných na použitie ako hybridizačné sondy alebo priméry na identifikáciu alebo amplifikáciu MP-kódujúcej nukleovej kyseliny (napr. MP DNA). Pojem „molekula nukleovej kyseliny“, tak ako sa v tomto dokumente používa, označuje molekuly DNA (napr. cDNA alebo genómovú DNA) a molekuly RNA (napr. mRNA) a analógy DNA alebo RNA vytvorené použitím nukleotidových analógov. Tento pojem zahrňuje tiež netranslatovanú sekvenciu lokalizovanú na oboch 3'- a 5'koncoch kódujúcej oblasti génu: najmenej asi 100 nukleotidovú sekvenciu lokalizovanú na 5'- konci kódujúcej oblasti génu proti smeru (upstream) transkripcie a najmenej asi 20 nukleotidovú sekvenciu lokalizovanú na 3'- konci kódujúcej oblasti génu v smere (downstream) transkripcie. Molekula nukleovej kyseliny môže byť jednovláknová alebo dvojvláknová, ale prednostne je dvojvláknová DNA. „Izolovanou molekulou nukleovej kyseliny je práve tá, ktorá je separovaná od iných molekúl nukleových kyselín, ktoré sú prítomné v prirodzenom zdroji nukleovej kyseliny. Výhodne, „izolovaná“ nukleová kyselina neobsahuje sekvencie, ktoré prirodzene lemujú nukleovú kyselinu (t.j. sekvencie lokalizované na 5-'a 3'-koncoch nukleovej kyseliny) v genómovej DNA organizmu, z ktorého je nukleová kyselina odvodená. Napríklad, v rôznych uskutočneniach, izolovaná MP molekula nukleovej kyseliny môže obsahovať menej ako asi 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb alebo 0,1 kb nukleotidových sekvencií, ktoré prirodzene lemujú molekulu nukleovej kyseliny v genómovej DNA bunky, z ktorej je nukleová kyselina odvodená (napr. bunka C. glutamicum). Navyše, „izolovaná“ molekula nukleovej kyseliny, ako napríklad DNA molekula, môže byť v podstate bez iného bunkového materiálu alebo kultivačného média, ak sa vytvorila pomocou rekombinantných techník, alebo chemických prekurzorov alebo iných chemikálií, ak sa syntetizovala chemicky.

Molekula nukleovej kyseliny, podľa predloženého vynálezu, napr. molekula nukleovej kyseliny, ktorá má nepárne očíslovanú nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, alebo jej časť, sa môže izolovať s použitím štandardných techník molekulárnej biológie a informácií o sekvencií poskytnutých v tomto dokumente. Napríklad, C. glutamicum MP DNA sa môže izolovať z knižnice C. glutamicum použitím celej sekvencie alebo časti jednej zo sekvencií s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname ako hybridizačná sonda a použitím štandardných hybridizačných techník (napr. ako sa opisuje v Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Okrem toho, molekula nukleovej kyseliny obsahujúca celú alebo časť jednej zo sekvencií nukleových kyselín podľa tohto vynálezu (napr. s nepárne očíslovanými SEQ ID NO:) sa môže izolovať polymerázovou reťazovou reakciou použitím oligonukleotidových primérov skonštruovaných na základe tejto sekvencie (napr. molekula nukleovej kyseliny obsahujúca celú alebo časť jednej zo sekvencií nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu (napr. s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) sa môže izolovať polymerázovou reťazovou reakciou použitím oligonukleotidových primérov skonštruovaných na základe tejto istej sekvencie). Napríklad, mRNA sa môže izolovať z normálnych endotelových buniek (napr. pomocou guanidíniumtiokyanátovej extrakčnej metódy podľa Chirgwina a kol. (1979) Biochemistry 18, 5294-5299) a DNA sa môže pripraviť použitím reverznej transkriptázy (napr. Moloney MLV reverznej transkriptázy, dostupnej od Gibco/GRL, Bethesda, MD; alebo AMV reverznej transkriptázy dostupnej od Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Syntetické oligonukleotidové priméry pre amplifikáciu polymerázovou reťazovou reakciou sa môžu skonštruovať na základe jednej z nukleotidových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname. Nukleová kyselina podľa tohto vynálezu sa môže amplifikovať použitím cDNA, alebo alternatívne, genómovej DNA, ako templátu a vhodných oligonukleotidových primérov podľa štandardných PCR amplifikačných techník. Takto amplifikovaná nukleová kyselina sa môže klonovať do vhodného vektora a charakterizovať pomocou vhodnej sekvenčnej analýzy DNA. Okrem toho sa oligonukleotidy zodpovedajúce MP nukleotidovej sekvencii môžu pripraviť pomocou štandardných syntetických techník napr. použitím automatického syntetizátora DNA.

Vo výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu obsahuje jednu z nukleotidových sekvencii uvedených v Sekvenčnom zázname. Sekvencie nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, tak ako sa uvádzajú v Sekvenčnom zázname, zodpovedajú Corynebacterium glutamicum MP DNA podľa tohto vynálezu. Táto DNA pozostáva zo sekvencii kódujúcich MP proteíny (t.j. „kódujúcej oblasti“ zaznamenanej v každej nepárne očíslovanej sekvencii SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), ako aj z 5'netranslatovaných sekvencii a 3'-netranslatovaných sekvencii, ktoré sa tiež zaznamenali v každej nepárne očíslovanej sekvencii SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname. Alternatívne, molekula nukleovej kyseliny môže obsahovať len kódujúcu oblasť ktorejkoľvek zo sekvencii nukleových kyselín v Sekvenčnom zázname.

Pre účely tejto prihlášky treba rozumieť, že každá zo sekvencii nukleovej kyseliny a aminokyselinových sekvencii uvedených v Sekvenčnom zázname je identifikovaná RXA, RXN, RXS alebo RXC číslovaním, ktoré má označenie „RXA,“ „RXN, „RXS“ alebo „RXC“ s následnými 5 číslicami (t.j. RXA00007, RXN00023, RXS00116 alebo RXC00128). Každá zo sekvencii nukleovej kyseliny sa skladá až z troch častí: 5'-oblasti proti smeru transkripcie, kódujúcej oblasti a oblasti v smere transkripcie. Každá z týchto troch oblastí je identifikovaná rovnakým RXA, RXN, RXS alebo RXC označeniami, aby sa zabránilo zámene. Slovné spojenie „jedna zo sekvencii s nepárnym číslovaním v Sekvenčnom zázname“ teda odkazuje na ktorúkoľvek zo sekvencii nukleovej kyseliny v Sekvenčnom zázname, ktorá môže byť rozlíšiteľná pomocou ich rozdielnych RXA, RXN, RXS alebo RXC označení. Kódujúca oblasť každej z týchto sekvencii je translatovaná na príslušnú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je tiež uvedená v Sekvenčnom zázname ako párne očíslovaná sekvencia SEQ ID NO: priamo nasledujúca po príslušnej sekvencii nukleovej kyseliny. Napríklad, kódujúca oblasť pre RXA02229 je uvedená v SEQ ID NO:1, zatiaľ čo aminokyselinová sekvencia, ktorú kóduje, je uvedená ako SEQ ID NO:2. Sekvencie molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sú určené rovnakými RXA, RXN RXS alebo RXC označeniami ako molekuly aminokyselín, ktoré kódujú, takže sa môžu ľahko korelovať. Napríklad, aminokyselinová sekvencia označená RXA02229 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXA02229, aminokyselinová sekvencia označená RXN00351 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXN00351, aminokyselinová sekvencia označená RXS02970 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXS02970 a minokyselinová sekvencia označená RXC02390 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXC02390; zhoda medzi RXA, RXN, RXS a RXC nukleotidovými sekvenciami a aminokyselinovými sekvenciami podľa tohto vynálezu a im pridelené SEQ ID NO sú uvedené v tabuľke 1.

Niektoré z génov podľa tohto vynálezu sú „F-označené gény“. F-označené gény zahŕňajú tie gény uvedené v tabuľke 1, ktoré majú „F“ pred RXA, RXN, RXS alebo RXC označením. Napríklad, SEQ ID NO: 5 označuje, ako je ukázané v tabuľke 1, taký F-gén, ktorý má označenie „F RXA01009 “,( SEQ ID NO: 73 taký F-gén, ktorý má označenie „F-RXA00007 SEQ ID NO: 75 taký gén, ktorý má označenie „F-RXA00364 “ a SEQ ID NO: 77 taký gén, ktorý má označenie „F RXA00367).

V jednom uskutočnení, molekuly nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu sa nemožno zahrnúť do tých, ktoré sú zostavené do tabuľky 2, a to v prípade dapD génu, ktorého sekvenciu publikoval Wehrmann, A. a kol. (1998) v J. Bacteriol. 180 (12), 3159-3165. Avšak, sekvencia získaná vynálezcami predloženej prihlášky je významne dlhšia, ako je publikovaná verzia. Predpokladá sa, že publikovaná verzia vychádzala z nesprávneho štartovacieho kodónu, a tak predstavuje len fragment skutočnej kódujúcej oblasti.

V inom výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu zahrňuje molekulu nukleovej kyseliny, ktorá je komplementárna s jednou zo sekvencií nukleotidov podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním sekvencie SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), alebo s jej časťou. Molekulou nukleovej kyseliny, ktorá je komplementárna s jednou z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu, je práve tá, ktorá je dostatočne komplementárna s jednou z nukleotidových sekvencií v Sekvenčnom zázname (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO:), takže sa môže hybridizovať s jednou z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu, v dôsledku toho sa vytvára stabilný duplex,

V ešte inom výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej asi na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, a výhodnejšie najmenej asi na 71 %,72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, %, alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, 93 %, 94 % alebo dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológna s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) alebo jej časťou. Intervaly alebo identita medziľahlých hodnôt s vyššie uvedenými intervalmi (napr.na 70- % identické alebo na 80-95 % identické) patria tiež do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, intervaly hodnôt identity využívajúce kombináciu akýchkoľvek vyššie uvedených hodnôt ako horné a/alebo dolné hranice taktiež patria do rozsahu vynálezu. V ďalšom výhodnom uskutočnení obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu nukleotidovú sekvenciu, ktorá sa hybridizuje, napr. sa hybridizuje v stringentných podmienkach s jednou nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu alebo jej časťou.

Okrem toho, molekula nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu môže obsahovať len časť kódujúcej oblasti sekvencie jednej z nepárne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, napríklad fragment, ktorý sa môže použiť ako sonda alebo primér, alebo fragment kódujúci biologicky aktívnu časť MP proteínu. Nukleotidové sekvencie určené z klonovania MP génov z C. glutamicum umožňujú vytváranie sond a primérov určených na použitie pri identifikácii a/alebo klonovaní MP homológov v iných typoch buniek a organizmoch, a tiež MP homológov z iných Corynebacteria alebo príbuzných druhov. Sonda/primér typicky obsahuje v podstate purifikovaný oligonukleotid. Oligonukleotid typicky obsahuje oblasť nukleotidovej sekvencie, ktorá sa hybridizuje v stringentných podmienkach najmenej asi s 12, výhodne asi s 25, výhodnejšie asi so 40, 50 alebo 75 po sebe idúcimi nukleotidmi zmysluplného (sense) vlákna jednej z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. jednej zo sekvencií s nepárnym očíslovaním SEQ ID

NO v Sekvenčnom zázname), nezmyselnú sekvenciu jednej z týchto sekvencií, alebo ich prirodzene sa vyskytujúce mutanty. Priméry založené na nukleotidovej sekvencií podľa tohto vynálezu sa môžu použiť pri PCR reakciách na klonovanie MP homológov. Sondy založené na MP nukleotidových sekvenciách sa môžu použiť na detekciu transkriptov alebo genómových sekvencií kódujúcich tie isté alebo homológne proteíny. Vo výhodných uskutočneniach, sonda ďalej obsahuje k nej pripojenú značkovú skupinu, napr. značkovou skupinou môže byť rádioizotop, fluorescenčná zlúčenina, enzým alebo enzýmový kofaktor. Takéto sondy môžu byť súčasťou diagnostického testovacieho kitu na identifikáciu buniek, ktoré chybne exprimujú MP proteín, napríklad meraním hladiny MP-kódujúcej nukleovej kyseliny vo vzorke buniek zo subjektu, napr. detegovaním MP mRNA hladín alebo stanovením, či genómový MP gén mutoval alebo deletoval.

V jednom uskutočnení molekula nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, kóduje proteín, alebo jeho časť, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr.sekvenciou s párnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname), takže proteín alebo jeho časť si udržiava schopnosť katalyzovať enzýmovú reakciu v metabolickej dráhe pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu. Tak ako sa používa v tomto dokumente, spojenie „dostatočne homológny“ odkazuje na proteíny alebo ich časti, ktoré majú aminokyselinové sekvencie, ktoré obsahujú minimálny počet identických alebo ekvivalentných (napr. aminokyselinový zvyšok, ktorý má podobný bočný reťazec s aminokyselinovým zvyškom v sekvencií jednej z párne očíslovaných SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) aminokyselinových zvyškov s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, takže proteín alebo jeho časť je schopný katalyzovať enzýmovú reakciu v C. glutamicum v metabolickej dráhe pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu. Proteínové členy takýchto metabolických dráh, ktoré sa opisujú v tomto dokumente, majú funkciu katalyzovať biosyntézu alebo degradáciu jednej alebo viacerých: aminokyselín, vitamínov, kofaktorov, „nutraceutík, nukleotidov, nukleozidov alebo trehalózy. Príklady takýchto aktivít sa tiež opisujú v tomto dokumente. Takto „funkcia MP proteínu“ prispieva k celkovému fungovaniu jednej alebo viacerých takýchto metabolických dráh a prispieva buď priamo alebo nepriamo k výťažku, produkcii a/alebo účinnosti produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálii. Príklady MP proteínových aktivít sú uvedené v tabuľke 1.

V inom uskutočnení je proteín najmenej asi na 50-60 %, výhodne najmenej asi na 60-70 % a výhodnejšie najmenej asi na 70-80 %, 80-90 %, 90-95 % a najvýhodnejšie najmenej asi na 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s párne očíslovanou sekvenciou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname).

Časťami proteínov kódovaných molekulami MP nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu sú predovšetkým biologicky aktívne časti jedného z MP proteínov. Ako sa používa v tomto dokumente, slovné spojenie „biologicky aktívna časť MP proteínu“, mieni sa tým časť, napr.doména/motív MP proteínu, ktorá katalyzuje enzýmovú reakciu v jednej alebo viacerých C. glutamicum metabolických dráhach pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu alebo niektorú z aktivít uvedených v tabuľke 1. Aby sa stanovilo, či MP proteín alebo jeho biologicky aktívna časť môže katalyzovať enzýmovú reakciu v C. glutamicum v metabolickej dráhe pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu, môže sa uskutočniť skúška enzýmovej aktivity. Takéto skúšobné metódy sú dobre známe odborníkom, ktorí pracujú v danej oblasti techniky, ako sa to podrobne opisuje v príklade 8 v príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Ďalšie fragmenty nukleovej kyseliny kódujúce biologicky aktívne časti MP proteínu sa môžu pripraviť izoláciou časti jednej z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencie s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), expresiou kódovanej časti MP proteínu alebo peptidu (napr. pomocou rekombinantnej expresie in vitro) a stanovením aktivity kódovanej časti MP proteínu alebo peptidu.

Vynález ďalej zahrňuje molekuly nukleových kyselín, ktoré sa odlišujú od jednej z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencie s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) (a jej častí) v dôsledku degenerácie genetického kódu, a tak kódujú rovnaký MP proteín ako ten, ktorý kódujú nukleotidové sekvencie opísané vo vynáleze. V inom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu má

3θ nukleotidovú sekvenciu kódujúcu proteín, ktorého aminokyselinové sekvencia sa uvádza v Sekvenčnom zázname (napr. s párne očíslovanou SEQ ID NO:). V ešte ďalšom uskutočnení, kóduje molekula nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu celú dĺžku C. glutamicum proteínu, ktorý je v podstate homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (ktorá je kódovaná otvoreným systémom čítania prislúchajúcou SEQ ID NO: uvedenou s nepárnym očíslovaním v Sekvenčnom zázname).

Odborník, ktorý je skúsený v danej oblasti, si bude vedomý toho, že v jednom uskutočnení, sekvencie podľa tohto vynálezu nie sú mienené tak, aby zahrňovali sekvencie známe z doterajšieho stavu techniky, t.j. sekvencie z Genbanky uvedené v tabuľkách 2 a 4, ktoré boli k dispozícii pred týmto vynálezom. V jednom uskutočnení vynález zahrňuje nukleotidové a aminokyselinové sekvencie, ktoré majú percento identity s nukleotidovou alebo aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu väčšie, v porovnaní s doteraz známou sekvenciou v danej oblasti techniky (napr. Genbanková sekvencia (alebo proteín kódovaný takouto sekvenciou) uvedená v tabuľkách 2 alebo 4). Napríklad vynález zahrňuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je viac ako a/alebo najmenej na 40% identická s nukleotidovou sekvenciou označenou RXA00115 (SEQ ID NO: 185), nukleotidovú sekvenciu, ktorá je viac ako a/alebo najmenej na % identická s nukleotidovou sekvenciou označenou RXA00131 (SEQ ID NO: 991) a nukleotidovú sekvenciu, ktorá je väčšia a/alebo najmenej na 39 % identická s nukleotidovou sekvenciou označenou RXA00219 (SEQ ID NO: 345). Odborník v danej oblasti techniky by bol schopný vypočítať dolný prah percenta identity pre akúkoľvek danú sekvenciu podľa vynálezu pomocou skúšania skóre GAPvypočítaného percenta identity uvedeného v tabuľke 4 pre každý z troch najlepších aktívnych záznamov pre danú sekvenciu, a to odpočítaním najvyššieho GAPvypočítaného percenta identity od 100 %. Odborník v danej oblasti techniky si bude tiež vedomý, že sekvencie nukleových kyselín a aminokyselín, ktoré majú percento identity väčšie ako takto vypočítaný dolný prah (napr. sú najmenej na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, výhodnejšie najmenej asi na 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % alebo % alebo 91 %, 92 %, 93 %, 94 % a dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac identické) sú tiež zahrnuté do vynálezu.

Okrem C. glutamicum MP nukleotidových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname s nepárne očíslovanými SEQ ID NO, môžu odborníci skúsení v danej oblasti techniky usúdiť, že v rámci populácie sa môžu vyskytovať DNA sekvenčné polymorfizmy, ktoré vedú k zmenám v aminokyselinových sekvenciách MP proteínov (napr. C. glutamicum populácie). Takýto genetický polymorfizmus v MP géne môže existovať medzi jedincami v rámci populácie v dôsledku prirodzenej variácie. Ak sa používajú v tomto dokumente pojmy „gén“ a „rekombinantný gén“, tieto sa vzťahujú na molekuly nukleovej kyseliny, ktoré otvoreným systémom čítania kódujú MP proteín, výhodne C. glutamicum MP proteín. Takéto prirodzené variácie môžu typicky spôsobovať 1-5% variáciu nukleotidovej sekvencie MP génu. Ktorékoľvek a všetky takéto nukleotidové variácie a následné aminokyselinové polymorfizmy v MP, ktoré vyplývajú z prirodzenej variácie a také, ktoré nemenia funkčnú aktivitu MP proteínov, sú zahrnuté do rozsahu tohto vynálezu.

Molekuly nukleovej kyseliny zodpovedajúce prirodzeným variantom a ne-C. glutamicum homológom MP DNA C. glutamicum podľa vynálezu sa môžu izolovať na základe ich homológie s C. glutamicum MP nukleovou kyselinou opísanou v tomto dokumente použitím C. glutamicum DNA, alebo jej časti, ako hybridizačnej sondy podľa štandardných hybridizačných metodík v stringentných hybridizačných podmienkach. V súlade s uvedeným, v ďalšom uskutočnení má molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu najmenej 15 nukleotidovú dĺžku a hybridizuje sa v stringentných podmienkach s molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu s nepárne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname. V ďalších uskutočneniach má nukleová kyselina dĺžku najmenej 30, 50, 100, 250 alebo viac nukleotidov. Tak ako sa používa v tomto dokumente pojem „hybridizuje sa v stringentných podmienkach“, opisujú sa tým podmienky na hybridizáciu a premytie, pri ktorých sú nukleotidové sekvencie najmenej na 60 % navzájom homológne a charakteristicky zostávajú navzájom hybridizované. Výhodne sú podmienky také, že sekvencie sú najmenej asi na 65 %, výhodnejšie najmenej asi na 70 % a dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 75 % alebo viac navzájom homológne a charakteristicky zostávajú navzájom hybridizované. Takéto stringentné podmienky sú známe skúseným odborníkom v danej oblasti techniky a dajú sa zistiť v Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Výhodným, nelimitujúcim príkladom stringentných hybridizačných podmienok sú hybridizácie v 6 X chloride sodnom/citráte sodnom (SSC) pri približne 45 °C s následným jedným alebo viacerými premytiami v 0,2 X SSC, 0,1 % SDS pri 50-65 °C. Výhodne sa molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, ktorá sa hybridizuje v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu zhoduje s prirodzene sa vyskytujúcou molekulou nukleovej kyseliny. Ak sa v tomto dokumente používa pojem „prirodzene sa vyskytujúca“ molekula nukleovej kyseliny, odkazuje sa tým na molekulu RNA alebo DNA, ktoré majú nukleotidovú sekvenciu vyskytujúcu sa v prírode (napr. kódujúcu prirodzene sa vyskytujúci proteín). V jednom uskutočnení, nukleová kyselina kóduje prirodzene sa vyskytujúci C. glutamicum MP proteín.

Okrem prirodzene sa vyskytujúcich variantnov MP sekvencie, ktoré sa môžu vyskytovať v populácii, si odborník v danej oblasti techniky bude v ďalšom vedomý, že zmeny, ktoré sa môžu zaviesť do nukleotidovej sekvencie podľa tohto vynálezu mutáciou, vedú aj k zmenám v aminokyselinovej sekvencii kódovaného MP proteínu, bez zmeny funkčnej schopnosti MP proteínu. Napríklad, podľa tohto vynálezu sa môžu v nukleotidovej sekvencii uskutočniť nukleotidové substitúcie, ktoré vedú k aminokyselinovým substitúciám na „neesenciálnych“ aminokyselinových zvyškoch. „Neesenciálny“ aminokyselinový zvyšok je zvyšok, ktorý sa môže zmeniť z „divého“ typu sekvencie jedného z MP proteínov (napr. s párnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) bez zmenenia aktivity spomínaného MP proteínu, kým „esenciálny“ aminokyselinový zvyšok sa vyžaduje na aktivitu MP proteínu. Ďalšie aminokyselinové zvyšky, však (napr. tie, ktoré nie sú zachované alebo len polozachované v doméne s MP aktivitou) nemôžu byť esenciálne pre aktivitu, a teda pravdepodobne podliehajú zmene bez zmenenia MP aktivity.

Podľa toho, vynález sa ďalej týka molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich MP proteíny, ktoré obsahujú zmeny v aminokyselinových zvyškoch, ktoré nie sú esenciálne pre MP aktivitu. Takéto MP proteíny sa líšia aminokyselinovou sekvenciou od sekvencie s párnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname, pričom si ešte udržali najmenej jednu z MP aktivít opísaných v tomto dokumente. V jednom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu najmenej asi na 50 % homológnu s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu a je schopný katalyzovať enzýmovú reakciu v metabolickej dráhe pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu alebo má jednu alebo viac aktivít, ktoré sú uvedené v tabuľke 1. Výhodne, proteín kódovaný molekulou nukleovej kyseliny je najmenej asi na 50-60 % homológny s aminokyselinovou sekvenciou jednej z nepárne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, výhodnejšie najmenej asi na 60-70% homológny s jednou z týchto sekvencií, dokonca ešte výhodnejšie najmenej asi na 70-80 %, 80-90 %, 90-95 % homológny s jednou z týchto sekvencií a najvýhodnejšie najmenej asi na 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % homológny s jednou z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu.

Aby sa stanovilo percento homológie dvoch aminokyselinových sekvencií (napr. jednej z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu a jej mutantnej formy) alebo dvoch nukleových kyselín, sekvencie sa zoradili za účelom optimálnych porovnaní (napr. medzery (gaps) sa môžu zavádzať do sekvencie jedného proteínu alebo nukleovej kyseliny na optimálne zoradenie s ďalším proteínom alebo nukleovou kyselinou). Aminokyselinové zvyšky alebo nukleotidy v prislúchajúcich aminokyselinových pozíciách alebo nukleotidových pozíciách sa potom porovnajú. Keď je pozícia v jednej sekvencií (napr. jednej aminokyselinovej sekvencií podľa tohto vynálezu) obsadená tým istým aminokyselinovým zvyškom alebo nukleotidom ako prislúchajúca pozícia v inej sekvencií (napr. mutantnou formou aminokyselinovej sekvencie), tak molekuly sú homológne na túto pozíciu (t.j. ak sa v tomto dokumente používa spojenie aminokyselinové alebo nukleovokyselinová „homológia“, je to ekvivalentné aminokyselinovej alebo nukleovokyselinovej „identite“). Percento homológie medzi dvoma sekvenciami je funkciou počtu identických pozícií podieľajúcich sa na sekvenciách (t.j. % homológie= # identických pozícií / celkových # pozícií x 100).

Molekula izolovanej nukleovej kyseliny kódujúca MP proteín homológny k proteínovej sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencia s párne očíslovanou

SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) sa môže vytvárať zavedením jednej alebo viacerých nukleotidových substitúcií, adícií alebo delécií do nukleotidovej sekvencie podľa tohto vynálezu tak, že jedna alebo viac aminokyselinových substitúcií, adícií alebo delécií sa zavedú do kódovaného proteínu. Mutácie sa môžu zaviesť do jednej z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu pomocou takých štandardných metód, ako polohou usmernených mutagenéz a PCR sprostredkovaných mutagenéz. Výhodne sa uskutočnili konzervatívne aminokyselinové substitúcie na jednom alebo viacerých predikovaných neesenciálnych aminokyselinových zvyškoch. „Konzervatívna aminokyselinová substitúcia“ je taká, pri ktorej sa aminokyselinový zvyšok nahradí aminokyselinovým zvyškom, ktorý má podobný bočný reťazec. Rodiny aminokyselinových zvyškov, ktoré majú podobné bočné reťazce, sú definované v danej oblasti techniky. Do týchto rodín patria aminokyseliny so zásaditými bočnými reťazcami (napr. lyzín, arginín, histidín), s kyslými bočnými reťazcami (napr. kyselina asparágová, kyselina glutámová), polárnymi bočnými reťazcami bez náboja (napr. glycín, asparagín, glutamín, serín, treonín, tyrozín, cysteín), nepolárnymi bočnými reťazcami (napr. alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, fenylalanín, metionín, tryptofán), beta-rozvetvenými bočnými reťazcami (napr. treonín, valín, izoleucín) a aromatickými bočnými reťazcami (napr. tyrozín, fenylalanín, tryptofán, histidín). Takto predikovaný neesenciálny aminokyselinový zvyšok v MP proteíne je výhodne nahradený s iným aminokyselinovým zvyškom z tej istej rodiny bočných reťazcov. Alternatívne, v inom uskutočnení sa mutácie môžu zavádzať náhodne, pozdĺž celej alebo pozdĺž časti MP kódujúcej sekvencie, napríklad saturačnou mutagenézou a vytvorené mutanty sa môžu podrobiť skríningu na MP aktivitu opísanú v tomto dokumente, aby sa identifikovali mutanty, ktoré si udržali MP aktivitu. Následnou mutagenézou jednej z nepárne očíslovaných nukleotidových sekvencií SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname sa môže rekombinantne exprimovať kódovaný proteín a aktivita proteínu sa môže stanoviť, napríklad pomocou skúšok uvedených v tomto dokumente (pozri príklad 8 v príkladoch uskutočnenia vynálezu).

Okrem molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich MP proteíny, ktoré sú opísané vyššie, sa vynález ďalej týka molekúl izolovanej nukleovej kyseliny, ktoré sú navyše nezmyselné. „Nezmyselná“ nukleová kyselina obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je komplementárna k „zmysluplnej “nukleovej kyseline kódujúcej proteín, napr. komplementárna ku kódujúcemu vláknu dvojvláknovej DNA molekuly alebo komplementárna k mRNA sekvencii. Podľa toho sa nezmyselná nukleová kyselina môže viazať vodíkovou väzbou so zmysluplnou nukleovou kyselinou. Nezmyselná nukleová kyselina môže byť komplementárna k celému MP kódujúcemu vláknu alebo len k jeho časti. V jednom uskutočnení je nezmyselná molekula nukleovej kyseliny nezmyselná ku „kódujúcej oblasti“ na kódujúcom vlákne nukleotidovej sekvencie kódujúcej MP proteín. Pojem „kódujúca oblasť“ sa vzťahuje na oblasť nukleotidovej sekvencie obsahujúcej kodóny, ktoré sa translatujú na aminokyselinové zvyšky (napr. celá kódujúca oblasť SEQ ID NO 1 (RXA02229) zahrňuje nukleotidy 1 až 825). V inom uskutočnení, nezmyselná molekula nukleovej kyseliny je nezmyselná ku „nekódujúcej oblasti“ na kódovacom vlákne nukleotidovej sekvencie kódujúcej MP. Pojem „nekódujúca oblasť“ sa vzťahuje na 5'- a 3'-sekvencie, ktoré lemujú kódujúcu oblasť, takže nie sú translatované na aminokyseliny (t.j. označované tiež ako 5'- a 3'- netranslatované oblasti).

Z uvedených sekvencii kódujúceho vlákna, ktoré kódujú MP, opísaných v tomto dokumente (napr. sekvencie uvedené s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname), sa môžu navrhnúť nezmyselné nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu podľa pravidiel Watsonovho a Crickovho párovania báz. Nezmyselná molekula nukleovej kyseliny môže byť komplementárna k celej kódujúcej oblasti MP mRNA, ale výhodnejšie je to oligonukleotid, ktorý je nezmyselný len k časti kódujúcej alebo nekódujúcej oblasti MP mRNA. Napríklad, nezmyselný oligonukleotid môže byť komplementárny k oblasti obklopujúcej miesto štartu translácie MP mRNA. Nezmyselný oligonukleotid môže mať napríklad dĺžku 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 alebo 50 nukleotidov. Nezmyselná nukleová kyselina podľa tohto vynálezu sa môže vytvoriť chemickou syntézou a enzýmovými ligačnými reakciami, pričom sa používajú postupy, ktoré sú známe v danej oblasti techniky. Napríklad, nezmyselná nukleová kyselina (napr. nezmyselný oligonukleotid) sa môže chemicky syntetizovať použitím prirodzene sa vyskytujúcich nukleotidov alebo rôzne modifikovaných nukleotidov určených na zvýšenie biologickej stability molekúl alebo na zvýšenie fyzikálnej stability duplexu vytvoreného medzi nezmyselnými a zmysluplnými nukleovými kyselinami, napr. sa môžu použiť fosforotionátové deriváty a akridínom substituované nukleotidy. Príklady modifikovaných nukleotidov, ktoré sa môžu použiť na vytváranie nezmyselných nukleových kyselín zahŕňajú 5-fluóruracil, 5-brómuracil, 5chlóruracil, 5-jóduracil, hypoxantín, xantín, 4-acetylcytozín, 5-(karboxyhydroxymetyl)uracil, 5-karboxymetylaminometyl-2-tiouridín, 5-karboxymetylaminometyluracil, dihydrouracil, beta-D-galaktozylcheozín, inozín, N6-izopentenyladenín, 1metylguanín, 1-metylinozín, 2,2-dimetylguanín, 2-metyladenín, 2-metylguanín, 3metylcytozín, 5-metylcytozin, N6-adenin, 7-metylguanín, 5-metylaminometyluracil, 5-metoxyaminometyl-2-tiouracil, beta-D-manozylcheozín, 5'-metoxykarboxymetyluracil, 5-metoxyuracil, 2-metyltio-N6-izopentenyladenín, kyselinu uracil-5oxyoctovú (v), wybutoxozín, pseudouracil, cheozín, 2-tiocytozín, 5-metyl-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metyluracil, metylester kyseliny uracil-5-oxyoctovej, uracil5-oxyoctovú kyselinu (v), 5-metyl-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2karboxypropyl)uracil, (acp3)w a 2,6-diaminopurín. Alternatívne sa nezmyselná nukleová kyselina môže vytvoriť biologicky použitím expresného vektora, do ktorého sa nukleová kyselina subklonovala v nezmyselnej orientácii (t.j. RNA transkribovaná z vloženej nukleovej kyseliny bude mať nezmyselnú orientáciu k danej cieľovej nukleovej kyseline, podrobnejšie opísanej v nasledujúcom odstavci).

Molekuly nezmyselnej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu sú typicky aplikované do bunky alebo sa vytvárajú in situ tak, že sa hybridizujú s alebo viažu na bunkovú mRNA a/alebo genómovú DNA kódujúcu MP proteín, aby týmto spôsobom inhibovali expresiu proteínu, napr. inhibovaním transkripcie a/alebo translácie. Hybridizáciou sa môže bežnou nukleotidovou komplementaritou vytvoriť stabilný duplex, alebo napríklad v prípade nezmyselnej molekuly nukleovej kyseliny, ktorá sa viaže na DNA, duplexy, a to prostredníctvom špecifických interakcií v hlavnej ryhe dvojitej skrutkovnice. Nezmyselná molekula sa môže modifikovať tak, že sa špecificky viaže na receptor alebo antigén exprimovaný na zvolenom povrchu bunky, napr. pripájaním nezmyselnej molekuly nukleovej kyseliny k peptidu alebo protilátke, ktorá sa viaže na povrchový receptor bunky alebo antigén. Molekula nezmyselnej nukleovej kyseliny sa môže tiež doručiť k bunkám použitím vektorov opísaných v tomto dokumente. Aby sa dosiahli postačujúce intracelulárne koncentrácie nezmyselných molekúl, uprednostňujú sa také konštrukty vektora, v ktorých je molekula nezmyselnej nukleovej kyseliny regulovaná silným prokaryotickým, vírusovým alebo eukaryotickým promótorom.

V ešte inom uskutočnení, molekulou nezmyselnej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu je α-anomérna molekula nukleovej kyseliny. α-Anomérna molekula nukleovej kyseliny vytvára špecifické dvojvláknové hybridy s komplementárnou RNA, v ktorých na rozdiel od obvyklých β-jednotiek, sú vlákna navzájom paralelné (Gaultier a kol.(1987) Nucleic Acids. Res. 15, 6625-6641). Nezmyselná molekula nukleovej kyseliny môže tiež obsahovať 2'-o-metylribonukleotid (Inoue a kol. (1987) Nucleic Acid Res. 15, 6131-6148) alebo chimérový RNA-DNA analóg (Inoue a kol. (1987) FEBS Letí. 215, 327-330).

V ešte ďalšom uskutočnení, nezmyselnou nukleovou kyselinou podľa tohto vynálezu je ribozým. Ribozýmy sú katalytické molekuly RNA s ribonukleázovou aktivitou, ktoré sú schopné štiepiť jednovláknovú nukleovú kyselinu ako mRNA, ku ktorej majú komplementárnu oblasť. Takto ribozým (napr. „kladivkovité“ ribozýmy (opísané v Haselhoff a Gerlach (1988) Náture 334, 585-591)) sa môžu použiť na katalytické štiepenie MP mRNA transkriptov, v dôsledku čoho sa inhibuje translácia MP mRNA. Ribozým, ktorý má špecificitu pre MP-kódujúcu nukleovú kyselinu sa môže navrhnúť na základe nukleotidovej sekvencie MP DNA molekuly uvedenej v tomto dokumente (t.j. SEQ ID NO:1 (RXN02229)). Napríklad, derivát Tetrahymena L-19 IVS RNA sa môže skonštruovať tak, že má nukleotidovú sekvenciu aktívneho miesta komplementárnu s nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa má rozštiepiť v MP-kódujúcej mRNA. Pozri, napr. Cech a kol., americký patentový spis US č. 4,987,071 a Cech a kol., americký patentový spis US č. 5,116,742. Alternatívne sa MP mRNA môže použiť na selekciu katalytickej RNA, ktorá má špecifickú ribonukleázovú aktivitu zo zásoby (pool) RNA molekúl. Pozri, napr. Bariel, D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261,1411-1418.

Alternatívne sa expresia MP génu môže inhibovať cieľovou nukleotidovou sekvenciou komplementárnou k regulačnej oblasti MP nukleotidovej sekvencie (napr. MP promótora a/alebo zosilňovačov), aby sa vytvorili trojité skrutkovnicové štruktúry, ktoré zamedzujú transkripciu MP génu v cieľových bunkách. Pozri všeobecne, Helene C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6), 569-84; Helene, C. a kol. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36; a Maher, L. J. (1992) Bioassays 14J12), 807-15.

B. Rekombinantné expresné vektory a hostiteľské bunky

Vynález sa ďalej týka vektorov, výhodne expresných vektorov, ktoré obsahujú nukleovú kyselinu, ktorá kóduje MP proteín (alebo jeho Časť). Tak ako sa používa v tomto dokumente, pojem „vektor“ označuje molekulu nukleovej kyseliny, ktorá je schopná transportovať inú nukleovú kyselinu, ktorá bola k nej pripojená. Jedným typom vektorov je „plazmid“, ktorý označuje kruhovú dvojvláknovú DNA slučku, do ktorej sa môžu ligovať ďalšie segmenty DNA. Iným typom vektora je vírusový vektor, ktorým sa ďalšie DNA segmenty môžu ligovať do vírusového genómu. Určité vektory sú schopné autonómnej replikácie v hostiteľskej bunke, do ktorej sú zavedené (napr. bakteriálne vektory, ktoré majú bakteriálny pôvod replikácie a epizomálne vektory cicavcov). Ďalšie vektory (napr. ne-epizomálne vektory cicavcov) sú integrované do genómu hostiteľskej bunky tak, že sa zavedú do hostiteľskej bunky a týmto spôsobom sa replikujú súčasne s hostiteľským genómom. Okrem toho, určité vektory sú schopné riadiť expresiu génov, ku ktorým boli funkčne pripojené. Takéto vektory sa v tomto dokumente označujú ako „expresné vektory“. Vo všeobecnosti, expresné vektory využívané v rekombinantných DNA metódach sú často vo forme plazmidov. V uvedenej prihláške sa pojmy „plazmid“ a „vektor“ môžu zameniteľné používať, pretože plazmid je najbežnejšie používanou formou vektora. Ale vynález je mienený tak, že zahrňuje také formy expresných vektorov, ako vírusové vektory (napr. replikačné defektívne retrovírusy a adenovírusy a adenoasociované vírusy), ktoré majú ekvivalentné funkcie.

Rekombinantné expresné vektory podľa tohto vynálezu obsahujú nukleovú kyselinu podľa tohto vynálezu vo forme vhodnej na expresiu nukleovej kyseliny v hostiteľskej bunke, čo znamená, že rekombinantné expresné vektory obsahujú jednu alebo viac regulačných sekvencií, zvolených podľa hostiteľských buniek, použitých na expresiu, ktoré sú funkčne pripojené k sekvencii nukleovej kyseliny, ktorá sa má exprimovať. V rámci rekombinantného expresného vektora, „funkčne pripojiť“ znamená, že nukleotidová sekvencia, ktorá je predmetom záujmu, sa pripojí k regulačnej sekvencii(iám) takým spôsobom, ktorý umožní expresiu nukleotidovej sekvencie (napr. v in vitro transkripčnom /translačnom systéme alebo v hostiteľskej bunke, ak je vektor zavedený do hostiteľskej bunky). Pojem „regulačná sekvencia“ zahrňuje promótory, väzbové miesta pre represory, väzbové miesta pre aktivátory, zosilňovače a iné expresné riadiace prvky (napr. polyadenylačné signály alebo elementy sekundárnej štruktúry mRNA). Takéto regulačné sekvencie sú opísané, napríklad v Goeddel; Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulačné sekvencie zahŕňajú tie, ktoré riadia konštitutívnu expresiu nukleotidovej sekvencie v mnohých typoch hostiteľských buniek a tie, ktoré riadia expresiu nukleotidovej sekvencie len v určitých hostiteľských bunkách. Výhodné regulačné sekvencie sú, napríklad také promótory, ako cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet, Ipp-, lac-, Ιρρ-lac-, lacl^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SPO2, A-P_R' alebo Ä-P_L, ktoré sa používajú predovšetkým v baktériách. Ďalšími regulačnými sekvenciami sú, napríklad, promótory z kvasiniek a húb ako ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, promótory z rastlín ako CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos alebo ubikvitínové alebo fazeolínové promótory. Tiež je možné použiť syntetické promótory. Odborník skúsený v danej oblasti techniky si bude vedomý toho, že konštrukcia expresného vektora môže závisieť na takých faktoroch, akými je výber hostiteľskej bunky, ktorá sa má transformovať, na úrovni expresie požadovaného proteínu, a pod. Expresné vektory podľa tohto vynálezu sa môžu zavádzať do hostiteľských buniek, v dôsledku čoho sa produkujú proteíny alebo peptidy, vrátane fúznych proteínov alebo peptidov kódovaných nukleovými kyselinami, ako sa opisuje v tomto dokumente (napr. MP proteíny, mutantné formy MP proteínov, fúzne proteíny a pod.).

Rekombinantné expresné vektory podľa tohto vynálezu sa môžu skonštruovať na expresiu MP proteínov v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách. Napríklad, MP gény sa môžu exprimovať v bakteriálnych bunkách, ako napríklad C. glutamicum, bunkách hmyzu (použitím baculovírusových expresných vektorov), kvasinkových a iných bunkách húb (pozri Romanos, a kol., (1992) „Foreign gene expression in yeast: a review“, Yeast 8, 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. a kol. (1991) „Heterologous gene expression in filamentous fungi“ v: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., str. 396-428: Academic Press: San Diego; a van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi“, v: Applied Molecular Genetics of Fungi, Pebérdy, J.F. a kol., eds., str. 1-28, Cambridge University Press, Cambridge), v riasach a v bunkách mnohobunkových rastlín (pozri Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) „High efficiency Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants“ Plánt Celí Rep, 583-586) alebo v bunkách cicavcov. O vhodných hostiteľských bunkách sa diskutuje ďalej v Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternatívne, rekombinantný expresný vektor sa môže transkribovať a translatovať in vitro, napríklad použitím T7 promótorových regulačných sekvencii a T7 polymerázy.

Expresia proteínov v prokaryotoch sa najčastejšie uskutočňuje s vektormi obsahujúcimi konštitutívne alebo induktívne promótory, ktoré riadia expresiu buď fúznych alebo ne-fúznych proteínov. Fúzne vektory pridávajú mnoho aminokyselín ku kódovanému proteínu, obvykle k amino-koncu rekombinantného proteínu, ale tiež k C-koncu alebo sa fúzujú s vhodnými oblasťami v proteínoch. Takéto fúzne vektory majú typicky tri funkcie: 1) zvyšujú expresiu rekombinantného proteínu; 2) zvyšujú rozpustnosť rekombinantného proteínu; a 3) pomáhajú purifikovať rekombinantný proteín tým, že majú funkciu ligandov pri afinitnej purifikácii. Často sa fúznymi expresnými vektormi zavádza proteolytické štiepne miesto na spojenie fúznej časti a rekombinantného proteínu, aby sa umožnila separácia rekombinantného proteínu z fúznej časti s následnou purifikáciou fúzneho proteínu. Takéto enzýmy, a ich príbuzné rozpoznávacie sekvencie obsahujú Faktor Xa, trombín a enterokinázu.

Charakteristickými fúznymi expresnými vektormi sú pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Jihnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40), ktoré fúzujú glutatión-S-transferázu (GST) k cieľovému rekombinantnému proteínu, pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), ktoré fúzujú maltózu E-viažuci proteín k cieľovému rekombinantnému proteínu a pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), ktoré fúzujú proteín A k cieľovému rekombinantnému proteínu. V jednom uskutočnení je sekvencia, ktorá kóduje MP proteín klonovaná do pGEX expresného vektora, aby sa vytvoril vektor, kódujúci fúzny proteín, ktorý má od N-konca k C-koncu začlenený proteín GST-trombínového štiepneho miesta-X. Fúzny proteín sa môže purifikovať pomocou afinitnej chromatografie za použitia glutatión-agarózovej živice. Rekombinantný MP proteín, ktorý nebol fúziou pripojený na GST sa môže získať štiepením fúzneho proteínu s trombínom.

Príkladmi vhodných induktívnych ne-fúznych E. coli expresných vektorov sú: pTrc (Amann a kol., (1988) Gene 69, 301-315) pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN III113-B1, λ gt11, pBdC1 a pET 11d (Studier a kol., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; a Pouwels a kol., (1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018). Cielená génová expresia zpTrc vektora sa zakladá na RNA polymerázovej transkripcii z hybridného trp-lac fúzneho promótora. Cielená génová expresia z pET 11d vektora sa zakladá na transkripcii zT7 gn 10-lac fúzneho promótora sprostredkovanej pomocou koexpresie s vírusovou RNA polymerázou (T7 gn1). Táto vírusová polymeráza je poskytovaná hostiteľskými kmeňmi BL21 (DE3) alebo HMS174(DE3) z rezidentného λ profágu prechovávajúceho T7 gn1 gén pod transkripčnou reguláciou laclIV 5 promótora. Na transformáciu ďalších druhov baktérií sa môžu vybrať vhodné vektory. Napríklad plazmidy plJ101, plJ364, plL702 a plJ361 sa úspešne používajú na transformovanie Streptomyces, zatiaľ čo plazmidy pUB110, pC194 alebo pBD214 sú vhodné na transformáciu Bacillus druhov. Niekoľko plazmidov sa používa pri prenose genetickej informácie do Corynebacterium, a to pHM1519, pBL1, pSA77 alebo pAJ667 (Pouwels a kol., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018).

Jednou stratégiou na maximalizáciu rekombinantnej proteínovej expresie je expresia proteínu v hostiteľskej baktérii s oslabenou schopnosťou proteolytického štiepenia rekombinantného proteínu (Gotteman.S., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119128). Ďalšou stratégiou je meniť nukleovokyselinovú sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá sa má vložiť do expresného vektora, takže individuálne kodóny pre každú aminokyselinu sú tie, ktoré sa prednostne využívajú v baktérii vybratej na expresiu, napríklad ako C. glutamicum (Wada a kol. (1992) Nucleic Acids Res. 20, 21112118). Takáto zmena nukleovokyselinových sekvencii podľa tohto vynálezu sa môže uskutočniť pomocou štandardných metód syntézy DNA.

V ďalšom uskutočnení je MP proteínovým expresným vektorom kvasinkový expresný vektor. Príkladmi vektorov na expresiu v kvasinkách S. cerevisiae sú:

pYepSed (Baldari a kol., (1987) Embo J. 6, 229-234), 2 μ, pAG-1, Yep6, Yep13, pEMBLYYe23, pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Celí 30, 933-943), pJRY88 (Schultz a kol., (1987) Gene 54, 113-123) a pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektory a metódy na konštrukciu vektorov vhodných na použitie v ďalších hubách, ako napríklad vo vláknitých hubách, sú detailne zhrnuté vo: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi“, v: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy a kol., eds., str. 1-28, Cambridge University Press, Cambridge, a Pouwels a kol., eds.(1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York (IBSN 0 444 904018).

Alternatívne sa MP proteíny podľa tohto vynálezu môžu exprimovať v bunkách hmyzu použitím baculovírusových expresných vektorov. Baculovírusové vektory dostupné na expresiu proteínov pri kultivácii buniek hmyzu (napr. buniek Sf9) zahrňujú pAc série (Smith a kol, (1983) Mol. Celí Biol. 3, 2156-2165) a pVL série (Lucklow and Summers (1989) Virology 170, 31-39).

V inom uskutočnení sa MP proteíny podľa tohto vynálezu môžu exprimovať v bunkách jednobunkových rastlín (napríklad v riasach) alebo v rastlinných bunkách vyšších rastlín (napr. ako v spermatofytoch poľnohospodárskych plodín). Príklady rastlinných expresných vektorov sú detailne zhrnuté v: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) „New plánt binary vectors with selectable markers located proximal to the left border“ Plánt Mol. Biol. 20, 11951197; a Bevan, M.W. (1984) „Binary Agrobacterium vectors for plánt transformation“, Nucl. Acid. Res. 12, 8711-8721 a zahŕňajú pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 a pDH51 (Pouwels a kol., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018).

V ešte inom uskutočnení sa nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu exprimujú v bunkách cicavcov použitím expresného vektora cicavcov. Príkladmi expresných vektorov cicavcov sú pCDM8 (Seed, B.(1987) Náture 329-840) a pMT2PC (Kaufman a kol. (1987) EMBO J. 6, 187-195). Ak sa použijú bunky cicavcov, tak regulačné funkcie expresných vektorov často plnia vírusové regulačné elementy. Napríklad, bežne používané promótory sa často odvodzujú od polyoma, Adenovirusu 2, cytomegalovirusu a Simian Vírusu 40. Ďalšie vhodné expresné systémy, tak pre prokaryotické ako aj eukaryotické bunky, sa uvádzajú v kapitole 16 a 17 v Sambrook, J., Fritsh. E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning,

A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

V ďalšom uskutočnení je rekombinantný expresný vektor cicavcov schopný riadiť expresiu nukleovej kyseliny prednostne v špecifickom type bunky (napr. na expresiu nukleovej kyseliny sa používajú tkanivovo-špecifické regulačné elementy). Tkanivovo-špecifické regulačné elementy sú známe v danej oblasti techniky. Nelimitujúcimi príkladmi vhodných tkanivovo-špecifických promótorov sú: albumínový promótor (pečeňovo-špecifický; Pinkert a kol., (1987) Genes Dev. 1, 268-277), lymfoid-špecifické promótory (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43, 235-275), predovšetkým promótory v receptoroch T buniek (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8, 729-733) a imunoglobulíny (Banerji a kol., (1983) Celí 33, 729-740; Queen a Baltimore (1983) Celí 33, 741-748), neurón-špecifické promótory (napr. neurofilament-promótor; Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86, 5473-5477), pankreas-špecifické promótory; (Edlund a kol., Science 230, 912-916) a špecifické promótory mliečnej žľazy cicavcov (napr. promótor mliečnej srvátky; americký patentový spis č. US 4,873,316 a publikovaná európska prihláška č. 264 166). Vývojovo-regulované promótory sú tiež zahrnuté, napríklad myšacie hox promótory (Kessel and Gruss, (1990) Science 249, 374-379) a a-fetoproteínový promótor (Campes and Tilghman, (1989) Genes Dev. 3, 537-546).

Vynález v ďalšom poskytuje rekombinantný expresný vektor obsahujúci molekulu DNA podľa tohto vynálezu klonovanú do expresného vektora v nezmyselnej orientácii. Znamená to, že molekula DNA je funkčne pripojená k regulačnej sekvencií takým spôsobom, ktorý umožňuje expresiu (pomocou transkripcie molekuly DNA) molekuly RNA, ktorá je nezmyselná k MP mRNA. Regulačné sekvencie funkčne spojené s nukleovou kyselinou klonovanou v nezmyselnej orientácii sa môžu vybrať také, aby riadili kontinuálnu expresiu nezmyselnej molekuly RNA v rôznych typoch buniek, napríklad vírusové promótory a/alebo zosilňovače, alebo regulačné sekvencie sa môžu zvoliť tak, aby riadili konštitutívnu, tkanivovo-špecifickú alebo podľa typu bunky špecifickú expresiu nezmyselnej RNA. Nezmyselný expresný vektor môže mať formu rekombinantného plazmidu, fágomidu alebo zoslabeného vírusu, v ktorom sa nezmyselná nukleová kyselina produkuje pod kontrolou vysoko účinnej regulačnej oblasti, aktivita ktorej sa môže stanoviť pomocou typu bunky, do ktorej je vektor zavedený. Podrobnejšie informácie o regulácii génovej expresie použitím nezmyselných génov, pozri Weintraub, H. a kol., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews- Trends in Genetics, Vol. 1(1), (1986).

Vynález sa ďalej týka hostiteľských buniek, do ktorých sa zaviedol rekombinantný expresný vektor podľa tohto vynálezu. Pojem „hostiteľská bunka“ a „rekombinantná hostiteľská bunka“ sa používa navzájom zameniteľné v tomto dokumente. Rozumie sa, že takéto pojmy označujú nielen príslušný subjekt bunky, ale aj progén alebo potenciálny progén takejto bunky. Pretože určité modifikácie sa môžu vyskytnúť v nasledujúcich generáciách v dôsledku buď mutácie alebo vplyvov prostredia, takýto progén nemôže byť v skutočnosti identický s rodičovskou bunkou, ale ešte stále je zahrnutý do rozsahu pojmu ako sa používa v tomto dokumente.

Hostiteľskou bunkou môže byť akákoľvek prokaryotická alebo eukaryotická bunka. Napríklad, MP proteín sa môže exprimovať v baktériových bunkách, ako sú C. glutamicum, bunkách hmyzu, kvasinkách alebo bunkách cicavcov (ako napríklad ovariálnych bunkách čínskeho škrečka (CHO) alebo COS bunkách). Ďalšie vhodné hostiteľské bunky sú známe odborníkom v danej oblasti techniky. Mikroorganizmy príbuzné ku Corynebacterium glutamicum, ktoré sa môžu obyčajne používať ako hostiteľské bunky pre nukleovú kyselinu a molekuly proteínov podľa tohto vynálezu, sú uvedené v tabuľke 3.

Vektor DNA sa môže zaviesť do prokaryotických a eukaryotických buniek prostredníctvom bežných transformačných a transfekčných metodík. Tak ako sa používa v tomto dokumente, pojmy „transformácia“ a „transfekcia“, „konjugácia“ a „transdukcia“ sú mienené tak, že odkazujú na rôzne, v danej oblasti techniky známe, metódy na zavádzanie cudzej nukleovej kyseliny (napr. lineárnej DNA alebo RNA (napr. linearizovaný vektor alebo samotný génový konštrukt bez vektora) alebo nukleovej kyseliny vo forme vektora (napr. plazmidu, fágu, „fazmidu“, „fagemidu“, transpozónu alebo inej DNA) do hostiteľskej bunky, vrátane koprecipitácie s fosforečnanom vápenatým alebo chloridom vápenatým, DEAEdextránovo sprostredkovanej transfekcie, lipofekcie, prirodzenej spôsobilosti, chemicky sprostredkovaného transferu alebo elektroporácie. Vhodné metódy na transformovanie alebo transfekovanie hostiteľských buniek sa dajú nájsť v Sambrook, a kol. (Molecular Cloning: A Laboratory manual. 2nd, ed., Cold Spring

Harbor laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) a ďalších laboratórnych príručkách.

Pri stabilnej transfekcii buniek cicavcov, ako je známe, v závislosti na expresnom vektore a použitej transfekčnej metodike, len malá frakcia buniek môže integrovať cudziu DNA do svojho genómu. Za účelom identifikácie a selekcie týchto integrácií sa gén, ktorý kóduje selekčný markér (napr. rezistenciu na antibiotiká) bežne zavádza do hostiteľských buniek spolu s génom, ktorý je predmetom záujmu. Výhodné markéry selekcie sú tie, ktoré prepožičiavajú rezistenciu na liečivá, také ako G418, hygromycín a metotrexát. Nukleová kyselina kódujúca selekčný markér sa môže zaviesť do hostiteľskej bunky na tom istom vektore, ktorý kóduje MP proteín alebo sa môže zaviesť na separátnom vektore. Bunky stabilne transfekované so zavedenou nukleovou kyselinou sa dajú identifikovať napríklad selekciou liečiva (napr. bunky, ktoré inkorporovali selekčný markérový gén prežijú, kým ostatné bunky odumrú).

Za účelom vytvorenia homológneho rekombinantného mikroorganizmu sa pripraví vektor, ktorý obsahuje aspoň časť MP génu, do ktorého sa zaviedla delécia, adícia alebo substitúcia, aby sa týmto spôsobom zmenil, napr. funkčne rozrušil, MP gén. Výhodne, týmto MP génom je Corynebacterium glutamicum MP gén, ale týmto môže byť homológ z príbuznej baktérie alebo dokonca zo zdrojov z cicavcov, kvasiniek alebo hmyzu. Vo výhodnom uskutočnení, je vektor skonštruovaný tak, že homológnou rekombináciou je endogénny MP gén funkčne narušený (t.j. už ďalej nekóduje funkčný proteín; tiež označený ako „knock out“ vektor). Alternatívne, vektor môže byť skonštruovaný tiež tak, že na základe homológnej rekombinácie sa endogénny MP gén zmutuje alebo sa ináč zmení, ale ešte stále kóduje funkčný proteín (napr. protismerná regulačná oblasť sa môže zmeniť tak, že sa zmení expresia endogénneho MP proteínu). V homológnom rekombinantnom vektore, zmenená časť MP génu lemuje jeho 5'- a 3'- konce pomocou dodatkovej nukleovej kyseliny MP génu, čo umožní homológnu rekombináciu medzi exogénnym MP génom prenášaným prostredníctvom vektora a endogénnym MP génom v mikroorganizme. Dodatková lemujúca MP nukleová kyselina má dostatočnú dĺžku na úspešnú homológnu rekombináciu s endogénnym génom. Charakteristicky, niekoľko kilobáz lemujúcej DNA (na oboch 5'- a 3'koncoch) je zahrnutých do vektora (pozri opis homológnych rekombinantných vektorov napr. Thomas, K. R., a Capecchi, M.R. (1987) Celí 51, 503 ). Vektor sa zavádza do mikroorganizmu (napr. pomocou elektroporácie) a bunky, v ktorých sa zavedený MP gén homológne rekombinoval s endogénnym MP génom sa rozdeľujú pomocou metód známych v danej oblasti techniky.

V ďalšom uskutočnení sa môžu produkovať rekombinantné mikroorganizmy, ktoré obsahujú zvolené systémy, ktoré umožňujú regulovanú expresiu zavedeného génu. Napríklad, inklúzia MP génu na vektor, umiestnený tak, že je regulovaný lac operónom, umožňuje expresiu MP génu len v prítomnosti IPTG. Takéto regulačné systémy sú dobre známe v danej oblasti techniky.

V ďalšom uskutočnení je endogénny MP gén v hostiteľskej bunke narušený (napr. homológnou rekombináciou alebo ďalšími genetickými spôsobmi známymi v danej oblasti techniky) tak, že expresia jeho proteínového produktu nenastane.

V ďalšom uskutočnení sa endogénny alebo zavedený MP gén v hostiteľskej bunke zmenil jednou alebo viacerými bodovými mutáciami, deléciami alebo inverziami, ale stále ešte kóduje funkčný MP proteín. V ešte ďalšom uskutočnení sa jedna alebo viac regulačných oblastí (napr. promótor, represor alebo induktor) MP génu v mikroorganizme zmenili (napr. deléciou, trunkáciou, inverziou alebo bodovou mutáciou) tak, že expresia MP génu je modulovaná. Odborník v danej oblasti techniky si bude vedomý, že hostiteľské bunky, obsahujúce viac ako jednu z opísaných MP génových a proteínových modifikácií sa dajú ľahko produkovať s použitím spôsobov podľa tohto vynálezu a sú zahrnuté do rozsahu predloženého vynálezu.

Hostiteľská bunka podľa tohto vynálezu, taká ako prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka, sa môže použiť na kultiváciu, aby sa produkoval (t.j. exprimoval) MP proteín. V súlade s uvedeným, vynález v ďalšom poskytuje spôsoby produkcie MP proteínov s použitím hostiteľských buniek podľa tohto vynálezu. V jednom uskutočnení, spôsob pozostáva z pestovania hostiteľskej bunky podľa tohto vynálezu, (do ktorej sa zaviedol rekombinantný expresný vektor kódujúci MP proteín, alebo do genómu ktorej sa zaviedol gén, kódujúci „divý“ typ alebo zmenený MP proteín) vo vhodnom médiu, až kým sa produkuje MP proteín.

V ďalšom uskutočnení sa spôsob ďalej týka izolácie MP proteínov z média alebo z hostiteľskej bunky.

C. Izolované MP proteíny

Vynález sa ďalej týka izolovaných MP proteínov a ich biologicky aktívnych častí. „Izolovaný“ alebo „purifikovaný“ proteín, alebo jeho biologicky aktívna časť, je v podstate bez bunkového materiálu vtedy, ak bol produkovaný rekombinantnými DNA metódami, alebo bez chemických prekurzorov alebo iných chemických látok vtedy, ak bol syntetizovaný chemicky. Pojem „v podstate bez bunkového materiálu“ označuje preparáty MP proteínu, v ktorých sa proteín oddelil od celulárnych zložiek buniek, v ktorých sa prirodzene alebo pomocou rekombinácie produkuje. V jednom uskutočnení, pojem „v podstate bez celulárneho materiálu“ označuje preparáty MP proteínu, ktoré majú menej ako asi 30 % (v sušine) ne-MP proteínu (tiež označené v tomto dokumente ako „kontaminujúci proteín“), výhodnejšie menej ako asi 20 % ne-MP proteínu, ešte výhodnejšie menej ako asi 10% ne-MP proteínu a najvýhodnejšie menej ako asi 5 % ne-MP proteínu. Ak sa MP proteín alebo jeho biologicky aktívna časť produkuje rekombinantne, tiež je výhodne v podstate bez kultivačného média, t.j. kultivačné médium predstavuje menej ako asi 20 %, výhodnejšie menej ako asi 10% a najvýhodnejšie menej ako asi 5% objemu proteínového preparátu. Slovné spojenie, „v podstate bez chemických prekurzorov alebo iných chemických látok“ označuje preparáty MP proteínu, v ktorých je proteín oddelený od chemických prekurzorov alebo iných chemických látok, ktoré sú zapojené do syntézy proteínu. V jednom uskutočnení, slovné spojenie „v podstate bez chemických prekurzorov alebo iných chemických látok” označuje preparáty MP proteínu, ktoré majú menej ako asi 30 % (v sušine) chemických prekurzorov alebo ne-MP chemických látok, výhodnejšie menej ako asi 20 % chemických prekurzorov alebo ne-MP chemických látok, ešte výhodnejšie menej ako asi 10 % chemických prekurzorov alebo ne-MP chemických látok a najvýhodnejšie menej ako asi 5 % chemických prekurzorov alebo ne-MP chemických látok. Vo výhodných uskutočneniach izolované proteíny alebo ich biologicky aktívne časti neobsahujú kontaminujúce proteíny z toho istého organizmu, z ktorého bol MP proteín odvodený. Charakteristicky sa takéto proteíny produkujú rekombinantnou expresiou, napríklad C. glutamicum MP proteín v takom mikroorganizme, ako je C. glutamicum.

Izolovaný MP proteín alebo jeho časť, podľa tohto vynálezu môže katalyzovať enzýmovú reakciu v metabolickej dráhe pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu, alebo má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1. Vo výhodných uskutočneniach, proteín alebo jeho časť má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), takže proteín alebo jeho časť si udržiava schopnosť katalyzovať enzýmovú reakciu v metabolickej dráhe pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu. Časť proteínu je výhodne biologicky aktívna časť, ako sa to uvádza v tomto dokumente. V ďalšom výhodnom uskutočnení má MP proteín podľa tohto vynálezu aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená s párnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname. V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení má MP proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s nepárne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V ešte inom výhodnom uskutočnení má MP proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá je najmenej asi na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, výhodnejšie najmenej asi na 71 %, 72 %, 73 %,74 %,75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, %, 94 % a dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológna s nukleotidovými sekvenciami podľa tohto vynálezu alebo s ich časťou. Rozsahy a medziľahlé hodnoty identity k vyššie uvedeným hodnotám (napr. na 70 až 90 % identické alebo na 80 až 95 % identitické) taktiež spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, rozsahy hodnôt identity využívajúce kombináciu ktorýchkoľvek z vyššie vymenovaných hodnôt ako horné a/alebo dolné medze sú taktiež zahrnuté. Výhodné MP proteíny podľa predloženého vynálezu majú tiež výhodne najmenej jednu z MP aktivít, ktoré sa opisujú v tomto dokumente. Napríklad, výhodný MP proteín podľa predloženého vynálezu má aminokyselinovú sekvenciu kódovanú nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, a ktorá môže katalyzovať enzýmovú reakciu v metabolickej dráhe pre aminokyselinu, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum“, nukleotid, nukleozid alebo trehalózu, alebo ktorá má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1.

V iných uskutočneniach, MP proteín je v podstate homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) a uchováva si funkčnú aktivitu proteínu jednej z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu, ale odlišuje sa od aminokyselinovej sekvencie, v dôsledku prirodzenej variácie alebo mutagenézy, ako sa to opisuje detailne v I. odstavci vyššie. Podľa toho, v inom uskutočnení, MP proteínom je proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je najmenej asi na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67%, 68%, 69% alebo 70%, výhodnejšie najmenej asi na 71 %,72 %, 73%, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, 93 %, 94 % a dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológna s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, a ktorá má najmenej jednu z MP aktivít opísaných v tomto dokumente. Rozsahy a medziľahlé hodnoty identity k vyššie uvedeným hodnotám (napr. na 70-90 % identitické alebo na 8095 % identitické) taktiež spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, rozsahy hodnôt identity využívajúce kombináciu ktorýchkoľvek vyššie vymenovaných hodnôt ako horné a/alebo dolné medze spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. V ďalšom uskutočnení sa vynález sa týka celej dĺžky proteínu C. glutamicum, ktorý je v podstate homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu.

Biologicky aktívne časti MP proteínu obsahujú peptidy, ktoré majú aminokyselinové sekvencie odvodené z aminokyselinovej sekvencie MP proteínu, napr. aminokyselinovej sekvencie s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname alebo aminokyselinovej sekvencie proteínu homológneho s MP proteínom, ktorý obsahuje menej aminokyselín, než je celá dĺžka MP proteínu, alebo celú dĺžku proteínu, ktorý je homológny s MP proteínom, a vykazujú najmenej jednu aktivitu MP proteínu. Typicky, biologicky aktívne časti (peptidy, napr. peptidy, ktoré sú napríklad 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 alebo viac aminokyselín dlhé) obsahujú doménu alebo motív s najmenej jednou aktivitou MP proteínu. Okrem toho, ďalšie biologicky aktívne časti, v ktorých sú ďalšie oblasti proteínu deletované, sa môžu pripraviť pomocou rekombinantných metód a ohodnotiť na jednu alebo viac aktivít opísaných v tomto dokumente.

Výhodne, biologicky aktívne časti MP proteínu obsahujú jednu alebo viac vybraných domén/motívov alebo ich častí, ktoré majú biologickú aktivitu.

MP proteíny sú výhodne produkované pomocou DNA rekombinantných metodík. Napríklad, molekula nukleovej kyseliny kódujúca proteín sa klonuje do expresného vektora (ako je opísané vyššie), expresný vektor sa zavedie do hostiteľskej bunky (ako je opísané vyššie) a MP proteín sa exprimuje v hostiteľskej bunke. MP proteín sa môže potom izolovať z buniek pomocou vhodných purifikačných postupov, a to použitím štandardných metód na purifikáciu proteínov. Alternatívne k rekombinantnej expresii sa MP proteín, polypeptid, alebo peptid môžu syntetizovať chemicky použitím štandardných metód syntézy peptidov. Okrem toho, natívny MP proteín sa môže izolovať z buniek (napr. endotelových buniek), napríklad použitím anti-MP protilátky, ktorá sa môže produkovať pomocou štandardných metód využívajúcich MP proteín alebo jeho fragment, podľa tohto vynálezu.

Vynález tiež poskytuje chimérové alebo fúzne proteíny. Tak ako sa používa v tomto dokumente, MP „chimérový proteín“ alebo „fúzny proteín“ zahrňuje MP polypeptid, ktorý je účinne spojený s ne-MP polypeptidom. „MP polypeptid“ označuje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia sa zhoduje s MP proteínom, zatiaľ čo „ne-MP polypeptid“ označuje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia zodpovedá proteínu, ktorý v podstate nie je homológny s MP proteínom, napr. proteínu, ktorý sa odlišuje od MP proteínu, a ktorý je odvodený z toho istého organizmu alebo odlišného organizmu. V rámci fúzneho proteínu sa chce pojmom „účinne spojený“ vyjadriť, že MP polypeptid a ne-MP polypeptid sa vzájomne fúziou „in frame“ spoja. Ne-MP-polypeptid sa môže spojiť fúziou s N-koncom a C-koncom MP polypeptidu. Napríklad v jednom uskutočnení fúznym proteínom je GST-MP fúzny proteín, v ktorom MP sekvencie sa fúziou spojili s C-koncovými GST sekvenciami. Takéto fúzne proteíny môžu uľahčiť purifikáciu rekombinantných MP proteínov. V ďalšom uskutočnení, fúznym proteínom je MP proteín obsahujúci heterológnu signálnu sekvenciu na svojom Nkonci. V určitých hostiteľských bunkách (napr. hostiteľských bunkách cicavcov) sa expresia a/alebo sekrécia MP proteínu môže zvýšiť prostredníctvom použitia heterológnej signálnej sekvencie.

Výhodne sa MP chimérový alebo fúzny proteín podľa tohto vynálezu produkuje pomocou štandardných DNA rekombinantných metód. Napríklad, fragmenty DNA kódujúce rôzne polypeptidové sekvencie sa spolu ligujú „in frame“ podľa bežných metód, napríklad sa používajú tupé (zarovnané) (blunt-ended) alebo posunuté (neprekrývajúce sa) (stagger-ended) konce na ligáciu, digescia s reštrikčným enzýmom na poskytnutie vhodných koncov, ak treba, doplnenie kohéznych koncov, spracovanie alkalickou fosfatázou na zamedzenie nežalateľného pripojenia, a enzýmová ligácia. V inom uskutočnení sa fúzny gén môže syntetizovať pomocou bežných metód, vrátane automatických DNA syntetizátorov. Alternatívne sa PCR amplifikácia génových fragmentov môže uskutočniť použitím zakotvených primérov, ktoré spôsobujú komplementárne prečnievania medzi dvoma za sebou nasledujúcimi génovými fragmentárni, ktoré môžu byť potom tepelne hybridizované a reamplifikované, aby sa generovala chimérová génová sekvencia (pozri, napríklad Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel a kol., John Wiley & Sons, 1992). Okrem toho, mnohé expresné vektory, ktoré kódujú fúzny podiel sú už komerčne dostupné (napr. GST polypeptid). MP-kódujúca nukleová kyselina sa môže klonovať do takéhoto expresného vektora, takže fúzny podiel je „in-frame“ spojený s MP proteínom.

Homológy MP proteínu sa môžu vytvárať mutagenézou, napr. diskrétnou bodovou mutáciou alebo trunkáciou MP proteínu. Tak ako sa používa v tomto dokumente, pojem „homológ označuje rôzne formy MP proteínu, ktoré pôsobia agonistický alebo antagonistický na aktivity MP proteínu. Agonista MP proteínu môže udržiavať v podstate rovnaké, alebo podprahové biologické aktivity MP proteínu. Antagonista MP proteínu môže inhibovať jednu alebo viac aktivít prirodzene sa vyskytujúcej formy MP proteínu, napríklad prostredníctvom kompetetívneho viazania sa so smerovým alebo protismerovým členom MP kaskády, ktorá zahŕňa MP proteín. Takto C. glutamicum MP proteín a jeho homológy podľa predloženého vynálezu môžu modulovať aktivitu jednej alebo viacerých metabolických dráh, v ktorých sú MP proteíny v tomto organizme funkčné.

V alternatívnom uskutočnení sa homológy MP proteínu môžu identifikovať skríningom kombinatorických knižníc mutantov, napr. trunkačných mutantov, MP proteínu na MP proteínovú agonistickú alebo antagonistickú aktivitu. V jednom uskutočnení sa variegátna knižnica (variegated library) MP variantov vytvára pomocou kombinatorickej mutagenézy na úrovni nukleovej kyseliny a je kódovaná variegátnou génovou knižnicou. Variegátna knižnica MP variantov sa môže získať napríklad pomocou enzýmovej ligácie zmesi syntetických oligonukleotidov do génových sekvencii tak, že degenerovaný súbor potenciálnych MP sekvencii je exprimovateľný ako individuálne polypeptidy, alebo alternatívne, ako súbor väčších fúznych proteínov (napr. na fágový displej) obsahujúcich súbor MP sekvencii tam uvedených. Existujú rôzne metódy, ktoré sa môžu použiť na vytváranie knižníc potenciálnych homológov MP z degenerovanej oligonukleotidovej sekvencie. Chemická syntéza degenerovanej génovej sekvencie sa môže uskutočniť v automatickom DNA syntetizátore a syntetický gén sa potom liguje do vhodného expresného vektora. Použitie degenerovaného súboru génov umožňuje zabezpečiť v jednej zmesi všetky sekvencie kódujúce požadovaný súbor potenciálnych MP sekvencii. Metódy na syntetizovanie degenerovaných oligonukleotidov sú známe v danej oblasti techniky (pozri napr. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura a kol., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53, 323; Itakura a kol., (1984) Science 198,1056; Ike a kol., (1983) Nucleic Acid Res. 11, 477).

Okrem toho, knižnice fragmentov kódujúcich MP proteín sa môžu použiť na vytváranie variegátnej populácie MP fragmentov na skríning a následnú selekciu homológov MP proteínu. V jednom uskutočnení sa knižnica kódujúcich sekvenčných fragmentov môže vytvárať pomocou spracovania dvojvláknového PCR fragmentu MP kódujúcej sekvencie s nukleázou v podmienkach, v ktorých medzera (nick) sa vyskytuje len raz na molekulu, denaturáciou dvojvláknovej DNA, renaturáciou DNA, aby sa vytvorila dvojvláknová DNA, ktorá môže obsahovať zmysluplné/nezmyselné páry produktov s rôznym počtom medzier, odstránením jednovláknových časti z novovytvorených duplexov pomocou spracovania s S1 nukleázou a ligovaním knižnice výsledného fragmentu do expresného vektora. Pomocou tejto metódy sa môže odvodiť taká expresná knižnica, ktorá kóduje Nkoncové, C-koncové a vnútorné fragmenty rôznych veľkostí MP proteínu.

Viacero metodík je známych v danej oblasti techniky na skríning génových produktov kombinatorických knižníc vytvorených bodovými mutáciami alebo trunkáciou a na skríning cDNA knižníc na génové produkty, ktoré majú zvolené vlastnosti. Takéto metódy sú prispôsobiteľné na rýchly skríning génových knižníc vytvorených kombinatoriálnou mutagenézou MP homológov. Najviac používané metódy, ktoré sú vhodné na vysokoúčinnú „through-put“ analýzu na skríning veľkých génových knižníc, typicky zahrňujú klonovanie génovej knižnice do replikovateľných expresných vektorov, transformovanie vhodných buniek s výslednou knižnicou vektorov a exprimovanie kombinatorických génov v podmienkach, v ktorých detekcia požadovanej aktivity uľahčuje izoláciu vektora kódujúceho gén, ktorého produkt sa detegoval. Rekurzívna množina mutagenézy (REM, recursive ensemble mutagenesis), nová metóda, ktorá zlepšuje frekvenciu funkčných mutantov v knižniciach, sa môže použiť v kombinácii so skríningovými skúškami na identifikáciu MP homológov (Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89,7811 -7815; Delgrave a kol., (1993) Protein Engineering 6_(3), 327-331).

V inom uskutočnení sa skúšky na báze bunky môžu využiť na analýzu variegátnej MP knižnice, ak sa použijú metódy, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky.

D. Použitie a spôsoby vynálezu

Molekuly nukleovej kyseliny, proteíny, proteínové homológy, fúzne proteíny, priméry, vektory a hostiteľské bunky opísané v tomto dokumente sa môžu použiť v jednom alebo vo viacerých nasledovných spôsoboch: identifikácia C. glutamicum a príbuzných organizmov; mapovanie genómov organizmov príbuzných C. glutamicum', identifikácia a lokalizácia C. glutamicum sekvencii, ktoré sú predmetom záujmu; evolučné výskumy; stanovenie oblastí MP proteínu potrebných na funkčnosť; modulácia MP proteínovej aktivity; modulácia aktivity MP dráhy; a modulácia bunkovej produkcie požadovanej zlúčeniny ako napríklad špeciálnej chemikálie.

Molekuly MP nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu majú rozmanité použitia. Po prvé, môžu sa použiť na identifikáciu organizmu, akým je Corynebacterium glutamicum alebo veľmi príbuzných organizmov. Taktiež sa môžu použiť na identifikáciu prítomnosti C. glutamicum alebo príbuzných organizmov v zmiešanej populácii mikroorganizmov. Vynález poskytuje sekvencie nukleových kyselín mnohých C. glutamicum génov; skúmaním extrahovanej genómovej DNA kultúry jednotnej alebo zmiešanej populácie mikroorganizmov v stringentných podmienkach so zameraním sa na takú oblasť C. glutamicum génu, ktorá je charakteristická pre tento organizmus, sa dá zistiť, či je tento organizmus prítomný. I keď Corynebacterium glutamicum samotná je pre ľudí nepatogénna, je príbuzná s takými patogénnymi druhmi pre ľudí ako Corynebacterium diphtheríae. Corynebacterium diphtheríae je kauzatívny agens diftérie, rýchle sa vyvíjajúcej, akútnej horúčkovitej infekcie s následkami tak lokálnej ako aj systémovej patológie. Pri tejto chorobe, sa vyvíja lokálne poškodenie horného respiračného traktu s nekrotickým poškodením epitelových buniek; bacily vylučujú toxín, ktorý sa rozšíri cez toto poškodenie do distálnych vnímavých telesných tkanív. Degeneratívne zmeny spôsobené inhibíciou proteosyntézy v takých tkanivách, ako v srdci, svale, periférnych nervoch, nadobličkách, obličkách, pečeni a slezine, majú za následok systémovú patológiu choroby. Diftéria pretrváva s vysokým výskytom v mnohých častiach sveta, vrátane Afriky, Ázie, východnej Európy a v nezávislých štátoch bývalého Sovietskeho zväzu. Pokračujúca epidémia diftérie vo východnej Európe a nezávislých štátoch bývalého Sovietskeho zväzu si vyžiadala najmenej 5000 úmrtí od roku 1990.

V jednom uskutočnení vynález poskytuje spôsob na identifikáciu prítomnosti alebo aktivity Corynebacterium diphtheríae v subjekte. Týmto spôsobom sa deteguje jedna alebo viacej nukleovokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencií uvedených s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), alebo aminokyselinových sekvencií (napr. sekvencie uvedené s párnym očíslovaním SEQ ID NO:v Sekvenčnom zázname) v subjekte, čím sa deteguje prítomnosť alebo aktivita Corynebacterium diphtheríae v subjekte. C. glutamicum a C. diphtheríae sú príbuzné baktérie a mnohé z molekúl nukleových kyselín a proteínových molekúl v C. glutamicum sú homológne s C. diphtheríae molekulami nukleovej kyseliny a proteínovými molekulami, a preto sa môžu použiť na detekciu C. diphtheríae v subjekte.

Molekuly nukleových kyselín a proteínov podľa tohto vynálezu môžu byť tiež markérmi špecifických oblasti genómu. Je to využiteľné nielen pri mapovaní genómu, ale tiež pri funkčných výskumoch proteínov C. glutamicum. Napríklad na to, aby sa identifikovala oblasť genómu, ku ktorej sa viaže určitý C. glutamicum DNA-väzbový proteín, by sa mal genóm C. glutamicum podrobiť digescii a fragmenty inkubovať s DNA-väzbovým proteínom. Tie, ktoré viažu proteín môžu byť dodatočne sondované s molekulami nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, výhodne s ľahko detegovateľnými značkami; viazanie takejto molekuly nukleovej kyseliny s genómovým fragmentom umožňuje lokalizáciu fragmentu na genómovej mape C. glutamicum, a keď sa to uskutoční viackrát s rôznymi enzýmami, uľahčí to rýchle stanovenie sekvencie nukleovej kyseliny, ku ktorej sa viaže proteín. Ďalej, molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu môžu byť dostatočne homológne so sekvenciami príbuzných druhov, takže molekuly nukleových kyselín môžu fungovať ako markéry pri konštrukcii genómovej mapy v príbuzných baktériách, takých ako Brevibacterium lactofermentum.

Molekuly MP nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sú tiež využiteľné pri evolučných výskumoch a výskumoch proteínovej štruktúry. Metabolické procesy, na ktorých sa molekuly podľa tohto vynálezu podieľajú, využíva veľa rozmanitých druhov prokaryotických a eukaryotických buniek, porovnaním sekvencií molekúl nukleových kyselín podľa predloženého vynálezu s tými, ktoré kódujú podobné enzýmy u iných organizmov sa môže určiť evolučná príbuznosť organizmov. Podobne, takéto porovnanie umožňuje určiť, ktoré oblasti sekvencie sú zachované a ktoré nie, čo môže pomôcť pri stanovení takých oblastí proteínu, ktoré sú esenciálne pre fungovanie enzýmu. Tento druh stanovenia je hodnotný pre výskumy proteínového manipulovania a môže byť indikáciou, čo proteín môže tolerovať pri mutagenéze bez straty funkcie.

Manipulácia molekúl MP nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu môže viesť k produkcii MP proteínov, ktoré sa funkčne odlišujú od „divého“- typu MP proteínov. Tieto proteíny môžu mať zvýšenú účinnosť alebo aktivitu, môžu sa nachádzať vo väčších množstvách v bunke ako obyčajne alebo môžu mať zníženú účinnosť alebo aktivitu.

Vynález tiež poskytuje spôsoby na skríning molekúl, ktoré modulujú aktivitu MP proteínu, buď interakciou so samotným proteínom alebo substrátom alebo väzobným partnerom MP proteínu alebo modulovaním transkripcie alebo translácie molekuly MP nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu. Pri týchto spôsoboch sa mikroorganizmus, ktorý exprimuje jeden alebo viac MP proteínov, podľa tohto vynálezu, kontaktuje s jednou alebo viacerými testovanými zlúčeninami, a takto sa dá stanoviť vplyv každej testovanej zlúčeniny na aktivitu alebo úroveň expresie M P proteínu.

Ak požadovanou špeciálnou chemikáliou, ktorá sa má izolovať z fermentácie kultúry C. glutamicum vo veľkom rozsahu je aminokyselina, vitamín, kofaktor, „nutraceutikum”, nukleotid, nukleozid alebo trehalóza, tak moduláciou aktivity alebo účinnosti aktivity jedného alebo viacerých proteínov podľa tohto vynálezu pomocou mechanizmov genetickej rekombinácie sa môže priamo ovplyvňovať produkcia jednej z týchto špeciálnych chemikálií. Napríklad v prípade enzýmu v biosyntetickej dráhe pre požadovanú aminokyselinu by zlepšenie účinnosti alebo aktivity enzýmu (vrátane prítomnosti mnohonásobných kópií génu) malo viesť k zvýšenej produkcii alebo účinnosti produkcie tejto požadovanej aminokyseliny. V prípade enzýmu v biosyntetickej dráhe pre aminokyselinu, syntéza ktorej je kompetitívna so syntézou požadovanej aminokyseliny, každé zníženie účinnosti alebo aktivity tohto enzýmu (vrátane delécie génu) by malo spôsobiť zvýšenie produkcie alebo účinnosti produkcie požadovanej aminokyseliny, a to v dôsledku poklesu konkurencie pokiaľ ide o medziproduktové zlúčeniny a/alebo energiu. V prípade enzýmu v degradačnej dráhe pre požadovanú aminokyselinu, by každý pokles účinnosti alebo aktivity enzýmu mal spôsobiť väčší výťažok alebo účinnosť produkcie požadovaného produktu, a to v dôsledku zníženia jeho degradácie. Napokon, takou mutagenézou enzýmu zapojeného do biosyntézy požadovanej aminokyseliny, že tento enzým už nie je ďalej schopný inhibície spätnou väzbou, by sa mali dosiahnuť zvýšené výťažky alebo účinnosť produkcie požadovanej aminokyseliny. To isté by sa malo vzťahovať na biosyntetické a degradačné enzýmy podľa tohto vynálezu, ktoré sú zapojené do metabolizmu vitamínov, kofaktorov, „nutraceutík”, nukleotidov, nukleozidov alebo trehalózy.

Podobne, ak požadovanou špeciálnou chemikáliou nie je žiadna z vyššie spomínaných zlúčenín, moduláciou aktivity jedného z proteínov podľa tohto vynálezu sa predsa len môže ovplyvniť výťažok a/alebo účinnosť produkcie zlúčeniny z kultivácie C. glutamicum vo veľkom rozmere. Metabolické dráhy sú v každom organizme vzájomne poprepájané; medziprodukt, ktorý sa používa v jednej dráhe sa často dodáva z inej dráhy. Expresia a funkcia enzýmu sa môže regulovať na základe celulárnych hladín zlúčeniny z iného metabolického procesu a celulárne hladiny molekúl, ktoré sú potrebné na základný rast, ako napríklad aminokyseliny a nukleotidy, môžu rozhodujúco ovplyvňovať životaschopnosť mikroorganizmu pri kultivácii vo veľkom rozmere. Takto sa moduláciou enzýmu na biosyntézu aminokyselín, napríklad takého, ktorý už ďalej nereaguje na inhibíciu spätnou väzbou, alebo takého, ktorý má zvýšenú účinnosť alebo schopnosť premeny môže dosiahnuť zvýšenie celulárnych hladín jednej alebo viacerých aminokyselín. Naopak, takáto zvýšená zásoba aminokyselín poskytuje nielen zvýšený prívod molekúl, ktoré treba na proteosyntézu, ale tiež molekúl, ktoré sa využívajú ako medziprodukty a prekurzory v mnohých ďalších biosyntetických dráhach. Ak je určitá aminokyselina limitujúcou pre bunku, jej zvýšená produkcia môže zvýšiť schopnosť bunky uskutočňovať mnohé ďalšie metabolické reakcie ako i umožňovať bunke účinnejšie produkovať proteíny všetkých druhov, a to snáď zvyšovaním celkovej rýchlosti rastu alebo schopnosti prežitia bunky pri kultivácii vo veľkom rozmere. Zvýšená životaschopnosť zvyšuje počet buniek schopných produkovať požadovanú špeciálnu chemikáliu vo fermentačnej kultivácii, čím sa zvyšuje výťažok tejto zlúčeniny. Podobné procesy sa dajú dosiahnuť moduláciou aktivity degradačného enzýmu podľa tohto vynálezu, takže enzým už ďalej nekatalyzuje, alebo katalyzuje menej účinne, degradáciu celulárnej zlúčeniny, ktorá je dôležitá pre biosyntézu požadovanej zlúčeniny, alebo ktorá bude umožňovať bunke rásť a reprodukovať sa v kultivácii vo veľkom rozmere. Treba zdôrazniť, že optimalizácia degradačnej aktivity znižovaním biosyntetickej aktivity určitých molekúl podľa tohto vynálezu môže mať tiež priaznivý vplyv na produkciu určitých špeciálnych chemikálií z C. glutamicum. Napríklad, znižovaním účinnosti aktivity biosyntetického enzýmu v dráhe, ktorá je kompetitívna s biosyntetickou dráhou požadovanej zlúčeniny pokiaľ ide o jeden alebo viac medziproduktov, viaceré z týchto medziproduktov by mali byť dostupné na konverziu na požadovaný produkt. Podobná situácia môže vyžadovať zvýšenie degradačnej schopnosti alebo účinnosti jedného alebo viacerých proteínov podľa tohto vynálezu.

Vyššie spomenuté stratégie mutagenézy MP proteínov, ktoré poskytujú zvýšené výťažky požadovanej zlúčeniny z C. glutamicum, nie sú mienené ako limitujúce; variácie týchto stratégií mutagenézy sú očividne zrejmé pre odborníkov, ktorí sú skúsení v danej oblasti techniky. Pomocou takýchto mechanizmov sa molekuly nukleovej kyseliny a proteínové molekuly podľa tohto vynálezu môžu využiť na vytváranie C. glutamicum alebo príbuzných kmeňov baktérií, v ktorých expresia mutovaných MP molekúl nukleovej kyseliny a proteínových molekúl je taká, že výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie požadovanej zlúčeniny sa zvýši. Požadovanou zlúčeninou môže byť akýkoľvek prirodzený produkt C. glutamicum, vrátane konečných produktov biosyntetických dráh a medziprodukty prirodzene sa vyskytujúcich metabolických dráh, ako aj molekuly, ktoré sa prirodzene nevyskytujú v metabolizme C. glutamicum, ale ktoré sú produkované kmeňom C. glutamicum podľa tohto vynálezu.

Tento vynález je v ďalšom ilustrovaný pomocou nasledovných príkladov, ktoré by sa nemali chápať ako limitujúce. Obsahy všetkých literárnych odkazov, patentových prihlášok, patentov, publikovaných patentových prihlášok, tabuliek a sekvenčných záznamov, ktoré sú uvedené v tejto prihláške, sú týmto zahrnuté ako odkaz.

SEQ	£ 2.
O	5 Q)
z o	SEQ
	O
	NO

Q.

CD

7Z	G) (D	0 <	7\	0	0
O Q	70 70 iť K	Q Š 1 s	Q □ Q	70 8 K	TJ

X o« □ x oQ.

m !>

Tabuľka 1 Gény v prihláške

588 28 5882éíi8 <S 8 S5 8 8 S S 3 am

z -I £5' D) a.

101 102 RXN03176 W0332 2 862 GLUTAMINÁZA (EC 3.5.1.2)

103 104 F RXA02879 GR10017 2 862 GLUTAMINÁZA jEC 3.5.1.2)

105 106 RXA00278 GR00043 2612 1581 GLUTAMÍN-VIAZUCI PROTEÍNOVÝ PREKURZOR

107 108 RXA00727 GR00193 614 1525 GLUTAMÍN-VIAŽUCI PERIPLAZMOVÝ PROTEÍNOVÝ

SEQ	F 2.
σ	5’ 0)
NO	SEQ
	σ
	ON

σ S z o z c x (D O á·

Q. CD

z & o ta

D O O TJ TJ TJ

O·

Q.

o q

c

Ώ xO

G to sa to to

O) to ro

to

ΓΟ

Š o g x x ^88 _k S -J

X s

A

Š §

to

X

Š

S

50 50 50 50

ŽČŠÍS o o o o o í-ť _k « -A ro

o. (D D í o< □ <'

7Γ O* Q.

C tu OT

Π) 5' c ><

$

Q. ro D

O) ση

S o< □ <* x o· Q.

0) □

5' c x X X X X ..

......Sšš

888 §8 8 to “Π oo

Q. ro □ í o<

□ <·.

O' Q.

i

A

Q 0 0

70 50 50 < O 0 O 0 g X X 50 50

X o □

5'

X

S cn * O

2.

Q to

í) O O Q (ľ) < (ľ) X X X X X X 88888§8 < 0 δ§ 88

Ul ro ro oo ω a·

Qí z -I &

Q)

Λ

8E

K) a*

D) A c ro tu « Ό ro x

IU'

F*

C

0) ro ro Ό ro x !U (Q 5' c •o -4 ro q to ro -o to O ro

O Id

-4 oo ro to o IĎ

Ul -4

CD ro o g a

Ŕa

M

-t & o ro w σ c x ω σ o φ ω T| -TI o o to to T| -n O O 0 0 r- ^— -< O ΓΤΊ XI o o to n

O to m

O to T) O to m ro ro ro « r> > > ΓΠ (n X X x X m X X X ~n o o o ? ~ N N N , ^z to

-n

O to

2.2.3.2,6 o o x T Ϊ z z z z N N M. X g O zzzornm

C □ 7Γ

O Q)' > -*

X W >

< o m .. x _ >->—v

KJ to to to -η TI -n ** > > >

nn^OOOXOO O s >.>.>·X x 52£zNtNN§>>

H H >>

to

O a

50.

O . 0 m m z z >>, mm o o m 0 ro to cn to to ss

O

A ŕo

O

A ŕo σ m σ> O 3 £

X x m x c x N O X

-< > h m (ľ o σ z o >-x x o ro

O

I to m > r σ m T-< u σ m T < ox o 0 m z >· £ > o -< r C ίσο >

>

£ m o ω to to

C □ S

Q) £5¾ z z > z’z r

5 >5 O O 2 Q m m £2 “ > to D >

> > to to U 0 > > 70 70 H H > to “0 >

> > > w « ro x x x x > > > > x x x x > to »»>»

D O ft) O( o < ω

5’ > to

T >

c □ s co > > > i g i z z z o o o z g >>z g’? ž

ΓΤΊ m £ 5 e· e to ro O ro -< z m o to >

to

XXX > > > z z z ro « ro

O H 50 > Z to >'

V • I II II ¹1 ’—ľ m m m m y x -i Axxxxxxp

5.	m o	m o	m m m m m 0 0 o O 0
ΠΊ	ro	to	ro to ro ro to
O	to	p	to to to to p)

Q¹ m o to ώ ui a

Ζ C

ω Μ

N a

K> o

O

*	G)	TJ Τ'	o	0	0	0	0
o □	7)	§ (Λ	71	71	7)	71	X)
5'		ŕ >	8	8 S

k) en

Ó) z -I

g o TO

TI	>	c *
C □	>	51 TJ
7Γ	O	5 >
O	m	2 z
55'	z	3 -<
	O s
	Γ”	Ό Z
	I	>

en ω c 5 z' o <

ΞΪ. □'

RXS02970 ACETYLORNITÍNAMINOTRAŇSFERÁZA (EC 2.6.1.11)

F RXA01009 GR00287 4714 5943 ACETYLORNITÍNAMINOTRANSFERÁZA (EC 2.6.1.11)

□ O 5Γ

0> n< o <

□ φ’ cn -N

χ(θ	ο	X	0	0 <
a □		ο □	7)		ο
Ρ’ 5'	§	3’	8	8	Μ

ζ ω -ΙΌ C2<g> 0> 3	5337	NT Šta	g Μ 00	8 8
* 3

“Π	σ	Π	τοτοτοτ
c	ζ	C	γπ m γτί
□ ρτ	>	□ 7Γ	Ο I 0 X Ο I Ο
ο	-η	Ο	Η -< 1- -< 1- < Γ-
ω'	υ 7J	0)'	ΓΠ σ ζ’σ ζ σ ž’ _ ΤΊ _ ΗΊ ΤΊ —

σ> σι

Z	Z I I	z	z
o 5	o <-<· 3 το to	o 5	o 3
ω	75; m m	·< ω	<7)
m	m > >	m	m
r-	C.N N z m m O O	1“	1“
z’	z'	z'

CD CD

é ίο ίο ίο ίο

CD A K) O 00 CD

A A

O

A A —x •ŕ». N)

Q

-J

Ul K

W 2

Λ

73 Π X) 7)

Q^QO^OOQOQO 8°88S888888 O ro m K S o ί ^M ä 8 8 íl 3 8 8 8

N)

8£

Tabuľka 1 (pokračovanie) Metabolizmus aromatických aminokyselín Nukleová Aminokyselina Identifikačný kód Kontig. NT Štart NT Stop Funkcia kyselina SEQ ID NO

SEQ ID NO

Ŕ

z Η & v	ω c σ	666 4714 4714	NT Šta	NT Šta
S-	ω r*		3.	Ä
Z	fi)	μι ffi -1	Z	z
H	5	k S 8	H	H
S Q	O	Q -1 N	Q O	ω o
15	Φ		ra	fô

σ>

B

CD O CD •M O)

CD CD

0) G) G) G) 0	D G) CD G) 5 Ň5 -* -* 5 -i co ->i	G) G) G) _k —X —X σι ω -*·	SEQ	F
						O	5' Q)
						Z
						O

m	F
O	ro_
ô	3' OJ
z
o

SEQ	f
σ	5’ OJ
z o	SEQ
	O
	NO

X	□	< 0	t:	0	0	0	0	<	Λ	5r	0
o D Q	2 C	§ 73	□ntia.	X	x	x 8 'J	X 8 s	N	□ntia.	o r+	x

z H	0 >		Z H	š	U1 W N K) §	z H	S	ä S
Q)		g A	<Q‘ OJ	o		»· 01	z
			Λ			3-	>

Metabolizmus molybdopterínov

Nukleová Aminokyselina Identifikačný kód Kontiq. NT Štart NT Stop Funkcia kyselina SEQ ID NO

SEQ ID NO

733 734 RXN02802 W0112 1 7369 1 6299 MOEB PROTEÍN BIOSYNTÉZY MOLYBDOPTERÍNU

735 736 F RXA02802 GR00783 7 474 MOEB PROTEÍN BIOSYNTÉZY MOLYBDOPTERÍNU

737 738 F RXA00438 GR00103 362 796 MOEB PROTEÍN BIOSYNTÉZY MOLYBDOPTERÍNU

CO

o

SEQ	F Φ
O	□’ ω
Z
O

(f) m o ô

19	N	^1
O	00	O)

A

N

n) o 8 8

O π X

<00 < 70 70

M 3

0000000 0

U 70707070707070 čn w 0 U M N

G) A Q A CO A A K O)

-«J

n c □ x* o

Q] >

□ o £

2. 5'

0)

ω«

ET

A

ω o to

σ c

5Γ ω

Ό O

0) n< O <

□ 5‘

-j NO

88Π

δι —A

— p CO o o c> oo

0 0 0 X ΣΙ TJ ΣΙ

Q Ο Ο Ο Ο čn čn

Q Ο 0 Q Ο X ΣΙ ΣΙ

0 0 ΣΙ ΣΙ Σ) 888

288

?6Eg äSsjäg? 2Ή°δ§ΐΙ x 5 □.w > § ® m c _z -<.—'lO n7Š f Z m φ 5’ c n -I ° T ° g.hS’s

-= > O (rn z t ·< O Q -t co z m o ® >70 O 8 z 9.3 n >2 m ° 2Š 70 70

-< m 5· *5 m x O£ \ H O b>

σι ω	Ί	—k Q	0 m -* ω	-Ä
N i	<0 5 0) c	0 00 5 -*j	00
ΙΌ 0)	-U		.k	ro
N)		K)	A

I -< σ tj o $ tu □'

Q. (D

ZT Ž* — Ä

ST'

N D) <

9”ω

J'S :< ® O o

Š8 m ω Σ) ω ôZ z'

I

o _ _ ITT -< < -< _mOOO —.7D TJ TJ . z O O O 3

2 2 2 O O O O

D T T T

X 70 X _ _ _ οοοο>·ο·οζ> -H-H-l-l -H-jmZ mmrnm — [ΠΕΟω ľz'O Λ “U ~71 ^{zzz z}mOO-im 2552< »m tj o o o o z h -j 2.fr

Z Z Z Z y 5 5 r-m d d ť d í ϋ.σ S t TJ

O m -i <

-i -i m z

OJ CD 00 O O o o o o

TJ *0 Ό σ o T -i m o

m m m ... _u.

2 2.2 č z'z'z‘z> C C C C Z z g z c č m O m > _k σι σι z”'

k)

0	0	0	0	0
r-	r*	I-	I-	I-
C	C	c	C	C
-1	d	-1	-1	-1
>	>	>	>	>
2	2	2	2	2
>	>·	>	>	>
-1	d	d	-<	-<
T	T	T	T	I
0	0	0	0	0
2	2	2	2	2
O	O	O	O	O
O	O	O	O	O
<	-<	<	-<	<
ω	<z>	ω	ω	(Λ
-1	-í	-1	-1	-1
m	m	m	m	m Z
z'	z	z'	z'

σι

A ώ

co

00	00 00 oo c	D OO C	2 92
σ>	Č) 0) Q) C	n σί ζ	n σι
CD	jL N) o č	o cn j	i. K)

·< A

7\ o

QOO

Q*

Q G) 0 0

TJ TJ

TJ □ 5'

Z —I ω0)

Z —i

Z

to

o

TabuFka 1 (pokračovanie)

CDCD(D(0CD(D(0C0(0(D<0 Oao^MOOOCDÁNJO (O(0CO(O(O(D(D(D(D(D(D tj 8 8 S s í á í ± 8

c»

8^8^	SEQ	F ro
	O	5' Q)
	Z O

g. o

H	z	z	z	z	z	Z
<o	o	o	o	o	o
>· ΓΜ	‘2	2	2	s	2	g
!>	c	σ	σ	σ	σ	σ
	>	>	>	>	>	>
m	N	N	N	N	N	N
o	O	o	O	O	o	o
A	r“	I-	Γ	i-	n	r-
W	5	5	5	5		5
N)	33	70	70	70	70	70
K)	00	oo	00	OD	00	CO
	O	o	O	O	O	O

Regulácia purínových a pyrimidínových biosyntetických dráh σ>

G)

J) 0 O “□

£8^ cá U1

z o tô

m o N ώ K>

Π c □

ti c □

Tabuľka 1 (pokračovanie

g (D é

Q. fD □

X*

0) Ω« □

7Γ O« □.

O < *<'

B φ »“* ω cr o ta o

_> ro é

ZO š

o o

-ο ΙΟ g ο ΡΌ -J

ΖΟ g

ο

Κ)

J^.

g ο ΓΌ to

Ό -J

ZO zo

8 hj to -q rt -Ί

ο. (D g.

s o<

□ <' x Ο» £X

O < Φσ B). N <

ta -η

-O to

O id

Cl o p x· tu o·

D <'

7Ϊ O D

5'

N

B c ω < < ο

-ο o ta <

< g σ

M

ZO

Q ta ro

0 0 0 zo--8

A

717171

888 σι *4

Ν)

-4 *4 k) ί

*4

0 0 0 ZO ZO Z) ZO ---8

k) ~4 Tt k)

0) CO to> qT

8ž to ot o σ -4 a ω

•U *4 to

Ό

4i

N C

N<

7Γ O' CL cn o ta £8

Ν)

CD to

Ο) g

-J σι oo §

ω σ>

to A é

g

-o to

2' m

3c

D X*

O Io/

D

O <

> S “0 m zo c c_ CΟ . U.ta Ζ ~ ώ to ώ ο to z c č m

O _ N N □ O c

n m o o > o m z , - o. i O N.7 ’.N Z ¹ I Z ~ ' σ

>

σ

m...

z z σ

> _ o σ m m z z o o _ _ N N N N p m m οΰοο ω ω >.ni to to -t ° io io

K)

Ó) σι >

m zo >·

k) zo < ω s 3 88

7C O

Q

O ta

O ta xr O < Q) 2 φ

C

Φ O N ď O <

D)

C X^ (D O to to

S ä

σι *4 bJ A

C/l·

Q) Λ

-U & ο ta χ(U τι ο λ· H ί> 0< ο < Ρ 3

Η·

O o íí o o N N z z o σ 55 s I z z >->· 55

O —I -p (f) -< z

H >

-i σ τ m < o ií§ _19 < 5 5 —1 ta —

O 00 N >

x ta

I

K _ ta d. o

0 0 c c c > > > z z z o o o o N N N N z'z'z'z' _ ώ ώ ώ co O q] U) QJ to N I I I I 2'5 5 5 5 ή ω ω ω ω SCCCCΤ' -π -π -η -π tj θοοοο»

C O “ m o o 5^ o o 2 NN >

c

7Γ O

0)* ta CD >

c D 7Γ

O ω

Ο to oí Ϊ33 — t 'ta ta ta —I —I —i —I m m m m , -1 -1 -i -i ta ta ta ta ta >·> > > >

z I n

........ o o o σ σ >« ------ TI o ta CD o ζ

⁵ c 2 > CD z o ο to ο to

Q. O <

z z' m o x -I -I -1 -I O n σ c σ σ o > zo zo x j) x >'>·>'>· -Π =1=10

-< <-< D ZO ZO

O

ΓΤΊ

O to m zo >

□ (D “1

7Γ O □ < Φ Ň ω

O O ta 3 to CD O O

O < r~ t

ΠΊ

-0 co

O ω “Π >’ to£ “Π ^u >0) 7* ^ω ω >».

z >·

O N to > Π^ >-m ω

m o ω en íu m o ω σι A w < z >· σ

m o ω en

55° Z Z N ω ω “*· -π -n -> _ ΓΠ ΓΤΙ κ — z >'J>- >>'

5

k) c I I κ· φ Q. c ΧΓ ο ω' ω d φ CQ ω ο. ω. ο ω

ta

H.

m o zo

q. ň m o m m o o

N) k)

A -U k) k) (D (0 m o ω σι X ω

O to n O I -< σ „______ta ~0OOO S 5-5-5-5.

u uu□2 22 , 5.5.5.5Í55

55555SSS >' m > č &»! > m h σι ο p) σι m o ω m o to

ΓΠ m o

O) ώ σι σι m o σ> ώ σι σι

-4 k)

-4 k>

~4 to io

ΓΠ

O ω

io io

Σ3

ο <

X

Q'

no ro -* -> oo n) o O

CO (D

S’ ω ä

-sj

N) é-₆N3 §

CO to< ω a.

CD

NJ

M \) <

N) A -«J CD

-xj s

«sl čo «si

ES

N3

Xx

NJ sa z -I co o to

0) σ c -r: x n>

H	“Π	T|	“Π	□J	TI	ΠΊ O
O	O	0	0	m	0
w	ω	to	to	-4	to
n	TI	T|	T)	>	“Π	A
O	0	0	0	* č	>	NO
			g	x	—1	—A
m	m	m	m	m	C
H	-1	-1	H		>'O
-<	K	<	-<	O	H
r~	r*	I”	Ι-	x	0
TJ	TJ	T	Ό	x	-/
-<	<	-<	-<	O	q
x	73	2 5	x	0
	222	0	<
σ	ODO	.i.S

Z Z Z Z ú

2SSS>5] cn m -> 70

> m rj ť “í

- c

220 . .. m m S x x o —I m o 5 κι tQ Ό -^ - - -· - O r- . -< -<

ο °í °ž

0^.0 ό ,., ω z -< <

ľ\J ΓΊ <s ry.

T O f“ < x

CD

m o ro

-4 A

OJ

Ό O ?r ω n< o < ω □

Φ

Z 2 X X

CD CD CD o o o o z c x I m o N ____o 5 0 0 0 0 Π3 -n -n n m O O O O O c cn </) to to—. 7š -n m m m m —I >»>«>'>'Ô s.....

TJ o σ C. m σ z o -4 s

x ____O -0 Z Z Z Z c c c c

Σ’ m m m m T.p pop

C □ x o

Q) c i* m . - o < N N -n — t o 2 i- O s

**\ TI >.o

X 03 03 _ O O O Z Z ^_ , c c ž č č γΓΠΓΠ ΪΟΟ A HH ΠΠ ϋ O o z z z c c o x t;

» -— — N

I “Π O to “Π O O m m

-sj CD

Ί£95^ο2 £ o m !> rn £ N c O to ξ.5 z -0 S _T ^C £ 5 P N P C 5 -o

E 2 5 2 ^m č m to -<to -n fΖ<ΓΠ r-, m TT| ΓΠ - — ^w = — o to

O

Ni

I

-n O ω

354; c_ _2 o ·<' “0 TJ o -4 m z' !> “D O Cm z -<* σ o x c x z' o < m» x o > ro O

ΓΠ ?Z

3,<

< o m·:

I o d

> □D O □ § c c

c

LL'.q —

-O ^z h

oi ., o ° £ 0 2

T TI O —I ΠΊ o επί

-o c m o 5 -J t_ — m z -< o o

T c

-, z'> Po m-C c

i '<P i?* ¹ o ! 2 i Π c č m O H

C to N N N □ o o o

TI o I x o π o

C ov o > z

Sgp Ί3 N o σ 3,1 o i- - - J> J» J» m-oj^ss m o K) *4 **s| m m §2 ϋ □ -< <

c π m O to

O -<

>—i * TJ

T)

A3 70 AJ AJ ~ m m m m P⁵ -q--c m z z z ω to ω x

m m m

7) c

ζ.πι m °nO o ω

K3 03 Ώ >

> >

X 73 m m > TJ m ~ —1._ □,> > > to N N N r m m m Nr^r, o m o m m o ιό .. to to to ’

2^..

S ω CD 0)0? ® 00 O K)—' g* c o o o rn m m o o o

-J -sl -J A A A m o ω K? N)

SEQ	F 2.
□	5' D)
Z o

SEQ	F 2.
O	5' Q)
z o

O	C o O
<	“0 < <
m·	m· m·
z
o	o o
2 q	ií.m m Z H H
>	O > >
03	e CD CD
O	O O
r-	r- r-
g	N N S 2
C	C C

ο

Tabuľka 2 Vylúčené gény

|AF145898

|AF 145897

AF 124600

AF124518

API 16184

AF1 14233

AF086704

|AF060558 |

|AF053071 |

AF052652

AF051846

|AF050166 |

|AF050109

AF049897

> Π O A 00 O) Λ.

> “Π o Jk σι CD (D 00

AF041436

AF038651

Tabuľka 2 (pokračovanie)

[inhA

[inhA

aroC; aroK; aroB; pepQ

aroD; aroE

panD

aroA

hisE

ZT (Λ* I

fi) o OD

metA

his A

ω’ Q

□' n* >

argC; argJ; argB; argD; argF; argR; argG; argH

0) (Q T

3 y

largR I

dciAE; apt; rel

Chorizmátsyntáza; šikimátkináza; 3dehydrochinátsyntáza; putativna cytoplazmatická peptidáza

3-dehydrochináza; šikimátdehydrogenáza

L-aspartát-alfa-dekarboxylázový prekurzor

5-enol pyruvátš i ki m át-3-f osfátsyntáza

Fosforibozyl-ATP-pyrofosfohydroláza

Glutamínamidotransferáza

Dehydrochinátsyntetáza |

Homoserín-O-acetyltransferáza

Fosforibozylformimino-5-amino-1- fosforibozyl-4-imidazolkarboxyamidizomeráza

[ATP-fosforibozyltransferáza |

Enoylacylreduktáza (prenášačový proteín) |

N-a c ety I g I uta my I f o sf átredu ktáza; ornitinacetyltransferáza; Nacetylglutamátkináza; acetylornitintransamináza; ornití n karba moyltransferáza; arg i ninový represor; arginínsukcinátsyntáza; argininsukcinátlyáza

[Argininsukcinátlyáza |

| Inozitolmonofosfátfosfatáza |

Argininový represor |

Proteín viažuci dipeptid; adenínfosforibozyltransferáza; GTPpyrofosfokináza

Dusch, N. et al. Expression of the Corynebacterium glutamicum panD gene encoding L-aspartate-alpha-decarboxylase leads to pantothenate overproduction in Escherichia coli, Appl Environ. Microbiol., 65(4)15301539(1999)

Park, S. et al. Isolation and analysis of metA, a methionine biosynthetic gene encoding homoserine acetyltransferase in Corynebacterium glutamicum, Mol. Cells., 8(3):286-294(1998)

Wehmeier, L. et al. 'The role of the Corynebacterium glutamicum rel gene in (p)ppGpp metabolism, Microbiology, 144:1853-1862 (1998)

Ν>

m ο u ω *χ! σ)

[E01375

E01359 '

E01358

D84102

D 17429

AJ238703

|AJ238250 |

AJ224946

AJ 132968

AJOI03I9

AJ007732

AJ004934

AJ001436

Tabuľka 2 (pokračovanie)

trpL; trpE

Q. zr D x·

O Q. >

porA

ndh |

mqo

cat

ftsY, glnB, glnD; srp; amtP

ppc; secG; amt; ocd; soxA

adEpj

Q n r-*· Ί3

Vedúci peptid; antranilátsyntáza

Tryptofánový operón

Protismerový (upstream) štartový kodón homoserínkinázového génu

Homoseríndehydrogenáza; homoserínkináza

2-oxoglutarátdeghydrogenáza

TranspozónIS31831

Porín

NADH-dehydrogenáza |

L-malát: chinón-oxidoreduktáza

Chloramfenikolacetoyltransferáza

Zapojený do bunkového delenia; Pil proteín;; uridylotransferáza (enzým odstraňujúci uridyl-) signálna rozpoznávacia častica; nizkoafinitný amóniový transportný proteín (pre príjem)

ÍFosfoenolpyruvátkarboxyláza; ?; vysokoafinitný amóniový transportný proteín (pre príjem); putatívna ornitíncyklodekarboxyláza; sarkozínoxidáza

Tetrahydrodipikolinátsukcinyláza (neúplná ) I____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Transport ektoinu.glycinu, betainu, prolínu

Matsui, K. et al. Tryptophan operon, peptide and proteín coded thereby, utilization of tryptophan operon gene expression and production of tryptophan, Patent: JP 1987244382-A 1 10/24/87

Katsumata, R. et al. Production of L-thereonine and L-isoleucine, Patent: JP 1987232392-A 2 10/12/87

Katsumata, R. et al. Production of L-thereonine and L-isoleucine, Patent- JP 1987232392-A 1 10/12/87

Usuda, Y. etal. Molecular cloning of the Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum AJ 12036) odhA gene encoding a novel type of 2-oxoglutarate dehydrogenase, Microbiology, 142:3347-3354 (1996)

Vertes et al. Isolation and characterization of IS3 1 83 1, a transposable element from Corynebacterium glutamicum, Mot Microbioi., 11 (4): 739-746 (1994)

Lichtinger, T. et al. Biochemical and biophysical characterization of the celí wal) porin of Corynebacterium glutamicum: The channel is formed by a low molecular mass polypeptide, Biochemistry, 3 7(43): 15024- 15032 (1998)

Molenaar, D. etal. Biochemical and genetic characterization of the membrane-associated malate dehydrogenase (acceptor) from Corynebacterium glutamicum, Eur. J. Biochem., 254(2):395-403 (1998)

Jakoby, M. et al. Nitrogen regulation in Corynebacterium glutamicum; Isolation of genes involved in biochemical characterization of corresponding proteins, FEMS Microbioi, 1 73(2):303-3 10(1 999)

Wehrmann, A. et al. Different modes of diaminopimelate synthesis and their role in celí wall integrity: A study with Corynebacterium glutamicum/’ J. Bacterial., 180(12):3 159-3 165 (1998)

Peter, H. et al. Corynebacterium glutamicum is equipped with four secondary carriers for compatible solutes: Identification, sequencing, and characterization of the proline/ectoine uptake systém, ProP, and the ectoine/proline/glycine betaine carrier, EctP.'V. Bacterial., 180(22):6005-6012 (1998)

ω

E06826

E06825

E06I46

E06111

E06110

E05779

E05776

E05112

E05108

E04484

E04377

E04376

E04307

E04041

E04040

E03937

EOI377

Tabuľka 2 (pokračovanie)

Mutovaná aspartátkinázová alfa podjednotka

Aspartátkináza

Acetohydroxysyntetáza

Mutovaná prefenátdehydratáza

Prefenátdehydratáza

Treonínsyntáza

Diaminopimeloyldehydrogenáza

Dihydrodipicolinátsyntetáza

Aspartátkináza

Prefenátdehydratáza

Izocitrátiyáza-N-koncový fragment

Izocitrátlyáza

Flavinaspartáza

Destiobiotínsyntetáza

Diamino : pelargonoyl-aminotransferáza

Biotinsyntáza

Promótorove a operátorove oblasti tryptofánového operónu

Sugimoto, M. et al. Mutant aspartokinase gene, patent: JP 1994062866-A 1 03/08/94

Sugimoto, M. et al. Mutant aspartokinase gene, patent: JP 1994062866- A 1 03/08/94

Inui, M. et al. Gene capable of coding Acetohydroxy acid synthetase and its use, Patent: J P 1993344893-A 1 12/27/93

Kikuchi, T. etal. Production of L-phenylalanine by fermentation method, Patent: JP 1993344881-A 1 12/27/93

Kikuchi, T. et al. Production of L-phenylalanine by fermentation method, Patent: J P 1993344881-A 1 12/27/93

Kohama, K. et al. Gene DNA coding threonine synthase and its use,” Patent: J P 1993284972-A 1 11/02/93

Kobayashi, M. et al. Gene DNA coding Diaminopimelic acid dehydrogenase and its use, Patent: J P 1993284970-A 1 1 1/02/93

Hatakeyama, K. et al. Gene DNA coding dihydrodipicolinic acid synthetase and its use, Patent: JP 1993 184371 -A 1 07/27/93

Fugono, N. et al. Gene DNA coding Aspartokinase and its use, Patent: JP 1993184366-A 107/27/93

Sotouchi, N. et al. Production of L-phenylalanine by fermentation, Patent: JP 1993076352-A 2 03/30/93

Katsumata, R. etal. Gene manifestation controlling DNA, Patent: JP 1993056782- A 3 03/09/93

Katsumata, R. etal. Gene manifestation controlling DNA, Patent: JP 1993056782-A 3 03/09/93

Kurusu, Y. et al. Gene DNA coding aspartase and utilization thereof, Patent: J P 1993030977- A 1 02/09/93

Kohama, K. et al. Gene coding diaminopelargonic acid aminotransferase and desthiobiotin synthetase and its utilization, Patent: JP 1992330284-A 1 11/18/92

Kohama, K. et al. Gene coding diaminopelargonic acid aminotransferase and desthiobiotin synthetase and its utilization, Patent: JP 19923 302 84- A 1 11/18/92

Hatakeyama, K. etal. DNAfragmentcontaining genecapableof coding biotin synthetase and its utilization, Patent: JP 1992278088-A 1 10/02/92

Matsui, K. et al. 'Tryptophan operon, peptide and proteín coded thereby, utilization of tryptophan operon gene expression and production of tryptophan, Patent: JP 1987244382-A 1 10/24/87

El 2773

El 2770

El 2767

El2764

El 2760, El 2759, El 2758

El 2594

E08901

E08900

E08649

E08646

E08643

E08234

E08232

m m m m m ogooo ω S ω ω ω -k C0 -x -k -k 00 -A 00 *4 K) - p (D 00

EOS 177

EO77O1

E06827

| Tabuľka 2 (pokračovanie)

secE

secY

Reduktáza kyseliny dihydrodipikolínovej

Aspartátkináza

Syntetáza kyseliny dihydrodipikolínovej

Arginyl-tRNA syntetáza; diaminopimeloyldekarboxyláza

Transpozáza

Serínhydroxymetyltransferáza

Diaminopimeloyldekarboxyláza

Dihydrodipikolinátreduktáza

Aspartáza

Biotinsyntetáza

FT aminotransferázová a destiobiotinsyntetázová promótorova oblasť

Acetohydroxyizomeroreduktáza

Spätnoväzbovou inhibíciou uvoľnená aspartátkináza

Aspartátkináza

Mutovaná aspartátkinázová alfa podjednotka

Moriya, M. et al. Amplification of gene using artificial transposon, Patent: JP 1997070291-A 03/18/97

Moriya, M. et al. Amplification of gene using artificial transposon, Patent: J P 1997070291-A 03/18/97

Moriya, M. et al. Amplification of gene using artificial transposon, Patent: JP 1997070291-A 03/18/97

Moriya, M. et al. Amplification of gene using artificial transposon, Patent: JP 1997070291-A 03/18/97

Moriya, M. et al. Amplification of gene using artificial transposon, Patent: JP 1997070291 -A 03/1 8/97

Hatakeyama, K. et al. Production of L-trypophan, Patent: JP 1997028391 -A 1 02/04/97

Madori, M. et al. DNA fragment containing gene coding Diaminopimelic acid decarboxylase and utilization thereof, Patent: JP 1995075579-A 1 03/20/95

Madori, M. et al. DNA fragment containing gene coding Dihydrodipicolinate acid reductase and utilization thereof, Patent: J P 1995075578-A 1 03/20/95

Kohama, K. et al DNA fragment having promoter function in coryneform bacterium,” Patent: JP 199503 1478-A 1 02/03/95

Hatakeyama, K. et al. DNA fragment having promoter function in coryneform bacterium, Patent: JP 1 99503 1476-A 1 02/03/95

Hatakeyama, K. etal. DNA fragment having promoter function in coryneform bacterium, Patent: JP 1 99503 1476-A 1 02/03/95

Asai, Y. et al. Gene DNA coding for translocation machinery of proteín, Patent: JP 1994277073-A 1 10/04/94

Inui, M. et al. Gene DNA coding acetohydroxy acid isomeroreductase, Patent J P 1994277067-A 1 10/04/94

Sato, Y. et al. Genetic DNA capable of coding Aspartokinase released from feedback inhibition and its utilization, Patent: JP 1 99426 1766-A 1 09/20/94

Sato, Y. et al. Genetic DNA capable of coding Aspartokinase released from feedback inhibition and its utilization, Patent: JP 199426 1766-A 1 09/20/94

Honno, N. et al. Gene DNA participating in integration of membraneous proteín to membráne, Patent: JP 1994 169780-A 1 06/21/94

Sugimoto, M. et al. Mutant aspartokinase gene, patent: JP 1994062866- A 1 03/08/94

cn

Ml 6664

Ml 6663

M16175

Ml 3774

L35906

L28760

L27126

L27I23

Ll 8874

L09232

L07603

LOI508

El3655

Tabuľka 2 (pokračovanie)

trp A

-t Ό m

5S rRNA

dtxr

aceA

0) o CD 00

PtsM

HvB; ilvN; ilvC

EC 4.2.1. 15

llvA

-1 •2 Ό r-t- O TJ Q)· □ ω < □ Q). N Q) ω í' 7Γ o □ Φ o

Antranilátsyntáza, 5'-koniec

Prefenátdehydratáza

Represor toxínu záškrtu

Isocitrátlyáza

Pyruvátkináza

Malátsyntáza

Fosfoenolpyruvát: sacharid-fosfotransferáza

Syntéza acetohydroxylovej kyseliny, veľká podjednotka; Syntáza acetohydroxylovej kyseliny, malá podjednotka; Izomeroreduktáza acetohydroxylovej kyseliny

3-deoxy-D-arabinoheptulózonát-7- fosfátsyntáza

Treoníndehydratáza

Glu kóza-6-fosfátdehydrog enáza

Sano, K. et al. Structure and function of the trp operon control regions of Brevibacterium lactofermentum, a giutamic-acid-producing bacterium, Gene, 52:191-200(1987)

Sano, K. et al. Structure and function of the trp operon control regions of Brevibacterium lactofermentum, a glutamic-acid-producing bacterium, Gene, 52:191-200(1987)

Park, Y-H. et al. Phylogenetic analysis of the coryneform bacteria by 56 rRNA sequences, J. Bacteriol., 169:1801-1806(1987)

Follettie, M.T. et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of the Corynebacteríum glutamicum pheA gene, J. Bacteriol., 167:695-702 (1986)

Oguiza, J.A. et al. Molecular cloning, DNA sequence analysis, and characterization of the Corynebacteríum diphtheriae dtxR from Brevibacterium lactofermentum,./ Bacteriol., 177(2):465-467(1995)

Jetten, M. S. et al. Structural and functional analysis of pyruvate kinase from Corynebacteríum glutamicum, Appl. Environ. Microbiol., 60(7):250 1-2507 (1994)

Lee, H-S. et al. Molecular characterization of aceB, a gene encoding malate synthase in Corynebacteríum glutamicum, J. Microbiol. Biotechnoi, 4(4):256-263 (1994)

Fouet, A et al. Bacillus subtilis sucrose-specific enzýme II of the phosphotransferase systém: expression in Escherichia coli and homology to enzymes II from enteric bacteria, PNAS USA, 84(24):8773-8777 (1987); Lee, J.K. et al. Nucleotide sequence of the gene encoding the Corynebacteríum glutamicum mannose enzýme II and analyses of the deduced protein sequence, FEMS Microbiol. Lett., 1 19(1 -2): 137- 145 (1994)

Keilhauer, C. et al. Isoleucine synthesis in Corynebacteríum glutamicum: molecular analysis of the UvB-ilvN-ilvC operon, J. Bacteria/., 175(17):55955603(1993)

Chen, C. et al. 'The cloning and nucleotide sequence of Corynebacteríum glutamicum 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase gene, FEMS Microbiol. Lett., 107:223-230(1993)

Moeckel, B. etal. Functional and structural analysis of the threonine dehydratase of Corynebacteríum glutamicum,./ Bacteria/., 174:8065-8072 (1992)

Hatakeyama, K. et al. Glucose-6-phosphate dehydrogenase and DNA capable of coding the samé, Patent: JP 1997224661 -A 1 09/02/97

CD

U31230	U31225	U31224	|U 14965	U 13922	UI1545	S59299	M89931	M85107, M85108	M85106	M258I9	| Tabuľka 2 (pokračovanie)
obg; proB; unkdh	proC	ppx	recA	cglIM; cglIR; clgUR	trpD	trp	aecD; brnQ; yhbw
?;gama- giutamylkináza; podobná Dizomérnym špecifickým 2-hydroxyacid dehydrogenázam	L-prolín: NADP+ 5-oxidoreduktáza			Putativny typ II 5-cytozínmetyltransferázy; putativny typ II reštrikčnej endonukleázy; putativny typ I alebo typ III reštrikčnej endonukleázy	Antranilátfosforibozyltransferáza	Vedúci gén (promótor)	Beta C-S lyáza; transportný prenášač rozvetveného aminokyselinového reťazca; hypotetický proteín yhbw	Gén 23S rRNA inzerčnej sekvencie	Gén 23S rRNA inzerčnej sekvencie	Fosfoenolpyruvátkarboxyláza
Ankri, S. et al. Mutations in the Corynebacterium glutamicumproline biosynthetic pathway: A natural bypass of the pro A step, J. Bacterial, 178(15):4412-4419(1996)	Ankri, S. et al. Mutations in the Corynebacterium glutamicumproline biosynthetic pathway: A natural bypass of the proA step, J. Bacterial, 178(15):4412-4419(1996)	Ankri, S. et al. Mutations in the Corynebacterium glutamicumproline biosynthetic pathway: A natural bypass of the proA step, J. Bacterial, 178(15):4412-4419(1996)		Schafer, A. et al. Cloning and characterization of a DNA región encoding a stress-sensitive restriction systém from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 and analysis of its role in intergeneric conjugation with Escherichia coli, J. Bacterial, 1 76(23):7309-73 1 9 (1994); Schafer, A. et al. 'The Corynebacterium glutamicum cglIM gene encoding a 5-cytosine in an McrBCdeficient Escherichia coli strain, Gene, 203(2):95-101 (1997)	O'Gara, J.P. and Dunican, L.K. (1994) Complete nucleotide sequence of the Corynebacterium glutamicum ATCC 21850tpD gene.Thesis, Microbiology Department, University College Galway, Ireland.	Herry, D.M. et al. Cloning of the trp gene cluster from a tryptophanhyperproducing strain of Corynebacterium glutamicum: identification of a mutation in the trp leader sequence, Appl. Environ. Microbioi, 59(3):79 1-799 (1993)	Rossol, I. et al. The Corynebacterium glutamicum aecD gene encodes a C-S lyase with alpha, beta-elimination activity that degrades aminoethylcysteine, J. Bacterial, 1 74(9):2968-2977 (1992); Tauch, A. et al. Isoleucine uptake in Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 is directed by the brnQ gene product, Árch. Microbioi, 169(4):303-312(1998)	Roller, C. et al. Gram-positive bacteria with a high DNA G+C content are characterized by a common insertion within their 23S rRNA genes, J. Gen. Microbioi., 1 38: 1 1 67- 1 1 75 ( 1 992)	Roller, C. et al. Gram-positive bacteria with a high DNA G+C content are characterized by a common insertion within their 23 S rRNA genes, J. Gen. Microbioi, 138:1167-1175(1992)	O'Regan, M. et al. Cloning and nucleotide sequence of the Phosphoenolpyruvate carboxylase-coding gene of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Gene, 77(2):237-25 1 (1989)

-sl

Χ54740

X54223

X53993

XI7313

XI 4234

X07563

X04960

U89648

C σι ω σι 00

IU43536 I

U43535

U35023

U31281

Tabuľka 2 (pokračovanie)

argS; lysA

a ω -σ >

fda

EC 4.1. 1.31

lys A

trpA; trpB; trpC; trpD; trpE; trpG; trpL

ω Ό ΖΓ ω

Ο Ό 00

cmr

thtR; accBC

bioB

Arginyl-tRNA syntetáza; Diaminopimelátdekarboxyláza

AttB-príbuzné miesto

L-2, 3-dihydrodipikolinátsyntetáza (EC 4.2.1.52)

Fru któza-bi sfosfátal dol áza

Fosfoenolpyruvátkarboxyláza

DAP-dekarboxyláza (mezodiaminopimelátdekarboxyláza,EC 4. 1. 1. 20)

Tryptofánový operón

Corynebacterium glutamicum neidentifikovaná sekvencia zapojená do biosyntézy histidínu, čiastočná sekvencia

ω _ι' cn Γ ω 3 2 Ο CQ π Ο Ν Q.’ Ο ω Ο , 0) 2 ω φ ω* Ν ω

|ATP-väzbový proteín teplotného šoku |

Proteín multiliekovej rezistencie

Tiosulfátsulfurtransferáza; acyl- CoAkarboxyláza

Biotinsyntáza

Marcel, T. et al. Nucleotide sequence and organization of the upstream región of the Corynebacterium glutamicum lysA gene, Mol. Microbiol., 4(1 1):18191830(1990)

Cianciotto, N. et al. DNA sequence homology between att B-related sites of Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium glutamicum , and the attP site of lambdacorynephage, FEMS. Microbiol, Lew., 66:299-302(1990)

Bonnassie, S. et al. Nucleic sequence of the dapA gene from Corynebacterium glutamicum, Nucleic Acids Res., 1 8(2 1 ):642 1 ( 1 990)

Von der Osteň, C.H. et al. Molecular cloning, nucleotide sequence and finestructural analysis of the Corynebacterium glutamicum fda gene: structural comparison of C. glutamicum fructose-1,6-biphosphate aldolase to class I and class II aldolases, Mol. Microbiol.,

Eikmanns, B.J. et al. 'The Phosphoenolpyruvate carboxylase gene of Corynebacterium glutamicum: Molecular cloning, nucleotide sequence, and expression, Mol. Gen. Genet., 218(2):330-339 (1989); Lepiniec, L. etal. Sorghum Phosphoenolpyruvate carboxylase gene family: structure, function and molecular evolution, Plánt. Mol. Biol, 21 (3):487-502 (1993)

Yeh, P. et al. Nucleic sequence of the lysA gene of Corynebacterium glutamicum and possible mechanisms for modulation of its expression, Mol. Gen. Genet., 212(1):1 12-1 19(1988)

Matsui, K. et al. Complete nucleotide and deduced amino acid sequences of the Brevibacterium lactofermentum tryptophan operon, Nucleic Acids Res., 14(24):101 13-101 14(1986)

Jáger, W. et al. A Corynebacterium glutamicum gene conferring multidrug resistance in the heterologous host Escherichia coli, J. Bacterial., 179(7):2449-2451 (1997)

Jáger, W. et al. A Corynebacterium glutamicum gene encoding a two-domain protein similar to biotin carboxylases and biotin-carboxyl-carrier proteins, Árch. Microbiol., 166(2);76-82( 1996)

Serebriiskii, I.G., Two new members of the bio B superfamily: Cloning, sequencing and expression of bio B genes of Methylobacillus flagellatum and Corynebacterium glutamicum, Gene, 175:15-22 (1996)

X69104

X69103

|X67737

X66112

X 0) σ> o -si 00

X60312

X59404

X59403

X57226

X56075

X56037

X55994

Tabuľka 2 (pokračovanie)

O ω -o M

Γ Q. ω σ OD

(Q

copl

lysí

gdh i____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

gap;pgk; tpi

lysC-alpha; lysC-beta; asd

attB-related site

zr O

trpL; trpE

I S3 príbuzný inzerčný element

Proteín povrchovej vrstvy PS2

| Dihydrodipikolináreduktáza

Citrátsyntáza

Psi proteín

L-lyzinpermeáza

Glutamátdehydrogenáza I

Glyceraldehyde-3-fosfát; fosfoglycerátkináza; tri ózof o sf áti zo m eráza

Aspartátkináza-alfa-podjednotka As partátkináza-beta-podj ednotka as partátbeta-semialdehyddehydrogenáza

Miesto pripojenia

Treoninsyntáza

Putativny vedúci peptid; antranilátsyntázový komponent 1

Bonamy, C. et al. Identification of IS 1206, a Corynebacterium glutamicum IS3-related insertion sequence and phylogenetic analysis, Mol. Microbioi, 14(3):57 1-581 (1994)

Peyret, J.L. et al. Characterization of the cspB gene encoding PS2, an ordered surface-layer proteín in Corynebacterium glutamicum, Mol. Microbioi, 9(1):97- 109 (1993)

Eikmanns, B.J. et al. Cloning sequence, expression and transcriptional analysis of the Corynebacterium glutamicum gltA gene encoding citrate synthase, Microbioi, 140:1817-1828 (1994)

Joliff, G. etal. Cloning and nucleotide sequence of the cspl gene encoding PS1, one of the two major secreted proteins of Corynebacterium glutamicum: The deduced N -terminál región of PS1 is similar to the Mycobacterium antigén 85 complex, Mol. Microbioi, 6(16):2349-2362 (1992)

Seep-Feldhaus, A.M. et al. Molecular analysis of the Corynebacterium glutamicum lysí gene involved in lysine uptake, Mol. Microbioi., 5(12):29953005(1991)

Bormann, E.R. etal. Molecular analysis of the Corynebacterium glutamicum gdh gene encoding glutamate dehydrogenase, Mol. Microbioi, 6(3):3 17-326 (1992)

Eikmanns, B.J. Identification, sequence analysis, and expression of a Corynebacterium glutamicum gene cluster encoding the three glycolytic enzymes glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 3-phosphoglycerate kinase, and triosephosphate isomeras,./ Bacterioi, 174(19):6076-6086 (1992)

Kalinowski, J. et al. Genetic and biochemical analysis of the Aspartokinase from Corynebacterium glutamicum, Mol. Microbioi, 5(5): 1 197-1204 (1991); Kalinowski, J. et al. Aspartokinase genes lysC alpha and lysC beta overlap and are adjacent to the aspertate beta-semialdehyde dehydrogenase gene asd in Corynebacterium glutamicum, Mol. Gen. Genet., 224(3):3 1 7-324 (1 990)

Cianciotto, N. et al. DNA sequence homology between an B-related sites of Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium glutamicum , and the attP site of lambdacory nephage, FEMS. Microbioi, Lett., 66:299-302(1990)

Han, K.S. et al. 'The molecular structure of the Corynebacterium glutamicum threonine synthase gene, Mol. Microbioi, 4(10): 1693- 1702 (1990)

Heery, D.M. et al. Nucleotide sequence of the Corynebacterium glutamicum trpE gene, Nucleic Acids Res., \ 8(23):7 138(1 990)

CO CO

X81379

X81191

X80629

X78491

X77384

X77034

X76875

X75504

X75085

X75083, X70584

| ssezzxl

X71489

X70959

| Tabuľka 2 (pokračovanie)

dapE

gluA; gluB; gluC; gluD

0) ω σ z >

aceB

recA

tuf

ace A; thiX

recA

mtrA

O □ z >

icd

leuA

Sukcinyldiaminopimelátdesukcinyláza

Glutamátový transportný systém

16S ribozómová RNA

Malátsyntáza

Elongačný faktor Tu

ATP-ázová-beta-podjednotka

Čiastková izocitrátlyáza 7

5-metyltryptofánová rezistencia

Glutamátdehydrogenáza (NADP+) |

Izocitrátdehydrogenáza (NADP+)

Izopropylmalátsyntáza

Wehrmann, A. et al. Analysis of different DNA fragments of Corynebacterium glutamicum complementing dapE of Escherichia coli, Microbiology, 40:3349-56 (1994)

Kronemeyer, W. et al. Structure of the gluABCD cluster encoding the glutamate uptake systém of Corynebacterium glutamicum, J. Bacterioi., 177(5):1 152-1 158 (1995)

Rainey, F.A. et al. Phylogenetic analysis of the genera Rhodococcus and Norcardia and evidence for the evolutionary origin of the genus Norcardia from within the radiation of Rhodococcus species, Microbioi., 141:523-528 (1995)

Reinscheid, D.J. etal. Malate synthase from Corynebacterium glutamicum pta-ack operon encoding phosphotransacetylase: sequence analysis, Microbiology, 1 40:3099-3 1 08 ( 1 994)

Billman-Jacobe, H. Nucleotide sequence of a recA gene from Corynebacterium glutamicum, DNA Seq., 4(6):403-404 (1994)

Ludwig, W. et al. Phylogenetic relationships of bacteria based on comparative sequence analysis of elongation factor Tu and ATP-synthase beta-subunit genes, Antónie Van Leeuwenhoek, 64:285-305 (1993)

Ludwig, W. et al. Phylogenetic relationships of bacteria based on comparative sequence analysis of elongation factor Tu and ATP-synthase beta-subunit genes, Antónie Van Leeuwenhoek, 64:285-305 ( 1 993)

i Reinscheid, D.J. et al. Characterization of the isocitrate lyase gene from Corynebacterium glutamicum and biochemical analysis of the enzýme, J. Bacterioi, 176(12):3474-3483 (1994)

Fitzpatrick, R. et al. Construction and characterization of recA mutant strains of Corynebacterium glutamicum and Brevibacterium lactofermentum, Appl. Microbioi Biotechnoi, 42(4):575-580 (1994)

Heery, D.M. et al. A sequence from a tryptophan-hyperproducing strain of Corynebacterium giutamicum encoding resistanceto 5-methyltryptophan, Biochem. Biophys. Res. Commun., 20 1(3): 1255- 1262 (1994)

Eikmanns, B.J. et al. Cloning sequence analysis, expression, and inactivation of the Corynebacterium glutamicum icd gene encoding isocitrate dehydrogenase and biochemical characterization of the enzýme, J. Bacterial., 177(3):774-782(1995)

Patek, M. et al. Leucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: enzýme activities, structure of leuA, and effect of leuA inactivation on lysine synthesis, /tyy?/. Environ. Microbioi, 60(1): 133-140 (1994)

(D O

Χ90359

X90358

X90357

X90356

X89850

X89084

X86157

X85965

X84257

X82929

X82928

X8206I

Tabuľka 2 (pokračovanie)

attB

pta; ack A

argB; argC; argD; argF; argJ

aroP; dapE

16SrDNA

proA

asd; lysC

05 ω ô z >

Promótorovýr fragment F13

Promótorový fragment F10

Promótorový fragment F2

Promótorový fragment Fl

Miesto pripojenia

Fosfátacetyltransferáza; acetátkináza

Acetylglutamátkináza; N-acetyl-gamaglutamylfosfátredu ktáza; acetyl : ornitín-aminotransferáza; ornitin : karbamoyl-transferáza; glutamát-Nacetyl-transferáza

Permeáza aromatickej aminokyseliny, ?

16S ribozómová RNA

Gam a-g I utamylf osf átred u ktáza

Aspartátsemialdehyddehydrogenáza; ?

16S ribozómová RNA

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Le Marrec, C. et al. Genetic characterization of site-specific integration functions of phi AAU2 infecting Arthrobacter aureus C70, J. Bacterial., 178(7): 1996-2004 (1996)

Reinscheid, D.J. et al. Cloning, sequence analysis, expression and inactivation of the Corynebacterium glutamicum pta-ack operon encoding phosphotransacetylase and acetate kinase, Microbiology, 145:503-513 (1999)

Sakanyan, V. et al. Genes and enzymes of the acetyl cycle of arginine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum: enzýme evolution in the early steps of the arginine pathway, Microbiology, 142:99-108 (1996)

Wehrmann et al. Functional analysis of sequences adjacent to dapE of C. glutamicum proline reveals the presence of aroP, which encodes the aromatic amino acid transportér, J. Bacterial., 177(20):599 1-5993 (1995)

Pascual, C. etal. Phylogenetic analysis of the genus Corynebacterium based on 16S rRNA gene sequences, Int. J. Syst. Bacterial. , 45(4):724-728 (1995)

Serebrijski, I. et al. Multicopy suppression by asd gene and osmotic stressdependent complementation by heterologous proA in proA mutants, J. Bacterial., 177(24):7255-7260(1995)

Serebrijski, I. et al. Multicopy suppression by asd gene and osmotic stressdependent complementation by heterologous proA in proA mutants, J. Bacterial., 177(24):7255-7260(1995)

Ruimy, R. et al. Phylogeny of the genus Corynebacterium deduced from analyses of small-subunit ribosomal DNA sequences, Int. J. Syst. Bacterial., 45(4):740-746(1995)

Χ96471

Χ95649

X935I4

X93513

X90368

X90367

X90366

X90365

X90364

X90363

X90362

X9036I

Χ90360

Tabuľka 2 (pokračovanie)

lysE; lysG

orf4

CT (D U

amt

Proteín pre export lyzínu; Regulačný proteín pre export lyzínu

Glycín-betaínový transportný systém

Amónium-transportný systém

Promótorový fragment PF109

Promótorový fragment PF104

Promótorový fragment PF101

Promótorový fragment F75

Promótorový fragment F64

Promótorový fragment F45

Promótorový fragment F37

Promótorový fragment F34

Promótorový fragment F22

Vrljic, M. et al. A new type of transportér with a new type of cellular function: L-lysine export from Corynebacterium glutamicum, Mol. Microbiol., 22(5):8 1 5-826 ( 1 996)

Patek, M. et al. Identification and transcriptional analysis of the dapB-ORF2dapA-ORF4 operon of Corynebacterium glutamicum, encoding two enzymes involved in L-lysine synthesis, Biotechnol. Lett., 19:1 1 13-1 1 17(1997)

Peter, H. et al. Isolation, characterization, and expression of the Corynebacterium glutamicum betP gene, encoding the transport systém for the compatible solute glycine betaine, J. Bacteriol., 178(17):5229-5234 (1996)

Siewe, R.M. et al. Functional and genetic characterization of the (methyl) ammonium uptake carrier of Corynebacterium glutamicum, J. Biol. Chem., 271(10):5398-5403(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from C. glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142: 1297-1309 (1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif/1 Microbiology, 142:1297-1309(1996)

(Ό Μ

Y12537

Y 12472

Y09578

Y09548

Y09I63

Y08964

Y00546

Y00476

Y00151

Y00140

X99289

X (D O) (D σ) M

X96580

| Tabuľka 2 (pokračovanie)

proP

leuB

pyc

putP

murC; ftsQ/divD; ftsZ

horn; thrB

thrA

ddh

□* 00

panB; panC; xyiB

Proteín prolín/ektoinového transportného systému(pre príjem)

Miesto pripojenia bakteriofágu Phi-16

3-izopropylmalatdehydrogenáza

Pyruvátkarboxyláza

Vysokoafinitný prolínový transportný systém

UPD-N-acetylmuramátalaninligáza;protein iniciácie delenia alebo proteín bunkového delenia; proteín bunkového delenia

Homoseríndehydrogenáza; homoserinkináza

Homoseríndehydrogenáza

Mezodiaminopimelát-D-dehydrogenáza (EC 1.4.1.16)

Homoserinkináza

Elongačný factor P

Inzerčná sekvencia IS 1207 and transpozáza]

3-metyl-2- oxobutanoáthydroxymetyltransferáza;pantoát -beta-alanínligáza; xylulokináza

Peter, H. et al. Corynebacterium glutamicum is equipped with four secondary carriers for compatible solutes: Identification, sequencing, and characterization of the proline/ectoine uptake systém, ProP, and the ectoine/proline/glycine betaine carrier, EctP.'V. Bacterioi, 180(22):6005-6012 (1998)

Moreau, S. et al. Site-specific integration of corynephage Phi- 16: The construction of an integration vector, Microbiol., 145:539-548 (1999)

Patek, M. et al. Analysis of the leuB gene from Corynebacterium glutamicum,/fflp/. Microbiol. Biotechnol., 50(1):42-47(1998)

Peters- Wendisch, P.O. et al. Pyruvate carboxylase from Corynebacterium glutamicum: characterization, expression and inactivation of the pyc gene, Microbiology, 144:915-927(1998)

Peter, H. et al. Isolation of the putP gene of Corynebacterium glutamicum pro line and characterization of a low-affinity uptake systém for compatible solutes, Árch. Microbiol., 168(2): 143-151 (1997)

Honrubia, M.P. et al. Identification, characterization, and chromosomal organization of the ftsZ gene from Brevibacterium lactofermentum, Mol. Gen. Genet., 259(1):97-104 (1998)

Peoples, O.P. etal. Nucleotide sequence andfine structural analysis of the Corynebacterium glutamicum hom-thrB operon, Mol. Microbiol., 2(1):63-72 (1988)

Mateos, L.M. et al. Nucleotide sequence of the homoserine dehydrogenase (thrA) gene of the Brevibacterium lactofermentum, Nucleic Acids Res., 15(24):10598(1987)

Ishino, S. et al. Nucleotide sequence of the meso-diaminopimelate Ddehydrogenase gene from Corynebacterium glutamicum, Nucleic Acids Res., 15(9):3917(1987)

Mateos, L.M. et al. Nucleotide sequence of the homoserine kinase (thrB) gene of the Brevibacterium lactofermentum, Nucleic Acids Res., 15(9):3922 (1987)

Ramos, A. et al. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding elongation factor P in the ami no-acid producer Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum ATCC 13 869), Gem?, 198:217-222(1997)

Sahrn, H. et al. D-pantothenate synthesis in Corynebacterium glutamicum and use of panBC and genes encoding L-valine synthesis for D-pantothenate overproduction, Appl. Environ. Microbiol., 65(5): 1 973- 1 979 ( 1 999)

(D ω

Sekvencia pre tento gen bola publikovaná vo vyznačenom odkaze. Avšak sekvencia, ktorú získali autori predloženej prihlášky je signifikantne dlhšia ako je publikovaná verzia. Predpokladá sa, že publikovaná verzia vychádzala z nesprávneho štartovacieho kodónu a tak predstavuje len fragment aktuálnej kódovacej oblasti.

N 0) o ω A

Z49824

Ζ49823

Z49822

N -U Q) U! ω

Z29563

Z21502

Z21501

Y 18059

Y 16642

YI3221

Tabuľka 2 (pokračovanie)

orf 1 ; sigB

galE; dtxR

(Λ CQ

|!6SrDNA |

thrC

dap A; dapB

argS; lysA

Ipd ,

CQ □ >

Transpozáza

?; SigB sigma faktor

Katalytická aktivita UDP-galaktóza-4epimerázy; regulačný proteín toxínu diftérie

SigA sigma faktor

|Gén pre 16S ribozómovú RNA

Treoninsyntáza

Dihydrodipikolinátsyntáza; dihydrodipikolinátreduktáza

Arginyl-tRNA- syntetáza; diaminopimelátdekarboxyláza (čiastková)

Miesto pripojenia Corynephage 304L

Dihydrolipoamiddehydrogenáza

Glutaminsyntetáza I

Correia, A. et al. Cioning and characterization of an IS- like element present in the genome of Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Gene, 170(1):91-94(1996)

Oguiza, J.A. et al Multiple sigma factor genes in Brevibacterium lactofermentum: Characterization of sigA and sigB, J. Bacterioi., 178(2):550553(1996)

Oguiza, J.A. et al 'The galE gene encoding the UDP-galactose 4-epimerase of Brevibacterium lactofermentum is coupled transcriptionally to the dmdR gene, Gene, 1 77: 1 03- 1 07 ( 1 996)

Oguiza, J.A. et al Multiple sigma factor genes in Brevibacterium lactofermentum: Characterization of sigA and sigB, J. Bacterioi., 178(2):550553(1996)

Malumbres, M. et al. Analysis and expression of the thrC gene of the encoded threonine synthase, Appl. Environ. Microbioí., 60(7)2209-2219 (1994)

Pisabarro, A. et al. A cluster of three genes (dapA, orf2, and dapB) of Brevibacterium lactofermentum encodes dihydrodipicolinate reductase, and a third polypeptide of unknown function,./ Bacterioi, 175(9):2743-2749 (1993)

Oguiza, J.A. et al. A gene encoding arginyl-tRN A synthetase is located in the upstream región of the lysA gene in Brevibacterium lactofermentum: Regulation of argS-lysA cluster expression by arginine, J. Bacterioi.,\75(22):7356-7362 (1993)

Moreau, S. et al. Analysis of the integration functions of φ304L: An integrase module among corynephages, Virology, 255(1): 150- 159 (1999)

Jakoby, M. et al. Isolation of Corynebacterium glutamicum glnA gene encoding glutamine synthetase I, FEMS Microbiol. Lett., 154(1):81-88 (1997)

Tabuľka 3 Kmene Corynebacterium a Brevibacterium, ktoré sa môžu uplatniť pri využití tohto vynálezu v praxi

		ATCC	FERM	NJRRL		ΝαΜδ	CBS '	NCTC	DSMZ
Brevibacterium	ammoniagenes	21054
Brevibacterium	ammoniagenes	19350
Brevibacterium	ammoniagenes	19351
Brevibacterium	ammoniagenes	19352
Brevibacterium	ammoniagenes	19353
Brevibacterium	ammoniagenes	19354
Brevibacterium	ammoniagenes	19355
Brevibacterium	ammoniagenes	19356
Brevibacterium	ammoniagenes	21055
Brevibacterium	ammoniagenes	21077
Brevibacterium	ammoniagenes	21553
Brevibacterium	ammoniagenes	21580
Brevibacterium	ammoniagenes	39101
Brevibacterium	butanicum	21196
Brevibacterium	divaricatum	21792	P928
Brevibacterium	flavum	21474
Brevibacterium	flavum	21129
Brevibacterium	flavum	21518
Brevibacterium	flavum			BI 1474
Brevibacterium	flavum			B11472
Brevibacterium	flavum	21127
Brevibacterium	flavum	21128
Brevibacterium	flavum	21427
Brevibacterium	flavum	21475
Brevibacterium	flavum	21517
Brevibacterium	flavum	21528
Brevibacterium	flavum	21529
Brevibacterium	flavum			BI 1477
Brevibacterium	flavum			BI 1478
Brevibacterium	flavum	21127
Brevibacterium	flavum			BI 1474
Brevibacterium	healii	15527
Brevibacterium	ketoglutamicum	21004
Brevibacterium	ketoglutamicum	21089
Brevibacterium	ketosoreductum	21914
Brevibacterium	lactofermentum				70
Brevibacterium	lactofermentum				74
Brevibacterium	lactofermentum				77
Brevibacterium	lactofermentum	21798
Brevibacterium	lactofermentum	21799
Brevibacterium	lactofermentum	21800
Brevibacterium	lactofermentum	21801
Brevibacterium	lactofermentum			BI 1470

Rod	dreh	ATCC	FERM	IM·	CECT	NCÍMB	CBS	NCTC	Ml
Brevibactenum	lactofermentum	21086
Brevibacterium	lactofermentum	21420
Brevibacterium	lactofermentum	21086
Brevibacterium	lactofermentum	31269
Brevibacterium	linens	9174
Brevibacterium	linens	19391
Brevibacterium	linens	8377
Brevibacterium	paraffinolyticum					11160
Brevibacterium	spec.						717.73
Brevibacterium	spec.						717.73
Brevibacterium	spec.	14604
Brevibacterium	spec.	21860
Brevibacterium	spec.	21864
Brevibacterium	spec.	21865
Brevibacterium	spec.	21866
Brevibacterium	spec.	19240
Corynebacterium	acetoacidophilum	21476
Corynebacterium	acetoacidophilum	13870
Corynebacterium	acetoglutamicum			BI 1473
Corynebacterium	acetoglutamicum			B11475
Corynebacterium	acetoglutamicum	15806
Corynebacterium	acetoglutamicum	21491
Corynebacterium	acetoglutamicum	31270
Corynebacterium	acetophilum			B3671
Corynebacterium	ammoniagenes	6872						2399
Corynebacterium	ammoniagenes	15511
Corynebacterium	fujiokense	21496
Corynebacterium	glutamicum	14067
Corynebacterium	glutamicum	39137
Corynebacterium	glutamicum	21254
Corynebacterium	glutamicum	21255
Corynebacterium	glutamicum	31830
Corynebacterium	glutamicum	13032
Corynebacterium	glutamicum	14305
Corynebacterium	glutamicum	15455
Corynebacterium	glutamicum	13058
Corynebacterium	glutamicum	13059
Corynebacterium	glutamicum	13060
Corynebacterium	glutamicum	21492
Corynebacterium	glutamicum	21513
Corynebacterium	glutamicum	21526
Corynebacterium	glutamicum	21543
Corynebacterium	glutamicum	13287
Corynebacterium	glutamicum	21851
Corynebacterium	glutamicum	21253
Corynebacterium	glutamicum	21514
Corynebacterium	glutamicum	21516
Corynebacterium	glutamicum	21299

		ATCC	FERM	Mi	CECT		CBS	NCTC	DSMZ
Corynebacterium	glutamicum	21300
Corynebacterium	glutamicum	39684
Corynebacterium	glutamicum	21488
Corynebacterium	glutamicum	21649
Corynebacterium	glutamicum	21650
Corynebacterium	glutamicum	19223
Corynebacterium	glutamicum	13869
Corynebacterium	glutamicum	21157
Corynebacterium	glutamicum	21158
Corynebacterium	glutamicum	21159
Corynebacterium	glutamicum	21355
Corynebacterium	glutamicum	31808
Corynebacterium	glutamicum	21674
Corynebacterium	glutamicum	21562
Corynebacterium	glutamicum	21563
Corynebacterium	glutamicum	21564
Corynebacterium	glutamicum	21565
Corynebacterium	glutamicum	21566
Corynebacterium	glutamicum	21567
Corynebacterium	glutamicum	21568
Corynebacterium	glutamicum	21569
Corynebacterium	glutamicum	21570
Corynebacterium	glutamicum	21571
Corynebacterium	glutamicum	21572
Corynebacterium	glutamicum	21573
Corynebacterium	glutamicum	21579
Corynebacterium	glutamicum	19049
Corynebacterium	glutamicum	19050
Corynebacterium	glutamicum	19051
Corynebacterium	glutamicum	19052
Corynebacterium	glutamicum	19053
Corynebacterium	glutamicum	19054
Corynebacterium	glutamicum	19055
Corynebacterium	glutamicum	19056
Corynebacterium	glutamicum	19057
Corynebacterium	glutamicum	19058
Corynebacterium	glutamicum	19059
Corynebacterium	glutamicum	19060
Corynebacterium	glutamicum	19185
Corynebacterium	glutamicum	13286
Corynebacterium	glutamicum	21515
Corynebacterium	glutamicum	21527
Corynebacterium	glutamicum	21544
Corynebacterium	glutamicum	21492
Corynebacterium	glutamicum			B8183
Corynebacterium	glutamicum			B8182
Corynebacterium	glutamicum			B12416
Corynebacterium	glutamicum			B12417

	Druh	ΙΒβΙΙ		NRRL	ím		CBS
Corynebacterium	glutamicum			B12418
Corynebacterium	glutamicum			BI 1476
Corynebacterium	glutamicum	21608
Corynebacterium	lilium		P973
Corynebacterium	nitrilophilus	21419				11594
Corynebacterium	spec.		P4445
Corynebacterium	spec.		P4446
Corynebacterium	spec.	31088
Corynebacterium	spec.	31089
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	15954							20145
Corynebacterium	spec.	21857
Corynebacterium	spec.	21862
Corynebacterium	spec.	21863

ATCC: Američan Type Culture Collection, Rockville, MD, USA

FERM: Fermentation Research Inštitúte, Chiba, Japan

NRRL: ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, IL, USA

CECT: Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Valencia, Spain

NCIMB: National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, UK

CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, NL

NCTC: National Collection of Type Cultures, London, UK

DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany

Na porovnanie pozri Sugawara, H. et al. (1993) World directory of collections of cultures of microorganisms: Bacteria, fungi and yeasts (4* edn), World federation for culture collections world data center on microorganisms Saimata, Japan

5 0)	5 Q)	5 Q)	5 0)
o	O	O	o
o	O	O	o
	^A	—X	o
	O	o	-4
σι	OJ	cn	KJ
-x	σι	-4
	M	(D
•v|	(O	00
o

2	3	2	σ
Q)	0)	0>
o	o	o	3t
o	o	o
o	o	o
cn	A	KJ
	K	GJ
		W
A	o	cn r-	o
o	on	-4 Iz
	CO	(D L|	N< 5Γ
		1—’	tí

o	0 0	0
00 I	OD 00 I I	00 t
1 ΞΕ	1 1 D TJ	00
H	70 >	>
0	A —í	KJ
ω	> >	>
>	O 70	“Π
O o o	O o o -4	en ω
00 σι ω	-» 00 O <0	KJ -4

v|

0	0 0	0
00 1	00 00 I I	oo I
m	tu en	00
ω	> >	>
H	KJ
σι	> m	š
	m o	-1
	o c	<
> A	2 ru H co	o o
CO A	m S 5? oo	KJ
KJ	G) 2Z
OJ

-v|

0	0	0	0	0	m	0	0
00	00 I	00 |	OJ	00	S I	00 I	00 I
I	1 Z	1 TJ	00	TJ	1 TJ	m	m
-1	—1	>	>	>	>	ω	ω
0	0	-1	KJ	H	-1	—I	—I	0
KJ	N)	m	m	KJ	m	co oo sL	O0 oo	O □
>	>	—A	o	en		sL
o o o -4	O o O *v|	G) -4 G) ω	O c g	KJ a	•vj G) O	£ •vl -vl G)	—4 -vl G)	A) 5 X* K
oo	00		00
<D	(D		CD			N)	NO
KJ	N)				(0	(0

-A	->· G)	N)	oo	-» —4	σι		—k	NJ	G)	G)
-vj	A σι	O	G)	O -»	G)	ω	oo	en -vj	(0	CD
o	00 4^	NO	-4	A -*	A	A	4^	-> G)	_A
o	CO			O KJ		KJ	NO	-vl ->		—*
00	oo			σι o>	A	σι	σι	CO
o	G)					-4	-vl	σι
>	> >	>	>	> C	>	>	>	m c	N)	m
o	O Z)	ΊΊ	>	m kj	r“	O	o	™ S	G)	—a
o	o o	-A	4^	o co	o	o	o	G) O	_k	_k
o	o -N	G)	(D	o σι	o	o	o	v °	N)	-vj
00	“v| —*	^A	4^	o 00	00	-4	•Vj	G) O		G)
U1		oo	NO	ω -1	(0	OO	00	0) G)		O
co	-k oo	no	ω	o	G)	<0	(0
vj	O (D	-v|	-vl	o	-4	KJ	N)

>>

•vj-4 •vl-4 ωσ>

NONO

CDCD

*** SEKVENOVANIE VO VÝVOJI neusporiadaných úsekov.

& O	z	ΠΊ
0 o	o	ω
	3 o	Ω □ CD
CD CD	w Q)	□.
□. σ fi) fi)	&
CD O r**-	<Ď’	ω
CD	□	o
□ . C	ω	o.

CD I“ CD I (/) < w <

o o o o S. o c o Π) U rt> U
□ 2	□	CD
e a.	e	•n ω
3 8	3	o o
□		□

O

N*' x· &>

> X· O ft)

	OO -N.	4^	4^	oo oo	oo
o	G),--'	O	NO	ΟΊ U1	N
NJ	‘-4 —*·	NO	00	G) G)	‘vl
<0	C0 -v|		<0	G) G)	σι
G)	CO G)	O	G)	CO CO	oo

en

O)

4v O

G)

o	oo	NO	o	NO	—k -A.		o	O	KJ -» o <	ΤΊ 2
N0	O	(0	to	O	NO A	vl	KJ	N)	00 ^4	ÄU 00
o	Ó	O	o	b	Ó	b	b	b	θ ľ~T ~+ n	2.
(0	G>	CO	<o	00	_k —t	G)	03	00	-4 KJ O M	cn
Č0	ČO	ČO	<0	čo	(0 CD	ČD	ώ	b	to <o <o 5>	M <Q
CD	(0	CD	<0	•v|	00 -v|	00	<0	<0	co ω o	- M

2 0)	s 0)	s 05	5 05	3 05
o	o	O	O	O
o	o	o	O	O
	A.	ω	ω
0)	Ul	M	-1,	CD
			'Vj
A	o	σι	ω	M
σ>	σι	cn	M	00
	CO	*4		A

0	0	0	0	0	0	0	0	0
05 I	OD	00 I	00 I	00 |	00 I	00 I	00 I	00 I
1 00	1 00	1 oo	1 00	1 00	00	1 I	<	1 00
>	>	>	>	>	>	-i	N)	>
—X			—A	—x		0	J
s	g	É	r-	T	s	0)	< f—	É
w	—1	—1	r~ “Ό	ω	—1	>		H
0	o	O	m	o	o	O	-s M O
-<	<	< N5		Ό <	-< w	o	00 -xj
Ul A	ui t»·	CD N5	CD σ z	Ti 00 X	00 ro	o -4 o O)	M	00 —k
			>

0	0	0	0 0	0	0
00 I	00 1	00 1	OO 00 1 I	00 I	00 1
00	1 00	1 00	1 1 0 0	00	1 T
>	>	>	ω >	>	—1
—χ		—x	ω í	N5	0
s	ώ	s		>	G)
-1	>	-1	Π	>
<	T)	-<	> σ>	o	O
N)		M	o -H	0) M ω	o
O	CD	o	£ -4	O
00	ω	00	A	00
_k	K5		0)	cn	cn
__k				G>
			<0		”χ4
			-4

φχ	_k	M	_X	N)	N)	—k	—k	G>
o	G)	O		N)	O	0)	00	0)
N)	CD	φχ	O)	-xj	fr.	<0	00	G>
NJ	G)	G)	00	ω	G)	M	M	G)
	σι				.a	0) cn		O
>	N	N	x	1	N	>	C	N
0	<0	OO	00		00	o	A-	CD
O Γ)	00 M	O	φχ N)	CD CD	o	o	O 00	cn
u Q	o		0)	A	—A	o	•xj	N)
O	(0	—1	K)	(0	-*	*x|	M
O						o
M						0>

G>	_k	ω	-M	G>	—k	—k
0)	cn	O)	cn	G)	0)
G)	_k	ω		O	t»	o
G)	-xj	ω		O	Ul	o
O	0)	o			00	G)
						O
N	>	N	>	—	>	>
(0 cn	LO	S	o	00 0)	-n o	O o
M _k	O -xj CD	N)	s 0)	φχ *χ|	cn M ω	o oo cn
	G) ΙΌ		CD *xl		•U Ul	G) **xj

O	CQ	o <§	o
o	3	o 3	o
cr	(D	CT <T>	cr
ω	□	a> □	0)
o		o <-►	o
r+ a	-x	Φ σ>	φ
c	N>	3. C -x	3. c

cn -U

cr	cr
Φ	(D
•n
O	O
C	c
o	o
cn.	ω
cn	ω’
ΣΕ	ΣΕ
ω	G>
*^j
Σϋ
<	<
C'	C'
TJ	TJ
3	□
*<»
(D	CQ
fD	Q
□	□
0’	O'
3	3

TJ

CD

CQ O' □

O' O'

3

22 2
*< o	D θ
o	3 o
cr	Φ cr
Q)	□ Q)
o	** o
Φ	rt λ
n.	G> □
c	(0 c
3
e	N í
cr	cr
φ	φ
o	o
C	C
o	o
cn	cn
cn'	cn’
□C	ΣΕ
G)	W
^4	*χ4
Z)
<	<
C'	C'
TJ	TJ
□	□
*<'
CQ	CQ
Φ	Φ
□	□
O'	O'

Q)	□ cn	0)
§	φ	<' □
	05.	0)

I o o

ω	G)	0)	4».	Ul	0)
0)	(0	O		U)	G)
0>	N)		Ul	o	G)
	N)			00	0)
oo	(0	φχ	A	o	cn

cn	0>	G)	G)	φχ
	-i	0)	CO		G)
G>	“co	“•M	“•N	Σ-k	cn
N)		00	M		>χ4
cn		00	0)	0)	—x

U) G)

0)

N) ro g>

0)

M ω cn

CO cn

o

_X

M

N)

_k

N)

G)

_k

_k

—k

_k

o o

ω

^4

00

(0

CD

00

N)

—X

-si

-x|

cn

-χ4

00

7^1

L_k

Ó

’o

b

b

b

La

La

b

O

b

O

b

K)

cn

0)

*xj

o

—x

O

OJ

0)

oj

0)

-tk-

O

(0

čo

(0

<0

čo

čo

(0

ČO

čo

(0

b

ČD

(0

ČD

0)

00

00

-xl

G)

oo

(0

0)

00

00

(D

00

co

CD

co o

(D (D

CD

CD

5

0) Q)

fi)	fi)	m
o	o	o
o	o	o
ľU
	(0	CD
cd	00	CD
	CD
—x	•M	00
—*	IU	ω

ω

o	Q	o	0	0	Q	0	0
00 I	00	00 I	OO I	00 1	00 I	00 1	00 I
1 Z	1 Z	1 m	1 01	1 00	1 I	1 Z	1 Z
•H	H	ω	>	>	-1	-H	H
O	0	—1			0	0	0
IU	NJ	M K	>	>	A-	ω	G)
Z	Z		00	00	ί-	>	>
ω	ω	>	o	o	ο	O	O
c C— 00 σι o	o c. 00 σι o	N) G) fU O	N) •M O 00	N) A O 00	o o	O o 00 CD	o o 00 CD
m	m	N)			00	-M	U
co	<0
_x		CD	00	00	00
—X		IU	-u	U	o		M
-J		OO	ω	g>	c»		U
G>	ω		A	A	o	ru	IU
σι	σι				Ul	IU	IU
ω	ω					g>	G)

0	0	0	0	0	0
00 I	00 I	00 I	00 I	00 1	00 |
1 00	1 00	1 00	1 tD	1 00	1 00
>	>	>	>	>	>
	M	-A			—x
ó	>	ώ	TJ	š	é
OO	•n	o	>	CO	-1
σι A U	O o K> G>	<0 00 —1 O	c 00 IU (D	0 CD CD ω	o < IU CD
	G)		CD	-xj O	M
				ω
U		ω		G)	fU
(0	Ul	ω	iu	00	O
00		CJ	00	CO	A
	G>	M	σι	—X	G)
		o		A

>	>	>	>	>	>	>
1“	n	M	CD	CD	O	O
._x	—A	G>	O	O	o	o
IU	N)	M	IU	IU		o
—1	—k				o	00
		Q	•U	*-x|
CD	Ul	M	O	o		CD
00	00		00	00	00

>	σ	>	>	c	1“	N
o	00	TI	Ι-	00		00
o	CD	o	Ο		OO	—1
o		o	o	M	00	o
00		IU	<0	CD	N)
^x	U		N)	CO	O	—4
0)		ω	O
		G)

Z	Z	7Ό	<9. O	<9. o	3 O	Z	Z	3 s	D)	2	n 2?
o 3 o cn fi) u	O 3 o cn Q) U	fi) e cn cn p	& q » ·< 3 g p cr £ ® 3 °	£. q 0) .< 3.1 p cr C D) 3 °	ÍL o οι ω □ θ “ 0>	o 3 o cn ω ό	O 3 o cn 0) ό	“1 =* 0 0 9. c 0 Q. □ ® σ 3 “	C 3	*< 0 0 D D) O 0	0 Čt ÍL S 8>
0' □ (0	a>‘ □ (0		-J ft0 ΣΙ. C	-J ·-► 0 3. C	0 •n	0' □ tn	0’ □ cn	o 0 0' n V □. — f—		□. C 3	0 cn

G>	G>	G>
U	-M
<0	CD	“iu
CD	CD	IU
(D	CD	_x

CO	CO	G>	GJ	G)	4^	(D	CD	CD	CD	CD
G>	JU	00		**s|	(D		N)	CD	CO	—1
Xj	~Lx	O)	A.		CD		CD	G>	CD	CD
O	_X	IU	CD	CD	CD	CO	CD	CO	G)	ru
hJ	G>	•M	—X		-U	—1	CD	CD	00	A

0

0

G)

_k

N)

ru

0

IU

-A

ru

_x

-A

G)

G)

G)

G)

0)

CD

CD

0

G)

CD

CO

Lx

Lx.

b

b

b

Lx

b

b

b

b

b

Lx

b

b

ru

ru

ω

G)

O

00

00

ru

G>

IU

ru

CD

CD

čo

čo

ČD

co

ČO

b

ČD

ČD

čo

čo

čo

b

b

b

co

co

co

<0

CO

co

CO

CO

co

00

(D

CD

CD

CO

3 Q)	5 Q)	5 fi)	5 m	2 Q)	í Q)
O	O	O	o	O	O
O	O	o	o	O	O
N)	ÍO	ľO	N>	ΓΟ	ΓΟ
ω	0)		ro	tO
O)	ľO		(O	ω	<0
σι		-x	oo
ω		0)	o	ro	O
	(D	IO	ω		CD
	-0	σ>		IO	σι

0	m	Q	0	0
CO I	2 I	01 I	CD 1	CD I
1 T	1 u	1 πι	<	<
>	>	o	N)	ro
-1	H		m	m
m o	m o	> “Π o	ľT c	T c
M	<o		00	00
—k	~>l	0)	(0	(D
ω			CD	CD
ω	<0	(D	cn	σι
		O	CD	σι

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

CD I

CD |

CD I

(D 1

CD 1

CD I

on I

CD

CD I

CD I

CD 1

CD 1

CD I

1 z

1 T

1 OJ

1 I

1 TJ

1 CD

1 z

1 CD

1 CD

1 z

1 z

1 z

1 T

-1

-1

>

-i

JJ

>

-1

>

>

-1

-1

—1

J)

0

0

0

ω

N)

0

K)

0

0

0

N)

—k

—k

ó

(O

>

>

A

>

ó

IO

M

IO

O

Ô

Ί)

0

>

O

-n

>

ΊΠ

T

>

>

>

z

“Π

“Π

t-

O

o

ro

o

ÍO 00

m

O

o

o

ω

g

g

-<

o

o

o

>

O

o

o

o

> n ω Ό

> 1“ ω U

ω

o 01 <o o ~s|

A cn <0 ω

Čn 00

o

A A A

ω Z TI

O σι o -J

O cn o —j CO |

o σι o -j <0 |

ô ω >

—k

—k

L

o

ω	ω	ro	ω	ω	_k
A.	σι	(D	ro	ro	ω
<0	ο	ω			ro
-N	σι	(D	(0	(0	σι 00
ΠΊ	m	>	C	C	>
O	ο	ΤΊ	00	00	Γ”
ro	ω	Ο	(0	(0	ο
	*0		<η	Ο)	U
ω	—k	Ο)	σι	σι	(0
ω	(0	<0 Ο	σι	σι	οο ο

(0	ro	οο	σι	-ο	ω
ro	ω	οο	ο	σι	οο
σι	ro	(0	to	00	(0
00		Ό	ro		ω
		ro	—k		00
>	X	>	>	>	>
Γ”	CD	Ο	Ο	“Π	Ο
ο	Ο	ο	ο	—*	ο
	G)	ο	ο	ro
(0		σ>	Α		ο
	ro	(0	σι	σι
οο		ο	(0
ο		Ό	ω	00	-*

	ω	ω	ω	w	—k
	•^ι	CD	4^	A	O
00	cn	A	“(D	io	O
σι	-t»-	(0		A	o
Ο)	4*.	CD	•O	Ό	o

ď ω	□ ω	ω	□ ω	ω
□ <q φ	Ε	□ φ	ΖΞ	□ φ
Φ' C	Ο	c	Ο	c
□ ω	□	ω	□	ω

ω	Α		ω	ω	ω	ω
<0	Ο	00	00	οο	οο	00
σι	~_χ	00	“ro	Κ)	“ro	“ο
ro	ω	ro	ro	ro	ro	ω
-ο	σι	CD		<1	ό	CD

ο NJ

M <

O

O

ro

ro

ω

ro

-x

-A

_a

ro

o

to

to

ro

co'S ó? 2-

00

<0 Ó

ω b

CO b

b

O

o b

CD b

00 b

00 b

O)

ro b

ro b

ro

ro

ro

P j σι <o 5 μ

o <0

ro b

cn b

σι b

00 b

00 b

<0

ro b

(D

σι b

o b

ω b

00 b

b

b

b

b

-«S.-

-0

ω

<0

(D

ro

<0

00

<0

<0

(0

CD

00

oo

00

(0

5 m	3 m	3 m	5 Q)	3 Q)	3 Q)	2 Q)
o	o	o	O	O	O	O
o	o	o	O	O	O	O
OJ	OJ	0)	ω	ω	IM	K)
A	ω	OJ	ro	N)	(D	sj
-J	U1	o	A	ω	CD	oo
oo	_x	-_k	co
(D	σι	σι	IM	A	_A
_a	σι	cn	σι	0)	IM	σι
		σ>	00	—*	cd	σι

0

Q

0

0

0

0 0

0 0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

ro 1

ro I

ro I

ro I

ro I

ro ro I 1

ro ro I 1

ro i

ro I

ro |

ro 1

ro 1

ro |

ro I

ro t

ro I

ro I

ro I

1 ro

m

ro

1 CD

ro

1 1 ro t

1 1 ro o

ro

ro

1 ro

ro

ro

1 TI

1 ro

l ro

1 70

ro

1 <

>

ω

>

>

>

> >

> g

>

>

>

>

>

>

>

>

o

>

k

Kj

Ή

—i

M

T H

—k

—'k

—A

-1

K)

jč

—i

ó

ώ

ľM ••J

g

>

ó

ro ô

g

š

t

s

m

ro

ó

ó

m

ω c 0J

> A

ω 0 ro

“Π O o cn

0 0 I-

□ <o =1 ° ľT ~sl 70 0° m ω

z

-1 o <

ω 0 ro

-1 o <

ω 0 ro

-1 o

o ω <o ω

xj ΓΟΟ

0 c OJ

c OJ O

0 c A

ľ“ X o cn

o M σι NJ

cn σι w _a

M -v| o

cn ω σι

Z >

A N> -J

OJ ro o

4k N) -J

OJ w o

A. M -'J

-j

O ro >

K) oo

-sl oo <0

OJ σι o> tn

“Π cn

sj

ω

-<

ω

ω

IM

O)

CO

_k

CO

-»· CO

CO CO

CO

CO

CO

CO

(0

—X

_k

_k

CO

IM

CO

oo

IM

00

0)

CD

OO -a

-a fM

OO

(D

00

CD

00

O

0)

0)

cn

cn

(D

(0

A

sj

(D

00

CO A

IM A

u

A

—k

A

o

A

—k

_k

co

CO

(D

O

CD

N) CD

O IM

—A

O

—k

O

—k

σι

-sl

A

o

—k

—k

CO

O

A

o

A

o

IM

C

> Jv

Γ

>

-<

N ô

x 5=;

N

n

N

n

N

m

□

C

C

c

>

CO

-M

TI

N> (O

cn R

sj

•xj

Sj

Sj

sj

o

CO

CO

A

~n

o

σι σι N)

00

o

co

CO o

cn •'J

o

oo

o

00

o

OJ

A

o

co

o

IM

oo

o

IM

cn -J

o

0)

00

0)

00

CD

CO

O

N)

Sj

cn

A

cn

—x

cn

IM

cn oo

ω r)

(0

(0

CO

OJ

oo

00

00

CO

O

N)

•sl

cd

—fc

w

-J ->i

IM

00

IM

00

IM

-J

A

(0

cn

CD

S Ξ		<z
Ί θ 3 o	o 3	*< o O	o 3
Φ D	O o	O	CT Φ
□ 0)	Q) □	Q)	Q) □
~ O	O ~	O	O
55 o	c? 55	0)	5“ 55
ω Zx c	=5. <g C ľl	Σ3. C	□. <2 c Zľ
en 3	3 PJ	3	3 P*
IM Z	Σ. IM		— IM

cr	σ	D	D	σ
φ -i	Q)	(D T	—1 fi)	CD -n
o	Φ	O	CD	O
c		C	χ·	C
o	o	o	O	o
ω	N	ω	N	ω
ω'	3.	ω’	3	ω’
Z	CL	Z	Ξ	Z
CO sj	(D	co -sl	OJ	co •sj
<	CO IM	7) <	CO IM	J) <
C'	cn CD	c>	ω CD	C'
Ό	**	Ό		•σ
□	<	□	<	□
	CD		CD	*<>
(Q	□ O	(Q	□ Q.	(Q
n>	CD	CD
□	Q)	□	Q)	□
O'	ΓΊ	O'	π	O'

o UJ

CO N

O

		3	3	3	3
CO	CD	CO		(0 (0	(0 CO	co	cn	A	CD	CO
A	(D	00	o	(0 (0	(0 (0	00	K)	A	O	cn
cn	CO	“(D	o	’-a (D	00 CO	o	cn	CD		CD
_k	A	O	o	•sl ->·	o cn		—A	O		—k
o	σι	CD	o	O	00 ->	(D	CD	CD	-*4	cn

co	O <3.	O	“03 XJ<a O
&	O •n	&	o “Π	& S	υ Q) 2 £ Φ c (Q (/»	s.	o —T
Q) 3	Φ	ω 3	(D	Q) >< 3	0) 3	3 Φ
o‘	σ	o'	cr	o tr	o’	o	cr
c	Q)	c	Q)	C Q)	c	c	Q)
3	o	3	o rA	3 a	(/)	3	o
	(D		CD	n			φ
	□.		Z3.	ZJ.			-
	C		C	C			ď
	3		3	3			3
	(0		(0	<o	CO		co
	00		00	<0	00		CD
	K)		A	~k	_k		“CD
	o		00	—k	(0		CD
			(0		o		00

Q (Q Q) □ ω ω Π) ZJ o

ΖΓ ω cr o. c£ (/)

CO CD b a co

IM

O

_A

_k

IM

IM O

-a m

ΓΜ

—X

ho

_k

IM

IM

o

IM

IM

o

o

<0

(0

cn

A

OO

O IM

Sl sj

A

σι

A

σι

A

(D

ω

-A

o

<0

CD

Lk

Ó

b

b

b

b -»

b b

b

b

O

b

b

b

b

^k

b

b

b

O

CO

CD

CD

00

CO IM

CD A

CD

cn

CD

CD

CD

CD

IM

00

A

_.k

(0

(D

ČD

(D

(D

b b

b b

b

(O

b

b

b

b

b

b

b

b

b

(0

CD

CD

(D

•sl

cn a

Sj co

(D

CD

CD

CD

CD

•sl

CD

CD

CD

sj

oo

Μ A cn

2 ω	5 0)	5 οι	2 ω	2 cu
o	o	o	o	o
o	o	o	o	o
ω	ω	ω	ω	ω
>4	σ>	0)	0)	σι
—X	-u	tn	σι	~1
	A	a	-sl
(0	tn	oo	M	σι
	cn	O	-sj	->ι
-s]	ω			oo

Q

0

0

0

0

0

Q

0

0

0

0

0

0

0

00

CD I

CD I

00

00

00 t

00 1

00 I

00 I

00 1

00 I

00 |

00 I

00 I

1 m

<

1 OJ

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

<

<

1 00

ω

>

>

>

>

>

>

>

>

>

ΓΌ

ro

>

-í

th

_A

--k

^a

>

>

^Α

ω Sj

0J e-*

ώ

z

Í>

ώ O

É

>

to

g

>

Π

ο

g

O

o

-1

GJ

-1

CD

o

-1

(D

ο Q

Γ

>

ω

o

o

ω

o

O

ω

o

O

σι

c

ω G)

TJ -n

> ω

-<

N)

> ω

-<

ro

> ω

-<

M A

σ> σι

ω -sl

CD

-s] σι o

w

>

-sj O

>

-sl O

>

-sj O

ω

ω

ηΧ 00

CD

00

tn

00

tn

00

-sl

to I m ω —i

M i (D

_k	co	CO	-s|	—X	CO	00	—x
ω	-sj	00	cn	cn	-sl	-sj	cn
*s|	00	o	0)	co	*s|	ω	<o
00	oo		00	o	σι		o
				_A	—Ik

co	00	_X	co	00	CO	-sj	co	cn
-sj	*sj	cn	-s|	-sj	_A	hJ	cn	00
-sl	CO	(0	sj	CO	CD	*s|	_A	—X
cn	A	o	cn	N	-s|	M	CO
		—x	—X			ro	oo

c	>	>	g	>	N	>	>
	“Π	CO	00	ί-	00	CD	r-
ω CD	o A	G)	CO CO	ο	CO 00	O M	o
cn a	CO -sl o o	cn o σι	ro ω	CO c» A CO	G)	A -J O 00	(0 00 A <0

N	>	>	N	>	>	>	c
oo	(D	1“	00	CD	Π	o
CO	o		CO	o		o	cn
Oo	N)	o	00	N)	A-	o	_a
G>	-U	(0	G)	A-	cn		oo
A	-s|	00	A	-s|	G)	CO	-s|
	O	A		O	cn	-sl
	00	(0		00	co	CO

$

CD

O

-s

0> ω o n

CO	CO	A.	co	to	CO	CO	to		CD	CO	CO
G)	A	K)	cn	-4	G)	CO	s	—k	CD	-sl	(0
00	w	σι	00	CD	ΪΟ	to	cn	CO	CO	“CO	X
CO	CO	CO	-Ps	O	-sl	—A	CD	CO	-0	N	<0
M	cn	co	ω	CD		ΓΌ	A	CO		G)	G)

T o 3 o ω o> g to' □ ω w -sj cn o o

K)	K)	M		—X		—x	-A
.u	M	-U	M	G)	-sl	CO	G)
b	b	b	b	b	b	b	b
co	_»x	00	G)	00	G)	CO	00
čo	čo	čo	ČO	ČO	Č0	*C0	čo
cn	00	co	CO	CO	00	<0	co

		>	K	_A		_X	0	K)
	CO	G)	-sl	CO	A	-sl	co	—A
Ó	ó	b	b	b	b	b	b	b
G)	CO	00	G)	co	G>	-sl	CO	-ps
ČO	(0	co	ČO	č©	čo	čo	CD	čo
00	<0	CO	00	co	co	00	cn	00

t/»

5 ω	3 m	5 m	5 Q)
o	o	o	O
o	o	o	O
A	A	ω	G)
O	O	co	CD
G)	K)	ω
	CD		00
k)	M	o	A
(Jl	ω		G)
A		-si

A

CD -si

A ro m

Q

0

Q

Q

0

0

0

0 0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

CD

CD i

OJ I

(D I

(D I

CD t

CD I

OD 00 1 I

CD I

OD I

0D I

OD I

0D i

OD I

DD I

CD I

01 I

1 CD

1 CD

1 CD

1 OD

1 OD

1 OD

1 CD

< “D

1 m

1 1

1 □:

1 00

1 0D

1 CD

1 OD

0

ϋ

>

>

>

>

>

>

>

3 >

ω

-1

H

>

>

>

>

ω

Γ~

k)

N>

N>

fo

—x

>H

—4

0

0

—k

—*

-k

—1

ω

~1x

>

>

>

>

Š

g

TI «y-A >

CO 00

W

ro

s:

2

š

TÍ

a

>

TI

ti

m

Π

1“

CD

-1

A 71

>

>

I-

CD

—j

>

>

Z

O U1 k) 0) cn k)

o CD M CO 00

—k o CD cn k)

O σι k> 0) cn k)

5 CO O cn

0 N) M A

·< N> 01 O O

oo o co m O CD cn oo CD M

> § o _k -sj o

O o o CD ω

O o o CD N> CD

O 00 M ro K>

0 < NJ N) A

< M CD D O

ZĽ m 2 r-

o G) O G) O

ω o 0 m Z

cn

00

<0

ω

m

ω

k>	k)	A	k>	-s|	A	A	k) CO
o	O	cn	o	-M	O	o	00 k)
(D	-xj		<0	0)	O	00	cn m
CD	cn	a	O)	k)	cn	CO	cn o
	00				—1	OO	co *s|

>	>	>	>	<	>	N	> >
“D	m	“ΓΊ	“Π		□	CD	TI	TJ
o	o	_k	O	ω	o	cn	—k	o
σι	co	o	CD	00	o	cn	A	0)
M	M	(0	k)	o	o	cn	00	cn
CD	CO		CD	CO	o	OO	00	00
σι		CD	cn		o		o	cn
k)	00	k)	k)		A		cn	k)

CD	_k	_k	ω
^A	-s|	cn	a
G)	00	-M
	O		—A
	cn		A
	CO
>	>	>	>
$	O o	O o	ľ~ O
o *4 O	o *sj cn G)	o O) k) 0)	A (0 A CD
cn CO	00	CO	~1

A	A	A	A	_k
O	O	A	00	k>
O	00	A	G)	CD
CD	CO	A		CO
-Λ	00
>	N	X	>	<
O o o o o	CD CD CD CD 00	00 k) o •sj k)	O -sj CO O CO	O 00 00 cn cn
o			O
A			ω

3	z m g	T
ω	o	C	Q)	o
“O	3	ω	“D	3
Q)	o	Ό o	Ď)	o
	v>	3.	—x	cn
-sj	D)	Q)	jsj	ω
-	Ό	CL		g
» *	C®'	m	4 *	φ
*	□	□	*	□
ω	ω	CD*	ω	ω

m o c· m o

O <s

Z p	Z P
o B.	Λ N O O
š3	š3
m3ľ	m x-
< □	< 9
O 3	O 3
<	< =r
	-<.X
< 2	< 5
o T	O T
c_ CD	f=z CD
ΪΟ1	I.m
»1	»1
- O	m I
1	1 N)
-4	CO

O '-Z1

ω

ω ω

Z

3

ω

Z

Z

a

2

e

S

í

Q)

“0

W “T

τ: ’o

φ

Φ

ω

o

0

o

TJ

<

σ

σ--<

Φ

ω

K O* n

ω £· tj 5 o 2

Ό Φ r-l··

9 Q)'

□ ω o

D ω’ r+

3 o

3 o

—T 0) Φ

o o CT

φ “T O

o O σ

α> o 2 &

Ξ (Q <

φ c Q.

o

ω *<'

o'

3

2.

cn

(Λ

Q)

&

Q)

£- D)

O

O

u 3

zŕ o

x*

O q

fi) Ό

Q) 2.

O Φ

O ω.

O Φ

o o s®

ω &)

3 o

<

φ’

φ’

□ .

ω’

3.

(Λ -r

□

Q)

□

□

C

C

c'

fi)

c ω

(Λ

vi

3

3

3

ω

(Λ m

φ o ÍL ä^-

G)	G)	A	G>	CO	A	cn	cn	cn	co	CO
00	00	O	A	cn	CO		—x	A	0)	CD
σι	CH	A	00	A	CD	-~A		__k	’-M	cn
O	00		k)	A	00	A	A	-sl	k)	o
(D	CD	k)		A	—A	G)	CO	cn	00	co

o

O

-A

N)

o

_k

o ro

_k

k)

_JL

m

O

_k

_k

—X

—x

CD

O)

oo

(D

A

G)

•N

k) (D

o

h)

o

-si

G)

-sl

OO

cn

~sl

b

’o

ô

b

l_k

b

b b

b

b

b

’o

La

O

b

—A

G)

k)

cn

CO

cn

kJ

ω

00 CD

CD

cn

cn

00

k)

0)

M

'Ί

O

(D

CD

(D

(D

CD

(D

(D

(D CD

CD

čo

co

<D

(D

CD

ČD

CD

CD

00

00

CD

00

*4

cn

00

CD CD

(0

CD

(0

CD

cn

00

cn

CD

cn

5 D)	5 α>	5 m	5 0)	5 Q)	3 m
Ο	ο	ο	ο	Ο	ο
Ο	ο	ο	ο	Ο	ο
Α	α	Α			α
A	ω	ω	ω	ΙΌ	ο
Ο	ίο	-J	σι	Ο	σι
σι	σι	σι		_χ	σ>
οο	φ	-j	ΙΌ	σι
Μ	_Χ	φ	ω	οο	ω
			CD	*Ό

0	0	0 0	0	0	0	0	0	0
00 I	CD 1	ΟΟ οο I 1	00 1	00 I	01 I	ΟΟ I	00 |	00 I
1 ϋθ	1 CD	1 1 I -ϋ	1 00	1 το	1 00	1 τ	1 ľr	1 I
>	>	-η Γ	>	70	>	70	-i	-1
	ΙΌ	0 Ν	—Λ	Α		Α	0	0
ώ	ώ	ω >	É	>	ώ	>	A	Α
Ο	S	> 2!	Η	ο	Ο	ο	>	>
Μ	Ν	Ο 0)	<	ο	ΙΌ	ο	Ο	Ο
ΓΤ1	ΟΟ	ο -SJ	ο	ο	>	ο	ο	ο
	Ο)	Ο 00	_Α	ιη		ιη	ο	ο
	ΞΪ	φ σι —1 00	0)	φ ιη		φ σ>	φ σ>	φ σι
	_k	ΙΌ		—1k		—*	α	Α
		Ο					—κ	—k

0	0	0	0	0	0	0	0	0
00 I	01 I	00 |	00 1	01 |	00 I	00 I	00 |	01 I
1 00	1 00	1 00	1 00	1 00	1 υ	1 00	m	1 00
>	>	>	>	>	70	>	ω	>
-Α	.Α		_Α		Α		—I
>	2	g	2	2	>	ž	Μ ω *•2	2
n	ω	ω	Η	Η	ο	-I	-I
>	0	0	-<	<	ο	<	£	<
Ο 00	00	-<	ω	Ο	ο σι	ο	ľt	ο _Α
00 Ν	(0 _χ ο	Μ σι	Ο _χ Μ	σ>	Α σι	ω	ΙΌ 09 00	σι

ω

00	-4	Ν) ->	σι	_Α	ΙΌ	_χ	-Α	«Α
00	00	σ> ο	ω	σι	ΙΌ	σι	0)	0)
(0	0)	Φ Μ	CD	σι	-4	σι	φ	(0
0)	ο	£Μ	0)		00	-Ν	σι	σι
ΙΌ		ΙΌ	σι	Φ	σι	00	00
		σι		ο		ο	ω	οο

ΙΌ	ω	ω	ω	σι	_k	σι	-4	σ
-4	-ί	-4	-μ	ω	Α	ω	ω	ω
0)	σι	.α	ο	σ>	ω	σ>	ο	σ>
ο	σ>	σ>	00	σ>	Ο)	<η		σ>
	σ>	Α	σι	Μ	-4	Μ		KJ

>	Ν	> >	>	>	>
Γ	οο	Ο Π	r	ο	ί-
ο	σ>	ο -*	ο	ο	ο
ΙΌ		ο φ	ΙΌ	ο	ω
ω	—Α	(D J	—Α	σί	—Α
		3. ω	ΟΟ	(ο
Φ		μ σι	-U	σί	00
—4		ο °°

>	>	>	ζ	η	>
ο	ο	ο	0)	•Μ ΟΟ οο ΙΌ	σ
ο	ο	ο	00	ο
ο	ο	ο	<0	Ο
σι	φ	φ	ο	ο
φ	σι	σι	Α		ο
σι	Α	Α
μΧ	—X				ΙΌ

Ν	>	>	>	>	>
οο	ξ-	ο	Γ~	Τ	Γ”
ο	ο	ο	ο		ο
οο	Μ	ο	ΙΌ		ΙΌ
	•Α	φ _Λ		ΙΌ 00 00	_α
ω	οο	00	00
	U	Α>		Α
	—1	σι	_α	—1

W (D	·<· ο	V (Τ>	ο	3	α>	-χ ο	<	ο		π
“Π Ο	ο D*	“5 ο	ο σ*	ο	•π Ο	Ο σ-	c c	□ 0	ο	Ο σ
C	0)	&	D)	ω	£.	ω	ω	ο	c	ω
0	ο	ο	Ο	ω	ο	ο		(D	ο	ο
ω.	η	ω	γ* α>	•υ	ω.	ŕ* α>		Ο	ω.	α
ω’	3.	<λ’	Ζ3.	cd’	ω’	Σ3.		ω	ω
	c		c	□		C				c'

Α	Α	Α 4^	ω	ΟΟ	Α
ΙΌ	ω	ω ω	*Ό	-*4	οο
Φ	ο	’ιό σι	Ο	Ο)	k)
οο	00	•*4 οο	00	-U	Ο)
	ο	0) οο	00	•*4	ΙΌ

ω	ω	ω	ω	0)	0)	Α	ω	σι	ω	σ
Ο)	Ο)	00	ω	—1	ΙΌ	Ο		-Ό		Ν)
ω	ω	σ>	σ>	ω	Ο		k	Μ	σι	00
ω	ω	^4	σι	ο	00	σ>	-Ό	σι	0)	Φ
σι	σι		-λ	ΙΌ	-a	φ	Φ	φ	σι	00

ο

ΙΌ

ο ->

ΙΌ

_ι

ο

_L

ΙΌ

-X

_Λ

ΙΌ

Ο

Μ

ω

ΙΌ

^4

ω

οο

οο

σι

00

Ν)

Μ

^4

σ

ρ

*^Ι

οο

9°

00

—1

ω

Ó

-Α

ό ό

ό

Ια

ό

Lx

La

La

ό

b

La

ό

Ô

La

ό

ό

ό

0)

Ο

οο 00

0)

00

—k

ο

ο

0)

ΓΌ

0)

0)

ΙΌ

0)

00

σι

φ

φ

Φ (0

(0

φ

φ

φ

φ

φ

φ

(0

Φ

*φ

Φ

Φ

φ

φ

‘φ

οο

φ

φ Φ

φ

00

00

00

φ

φ

0)

0)

οο

Φ

00

φ

00

φ

o o A A O)

CD σι

CD •xl

K)

N

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Q

0

0

0

0

CD

OJ t

CD I

CD I

DD I

CD I

CO

CO

00 I

CD I

00 1

CD I

00 I

00 I

1 OJ

m

t I

1 T

1 Z

1 Z

1 D

1 z

1 I

1 00

1 Z

1 Z

1 U

CD

>

ω

-1

-1

-1

-1

;d

-1

-1

>

-1

-1

TJ

>

—1

0

o

Q

0

G)

Q

0

0

0

ro

—λ

g

G) cn

K)

N)

M

M

>

A

A.

ώ

N)

N)

Z

ώ

ľ”

>

>

>

>

O

>

>

o

Z

z

ω

o

o

£

O

O

ΊΊ

“Π

o

O

O

O

ω

ω

N)

00

00

o

o

O

O

o

o

o

**4

□

0

-xj

m

o

o

N)

N)

G>

o

o

00

<_

c_

G>

—

-xj

00

—«J

-4

CO

CD

cn

CO

CD

*xj

-xj

O

-xJ

o

oo

oo

G>

G)

*χ|

ω

CO

(D

cn

M

M

0)

0)

o

σ>

σ>

CD

CD

-M

A

A

*x|

M

-sl

-sj

z

z

G>

G)

A*

__k

00

M

N)

G)

M

K)

G)

GJ

G)

ω

A

00

M

N>

cn

cn

cn

—1

OO

K)

K)

ω

ω

00

00

CD

σ>

σ>

ro

*xl

*x|

CD

cn

G)

ω

CD

O)

A

o

o

K)

—X

—i

G)

<n

A

0)

CD

•M

•M

cn

U1

cn

A

G)

M

—X

cn

cn

σι

cn

A.

-Ék

00

N

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

(D

00

o

o

“Π

“Π

O

O

O

r“

I“

1“

Ι-

ľ“

00

o

o

o

o

o

o

o

o

ο

o

ΓΌ

oo

Q

o

N)

M

o

o

o

G)

o

O

G)

l\J

*x|

o

*xj

-j

CD

CD

G>

co

CO

A

CO

CO

—λ

G)

—Λ

cn

00

00

G)

G>

cn

CO

G)

CO

CD

CO

*xj

-xj

N)

N>

0)

cn

•xj

0)

o>

cn

G)

G)

00

CO

k

A

-xi

-J

o

-s|

-sl

cn

“*

sj

CD Ό “Ί £D

CD

*< O O σ Q) o

CD 2. C 3

z	Z	Z
o	O	0
3	3	3
o	o	o
ω	ω	ω
Q)	D)	ω
□	“2.	2.
(D	<d’	α>’
□	□	□
ω	ω	ω

G)

G) O 00

-ŕx		ω	ω	G)	G)	G>	cn	G>	G>	w	G)
Ο	ο			cn	A		cn	A	-N	oo	J2D
Ο	ο	G)	G)	D)	ω	~CD	A.	cn	cn	o	Vj
Ο	ο		-*1	00	cn	cn		K)		M	o
ο	ο	ω	G)	M	CO	(D	O		—*	xl	N)

O

M

O

O

o

—k

M

o

O

N)

O

00

A

M

N)

oo

00

CD

P

cn

cn

U)

G>

G)

A

b

b

Ó

Ó

'_k

b

'_X

Lk

_x

b

00

00

00

00

O

o

cn

o

o

—x

N)

M

—*

cn

čo

čo

ČO

ČO

čo

čo

CD

ČD

čo

CD

ČD

ČD

CD

ČD

-d

CD

CD

CD

-sl

-sl

00

CD

CD

00

CD

CD

(D

OO

0)

0)	0)	0)	m	ω	0) 0)
ο	Ο	ο	ο	ο	ο ο
ο	ο	ο	ο	ο	ο ο
σι	σι	σι			φχ
ω	ω	ω	00	00	οο σ>
σ)	Α	ω	Φ	00	*4 σι
		_x
Α	ω	—X	NJ	0)	0)
Φ	00	σι	-Ν.	Α	Φ
	σ>	σι	σι	_χ	Ν)

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

00 I

00

00 I

00 1

00 1

00 I

00 I

00 1

00 I

00 I

00 I

00 I

00 I

00 I

00 I

00 I

00 I

00

1 00

1 ϋ

1 00

1 00

1 Τ)

1 00

1 00

1 I

1 I

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 0

1 <

>

>

>

>

>

>

>

-1

—1

>

>

>

>

>

>

>

ω

-Μ

—1

-1

—1

—1

0

0

NJ

-k

ÍO c

—X

Μ

ω

ό

ό

m

ô

ô

ί-

ό

ό

ΓΌ

ΙΌ

č

ώ

g

č

ώ

—*

Ξ

0

Ο

0

ο

0

0

i

i

ο

ο

ο

-I

-1

ο

>

σι

Ο

Γ~ ΓΠ

Α σι

£

I- <

-4 σι Α

ο -<

I <

ω ΙΌ

ω ΙΌ

ο ο

> Α

ο ο

ο <

ο <

ο ο

0 C

> Ο

00 σ>

c >

Α

ω X

ω

Ο)

ω Ο

(η

ΙΌ σι ΓΠ

ΙΌ σι m

σι

Ο σ>

σι

-4 οο

-4 00

σι

£

σ> Α Ο

ΓΠ -Ν

σ

>

—X

—X

ο

ο>

ω

ΓΌ

NJ

NJ

Ο

ω

ΓΌ

Ν)

NJ

_k

ΙΌ

—1

_k

φχ

Α-

Α

ω

ω

Φ*>

gj

Φ^

ΙΌ

-Ν

CD

Φ

00

«Λ

σι

00

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

0)

ΓΌ

ω

ω

ΙΌ

00

0)

φ

φ

Α

σι

Ο

φ

Ο

(Λ

CD

G)

Φ

ω

00

00

ω

σ>

4

G)

ΙΌ

(β

-4

ο>

ΙΌ

ω

Α

Α

ΙΌ

ΙΌ

ΓΌ

—k

ΙΌ

0)

σι

σ>

0)

σι

σ>

00

00

σι

NJ

Α

Α

X

m

Γ“

X

>

X

X

>

>

C

>

C

Ν

Ν

C

<

>

>

^4

—1

σι

Ο

00

σι

Ι-

Ι-

ο

c_

Ο

*4

*4

Ο

—k

ο

η

ο

Α

0)

~4

*4

NJ

*4

ο

ο

ο

Ο

ο

-4

*4

ο

ο

0)

ο

φ

σι

00

Ν)

σι

Φ

ΙΌ

ω

ω

ο

«Α

ο

—k

ο

Α

fv

ΙΌ

σι

-Ν·

NJ

ΙΌ

ΙΌ

Ο

0)

0)

Φ

/->

^Χ

φ

00

0)

σι

ΟΟ

ω

Ί

4

σι

0)

σι

σι

σι

σι

Φ

<4

Ο

-4

ο

ΙΌ

00

ΙΌ

ΓΌ

—*

σι

Ο)

ω -=» ΓΊΪ	w m	2
*< ο	(Q	*< Ο	(Q	Ο	*< ο
Ο	3	0	3	Ο	ο
σ-	φ	σ	φ	CT	ΟΓ
ω	□	0)	□	0)	0)
ο		ο		ο	ο
πΓ 2. c	Α σι	r* φ -, c’	Φχ CD	r+ Φ Π. c	Γ* φ ζ. c
3 φ	<η ΓΌ	3 ?	0) NJ	3 2“	3 φ
15		σ		σ-	Ο
“1 0)		φ		φ	“Ί 0)
φ		ο		ο	φ
π		C		C	X“
ο		ο		ο	ο
Ν		ω		ω	Ν
3		ω’		ω’	3
£Χ		Ζ		Ζ	ο.*
03		ω ~4		ω •4	00
0) ΓΌ		70 <		<	0) ΙΌ
Ο		C'		C'	Ο
				σ
		□		□
		*<'		*<'
		(D		φ
		φ		φ
		□		□
		0'		θ'
		3		3

ι

ΙΌ ζ ω (Ο φ □ θ' 3 ο < 0).

—I <

Ί3

ΖΓ □

□ Q)'

0) □

ο < *<'

<ώ nm ο	Ζι	Ο	<α Ο	7Γ tf!	<e. o	<Q O
& Q		D) <	ο	& 3	° ?ί	& °	& °
α) < 3.1	0) κ< 3.3	Φ ω ο	φ	0) .< 3. g	É 1	Q) 3.1	ID -< 3.1
ο σ	ο σ	φ	σ	ο σ	x*	o tr	o CT
C Q)	C 0)	□	ω	C Q)	<-*<<.	c m	C 0)
3 a	3 a	(Ό	ο	3 a		3 a	3 a
φ	φ		Φ	<»		α	n>
ζ.	□.		Ζ.	3. c		3.	3.
c	c		c		c	C
3	3		3	3		3	3
	φ		φ	to	Φ	(0	to
ο	οο		οο	(0	Φ	<0	to
ο	\|		Vl	bo	ω	K)	<O
ο			ο	σι	φ	ΓΌ	—k
ο	ω			σ>	__k		ω
ο

?

2. Ο

0)

0) □ ο (Q ω (Λ φ

ω ο σ

ΖΓ ω

G)	(4	C4	0)	C4	C4	(4	GJ	*4	G)	G)
0)	0)	00	O	<0	Φ	Φ		A	00	-vj
Vi	Vi	o	oo	—X	A	Vi	K>	NJ	—k	A.
σι	σι	A	C4		σι	ΙΌ	-N.	σι	—X	00
σ)	σ)	_k	σι	00	—‘	cn	00	φ	0)	-4

NJ

_X

C4

_X

O

O

O

o

—k

—k

o

o

O

NJ

O

00

—k

*4

O

*4

*4

ω

GJ

—k

-4

—k

-4

•4

00

00

-4

ó

ó

O

Ó

O

Ó

O

Lk

Lk

Ó

b

b

b

b

b

b

b

b

NJ

-4

0)

NJ

*4

NJ

NJ

NJ

NJ

G)

Φ

C4

σ)

0>

C4

—X

^4

-fix

Φ

Φ

Φ

ώ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

φ

φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

G)

*4

G)

-4

“4

Φ

Φ

00

-ÉA

00

00

-N.

00

Φ

Φ

3 Q)	5 Q)	s o	5 0)	5 m	3 ω	3 0)
o	O	o	o	o	o	o
o	O	o	o	o	o	o
CD	σι	cn	σ	σ	σ	w
00	00	CO	**q	σ	A	ω
A		o	(D	00	_A
				—X	-*q	M
N)	o	a	CD	4*	(0	A
A	CD	M	oo		l\)	O
00	N)	σι	ω	O		<0

Q O

m

Q

m 0

Q

0

m 0

0

0

0

0

0 0

0

0

0

0

0

CD CD I 1

2

CD I

2 (D | I

OD I

CD I

iSiro

CD I

CD I

CD I

CD I

CD CD I 1

CD I

CD I

CD I

CD 1

00 I

1 1 CD TJ

1 TJ

1 U

0 □

1 TJ

1 TJ

TJ TJ

1 (D

1 CD

1 OD

1 CD

1 l OJ 0

00

00

00

DD

03

> >

>

>

> >

>

>

> >

>

>

>

>

> >

>

>

>

>

>

—1

-1

H

H H

-1

H

-1 H

—1

—1

—1

-> H

—X

—1

N)

-*

—k

ô ί-

m

m

m >

Π1

m

m >

2

S

bó

2

2 CD

2

2

ώ

É

ο 70

—1

70

—*

—χ

-> 70

-1

f“

>

-1

Γ- M

H

-1

o

-d

H

70 O > CD T A TJ 00

M -~J ω

N) σ CD A

00

N) σ co A

M σ co A

00

O -< ~sl Z

C σ 00

TJ c 70 n

O < ω cn co

O o CD cn w

C ω A CO σ

O -< 'd Z

o K> σ

C 00 00 σ N)

< O σ

ω ω

ω

ω

4 >

M

CD

^4 >

0)

M K)

N)

N)

ΙΌ M

hJ

M

N) ΙΌ

-1

A

_k

co

co m

M

—X

A

K)

_k

σ -1

_k _x

__x

o

O

00

G)

00 -x

A

O

_k

A

M

**J o

O

o

o O

O

O

O O

A

00

OO

_x _k

G)

A

cn

—k

—x

o

4x

4^

A -U

4x

A

-U· 4^

σ

K)

σ

σ

o σ

N)

σι

N)

N)

_k

CO

o

Φ

—1

N)

ľ\J

σι ο

σ> ο co >

7ϋ ο σ>

Α ω

m

m

m >

m

m

m >

N

c

x

N

W ω

c

N

>

c

>

-* 70

CO

CO

00

Ä K>

co

(0

1“

00

Γ“

_k

hJ

-k Ä

M

N)

—x í-ť

σ

σ

o

CD Q

A

σ

—X

oo

O

M

σ

N) -S

σι

σι

N) Z1

CD

N)

bO

ľi σ

(0

G)

—k

σ

M

*s|

<0

Π)

CO

(D

*4 O)

00

σ

N)

σι m

σ

00

N)

M

co

A

co K

A

CO

00

N)

M

G)

G)

00

σ

G)

—k

00

00

N)

CO

CO

•U

-1

C' Ό

0)'

Ο Q. ω

< r	3 <	<
Q.	Q.	Q_
“1	“Ί	“T
O	O	O
3		3
3	3	3
n>	Φ	Φ
f+	<	š
=r	q-
03	&>	0)
□	□	□
ω	v>	ω
		—♦«
Φ	Φ	φ
“T
Q)' 2	Q), e N	Q)' e

S *< ο ο σ ω ο

Ο

3. C 3 α>

ω φ

7Γ ο Ν 3

<a o	Z	<a o	<e. o	<o O	z<s. o	<α O
& S	Φ Nl	5 q	& R	& °	c® C O KJ “T	& °
ω -<	3	o> ><	0) <<	0) ·<	g ώ *<	0) x;
3.3	Q),	3.3	3.3	3 3 2. n>	0)' 3 □ =· φ	3.3
n σ	3	o σ	o σ	o σ	□ o σ	2 f
C Q)	*<	C 0)	C Q)	C D)	C 0)	C Q)
3 a		3 a	3 a	3 a	3 a	3 a
		c®	o>	n>	Φ	a>
2.		3.		□.	3.	3.
C		C	c'	c	C	C
3		3	3	3	3	3

co co

-q co co

-*q -q

O O

Ν) Ο co *>ι CD -k

CO

(0

CD

<0

CD

(0

G)

G)

G>

G>

G)

(D

G)

G)

G)

CD

CD

<0

(0

(0

oo

OO

oo

4^

U

G)

o

ro

OO

N)

NJ

G)

00

00

GJ

G)

ω

00

00

00

00

CO

o

00

Tu

G>

K)

4^

“—x

_k

o

G)

G)

G)

_k

—k

G)

—X

<0

—k

G)

σ

O

O

00

00

o

00

OO

00

o

o

O

G)

σι

σ

00

(D

σ

—k

**q

σ

G)

l\J

o

<

O

M < O

O

O

M

M

<

O

O

G) ó

CD

Φ_

00

A Y o S ™

00

CD

b

b

< ί-

00

cn

^q b

A

M

o

O

-°1 ° cn

o

M

G)

G)

ο ’ in

o

M

G)

ώ

<0

Φ

Cn N)

ČD

CD í» M

CD

CD

CD

CD

3 W

CD

<0

CD

co

00

□ Q),

00 2 Q)'

00

00

00

□ Q'

-xl

oo

00

O	o	—X	M	o	N)	_k	hJ	N)	ľ\J
(0	σ	-q	-U	W—k	00		—Á	G)	A
b	b	b	b	’_k	O	O	b	O	b
co	CD	G)	G)	M	—1	CD	<0	M	G)
(0	(D	(D	ČD	(0	ώ	(0	CD	CD	CD
cn		00	•^1	00	M	OO	(0		CD

5 Q)	í a)	í D)	3 m	3 0>	5 Q)
O	o	O	o	o	O
O	o	O	o	o	O
CD	cd	σ>	σ>	0)	cn
G)	M	M	M
M	CD	Γ-	o	<0	00
		ΟΟ		_x	_X
(0	ω	—λ	o	CD	M
cn	oo	o		CD	co
	0)		4^		o

Q

0

o

0

0

0

Q

0

0

0

Q 0

0

Q

0

0

0

0

0

CD I

00 I

00 I

00 I

00 |

CD

00 I

oo I

00 I

00 I

00 00 1 1

00 I

00 |

CD

00 1

CD I

00 1

00 1

1 TJ

1 00

1 00

1 00

1 00

1 <

m

1 I

1 00

1 1 TJ TJ

1 00

1 00

1 m

1 m

I CD

1 00

>

>

>

>

>

7^

ω

-*

-1

>

C >

>

>

ω

ω

>

>

-1

—A

—x

O

-4

o

Q

N -i

—X

ó

—1

-1

m

óô

É

2

2

m

ω

m

ω

ώ

>>

2

2

2

K) 00

CO

O

>

o

TJ

r*

Ι-

-1

<

-<

>

-I

S $

r~

-I

>

(0

o

A r-»

ί-

c

Ο

o

£

a

O

2

S o O) (ji

o

O

Z

>

£

O

TJ

kJ A

σο

-λ

00

<

m

w

m

o

>

ω o

00

r-

σι

00

*4

O

O > o

CD 00

<J1

ω σ> (D

g>

cn N) cn 1

g>

o 00 -vl o ω

TJ D

m cn A **4

cn

ω σ> co

r <

G) 4^ G) OO

o M vj G) 1

N > ω CD

CD

M

G)

G)

ω

_k

G)

_X

M

M

—X -A

G)

G)

A

cn

ΙΌ -a

ω

*•4

N)

cn

00

CD

CD

-s]

CD

^A

O

4^ 00

oo

cn

o

00

OO A

cn

*4

—x

oo

o

N)

O

A

cn

cn

00

M

O G)

(0

M

G)

o

CD

CD

0)

CD

<0

o cn

o

CD

CO

cn

00

<0

o

-D-

A

-v|

CO

o

00

—1

m	O	C
O
A	A	U1
O	O
-U	oo	oo
—1	G)	-vj

> >	N	N	x
-n cd	<0	00	oo
o o	cn	O	(0
cd ω	-	ÍO	oo
ω o	cn	M	cn
N> CD	—A	cn	oo
A

m 3 ť °	□ (Λ Q)	ω Í
O o-	3	t: o
< 3	5’	<o
ľ?. —x	o	D) vj
< ω	σ n>	Pt θ Gŕ. oo
O a:	σ	o w
c_ o		3 N
— □	Q.	o CO

ÍL o	SL o	ÍL o
0) ω	O ω	Q)	ω
□ 0	□ o	□	O
O “O	O Ό	O	•n
<q z ä ®	<q s: ä“	(Q Q) ω_	zr of
o	cp	o

(0

(D

G)

CD

CD

CO

G)

G)

A.

G)

4^ cn

CD

cn

G)

•N

co cn

cn

00

*^l

00

00

*4

*4

00

cn

O

•*4

—x —x

m

4^

—*

CO CO

o

CO

O

00

(O

cn

CO

co

O

~_A

O kj

00

^4

CO

-A

ω co

cn

*4

CD

O

o

*4

<D

-*4

00

M

M

cn oo

CO

<0

G>

hJ

cn

-N

OO

*s|

cn

00

cn

O

cn

o cn

—k

cn

00

cn

00 N)

CO

N)

O

O

ro

o

M

O

o

o o

M

_X

o

_x

M O

N)

<0

G)

(0

4^

**4

N)

ro

GJ

M

cn σ>

4^·

*4

00

00

CD -4

<0

Ó

Ó

Ó

O

O

Ô

O

o

O

O

b ô

b

O

_x

b

-A O

O

(D

N)

G)

cn

cn

(0

A

(0

00

cn

-> G)

cn

cn

G)

N)

GJ

CO

ČO

(0

ω

Č0

(D

ČO

čo

CO

ČO

ČO čo

čo

čo

CD

ČO

ČO ČO

ČO

•^J

CD

cn

-M

00

CO

•M

C0

CO

G)

(0 00

oo

CD

CD

00 (0

CO

s u	5? 0)	5 ω	5 0)	3 0)	3 Q)
o	o	o	o	o	O
o	o	o	o	o	O
-J	-*4	M	•sj	0)	CD
M			o	00	g>
	00	'sl	00	00	ω
	oo		CO	0)
O	ω	o	ω	0)	ω
ω		oo	o	0)	(D
m		ω			ro

Q

Ο

Q

Q

0

0 0 0 0 0

0

0

0

0

0

0

0

0

(JD

CD

00

00

00

00 00 00 00 00

oo

00

00

oo

00

00

00

00

I

0

00

00

OO TJ T ϋ Ό

00

00

00

00

00

Ό

00

T)

-1

-H

ω

>

>

> > > > >

>

>

>

>

>

>

>

>

Q

Q

(n

—x

—1 —1 —l —1

N)

N)

ro

-1

—k

-1

ω

ω

-U. IO

g

2

ž (5 -m Q! ô

>

2

00

m

m

ob

m

>

>

H

—1

—I to oo o o

ΊΊ

CD

70

-H

n:

O

70

O

o o o oo ω

O o o OO ω

> o A N> O

O ro σι

o to cn

n o J O co — a. σι ω co -t ro co -* en ro en

σι A (D gj

C -o -sl (0

V cn m o

< O A _k

C g> 00 σι

A o A O

1“ 00 o >

A O A O

ω

G)

^1

ro

(O

o

ro

NJ

Ul

σι

00 cn A σι

00 σι A σι

0) •sj

ω -sl a G) ro

G) si A G) ro

G> A G) M

—A ^k —k — 00 00 oo oo σι cn

ro σι A cn A

-O 0) G)

σι σ>

ro 00 00 ro CD

N> <0 O

ro •sj ro

ro ro Ό ro

to Ό ro

•o

g> ω

>

>

>

N

N

N

<0

-o

m

o

>

C

O

>

C

m

σ

m

o

o

0

(0

(0

(0

N)

00

o

o

Π

-4

«a

í“

ω

o

_a

o

o

o

00

00

00

o

-o

o

00

-sj

a

o

00

a

a

A

o

o

ro

N)

ro

ro

A

σι

G)

G)

CD

(0

ro

cn

o

o

O

00

00

θ

0)

0)

o

ro

ω

σ>

Ό

—A

0)

^A

^A

A

00

A

g>

G)

Ό

00

co

oo

—k

A

ro

ro

CO

<0

O

G)

O

G>

G)

σι

(0

(J1

N)

IO

Ul

G)

00

*<; O O	CD 3	O O	(Q 3	*<; O O
D	CD	σ*	CD	cr
fi)	□	ω	□	fi)
O		o	r+	o
n>	**4	r* CD	*s|	CD
Z3. C	0)	D. C	s?	D. C

' 3	CD 3 M T	0) 3 M Í
	• e	E
cr	tr	cr
(D	CD	CD
O	o	o
C	c	c
O	o	o
(fi	(fi	ω
	ω’	w*
T	ΞΕ	□ľ
co	G)	G>
-o	-sj	-si
zo	zo
<	<	<
c*	c*	C'
Ό	a	Ό
□	3	□
*<>	*<>	*<>
(Q	(Q	(Q
CD	CD	Q
□	□	□
O'	O'	O'

ω Ľ	ω	A	03^
cn<	A	O	m 3
0) W	Ό	N	CD Q)
CO (D G) =	CD	3	ΟΊ5
OO		Q_ Q)
-4	cn	cx	-
00< r^ro	a	ε o	o) Y

A	G>	4^	cn	σι G> G) -U. -Φ-	G>	CD	<0	CD	σι
O	σι	O	CD	0-0-0	-o *O	(0	O	CO	O	cn
8	Ύ	GJ	ro	0) 00 00		Lk	o	σι	o	cn
cn	O	ro	-k -k	—k _k	_k	ω	CD	ω	CD
A	o	O	00	N A	CO CO	0>	o	G)	o

o	<e. o<e. o
o “T	s °	& °
CD	O) -<	fi) *<
1.3	3.3
cr	o σ-	o σ-
0)	ε: Q)	Ε Q)
o	3 a	3 a
CD	CD	CD
□.	3.	—
C	C	C
3	3	3
<0	CD	<0
σι	U1	G)
Vi	0)	00
cn	CO	-k
CD	o	A

o

O

ro

_k

_k

o

o

ro

ro

o

ro

O

_k

o

ro

o

ro

o

0)

G)

-o

Ό

G)

(0

-a

σι

-o

G)

A

(0

ω

(0

ó

’o

ó

’o

O

b

Lk

b

b

b

b

b

b

b

Lk

b

b

b

00

co

co

CD

0)

σι

ro

A

(O

σι

—*

ro

0)

—1

co

ro

co

(0

(0

(D

(D

(D

čo

čo

ČO

čo

čo

čo

čo

čo

co

Č0

čo

čo

čo

CO

CO

CO

OO

00

00

oo

oo

G)

co

(0

co

oo

0)

-o

co

-o

α>	ω	0)	ω	m	m
ο	ο	ο	ο	ο	ο
ο	ο	ο	ο	ο	ο
00	00	-sj	-j	^ι
0>	ω	00	-j		σ>
ω	00	Ο	(Ο	ο	σ>
οο		0)		_4.	<ο
Ο)	ο	0)	ο	Μ	σ>
sl	ΓΌ	(0	σι	<0	m
	ω		σ>	ω

G)

Q

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

tn I

01 I

(D I

CD I

CD 1

CD I

CD 1

co I

00 I

CO 1

00 I

OD |

00 I

CO I

00 I

1 Τ3

1 tn

1 m

1 “D

m

1 CD

1 OD

1 CD

1 T

1 I

1 ľT

1 CO

1 00

1 00

1 00

>

>

ω

1“

ω

>

>

>

Γ

-1

-1

>

>

>

>

-1

—1

ΙΌ

-1

K)

ΓΌ

0

0

KJ

m

ώ

G)

> O

>

>

2

>

ώ

s

g

ó

—X

Ι-

> (0

N ω o m

Π

<

H

“n

o

o

O

r~

—1

(0

σ> -j

Ο >

o o o>

o Q

< n

O -<

o -m 00

m 70

m m

o M

c

< O

o oo a«A

S

u

<0

ΙΌ

o

-sj

70

CD

0)

o

o

tn

U1

A.

Q

>

00

σι

σ>

00

m

00

(0

oo

00

W

CD

g> <0

00

O

0

G)

> σι

> σι

oo M

0	0	0
00 I	00 I	00 1
1 I	1 ΞΕ	1 ΞΕ
-1	-1	H
0	0	0
hJ	M	ω
ί-	>	>
ο	O	O
o	o	o
O	O	o
0)	<n	ω
-J	-4	G)
oo	00	G)
CO	CO	ΓΌ

ΓΌ	G)	Φ-	—k	ω
O	tn	CJI		M
O	•M	tn	o	<0
_k	ΪΌ		A

ΓΠ σ> -Μ (0

σι ο ΓΌ

0)	-s|	ω	__x	tn	tn	A	u	0) ΙΌ
-sj	o	^A	A-	_k	^A	^A	o	00	o
O	(0	ΙΌ	(D	(0	CD	σ>		00	A
	(D	ΓΌ	ΙΌ	ΓΌ	N)	N)	M		-s|
		cn		O	O	ro	ω	00	0)
>	S	N	>	N	N	>	C	>	□
Π	0)	00	“Π	00	OO	r~	_A	ί-	(0
o	o	G)	O	ΙΌ	ΓΌ	-A	σι	ο	O
o	o	00	-Ό	ΙΌ	ΓΌ	^A		ΓΌ	00
	<0	0)	OO	OO	OO	00	00	ΙΌ
“Ό	o	O	0>	—k	—A	tn	ro	O	o
oo			CD					O
o			G>			A		-U

σι Α CH g> ω ΓΌ

ro

5 ro ο

(0	(0	ω	G)
CD	<0	σ>	σι
σι	tn	ο	σι	ω
G)	ω	-r*.		ο
CO	(0	u	_λ	00

G)	σι	σι	σι	0)	0)	σι	0)	σ> ω	ω	G)
ω	—X	φ>.		-Γκ	-U	(0	—k	σι σ>	σ)	0)
G)	”“Μ	4».	ω	00	00	(0	έ	’-Α σι	Μ	Μ
Ο	ΙΌ	^Α	·~-ι	(0	CD	G)	<0 Ν>	G)	G)
(0	(0	Ο	ο	0)	0)	00	G)	ω σι	•Μ	-s|

οο 00 οο

ΓΌ

Ο

ΓΌ

_χ

o

ΙΌ

o

_x

M

O

ΓΌ ΓΌ

ΓΌ

ΓΌ

O

00

0)

00

00

—k

00

0)

*s|

gí

-U

U

—k

CD

U (D

cn

σι

0)

ό

ό

ό

La

b

Ó

b

O

La

La

La

O

b

’o ’o

b

b

O

•sj

00

C0

Μ

G)

G>

0)

—k

O

O

(O

G)

σι σι

M

ΙΌ

00

Č0

Č0

C0

(0

Č0

ČO

čo

čo

CD

CD

ČD

CO

CD

čo čo

čo

ČO

ČO

C0

G)

(0

00

(O

G)

00

CD

OO

00

<0

cn

CD -sl

CD

CD

CD

2 0)	5 ω	3 0)	£ o	3 D)	3 0)	3 0)
o	o	o	o	O	o	O
o	o	o	o	O	o	O
CO	00	oo	oo	oo	oo	oo
cn	to	00		cn	CD	CD
M		A	gj	vl	U1	A
CO		_A	-4	cn		00
cn	—X	NJ	-4	cn	O	-sl
ω	o	0)	(0	o	M	ω
	NJ	ω			CD

0

m

0

0

0

0

0

0 0

0

0

0

0

0 0

0

0

0

0

0

0

00 I

š |

on r

oo |

00 I

00 I

00 I

00 00 1 1

00 |

00 (

00 |

00 1

00 00 1 1

00 I

00 1

00 l

00 1

00 l

00 l

1 00

1 T3

1 □0

1 00

1 03

1 0

1 00

1 1 00 00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 1 00 “0

1 TO

1 00

1 TO

1 00

1 00

1 TO

>

>

>

>

>

ω

>

> >

>

>

>

>

> >

>

>

>

>

>

>

—1

-1

—A

—1

—1

ω

—Á

^A

—*·

—1

—1

->· H

H

-1

—1

-i

OT

m

ώ

ώ

g

2 o

ω

ώ

ώ

g

Š >

m

oô

ŕn

ó

bo

m

r-

o

o

-1

tn

(fi

-i -J

o

O

>

ι-

-J 70

—a

r~

—A

0

Ι-

-1 7) Ό

o CO CD ω

O o o A) O

O o o M O

O A 00 00

> o CD CD A CD

0 -< M A) ro

O “ < (0 A) oo CD ω

O o o A) g

O o o A) O

C CO CD CD CD

Ο 00 A) A)

< O O £ o CD A) -> -A ω

CD -J CD A)

□ > TO > 00

A CD A) O

O > Έ 00

Ο 5> TJ > 00

A CD A) O

CD

CD

O

CD

GJ

(0

CO

_k

-N

A

M

(0

CD

N)

A

σι

_k

—k

ω

A)

_x

ω

NJ

_k

σι

—k

—k

G)

—k

GJ

cn

—k

00

O

CD

A

-N

σι

O

(0

σ

O

N)

_x

00

00

•vj

00

NJ

O

00

00

G)

N)

-U

_x

_A

-4

O

O

-4

O

cn

00

to

o

σι

ω

(D

00

00

^A

—A

_A

NJ

NJ

NJ

o

o

o

X

m

>

>

N

>

>

N

O

>

>

C

N

>

>

m

N

m

X

N

m

o

—A

c.

G-

(D

o

O

00

-4

c_

c_

(0

n

—A

NJ

ω

N)

_k

A

O

o

o

0)

rt\

o

—A

00

O

o

ω

oo

o

o

CD

-a

A

-4

-A

A

to

to

o

o

O

VJ íl*l

Q

G)

ax

O

o

00

-4

o

w

-M

cn

CD

—4

cn

σ

G)

CD

—1k

---k

-sj

w 1 f».

o

(J)

(0

—A

cn

A

oo

00

σ

o

A)

ω

o

N)

O

gj

NJ

N)

0)

Q

00

OO

NJ

N)

oo

.A

to

—A

NJ

NJ

O

—J

N)

O

O íh

o m

o

-A

O íft

O m

CD -^1

_A

CQ_ *<

O <Ω (t* g 4

0 S“ σ 2. n’ c

	P		ď
	d	0.
o Φ	z\ *<	5’ D)'	O
□ OJ'	ω φ_	=r	5* a>'
qo r>	□' x:	CD Q. C	«t o r*

GJ

g	e	g	Z	<e. o	(D	O	<2. O	<a o	(Q
	σ	*<	Φ M	& 5	&	o	& 9	& 5	&
O O cr fi)	(V “T O £.	O cr fi)	o)' 3	m >< 3.1 o σ	Q) 3 o	Q σ	fi) < 3? o σ	Q) s< 2. φ o σ	fi) 3 o
o	O	o	*<	C fi)	c	Q)	C Q)	C Q)	c
φ	ω’	ω 3	3 &	3	o	3 o	3 &	3
c 3	c’ 3		<P 2. C		Φ □ . C	φ “Ί c’	φ □. c

(0

(0

5

OJ

G)

GJ

G)

G) G)

G)

CD

G)

G>

O> to

to

—X

—X

_k

00

(0

OJ

OJ

00

T4 °

G)

to

<0

to (0

ω

o

o

o

00

G)

Vi

<0

NJ

to

O

cn

CD

“-si

’-A 00

00

o

o

o

00

NJ

G)

CD

-M

O

00 <0

—k

o

00

-J Q

o

o

o

o

•^i

00

σ

•*4

G)

σ a

σι

G)

NJ

to σ

σ

o

o

o

o

o

o

o	NJ	NJ	_k
00	to	to	00
1_X	b	‘o	b
o	ω	ω	CD
ώ	co	co	to
-4	co	ω	00

N)

o

o

N)

N)

NJ

NJ

-k N)

NJ

_X

NJ

o

_x

NJ

NJ

ω

σι

to

to

σι

NJ

to

oo

G)

00

G)

00

b

Lx

b b

b

b

’_k

b

b b

b

b

b

b

b

b

CD

NJ

CD N)

GJ

G)

o

00

GJ to

•M

00

A

00

-4

to

to

(D to

to

<0

to

to

to to

’to

to

to

to

to

to

to

G)

oo to

to

to

G)

-4

00 ω

to

G)

to

G)

GJ

to

í Q)	s 0)	5 m	2 m	5 0)	2 ω	3 Q)
O	o	o	o	o	o	O
O	o	o	o	o	o	O
(D	<o	<0	CD	<0	<o	CD
*4	-vl	σι	σι	cn	σι	σ
M	o	oo	-4	σ>	cn	A
		vl		_»	_»	CD
	o	A	0)	M	cn	A
σι	σι	S	*4	ω		A
oo	o		M	vl	σι

0

0 0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

m

0

0

Q

o

0

0

0

OT I

OT CD I 1

0J I

00 I

00 I

00 |

00 I

00 I

00 |

00 I

00 I

I

00 |

00 I

00 I

00 I

00 I

00 |

00 I

l TI

1 1 TJ TJ

1 0J

1 TJ

1 TJ

1 00

1 TJ

1 TJ

1 00

1 TJ

1 OJ

1 T

1 TJ

OJ

1 TJ

1 □J

1 TJ

1 TJ

1 TJ

>

> >

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

-H

-H -H

-A

-1

H

_A

-H

-1

—X

-1

-1

-1

-*

-1

-*

-1

—<

-1

m

m ô

ó

m

m

OT

m

m

ČĎ

m

ro

m

m

oô

m

ώ

m

m

m

O (0

0

o

o

1“

o

o

1”

o

r-

o

r-

o

1“

o

o

o

cn

—· o

_A

—1

—1

-1

o

-1

_a

H

—k

-A

—A

•vi

ω y

ΞΓ

O)

CD

cn

ω

ω

CD

σ>

XJ

ω

0)

ω

CD

cn

cn vj

O

00

vl

-g

00

vj

vl

-Q

0)

00

-g

*4

g

CO

-4

00

cn

00

s

oo

cn

00

cn

cn

ω

00

σι

00

σ

00

ω

g>

N) G)

ω

-s|

-4

-4

*4

-sj

*4

*4

*sj

ω

σ

cn

σ> CD

σ>

-4

-4

*4

sj

-sj

-sj

-4

-vj

—i

-sl

•sj

-* 00

00

Μ

Ν)

N)

N)

|\J

M

hJ

w

<0

(0

σι σ

σ

σ

0)

σ

σι

0)

σι

0)

σ

oo

-sl

-sj -sj

N) ro σ cn •m

N) cn

-sj -sl

-s| M ro w σ> σι *sj -sl

-sj -4

N) N)

σ) σ >

o

G)

m

ΓΠ Q

<

m

m

x

m

m

X

m

X

m

m

X

m

X

m

m

m

O CD

o

o

O

o

O

O

o

o

o

—,

o

o

O

o

o

o

o

cn

—1 o

o

A

>

^A

4^

o

^A

A

^A

4x

_A

—i

—X

*sj

G> 5

cn

<n

G)

(0

cn

ω

<o

ω

(0

<0

cn

<0

ω

(D

cn

ω

cn

cn

σ či

A

co

-si

0)

oo

-vl

O)

vj

0)

0)

00

cn

-v|

0)

00

-sj

OO

σι

oo

0)

oo

σ

O

00

cn

o

cn

O

ω

00

o

cn

O

00

σ

00

o

Z<2. O<a	O Z <2. O	□	<e. o<a o
CD Nl	& R	&	O	CD Ň	& S	cd Q_	& °	&	O
s Ql·	0) *< 3.1	Q) 3	CD	Qh 5	3.1	CD □ Ct.	Q) *< 3.1	D> 3	CD
3	o cr	o	D	3	Q °·	2 o-	Q	cr
	c Q)	c	0) ·<	C Q)	7Γ	C Q)	C	Q)
	3 O J	3	o		3 a	O	3 a	3	O
	CD		CD		CD		CD		(D
	3.		3.		3.	Q)	3.		□.
	C		C		C	3	C		C
	3		3		3	'<»	3		3
co	CD		CD	CD	(D	CD	CD		co
CD	CD		-4	CD	CD	00	00		00
CO	Φ		cn	00	CD	0)	Vl
GJ	G)		N)	^A	O	σ	<0		CD
			a-	O	σ	oo	m		K)
K)	M		K)	o		N)	K)
CD	00		CD	M	N)	CD	CD		O
O	O		Ó	L_k	b	b	b		O
CD	sj		CD	W	CD	CD	CD		K)
(D	ČD		CD	(O	ČD	CD	ČD		(0
CD	(0		-4	A	G)	sj	•M		CD

□	Ό. Ο<η Ο<α ο<3. O	<a O
2. Λ			s. s	£.3
ĹX CD			Q) *< q 3		3
ä	3. (D	3. CD	3. CD	3. (D	2. o
σ σ	2 Q	2 cr	2 °·	2 θ’
	C Q)	C Q)	C Q)	c Q)	C 01
O	3 O r*	3 a	3 θ	3 a	3 a
	CD	CD	CD	CD	n
Q)	□ .	3.	3.	3.	Z3.
Z3	C	C	C	C	C
*<'	3	3	3	3	3
CD	CD	CD	CD	CD	<o
oo	00	(0	00	<0	oo
oo	ω	Lx	CD	La	(0
0)	M	0)	A	O	4».
-s]	-si	cn	σ	-4	<0
N)	M		M		< <=; O
CD	CD	o	CD	O	·< Λ 00 z (t>
O	b	b	O	O
CD ČD	co CD	M ČD	(D ČD	M ČD	2 ' o s 15 ώ
-s|	-4	CD		<0

Z<Q	O<a	Ota O	Z ta O	Z
££	° £	O	& s	2.	S R	2.
Q. CD 3		i	fi) *<	ol CD	Q) *<	Q_ CD
□ 3.	ÍD 2.	(D	3. CD	□	3. (D	□
C± O	σ o	σ	o σ-	A	o σ-	cŕ.
2 c	o> c	0)	c fi)		C Q)
O 5	a 3	a	3 a	O	3 a	zS o
<		CD	CD	<	CD	<
	n.	3.	3.	Q)	•n	ω
3	c	C	C	□	c‘	3
*<'	3	3	3		3	*<'
CD	<o	CD	CO	CD	CD	CD
00	oo	00	00	00	00	00
M	ω	G)	*s|	-si	-sl	A
	-vl	-4	σι	cn	cn	N)
M	M	M	00	00	00	00
M		ro		M	N)	w
CD	O	CD	o	CD	CD	CD
Ó	Ó	b	b	O	O	b
CD	M	CD	N)	CO	CD	CD
ČD	CO	ČD	ČD	CD	CD	CD
-4	CO	•*4	CD	^4		-4

3	3	2	3	5	5
0)	0)	0)	0)	ω	m
g	o	o	o	o	o
		_A	o	o	o
Ô	o	o	10	(0	<0
M	fO	_A	<0	oo	oo
—j	0)	(0	sj	(0	—1
	_X	_X	sj		Si
—k		-A	o	0)	ui
w	00	—k	ui	-N	ω
—k	ÍO	O

Q

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

ro I

ro I

CD I

ro I

ro I

ro I

ro |

ro I

ro I

ro I

ro t

ro 1

ro I

ro 1

ro I

ro 1

ro I

ro 1

ro

1 ro

1 ro

1 ro

1 ro

1 ro

1 ro

0

1 Z

1 Z

'<

1 z

1 ro

1 00

1 ro

1 ro

1 0

1 Ό

1 o

1 D

>

>

>

>

>

>

CD

—1

H

-1

>

>

>

>

CD

1“

<

>

—*

—1

—x

—1

—x

CD

0

0

O

0

Kj

-1

CD

ro

0 0 >w.

H

ώ

É

S

S

>

ώ

(O

ÍO

ro

m

-1

ó

2

ώ

5

—1

>

rn

T)

-1

ι-

-1

-1

o

>

>

>

00

ó

0

—1

o

-1

O

O

c

O

Ο

<

I m

-χ

D

O

O

o o

m

c

<

<

<

Z

O

fo

A σ o

z

<

ro

o

o

-A

o

o

o

-<

CO

o

>

o

CD

UJ >j

A

0

ω

ro

o

N)

o

o

—k

to

o

r-

o

o

00

σ

Oo

A

ω

fO

o

σι

σ

ω

ro

oo

CD

00

o

00

0)

s c —1

(0

s|

o

00 o oo

o σ to

o σ ro

Ω M

ro σ

n U

XJ Z

s|

0) A

“I f\J x ž

_A

A

A

*0

ro

A

Ul

_A

_A

o>

ro

—k

CD

ω

G)

σ

σ

OJ

—k

ω

A

o

Φ

ro

«Α

A

A

φ

00

00

OJ

CD

OJ

A

σ

—x

σ

σ

OO

to

00

ro

K)

A

A

A

ro

_A

o

-A

O

ro

ω

ro

-4

ro

ro

OO

00

ro

_k

-M

*-4

00

OJ

<0

OJ

Α

Φ

ω

ro

o

ω

ω

0)

ω

L·)

ω

ω

A

A

OO

Α

N

N

N

>

X

>

>

>

>

N

>

C

>

>

>

>

>

m

ro

oo

(D

ί-

oo

Ι-

o

o

o

0)

n

ω

1“

—k

r

r“

ο

_k

ω

(0

ο

A

ο

_X

o

o

Φ

o

_k

o

OJ

o

o

Q

ro

A

o

ro

ro

(D

OJ

•«sj

o

θ

CD

o

ro

to

o

ro

00

Q

A

σ

O

CD

^k

A

-A

cn

cn

ω

φ

io

^A

-o

σ

o

ro

00

co

ro

-O

00

o

Q

A

o

σ

to

o

ro

ω

OO

CD

00

oo

to

o

σ

σ

ro

A

A

ω

00

CD

ό

A

00

to

ro

CD

<7)

CD

00

A

la

OJ	σ	ω	A	CD	CD
oo		OO	O	jCn	00
o	b	σ>	A	b	N)
00	00	OJ	σ	OJ	“M
00	φ	CD	A	CD	σ

Z	z	Z	2. Ο
o	o	o	α>	α>
3 o	3 0	3 o	(Q □	π> □ ο
V)	Φ	ω	ω	3-
Q)	D)	ω
Ό	-σ	*σ		0)
αΓ	<tľ	φ’		ο. ω
□	□	□
ω	<n	ω

ô'Ή. o o

O o ω

0J

ω

OJ

OJ

ω

Α

ω

σ

Α

Α

OJ

OJ

φ

Α

φ

φ

CD

CD

Ο

00

οο

Ο

•N

s

Φ

σ>

“_Α

Α

Α

οο

La

Vj

ro

CD

cn

b

CD

^4

Ν

Α

CD

Ό

CD

O

OJ

OJ

—k

to

ΙΟ

0)

ČD

—k

-Ο

φ

OJ

A

O

00

—1

_1

_A

IO

O

_A

«Α

_A

_A

0

10

0

-A

0

-A

ro

0

10

ro

σ

->l

ω

A

σ

74

10

ro

ro

P

ro

ω

*^l

00

A

00

co

b

Ó

b

b

Lk.

b

La

b

b

b

-A

b

b

b

b

b

La

b

b

CD

CD

φ

CD

O

—*

O

CD

CD

Φ

O

00

CD

ω

00

CD

O

φ

-4

b

Φ

b

b

b

b

Φ

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

A

00

Φ

σ

ω

00

oo

00

φ

φ

CD

00

00

00

φ

φ

φ

φ

Q) Ο	Q) Ο	0) Ο *Α	0) Ο	0) ο —k	0) Ο	ω ο
Ο	ο	Ο	Ο	ο	Ο	ο
CD	<0	(0	00	00	s	-j
00	-4	σι	—4	ο	<0	ω
00	Α	00	(0	ΟΙ	κ>	co
(0	•Μ	σι	(0	0)	Ν)	cn
sj	-4	—4	(0	>4	Μ ω

0	0	0	0	0	0	0	0
00 I	00 f	00 I	00 |	00 |	00 |	00 I	00 |
1 00	1 00	1 00	00	00	1 Ζ	1 ζ	1 00
>	>	£	£	£	-1	-1	>

Π	-π	Π
ο	ο	ο
ω	ω	ω
ο	ο	ο
Α	Α	Α
Ο	Ο	Ο
σι	σι	σι

0	0	0	0	0	0
CD 1	od	OT |	OT I	00 |	00 I
1 0J	1 CD	1 00	1 OT	1 00	1 00
>	>	>	>	>	>
—x		Μ			Ν)
ώ	ό	>		ό	>
-I	>	Π	-4	>	Π
ζ	ζ		<	ζ
70	70	ΙΌ	Ο	70	ΓΌ
σ	α	σι	Ν)	σ	σι
	τι	G)		τη	ω
	0	σι		0	σι
	m			m
	ζ			ζ

*sj

_k

_k

ω

__χ

_k

Α

0)

Α

-4

0)

Α

co

_χ

_χ

-4

-4

-4

σι

ΙΌ

ω

ο

00

Q

ω

Ο

Ο

ω

ΙΌ

0)

ο

σι

σι

ω

Α

(0

CD

σι

σ>

ΙΌ

σι

ω

σι

-4

ο

(0

<ο

ω

Ο

σι

ω

Α

ω

00

Α

ω

-4

ΙΌ

Α

—k

_k

00

ω

—4

—4

ω

-sj

-4

<0

-sl

>

>

>

Ν

C

Ν

>

X

-<

>

>

-<

>

>

>

ζ

Π

ο

ο

<0

00

(0

Π

—4

ο

τι

Γ“

Ο

Π

ο

ο

_k

Ο

ο

ο

σι

σι

Α

ο

ω

C0

Ο

C0

_Α

ο

ο

σι

ω

σι

-sl

/2

σι

Ν)

cn

ΓΌ

σι

^Α

ο

ο

00

ο

σι

Ο

tn

ω

ΙΌ

sl

ΙΌ

—4

ΓΌ

0)

sj

α

0)

0)

Α·

ΙΌ

σι

Α

0)

ΙΌ

σι

ΙΌ

ΙΌ

σι

ΙΌ

10

ο

ω

gj

—k

ω

00

G)

00

GJ

σι

ΓΌ

ΙΌ

Μ

cn

—4

cn

ΙΌ

00

•0 C-	0	π	uj_ -φ»
70 >	70	<	0)
> ί-		C'
ο ο	Ο	Ό	m
Ο <	Ο	□	τι
<	<	*<'	_χ
Ζ	ζ	(0
	·<·	α> □	(Q
ζ	ζ	θ'	θ'
>	>	3	□
<	<
70	70
Ζ	Ζ

0)

<0

U

ω

ω

ω

ω

σ

0)

_Α

ω

-s|

CD

w

Ο

-4

ο

σ>

0)

ω

-s|

-sl

ω

ΙΌ

σι

Ο

οο

cn

co

0)

G>

b

“C0

“ιό

ο

“οο

“ιό

ω

“-sj

χ

σι

ο

‘ιό

ω

00

-_k

0)

—4

g>

ο

b

ω

-s|

_Α

—4

σι

-s|

-Α

b

<0

σ)

ΙΌ

oo

0)

ΙΌ

ω

0)

ο

σ)

ω

<0

cn

ο

—4

_Χ

ο

σι

0)

o

^A

ο

ο

ΓΌ

—x

, K

—A

K

>

, |¥

_k

ΙΌ

ΙΌ

o

_X

o

ΓΌ

—A

o

—x

O

N)

-sl

o

G>

ω

ω

CO

CO

-sj

σ>

ω

<0

ω

00

cn

G)

00

cn

ω

-A

0)

b

Lk

l_k

O

’o

’o

b

b

b

b

b

b

b

b

Ó

00

ΙΌ

—X

—X

—X

—X

—x

0)

•sj

-A

ω

ω

co

0)

00

G3

—4

-fcs

(0

b

Č0

Č0

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

(0

0)

-sj

-sl

-sl

CD

co

00

-4

CD

co

-sj

00

CD

CD

oo

CD

CD

CD

G4

5	£	2	2	s	2
0)	0)	m	0)	0)	0)
ο	ο	ο	ο	o	O
	_Α	_λ
_χ	__Λ	_χ	_k		*A
ω		ο	Ο	O	O
ro	σι	σ>	σι	A
	—X	_χ	_>.	Ό
Α	—Α	Α	ro	M	σι
-k	ω	Α	ro	<0	0)
(0	Ό	<0	—

οο

0)

G)

I “Ο >

>

0) ro (Ο

Q	0	0	0	0	0	0	0	0
CD I	OD 1	00 1	00 I	00 I	00 I	00 I	00 I	00 |
1 DO	1 (D	1 00	1 oo	1 00	1 oo	1 00	1 00	1 00
>	>	>	>	>	>	>	>	>
-A		—k		-Λ		—k		__a
ó			g	s	k	S		ώ
o	-1	ω	ω	Ι-	(Λ	-1	-1	o
to	o	z	0	Ο	0	o	o	A
>	<	fn	-<	00	-<	<	-<	0
	ω	V)	to	-1	io	ω	ω	0)
>	ω	O	ro	0)	ro	ω	ω
	σ>	o	ω	o	ω	σ>	σ>

0	0	0	0	0	0	0
00 I	00 I	00 |	OT I	00 I	00 I	CD I
1 00	1 00	1 00	1 oo	1 z	1 00	1 OD
>	>	>	>	-i	>	>
—1		—1	bJ >	0	KÍ	K)
ώ	ώ	ώ		>	>
-I	-I	o	-n	i	ti	“Π
S z	S z	A 0	o CD O	ω o	o CD O	o cn
ω o	ω O	CD	Ul	<_	cn	00
	CD oo	A	cn oo	.u 0)
u	o		O
>	>			> <0

*xj ω οο

hJ

^A

A

G)

K)

A

A

•k

ω

ω

ω

ω

G)

ω

CD

k)

CD

00

o

ω

ro

k)

k>

O

k)

K)

N)

σι

<0

(0

σ>

ω

k)

OJ

0)

O)

O

A

(D

O

O

O

A

A

(0

oo

00

ω

CD

CD

(0

*xj

σι

G)

OO

0>

Ul

0)

ω

ω

^A.

-xl

-sj

m

—*

X

x

X

X

σι

ιη

>

m

o

Ι-

N

x

>

>

>

N

N

>

g

z

>

>

>

>

CD

o

Ο

<0

CD

□

Ι-

o

(0

(o

ί-

G>

G)

1“

-n

r~

*n

O

00

A

CO

σι

ui

o

ο

o

σι

σι

ο

O

o

o

K>

kJ

Ul

k)

cn

ui

o

A

Q

cn

σι

ω

0)

0)

(0

CD

o

o

CD

G)

Ul

G>

00

A

o

CO

o

00

00

0)

M

k)

0)

O

<0

o

CO

k)

k)

0)

M

o

CO

o

o)

0)

00

00

00

00

Ul

<0

cn

—k

00

oo

U1

σι

(D

G)

(0

4^-

k

CO

'xl

00

> η Ο cn οο Λ σ>

2 o	2 o	ω ω (Ϊ o“ o“	s *< O
o	o	o 3 o 3	O
σ	cr	σου-»	cr
Q)	Q)	!»□&>□	Q)
O	O	o <* o >·*	o
r* Φ	r* Q	φ x a x	Φ
3.	□ .	□. g □. O	3.
C	C	c i c i	C
3	3	3 cd g cd	3

cr	σ	σ	σ	cr
φ	3	φ	φ	φ
0	φ	ο	ο	ο
£.	7?	c	C	c
o	0	ο	0	ο
w	Ν	ω	ω	ω
ω'	3	ω’	ω’	ω’
ω φ χ< φ	ď ϋθ ω	</> φ ? φ	Ζ ω xj Ζϋ	Ζ G> -χ| Ζϋ
□	□	<	<
ο	ρ	ο	C-	C'
0)'	5’	σ	Ό
Ν		Ν	□	□
Ξ		Ε	*<'
Ο		ο	CQ	(Q
□ C		g	Φ □ θ'	Φ □ θ'
*< k)		Κ)	3	3
Μ		Μ	** *	~
G)		ω

Η ω cr c ω

4*

Ό Ο

X n ω η< Ο < ω □ 5’

&

<θ Ο

ο *<

ρ σ ⁰¹

2.

φ

G)	(0	<0
00	(0	(0
0)	00	Ch
*χ|	ο	0)
cn	G)	Ο

σι

0)

G)

0)

G>

0)

0)

G>

cn

0)

G>

(0

G)

<o

CD

Ο

ΟΟ

Ο

•xj

O

ω

o

O

(0

00

O

00

>

O

cn

Ο

4κ

“_χ

k)

ω

00

(0

G)

O

G)

O

G)

4*

cn

χ

_k

ο

Ν)

—Α

G)

o

CD

ω

0)

A.

G)

σι

•xj

0)

ro

cn

cn

ο

Ο

G)

M

—

-U

cn

G>

G)

00

k)

G)

cn

ο

o

m

O

M

k)

G>

_x

k>

_A

ro

k)

k>

k)

k)

k)

k)

k>

N)

_*

ω

CD

G>

G)

4t

O

O

•N

O

4*.

4^

G)

0)

0)

G)

(0

G)

CD

k)

b

b

b

O

O

b

—k

b

Lx

O

b

b

b

b

O

’o

L_k

b

b

G)

<0

M

k)

CD

cn

M

00

k)

CD

CD

•>4

-k

4^

•M

-k

—

4*

G)

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

oo

xj

<0

cn

(0

ω

0)

<0

o

CO

<o

<0

G>

G>

(D

00

čo

00

00

3	2	3	5	3	s
D)	0)	0)	D)	D)	0)
O	o	o	O	O	o
^A	_A	—k	.A		.k
CO	IU	M	IU	IU	IU
ru	σι	ω		o	o
	co	(O	CD	CD	OO
	00	K)			OO
o	**4	Ul	O	CD
A	CO	Ul	CD	ru	CD
A		σι	00	00

0	0	0	0	0
00 I	00 1	00 1	00	00 1
0	1 <	1 Ό	1 □	0
(n		1“	1“	0
m	O	IU	IU	ω
—A	m	Ύ1	ΎΙ	φ
A	ι-	CD	CD
> o	Ο o 0)	O 00	0 00	o
Ul	0			o
^A			-*4
00	—1			IU
00				O
Φκ				—x

ω

0	0	0	0	0	0
00 I	00 I	00 1	00 I	00 1	00 I
1 •U	1 00	1 I	1 <	1 uo	1 13
70	>	-1	««k	>	I-
N)		0	Γ”	—X	—1
>	g	N)	m	g	> 00
00	H	Z	u	H
O	O	ω	to	O	□
W (D O ω M	-< A 00	C_ xl <O (D O —X	U TO	-< o 0 ru	o o xl xl

cn

0	0	0	0	0	0
OD I	00 I	00 I	00	00 i	00 1
1 Z	1 Z	1 “ϋ	1 z	1 z	1 TJ
-1	-1	Γ	-i	-i	70
0	0	IU	0	0	ω
ω >	ω >	H >	M >	M >	ίο
O	o	C CD CD 00 CD CD	O	O	o
o A	o A-	o o A CO	o o A (O	o Ul N) 01
σι	σ>	σι	σι	Ul
<o	(O		σι	ui

ω ι σ ω

i ω ru A m σι

A	G)	CO	CO	G)	CD
A		CO	CO	CD	G)
	IU	CO	CO	CD	-u
	O	M	N		•u
	CD	ω	u
>	C	>	>	>	>
O	-ŕx	O	o	O	CD
CD	-1	o	o		O
	O	o	o	o	IU
00		Ul	Ul	~xj	CD
00	A	CO	CO	IU	O
		CO	CO	o	GJ
G)		o	o		IU

GJ		_A	GJ	•M	_k
(D	G)	00	00	•M	_k
GJ	O	00	CD	GJ	ω
”*4			^4	00
-M			O	O	G)
	(D				CD
N	>	g	N	>	>
-si	I“	*xj	CD	00	o
A O	O CD	CD CD	IU cn	o	o
IU	O	CD	GJ	o	L
o	G)	G>	(D	o	A
	A				CD
	A			•*4	(D

_X	IU	GJ	c*>	A	GJ
_X	G)	ru	N)	W	CD
ω	CD	GJ	ω	CO	CD
A	-u		Xl	o	O
W		CD	co	o	CD
0)		ru	M
>	C	>	>	>	N
O	CD	O	o	o	00
o	CD	o	o	o	ru
	00	o	o	o
	CD	4^	A	Ul	00
A	CD	(0	(O	M	CD
<n		CD	cn	cn
co		CD	m	Ul

-U

G)

GJ

GJ

GJ

GJ

GJ

CD

c*>

GJ

A-

A-

GJ

GJ

G)

GJ

oo

CD

CD

CD

OO

00

O

xl

CD

O

O

0)

CD

oo

La

CD

CD

L^

A

G)

Lx

_A

->1

o

00

O

o

ru

b

b

GJ

ru

CD

*x|

O

CD

GJ

GJ

GJ

A.

O

O

o

CD

cn

CD

CD

O

A

00

00

A

CD

CD

00

xl

GJ

o

o

CD

00

00

GJ

gj σ> ru o -u

o

GJ

ru

IU

ru

o

IU

o

IU

o

o

o

-x

—k

o

ru

CD

O

GJ

GJ

00

-u

CD

u

*4

p

γΐ

u

—1

IU

ru

CD

GJ

b

Lx

Lx

Lk

b

b

b

Lx

b

O

Lk

Lk

Lk

b

b

b

O

—k

CD

—x

ru

ru

00

oo

CD

—k

CD

CD

“k

o

o

IU

CD

CD

*χ|

“*

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

CD

CD

00

00

OO

<D

oo

CD

G>

00

CD

CD

CD

CD

00

00

00

CD

5 0)	3 0)	2 Q)
ο	ο	Ο
		«Α
ω	ω	co
C0	ΟΟ	0)
ω		_χ
co	ω	ω
<0	α	ΙΌ
ω	Α	(0

ω cn

ΙΌ *4 Ο Ο)

0	0	0	0
<π I	00 1	00 I	00 1
1 υ	1 00	1 00	ϋθ
7J	>	>	>
ω	—1	—i	—1
>	ώ	ό	g
Ο	ο	0	-J
ο	σ	Γ~	<
ο	>	-<	ο
-> ο σι	-4	ω m	Ji ω

0	0 0	0 0	0	0	0	0	0	0	0	0
00 I	03 00 1 1	00 00 | I	00 |	00 I	00 I	00 1	00 I	00 I	00 I	00 1
1 0	1 1 Ί3 73	1 1 m 7)	m	1 0	m	1 ΞΕ	1 Ί3	1 •υ	1 lľ	1 ζ
ω	Ľ ο	(Λ ο	W	73	ω	-1	1“	η	-1	-4
ω	• 1	J	—1	Ν>	—I	0	Κ)	ΙΌ	0	0
σι > D 4	ro£ °§ 8 00	Μ > Μ 03 >§ Ο 00	ω -Ν > <	i ω Μ Κ>	ω ΙΌ > 4	ω > Ο ο	Š > ο	> Η > Ο	4i > ο ο	ΙΌ > Ο ο
G)	ro 00	σ (Ο		--J	ΓΌ		ο	Ο		ο
σ>	ω <Ο	Ο -i		Ί3	σι	_χ	ο	ο	_χ	-4
oo	y σ	σ σ	—1		σι	_χ	σι	σι	σ>	Α
		ω ω	ο		ω	σι	00		(0	-4
ο		Μ _χ	<0 (0		ω	ο	ΓΌ σι	σ) *4	σ>	ω

_Α

α

ΓΌ

0)

Α

00

ω

ΙΌ

σι

_k

00

*4

ιο

ΟΟ

_k

ο

G)

00

C0

-4

ο

(0

ω

-4

ΓΌ

ΓΌ

ΓΌ

ω

ΙΌ

ω

*4

00

_k

00

0)

ω

ο

ω

(0

00

^1

ω

ΓΌ

ω

Α

Α

ω

Μ

σι

ΓΌ

οο

0>

00

-4

00

σι

—k

ΓΌ

Ο

ο

Α

ΓΌ

>

>

X

>

>

>

>

>

>

>

Ν

>

>

>

>

Ο

Γ

(0

Ι-

D

σι

00

ο

00

<

00

*4

Ο

Ο

Ο

ο

Ο

CD

Ο

*4

ο

ο

σι

ο

—k

ΓΌ

Ο

Ο

ο

ο

C0

Α

ΓΌ

cn

ο

ο

ο

ο

*4

ο

σι

__k

Q

ο

Α

-4

ΓΌ

o

σι

03

cn

00

_k

ο

σι

_Α

οί

σι

ο

—Α

—11

Ο

00

ΙΌ

00

co

CD

Ο

-4

00

00

σι

Ο

Ο

A

ω

03

ΙΌ

(0

W

σι

Μ

ČD

Α

*4

Α

O

*4

σ

σι

(0

ο

σ

-4

σ) (Ο σ)

CD Α 00 σι CD > Ο ο ο

Α -4 ω

2	2	g	<:
c	c	c	c
ω	ω	ω	ω
3	3	3	3
c	c	c	c
(Λ	ω	ω	ω
Ο	o	o	o
C	C	c	ε.
c	c	c	c
ω	ω	(/)	ω

A	A A	A	CO	CO	ω	CO	CO	CO	A
	a σι	0)	CD	00	•4	A	A	00	O
CO	o σι	K)	“4	A	-4	ω	G>	N)	0)
-j.	<0 -4	ω	ω	CD	N)	—k	—k.	CD	G)
0)	•4 A	•4	00	ΙΌ	ΙΌ	—*	—*	O	A

O

ΓΌ

N)

ΓΌ

ΙΌ

ΓΌ ΙΌ

O ΙΌ

O

ΓΌ

_k

O

_k

N)

O

(D

4

A

A

00

o ω

C0 OO

0)

ω

—k

—1

ΓΌ

σι

0)

Γ4

O

O

Ó

b

b

l_k Lk

O ’o

O

O

Lk

b

Lk

—k

O

-4

-4

ΓΌ

ω

4

—k —k

•4 CD

-4

—1

0)

O

A

O

O

OO

CD

(D

(0

co

b

CD CO

(O CO

CD

(D

<0

(0

CD

CD

CD

CD

00

00

-4

CD

(0

(0 4

00 <0

CD

<0

(0

(0

(0

00

(D

(0

5	5	5	3	5	5
	α>	0>	ο>	D)	0)
ο	ο	ο	ο	Ο	ο
		_Α
φχ	-Ν	χ.	X	X	X
00	00	00	f*.	Ε	—X
φ	σ>	ω	σ>	Κ)	σ>
	S	_j.		_k	σ>
_k	σι	ω	Α	ω	ω
φχ	s	<0	-Α	χ.	ο
σ>		ΟΙ	G)	S

ω ω φχ οο ΙΌ ΙΌ

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0 0

0

0

0

0

0

0

OT

0) I

00 1

00 I

00 1

0} I

00 i

00 1

00 1

00 1

CD 1

00 I

00 οο

00 |

00 I

00 1

00 I

00 I

00 |

1 OT

1 (Ό

1 <π

1 m

00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 1 00 00

1 00

t 00

1 00

1 00

1 0

00

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

> >

>

>

>

>

ω

>

ΓΌ

-Α

R)

-A -Α

—Λ

—X

—Λ.

ω

—X

2

ό

ώ

2

2

>

2

Š

2

ώ

> m

□ ό

2

ώ

ό

σι

ό

Ι-

Ο

ο

ι-

Η

“Π

ω

Η

Γ

-1

ο

φ φ

-j

Γ

ο

0

>

0

Ο tu

Τ) Π

ω ο

Ο 00

< Ο

ο ΓΌ •sj

0 οο

Ο <

Ο 00

τ

ο ο η

ο ο 00 00 N) ΙΌ

< ο

Ο 00

ω Ο

I -<

Ο -sl

I <

Μ

>

ω

Ν)

Ο

Ul

<0

X

G>

ο

Ν)

ΟΟ -xj

ο

Μ

ω

ω

0)

(Λ

Μ

0

ΓΟ

ΓΌ

Ο

Μ

00

m

-χ|

ΙΌ

Ν>

m

φ

m

ω

-sl

Μ <0

ο

Φ

0

ΓΌ ΙΌ

0

Ο ω

φχ

_Χ

ω

σι

σι

ω

ω

ω

ω

ω

—X

—X

—X

σι

φχ

ω

ΓΌ

σι

ΓΌ

Ο

υι

-Α

ο

σ>

ο

-Α

0)

σι

φ

ο

φχ

00

σ>

Ο

—1

ω

ο

ω

ΓΌ

φ>

ω

ΓΌ

φχ

0)

0)

ΓΌ

ω

ο

σι

00

σι

00

Α

ΙΌ

ω

ο

-χΙ

00

-xj

00

00

—1

00

-χ|

ΓΌ

ΓΌ

σι

φ

00

_Χ

00

00

Φ

Φχ

-Α

ΙΌ

—1

Φχ

Ο

σι

ο

φ

σι

ο

0)

φ.

_Α

ΙΌ

Ν	σ	>	N	>	>
Φ	G)	Ι-	Φ	r*	H
00	•sj	ο	00	O	o
-χ|	φ	ω		O	ΙΌ
U	CD	—k	φχ	00
—k	-xj	ΓΌ	—x	Φ	σι
		G)		CD	o
		—X		-xj	—x|

-s|

ΟΟ

ΙΌ

N	>	N	>	>	□ □	>	N	>	x	>	X
00	1“	Φ	n	ΓΠ	Φ Φ	Ι-	Φ	r	φ	o	Φ
G>	o	Ul	o	o	O O	ο	oo	o	O)		σ>
00	ΓΌ	ω	φ	o	00 00	o	-χ|	ω	Φ	G)	φ
CD	G)	ΓΌ	φ	o	ΙΌ ΙΌ	00	Φ	_A	-χ|	Φ	-x|
o	Ul	Φ	•Sj	ΓΌ	00 -sl	Φ	A	ΓΌ	-A	ΙΌ	—k
	—X		Ul	*xj		CD		ω		M
	Φ		φ.	Φ		•si		-*		G)

*σ

-τ Φ “Π >

ο

I (Λ *< a φ &

2 2 2		2
< o	<g o	< O	CQ	o
o	3 o	0	3	0
cr	a> cr	O	φ	cr
Q)	□ »	0)	3	0)
O	o	o	1^·	o
Φ	K r*‘ 7^ Λ	Φ	-X	1-¼ Φ
□ x	R	□.	00	□.
c	y c	c	—x	c
3	3	3	CD	3
o	N ?	φ	ru	e
TJ	σ	TJ		cr
—T ω	φ “1	0)		φ
φ	o	Φ		o
7Γ	£.	π		H
O	o	0		0
N	cn	N		<nt
3	cň’	3		cň’
ď	□ľ	á.		□ľ
CD	G) *xj	OJ		G)
A ΙΌ ΙΌ	πι <	φχ		TJ <
Φ	c* TJ □			C' TJ 3 <'
□ Z
>	(Ω			(Q
cn	Φ			Φ
Φ	□			3
? Φ	O* 3			O* 3
□
o

ω φ π <

φ □ ο ρ>

Ο φ_

C ω *< ω m

ω ω

(Q

Φ' □

*<

ω cr c

7Γ ω

Α

Ό Ο ω η< Ο < ω □

φ' |vj ο

φ

ζ.

ο ZJ^-

0)

3Γ

Φ

0) m ω ο

ο cnco ο

φ φ ω Σ2.

C

Ul Ul	G)	GJ	σ>	G)
CD 00	-M	Φ	ΙΌ	G)
Ul	G)	_A	’-xJ	O)
Ul —x	Φχ	σι	ΙΌ	CD
—x -xj	O	φ	CD	σ

ΙΌ

o

ΓΌ

-A

_A

_x

-A

ΙΌ

_k

o

_X

ΙΌ

ΙΌ

_x

ΙΌ

_A

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

OJ

O

ΓΌ

-sl

CD

Ul

-xj

xj

xj

-U

ΙΌ

—X

—X

s

ΙΌ

o

φχ

00

Φ-

b

b

b

O

O

O

b

b

b

b

b

La

b

b

b

b

b

b

b

O

oo

ΙΌ

00

00

U)

CD

CD

oo

CD

Ul

ω

G)

cn

oo

00

ΓΌ

-sl

ΙΌ

Φ

Φ

φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

φ

Φ

φ

Φ

Φ

Φ

-xl

Φ

00

-xj

00

00

0)

00

Φ

oo

Φ

00

-sl

-xj

00

-sl

00

-xj

Φ

•^i

cn o o

s	5 5 5 5 5
0)	fl)	D)	0)	0)	fi)
o	o	O	o	o	o
_X	^A	_A	—k	_A	—X
CD	σι	cn	CD	CD
A	^A	—á	^A	O	co
CD	CD	a	M	00	-*
CD	CO	—4	-M	—A	o
	sl	—A	to	(D	—4
ω	CD	“1	G)	CD N)

O oo I

TJ r N) ti CD Z

-sl CO

0

Q

0

0

Q

0

0

0

Q

Q

0

0

Q

0

0

Q

O

00 1

00 t

00 I

00 |

00 |

00 1

00 I

00 I

00 I

00 t

00 1

00 t

00 I

00 I

00 f

00 I

OD 1

1 z

1 <

1 00

1 00

1 00

1 u

1 00

1 00

1 00

i 00

1 00

1 <

'<

1 o

m

1 00

oo

-1

7^

>

>

>

1“

>

>

>

>

>

rÝ

<

ω

>

>

0

σ

-x

—k

—A

—A

—A

—A

o

o

j

-A

ω

s

5

m

m

m o

s

g

g

g

ώ

m

m

o

ω >L

S

ώ

ί-

m

-1

o

o

Γ”

-I

H

>

o

Π K) 00

Π K) 00

-j

o

ο

K)

o

o

o

Q

O

o

-Í.

C

m

o

c

<

-A

o o CO

G) 00 00

A CO

c ž

c š

-1 0 o

OD K) σι

< sl Z

CD O

oo oo 00

CO

O w

O N)

z > “0

A* ω σι G)

o o M

O > O

M O

-χ4

CO ω

CO ω

z

K 00

-sl 00

o

sl CD

73 o

s cn

00

-b-

—A

CD

W

ω

ω

M

ω

N)

ω

00

G)

_A

-sl

M

σι

ω

M

oo

O

A

CO

ω

ω

A

oo

A

ω

A

sl

A

A

ω

CD

G)

(0

σι

φχ

ω

A

OO

00

K)

<0

M

o

O

-sl

CD

G)

M

CD

•sl

(D

N)

00

ČO

ω

CD

CD

A

CD

ω

CD

cn

-sl

—X

ω

0)

^A

o

ω

ω

0)

£

o

o

ω

w

CD

A

A

A

>

>

N

C

c

N

>

N

N

C

>

N

N

X

> >

>

o

c_

Ό

1“

CD

CO

00

r~

CO

CO

CD

>

Ι-

n

θ

ro

ω

A

CD

o

cn

cn

00

o

G)

G>

N)

G>

Ο

o

Q

ω

CD

o

o

-sl

M

cn

00

G)

ω

G)

cn

o

sj

CO M

00

G)

o

o

cn

ω

cn

ω

-xj

(D

00

OO

00

G)

oo

00

00

G)

ω

ω

*s|

O

-sl

G)

cn

00

O

o

O

CO

CD

G)

A

CD

cn

G)

—k

O

-4

ω

G)

-s|

00

2?

£D σ Q,’ o “O ω ω’

Q) □

Q)

ΊΊ G) Z 00

s s
θΐ o 3	θι o 3
O 0	cr 0
Q) □	Q) □
o	o
r+ v S.ČD	rA- s Λ ľt 3. V1
c ω	c é
3	3 zt
G)	. G)
(D M	? N
TJ ‘	cr
“Π fi)	0
0	o
7Γ	£.
O	o
N	ω
3	ω’
a.	Z
00	G) •-J
M cn	73 <
00	C' Ό
	□
	(Q
	0
	□
	O'
	3

ω

Ό

O < o Q ω o o ÍL 5' O. o

N

CL

O >

•sl

to

G)	G)	ω	G)	G>	G)	G)	G)
cn	G)	-sl	G)	oo	•xl	00
00	_A	oo	G)	O	cn	CD	00
-U		CD	-Ps	^A	o		-X|
G)	CO	—•4	G>	O	o	CO	G>

		cn	G)	G)	G>	ω	G)	G>	G)
G)	O	N	CD	00	**4	00	-sl	-sl	G)
G)	o	cn	b		“CD	K>	G>	O	ω
	00	N)	M	G)	00	00	K	G)	G)
G>	G)		A	CD	•ps	CO	-sj	M	O

o

N)

M

-A

M

bj

_X Q

_k

M

to

_K

N)

-X

o

(D

G)

O

G>

-P^

sl

*xj

p

•-4

00

*sl

(D

<o

p

ω

CO

•sl

CO

b

o

’o

O

b

o

b

La

b

b

b

O

o

«Α

La

—k

b

b

b

OO

G)

OO

OO

G)

-ps

O

00

G)

G>

ω

cn

—*

—k

O

D)

G)

b

(0

CD

ČD

b

b

b

b

b

b

b

<D

(O

b

b

b

b

b

b

CO

CO

CD

CD

CD

G)

G)

cn

CD

00

00

xj

(D

oo

oo

cn

M

00

(D

J ω	5 D)	s 0)	5 0)	5 0)	5 0)	5 0)
o	O	o	o	o	o	o
	^A	^A	^A	A		^A
O)	0)	σι	cn	cn	cn	cn
cn	_A	(0	o	cn	KJ	ro
	-4	<0	a		00
-4	*4			.A	o>	CD
N)	CD	-4	o	<0	cn	N)
G)	cn	00	σι	CD	_k
		σι	ω	00

0	0	0	0	0	Q	0	0 0 0	0
00 I	(D I	UJ	00 1	□0 |	00 I	00 I	00 OO 00 1 1 1	00 I
1 m	1 (D	1 Ό	1 o	1 TJ	1 00	1 00	1 1 1 00 o TJ	1 <
ω	>	70	70	70	>	>	> g 70
-1		KJ	KJ	KJ	—-	—k	ΓΤ A-	o
po		i	i	i	s	c	s X 1	m
b	-I	u>	ω	ω	r·	o	-10 w	< CD KJ
*vj CD N)	o	s			O	o Q	o o c
-<	-1	G) f-t	-1	00	N)	Zľ > cn	T
-vj 00	> _A	g o	VJ o	o	ω cn		B2g	<0 >
	O						CO

0 0	0	0	0 0 0 0	0	0	0
00 00 I I	00 I	00 I	00 00 00 00 i i 1 1	00	00 I	00 I
1 1 00 00	1 00	1 TJ	1 •0	1 70	1 TJ	1 T	00	1 T	1 T7
>>	>	70	70	O	70	70	>	r-	I-
KJ	A	ω	ω		KJ	KJ		KJ	KJ
ώ m	'š	>	>	É	ί-	ί-	>	>	> -Π f—\
o o	-1	O	O	S	ο	ο	z	-1
O O	O -< KJ KJ 0	o o cn —j	o o cn —j	A ω M TI	o o KJ A	O o KJ A	> z Π	o o o	ω 00 00 ω
00 (0	A	A	<0	CD	CD	00	cn
o	O		—k	—x	z	(0 cn
	o							•Vj

ω

K)

M

-A

KJ

G)

G)

G)

ω

ω

A

G)

_A

_X

-A -A

cn

_k

0)

CD

cn

_A

cn

00

CO

-4

<p

KJ

-vl

cn -4

cn

00

00

0)

<0 CO

<0

o

A

NJ

(0

-vl

G)

*4

CD

A

ίη

o

G)

A 0)

A

0)

0>

cn

*4 -v|

G)

00

vl

A

cn

^A

0)

G)

<0

ω

KJ

<0

A

N)

-vl

*4

(0

M M

0)

G)

(0

σι

A

σ

0)

G)

M

σ>

-* (0

O

OO

00

o

*4 *4

cn

-v|

-v|

v|

cn

O

O

G) G)

cn

O

N

>

>

>

N

C

N

g

c

>

> C

N

>

>

>

> >

C_

>

>

-vl

CD

Ι-

Γ-

Ι-

(0

o

CD

cn

r*

r- o

00

o

o

Ι-

O o

O

O

n

CD

cn

ο

o

ο

cn

o

00

oo

o

o o

A

o

o

ο

o o

cn

Q

O

N)

g>

G>

N)

G)

—1

o

N)

o

G)

CO O

-vl

o

Q

A

o o

o

G)

“vj

00

A

A

—1

M

0>

ΊΓ

o

K)

CD O

N)

cn

cn

CD

N) NJ

cn

00

00

*4

G>

A

ω

-4

—x

00

GJ

(J)

oo cn

A

*vj

vj

00

A A

CD

00

00

O

oo

G)

KJ

A

A

0)

0) 0)

σ

G)

A

-4

A

O

GJ

O

O

0)

vj

—1

*< ΓΛ *< n Έ n
o	d	O
σ		σ
ω	□	ω
o		o
(D	-4	cd
□ . C	0J	□. c

ä-3	D)-
W	ω	ω
CD	o	CD
X		X·
<		<
CD	0	CD
□ O	3 o	□ O
S*	N	S*

NJ M

1 N) A	-v| ZJ
v|	<
C' Ό □

Z

S

x

Z

Z

CD

2

CD

2

e s

ω

Z

2.

o

n Í2

m

2* 2

T

Z

2

Z

Z

o

σ

<

o

0

O

Ό

*<

C

*<

σ·<

c

O

(D

ω

O cf

(Λ

£Γ*<

o

o

C

O

O

3 0

(D -t o

o 0 cr

B o

3 0

3 o

W CD

O O C-

Q) CD

O O C

CD o z o

</) ω o

3 o

(Q Q) □

□ o

2. ít ô”5. O n

O ZT (D

CD O z o P σ

3 o

3 o

cn 3

3 o

3 o

cn

c

0)

ω

cn

cn

fi)

Q)

£. ω

1

cn

cn

g-

λ

3.

C Q)

m

cn

c

cn

cn

Q)

0

o

D)

Q)

fi)

O

O

o o

5.

Q)

J

5 2

O «r

O o

a>

Q)

cn

ω

ω

Ί2.

cn.

CD

σ

*5.

’C

CD

rÁ CD

S* «

Q)

Ί2.

Ul σ

·<

Q)’

-a

u

o Q

*S.

’C

cd*

ω

2.

n>‘

(D*

CD*

0.

0.

W Ξ3.

CD*

Q.

O

ω □.

5’

(D*

CD*

CD*

□

C

□

□

□

C

C

C

□

CD tft

O

c

□

3

C

□

□

ω

3

ω

ω

ω

3

3

3

cn

cn’

Vr

o_

3

<n

cn

cn

cn

cn

A

G)

ω

A

G)

G)

CD GJ

G>

G>

0) G)

G)

G)

G)

G)

G)

G>

G)

G)

JA

O

CD

oo

Ό

5°

jen

GJ CO

-vl

00

O OO

00

oo

•Vl

-v|

A

0)

00

00

O

0)

b

•vj

oo

vj

vl

GJ GJ

•v|

cn

NO

G>

b

o

cn

-4

0)

N)

O

cn

σ

0>

«Α

σι

σι

O A

G>

—k

v| 0)

•vl

G)

G)

o

—X

M

O

CD

O)

σ)

00

00

—A

0)

ω

O O

O

A

cn a

—A

σι

—k

o

<0

G>

0)

σ

0)

o

_k

o

M

O

N)

M

_k

K)

O

O

o -*·

_A

o

O N M N

N)

O

-A

(D

^i

σ

G)

cn

A

CD

-v|

-4

^1

N)

OO -v|

-4

CD

O

O

0)

'N

ω

b

b

b

1a

b

O

b

O

b

_A

O

’o

b

Í-A

La

O

b

b

O

b

b

N)

ω

-v|

—k

*vj

0)

CD

0)

A

M

CD

*4 M

0)

o

O

0)

CO

00

A

—1

A

CD

ČO

Č0

ČO

čo

ČO

ČD

(0

*(0

ČO

ČO

ČD CD

čo

(D

ČD

CD

CD

(D

CD

CD

CD

ω

00

(D

<0

CO

•v|

A

00

G)

CD

CD

<0 G)

00

oo

OO

(D

-v|

-4

G)

<0

CD

5	5	3	5	2	ί
0)	D)	α>	ω	ω	ω
ο	Ο	ο	ο	ο	ο
	_χ	_x	—1	_Α	_χ
σ>	σ>	σ>	σ>	σ>	0)
<0	(Ο	(0	-Ί	-j	0)
00	ΙΌ	ο	<Ω	00	ο
—X	ΟΟ			σι	0)
ω	-4	Μ	ω	σι	-4
σι	ω	Μ	σι	—ί	U1
ω		Α	<ο

0	0	0	0	0	0	0	0
00 I	00 I	00 I	00 I	00 I	00 I	00 I	00 1
1 00	1 00	00	1 30	30	1 00	1 < ΙΌ	1 m
>	>	>	ο	ο	>	ω
^χ	-Α	κ>	7ϋ 0		Κ)	>	—I
2	2	>	'i	>	Π «Α	ΙΌ ΙΌ
ω 0 00	-1 ο -<	Π Ν> Α	ζ Π ζ	-I ζ •η	“Π ο 0) -4	-4 00 (0	> ο 0) Α Μ ω Μ
<0 ω Μ Ο ω	σι (Ο	σ> ο ο		ZC ϋ m υ	ΙΌ ω	0)

0	0 0	0	0	0	0 0 0	0	0
0 |	00 00 I 1	00 I	00 I	00 1	00 00 00 1 1 1	m I	□j
1 00	ι 1 ό ω	m	1 <	'<	1 ι » < 13 7U	1 00	1 ro
>		ω	Ξ > Ο	>	>
—1	—1	d	ď	ď η -	—k	ΓΌ
ώ Ο ό Μ	> 0 2J Μ r ί Ο> rn <0 Φ ΙΌ σ.^	ιη ϊ <0 Α 00 4^ ω	< G <0 σι ω ο Μ	< G <0 σι ω ο ω	gší |s< S οο (0 w	2 o _A ω	> Π ΙΌ CD CD ΙΌ
	_Α					CH

G)

g>

ω

ω

—X

_A

A

4^

G)

G)

0)

0)

(D O) O)

_k

_k

00

ω

-A

o

o

o

O

CD

N)

ΙΌ 0)

0)

o

o

O A A

_x

O

CD

00

^A

00

00

ω

ΙΌ

G)

N)

O ΙΌ

ΙΌ

o

o

O 00 00

G)

ΙΌ

-A

_A

cn

Ul

cn

A-

O

_A

ΙΌ

O O

cn

4^

OO

O

A

ω

CD σ •π ω CD

1“	N	>	X	z	>	>
*4	00	n	—X	G)	“Π	m
00	G)		G)	-sJ	O
00	00	K)	00	ΓΌ	0)	_x
ΙΌ	0)	A	O	ΙΌ	-4	-J
O	G)	0>	A	*4		oo
		O			ΙΌ	<0
		O			G)	0)

>	>	> 0	I	C	C	C > X	>	>
Q	1“	TI N)	<0	S	<0	<0 0> (O	ľ“	Π
0) K.	O	0)		cn	cn -Ί •'J	o	—x
G)	ω <o	oo	ω	ω	ω cn -~j	N)	ΙΌ
Ŕ G) ΙΌ	—x	(O W	A	o	o	o o ->	—k	CD
	A tn	ω	M	ω	(0 00 co	G)	CO
ΙΌ	cn					O	ΙΌ
A						CD	cn

ο ο cr ω ο α> 3.

ω (9 (Q 3

Π) □

(D *U “1 ω ro

ο Ν

CL σι

□ ζ >

ω η π < π>

□ ο ω*

t'j UJ

0)

GJ

v

ω

G>

A

ω

G)

cn

G) G>

G)

ω

G) GJ

A

-U

ΙΌ

0)

O

•4

—4

oo

σ>

00

o

OO CD

CO

co

—*·

-a cn cn

O

o

*4

G)

O

o

O

O

La

O

cn

CO

La

cn

-4

oo ω ω

CO

-4

00

ΙΌ

b

CD

CD

-vl

ΓΌ

G>

A

-> cn

cn

*4

—x

co σι cn

00

O

o

G>

o

G)

ω

C0

ΓΌ

-4

A

O -4

*4

0)

ΙΌ

4*. -N -ŕk

0)

CD

•A

0

_x

ΙΌ

O

0

ΙΌ

_x

0

_A

ΙΌ

ΓΌ

ΙΌ

M O M

_x

_k

cn

74

^4

G)

M

U

cn

-A

CO

00

00

00

cn

co

4

-4

o

b

b

b

b

b

b

Lx

b

’o

b

La

La

_A

La

S

b

O

b

p

0)

cn

-4

4^

σ>

-4

—

cn

cn

—k

O

0

O

cn

00

cn

cn

CD

ČD

čo

čo

CD

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

0)

00

co

cn

Gí

00

co

00

co

co

0)

cn

-4

-4

-4

co

O)

00

CD

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

CD

(D

CD I

CD I

CD I

OJ I

OJ I

CD I

OJ I

OJ 1

CD I

CD |

OJ I

(XJ 1

(D 1

1 CD

1 07

1 m

1 m

1 TJ

1 TJ

1 TJ

m

1 I

1 z

m

m

ΓΤ1

1 07

1 CD

>

>

U)

ω

20

r-

20

ω

-1

-4

ω

ω

ω

>

>

—4

H

A

r-J

A

H

0

Q

H

—4

—1

M

K)

2 ι-

-í

ω >ÍJ

ω 70

ίο

-4 2

ίο

M 74

i

i

N>

K)

CD O

> “Π

> n

Ο CD

O ·<

A CD NJ

A 0) N)

o o OJ

o en

O o 0)

> t

ω σ

ω σ

1

!)> <XJ

CO -vi

O 0)

—X NJ A

κ> M

(D

M -vl

K)

G> l\J

>

ω N)

*4

<_ en

<_ CJl

σι N)

<D M

M

cn 00

CD O

O

ro

o

M

O 00

w A

G) A z:

A 0) O)

A CD CD

σι

O

A

G)

a

A

—x

_X

—X

A

_A

_x

N)

N)

G)

A

A

O

A

a

A

*4

0

*4

G)

cn

CD

-4

*4

<0

N)

G)

ω

<0

CD

<0

A

A

00

00

CO

O

00

σι

0)

—x

0)

A

A

CO

CD

_x

o

A

00

A

*4

O

A

O

0)

CD

N

N

7)

Ζϋ

>

>

>

>

>

>

>

>

O

>

>

(D

*4

A

A

0

TI

0

r~

n

>

>

“Π

Π

00

O

0)

0)

0

0

0

A

-a

co

co

CO

O

•*4

ΓΌ

ΓΟ

ΓΌ

0

Q

0

0

cn

cn

*4

—x

m

A

00

ro

N)

0)

G)

0)

(0

CO

no

M

0)

A

—1

G)

-4

-4

co

ro

CO

Q

(0

CO

A

A

N)

en

CD

N)

CO

N)

00

M

N)

en

en

00

O

N)

A

M

en

en

en

σ>

cn

O

	00 O		<
N	ω S	2 O ’	□ (D
-4	*	c cn	C
X)	3 *2	cn G)	ω
-x	70 ω > G)	TJ A	TJ
_x K) G) 1	q Q) Q_ *	0 □. Q) Q.
Δ K)	^0)	ω í	0) □
		Xl·	*<>
		0	O
—k	r	□	ΖΓ

φ 2 e 2	Z	Z	Z	n> 3
TJ *<	σ<	0	O	0
m 0 X 0 « c	CD O p g-	3 O	3 0	3 0	ď) Z □ ex
0)	C. Q)	ω	en	en	fi) 0
O	0 0	Q)	ω	Q)	TJ
f-A CD	—· a	TJ	*2.	*2.	ω.
3.	ω □.	cd	<d‘	cd’	cn
C	C	□	□	z
3	3	ω	ω	cn
en	en	A	A	G>	ω
-4	(D	N)	M	-4	cn
en	K)	0)	bo	Kj	en
00	co	en	_x	A	CO
A	A	cn	M	G)	00

Z	g	Z	Z	0 -H
0	c	0	0	2
3	en	3	3	b. TJ
0	3	0	0	š
ω	c	en	cn	0
Q)	en	0)	ω	cn
TJ	0	TJ	TJ cd’	0
cd’	c	cd’	3
□	c	□	□	0)
en	cn	en	cn
G>	Ca)	e>>	Ca>	A
en	CO	en	en	—X
bo	en	en	ω	G>
—i	*4	cn	cn	en
•4		-A	—	*4

q Z<	0		ta O
2 »5 tJ.TJ m □	1 cn	Q) ej- 2. 3 CD TJ a.o	S R Q) < I.?
0 en 0 3	0) tí*. < Q)	en g x: 0 CD	O cr c 0> 3 a m
Q)		en	-
			c’
			3
A	A	A
O	en	O	0
bo	A	K>	0
•4	K)	0)	b
en	cn	0	0
			0

M		N)	M	_X	_X	—X	O
M	4	M	K)	00	ro	00	CD
b	b	O	b	b	b	b	b
00	en	en	cn	G)	-4	G)	G>
co	b	b	b	ω	b	b	b
*4	00	cn	cn	CD	^4	CD	co

N)	N)	ro	N)	M	0	0
G)	G)	CD	(D	A	>4	A
	^x		L_x	Lx	L_x	b
—k	—k	0	O	O	M	cn
b	b	CD	b	b	b	b
<0	CD	00	00	en	^4	<0

s	s	2	5	3
fi)	a>	0)	0)	0>
o	o	o	o	o
	_.A		_1
00	00	00	OO	00
sj	0	ω	IM	o
00	o	m	—k	sl
	_X	0	A	(D
o	A	σι	O
o	-sl	A·	—a	cn
IM	O

Q

OD I

I —I Q

Ó m

< cn A *n

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

OD 1

00 I

00 1

00 t

ro 1

00 I

ro I

00 I

ro t

ro I

ro 1

ro I

ro i

ro I

ro I

ro I

1 OD

1 00

1 00

1 0

1 ω

1 m

1 O

1 70

1 ro

1 I

1 z

1 ro

m

m

m

00

>

>

>

ω

—1

ω

<

O

>

-1

-1

>

ω

ω

ω

>

bs)

bJ

K)

w

ω

“H

—A

0

0

-H

—1

“H

—k

i±

>

m

ω

0

ω o

Λ* g

ó

A

A

>

IM o

A

IM

ώ

ω

m

O

ro

A

—I

0

>

ί-

TJ

sL

Z

sľ

o

bs> M

o O o

o c

ACD o

00 w A

> 0) IM

0 K ΓΜ

> f“

n o o

O o

ο o

o o o

£ oo

ω A O

£ CD

cn “Π sj

σι

w CD ro

Š 0

cn M

0

CD A •s| CD

Q i”

s| sj ω IM

O 0) (D A

o 0 <0 A

o 0 ω

CD CD O co oo

A IM

00 A cn A

_χ

„A

_k

_a

cn

cn

ω

_k

A

—a

—k

—x

A·

CO

A

•sl

Ca)

o

CD

ω

0)

A

0

0

A

—A

Sj

co

O

cn

cn

CO

00

o

CD

CD

CD

0

O

CD

CD

•sl

ω

A

O

—A

—A

O

OO

OO

ω

A

CD

cn

o

cn

cn

o

00

o

sj

Sj

o

N

C

>

c

00

0

>

X

2

>

>

>

>

>

Z

>

<0

ω

m

A

A

0)

•sl

IM

c_

O

O

T0

>

CO

>

CD

IM

o

00

CD

00

N)

00

A

O

o

o

o

a

A

CD

sj

sj

o

CD

O

IM

CD

IM

O

_A

o

co

O

_k

sj

o

CD

CD

A

sj

O

Sj

o

o

o

to

A

00

0)

cn

CO

•sl

N)

CD

-u

IM

co

sj

CD

(D

o

o

IM

A

CD

co

CO

(D

CO

0

ω

CD

IM

IM

A

A

ω

ra

A

o o

M

-s| M

*s|	(D	-J <D	u ω ·	1 fi)
CD	00	0 TO	a	O
□	0)	=> 0	X“ o	Q)
(D C	Z	C 1	ffl'	ω cn
ω Ό	IM	(/) IM “D -	cd	D)
O □.	4 4 4	-J- 4	^4	O O
0)		0)		z
Q. Q)		Q. Q)		>
2		2		z
·<' O 2		<* O 2“		o 2

Ca)

Ca)

Ca)

ω

ω

ω

Ca)

CO

ω

ω

A

A-

Ca)

CO

0)

CD

00

sj

•sl

Sj

oo

0)

OO

O

0

0

O

O

CD

(0

—k

00

o

o

b

’_k

(0

CD

O

A-

A-

O

O

C0

CD

oo

0)

IM

CD

IM

IM

o

CD

<0

b

0

0

0

O

A

CD

O

0)

(0

IM

IM

o

O

O

-J

O

IM

CD

O

,L	IM	_k	c	o	IM	M	_A	—x
A	(0	IM		00	0)	0	CD	CD
>	O	L_k	oo	b	O	b	O	La
O (0	CD (D	ČD	CD <0	Aco	CO (0	A- CO	IM b	IM b
00	00	00		(O	CD	CO	CD	A

O	_χ	_x	IM	_A	o	IM	IM
Sj	P	0)	IM	IM	IM	CO	IM
b	La	La	O	b	O	O	O
	O	O	0)	A	A	0)	sj
b	b	b	b	b	b	b	b
CD	(0	(D	co	oo	oo	oo	<0

bJ

ω -4 οο

Q

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

οο

00 I

00 t

00 |

00 I

00 I

00 1

00 I

00 I

00 I

οο |

οο I

00 I

00 I

00 I

00

00 I

1 □D

1 00

1 00

1 Ό

1 0

1 00

σι

1 00

1 ϋθ

1 ζ

'<

1 00

1 00

1 00

1 οο

1 I

1 ΞΕ

>

>

>

r-

Γ“

>

>

>

>

-1

ΓΤ

>

>

>

>

-1

-1

^Α

~*

.Α

Μ

Α

ΓΌ

0

Ο

«Α

Α

0

0

><

X

ό

>

>

Ο

>

ο

>

ω

m

2

2

2

2

>

ο

0

υ

“0

0

Π

>

τι

ί-

“Ρ|

—1

ω

Ι-

-I

ό

Ο

ζ

c

Ό

ο ο

ο ο

TJ

8

ζ

Ο

ο

0

Ο

Ο

m

m

I

ω

>

ο

ο

>

ο

70

ΓΌ

ο

0)

<

00

00

-<

-<

7)

G)

ζ

-ŕs

ζ

ο

cn

I

Μ

Μ

Μ

σι

cn

-q

cn

ΓΌ

Μ

σ>

τι

ω

<0

σι

-Μ

cn

σι

-si

Α

A

CD

00

ω

ω

00

0

ω

ΓΌ ο

Α

Μ φ Ο ω

ο

Α

Π

Π

0) >

m ζ

Α

-1

—1

_χ	00	ΙΌ	_A	_χ	K)	A	0)	_x
G)	A	—A	cn	σι		N)	o	~xl
ΓΌ	ΓΌ	0)	A	-N	cn	ΓΌ	σι	<0
CO	<0	N	A	4^	A	00	4κ	00
			s|	-4
			00	00
g	C	X	>	>	X	>	-<	>
(0	G)	CO	g	T	CO	“Π	O	-n
(D	ω	o	o	O	cn	O	CD	—X
	cn	cn	o	o	cn	σι	σι	—x
	A	00	o	o	c»	o	sj	N)
4^	00	o	4s	4^	o	—*	N)	CD
			ΓΌ	ΙΌ		O)		ω
			ω	Ca)		00		cn

_x	Ca>	G)	G>	A	G)	—X	—x
—k	00	CD	0)	O	<0	-4	si
CD	00	<0	(0	<n	<0		-4
cn	00	(0	00	o	CD	-4	—4
ω	0)		cn	ω		A	A
ω						00	00
>	C	N	r	N	N	N	N
O θ	A	-4	-sl	φ		CD	CD
_x	A	oo	~xl	A	(0	CD
f)	σι	O	oo	ω	O		^4
CD ΙΌ	±k.	ΙΌ	ΙΌ	cn	ΪΌ	-4	-4
G)	A	4».	ω	4^	0)	0)

ο

<	3	<	3
□	<	□	<
CD		a
C	Sľ	C	7Γ
ω	o	ω	0
Ό	□	Ό	□
o □.	-<	o 3.
fi)	0)	ω	0)
Q.	A	Q_	•U
ω	“Π	Q)	“Π
□	^A	□	^x
	_A
o	-	o
	*	ΖΓ	*
	4 *		4 4

G)

G)

_x

G)

G>

_k

*4

-s|

<0

G)

G)

G>

0)

0)

G>

G)

co

CD

OO

o

G)

cn

O

N)

o

CD

—X

00

-*4

4s

4^

cn

“sj

-4

CO

kj

o

CO

b

O b

O

G)

Vj

cn

cn

N)

N)

K)

b

cn

cn

O

A

b

ΓΌ

—X

00

ΓΌ

G)

-si

ΓΌ

ΓΌ

0)

0)

«X

“s|

0)

cn

<0

o

cn

-J

o

ΙΌ

G)

<0

σι

CO

O

O

O

cn

A

o

o

ΓΌ Ο

x

x

_X

_X.

ΙΌ

_X

o

_A

ΓΌ

_k

-A

ΓΌ

_k

_y

_k

4*

CD

—A

cn

σι

—x

G)

00

cn

00

(0

(D

cn

N

(0

A

O

O

O

b

b

Q

b

b

b

b

La

Ó

b

O

b

La

CO

CO

cn

CD

(D

cn

A

oo

00

cn

cn

00

cn

O

O

b

ČD

CD

čo

b

(D

ČD

b

b

b

b

φ

b

b

b

b

b

G)

0)

(D

(D

CD

CD

00

00

<0

co

cn

00

cn

CD

00

00

00

5 0)	2 0)	5 ω	5 5 3 ν ο) ω	5 0)	5 0)	5 ω
ο	ο	ο	ο ο ο	ο	ο	ο
NJ	ΙΌ	ΓΌ	ΙΌ ΓΌ ΓΌ	ΓΌ	ΙΌ	—X
	ο	Ο	Ο ο ο	Ο	Ο	(0
ο	(0	00	*4 C0 ΓΌ	ΙΌ	ΙΌ	φχ
0)	ω	σι	ΙΌ -> *4	Α	ΙΌ	Ο
_χ	(0	ΙΌ	_i.	ΟΟ	_χ
V	ΙΌ	co	Α	σι	ΙΌ	Ο
-4	-4	CD	σ>	to	ω	σι
C0		00	α		ο	(0

ο

Ο 0

Ο

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

00

00 00

00

00

00 I

00 I

00 I

00 1

00 |

00 1

00 |

00 I

00 |

00 |

00 I

iro

00 I

oo |

00 I

1 TJ

1 1 00 ΊΟ

1 m

1 ΓΠ

1 00

1 00

I 00

1 00

1 00

1 οο

1 00

1 00

1 00

CD

1 00

00

1 TJ

00

< ΙΌ

X

> 70

ω

ω

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

>

o

Α

-> ω

Η

Η

—X

—*>

—1

—χ

—k

«X

—1

-X

—k

SZ

ΙΌ

Ó

>

ώ >

Π1

ž

2

Ί3

ô

ό

s

2

É

>

ó 0

ó

>* “Π

>

Π (—

Ο

ο ο

ο

r~

Η

>

0

0

J“

U)

-1

Ό

0

—k

m

L—

ο

~χ Ο

£

ο

Ο

Ο

m

0

0

c

0

o

C

σ

σ

*4

o Q

CO

ο σι σι σι ω

> ο σι ω ο -4 Α

σ> Α Φ ω

> Α Α ΟΟ Α

c ž οο σι

00 ω ω

< ΙΌ ΙΌ 0 00

οο Α φ Α

□ I

σ □: >

σι CO o

00 Φ ΓΌ

ω <n A

A 4 O σι σι

z £ 70 n

> Ί3 m

cn <0 CD *4

A σ> -<

ω 4

A

co

A

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ω

ω

ΓΌ

<η

ΓΌ

-X

ω

—k

_k

σι

M

ΓΌ

(D

O

O

oo

00

φ

Α

CD

C0

Α

—k

ο

ΓΌ

A

ΙΌ

cn

ΓΌ

ω

ω

cn

σι

ιη

<η

σ>

(0

σ>

σι

ΙΌ

σι

OO

4

-4

•4

ο

Α

φ

Μ

σ)

ΓΌ

ο

ο

A

A

o

σι

ω

Ο

—1

co

1

£ fv

s οο

N CO A

N (0 cn

-< _x oo

X cn (0

X 4 ΓΌ

C cn

ΙΟ

N čo 00

C A •4

x 00 σι

X οο

> “Π

> ΓΠ ο

C Α CO

θ

24

σι

A

A

OO

cn

4

O

φ

co

*4

ο

CO

é Α

ΙΌ

00

(0

O

cn

00

co

4

cn

σι

-4

σι

_Χ

*4

(0 G)

é

ω

σι

A

A

cn

o

o

4

σι

cn

<0

<0 ω

Α σ>

-k

*4

S

•4

4

ΓΌ *4

13 «ι	ζ	Ζ
ο 9 q· ο	ο	Ο
3 =5 3	3	3
	ο	0
ω §· 2 ω	V)	ω
οι ο 3 ο>	0)	ω
Ό -< -σ.	-σ	Ό
<® 2 »	φ'	φ’
□ ® □	3	3
υ> 01 ιη	ω	ω

Φ Ό ω φ

Ο

3.

ď ď

ω	ω ω	10	£	ιη	(η	ω
Α	σι ->	σι	ΙΌ	Ο)	οο
“ιό	00 “(0	cn	—X	k	Α	i
«4		00	σ>	ΓΌ	00
Α	ΟΟ *4	ο	ω	4	σ>	ΙΌ

σ>

Α

C0	-k Ο	ΙΌ	Ο	ΙΌ	ΙΌ
	C0 Ο)	•4	Α	Φ	Α
	b	Α	b	b	ό
ΙΌ	—X	Ο	σ>	σι	0)
<0	b b	b	b	φ	b
00	(0 -4	4	-4	σι	*4

_χ	ο	C0	ΙΌ	ο	_χ
*4	σ>	ο	Α	φ	Α
b	b	b	b	b	b
σ>	ΙΌ	*4	σι	ω	Ο)
(0	<0	b	<0	φ	<0
00	ω	(0	ω	σι	σ>

ν		CO	O	ΙΌ	ΓΌ	_A
	*4	O	OO	O)	O	00
b	b	A	b	b	b	O
CD	ΓΌ	—1	oo	Φ		CD
(0	(0	(0	(0	Φ	b	b
CO	CD	•4	CD	Φ	(0	CD

<0

0	0	0	0	0	0	0
00	00	00 1	00 I	00 |	00 |	00 1
1 Ό	1 TJ	1 0	1 TJ	1 TJ	1 TJ	1 00
í“	r~	1“	Γ	ľ“	TJ	>
k)	k)	k)	M	k)	ω
C	TI	>	ii	>	Ϊ	ώ
00		-1	oo	-H	ω cn k) cn r*	o
(D <0 σι (0	cn Z φ	> O O o	<0 CO cn <0	TI k) TJ	ω m o
		cn		00	<n	-<
		00				o
		CO				z >
	-si	cn		oo		0)
o			o	cn	O)	-X
O)	O		cn		oo	cn
CD	CD	cn	<o	00	—k	A
*sl	-sj	k)	•M	σι
CO			ω
c	>	>	C	>	>	X
OO	o	o	00	Γ”	F“	oo
(0	o	o	(0	o	O	(0
CO	o	o	<0	k)	hj	o
cn	cn	cn	cn	k)	co
CD	k> «sj	00	<0	co A	00 O	_A
	00	CD		Sj

0	0	0	0	0	0	0	0
00 I	00 I	00 |	00 1	00	00 1	00 I	00 I
1 00	1 z	1 0	1 ZĽ	1 00	1 00	1 OJ	m
>	-1	(f)	—1	>	>	>	ω
—A	0	ω	0	—1	—A	—k	—1
ώ	ω	ω	ω	g	Č	ώ	Ca)
o	>	00	>	-1	o	o	TJ
ω	O	o	O	o	o	σ>	A
m	o	<0 oo ω co	o	-<	o	0	(D
o -<	o cn	o cn	ω ω σ>	o	o	A cn
o	-s|		-vj
z	CD		<0

>

cn	ω	_X	_k	_A	Ca)	A	Ca)	CO
cn		cn	-k	cn	k)		cn	CD
00	cn	-s|	(O	-si	A	_A		•sj
	A	cn	_k	cn	Ca)	-s|	Ca)
		cn		cn	-s|		A
		00		00
>	X	>	oo	>	N	c	>	TJ
•sj	00	o	o	O	CO	o	ί-	A
ω	ω	o	CO	o	cn	o	ο	CD
o	_A	00		cn	o	A	-M
čí <0	—A	o	W	o	oo		CD	A
—A	cn	(O	cn	cn	o	A	cn
σι		•sj		-sj			CD
	CD		(D			-si

N)

ΖΓ o 3 o

Ca)

Ca)

Ca)

Ca)

Ca)

Ca)

Ca)

Ca)

Ca)

Ca)

Ca)

Ca)

ω

en

A

A

Ca)

A

A

cn

Ca)

en

'sl

•s|

-sj

CD

o

—k

k)

00

Ca)

Ca)

kj

A

en

CD

00

’CD

en

en

_x

O)

k)

••J

k)

cn

cn

en

Ca)

O

A

O

o

en

CD

en

O

CO

A

cn

cn

en

—1

Ca)

CD

Ca)

CD

A

Ca)

—1

k)

k)

o

o

k)

o

k)

O

_k

o

k)

_k

k)

k)

O

k)

D)

N

Ca)

en

CD

Ca)

k)

—k

k)

A

A

A

A

—k

A

00

b

•

La

ó

Ó

L_k

’o

O

b

’o

O

b

b

b

b

b

en

_A

—x

en

en

Ca)

en

Ca)

CD

en

CD

en

Ca)

CP

cn

(D

CO

CD

ČD

ČD

ČD

CD

CD

ČO

CD

čo

ČD

CD

ČD

ČD

co

00

00

00

00

CO

CD

00

CD

00

CD

*4

CD

CD

A

CD

cn

I >

ω οο α

Μ

Ο σι

φ σ> Μ

Ο	0	0	0	0	0
00 I	00 I	00 |	00 I	00 |	00 I
1 03	1 00	1 00	1 00	1 0)	00
>	>	>	>	>	>
Ν)	—Α	—k		NJ	_,k
>	ό	ό	>	>	ô
ΊΠ	0	0	Π	“Π	0
Ο Α <0	> 70	> 70	ο ο υι	Ο Α <0	> 70
00	0	0	Ν>	οο	0
(0 -4	Ο <_	Ο c_	Α Μ	(0	ο c_
	00	00			00
	σ	σ			D
(0	Α	Α		(0	A
	ω	ω	Ο	_Α	ω
(0	σι	ιη	Α	<0	cn
0)	ιη	σι	Α	0)	cn
>	X	X	>	>	X
Π	00	00	π	“Π	00
ο	σ>	σ>	Ο	ο	σ>
Α	^Α	_α	Ο	Α	^A
<0	U1	σι	σι	(0	cn
00	-J	-4	Μ	00	-sj
C0			Α	(0
Μ			Μ	-4

0	0	0	0	0
00 I	00 t	00 I	00 I	ro I
1 OD	OJ	1 00	ro	ro
>	>	>	>	>
	Nj	—*	—1
	>	É	z	Š
“Π	TI	ω	ω	—<
o o	o A	0	0	o
cn	CD	00	ro	-<
nj	00	—k	_k
A	CD	σι	cn	<0
N)	-sj	cn	cn	O
		vA	A
		O	O
		ω	ω
	CD	ω	co	CO
O		05	0)	A
έ	CD	cn	cn	—A
0)	A	A	<n
	00	00	o
>	>	r~	f“	N
Π	m	-sj	-sj	-4
ô	o	00	oo	O
8	A (D	oo	00	NJ 00
M	OO	ω	A	ω
A	CO
M	-4

κ>

o«e. o<e. o	<Q O
o	s. 3		& °
Q	2. α	2. Φ	3. (D
σ-	o σ-	o σ*	o cr
Q)	ε Q)	C Q)	C Q)
o r*	3 o j «-»*	3 a	3 a
n>	φ	(D	o
2.	2.	2.	□.
c	C	C	c
3	3	3	3
(0		CD	(D
CD	O	00	00
kl	o	A	CTI
0)	o	•Sj	σ
-4	o	-4	—-

<Q OÔSÔSE 2

CD	w	CO	0)
(0	0)	0)	NJ
	σ>	0)	'C0
O	A	A	O
A	00	00	A

	o	N)	N)	O	o	NJ	O
cn		cn	cn	NJ	—k	cn	NJ
o	ó	'o	b	b	b	b	b
cn	-4	-4	*s|	-4	-4	-4	•sj
co	(0	(0	(0	CD	(0	CD	CD
0)	00	0)	0)	-sj	00	0)	-4

o	_k	_k	_k
	cn	cn	-4
b	b	b	b
74	ω	0)	σ)
CD	(D	<0	CD
00	o	0)	O0

N) cn ω

0)

0 00 1	0 00 I	0 00 I	0 00 1
1 00 Č	1 00 >	1 οο č	00 č
>	ό	>	>
“Π	0 >	Π	η
ο	ο	ο
Α.	G)	Α
C0			Φ
00	0	σι	οο
(0	ο <_ 00 σ	_Α	φ
•xj	00	-Ί
(0	Α	IX)	Φ
«Α	ω	Ο
(0	cn	-Ν-	(0
0)	σι	σ	0)
>	X	>	>
“Π	οο	Ή	-π
ο	σ>	Ο	ο
-Ν-	—X	G)	Α
ω	σι		Φ
00	-4	σ	00
(0		—X	φ
-4		ΟΟ	-ν|

0	0	0	0	0	0
00 I	00 t	00 I	00 |	00 1	00 |
1 00	1 00	1 00	1 00	1 00	00
>	>	>	>	>	£
		Κ)	ŕo	—k	Ν)
	ό	>	>	ο	> “Π
-1	0	“Π	ΓΠ	0
Ο	>	ο U	ο ο	>	ο -Ν
-<	70	(0		70	(0
ο 0) Τ	0 ο c_	00 (0	00 0)	0 Ο <_	00 <0 **4
	00			00
	ο			σ
G)	Α	(0		Α	<0
ΟΟ	ω	_χ	ο	ω	^Α
Ο	σι	<0	ο	σι	(0
ο	σι	0)	ο	σι	0)
Ο			-4
Ν	X	>	>	X	>
00	οο	“Π	ΓΠ	οο	ΊΊ
σ	σ>	ο	ο	CD	Ο
10	^Α	-Ν	ο	—Α	Ν·
C0	σ	(0		σ	(0
Ν)		00	00	*4	00
		(0	_Α		(0
		-4	0)

GJ

Ο

«θ. Ο	(θ_ ο<ο_	ο	<a. ο	P S	(Q	ο
& 3	& 3	&	ο		cr *<	&	ο
		ω q			3 ο ο	0) 3	*5
2. Φ	2. φ		φ	2. φ	C Q)		Φ
ο σ	ο σ	ο’	CT	ο σ		5'	σ
C fi)	C Q)	c	0)	ε α	(Λ Ä·	c	0)
3 a	3 a	3	ο.	3 a	S· Λ (ft 3.	3	ο Γ*
φ	φ		α	φ			φ
ZL	3.		2.	π.			□.
C	C		c	c	3		c
3	3		3	3			3
co			(0	_χ	CH		«ο
ω	ο		(0	ο	—4		<0
00	ο		00	ο	NJ		σ)
-Ν	ο		(0	b	-4		-Α
OJ	ο		οο	ο	00		IX)
	ο			ο

ο c σ οι ο

CD ο ο b ο ο

Ο	Μ	Ο	ο	_χ	Ν>	ο	ο	N)
_Α	σ	σι		—4	σ	_Α	K)	σ
b	b	b	b	b	b	b	b	b
•-j			—4	σ>	-4	-4	0)	-4
(0	(0	b	b	b	b	b	b	b
οο	0)	(0	00	ΟΟ	0)	00	CO	σ)

ο b -4 b

5 0)	g	£ ω
ο	ο	ο
ΙΌ	ΓΌ	ΙΌ
—Α	—α	^Α
φ	οο	•χΙ
CO	φ	σ>
	00
-4	0)	Μ
ο	—*	σι

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

00 I

00 I

00 I

03 1

00 |

03 1

00 I

00

00 1

00 1

00 I

00 I

00 I

00 I

00 I

1 00

1 Ό

1 CD

1 Ό

1 ϋ

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

1 00

00

>

70

>

70

Γ-

>

>

>

>

>

>

>

£

>

ω

—1

ω

hj

—k

—1

—k

Κ)

Μ

—χ

κ>

Kj

μ

ΙΌ

ώ

>

2

>

ιό

ό

2

2

>

>

ώ

>

>

>

>

70

Ο

0

Ο

0

0

-Η

-1

Π

“Π

Ο

Π

τι

Π

“Π

£ ω

ο ο Μ

0 00

ο ο ΓΌ

c σ> m ω <ο

0 Γ~ -1

Ο -< ω

Ο -< ο

ο Α 00

Ο Α <0 00

> 70 0

Ο ω ο σι

ο Α <D 00

ο Α

ο ω —X cn

τ

ϋ)

to

0)

0

0

0

<0

0 ζ

Μ

(0

ω

—X

>

οο

ο

ΟΟ

(Ο

I

Α

-~4

ο

-4

σ>

00

_x	_χ	ω	-Α	ΙΌ	ω	ω	C0	—X
Φ	—X	φ	-Α	-4	ο	-4	00	Α
ΟΟ	σι	ω	cn	ο	—κ	σ>	ο	ω
Ν	00	φ	00	ο	ω	ω	ο	Μ
	00	φ	00			ο	ο
	00		00
ϋ	>	1“	>	c	X	Ν	Ν	>
Μ	ο	-4	ο	σ>	σ>	-s|	00	ΤΙ
cn	ο	00	ο	σι	σ>	G>	σι	ο
ω	ο	00	ο	ω	—k		φ	Α
	bJ		Κ)	φ	^Α	Ο	00	ΟΟ
Ο)	Α>	σι	4^	Φ	Μ		Μ	-~4
	0)		Ο)					φ
	00		00					Α

<0	_χ	_Λ	Φ	σ	ΙΌ
	φ	Μ	—X	__Χ	Ο
(Ο	ο	Ο	φ	Ο)
σ>	φ	0)	0)		σ
>	Ν	>	>	>	>
-π	Α	-π	Π	Π	Π
Ο	Φ	Ο	ο	ο	ο
Α		ω	4^	4^	ω
<0		ο	Φ	^Α	—Α
00		σι	οο	Α	0
(Ο		κ>	φ	ω	—X
-4		ο	-4	0	00

ω γς	w π:	C'
φ c	2? m c	Ό
5 °- < w Φ 7Γ	ň 5 αχ < <Λ Ξ. « χ·	□ 0)'
□ <<	S ο θ' S- .«?	Ο
£· ° ω στ	ο. ω

<α Ο Ο. ω<α Ο

c	Ο	0)		c	Ο
ω □	“1 *3	I	Φ “Ο	ω 3
θ’	φ	(Q	ο		φ
σ	Φ	3 »< ο	ο’	σ
c 3	ω a	S W	c 3	ω a
	φ		φ		φ
	π.		ω		3.
	c				C
	3				3
	00		0		to
	00		0		to
	σι		<0		οο
	ΓΌ				w
	Α		ω		A

<e. o<s. o<a o
e. ° ω >< 3.3	&	Q	& 9 Q) -<
3	□ φ	1. φ
o σ-	o	σ	o σ
ε ο»	c	ω	C Q)
:□ o	3	o r*	3 q.
Q		Φ	o
□.		Z3.	□.
C		C	C
3		3	3
φ		_x	00
φ		o	00
Vj		o	0)
-4		b	-sj
U		o o	Φ

o

—i

—x

—k

—k

—k

o

O

M

O

O

o

P

P

cn

O)

Φ

*4

-4

4

bJ

Φ

—k

σ

σ

b

b

b

b

b

b

O

O

ô

b

b

b

b

b

ιό

φ

O)

Φ

-4

ro

0)

O)

-4

-4

«X

“*4

γ

Φ

φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

<0

Φ

Φ

Φ

Φ

φ

φ

Φ

00

O)

00

Ul

00

00

0

00

CD

-4

OO

φ

φ

5 ω	5 D)	3 ω	3 ω	3 m	3 0)	2 0)
ο	Ο	ο	ο	ο	ο	ο
Μ	Κ)	Ν>	Μ	κ>	Μ	Ν)
Μ	Μ	Μ	_1	^Χ	—λ
C0	Μ	Ο	<0	<0	<0	<0
-Ν	(0	00	οο	-J	σι	Α
ω	(D		Μ	σι	ω	to
	Α	ο	σι	σι	<0	0)
ω	οο	Μ	<0		ω	σ>
Ν)		σι	<0

0	Ο	0	Q	0	0	0
00 |	00 1	(0 I	00 I	00 |	00 |	00 I
1 (0	1 <0	1 (0	1 00	1 τι	1 00	1 00
>	>	>	>	70	>	>
		—Α	-Α	Α		«Α
g	c	s	š	ί-	>	C
(Λ	ο	-1	ω	ο	τι	ο
Q	ο ο	Ο	0	Ο ο	ο ο	ο ο
m	—Α	-<	<	0)	ο
ω	(0		-Α	Ν)	ο	-sl
ω		cn	σι	ω	σ>
--j		Α	4»	σ>	ω
ο

0	0	0	0	0	0	0
00 I	00 I	00 1	00 I	00 I	00 I	00 |
1 00	1 00	1 00	1 00	1 00	1 00	ω
>	>	>	>	>	>	Μ
—λ					οΑ	ω
	2	c	č	2	2	'0
-1	ι-	ο	ο	Γ	-1	ο
Ο <	Ο 00	ο ο	ο ο	Ο ϋθ	ο <	<0 σι
Μ	Μ	•sj	*4	Μ	Μ
σ>	σι			σι	σ>
^Χ	ω			ω	U
	ω			ω

0	0	0	0	0	0	0
00 I	00 I	00 1	00 I	00 1	00 I	00
1 00	1 00	I τι	1 00	1 00	1 00	1 •υ
>	>	>	>	>	>	>
—1	R)	-<	—X	Κ)		—1
ϋ>	>	m	0Ô	>	m	ΠΊ
	π	ο	Ä0 Γ-	ΤΙ	ο	Ο
Α	ο	οο	ο	Ο	Α
	α>	Ο)	>»	σι	ω
tol	ω	Α	ω 0	ο	c	ο
κ	-4 Ο	<0	σ>
σί	Α		>	σ>	<0 ω

ω

ω

_Α

4χ

-Α

-Α

Ν)

4χ

Α

Α

Ν)

co

0)

Μ

_χ

—Α

00

ω

00

ω

ω

Ο

Μ

00

Μ

*«4

ο

Κ)

Μ

Ο

*4

co

ο

σ>

00

C0

Α

co

σι

co

ο

(0

Μ

σι

_χ

ω

Μ

-α

—.k

Μ

ω

Κ)

Α

οο

00

Ο

00

00

_Α

ω

to

ro

cn

co

<η

Ν)

Α

cn

σι

Ι\)

C0

-4

σι

—Α

Φχ

ω

σι

(0

Ο

-Μ

Μ

cn

4

-4

cn

Μ

co

ω

ο

4χ

Γ“

C

Ν

>

>

>

C

Ν

>

C

C

>

Ν

Q

<

>

m

Ο

>

c

m

•vj

ο

<0

□

ο

0

Ο

(0

Γ

ο

ο

Ι-

(0

ο

—X

ΤΙ

ο

Ν)

Π

ο

00

ο

ΟΟ

ο

ο

ο

ο

•*4

ο

ο

ο

ο

«4

—k

«4

ο

00

cn

ο

Α

οο

ο

Ν)

ο

ο

ο

ο

σι

10

ο

ο

ω

cn

_α

00

σι

to

cn

Ο

ω

Ν)

Ο

ο

0)

ο

—Α

σι

cn

σι

tn

(0

Ν

σ>

4χ

ο

Ο

ο

Ο

<0

<0

ο

Μ

ο

«Ό

(0

ω

4

«sj

co

<0

cn

σι

tol

(0

σ>

ω

«4

ο

C0

0)

—Λ

Ο

ω

Ν)

0)

ω

ο

Ο

Α

σ>

*<	<
o	o
o	o
CT	σ
0)	fi)
o	o
Φ	<F
3.	3.
C	C
3	3
e	e
cr	cr
CD	CD
	Ί
o	0
c	c
o	0
(Λ.	cn
ω*	c/)'

	> n>	*</«*<
3-g (Λ	o TJ	o o CT	3 (D	o o cr
Λ &	a	m	□	Q)
	d	£	r+	o
< *2.	3	(D	CO	(D
Q Q		n.	cn	2.
□ 3	Ό	c	«Α	C
ο w	CD t	3	0)	3
D) O CT	□ X	<Ď*	N	e
O	(Q	u		σ
3	Φ	Q)		(D
o	□	O		o
N rv	O“3			c

CL·	T	CL	CL	CL·	ď
□J	CO -xj	OO	07	CD	00
M	TJ	N)	N)	hJ	N)
.x	cn		.A	cn
M	<	ω	M	M	CO
P	C'	ω	0)	P	CO
TJ

o o	ω	o 0	fi)	O o	fl)	O o	Q)	O o
CT	<n	CT	CD	CT	CD	CT	CD	CT
Q)		Q)		Q)		Q)		Q)
a		a		a		a		O
o		CD		φ		CD		CD
3.		3.		3.		3.		3.
C		C		C		C		C

c c o CT 3		F °
U 2. cd	2. (D	2. (D
2 o σ	2 θ’	O σ
=. C fi)	c ω	c fi)
i 3 a	3 a	3 a

CO

cn

CO

0)

CO

CO

0)

CO

CO

CO

—A

C0

(0

CO

CO

(D

CD

N

cn

oo

0)

cn

CO

cn

CD

o

o

CO

00

-si

(0

A

00

cn

’-k

0)

cn

“(O

cn

O

o

o

00

N)

cn

CO

Φχ

M

«sj

ω

*xj

^4

—i

CO

*4

o

o

o

0)

K)

CO

•*4

cn

-ŕx

O

*0

00

N)

cn

o

o

cn

o

-*4

o

o

_k

o

o

M

N)

o

_k

w

O

O

ro

_x

NJ

o

o

N)

o

o

_x

KJ

σι

«sj

CO

P

M

—i

M

'sj

-X

*s|

«vi

OO

cn

00

(D

0)

tn

-si

(D

b

b

b

A

_X

b

b

b

b

b

b

b

b

O

b

b

O

b

b

’o

O

cn

CO

0>

K>

N)

0)

CO

0)

00

CO

CO

00

cn

N)

00

m

CO

N)

—x

4x

CD

C0

(D

CD

*C0

CO

*C0

CD

(0

*C0

(0

(0

c©

CO

*C0

’co

CO

CO

CO

CD

CD

(0

cn

JXk

00

0)

00

CO

φχ

00

CO

-Dx

Px

CO

00

cn

oo

C0

'sl

CD

C0

0)

-4

3 Q)	£ m	3 D)	5 0	3 ω	3 0
O	o	O	o	o	o
ro	bj	M	ro	ro	ro
ro	m	bJ	ro	ro	ro
A	Φ-	4»	w	ω	ω
-sl	cn	O	Φ	->1	cn
-s|			-A	G)	*o
σ	—X	ω	ω	CO	to
G)	O	h·	00	ω
	-sj	φ.	(0

0	m 0 0	0	m	0
OJ	S ro ro	ro	g	ro
T)	ro ro ro	Ό	ro	'ro
>	> > >	>	>
-1	-* -1 -1	-H		Fo
OJ	> ω ω	m	>
ro	ro m m	O	ro	“Π
-s|	O sj s|	*s|	o
A	O A A		o
ro	ωω m	cn	ω	*s|
	G)		G)	ro
	<0		<0
	O>		OJ	A
cn	cn io cn	cn	cn	IO
cn	m cn cn	ui	ui	ω
oo	00 00 00	00	00	O
(0	(0 (0 <0	<0	(0	w
Ô5	> ω ω	m	>	>
ro	ro m bj	o	ro	H
-j	O -s| **J	*sj	o
A	O Φ Φ	CO	o
ro	oj oj ro	cn	ω	-s]
	ro	**4	ro	bJ
	CO		Φ	N
	ω		ω	A

0	m	0	0	0	0
ro I	S	ro i	ro 1	ro I	ro I
1 u	1 D	1 I	1 I	1 ro	m
>	>	-1	-1	>	ω
-1	-1	o	0	—1	-H
>	m	ω	ω	š	IO ro
ω	o	>	ί-	-1
s| oo ω _A	(0 00 Ul ui	O o o	ο o o	o K bJ	> C O
		s|	sl	ro φ
		ΦUl	Φ Ul	-sj G)
			OJ
cn				ω	cn
OJ	bj	CO	(0	(O	00
co	ω	w	ω	_A	G)
IO	<0	oo	00	cn
		ro	ro	o
		m	bj
>	m	>	>	N	>
ω	o	O	O	00	C
-si 00	<0 oo	o	o	o .A	O
ω	Ul	o	o	o	•M
	Ul	sl	sj	00	-4
		Φ-	φ.		G)
		Ul	Ul		ω

0	0	0	0	0	0	0
ro I	ro |	ro I	ro I	ro I	ro t	CD 1
1 ro	1 ro	1 I	1 I	ro	ro	00
>	>	-1	-1	>	>	>
K)	—A	0	0	—*	m	—k
>	S	ω	ω	š	c	2
ti	H	>	ί-	ω	o	H
o	O	O	ο	c	o	O
•O		o	o	<o		-<
OJ	bJ	o	o	—Á	ro	ro
IO	^A	<0	<0	cn		00
A	OD	ω	c*>	-s|
	A	2	ro φ	to		ro
cn	OJ			(O	A	ro
ro	CO	<0	(O	G)	OJ	O
IO		N)	b>	O	Φ	A
00	čn	•M	sl		OJ	OJ
	o	CO	<0			-A
			»A
>	N	>	>	C	c	N
TI	00	O	o	(0	o	00
o	o	o	o	—X	—k
*s|	—4	o	o	σι	o	O
-sj	o	(0	co	S|	sl	—'k
ω	00	ω	ω	bj	bJ
IO		G)	G)
A		A	A

UJ UJ

Z	a ozz®o	0) O
ro	3	O ro ro	3 o	3	o
	3	<9 9	3 í	3	t -<
Q),	o	□ Q). Q).	o 2	o	o
3	2.	g-3 3	□ S-	3.	ro cr
*<	0)	(D ·< -<	o> D)	0)	Q)
	(Q	q '	*2 2. ro J? □ 2	(Q ro □	o
	(n □	α	ro
	n	3.	ro 2*	ro	□.
	ω	C	ω C	ω	c
		3	3		3
cn		cn ui ro	cn		cn
->j		si si bj	ro		ro
<0		“(0 ’(O CO	b		b
OJ		ω ω o	o		o
-sl		sj sl co	φ		Φ

G)

G)

φ

OJ

OJ

cn

03

A

Ul

OJ

OJ

G)

G)

-*4

cn

ω

φ

G)

0)

G)

00

—k

Ul

-sl

-4

O

jsl

b

cn

cn

-sj

“ro

G)

La

oo

Φ

Φ

00

La

“-s|

o

G)

—4

—4

00

00

Φ-

Φ

Φ

-sj

O

ro

o

oo

čn

to

IO

ro

G)

cn

Φ-

A

A

O

—1

OJ

o < o

O o

o

bJ < o

OJ

o.S o

ro

ro

ro

-k

o

ro

o

o

ro

ro

-*·

tns 70

OJ G)

G)

co'S. ro ω

cn S. ro sj

OJ

p

cn

G)

—k

—*

IO

ro

00

o < —

L* b

b

Ó S — L·.

b

o S — —x

b

b

b

Lx

La

b

b

b

b

b

bj ° /n

o ro

ro

<o ° · o

P

ω 5 ’ o

φ

φ

G)

o

—χ

G)

φ

φ

OJ

ro

cn

<D 2 S

b b

b

io 2 co

φ

<D !· m(O

ω

φ

’φ

Φ

Φ

b

ω

φ

b

b

b

-tí □ 0>-

-4 -si

-sj

-J g.

ω

sj □ - sl D).

co

φ

oo

oo

00

00

ω

ω

-sl

OJ

00

5 Q)	3 0)	3 0)	£ 0)	5 01	5 α	3 íl	5 Q)
O	o	o	o	o	o	O	O
ru	M	M	M	M	M	N)	ru
IU	ro	M	M	M	M	M	ru
CD	00	xl	cn	01	Ul	A	A
CO	-1	M	ω	M	O	(0	00
cn		—i	A		σι	σι	—1
co	Ul	gj	oo	ro	A	o	co
	A	0)	oo	O)	GJ	o	00
	ui	co		u>			co

ο CD

I

Ο o ω

M ίο

A·

m	0	0	0	0	0
g	DO t	co I	CO I	CO I	CD I
1 0	1 CD	1 CO	'<	1 CO	1 CO
>	>	>		>	>
H		—x	z	—x	—x
m	Ó	ó	m	O	Ó
o	0	o	z o	0	0
co	r	Ι-	>	Ι-
co	o	ο	S	Τ’	ο
•u co	o ~4	o xl	<	x -1	o xl
	-4	X|	C J	0	xl
	co	GJ	0	m τ	GJ
	IU	W	M

m g I 1	0 CO I	Q Q 0 OO 00 00 1 1 1	0 UJ	0 00 I
1 l 00	1 TJ	1 1 l U U T	1 TJ	1 TJ
>	>	> > >	>	>
	H	H H -H	H	H
>	ČO	HJ GJ G>	m	m
00	ru	O M M	o	o
o	-4	xl xl xl	4	*4
o	A	(O A- A	CO	CD
CO	IU	Ul GJ M	cn	cn
σ>	xl	*4

<o gj m 0 ro i i

CD TJ > >.

> CD O O ω gj w χ; A N gj

cn

v

CO

cn

_1

_x

_A

A

A

ru

ru

A

CD

CD

CD

IU

σι

cn

cn

CD

CD

A

o

O)

cn

A

σι

σι

A

A

ru

o

A

CD

CD

CD

CD

σι

cn

CD

CD

cn

o

ru

CO

0)

CD

CD

cn

CD

CD

IU

CD

OO

00

Oo

00

00

00

00

00

oo

co

o

—A

o

O

CO

00

O

CD

CD

CD

CD

CD

CD

CD

(D

(D

co

-4

σι

cn

o

A

>

>

>

>

>

O

m

>

>

X

X

>

>

ČÔ

m

Čô

Čô

m

m

>

ČÔ

“Π

o

^A

o

O

CO

o

c_

G.

—k

CO

(_

OJ

IU

o

IU

tu

o

o

0)

IU

o

IU

o

00

co

o

O

*4

CO

O

o

-4

-4

-4

’sl

-4

•u

O

-4

—X

Q

00

o

σι

co

o

o

A

cn

o

o

A

<0

A

A

CD

CD

o

A

CD

-xj

0)

O)

o

-4

*4

-*4

O

—k

-4

CO

ru

cn

CO

IU

(D

CD

CO

ru

00 A

o (0

M GJ

o _A O

cn CO cn

cn

CO

*4 CO ru

*4 CO ru

CO

CO

*4 CO IU

CD (0 CO

*4

*4

~xj

CD (0 CO

Z o 3 o

Z	ro	00
0	0)	Q)
3	o.	O.
o	č	C
OT	cn	cn
Q)	cn	cn
ό	•p	•p
□
<n

<9. O <9. O ?
£ R	& q 2
H	H ®
9. a>	=. φ ω
2 σ	2 σ £
C 0)	C D) p
3 2.	3 2. ω
<t> Σ3.	™ m
C	ď
3	3

Z <9. O <9. O

C	&	o	& q
3	o>	*<	a>
m □	3	□ Φ	3	□ (D
	o	σ	o	σ
	c	&)	c	ω
	3	o	3	o 1-¼
		CD		Φ
		3.		2.
		C		C
		3		3

D) o □ m (Ώ <t>

□

O O “1 *<

□ Φ σ

Z Φ

Q)' ω *< o (D

	CO	CO	CO	GJ <0	CO	CO	_x
o	(0	-u	CD	JJ) 0>	CD	*4	o
o	b	b	La	k> xl	CD	cn	o
b	00		CD	0) 00	ru	IU	b
o	00	-4	-4	A- -x	oo	CD	o
o							o

CO	_k	_X	cn cn	CD CD CD	CD	CD	cn cn
oo	o	o	CD CD	CD A A	A	—A	—A —A
D)	o	o	CO CO	CO CO CO	CO	OO	OO 00
cn	o	o		-»· A A	A	A	A A
	o	o	00 oo	OO CD CD	CD	CO	CO CO

o o

o

v

o

_1

N> O <

o

O

O

_X

tu

o

< -= o o

IU o o

IU

ru o

CD b

CD

*4 O

9 ľ-J'S O O x

^J 00

b

•u b

o b

CD b

*4 b

x 70 g> cn s 2- —x b

CD CD CD bob

CD O

σι

co

O

CO

M 00 O

cn P

—x

IU

cn

—k

q u, 9 N

CD IU IU

CD

CD

ČD

ČD

ČD

<0 <0 2

íu <0

ČD

b

b

b

b

2 K> <0 <0

b b b

b

CD

CD

00

CD

00 st

- **4

CD

CD

co

cn

CD

g. -

*4 *4 -U

-*4

ΙΌ < O O (oS. XJ ω cn ô S — ίχ ó φ q · q n <o 2 ro ω ω

-J g.-

Q)	Q)	ω	fi)
O	O	o	O
ΙΌ	ΙΌ	ΙΌ	ΓΌ
ω	ω	co	ω
A
CD	CD	00	cn
-A	^A	A	—X
ω	O	O	-sl
N)	00	ΙΌ	cn
o	o		ΓΌ

CO ω

0

o

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

to

oo

OD

00

00 1

00 I

00 |

00 I

00 i

00 I

00 I

00 1

00 1

00 I

οο

00 I

1 00

1 00

1 m

1 00

1 OT

1 ζ

1 Ζ

1 Ζ

1 00

1 00

1 00

οο

1 ζ

ζ

'<

0

>

>

ω

>

>

-1

Η

-I

>

>

>

>

-1

-1

to

A

Ή

_Α

0

0

0

—k

—Α

KJ

0

0

to

g

bo

ΙΌ co LL

g

S

ω

ω

ω

s

g

ŠŽ

jó

Α

Α

ζ σι 00

φ

-1

>

—j

to

>

ί-

ί-

Μ

“Í

Μ

70

>

ί-

ίΟ

o

TJ

-s

0

Ο

ο

ο

0

-s ro σι σ

0

C

Ο

ο

Η

< ~4

c 70 Z

•-J ΓΌ

Μ σι Ο

K Μ Μ

ο Α Α

ο ω

Ο ω

-< κ> Μ

< Ν) Μ fv

ω σι σι _k

ο ο σ> ο

ο ο ω Ο

77 Ζ

σ> α. ω

m

—X

Q

^Α

Α

Α

ο

ο

ω

C0

_Α

co

ΓΌ

οο

00

—-

—χ

ο

Α	ΙΌ	Α	Α	A	00		—X	Α	Α	Α
ΙΌ	cn	-sl	Ο	Ο	C0			Ο	Ο	Ο
-sl	00	σ>	00	Ο	ΓΌ		^Α	Ο	00	Ο
ΙΌ	ΓΌ		ω	σι	ω	ο	Ο	σι	ω	σι
(0			00	-Α	Α	00	00	^Α	00	_k
						ω	ω
Ν	X	>	Ν	>	>	>	>	>	Ν	>
C0	C0	_Α	C0	Ο	Ο	Ο	Ο	□	8	ο
ΙΌ	—Λ	—Α	cn	ο	ο	ο	ο	ο	ο
-sl			cn	ο				ο	cn	ο
—4	00	ΓΌ	cn	ο				ο	cn	ο
	(0		00	ο	Α	ω	ω	ο	οο	ο
		co		ο	-Α	Α	Α	ο		ο
				Α	ΙΌ	οο	00	Α		Α

—Α	A	_X	A	cn
Ο)	-4	-4	cn	o
ΓΌ	cn	CD	cn	-4
cn	oo	00	-sj
C0	-s|	-sl
	00	OO
c	>	>	X	>
cn	O	O	CD	O
cn	o	o	co
cn	o	o	A	(D
-A	CD	O)	CD	A
O	O	o	00	G)
	CD	CD		-A
				O

CO	CD	CO	CO
CO	—k	cn	-sl
CD	k|	b	*s|
ΓΌ	CO	00	CD
A		A	ΙΌ

CO	A	A	ω	CO	G)	A	G)
00	CO	CD	-4	CD	CD	O
-A	G>	A	00	A	A	K)	K>
cn	CD		ΓΌ	cn	cn	00	-sl
o	O	00	OO	A	A	00	00

LA

o

O

o

o

o

o

_x

o

O

ΓΌ

ΙΌ

o

-*

O

A

ΙΌ

-sl

co

CD

P

CD

CO

—4

CO

<0

^4

4

CO

Q)

o

Q

b

b

La

v

_x

La

La

b

La

b

A

A

b

_A

ΓΌ

CD

CD

ΓΌ

o

O

O

ΙΌ

CD

ΙΌ

A

O

O

CD

O

čo

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

b

CD

-4

00

oo

CD

CO

co

CD

CD

00

CD

-o

CD

co

CD

oo

	0)
o	CD	A
CD	co
00		<0

0)	0)	0)	0)
o	O	o	o
ΓΌ	ΙΌ	ΙΌ	M
ω	ω	CO	CO
00	•4	•4	CD
o	σι	CO	O
4			0)
•4	ω	O	-A
4	σι	ω	00
	o	00

G) O Q	Q	0	0	0	o	0	0
UJ CD DD 1 1 1	OT 1	0) |	00 |	00 t	00 I	00 I	00 I
1 1 1 ΟΌΌ	1 0)	1 00	1 00	1 00	1	1 I	00
ω > >	>	>	>	>	-1	-1	>
co .4 .T<	—i	M	—i	—i	0	0	—1
σι ~1 oo (f ω σ>	ó	Ó	s	ó	4i	Φ-	g
0	0	H	0	ί-	ί-	—1
> CD -i	>	C	O	Ί3	ο	ο	o
O CD (D o	O m	ω M	-< -ti M	73 O	o o	o _A O	< M to
0)		ω	OO	>	CD	CD	ω
00		o	Q	CD	σι
A ΓΌ				m	CO	co

0	0	0 0 0 0	0	0	0	0
00	00	00 00 OO 00	00	00	00	CD
I	Z	00 TJ TJ TI	TJ	τ	'οο	'οο
H	-1	> > > >	Γ	1“	>	>
0	0	M-m	-χ			_k
ω	ω	O δ δ ΓΠ	ο ο	ώ	οό	g
>	>	0 O CD o	Ο	>	-1
o o o	o o o	r- 0° O O H ω ω ω “ CD ο	X < ο	C0 Ο	TJ c 73	ο -< -4
CD CD A	CD CD A	ΙΌ ω ο	73 Π	00 X	X m	—Α
O)	0)		0)	<

ΙΌ

ΙΌ

ΙΌ

ω

ΓΌ

_χ

_ι

_Α

Α

_k

-Α

GJ -x -k

—X

σι

_k

«X

Α

ο

0)

•4

ΙΌ

ΙΌ

ω

0)

Ο

00

00

οο

ο

ΓΌ

ω

co

ΙΌ

ο

CD

00

Ο

Ο

ΓΌ

CD

CD

Ο

σι

σι

σι

C0

CD

σι

σι

*4

σι

ω

4

•4

ω

Ο

Ο

σι

ω

C0

C0

οο

σι

Α

σι

cn

ο

*4

*4

Α

ΙΌ

Α

Α

ΓΌ

ΓΌ

00

ΙΌA

CHΙΌ

004

ΓΌk) (D σι o en oo

OO

0) (0

A ΓΌ

X

c

Ν

X

>

>

Ν

>

>

c

ο

ο

m

X

X

-sl

ω

00

00

ο

ο

00

Ο

ο

ω

ο

0)

ο

(0

Φ

to

ΓΌ

ο

ο

ο

ο

00

Ο

ο

Ο

Α

CD

Μ

Α

CD

-Α

C0

ο

ο

ΙΌ

C0

C0

ω

σι

14

ο

ω

σι

ΓΌ

ο

ο

0)

CD

<ο

ω

0)

Ο

—x

C0

φ-

ο

—1

C0

CD

0)

00

(0

<ο

ο

00

cn

σι

σι

Α

Φ-

οο

00

0)

αί

X <0 oo (D

N CD

ΓΌ -4 4

	3	3		3
CJ -i	_K	CD	CO	CD	CO	CO	CO
<0 o o	o	00	00	00	σι	σι	OO
NP °	o	cn	o	00	00	CO	O
-i o o	o	ΙΌ	cn	o		—X	00
CD O O	o	CD	A	ΙΌ	•4	*4	00
o o	o

m ·	m
X	x
<	<
m	m
z	z
Ο	O
<	<
>	>
z	z
m	m
z	z
o	o
3	3
o	o
</>	ω
m	m
g	TO
o'	o’
□	□
(Λ	(Λ
ω	ω
O)	CD
σι	CD

-x M

o

o

_.x

ΙΌ

_X

_x

—k

O

O

O ΓΌ O ΓΌ

O

—x

—k

—k

O

cn

O

(0

ΙΌ

*4

CO

0)

0)

•4

00

00

ΙΌ

—k

N

CD

CD

A

O

b

o

b

b

b

b

b

Lx

Lx

O

b

b

b

b

—A

O

Lk

O

O

b

σ)

CD

0>

CD

00

0)

O

O

0)

CO

CD

00

cn

hJ

CD

—x

*4

—k

ιό

b

Φ

CD

Φ

CD

čo

čo

CD

CD

(D

(D

(D

čo

čo

ČO

ČO

(0

CD

CD

čo

co

cn

oo

A

0)

00

4

CD

CD

00

CD

CD

0)

co

4i

-J

σι

*4

4

CD

UJ O

3 0)	3 0)	3 D)	3 ID
o	o	O	O
A)	A)	A)	A)
A	A	A	A
<0	(0	0)	U1
<0	--J	Φ	oo
<0			-A
ω	O	cn	A
ω	U1	U1	-A
	o	A	ω

Q

o

Q

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

U3 I

00 1

00 I

00 I

00 I

00 I

00 I

00 I

00 1

00 i

00 1

00 I

00 I

00 I

00 |

00 I

00 |

00 1

1 Ό

'<

1 00

1 00

1 I

1 00

1 00

1 00

1 00

00

1 00

1 oo

1 00

0

m

(D

1

m

Ϊ0

>

>

-1

>

>

>

>

>

>

>

>

ω

ω

>

í“

ω

ω

i

0

—-

AJ

—A

—-

AJ

—-

—-

—-

co

—1

NJ

—k

—1

>

m

‘č

g

A>

z

Ó

ώ

g

Ô

ώ

g

g

GJ -sj

>

> 00

O

n

o

Ή

>

0

0

o

-1

0

o

Ι-

—1

CD

GL

Π

-H

o o

k J a

o o

O <

O o

-J

c ω

m -j

o -<

C ω

>

Ο 00

o ·<

> O

l

Α-

o o 0)

O cn 00

cn

oo

AJ

O

I—

^A

AJ

^A

ω

o

o

Ν)

0)

o

CO

O

•M

AJ

o

A)

CJ

N

Ul

cn

—A

G)

CD

A

N) 00

0 Φ

Φ 00 A

5»

AJ cn

0 Φ

AJ A

G) o _k

00 00

φ

o o NJ

GJ O 0)

GJ

CO

G)

A

G)

—x

-A

-A

A

G)

A

A

GJ

G)

CD

CD

NJ

-4

NJ

CO

00

0)

—4

NJ

0)

CO

0)

A

NJ

CD

NJ

CO

NJ

CO

NJ

NJ

CO

NJ

O

NJ

(D

M

O

-4

NJ

NJ

N)

A

0)

00

_A

_A

00

00

—A

CD

>

X

C

N

>

X

C

>

N

C

>

>

N

o

Q

o

^A

G)

Ι-

-4

G)

c_

Ι-

OO

θ

A

o

-4

o

GJ

A

ο

-4

O

ο

G)

Q

o

—A

o

CO

NJ

A

-A

NJ

o

00

cn GJ

*

0)

»sj

0)

NJ

Φ

0)

NJ

O

00

CD

AJ

oo

NJ

CO

CD

CD

00 _k

NJ

A

0) o

0)

(0

G>

A

co

G)

cn

CO

A

CD

G>

ω

GJ

-A

GJ

GJ

GJ

GJ

—4

CO

co

0)

00

CO

<0

φ

co

O

CD

-4

A

NJ

Vi

(D

A

A

00

G)

0)

N)

o

CD

to

O

A

A

NJ

A

CD

A

GJ

CO

->l

b

N)

0)

(D

CO

O

CO

CD

CO

GJ

A

cn

o o

0>

CD

o

G)

o

_k

-A

o

A

NJ

A

M

_A

o

NJ

G)

NJ

p

NJ

O

—4

NJ

-4

-4

M

O

p

O

b

b

b

Q

’o

O

O

O

O

b

b

b

—k

O

oo

co

00

CD

0)

00

CO

00

0)

cn

co

NJ

—1

0)

(D

čo

CD

CO

CO

to

ČO

ČO

čo

φ

’co

to

CD

to

CO

GJ

0)

CO

oo

0)

00

CO

00

φ

co

CD

CD

GJ

GJ -J

0)	0)	0)	0)	m
ο	ο	ο	ο	ο
k)	Μ	k)	k)	k)
cn	cn	cn	cn	cn
CO	ω	_α	—α	ο
0)	k)	xj	φ	α
00	_Α	cn		σι
xj		xj	ω	00
ω	xj	Ο	οο
	Ο		σ)

0	ο	Q	0	0	0	0	Q	0
οο	□0 |	OJ	0) I	CD |	OJ I	CD I	CD I	OJ I
1 OT	1 00	1 Ό	1 z	1 z	m	m	1 o	00
>	>	r~	-1	-1	ω	ω	<	>
		—1	o	0	H	—1		—1
S	s	>	M	N)	k) O	CO O	J* TI	ώ
ω Q OJ <0	X ο < Μ —1 Φ	—I Η k) c_ cn	> •n ω o OO	> Ti G) O oo	£ 00 k) k)	> 0) A cn o	CO -4 N <0	o o M M
xj		01	01	cn	cn
ο			01	01	(D	N
Ο				cn

(/)

0	o	0	0	0	0	0	0	0	0
(D	UO I	UO I	oo I	CD |	00 I	00 1	00 I	00 i	00 I
1 (D	1 Π)	1 00	1 00	1 03	1 u	1 TJ	1 00	1 “0	1 TJ
>	>	>	>	>	TO	TO	>	TJ	TO
—1	—1	—A	—1		Cl	ω	—*	CO	ω
Č	S	s	č	2	>	>	g	>	>
O	Ι-	—f	o	Γ	o	o	-1	O	O
o	Ο	<	o	O	o	o	o	O	o
o	1“ cn	o o	o ω	Γ cn	o Ul	o m	< M	O cn	o Ul
co	co	—J	CO	Ul	ω	Q	CO	Ul
	σ)			0)	A	M	Q	k)	A
			ui	oo	00	ui
							<o

CO	(D	oo	_X	_x	A	CO	oo	k)
(0		A		-A	k)	O	CO	M
CO	cn	E	00	00	CO			-A
(0	o	<0	oo	00
CD		(D	•xj	xj				Ul
			A	A
1“	N	>	>	>	>	>	>	>
xj	(0	Γ*	TI	Π	!>	0)	Π	Ι-
00	xj	O	_x	_k	oo	f·».		ο
00	(0	G)	CO	CO	k)	cn	CO	(0
—'k	<0	cn	O	O	k)	Q	•xj	0)
cn	—A	cn	00	00	cn	Ul	k)	00
		k>	0)	0)	<0		-A	G)
		w	0)	0)	cn		(0	(0

G)	CO	G)	CO	CO	A	CO	CO	CO	A
Ul	0)	k)	cn	0)	(0	cn	-X|	Ul	CO
00	k)	00	00	k)	cn	A	k)	A	cn
00	k)	O	00	k)	-A	—A		-A	—A
-A	A	0)		A	A	A	00	A	A
c	N	>	C	N	>	>	N	>	>
o	(D	ľ“	o	(D	o	o	*xl	o	o
o	(0	O	o	(0	o	o	•xj	o	o
o CO	k) Ul	k)	o CO	k) Ul	o Ul Ul	o cn CO	0) k)	o cn CO	o cn Ul
		oo			A	k>		k)	A
		A			Ul	00		00	cn

s	3
D)	*<'	m
2‘	(Q	0>
_J 0' 3* O	Φ	0)
□ O' 3	CO A
u		C'
-r		“O □
n>

CO

CO

CO

A

A

A

A

CO

CO

CO

CO

0)

CO

CO

A

A

cn

CO

CO

(0

*xj

Ul

O

O

ro

0)

*xj

-xl

xj

—X

xj

•Xj

—4

—x

A

A

(D

o

“-xj

o

•xl

xj

CO

00

oo

O

o

o

CO

'xj

“xj

k)

kJ

‘co

(0

ω

k)

xj

0)

Ul

Ul

Ul

0)

cn

-xj

-A

—A

CO

ro

k)

CD

0)

A

A

k)

A

CO

CO

A

A

CO

o

ω

_A

00

00

cn

CO

CO

Ul

Ul

O

—1

k)

y

kJ

ro

k)

_x

k)

O

_x

O

O

o

O

o

k)

_x

k)

o

cn

xj

A

-A

xj

(0

•xj

k)

—*

A

-xj

A

CO

00

00

CO

ô

b

b

O

b

O

O

b

b

O

'_k

b

b

La

’o

b

b

b

b

CD

CD

k)

CO

CO

k)

A

CD

Xj

CO

kJ

0)

co

k)

io

xj

0)

xj

(D

(D

(0

(0

(D

CD

(D

(D

(D

(D

čo

(D

co

(D

(0

b

(D

Φ

(0

(0

0)

oo

(D

<0

(D

OO

(D

(0

CD

A

00

00

A

00

00

00

00

00

00

3		s		5			£
m		m		0)			ai
o		o		o			o
NJ		M		M			M
0)		cn		cn			cn
A		A		N)			M
0)		cn		CD			ω
				M			-J
ω		<0		O
(D		σι		cn			A
NJ		ω
Q	o	0 0	0	0	0	0	0

_k		_k		—k	A	A	cn	-A
(0	<0	<0	<0	<0	0)	cn	A	(0
NJ	NJ	NJ	NJ	NJ	NJ	M	A	00
cn	σι	σι	σι	cn				σι

>	Γ	ί-	>	>
A	ο	ο	Α	Α
σι	-Λ		σι	σι
σι	cn	σι	cn	cn
00	ο	ο	00	-4
σι	00	00		-4

ο	Ο Q	Ο £	Ο	ο
CO σ	3	3	(0 σι	<0 σ
—Α <0	=r	=r	co	<ο
Α Α	Φ Ο	(D Ο	t	Α Α
NJ			NJ	Μ

“I Q) X 3.1	Sfi) 3	3 Φ	-r fi) < 3.1	fi) 3	—n Έ Φ	» x 3.1	O Έ. m. o Ξ. «< -> “ >< -1 Q 0) g- O 0>
o σ-	o	cr	O	cr	o	cr	O	tr	n>: q< ľ. 5; q<
ε Q)	c	Q)	c	Q)	c	fi)	c	Q)	□ 3, 5· 3.

cn		o
00		ro
ω		<n
0	0 0	0	Q
CD I	ro ro I 1	ro I	CD I
1 ro	1 1 ro τ	1 ro	1 ro
>	> >	>	>
w	-» -I		M
> m	2ŕG	2	ώ
H 00	-j	o
o	C ro	<	M
o	M «	o	□ľ
	-kj	o	A
-4 00 O	ω m	A

A	A	—k	cn	cn	0)	N)
(O	<0	^A	^A		Φ	cn
M	M	(0	O	o	OJ	(D
σ	cn	(0	o	o	cn	•sj
A	A	~sj			o	o
>	>	>	c	Ňj	>	>
ti	m	m	NJ	00	Ι-	Ι-
o	o	o	•sj	0)	ο	ο
cn	cn	o	G)	00	o	OJ
A	A		cn	A	(D	—A
σ	σ	-4	-sl		—k	cn
cn	cn	oo			(0	—x
A	A	o			00	A

Π	“Π
c	C
CQ	(Q
C	C “5
C σ	C cr
2.	□.
σ	σ
Φ	o
ω	ω

o>

OJ

OJ

OJ

ω

OJ

OJ

OJ

OJ

ŕ

OJ OJ

A

OJ

(0

(0

-4

*4

co

cn

00

0)

(D

CO CO

-4

-4

«a

“_A

b

b

'L.

-4

00

Ύ

”*4

CO

“_A k

OJ

’CO

OJ

OJ

A

_A

o

o

OJ

—k

OJ OJ

σι

O

o

o

OJ

OJ

cn

A

-A

OJ

NJ

A

00 00

00

0)

O

NJ

NJ

O

0

NJ

NJ

NJ

_k

NJ

—k

—k

0

NJ O

_k

_k

-sj

0)

0)

-4

-4

00

00

-4

CD

0)

-4

*4

NJ

0) 0)

00

(D

b

’o

b

b

b

b

b

b

La

b

b

b

b

b ô

b

La

OJ

A

A

0)

OJ

A

A

00

—k

00

00

0o

0)

C0 NJ

0)

O

<0

(D

ČO

co

čo

ČO

ČO

čo

CD

co

b

čo

CO

čo čo

čo

CD

-s|

OJ

OJ

-4

—4

OJ

OJ

co

(0

<0

CD

<0

<0

cn -4

00

CD

5	s 3	J
0)	Q) (B	o>
o	O O	o
M	M M	N>
-J	cn cn	0)
-A	co cn	-f>-
	-4 ω	00

>.	o	o	ω
0)	o	cn	w
—k	cn	oo	cn

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

OJ I

CD I

CD I

CO i

CD I

CD I

co I

uo 1

00 t

00

CD I

00

00 I

00 i

1 z

1 z

1 CD

1 z

1 z

1 τι

1 T)

1 T)

1 TJ

1 13

1 CD

1 0

1 m

1 o

—<

-1

>

-1

-1

TJ

7)

1“

>

>

>

0

0

<

0

0

0

0

ω

K>

—k

H

—I

U

0

H

cn

cn

g

M

w

ί-

Z

z

m

m

ó

00

ô

>

>

-H

>

Ϊ-

ο

ω

<

o

o

o

>

··

—4

O o

O o

O <

o o

Ο o

o o

ω

o z

cn

A a 00

7) g

O o

O Z

•Xl

O 00

o 00

A -si

o z

A Í

o

0

Z

o 0

0

O

O)

cn

M

M

cn

cn

m

(D

0

•sl

-j

M

M

A

>

CH

A

00

00

ω

ω

O

0 A

CD

I

T>

> -I > -t*, cn cn co ω

_X

A

_k

_A

0

M

0

CD

CD

A

0

k)

_k

-sl

•si

k)

0

0

CD

CD

CO

A

A

O

0

A

O

CD

—A

sj

o

o

^A

•sj

-sl

0

0

0

O

0

A

k)

CD

CO

k)

k)

k)

0

_k

A

0

CD

0

0

0

(0

—k

0

0

0

-*4

•sj

nj

k)

>

>

N

>

>

>

N

<

m

m

g

>

>>

2

>

o

o

(D

O

O

o

0

o

o

D

S>

0

A

o

o

M

o

o

o

(D

A

0

A

0

o

k)

0

0

sj

o

o

o

sj

0

—*

A

-sl

o

0

0

•sj

0

0

A

O

sj

__k

0

-4

0

0

_x

0

cn

ω

k)

k)

sj

0

0

o

0

A

CD

A

-A

0

-4

-sl

k)

M

0

0

0

00

0

0

CP

A

O

A

ω ť ω m m 5 o> 5 m q m
z	> z
o	o
<	<
>	>
z	z
m	m
<	<
O	O

Z<Q o<e. O®. O

Z	2?	ô“ O
o 3	” o	“ & § r o> 'S
o	3 5Γ	Ξ 3.1 CO O (T C Q) 3 a
co Q) TJ Φ	c ? ε.
□	c	0>
(0	<n	3. t—

0	0	0	0	0	0	0	0	(O	CD	CD
0	0	•sj	k)	k)	0	0	0	0	0	CD
00	CP	00	“M	Vi	o	o	0	0	0	Vj
o	0	0	0	0	0	0	CD	M	k)
•sj	—A	0	-sl	*s|	CD	CO	0	0	0	0

0	0	0	CO
0	0	0	CO
O	0	A	o
-sj	0	O	0
A	0	k)	0

o o

-A

o

o

k)

k>

M

k)

k)

w

k)

k)

k)

o

cn

0

O

k)

N

0

k)

cn

(D

CO

cn

Sj

O

A

•sj

—k

L_k

b

b

Ó

b

L-k

b

b

b

o

b

b

b

b

—k

-a

k)

0

00

0

—x

ω

CD

(D

A

0

0

0

0

ČD

CD

CD

čo

CO

čo

ČO

ČO

čo

čo

ČO

čo

CD

ČO

CD

CO

CD

CO

co

CD

0

CO

CD

-sj

ω

0

•M

0

-«4

ω			_x			—k			0)
cn			bJ						•sl
			0			cn			OO
			0			CD
0	O	0	0	0	G)	0	0	0	0
00 I	OJ 1	CD I	CD 1	CD |	ro	ro I	ro I	ro	OD 1
1 tu	1 T	1 u	l OJ	1 ro	1 ro	1 ro	m	1 <	1 ro
>	70	70	>	>	>	>	ω	r*	>
	A	A-	—χ	—X	—X	M	—i	o	w
s	>	>	S	C	g	>	ω 0 *»1	m	>
-1	O	O	-1	O	-1	n	i- _j	n
O -< 0 <0	o o ot 0 0	o o 0 0 0 —X	o -< 0 u>	o o	O s bJ m —j	o ω to 0 0	< ω ω 0	(0 07 A	o ω co 0 0

0 ω	CO	_k	-A	CO	A	CO	A	ω	CO	A	IM
O 0	CO	Sj	Sj	ω	O	CD	O	0	Sj	O	CO
l*> <O	oo	K)	IM	oo	A	(0	Sj	o	—k	Sj	—k
-J A.	_k	(0	(0	—k	bJ	A	sl		IM	•Sj	00
	00	<0	ω	00	(D	0)			—k		CO
		-1	—1
N g	N	>	>	N	C	N	>	>	C	>	>
w	oo	o	o	00	O	Sj	m	<	oo	m	ΊΊ
0	CO	o	o	CO	o	•s|	o		o	o	o
ω Zx	oo	o	o	00	o	•sl	CO	CD	A	co	0)
'J (O	0)	0)	0)	0)		IM	oo	U	CO	CD	A
w 0	CO	cn	cn	CO	—X	A	0)	0	00	0)	O
		00	00				CD	-J		CD	-sl
		-1					—k	bJ		—k	O

A

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

(D

A

A

CD

O

oo

00

<0

cn

•Sl

Sj

00

00

CD

00

CO

<0

oo

A

ω

*s|

im

CO

0)

”C0

CO

(0

cn

bo

00

IM

(0

CO

0>

00

o

A

CD

CO

—k

00

CO

CD

00

CD

Sj

CD

o

0)

o

0)

<0

A

oo

0)

ΓΜ

IM

O IM

_x

o

o

—k

o

_k

—k

IM

O

—x

IM

sj

CO 00

•>J

co

CO

Sl

A

•sl

A

IM

A

A

O

La

b b

b

b

b

’o

o

b

O

b

La

O

O

O

00 A

cn

0>

0)

0)

CO

0)

CD

s|

IM

CD

<0

Φ <0

čo

čo

co

CD

CD

CD

(D

CD

(D

CD

čo

00

A CO

00

CD

CD

00

A

00

OO

<0

0)

00

co

2 ω	s ω	2 Q)	3 Q)
o	o	O	O
G)	G>	M	N)
M	M	00	00
M G>	8	A ω	_a A
_A	(0	O)	A
K)	0)	o	(D
G)	G)	00	A
-sl

0

0

0

0

0

0

0

Q

0

0

0

0

0

CD |

OD |

00

00 I

00 |

00 I

00 |

00 1

uo I

00 I

UO I

00 I

00 i

1 T)

1 •U

'<

m

m

00

1 00

1 00

1 00

1 Ό

1 00

1 00

m

TJ

TJ

ω

ω

>

>

>

>

TJ

>

>

ω

ω

ω

1“

—1

—í

A

-A

—1

i

i

2

M G) sl

M

ro

s

ó

i

g

š

M A

U)

ω

1 p—

sl

r-

r-

-1

0

ω

—J

-1

>

σ

o

N)

ž

ξ

W

C

o

>

>

o

o

c_ σ> OJ

<_ 2 π

-4 A G)

cn 00 G)

>* CD 00 o

0 00 0

cn oo

ω cn A

<_ A CO ω

c_ N> <0 0)

-< vj σ

s •Vl □

nj N) G) A

N>

N>

_A 0)

N> G)

Z

o

A

M

O

-sl

M	G)	M	-> -vl	M	N)	_k
<0	CD	(O	-» -vl	M	M	0)
O	0)	cn	cn oo	O	O	(D
CD	-sl	A	o	N	N
	σ	O		O	O
	C	N	> >	N	N	> M K)
		<0	t_ c_	(D	CD
	σι	ω	o o	cn	σ
N		vl	o o	_A	^A
oo	Vj	A M	M	K)	GJ
A (0 00 M	O	s	<0 <0 ω cn A N	O	o	A O
A

z	i g
o	O 0) 3 o’
3
o	o “»
ω	u
&	Q)
“S.	Ό.
(D*	w’

CO	CO	G>	G)	A	(D	CO	G>	-A CJ	A	cn	A
A	A	CD	00	—*	OO	CO	-4	O CD	O	oo	O
σ>	<0	00	O	A	00	cn	“*4	-° 00	A	A	00
co	CO	0)	O	00	cn	w		O N)	CO		NJ
A	O	CD	cn	CD	A	O)	O	O 0) O	cn	00	00

G)

M

M

o

A

o

_A

-A

ΓΌ

^4

-4

σι

o

—4

cn

CD

-sj

•sl

oo

*s|

-s|

-4

1a

1a

1a

b

O

b

b

o

b

b

b

b

_k

N)

hJ

ro

CD

σ

A

G>

cn

P

—A

0)

σ>

O

(D

CD

ČD

ČD

(D

co

ČD

CD

ČD

ČD

čo

ČD

CD

(D

CD

<0

00

oo

0)

cn

oo

00

oo

00

oo

00

143

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava celkovej genómovej DNA Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Kultúra Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) sa pestovala cez noc pri 30 °C za intenzívneho pretrepávania v BHI médiu (Difco). Bunky sa zbierali centrifugáciou, supernatant sa odhodil a bunky sa resuspendovali v 5 ml tlmivého roztoku-l (5 % pôvodného objemu kultúry - všetky vyznačené objemy boli kalkulované na 100 ml objem kultúry). Zloženie tlmivého roztoku-l: 140,34 g/l sacharózy, 2,46 g/l MgSO₄ x 7 H₂O, 10 ml/l KH2PO4 roztoku (100 g/l, pH upravené s KOH na 6,7), 50 ml/l M12 koncentrátu (10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l NaCI, 2 g/l MgSO₄ x 7 H₂O, 0,2 g/l CaCI₂, 0,5 g/l kvasinkového extraktu (Difco), 10 ml/l zmesi stopových prvkov (200 mg/l FeSO₄ x H₂O, 10 mg/l ZnSO₄x 7 H₂O, 3 mg/l MnCI₂ x 4 H₂O, 30 mg/ H3BO3, 20 mg/l CoCI₂ x 6 H₂O, 1 mg/l NiCI₂ x 6 H₂O, 3 mg/l Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 500 mg/l komplexotvorného činidla (EDTA alebo kyseliny citrónovej), 100 ml/l zmesi vitamínov (0,2 mg/l biotínu, 0,2 mg/l kyseliny listovej, 20 mg/l kyseliny p -aminobenzoovej, 20 mg/l riboflavínu, 40 mg/l Ca-pantotenátu, 140 mg/l kyseliny nikotínovej, 40 mg/l pyridoxín hydrochloridu, 200 mg/l myoinozitolu). Lyzozým sa pridal k suspenzii na konečnú koncentráciu 2,5 mg/ml. Po asi 4 h inkubácii pri 37 °C sa bunková stena rozložila a výsledné protoplasty sa zbierali centrifugáciou. Sediment sa raz premyl s 5 ml tlmivého roztoku-l a raz s 5 ml TE-tlmivého roztoku (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8). Sediment sa resuspendoval v 4 ml TE-tlmivého roztoku a pridalo sa 0,5 ml roztoku SDS (10 %) a 0,5 ml roztoku NaCI (5 M). Po pridaní proteinázy K na konečnú koncentráciu 200 pg/ml sa suspenzia inkubovala cca 18 hodín pri 37 °C. DNA sa purifikovala extrakciou s fenolom, fenolom-chloroformom-izoamylakoholom a chloroformomizoamylalkoholom podľa štandardných metód. Potom sa DNA vyzrážala pridaním 1/50 objemu 3 M octanu sodného a 2 objemov etanolu s následnou 30 minútovou inkubáciou pri -20 °C a 30 minútovou centrifugáciou pri 12 000 otáčkach za minútu (rpm) vo vysokorýchlostnej centrifúge s použitím SS34 rotora (Sorvall). DNA sa rozpustila v 1 ml TE-tlmivého roztoku obsahujúceho 20 pg/ml RNázy A a dialyzovala pri 4 °C proti 1000 ml TE-tlmivého roztoku najmenej 3 hodiny. Počas tohto času sa tlmivý roztok trikrát vymenil. K 0,4 ml alikvotným podielom

144 dialyzovaného roztoku DNA sa pridalo 0,4 ml 2 M LiCI a 0,8 ml etanolu. Po 30 minútovej inkubácii pri -20 °C sa DNA získala cenrifugáciou (13 000 otáčok za minútu (rpm), Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau, Nemecko). DNA sediment sa rozpustil v TE-tlmivom roztoku. DNA pripravená týmto postupom sa môže použiť na všetky účely, vrátane metódy južných odtlačkov (southern blotting) alebo konštrukcie genómových knižníc.

Príklad 2

Konštrukcia genómových knižníc Corynebacterium glutamicum ATCC13032 v Escherichia coli

DNA pripravená podľa opisu v príklade 1 sa použila na konštruovanie kozmidových a plazmidových knižníc podľa známych a dobre zavedených metód (pozri napr. Sambrook, J. a kol. (1989) „Molecular Cloning: A Laboratory Manuaľ, Cold Spring Harbor Laboratory Press, alebo Ausubel, F. M. a kol. (1994) „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley & Sons.).

Použiť sa môže akýkoľvek plazmid alebo kozmid. Predovšetkým sa použili plazmidy pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl. Sci. USA, 75, 3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134, 1141-1156), plazmidy sérií pBS (pBSSK+, pBSSK- a ďalšie; Stratagene, LaJolla, USA), alebo kozmidy ako SuperCos 1 (Stratagene, LaJolla, USA) alebo Lorist6 (Gibson, T.J., Rosenthal, A. and Waterson, R.H. (1987) Gene 53, 283-286. Génové knižnice špecifické na použitie v C. glutamicum môžu byť konštruované použitím plazmidu pSL109 (Lee, H.S. and A.J. Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4, 256-263).

Príklad 3

Sekvenovanie DNA a komputerová funkčná analýza

Na sekvenovanie DNA podľa štandardných metód sa použili genómové knižnice, opísané v príklade 2, predovšetkým sa použila metóda reťazovej terminácie použitím ABI377 sekvenačných prístrojov (pozri napr. Fleischman, R.D. a kol. (1995) „Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd.‘‘, Science, 269, 496-512). Použili sa sekvenačné priméry s nasledovnými nukleotidovými sekvenciami: 5'-GGAAACAGTATGACCATG-3', SEQ ID NO:1157 alebo 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3', SEQ ID NO:1158.

145

Príklad 4

In vivo mutagenéza

In vivo mutagenéza Corynebacterium glutamicum sa môže uskutočniť pasážovaním plazmidu (alebo iného vektora) DNA do E. coli alebo iných mikroorganizmov (napr. do druhov Bacillus alebo kvasiniek ako napríklad Saccharomyces cerevisiae), čím sa zhorší ich schopnosť udržať si integritu svojej genetickej informácie. Typické mutátorové kmene majú mutácie v génoch reparačného systému DNA (napr. mutHLS, mutD, mutT, atď.; na porovnanie pozri Rupp, W.D.(1996) DNA repair mechanisms in: Escherichia coli and Salmonella, str. 2277-2294, ASM, Washington.) Takéto kmene sú dobre známe odborníkom, ktorí sú skúsení v danej oblasti techniky. Použitie takýchto kmeňov je uvedené napríklad v Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies7, 32-34.

Príklad 5

Transfer DNA medzi Escherichia coli a Corynebacterium glutamicum

Niektoré druhy Corynebacterium a Brevibacterium obsahujú endogénne plazmidy (ako napr. pHM1519 alebo pBL1), ktoré sa autonómne replikujú (pozri prehľad, napr. Martin, J.F. a kol. (1987) Biotechnology, 5, 137-146). „Shuttle“ vektory pre Escherichia coli a Corynebacterium glutamicum sa môžu ľahko konštruovať použitím štandardných vektorov pre E. coli (Sambrook, J. a kol. (1989), „Molecular Cloning: A Laboratory Manuaľ, Cold Spring Harbor Laboratory Press alebo Ausubel, F.M. a kol., (1994) „ Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley & Sons), ku ktorým sa pridal pôvodný alebo na tento účel replikovaný a vhodný markér z Corynebacterium glutamicum. Takéto zdroje replikácie sa výhodne zvolia z endogénnych plazmidov izolovaných z Corynebacterium alebo Brevibacterium druhov. Predovšetkým výhodné pre tieto druhy je použitie génov zodpovedných za rezistenciu na kanamycín (napríklad takých, ktoré sú odvodené z Tn5 alebo Tn903 transpozónov) alebo na chloramfenikol (Winnacker, E.L. (1987) „From Genes to Clones - Introduction to Gene technology, VCH, Weinheim) ako transformačných markérov. V literatúre existuje mnoho príkladov na konštrukciu „divého“ typu „shuttle“ vektorov, ktoré sa replikujú aj v E. coli aj v C. glutamicum, a ktoré sa môžu použiť na niekoľko účelov, vrátane nadmernej expresie génu (pozri odkaz napr. Yoshihama, M. a kol. (1985) J. Bacteriol. 162, 591-597, Martin J.F.

146 a kol. (1987) Biotechnology, 5, 137-146 a Eikmanns, B.J. a kol. (1991) Gene, 102, 93-98).

Použitím štandardných metód je možné klonovať gén, ktorý je predmetom záujmu, do jedného zo „shuttle“ vektorov opísaných vyššie a zaviesť takéto hybridné vektory do kmeňov Corynebacterium glutamicum . Transformácia C. glutamicum sa môže dosiahnuť pomocou protoplastovej transformácie (Kastsumata, R. a kol.(1984) J. Bacteriol. 159, 306-311), elektroporácie (Liebl, E. a kol. (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53, 399-303) a v prípadoch, keď sa použijú špeciálne vektory, tiež pomocou konjugácie (ako sa to opisuje napr. v Schäfer, A. a kol. (1990) J. Bacteriol. 172, 1663-1666). Tak isto je možný transfer „shuttle“ vektorov pre C. glutamicum do E. coli pomocou preparácie plazmidovej DNA z C glutamicum (použitím štandardných metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky) a jej transformovaním do E. coli. Takýto transformačný krok sa môže uskutočniť použitím štandardných metód, ale výhodné je použiť Mcr-deficitný kmeň E. coli, ako napríklad NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166, 1-19).

Gény sa môžu nadmerne exprimovať v kmeňoch C. glutamicum použitím plazmidov, ktoré obsahujú pCG1 (americký patentový spis č. US 4,617,267) alebo ich fragmentov a voliteľne gén rezistencie na kanamycín z TN903 (Grindley, N.D. a Joyce, C.M. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(12), 7176-7180). Okrem toho sa gény môžu nadmerne exprimovať v kmeňoch C. glutamicum použitím plazmidu pSL 109 (Lee, H.-S. and A.J. Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4, 256-263).

Okrem použitia replikačných plazmidov sa nadmerné exprimovanie génu môže tiež dosiahnuť pomocou integrácie do genómu. Genómová integrácia v C. glutamicum alebo iných Corynebacterium alebo Brevibacterium druhoch sa môže uskutočniť pomocou takých metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky, ako je homológna rekombinácia s genómovou(ými) oblasťou(ami), integrácia usmernená reštrikčnou endonukleázou (REMI) (pozri napr. nemecký patentový spis DE 19823834), alebo prostredníctvom použitia transpozónov. Tak isto je možné modulovať aktivitu génu, ktorý je predmetom záujmu, pomocou modifikovania regulačných oblastí (napr. promótora, represora a/alebo zosilňovača) pomocou sekvenčnej modifikácie, inzercie alebo delécie, využijúc miestne cielené metódy (ako je homológna rekombinácia) alebo metódy založené na náhodných prípadoch (ako transpozónová mutagenéza alebo REMI). Sekvencie nukleových

147 kyselín, ktoré majú funkciu transkripčných terminátorov, sa tiež môžu vložiť 3' ku kódovacej oblasti jedného alebo viacerých génov podľa tohto vynálezu; takéto terminátory sú dobre známe v danej oblasti techniky a sú opísané napríklad voWinnacker, E.L. (1987) From Genes to Clones - Introduction to Gene

Technology. VCH, Weinheim.

Príklad 6

Stanovenie expresie mutantných proteínov.

Pozorovania aktivity mutovaných proteínov v transformovanej hostiteľskej bunke sa opierajú o fakt, že mutantný proteín sa exprimuje podobným spôsobom a v porovnateľnom množstve ako „divý“ typ proteínu. Na určenie úrovne transkripcie mutantného génu existuje vhodná metóda (indikátor množstva mRNA dostupnej na transláciu na génový produkt), a to metóda severných odtlačkov (Northern blot) (pozri odkaz napríklad Ausubel a kol.(1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York), pri ktorej sa primér určený na naviazanie ku génu, ktorý je predmetom záujmu, označí s detegovateľnou značkou, (obyčajne rádioaktívnou alebo chemoluminiscenčnou) tak, že keď sa celková RNA kultúry organizmu vyextrahuje, spracuje na géli, transferuje sa na stabilnú matricu a inkubuje s touto sondou, naviazanie a množstvo naviazanej sondy indikuje prítomnosť a tiež množstvo mRNA pre tento gén. Táto informácia je dôkazom stupňa transkripcie mutantného génu. Celková bunková RNA sa môže pripraviť z Corynebacteríum. glutamicum pomocou niekoľkých metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky, ako je opísané v: Bormann E.R. a kol. (1992) Mol. Microbiol. 6, 317-326.

Na stanovenie prítomnosti alebo relatívneho množstva proteínu translatovaného z tejto mRNA sa môžu použiť štandardné metódy, také ako metóda západných odtlačkov (Western blot), (pozri napríklad Ausubel, a kol. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York). Pri tomto procese sa celkový bunkový proteín extrahuje, gélovou elektroforézou sa separuje, prenesie sa na matricu, ako je nitrocelulózová matrica, a inkubuje sa so sondou, ako napríklad protilátkou, ktorá sa špecificky viaže na požadovaný proteín. Táto sonda je obvykle označená s chemoluminiscenčnou alebo kolorimetrickou značkou, ktorá sa dá ľahko detegovať. Prítomnosť a množstvo pozorovanej značky poukazuje na prítomnosť a množstvo požadovaného mutantného proteínu prítomného v bunke.

148

Príklad 7

Rast geneticky modifikovanej Corynebacterium. glutamicum - médiá a podmienky kultivácie

Geneticky modifikované Corynebacteria sa pestujú na syntetickom alebo prírodnom rastovom médiu. Celý rad rôznych rastových médií pre Corynebacteria sú aj dobre známe, aj ľahko dostupné (Lieb, a kol., (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 205-210; von der Osteň, a kol., (1998) Biotechnology Letters, 11, 11-16; nemecký patentový spis DE 4,120,867; Liebl (1992) „The Genus Corynebacterium, v The Procaryotes, Volume II, Balows, A. a kol., eds. SpringerVerlag). Tieto médiá sa skladajú z jedného alebo viacerých zdrojov uhlíka, zdrojov dusíka, anorganických solí, vitamínov a stopových prvkov. Výhodnými zdrojmi uhlíka sú sacharidy ako mono-, di-, alebo polysacharidy. Napríklad, glukóza, fruktóza, manóza, galaktóza, ribóza, sorbóza, ribulóza, laktóza, maltóza, sacharóza, rafinóza, škrob alebo celulóza sú veľmi dobrými zdrojmi uhlíka. Tak isto je možné dodávať sacharid do média prostredníctvom komplexných zlúčenín, ako je melasa alebo vedľajšie produkty pri rafinácii cukru. Tak isto sa môžu výhodne dodávať zmesi rôznych zdrojov uhlíka. Ďalšími možnými zdrojmi uhlíka sú alkoholy a organické kyseliny ako metanol, etanol, kyselina octová alebo kyselina mliečna. Zdrojmi dusíka sú obyčajne organické a anorganické zlúčeniny dusíka alebo materiály, ktoré obsahujú tieto zlúčeniny. Príkladnými zdrojmi dusíka sú plynný amoniak alebo amónne soli ako NH₄CI alebo (NH₄)₂SO₄, NH₄OH, dusičnany, močovina, aminokyseliny alebo komplexné dusíkové zdroje ako macerovaný kukuričný mok, sójová múčka, sójový proteín, kvasinkový extrakt, mäsový extrakt a iné.

Zlúčeniny anorganických solí, ktoré sa môžu zahrnúť do médií sú soli vápnika, horčíka, sodíka, kobaltu, molybdénu, draslíka, mangánu, zinku, medi a železa vo forme chloridov, fosforečnanov alebo síranov. Aby sa udržali ióny kovov v roztoku, môžu sa pridať do média chelátotvorné zlúčeniny. Predovšetkým užitočnými chelátotvornými zlúčeninami sú dihydroxyfenoly, ako katechol alebo protokatechinát alebo organické kyseliny, ako napríklad kyselina citrónová. Médiá zvyčajne obsahujú aj ďalšie rastové faktory, ako vitamíny alebo rastové promótory, napríklad ako biotín, riboflavín, tiamín, kyselinu listovú, kyselinu nikotínovú, pantotenát a pyridoxín. Rastové faktory a soli často pochádzajú z komplexných

149 zložiek média ako kvasinkového extraktu, melasy, macerovaného kukuričného moku a ďalších. Presné zloženie médií veľmi závisí od bezprostredného pokusu a rieši sa individuálne pre každý špecifický prípad. Informácie o optimalizácii médií sú dostupné v príručke „Applied Microbiol. Physiology, A practical Approach (eds. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) str. 53-73, ISBN 019 963577 3). Tiež je možné, aby sa zvolilo rastové médium od komerčných dodávateľov, ako štandard 1 (Merck) alebo BHI („grain heart infusion“, DIFCO) alebo ďalšie.

Všetky zložky média sa sterilizujú, buď tepelne (20 minút pri 1,5 bar a 121 °C) alebo sterilnou filtráciou. Zložky sa môžu sterilizovať spolu, alebo ak je to nutné, tak oddelene. Všetky zložky médií môžu byť prítomné na začiatku rastu, alebo sa môžu voliteľne pridávať kontinuálne alebo po dávkach.

Podmienky kultivácie sú určené pre každý pokus osobitne. Teplota by mala byť v rozsahu od 15 °C do 45 °C. Teplota sa môže udržiavať konštantná, alebo sa môže v priebehu pokusu meniť. Hodnota pH média by mala byť v rozpätí od 5 do 8,5, výhodne okolo 7,0 a dá sa udržiavať pomocou prídavku tlmivých roztokov k médiám. Príkladným tlmivým roztokom na tento účel je tlmivý roztok fosforečnanu draselného. Alternatívne alebo súbežne sa môžu používať syntetické tlmivé roztoky ako MOPS, HEPES, ACES a iné. Konštantné pH sa pri kultivácii môže tiež udržať pridaním NaOH alebo NH₄OH počas rastu. Ak sa použijú komplexné zložky do média, ako kvasinkový extrakt, nutnosť používať dodatočné tlmivé roztoky sa môže znížiť v dôsledku toho, že mnohé komplexné zlúčeniny majú vysokú tlmivú kapacitu. Ak sa na kultiváciu mikroorganizmov používa fermentor, tak pH sa dá tiež regulovať použitím plynného amoniaku.

Inkubačný čas je obvykle v rozpätí od niekoľkých hodín až do niekoľkých dní. Tento čas sa zvolí tak, aby sa umožnilo maximálne nazhromaždenie produktu v živnom kvapalnom médiu. Opísané rastové pokusy sa môžu uskutočňovať v rôznych nádobách, napríklad mikrotitračných platniach, sklenených skúmavkách alebo sklenených bankách alebo sklenených alebo kovových fermentoroch rôznych veľkostí. Na skríning veľkého množstva klonov by sa mali mikroorganizmy pestovať na mikrotitračných platniach, v sklenených skúmavkách alebo trepacích bankách, buď s alebo bez miešacích zarážok. Výhodne sa používajú 100 ml trepacie banky naplnené na 10 % (objemových) s požadovaným rastovým médiom. Banky by sa mali trepať na rotačnej trepačke (rozkmit 25 mm) pri rýchlostnom rozsahu 100 150

300 otáčok za minútu. Straty odparovaním sa môžu znížiť pomocou udržiavania vlhkého ovzdušia; alternatívne by sa mala uskutočniť matematická korekcia strát odparovaním.

Ak sa testujú geneticky modifikované klony, mal by sa tiež testovať nemodifikovaný kontrolný kloň alebo kontrolný kloň obsahujúci základný plazmid bez akejkoľvek inzercie. Médium sa inokuluje na 0,5 - 1,5 Οϋεοο použitím buniek kultivovaných na agarových platniach ako napríklad CM platniach (10 g/l glukóza, 2,5 g/l NaCI, 2 g/l močovina, 10 g/l polypeptón, 5 g/l kvasinkový extrakt, 5 g/l mäsový extrakt, 22 g/l agar, pH 6,8 s 2 M NaOH), potom sa inkubuje pri 30 °C . Inokulácia média sa dosiahne buď tým, že sa zavedie suspenzia buniek C. glutamicum z CM platní vo fyziologickom roztoku alebo prídavkom tejto kvapalnej predkultivovanej baktérie.

Príklad 8

In vitro analýza funkcie mutantných proteinov

Stanovenie aktivít a kinetických parametrov enzýmov je v danej oblasti techniky dobre zavedené. Pokusy stanoviť aktivitu akéhokoľvek zmeneného enzýmu sa musia prispôsobiť špecifickej aktivite „divého“ typu enzýmu, čo je v schopnostiach odborníka skúseného v odbore. Všeobecný prehľad o enzýmoch, ako aj špecifické detaily týkajúce sa štruktúry, kinetík, princípov, metód, aplikácií a príklady na stanovenie mnohých enzýmových aktivít sa dajú nájsť napríklad v nasledovných odkazoch: Dixon, M., and Webb, E.C., (1979) Enzymes, Longmans, London; Fersht, (1985) Enzýme Structure and Mechanism. Freeman, New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press, Oxford; Boyer, STR. D., ed. (1983) The Enzymes, 3^rd ed. Academic Press, New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2^rd ed. VCH, Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Grapl, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3^rd ed., vol. I -XII, Verlag Chemie, Weinheim; a Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, „Enzymes“. VCH, Weinheim, str. 352-363.

Aktivita proteinov, ktoré sa viažu na DNA sa môže merať pomocou niekoľkých dobre zavedených metód, ako DNA skúškami pásového posunu (tiež nazývanými gélové retardačné skúšky). Vplyv takýchto proteinov na expresiu

151 ďalších molekúl sa môže merať pomocou skúšok s reportérovým génom (tak ako to opisuje Kolmar, H. a kol. (1995) EMBO J. 14, 3895-3904 a odkazy tam citované). Testovacie systémy reportérového génu sú dobre známe a zavedené na aplikovanie tak v prokaryotických, ako aj eukaryotických bunkách, použitím takých enzýmov ako beta-galaktozidázy, zeleného fluorescenčného proteínu a niekoľkých ďalších.

Stanovenie aktivity membránovo-transportných proteínov možno uskutočniť podľa takých metodík, aké sa opisujú v Gennis, R.B. (1989) „ Pores, Channels and Transporters“, v Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer, Heidelberg, str. 85-137, 199-234 a 270-322.

Príklad 9

Analýza vplyvu mutantného proteínu na produkciu požadovaného produktu

Vplyv genetickej modifikácie v C. glutamicum na produkciu požadovanej zlúčeniny (ako napríklad aminokyseliny) sa môže stanoviť kultiváciou modifikovaného mikroorganizmu vo vhodných podmienkach (opísaných vyššie) a analyzovaním média a/alebo bunkovej zložky na zvýšenú produkciu požadovaného produktu (t.j. aminokyseliny). Takéto analytické metódy sú dobre známe odborníkom, ktorí pracujú v danej oblasti techniky a zahŕňajú spektroskopiu, tenkovrstvovú chromatografiu, vyfarbovacie metódy rôzneho druhu, enzýmové a mikrobiologické metódy a analytickú chromatografiu, ako napríklad vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu (pozri napríklad: Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, str. 89-90 a str. 443-613, VCH, Weinheim (1985); Fallon, A. a kol.,(1987) „Applications of HPLC in Biochemistry“ v Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm a kol., (1993) Biotechnology, vol. 3, Chapter III: „Product recovery and purification“, str. 469-714, VCH, Weinheim; Belter, P.A. a kol. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery process for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D. (1988) Biochemical separations, v Ulmann s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, str. 1-27, VCH, Weinheim; and Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

152

Okrem merania konečného produktu fermentácie je tiež možné analyzovať ďalšie zložky metabolických dráh, ktoré sa využívajú na produkciu požadovanej zlúčeniny, ako napríklad medziprodukty a vedľajšie produkty, aby sa stanovila celková účinnosť produkcie zlúčeniny. Analytické metódy zahrňujú merania hladiny živín v médiu (napr. sacharidov, uhľovodíkov, zdrojov dusíka, fosfátu a iných iónov), merania zloženia a rastu biomasy, analýzu produkcie bežných metabolitov biosyntetických dráh a meranie plynov produkovaných počas fermentácie. Štandardné metódy pre tieto merania sú načrtnuté v Applied Microbial Physiology, A Practical Approach, P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, eds., IRL Press, str. 103129; 131-163; a 165-192 (ISBN 0199635773) a odkazoch tam citovaných.

Príklad 10

Purifikácia požadovaného produktu z kultúry C. glutamicum

Získanie požadovaného produktu z buniek C. glutamicum alebo supernatantu vyššie opísanej kultúry sa môže uskutočniť rôznymi metódami, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky. Ak požadovaný produkt nie je vylučovaný z buniek, bunky sa môžu zbierať z kultivácie pomocou centrifugácie pri nízkych otáčkach, potom sa bunky lyžujú štandardnými metódami, ako napríklad mechanickým zásahom alebo sonifikáciou. Bunkový debris sa odstráni centrifugáciou a supernatantná frakcia obsahujúca rozpustné proteíny sa nechá na ďalšiu purifikáciu požadovanej zlúčeniny. Ak je produkt vylučovaný z buniek C. glutamicum, potom sa bunky odstránia z kultúry pomocou centrifugácie pri nízkych otáčkach a supernatantná frakcia sa nechá na ďalšiu purifikáciu.

Supernatantná frakcia z oboch purifikačných metód sa podrobí chromatografii s vhodnou živicou, pri ktorej je požadovaná molekula buď zadržaná na chromatografickej živici, zatiaľ čo mnohé nečistoty nie; alebo pomocou živice sa zadržia nečistoty a nie vzorka. Takéto chromatografické kroky sa môžu opakovať, ak je potrebné, použitím rovnakej alebo rôznych chromatografických živíc. Odborník v danej oblasti techniky by mal byť veľmi skúsený vo výbere vhodných chromatografických živíc, v ich najúčinnejšej aplikácii na príslušnú molekulu, ktorá sa má purifikovať. Purifikovaný produkt sa môže zahustiť pomocou filtrácie alebo ultrafiltrácie a uchovávať pri teplote, pri ktorej stabilita produktu je maximálna.

153

V danej oblasti techniky je známych veľa purifikačných metód a predchádzajúca metóda purifikácie nie je limitujúcou. Takéto purifikačné metódy sú opísané napr. v Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-HilI, New York (1986).

Identita a čistota izolovaných zlúčenín sa môže stanoviť štandardnými metódami v danej oblasti techniky. Tieto zahŕňajú vysokúčinnú kvapalinovú chromatografiu (HPLC), spektroskopické metódy, vyfarbovacie metódy, tenkovrstvovú chromatografiu, NIRS, enzýmovú alebo mikrobiologickú skúšku. Takéto metódy analýzy sú zhrnuté v: Patek, a kol. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60, 133-140; Malakhova a kol. (1996) Biotekhnologiya 11,27-32; a v Schmidt a kol., (1998) Bioprocess Engineer. 19, 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH, Weinheim, str. 89-90, str. 521-540, str. 540-547, str. 559-566, 575-581 a str. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways, An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. a kol., (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in Biochemistry in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol.17.

Príklad 11

Analýza génových sekvencií podľa vynálezu

Porovnanie sekvencií a určenie percenta homológie medzi dvoma sekvenciami sú v danej oblasti techniky známe metódy a môžu sa uskutočniť použitím matematického algoritmu, ako napríklad algoritmu podľa Karlina a Altschula (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-68, modifikovaného podľa Karlina a Altschula (1993) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 90, 5873-77. Takýto algoritmus je inkorporovaný do NBLAST a XBLAST programov (version 2.0), Altschul, a kol. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-10. BLAST nukleotidové vyhľadávanie sa môže uskutočňovať s NBLAST programom, „score = 100“, „wordlenght = 12“, aby sa získali nukleotidové sekvencie homológne s MP molekulami nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu. BLAST proteínové vyhľadávanie sa môže uskutočniť s XBLAST programom, „score = 50“, „wordlength = 3“, aby sa získali aminokyselinové sekvencie homológne s MP proteínovými molekulami podľa tohto vynálezu. Aby sa kvôli porovnaniam získali zoradenia s medzerami, môže sa využiť Gapped BLAST, ako sa to opisuje v Altschul a kol., (1997) Nucleic Acids Res.

154

25(17), 3389-3402. Keď sa používajú programy BLAST a Gapped BLAST, odborník skúsený v danej oblasti techniky bude vedieť, ako treba optimalizovať parametre programu (napr. XBLAST a NBLAST) na to, aby sa mohla analyzovať Špecifická sekvencia.

Ďalším príkladom matematického algoritmu využívaného na porovnanie sekvencií je algoritmus podľa: Meyers and Miller ((1988) Comput. Appl. Biosci. 4, 11-17). Takýto algoritmus je inkorporovaný do ALIGN programu (version 2.0), ktorý je súčasťou GCG sekvenčného zoraďovacieho súboru programov. Ak sa používa na porovnávanie aminokyselinových sekvencií ALIGN program, môže sa použiť PAM120 „weight residue table“, „gap length penalty 12“ a „gap penalty 4“. Dodatkové algoritmy pre sekvenčnú analýzu sú známe v danej oblasti techniky, a zahŕňajú ADVANCE a ADAM opísané v: Torelli a Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. W, 3-5; a FASTA opísané v: Pearson and Lipman (1988) P.N.A.S. 85, 24448.

Percento homológie medzi dvoma aminokyselinovými sekvenciami sa môže tiež stanoviť použitím GAP programu v GCG súbore programov (dostupných na http://www.gcg.com.), použitím buď Blosum 62 matice alebo PAM 250 matice a „gap weight“ 12, 10, 8, 6 alebo 4 a „length weight“ 2, 3 alebo 4. Percento homológie medzi dvoma nukleotidovými sekvenciami sa môže stanoviť použitím GAP programu v GCG súbore programov, pri použití štandardných parametrov „gap weight“ 50 a „lenght weight“ 3.

Porovnávacia analýza génových sekvencií podľa tohto vynálezu s tými, ktoré sú uvedené v Genbank sa uskutočnila pomocou metód, ktoré sú známe v danej oblasti techniky (pozri napr. Bexevanis and Ouellete, eds. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. John Wiley and Sons, New York). Génové sekvencie podľa tohto vynálezu sa porovnali s génmi uvedenými v Genbanke trojkrokovým postupom. V prvom kroku sa uskutočnila BLASTN analýza (napr. lokálna zoraďovacia analýza) pre každú sekvenciu podľa tohto vynálezu voči nukleotidovým sekvenciám uvedeným v Genbanke a najlepších 500 nálezov sa odložilo na ďalšie analýzy. Ďalšie FASTA vyhľadávanie (napr. kombinovaná lokálna a globálna analýza zoradenia, v ktorej sú limitované oblasti sekvencií zoradené) sa uskutočnilo na týchto 500 nálezoch. Každá génová sekvencia podľa tohto vynálezu bola ďalej globálne priradená ku každému

155 z najlepších troch FASTA nálezov, použitím GAP programu v GCG súbore programov (použitím štandardných parametrov). Za účelom získania správnych výsledkov sa dĺžka sekvencie, vyňatá z Genbanky, upravila na dĺžku vyhľadávaných sekvencii pomocou metód dobre známych v danej oblasti techniky. Výsledky tejto analýzy sú uvedené v tabuľke 4. Výsledné údaje vyžadovali signifikantne kratšie komputerové časy v porovnaní s takouto širokou databázovou GAP (globálnou) analýzou, avšak sú identické s tými, ktoré by sa boli získali samostatne vykonanou GAP (globálnou) analýzou na každom géne podľa tohto vynálezu v porovnaní so všetkými odkazmi v Genbanke. Sekvencie podľa tohto vynálezu, pre ktoré sa nezískali žiadne zoradenia mimo „cutoff“ hodnôt sú uvedené v tabuľke 4 tak, že tam chýbajú informácie o zoradení. Odborník skúsený v odbore si bude ďalej vedomý toho, že percento GAP homológie zoradenia, ktoré sa uvádza v tabuľke 4 pod hlavičkou „% homológie (GAP)“ je uvedené v európskom numerickom tvare, v ktorom ” , predstavuje desatinnú čiarku. Napríklad hodnota „40,345“ v tejto kolónke predstavuje „40,345 %“.

Príklad 12

Konštrukcia a funkcia DNA mikromatríc (DNA mikroradov)

Sekvencie podľa tohto vynálezu sa môžu okrem toho použiť na konštrukciu a aplikáciu DNA mikromatríc (zostavenie, metodológia a použitia DNA mikromatríc sú dobre známe v danej oblasti techniky a sú opísané napríklad v Schena, M, a kol., (1995) Science 270, 467-470; Wodicka, L. a kol. (1997) Náture Biotechnology 15, 1359-1367; DeSaizieu, A. a kol., (1998) Náture Biotechnology 16, 45-48; a DeRisi, J.L. a kol. (1997) Science 278, 680-686).

DNA mikromatrice sú pevné alebo flexibilné podklady skladajúce sa z nitrocelulózy, nylonu, skla, silikónu alebo iných materiálov, k povrchu ktorých sa molekuly nukleovej kyseliny môžu pripojiť v určitom usporiadaní. Po vhodnom označkovaní sa môžu ďalšie nukleové kyseliny alebo zmesi nukleových kyselín hybridizovať s imobilizovanými molekulami nukleovej kyseliny a značka sa môže použiť na monitorovanie a meranie individuálnych signálnych intenzít hybridizovaných molekúl v určených oblastiach. Táto metodológia umožňuje súčasne kvantifikovať relatívne alebo absolútne množstvo všetkých alebo zvolených nukleových kyselín v použitej vzorke nukleovej kyseliny alebo zmesi.

156

DNA mikromatrice preto umožňujú analýzu expresie veľkého počtu (až 6800 alebo viac) nukleových kyselín paralelne (pozri napr. Schena, M. (1996) BioEssays 18(5), 427-431).

Sekvencie podľa tohto vynálezu sa môžu tiež použiť na konštrukciu oligonukleotidových primérov, ktoré sú schopné amplifikovať definované oblasti jedného alebo viacerých C glutamicum génov pomocou takej nukleovokyselinovej amplifikačnej reakcie akou je polymerázová reťazová reakcia. Výber a konštrukcia 5'- alebo 3'-oligonukleotidových primérov alebo vhodných spojovníkov umožňuje kovalentné pripojenie výsledných PCR produktov k povrchu podporného média, opísaného vyššie (a tiež opísaného napríklad v Schena, M. a kol. (1995) Science 270, 467-470).

Nukleovokyselinové mikromatrice sa môžu tiež konštruovať pomocou oligonukleotidovej syntézy in situ podľa Wodicka, L. a kol. (1997) Náture Biotechnology 15, 1359-1367. Pomocou fotolitografických metód sa presne určené oblasti matrice exponujú na svetle. Ochranné skupiny, ktoré sú fotolabilné, sa týmto spôsobom aktivujú a podliehajú nukleotidovej adícii, zatiaľ čo oblasti, ktoré sú maskované pred svetlom, nepodliehajú žiadnej modifikácii. Nasledujúce cykly ochrany a aktivácie svetlom umožňujú syntézu rôznych oligonukleotidov v definovaných pozíciách. Malé, definované oblasti génov podľa tohto vynálezu sa môžu syntetizovať na mikromatriciach pomocou syntézy oligonuleotidov v pevnej fáze.

Molekuly nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu prítomné vo vzorke alebo zmes nukleotidov sa môžu hybridizovať s DNA mikromatricami. Tieto molekuly nukleovej kyseliny sa môžu značkovať podľa štandardných metód. Stručne, molekuly nukleovej kyseliny (napr. mRNA molekuly alebo DNA molekuly) sa značia pomocou inkorporácie izotopicky alebo fluorescečne značených nukleotidov, napr. počas reverznej transkripcie alebo syntézy DNA. Hybridizácia značených nukleových kyselín s DNA mikromatricami je opísaná (napr. v Schena, M. a kol., (1995); Wodicka, L. a kol., (1997), citované vyššie; a DeSaizieu A. a kol. (1998), citované vyššie). Detekcia a kvantifikácia hybridizovanej molekuly je prispôsobená špecificky inkorporovanému značeniu. Rádioaktívne značenia sa môžu detegovať (napríklad podľa Schena, M. a kol., (1995) citované vyššie;) a fluorescenčné

157 značenia sa môžu detegovať napríklad podľa metódy Shalon a kol. (1996) Genome Research 6, 639-645).

Použitie sekvencií podľa tohto vynálezu na DNA mikromatricovú technológiu, ako sa opisuje vyššie, umožňuje porovnávacie analýzy rôznych kmeňov C. glutamicum alebo iných Corynebacteria. Napríklad, výskumy interkmeňových variácii založených na individuálnych transkripčných profiloch a identifikácia génov, ktoré sú dôležité pre špecifické a/alebo požadované vlastnosti kmeňa, ako je patogenita, produktivita a odolnosť voči stresu, sú uľahčené použitím nukleovokyselinových matricových metodík. Nukleovokyselinové matricové technológie je možné použiť tiež na porovnania profilu expresie génov podľa tohto vynálezu v priebehu fermentačnej reakcie.

Príklad 13

Analýza dynamiky bunkových proteínových populácií (proteómov)

Gény, kompozície a spôsoby podľa tohto vynálezu sa môžu aplikovať na výskum interakcií a dynamiky populácií proteínov, nazývaných „proteómy“. Proteínové populácie, ktoré sú predmetom záujmu, obsahujú, ale nie sú obmedzené na, celkovú proteínovú populáciu C. glutamicum (napr. v porovnaní s proteínovými populáciami iných organizmov) a tie proteíny, ktoré sú aktívne v špecifických podmienkach prostredia alebo v špecifických metabolických podmienkach (napr. počas fermentácie, pri vysokej alebo nízkej teplote, alebo pri vysokom alebo nízkom pH) alebo tie proteíny, ktoré sú aktívne počas špecifických fáz rastu a vývoja.

Proteínové populácie sa môžu analyzovať pomocou rôznych dobre známych metód, ako napríklad gélovou elektroforézou. Bunkové proteíny sa môžu získať, napríklad, lýzou alebo extrakciou a môžu sa navzájom separovať použitím rôznych elektroforetických metód. Polyakrylamidová gélová elektroforéza s dodecylsulfátom sodným (SDS-PAGE) separuje proteíny prevažne na základe ich molekulovej hmotnosti. Izoelektricko-fokusačná polyakrylamidová gélová elektroforéza (IEFPAGE) separuje proteíny pomocou ich izoelektrického bodu, (ktorý odráža nielen aminokyselinovú sekvenciu, ale tiež potranslačné modifikácie proteínu). Ďalšou, výhodnejšou metódou proteínovej analýzy je následná kombinácia oboch IEFPAGE a SDS-PAGE metód, známych ako 2-D-gélová elektroforéza (opísaná

158 napríklad v Hermann a kol. (1998) Electrophoresis, 19, 3217-3221; Fountoulakis, a kol. (1998) Electrophoresis, 1_9, 1193-1202; Langen, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1184-1192; Antelmann, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1451-1463). Na proteínovú separáciu sa môžu tiež použiť ďalšie separačné metódy, ako napríklad kapilárna gólová elektroforéza; tieto metódy sú dobre známe v danej oblasti techniky.

Proteíny, ktoré sa separovali pomocou týchto metodík, sa môžu vizualizovať štandardnými metódami, takými ako vyfarbovanie alebo značkovanie. Vhodné vyfarbovacie činidlá sú známe v danej oblasti techniky a zahŕňajú Coomassie Brilliant Blue, striebro alebo fluorescenčné farbivá, ako Sypro Ruby (Molekulové sondy). Zahrnutie rádioaktívne značených aminokyselín alebo ďalších proteínových prekurzorov (napr. ³⁵S-metionínu, ³⁵S-cysteínu, ¹⁴C-značených aminokyselín, ¹⁵Naminokyselín, ¹⁵NO3 alebo ¹⁵NH4⁺ alebo ¹³C-značených aminokyselín) do média C.glutamicum umožňuje označiť proteíny z týchto buniek pred ich separáciou. Podobne sa môžu použiť fluorescenčné značky. Tieto značené proteíny sa môžu extrahovať, izolovať a separovať podľa doteraz opísaných metodík.

Proteíny vizualizované týmito metódami sa môžu v ďalšom analyzovať meraním množstva použitého farbiva alebo značky. Množstvo určitého proteínu sa môže v ďalšom stanoviť kvantitatívne použitím, napríklad, optických metód a môže sa porovnať s množstvom iných proteinov v tom istom géli alebo v iných géloch. Porovnania proteinov na géloch sa môžu urobiť napríklad optickým porovnaním, spektroskopicky, zobrazovacím snímaním a analýzou gélov, alebo použitím fotografických filmov a zobrazení. Takéto metódy sú dobre známe v danej oblasti techniky.

Aby sa stanovila identita ktoréhokoľvek daného proteínu, môže sa použiť priame sekvenovenie alebo iné štandardné metódy. Napríklad sa môže použiť Na/alebo C-koncové aminokyselinové sekvenovanie (ako Edmanova degradácia) , ako aj hmotnostná spektrometria (výhodne MALDI alebo ESI metódy (pozri napr. Langen, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1184-1192)). Tu poskytnuté proteínové sekvencie sa môžu použiť na identifikáciu C. glutamicum proteinov pomocou týchto metodík.

159

Informácie získané týmito metódami sa môžu použiť na porovnanie podôb proteínovej prítomnosti, aktivity alebo modifikácie medzi rôznymi vzorkami z rozličných biologických podmienok (okrem iného napr. rôzne organizmy, časové podmienky fermentácie, stav média alebo rôzne biotopy). Údaje získané z takýchto pokusov, samotných alebo v kombinácii s ďalšími technológiami, sa môžu použiť na také rôzne aplikácie, ako na porovnanie správania sa rôznych organizmov v určitej (napr. metabolickej) situácii, na zvýšenie produktivity kmeňov, ktoré produkujú špeciálne chemikálie alebo na zvýšenie účinnosti produkcie špeciálnych chemikálií.

Ekvivalenty

Odborníci skúsení v danej oblasti techniky zistia alebo budú schopní len pomocou bežnej rutinnej praxe zistiť mnohé ekvivalenty ku špecifickým uskutočneniam podľa vynálezu, opísaným v tomto dokumente. Takéto ekvivalenty uskutočnení spadajú do rozsahu nasledujúcich patentových nárokov.

Claims (38)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny z Corynebacterium glutamicum kódujúca proteín metabolickej dráhy alebo jeho časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiadne F-označené gény uvedené v tabuľke 1.
2. 2. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa nároku 1, kde uvedený proteín metabolickej dráhy je zvolený zo skupiny zapojenej do metabolizmu aminokyseliny, vitamínu, kofaktora, nutraceutika, nukleotidu, nukleozidu alebo trehalózy.
3. 3. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny z Corynebacterium glutamicum zvolená zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname alebo jej časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden F-označený gén uvedený v tabuľke 1.
4. 4. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá kóduje polypeptidovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
5. 5. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá kóduje prirodzene sa vyskytujúci alelický variant polypeptidu zvolený zo skupiny aminokyselinových sekvencii zahrňujúcich sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
6. 6. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50 % homológna s nukleotidovou sekvenciou zvolenou zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, alebo jej časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
7. 7. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahujúca najmenej 15 nukleotidový fragment nukleovej kyseliny obsahujúci nukleotidovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.

   161
8. 8. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá sa hybridizuje s molekulou nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 v stringentných podmienkach.
9. 9. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, vyznačujúca sa tým, že obsahuje molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 alebo jej časť a nukleotidovú sekvenciu, kódujúcu heterológny polypeptid.
10. 10. Vektor, obsahujúci molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9.
11. 11. Vektor podľa nároku 10, ktorý je expresným vektorom.
12. 12. Hostiteľská bunka transfekované s expresným vektorom podľa nároku 11.
13. 13. Hostiteľská bunka podľa nároku 12, kde uvedenou bunkou je mikroorganizmus.
14. 14. Hostiteľská bunka podľa nároku 13, kde uvedená bunka patrí do rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium.
15. 15. Hostiteľská bunka podľa nároku 12, kde expresiou uvedenej molekuly nukleovej kyseliny sa moduluje produkcia špeciálnej chemikálie z uvedenej bunky.
16. 16. Hostiteľská bunka podľa nároku 15, kde uvedená špeciálna chemikália je zvolená zo skupiny pozostávajúcej z organických kyselín, aminokyselín proteínového a neproteínového pôvodu, purínových a pyrimidínových báz, nukleozidov, nukleotidov, lipidov, nasýtených a nenasýtených mastných kyselín, diolov, sacharidov, aromatických zlúčenín, vitamínov, kofaktorov, polyketidov a enzýmov.
17. 17. Spôsob produkcie polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu hostiteľskej bunky podľa nároku 12, vo vhodnom kultivačnom médiu, pričom sa produkuje polypeptid.
18. 18. Izolovaný polypeptid metabolickej dráhy z Corynebacterium glutamicum, alebo jeho časť.
19. 19. Proteín podľa nároku 18, pričom uvedený polypeptid je zvolený zo skupiny proteínov metabolickej dráhy, ktoré sa zúčastňujú na metabolizme aminokyseliny, vitamínu, kofaktora, nutraceutika, nukleotidu, nukleozidu alebo trehalózy.

    162
20. 20. Izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
21. 21. Izolovaný polypetid obsahujúci prirodzene sa vyskytujúci alelický variant polypeptidu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, alebo jeho časť, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
22. 22. Izolovaný polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 21, ktorý ďalej obsahuje heterológne aminokyselinové sekvencie.
23. 23. Izolovaný polypeptid, ktorý je kódovaný molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50 % homológna s nukleovou kyselinou zvolenou zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiadne F-označené molekuly nukleovej kyseliny uvedené v tabuľke 1.
24. 24. Izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50 % homológna s aminokyselinovou sekvenciou zvolenou zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
25. 25. Spôsob produkcie špeciálnej chemikálie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu bunky obsahujúcej vektor podľa nároku 12, pričom sa produkuje špeciálna chemikália.
26. 26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob ďalej zahrňuje krok získania špeciálnej chemikálie z uvedenej kultúry.
27. 27. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob ďalej zahrňuje krok transfekcie uvedenej bunky s vektorom podľa nároku 11, pričom sa získa bunka obsahujúca uvedený vektor.

    163
28. 28. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená bunka patrí do rodov Corynebacterium alebo Brevibacterium.
29. 29. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená bunka je zvolená zo skupiny pozostávajúcej z Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitrilophilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium healii, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium paraffinolyticum, a tých kmeňov, ktoré sú uvedené v tabuľke 3.
30. 30. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že expresiou molekuly nukleovej kyseliny z uvedeného vektora sa moduluje produkcia uvedenej špeciálnej chemikálie.
31. 31. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená špeciálna chemikália je zvolená zo skupiny pozostávajúcej z organických kyselín, aminokyselín proteínového a neproteínového pôvodu, purínových a pyrimidínových báz, nukleozidov, nukleotidov, lipidov, nasýtených a nenasýtených mastných kyselín, diolov, sacharidov, aromatických zlúčenín, vitamínov, kofaktorov, polyketidov a enzýmov.
32. 32. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedenou špeciálnou chemikáliou je aminokyselina.
33. 33. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedená aminokyselina je zvolená zo skupiny zahrňujúcej lyzín, glutamát, glutamín, alanín, aspartát, glycín, serín, treonín, metionín, cysteín, valín, leucín, izoleucín, arginín, prolin, histidin, tyrozín, fenylalanín a tryptofán.
34. 34. Spôsob produkcie špeciálnej chemikálie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu bunky, ktorej genómová DNA sa zmenila inklúziou molekuly nukleovej kyseliny, podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9.
35. 35. Spôsob diagnostikovania prítomnosti alebo aktivity Corynebacterium diphtheriae v subjekte, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje detekciu prítomnosti

    164 jednej alebo viacerých sekvencií z1 až 1156 sekvencií SEQ ID NO v

    Sekvenčnom zázname v subjekte, pričom sekvencie nie sú alebo nie sú kódované žiadnou z F-označených sekvencií uvedených v tabuľke 1, čím sa diagnostikuje prítomnosť alebo aktivita Corynebacterium diphtheríae v subjekte.
36. 36. Hostiteľská bunka, obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú zo skupiny molekúl nukleových kyselín, ktoré sú uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny je porušená.
37. 37. Hostiteľská bunka obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú zo skupiny molekúl nukleových kyselín, ktoré sú uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny obsahuje jednu alebo viac nukleovokyselinových modifikácií sekvencií, ktoré sú uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname.
38. 38. Hostiteľská bunka obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú zo skupiny zahrňujúcej molekuly nukleových kyselín uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom regulačná oblasť molekuly nukleovej kyseliny je modifikovaná v porovnaní s regulačnou oblasťou “divého” typu molekuly.