SK18902001A3 - Gény Corynebacterium glutamicum kódujúce homeostázové a adaptačné proteíny - Google Patents

Description

-1 Gény Corynebacterium glutamicum kódujúce homeostázové a adaptačné proteíny

Príbuzné prihlášky

Táto prihláška si nárokuje prioritu z predošlej americkej predbežnej patentovej prihlášky č. 60/141031, podanej 25. júna 1999. Táto prihláška si taktiež nárokuje prioritu z predošlej nemeckej patentovej prihlášky č. 19931636.8, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932125.6, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky 19932126.4, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932127.2, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932128.0, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932129.9, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932226.0, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č.19932920.6, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932922.2, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č.19932924.9, podanej 14 júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č.19932928.1, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č.19932930.3, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č.19932933.8, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č.19932935.4, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č.19932973.7, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č.19933002.6, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č.19933003.4, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19933005.0, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky 19933006.9, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č.19941378.9, podanej 31. augusta 1999, nemeckej patentovej prihlášky

č.19941379.7, podanej 31. augusta 1999, nemeckej patentovej prihlášky

č.19941390.8, podanej 31. augusta 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19941391.6, podanej 31. augusta 1999 a nemeckej patentovej prihlášky č. 19942088.2, podanej 3. septembra 1999. Celý obsah všetkých vyššie uvedených prihlášok je tu týmto výslovne začlenený formou odkazu.

Oblasť techniky

Vynález sa týka génov Corynebacterium glutamicum kódujúce homeostázové a adaptačné proteíny.

-2Doteraiší stav techniky

Určité produkty a vedľajšie produkty prirodzených metabolických pochodov v bunkách majú široké priemyselné uplatnenie, vrátane potravinárskeho, krmovinárskeho, kozmetického a farmaceutického priemyslu. Do tejto skupiny molekúl súhrnne nazývaných ako špeciálne chemikálie („fine chemicals“) patria organické kyseliny, aminokyseliny proteínového, respektíve neproteínového pôvodu, nukleotidy a nukleozidy, lipidy a mastné kyseliny, dioly, sacharidy, aromatické zlúčeniny, vitamíny a kofaktory, a enzýmy. Ich produkcia sa najvhodnejšie uskutočňuje prostredníctvom veľkého počtu kultúr baktérií vyvinutých na výrobu asekréciu veľkého množstva jednej alebo viacerých požadovaných molekúl. Jedným predovšetkým vhodným organizmom na tieto účely je grampozitívna, nepatogénna baktéria Corynebacterium glutamicum. Pomocou kmeňovej selekcie sa vyvinulo mnoho mutantných kmeňov, ktoré produkujú veľký počet požadovaných zlúčenín. Avšak selekcia kmeňov so zvýšenou produkciou danej molekuly je časovo náročný a ťažký proces.

Podstata vynálezu

Predmetom predloženého vynálezu sú nové molekuly bakteriálnych nukleových kyselín, ktoré majú rôznorodé použitia. Tieto zahŕňajú identifikáciu mikroorganizmov, ktoré sa dajú využiť na produkciu špeciálnych chemikálií, na moduláciu produkcie špeciálnych chemikálií v C. glutamicum alebo v príbuzných baktériách, na klasifikáciu alebo identifikáciu C. glutamicum alebo príbuzných baktérií, ako referenčné body pri mapovaní genómu C. glutamicum a ako markéry transformácie. Tieto nové molekuly nukleových kyselín kódujú proteíny, označované v tomto dokumente ako homeostázové a adaptačné (HA) proteíny.

C. glutamicum je grampozitívna aeróbna baktéria, ktorá sa bežne používa na priemyselnú výrobu rôznych špeciálnych chemikálií vo veľkom rozsahu a tiež na degradáciu uhľovodíkov (ako napríklad v prípadoch ropných únikov) a na oxidáciu terpenoidov. Molekuly HA nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sa preto dajú využiť na identifikáciu mikroorganizmov, ktoré sa môžu použiť na produkciu špeciálnych chemikálií, napríklad pomocou fermentačných procesov. Modulácia expresie HA nukleových kyselín podľa tohto vynálezu alebo modifikácia sekvencie

-3HA molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sa môžu použiť na moduláciu produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z mikroorganizmov (napríklad na zlepšenie výťažku alebo produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z druhov Corynebacterium alebo Brevibacterium).

HA nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu, sa dajú tiež použiť na identifikáciu takého organizmu akým je Corynebacterium glutamicum alebo veľmi príbuzného druhu, alebo na identifikáciu prítomnosti C. glutamicum alebo príbuzného druhu v zmiešanej populácii mikroorganizmov. Vynález poskytuje sekvencie nukleových kyselín mnohých génov C. glutamicum. Skúmaním extrahovanej genómovej DNA jednej kultúry alebo zmiešanej populácie mikroorganizmov v stringentných podmienkach so zameraním sa na takú oblasť C. glutamicum génu, ktorá je charakteristická pre tento organizmus, sa dá zistiť, či je tento organizmus prítomný. Hoci Corynebacterium glutamicum samotná je nepatogénna, dáva sa do súvisu s takými humánnymi patogénnymi druhmi ako Corynebacterium diphtheriae (spôsobujúcimi záškrt); detekcia takýchto organizmov má signifikantný klinický význam.

Molekuly HA nukleových kyselín podľa predloženého vynálezu sú aj referenčnými bodmi pri mapovaní C. glutamicum genómu alebo genómov príbuzných organizmov. Podobne sú tieto molekuly alebo ich variantné formy alebo ich časti markérmi pri génových manipuláciách s druhmi Corynebacterium alebo Brevibacterium.

HA proteíny kódované novými molekulami nukleových kyselín, ktoré sú predmetom vynálezu, sú schopné fungovať napríklad pri udržaní homeostázy v C. glutamicum alebo zastávajú funkciu pri schopnosti tohto mikroorganizmu adaptovať sa na rôzne podmienky prostredia. Tým, že sa v Corynebacterium glutamicum môžu použiť klonovacie vektory, tak ako to opisujú Sinskey a kol. v americkom patentovom spise US 4,649,119, a metódy génovej manipulácie C. glutamicum a príbuzných druhov Brevibacterium (napr. lactofermentum) (Yoshihama a kol., J. Bacteriol. .162: 591-597 (1985); Katsumata a kol., J. Bacteriol. 159: 306- 311 (1984); aSantamaria a kol., J. Gen. Microbioi. 130: 2237-2246 (1984)), môžu sa molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu využiť pri génových manipuláciách tohto organizmu s cieľom zlepšiť alebo zefektívniť produkciu jednej

-4 alebo viacerých špeciálnych chemikálií. Zvýšená produkcia alebo účinnosť produkcie špeciálnych chemikálií sa dá dosiahnuť priamou manipuláciou s génom podľa tohto vynálezu, alebo sa to dosiahne nepriamym účinkom takejto manipulácie.

Existuje mnoho mechanizmov, pomocou ktorých sa zmenou HA proteínu podľa tohto vynálezu, môže priamo ovplyvniť výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie špeciálnej chemikálie z kmeňa C. glutamicum, a to inkorporáciou takéhoto zmeneného proteínu. Napríklad enzýmovou manipuláciou, ktorou sa modifikujú alebo degradujú aromatické a alifatické zlúčeniny tak, že sa zvyšuje alebo znižuje aktivita alebo množstvo týchto enzýmov, môže sa modulovať produkcia jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií, ktoré sú modifikačnými alebo degradačnými produktami týchto zlúčenín. Podobne, enzýmy zahrnuté do metabolizmu anorganických zlúčenín poskytujú kľúčové molekuly (napr. molekuly obsahujúce fosfor, síru a dusík) na biosyntézu takých špeciálnych chemikálií akými sú aminokyseliny, vitamíny a nukleové kyseliny. Menením aktivity alebo množstva týchto enzýmov v C. glutamicum (alebo použitím alternatívnych anorganických zlúčenín) sa zvýši premena týchto anorganických zlúčenín a tým sa zvýši rýchlosť inkorporácie anorganických atómov do týchto špeciálnych chemikálií. Génovou manipuláciou enzýmov C. glutamicum, ktoré sú zahrnuté v základných bunkových procesoch sa môže tiež priamo zvýšiť produkcia špeciálnych chemikálií, pretože mnohé z týchto enzýmov priamo modifikujú tieto špeciálne chemikálie (napr. aminokyseliny) alebo enzýmy, ktoré sú zapojené do syntézy špeciálnych chemikálií alebo ich sekrécie. Modulácia aktivity alebo množstva bunkových proteáz môže mať tiež priamy vplyv na produkciu špeciálnych chemikálií, pretože mnohé proteázy môžu degradovať špeciálne chemikálie alebo enzýmy podieľajúce sa na produkcii, resp. rozklade špeciálnych chemikálií.

Okrem toho vyššie spomínané enzýmy, ktoré sa zúčastňujú na aromaticko/alifatickej modifikácii zlúčenín alebo rozklade, vo všeobecnosti na biokatalýze, metabolizme anorganickej zlúčeniny alebo proteolýze sú vlastne špeciálne chemikálie, ktoré sú vhodné kvôli svojej aktivite na rôzne in vitro priemyselné aplikácie. Menením počtu kópií génu pre jeden alebo viac týchto enzýmov v C. glutamicum sa dá zvýšiť počet týchto proteínov produkovaných

-5bunkou, a tým aj zvýšiť možný výťažok alebo účinnosť produkcie týchto proteínov z mnohých C. glutamicum kultúr alebo príbuzných bakterálnych kultúr.

Premena HA proteínu podľa tohto vynálezu, môže tiež nepriamo vplývať na výťažok a/alebo na účinnosť produkcie špeciálnych chemikálií z kmeňa C. glutamicum, a to inkorporáciou takto zmeneného proteínu. Napríklad pomocou modulácie aktivity a/alebo počtu týchto proteínov podieľajúcich sa na tvorbe alebo prestavbe bunkovej steny sa dá modifikovať štruktúra samotnej bunkovej steny tak, že bunka je schopná lepšie odolávať mechanickým alebo iným stresom počas fermentačného procesu vo veľkom rozsahu. Okrem toho rast C. glutamicum vo veľkom rozsahu vyžaduje významnú produkciu bunkovej steny. Modulácia aktivity alebo počtu enzýmov podieľajúcich sa na biosyntéze alebo rozklade bunkovej steny dovoľuje väčšie rýchlosti biosyntézy bunkovej steny, ktoré umožnia zvýšenú rýchlosť rastu tohto mikroorganizmu pri kultivácii, a tým zvýšenie počtu buniek produkujúcich požadovanú špeciálnu chemikáliu.

Modifikovaním HA enzýmov podľa tohto vynálezu sa dá nepriamo ovplyvniť výťažok, produkcia alebo účinnosť produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z C. glutamicum. Napríklad mnohé základné enzýmy C. glutamicum môžu signifikantne vplývať na globálne bunkové procesy (napr. regulačné procesy), ktoré zase majú signifikantný vplyv na metabolizmus špeciálnych chemikálií. Podobne, proteázy, enzýmy, ktoré modifikujú alebo rozkladajú možné toxické aromatické alebo alifatické zlúčeniny a enzýmy, ktoré podporujú metabolizmus anorganických zlúčenín, zvyšujú životaschopnosť C. glutamicum. Pomocou proteáz sa dajú selektívne odstraňovať chybne poskladané alebo deregulované proteíny, ktoré sa môžu vyskytovať za relatívne stresových podmienok počas fermentácie kultúry vo veľkom rozsahu. Menením týchto proteínov je možné v ďalšom zvýšiť túto aktivitu a zlepšiť životaschopnosť kultúry C. glutamicum. Aromaticko/alifatickou modifikáciou alebo rozkladom proteínov sa nielenže detoxikujú také odpadové zlúčeniny, (ktoré môžu pochádzať zo znečistenia kultivačného média alebo sú odpadovými produktami samotných buniek), ale tiež umožňujú bunkám zužitkovať alternatívne zdroje uhlíka, ak optimálny zdroj uhlíka je limitujúcim pri kultivácii. Zvyšovaním ich počtu a/alebo aktivity sa prežitie C. glutamicum buniek pri kultivácii môže zvýšiť. Anorganický metabolizované proteíny podľa tohto vynálezu zásobujú

-6bunky anorganickými molekulami potrebnými (okrem ostatných syntéz) na všetky syntézy proteínov a nukleotidov, čo je kritické pre celkovú životaschopnosť bunky. Zvýšenie počtu životaschopných buniek produkujúcich jednu alebo viac požadovaných špeciálnych chemikálií pri kultivácii vo veľkom rozsahu by malo súbežne poskytnúť zvýšený výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie špeciálnych chemikálií pri kultivácii.

Vynález poskytuje nové molekuly nukleových kyselín kódujúce proteíny, ktoré sa v tomto dokumente označujú ako HA proteíny; tieto sú napríklad schopné fungovať pri udržaní homeostázy v C. glutamicum alebo sa podieľajú na schopnosti tohto organizmu adaptovať sa na rôzne podmienky prostredia. Molekuly nukleových kyselín kódujúce HA proteín sa v tomto dokumente označujú ako HA molekuly nukleových kyselín. Vo výhodnom uskutočnení sa HA proteín zúčastňuje na biosyntéze bunkovej steny C. glutamicum alebo jej prestavbe, metabolizme anorganických zlúčenín, modifikácii alebo degradácii aromatických alebo alifatických zlúčenín alebo má C. glutamicum enzýmovú alebo proteolytickú aktivitu. Príkladmi takýchto proteínov sú tie, ktoré sú kódované génmi uvedenými v tabuľke 1.

Vynález sa ďalej týka molekúl izolovaných nukleových kyselín (napr. cDNA, DNA alebo RNA) s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou HA proteín alebo jeho biologicky aktívne časti, ako aj fragmentov nukleových kyselín, ktoré sú vhodnými primérmi alebo hybridizačnými sondami na určenie alebo amplifikáciu HA kódujúcich nukleových kyselín (napr. DNA alebo mRNA). V predovšetkým výhodných uskutočneniach obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny jednu z nukleotidových sekvencií, ktorá je uvedená s nepárne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname (Sequence Listing) (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ....) alebo kódujúcu oblasť alebo komplementárny úsek jednej z týchto nukleotidových sekvencií. V ďalších predovšetkým výhodných uskutočneniach obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu nukleotidovú sekvenciu, ktorá sa hybridizuje na alebo je najmenej asi na 50 %, výhodne najmenej asi na 60 %, výhodnejšie najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % alebo dokonca výhodnejšie na najmenej 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológna s nukleotidovou sekvenciou uvedenou s

-7nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7) alebo jej časťou. V iných výhodných uskutočneniach kóduje molekula izolovanej nukleovej kyseliny jednu z aminokyselinových sekvencií uvedených s párne očíslovanými SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname napr. (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8). Výhodne majú HA proteíny, podľa tohto vynálezu, aspoň jednu z HA aktivít opísaných v tomto dokumente.

V ďalšom uskutočnení kóduje molekula izolovanej nukleovej kyseliny proteín alebo jeho časť, pričom proteín alebo jeho časť obsahuje takú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. takou, ktorá má párne očíslovanú sekvenciu SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), ktorá je napr. dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou vynálezu tak, že proteín alebo jeho časť si udržuje HA aktivitu. Proteín kódovaný molekulou nukleovej kyseliny alebo jeho časť si výhodne zachováva schopnosť podieľať sa na udržaní homeostázy v C. glutamicum alebo funguje v adaptačnom procese tohto mikroorganizmu na rôzne podmienky prostredia. V jednom uskutočnení je proteín kódovaný molekulou nukleovej kyseliny najmenej asi na 50 %, výhodne asi na 60 %, predovšetkým výhodne asi na 70 %, 80 % alebo 90 % a najvýhodnejšie asi najmenej na 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s celou sekvenciou aminokyselín zvolenou zo sekvencií s párnym poradovým číslom v Sekvenčnom zázname). V inom výhodnom uskutočnení má proteín úplnú dĺžku proteínu C. glutamicum, ktorá je v podstate homológna s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (kódovanou systémom otvoreného čítania súboru uvedeného v príslušnom Sekvenčnom zázname s nepárne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO:ktorá je (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7).

V ďalšom výhodnom uskutočnení je molekula izolovanej nukleovej kyseliny odvodená z C. glutamicum a kóduje proteín (napr. HA fúzny proteín), ktorý obsahuje biologicky aktívnu oblasť, ktorá je najmenej asi na 50 % alebo viac homológna s jednou z aminokyselinových sekvencií, podľa tohto vynálezu, (napr. s jednou z aminokyselinových sekvencií s párnym očíslovaním SEQ ID NO:

v Sekvenčnom zázname) a je schopná zúčastňovať sa na reparácii alebo rekombinácii DNA, transpozícii genetického materiálu, génovej expresii (t.j. procesoch transkripcie alebo translácie), proteínového skladania alebo na sekrécii proteínu v Corynebacterium glutamicum alebo má jednu alebo viac aktivít, ktoré sú uvedené v tabuľke 1, a ktoré tiež obsahujú heterológne sekvencie nukleových kyselín kódujúcich heterológne polypeptidové alebo regulačné oblasti.

V ďalšom uskutočnení má izolovaná molekula nukleovej kyseliny dĺžku aspoň 15 nukleotidov a hybridizuje sa v stringentných podmienkach s molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu podľa tohto vynálezu (napr. so sekvenciou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). Výhodne sa izolovaná molekula nukleovej kyseliny zhoduje s prirodzene sa vyskytujúcou molekulou nukleovej kyseliny. Ešte výhodnejšie usporiadanie je také, v ktorom izolovaná nukleová kyselina kóduje prirodzene sa vyskytujúci HA proteín C. glutamicum alebo jeho biologicky aktívnu časť.

Vynález sa ďalej týka vektorov, napr. rekombinantných expresných vektorov obsahujúcich molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, a hostiteľských buniek, do ktorých sa tieto vektory zaviedli. V jednom uskutočnení sa takáto hostiteľská bunka použila na produkciu HA proteínu, a to kultiváciou hostiteľskej bunky vo vhodnom médiu. HA proteín sa potom môže izolovať z média alebo z hostiteľskej bunky.

Vynález sa ďalej ešte týka geneticky zmeneného mikroorganizmu, do ktorého sa zaviedol HA gén alebo ktorý sa modifikoval. V jednom uskutočnení sa zmenil genóm mikroorganizmu zavedením molekuly nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, kódujúcej „divý“ druh sekvencie alebo zmutovanej HA sekvencie ako transgénu. V ďalšom uskutočnení bol endogénny HA gén v rámci genómu mikroorganizmu zmenený, napr. funkčne narušený homológnou rekombináciou so zmeneným HA génom. V ďalšom uskutočnení sa endogénny alebo zavedený HA gén v mikroorganizme menil mutáciami, deléciami alebo inverziami v jednom alebo viacerých bodoch, ale stále kódoval funkčný HA proteín. V ešte ďalšom uskutočnení sa jedna alebo viac regulačných oblastí (napr. promótor, represor alebo induktor) HA génu v mikroorganizme menila (napr. deléciou, trunkáciou, inverziou alebo bodovou mutáciou) tak, že expresia HA génu sa modulovala. Vo

-9výhodnom uskutočnení patrili mikroorganizmy do rodu Corynebacterium alebo

Brevibacterium, pričom Corynebacterium glutamicum bol predovšetkým výhodný.

Vo výhodnom uskutočnení sa mikroorganizmus tiež použil na produkciu požadovanej zlúčeniny, napríklad aminokyseliny, predovšetkým výhodne lyzínu.

Vynález sa ďalej týka spôsobu na identifikáciu prítomnosti alebo aktivity Corynebacterium diphteriae v subjekte. Tento spôsob sa týka detekcie jednej alebo viacerých sekvencií nukleových kyselín alebo aminokyselín podľa tohto vynálezu (napr. sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname ako SEQ ID NO: 1 až 440) v subjekte, čím sa deteguje prítomnosť alebo aktivita Corynebacterium diphteriae v subjekte.

Vynález sa ešte ďalej týka izolovaného HA proteínu alebo jeho časti, napr. jeho biologicky aktívnej časti. Vo výhodnom uskutočnení sa izolovaný HA proteín alebo jeho časť môžu podieľať na udržaní homeostázy v C. glutamicum, alebo môžu byť funkčné v adaptácii tohto mikroorganizmu na rôzne podmienky prostredia. V inom výhodnom uskutočnení je izolovaný HA proteín alebo jeho časť dostatočne homológny s aminokyselinovou sekvenciou vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), takže proteín alebo jeho časť sú schopné podieľať sa na udržiavaní homeostázy v C. glutamicum, alebo sú funkčné v adaptácii tohto mikroorganizmu na rôzne podmienky prostredia.

Vynález tiež poskytuje izolovaný preparát HA proteínu. Vo výhodných uskutočneniach obsahuje HA proteín aminokyselinovú sekvenciu vynálezu (napr. sekvenciu s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V inom výhodnom uskutočnení sa vynález týka celej dĺžky izolovaného proteínu, ktorý je v podstate homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) (ktorá je kódovaná otvoreným systémom čítania prislúchajúcou SEQ ID NO: uvedenou s nepárnym očíslovaním v Sekvenčnom zázname). V ešte inom uskutočnení je proteín najmenej asi na 50 %, výhodne najmenej asi na 60% a výhodnejšie najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % a najvýhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológny s úplnou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. so sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V iných uskutočneniach má izolovaný HA proteín

-10aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je homológna najmenej na 50 % alebo viac s aminokyselinovými sekvenciami podľa tohto vynálezu (napr. so sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) a je schopný podieľať sa na udžiavaní homeostázy v C. glutamicum alebo je funkčný v procese adaptácie tohto mikroorganizmu na rôzne podmienky prostredia alebo má jednu alebo viac aktivít, ktoré sa uvádzajú v tabuľke 1.

Alternatívne môže izolovaný HA proteín obsahovať takú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach alebo je najmenej asi na 50 %, výhodne najmenej asi na 60 % a výhodnejšie najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % a dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológne s jednou nukleotidovou sekvenciou zo súboru s párne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname. Je tiež výhodné, že výhodné formy HA proteinov majú tiež jednu alebo viac HA bioaktivít, ktoré sa uvádzajú v tomto dokumente.

HA polypeptid alebo jeho biologicky aktívna časť sa môže účinne spojiť s polypeptidom, ktorý nemá HA aktivitu za vzniku fúzneho proteínu. Vo výhodných uskutočneniach má tento fúzny proteín odlišné aktivity v porovnaní so samotným HA proteínom. V ďalších výhodných uskutočneniach sa tento fúzny proteín zúčastňuje na udržaní homeostázy v C. glutamicum alebo je funkčný v procese adaptácie tohto mikroorganizmu na rôzne podmienky prostredia. V predovšetkým výhodných uskutočneniach sa integrovaním tohto fúzneho proteínu do hostiteľskej bunky moduluje produkcia požadovanej zlúčeniny bunkou.

Vynález sa ďalej týka spôsobu skríningu molekúl, ktoré modulujú aktivitu HA proteínu buď pomocou interakcie so samotným proteínom alebo substrátom alebo väzobným partnerom HA proteínu alebo pomocou modulácie transkripcie alebo translácie molekuly HA nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu.

Vynález sa ďalej týka spôsobu produkcie špeciálnej chemikálie. Tento spôsob spočíva v kultivácii bunky obsahujúcej vektor, ktorý riadi expresiu molekuly HA nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu tak, aby sa produkovala špeciálna chemikália. Vo výhodnom uskutočnení sa táto metóda v ďalšom týka postupu

-11 získania bunky obsahujúcej takýto vektor, pričom pri tomto spôsobe sa bunka transfekuje s vektorom riadiacim expresiu HA nukleovej kyseliny. V inom výhodnom uskutočnení zahŕňa okrem toho táto metóda postup získavania špeciálnej chemikálie z kultúry. V predovšetkým výhodnom uskutočnení sa použila bunka rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium, alebo sa vybrala z kmeňov, ktoré sú uvedené v Tab. 3.

Vynález sa ďalej týka spôsobov modulovania produkcie molekuly z mikroorganizmu. Takéto spôsoby zahŕňajú spôsoby kontaktovania bunky sagensom, ktorý moduluje aktivitu HA proteínu alebo expresiu HA nukleovej kyseliny tak, že bunková aktivita sa mení v porovnaní s rovnakou aktivitou v neprítomnosti agensa. Vo výhodnom uskutočnení sa bunka moduluje jedným alebo viacerými procesmi zahrnutými do biosyntézy bunkovej steny alebo jej prestavby, metabolizmu anorganických zlúčenín, modifikácie alebo degradácie aromatických alebo alifatických zlúčenín alebo enzýmovými alebo proteolytickými aktivitami. Agensom, ktorý moduluje aktivitu HA proteínu môže byť agens, ktorý stimuluje aktivitu HA proteínu alebo expresiu HA nukleovej kyseliny. Príkladmi agensov, ktoré stimulujú aktivitu HA proteínu alebo expresiu HA nukleovej kyseliny sú malé molekuly, aktívne HA proteíny a nukleové kyseliny kódujúce HA proteíny, ktoré boli zavedené do bunky. Príkladmi agensov, ktoré inhibujú HA aktivitu alebo expresiu sú malé molekuly a nezmyselné (antisense) molekuly HA nukleovej kyseliny.

Vynález sa ďalej týka spôsobov modulovania výťažkov požadovanej zlúčeniny z bunky, medzi ktoré patrí zavádzanie „divého“ alebo mutovaného typu HA génu do bunky buď udržiavaného na separátnom plazmide alebo integrovaného do genómu hostiteľskej bunky. Pri integrácii do genómu môže nastať náhodná integrácia alebo homológna rekombinácia, takže natívny gén sa nahradí zavedenou kópiou a spôsobí produkciu požadovanej zlúčeniny bunkou, ktorá sa má modulovať. Vo výhodnom uskutočnení sú vyššie spomínané výťažky zvýšené. V inom výhodnom uskutočnení sú vyššie uvedenými chemikáliami špeciálne chemikálie. V predovšetkým výhodnom uskutočnení sú vyššie uvedenými špeciálnymi chemikáliami aminokyseliny. V obzvlášť výhodných uskutočneniach je uvedenou aminokyselinou L-lyzín.

-12Podrobný opis vynálezu

Predložený vynález poskytuje HA nukleovokyselinové a proteínové molekuly, ktoré sú zapojené do C. glutamicum biosyntézy bunkovej steny alebo prestavby bunkovej steny, do metabolizmu anorganických zlúčenín, modifikácie alebo degradácie aromatických alebo alifatických zlúčenín alebo majú C. glutamicum enzýmovú alebo proteolytickú aktivitu. Molekuly podlá tohto vynálezu, sa môžu využiť pri modulácii produkcie špeciálnych chemikálií z takých mikroorganizmov ako C. glutamicum buď priamo (napr. keď nadmerné exprimovanie alebo optimalizácia aktivity proteínu zapojeného do produkcie špeciálnych chemikálií (napr. enzýmu) má priamy účinok na výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie špeciálnych chemikálií z modifikovanej C. glutamicum) alebo nepriamym účinkom, ktorý i napriek tomu zvyšuje výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie požadovanej zlúčeniny (napr. tam, kde modulácia aktivity alebo počtu kópií C. glutamicum aromatickej alebo alifatickej modifikácie alebo degradácie proteínu má za následok zvýšenie životaschopnosti buniek C. glutamicum, ktoré naopak umožňujú zvýšenú produkciu pri kultivácii vo veľkom rozsahu). Aspekty vynálezu sú vysvetlené v dálšom texte.

I. Špeciálne chemikálie

Pojem „špeciálne chemikálie“ je zaužívaný technický pojem a zahŕňa molekuly produkované organizmom, ktoré majú rôznorodé priemyselné použitia, v takých priemyselných odvetviach, ale nielen v nich, akými sú farmaceutický, poľnohospodársky a kozmetický priemysel. Tieto zlúčeniny zahŕňajú také organické kyseliny, ako kyselinu vínnu, kyselinu itakonovú a kyselinu diaminopimelovú, aminokyseliny aj proteínového aj neproteínového pôvodu, purínové a pyrimidínové bázy, nukleozidy a nukleotidy (ako sa to opisuje napr. v Kuninaka, A. (1966), Nucleotides and related compounds, str. 561-612, v Biotechnology vol. 6, Rehm a kol., eds. VCH, Weinheim a v odkazoch tam uvedených), lipidy, nasýtené aj nenasýtené mastné kyseliny (napr. kyselinu arachidonovú), dioly (napr. propándiol a butándiol), sacharidy (napr. kyselinu hyalurónovú a trehalózu), aromatické zlúčeniny (napr. aromatické amíny, vanilín a indigo), vitamíny akofaktory (podľa opisu v Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, „Vitamins“, str.. 443-613 (1996) VCH, Weinheim a v odkazoch tam uvedených a v Ong, A.S., Niki,

-13Ε.& Packer, L. (1995) „Nutrition, Lipids, Health and Disease“ Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and Society for Free Radical Research - Asia, konanej 1.-3. septembra 1994 v Penang, Malajzia, AOCS Press, (1995)), enzýmy, polyketidy (Čane a kol., (1998) Science 282. 63-68) a všetky ďalšie chemikálie opísané v Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN, 0818805086 a v odkazoch tam uvedených. Metabolizmus a použitie určitých špeciálnych chemikálií sú vysvetlené v ďalšom texte.

A. Metabolizmus aminokyselín a použitia

Základnými štruktúrnymi jednotkami všetkých proteínov sú aminokyseliny a ako také sú esenciálne pre normálnu bunkovú činnosť vo všetkých organizmoch. Pojem „aminokyselina“ je zaužívaný technický pojem. Aminokyseliny proteínového pôvodu, ktorých je 20 druhov, sú štrukturálnymi jednotkami proteínov, v ktorých sú viazané peptidovými väzbami, kým aminokyseliny neproteínového pôvodu (ktorých sú známe stovky) sa spravidla nevyskytujú vproteínoch (pozri Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol.. A2, str. 57-97 VCH, Weinheim (1985)). Aminokyseliny môžu byť v D- alebo L- optickej konfigurácii, i keď L- aminokyseliny sú vo všeobecnosti jediný druh, ktorý sa zistil v prirodzene sa vyskytujúcich proteínoch. Biosyntetické a degradačné cesty každej z 20 aminokyselín proteínového pôvodu sú dobre známe v prokaryotických, ako aj v eukaryotických bunkách (pozri napr. Stryer, L. Biochemistry, 3. vydanie, strany 578-590 (1988)). „Esenciálne“ aminokyseliny (histidín, izoleucín, leucín, lyzín, metionín, fenylalanín, treonín, tryptofán a valín), ktoré sú takto nazvané, pretože sú obvykle nutritívnou požiadavkou z dôvodu zložitosti ich biosyntéz, sa ľahko jednoduchými biosyntetickými cestami menia na ostatných 11 „neesenciálnych aminokyselín“ (alanín, arginín, asparagín, aspartát (kyselina asparágová), cysteín, glutamát (kyselina glutámová), glutamín, glycín, prolín, serín a tyrozín). Vyššie živočíchy si udržiavajú schopnosť syntetizovať niektoré z týchto aminokyselín, ale esenciálne aminokyseliny sa musia dodať výživou, aby mohla prebiehať normálna biosyntéza. proteínov.

Bez ohľadu na ich funkciu v biosyntéze proteínov, sú tieto aminokyseliny zaujímavé chemikálie so sebe vlastnými schopnosťami a mnohé našli uplatnenie

- 14v rôznych aplikáciách v potravinárskom, krmovinárskom, kozmetickom, poľnohospodárskom a farmaceutickom priemysle. Lyzín je dôležitá aminokyselina nielen vo výžive ľudí, ale aj monogastrických živočíchov ako hydiny a ošípaných. Glutamát sa najčastejšie používa ako chuťová prísada (glutamát sodný, MSG) a vo veľkom rozsahu sa v rámci potravinárskeho priemyslu používa aj aspartát, fenylalanín, glycín a cysteín. Glycín, L-metionín a aj tryptofán sa využívajú vo farmaceutickom priemysle. Glutamín, valín, leucín, izoleucín, histidín, arginín, prolín, serín aalanín sa používajú aj vo farmaceutickom aj v kozmetickom priemysle. Treonín, tryptofán a D/L-metionín sú bežnými kŕmnymi aditívami (Leuchtenberger, W. (1996) Amino aids - technical production and use, str. 466502 v Rehm a kol. (eds.) Biotechnology vol. 6, chapter 14a, VCH, Weinheim), Okrem toho sa zistilo, že tieto aminokyseliny sú vhodnými prekurzormi na syntézu syntetických aminokyselín a proteínov, ako N-acetylcysteínu, S-karboxymetyl-Lcysteínu, (S)-5-hydroxytryptofánu a ďalších opísaných v Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, str.. 57-97, VCH, Weinheim, 1985.

Biosyntéza týchto prírodných aminokyselín takými organizmami schopnými ich produkcie ako sú baktérie, je dobre známa, (pozri prehľad o bakteriálnej biosyntéze aminokyselín a jej regulácii Umbarger, H. E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47, 533-606). Glutamát sa syntetizuje redukčnou amináciou a-ketoglutarátu, medziproduktu v cykle kyseliny citrónovej. Glutamín, aj prolín a arginín vznikajú potom z glutamátu. Biosyntéza serínu je trojkrokový proces, ktorý sa začína od 3fosfoglycerátu (medziproduktu pri glykolýze) a končí sa touto aminokyselinou po kroku oxidácie, transaminácie a hydrolýzy. Aj cysteín aj glycín vznikajú zo serínu; cysteín kondenzáciou homocysteínu so serínom a glycín prenosom bočného reťazca β-uhlíkového atómu na tetrahydrofolát reakciou, ktorú katalyzuje seríntranshydroxymetyláza. Fenylalanín atyrozín sa syntetizujú z glykolytických a pentózofosfátových prekurzorov erytrózo-4-fosfátu a fosfoenolpyruvátu 9krokovou biosyntetickou cestou, ktorá sa líši len v konečných dvoch krokoch po syntéze prefenátu. Tryptofán vzniká tiež z týchto dvoch počiatočných molekúl, ale jeho syntéza je 11-kroková cesta. Tyrozín sa môže tiež syntetizovať z fenylalanínu reakciou, ktorú katalyzuje fenylalanínhydroxyláza. Alanín, valín a aj leucín sú biosyntetické produkty pyruvátu, konečného produktu glykolýzy. Aspartát vzniká z oxalacetátu, medziproduktu cyklu kyseliny citrónovej. Asparagín, metionín,

-15treonín a aij lyzín vznikajú konverziou aspartátu. Izoleucín vzniká z treonínu. Zložitá

9-kroková cesta končí vznikom histidínu z 5-fosforibozyl-1-pyrofosfátu, aktivovaného sacharidu.

Viac aminokyselín ako je potrebných na syntézu proteínov sa nemôže uchovávať v bunke a namiesto toho sa degradujú, pričom poskytujú medziprodukty pre hlavné metabolické dráhy bunky (pozri prehľad Stryer, L. Biochemistry 3. ed., Ch. 21 .Amino Acid Degradation and Urea Cycle“str. 495-516 (1988)). Hoci bunka je schopná premieňať nežiaduce aminokyseliny na užitočné metabolické medziprodukty, je produkcia aminokyselín z energetického hľadiska náročná, vyžaduje prekurzorové molekuly a enzýmy na ich syntézu. Tak nie je prekvapujúce, že biosyntéza aminokyselín je regulovaná inhibíciou spätnou väzbou, pri ktorej prítomnosť určitej aminokyseliny spôsobí spomalenie alebo celkom zastavenie jej produkcie (pozri súhrn o mechanizmoch spätnej väzby v aminokyselinových biosyntetických dráhach v Stryer, L. Biochemistry, 3. ed. Ch. 24: Biosynthesis of Amino Acids and Heme“str. 575-600 (1988)). Tak produkcia každej jednotlivej aminokyseliny je ohraničená množstvom tej aminokyseliny, ktorá je prítomná v bunke.

B. Metabolizmus vitamímov, kofaktorov a „nutraceutík a použitia

Vitamíny, kofaktory a nutraceutiká predstavujú ďalšiu skupinu molekúl, ktorých schopnosť syntézy vyššie živočíchy stratili, atak sa musia prijímať potravou, i keď iné organizmy, napríklad baktérie, ich ľahko syntetizujú. Tieto molekuly sú buď bioaktívnymi substanciami, alebo sú prekurzormi biologicky aktívnych látok, ktoré sú prenášačmi elektrónov alebo sú to medziprodukty v rozmanitých metabolických dráhach. Okrem ich nutritívnej hodnoty majú tieto zlúčeniny tiež signifikantnú priemyselnú hodnotu ako farbivá, antioxidanty a katalyzátory alebo iné technologické pomocné látky. (Pozri napr. súhrn o štruktúre, aktivite a priemyselných aplikáciách týchto zlúčenín v Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, „Vitamins“ vol. A27, str. 443-613, VCH, Weinheim, 1966). Pojem „vitamín“ je zaužívaný technický pojem a zahŕňa živiny, ktoré organizmus potrebuje na normálne fungovanie, ale ktoré si organizmus nevie sám syntetizovať. Do skupiny vitamínov možno zahrnúť kofaktory a nutraceutické zlúčeniny. Pojem „kofaktor“ predstavuje zlúčeniny neproteínového pôvodu, ktoré sú

-16potrebné na normálnu enzymatickú aktivitu. Tieto zlúčeniny môžu byť organické alebo anorganické; kofaktorové molekuly v predloženom vynáleze sú výhodne organické. Pojem „nutraceutikum“ zahŕňa potravinové doplnky, ktoré majú užitočný vplyv na zdravotný stav rastlín, zvierat a hlavne ľudí. Príkladmi takýchto molekúl sú vitamíny, antioxidanty a tiež niektoré lipidy (napr. polynenasýtené mastné kyseliny).

Biosyntéza týchto molekúl v organizmoch, ktoré sú schopné ich produkcie, napríklad v baktériách, je zoširoka opísaná (Ullman 's Encyclopedia of Industrial Chemistry, „Vitamins“ vol. A27,str. 443-613, VCH, Weinheim, 1966; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways, An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A. S., Niki, E & Packer, L (1995) „Nutrition, Lipids, Health and Disease“ Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research - Asia, konanej 1.- 3. septembra 1994 v Penang, Malajzia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S).

Tiamín (vitamín B,) sa tvorí chemickým viazaním podielov pyrimidínu atiazolu. Riboflavín (vitamín BJ sa syntetizuje z guanozín-5'-trifosfátu (GTP) a ribózo-5'-fosfátu. Samotný riboflavín sa využíva na syntézu flavínmononukleotidu (FMN) aflavínadeníndinukleotidu (FAD). Rodina zlúčenín so spoločným názvom „vitamín“ B₆ (napr. pyridoxín, pyridoxamín, pyridoxal-5'-fosfát a komerčne používaný pyridoxín hydrochlorid) sú všetko deriváty spoločnej štruktúrnej jednotky, 5-hydroxy-6-metylpyridínu. Pantotenát (kyselina pantoténová, (R)-(+)-N-(2,4dihydroxy-3,3-dimetyl-1-oxobutyl)-p-alanín) sa môže vyrábať buď chemickou syntézou alebo fermentačne. Konečné kroky pri biosyntéze kyseliny pantoténovej pozostávajú z ATP-riadenej kondenzácie β-alanínu a kyseliny pantoovej. Enzýmy zodpovedné za biosyntetické kroky konverzie na kyselinu pantoovú, β-alanín a za kondenzáciu na kyselinu pantoténovú sú známe. Metabolický aktívna forma pantotenátu je koenzým A, ktorého biosyntéza je 5 krokový enzymatický postup. Pantotenát, pyridoxal-5'-fosfát, cysteín a ATP sú prekurzory koenzýmu A. Tieto enzýmy, nielenže katalyzujú tvorbu kyseliny pantoténovej, ale tiež produkujú (R)pantoovú kyselinu, (R)-pantolaktón, (R)-pantenol (provitamín B_§.), pantoteín (a jeho deriváty) a koenzým A.

-17Biosyntéza biotínu z prekurzorovej molekuly pimeloyl-CoA v mikroorganizmoch sa detailne študovala a identifikovali sa niektoré gény zapojené do tohto procesu. Zistilo sa, že mnohé príslušné proteíny sú zapojené do syntézy Fe-clasteru a sú členmi nifS triedy proteínov. Kyselina lipoová je odvodená z kyseliny oktánovej a je koenzýmom v energetickom metabolizme, ktorý je súčasťou pyruvátdehydrogenázového komplexu a a-ketoglutarátdehydrogenázového komplexu. Foláty sú skupinou látok, ktoré sú všetky derivátmi kyseliny listovej, ktorá je samotná odvodená z kyseliny L- glutámovej, p-aminobenzoovej kyseliny a 6-metylpterínu. Biosyntéza kyseliny listovej a jej derivátov začínajúca sa od metabolických medziproduktov guanozín-5'-trifosfátu (GTP), kyseliny Lglutámovej a kyseliny p-aminobenzoovej sa podrobne skúmala v určitých mikroorganizmoch.

Korinoidy (ako kobalamíny a predovšetkým vitamín B₁₂) a porfyríny patria do skupiny chemikálií vyznačujúcich sa tetrapyrolovým kruhovým systémom. Biosyntéza vitamínu B,₂ je tak zložitá, že nie je úplne charakterizovaná, ale mnohé enzýmy a substráty zapojené do biosyntézy sú už známe. Kyselina nikotínová (nikotinát) a nikotínamid sú pyridínové deriváty, ktoré sa tiež označujú ako „niacín“. Niacín je prekurzorom dôležitých koenzýmov NAD (nikotínamidadeníndinukleotidu) a NADP (nikotínamidadeníndinukleotidfosfátu) a ich redukovaných foriem.

Výroba týchto chemikálií vo veľkom rozsahu je väčšinou odkázaná na bezbunkové chemické syntézy, i keď niektoré tieto chemikálie, ako riboflavín, vitamín B₆, pantotenát a biotín, sa tiež vyrobili kultiváciou mikroorganizmov vo veľkom rozsahu. Len vitamín B₁₂ sa vyrába výhradne fermentačne, a to kvôli zložitosti jeho syntézy. In vitro metodológie vyžadujú značné materiálové vstupy a čas, často pri vysokých nákladoch.

C. Metabolizmus purínov, pyrimidínov, nukleozidov a nukleotidov a použitia

Gény metabolizmu purínov a pyrimidínov a im prislúchajúce proteíny sú významými cieľmi terapie nádorových ochorení a vírusových infekcií. Pojem „purín alebo pyrimidín“ označuje dusíkaté bázy, ktoré sú zložkami nukleových kyselín, koenzýmov a nukleotidov. Názov „nukleotid“ zahrňuje základné štruktúrne jednotky molekúl nukleových kyselín, ktoré pozostávajú z dusíkatej bázy, pentózového

-18sacharidu (v prípade RNA je sacharidom ribóza; v prípade DNA je sacharidom Ddeoxyribóza) a kyseliny fosforečnej. Pojem „nukleozid“ zahŕňa molekuly, ktoré sú prekurzormi nukleotidov, ale ktoré neobsahujú ako zložku kyselinu fosforečnú, túto majú nukleotidy. Inhibovaním biosyntézy týchto molekúl, alebo ich aktivovaním na tvorbu molekúl nukleových kyselín, je možné inhibovať syntézu RNA a DNA; inhibovaním tejto aktivity spôsobom cieleným na karcinogénne bunky sa môže inhibovať schopnosť nádorových buniek deliť sa a replikovať sa. Navyše sú to nukleotidy, ktoré nevytvárajú molekuly nukleových kyselín, ale skôr fungujú ako energetické zásoby (t.j. AMP) alebo ako koenzýmy (t.j. FAD a NAD).

Niekoľko publikácií opisuje použitie týchto chemikálií na lekárske indikácie pomocou ovplyvňovania purínového a/alebo pyrimidínového metabolizmu (napr. Christopherson, R. I. and Lyons, S. D. (1990) „Potení inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents“ Med. Res. Reviews, 10, 505-548). Výskumy enzýmov zahrnutých do purínového a pyrimidínového metabolizmu sa zamerali na vývoj nových liečiv, ktoré by sa mohli použiť napríklad ako imunosupresíva alebo antiproliferatiká (Smith, J. L., (1995) „Enzymes in nucleotide synthesis“ Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 752-757; (1995) Biochem Soc. Transact. 23, 877-902). Avšak purínové a pyrimidínové bázy, nukleozidy a nukleotidy majú ďalšie využitia: ako medziprodukty pri biosyntéze viacerých špeciálnych chemikálií (napr. tiamínu, S-adenozyl-metionínu, folátov alebo riboflavínu), ako bunkové energetické prenášače (napr. ATP alebo GTP) a ako samotné chemikálie sa bežne používajú ako prostriedky na zvýraznenie chuti a vône (napr. IMP alebo GMP) alebo vo viacerých lekárskych aplikáciách (pozri napr. Kunianaka, A. (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology, vol.6, Rehm a kol., VCH, Weiheim, str. 561-612). Taktiež enzýmy, podieľajúce sa na metabolizme purínov, pyrimidínov, nukleozidov alebo nukleotidov čoraz viac slúžia ako ciele, proti ktorým boli vyvinuté chenikálie na ochranu poľnohospodárskych plodín ako fungicídy, herbicídy a insekticídy.

Metabolizmus týchto zlúčenín sa charakterizoval v baktériách (pozri napr. prehľad Zalkin, H. and Dixon, J. E. (1992) „de novo purine nucleotide biosynthesis“, v Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, vol. 42, Academic Press, str. 259-287; a Michal, G. (1999) „Nucleotides and Nucleosides“, Chapter 8

-19v Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York). Purínový metabolizmus bol predmetom intenzívneho výskumu a je esenciálny pre normálne fungovanie bunky. Oslabený purínový metabolizmus môže u vyšších živočíchov spôsobovať závažné choroby, ako napríklad dnu. Purínové nukleotidy sa syntetizujú z ribózo-5-fosfátu sériovými krokmi cez medziproduktovú zlúčeninu inozín-5'-fosfát (IMP), končiacimi vznikom guanozín-5'-monofosfátu (GMP) alebo adenozín-5'-monofosfátu (AMP), z ktorých sa ľahko vytvárajú trifosfátové formy využiteľné ako nukleotidy. Tieto zlúčeniny sa tiež využívajú ako energetické zdroje, pretože ich degradácia poskytuje energiu pre mnoho rôznych biochemických procesov v bunke. Biosyntéza pyrimidínov pokračuje tvorbou uridín5'-monofosfátu (UMP) z ribózo-5'-fosfátu. UMP sa zase premení na cytidín-5'trifosfát (CTP). Deoxyformy všetkých týchto nukleotidov vznikajú jednokrokovou redukčnou reakciou z difosfátribózovej formy nukleotidu na difosfátdeoxyribózovú formu nukleotidu. Na základe fosforylácie sú tieto molekuly schopné podieľať sa na syntéze DNA.

D. Metabolizmus trehalózy a použitia

Trehalóza pozostáva z dvoch glukózových molekúl spojených α,α-1,1väzbou. Zvyčajne sa používa v potravinárskom priemysle ako sladidlo, aditívum pre sušené alebo mrazené potraviny a v nápojoch. Ale uplatňuje sa tiež vo farmaceutickom, kozmetickom a biotechnologickom priemysle (pozri napr. Nishimoto a kol., (1998) americký patentový spis č. US 5,759,610; Singer, M.A. and Lindquist, S. (1998) Trends Biotech., 16, 460-467; Paiva, C.L.A. a Panek, A:D. (1996) Biotech. Ann. Rev.,_2, 293 - 314; a Shiosaka, M. (1977) J. Japan 172, 97 102). Trehalózu produkujú pomocou enzýmov mnohé mikroorganizmy a prirodzene sa vylučuje do okolitého média, z ktorého sa môže získať metódami známymi v danej oblasti techniky.

II. Udržiavanie homeostázy v C. glutamicum a adaptácia na okolité prostredie

Metabolické a iné biochemické procesy, pomocou ktorých fungujú bunky, sú citlivé na také podmienky okolitého prostredia ako teplotu, tlak, koncentráciu rozpustených látok a dostupnosť kyslíka. Ak sa jedna alebo viac takých podmienok prostredia poruší alebo zmení takým spôsobom, ktorý je nezlúčiteľný s normálnym

-20fungovaním týchto bunkových procesov, musí sa bunka brániť, aby si udržala intracelulárne prostredie, ktoré jej bude umožňovať existenciu aj napriek nepriaznivému okoliu. Grampozitívne bakteriálne bunky, také ako C. glutamicum bunky, majú mnoho mechanizmov, pomocou ktorých sa môže udržiavať intracelulárna homeostáza, a to i napriek nevhodným extracelulárnym podmienkam. Tieto zahrňujú bunkovú stenu, proteíny, ktoré sú schopné rozkladať potencionálne toxické aromatické a alifatické zlúčeniny, mechanizmy proteolýzy, ktorými sa nesprávne poskladané alebo deregulované proteíny môžu rýchle rozložiť a katalyzátory, ktoré umožňujú intracelulárne reakcie, ktoré by sa normálne neuskutočnili v daných podmienkach optimálnych pre bakteriálny rast.

Okrem samotného prežívania v nepriaznivom prostredí, sú bakteriálne bunky (napr. bunky C. glutamicum) tiež často schopné takej adaptácie, že sú schopné využívať takéto podmienky. Napríklad, bunky v prostredí neobsahujúcom požadované zdroje uhlíka môžu byť schopné adaptovať sa na rast smenej vhodným zdrojom uhlíka. Bunky môžu byť tiež schopné využívať menej vhodné anorganické zlúčeniny, keď zvyčajne využívané zlúčeniny nie sú dostupné. Bunky C. glutamicum majú mnoho génov, ktoré im umožňujú adaptovať sa tak, že využívajú anorganické a organické molekuly, s ktorými by sa normálne nestretli v optimálnych rastových podmienkach ako výživovými zložkami a metabolickými prekurzormi. V ďalšom texte sú vysvetlené aspekty bunkových procesov zapojených v homeostáze a adaptácii.

A. Modifikácia a degradácia aromatických a alifatických zlúčenín

Bakteriálne bunky sú v prírode bežne vystavené pôsobeniu rozličných aromatických a alifatických zlúčenín. Aromatické zlúčeniny sú organické molekuly s cyklickou kruhovou štruktúrou, zatiaľ čo alifatické zlúčeniny sú organické molekuly skôr s otvorenými reťazcovými štruktúrami ako s kruhovou štruktúrou. Také zlúčeniny môžu byť vedľajšími produktami priemyselných výrob (napr. benzén alebo toluén), ale môžu byť tiež produkované určitými mikroorganizmami (napr. alkoholy). Mnohé z týchto zlúčenín sú toxické pre bunky, predovšetkým aromatické zlúčeniny, ktoré sú veľmi reaktívne vďaka svojej vysokoenergetickej kruhovej štruktúre. Teda určité baktérie si vyvinuli mechanizmy, pomocou ktorých sú schopné modifikovať alebo degradovať tieto zlúčeniny tak, že tieto už ďalej nie sú

-21 nebezpečné pre bunku. Bunky môžu obsahovať enzýmy, ktoré sú schopné napríklad hydroxylovať, izomerizovať alebo metylovať aromatické alebo alifatické zlúčeniny tak, že tieto sa stávajú menej toxickými, alebo tak, že tieto modifikované formy sú schopné spracovať prostredníctvom dráh pre štandardný bunkový odpad a degradačnými dráhami. Bunky môžu tiež obsahovať enzýmy, ktoré sú schopné špecificky degradovať jednu alebo viac potenciálne nebezpečných látok, a tak ochraňovať bunku. Princípy a príklady týchto typov modifikačných a degradačných procesov v baktériách sú opísané v niekoľkých publikáciách, napríklad v Sahm, H. (1999) “Procaryotes in Industrial Production“ v Lengeler, J. W. a kol., eds. Biology of the Procaryotes, Thieme Verlag, Stuttgart; a Schlegel, H. G. (1992) Allgemeine Mikrobiológie, Thieme, Stuttgart).

Okrem jednoduchej inaktivácie nebezpečných aromatických alebo alifatických zlúčenín sa u mnohých baktérií vyvinula schopnosť využiť tieto zlúčeniny ako uhlíkaté zdroje pre trvalý metabolizmus, ak výhodné zdroje uhlíka bunky nie sú dostupné. Napríklad sú známe kmene Pseudomonas, ktoré sú schopné využívať toluén, benzén a 1,10-dichlórdekán ako zdroj uhlíka (Chang, B. V. a kol. (1997) Chemosphere 35 (12), 2807-2815; Wischnak, C. a kol. (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64 (9), 3507-3511; Churchill, S. A. a kol. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 549-552). Existujú aj podobné príklady z mnohých iných bakteriálnych druhov, ktoré sú známe v danej oblasti techniky.

Schopnosť určitých baktérií modifikovať alebo degradovať aromatické a alifatické zlúčeniny sa začala využívať. Ropa je zložitá zmes chemikálií, ktorá obsahuje alifatické molekuly a aromatické zlúčeniny. Pri aplikácií baktérií, ktoré majú schopnosť degradovať alebo modifikovať tieto toxické zlúčeniny, napríklad na ropné úniky, je možné eliminovať mnoho škôd na životnom prostredí s vysokou účinnosťou a s nízkymi nákladmi, (pozri napríklad Smith, M. R. (1990) „The biodegradation of aromatic hydrocarbons by bacteria“ Biodegradation 1(2-3), 191206; aSuyama, T. a kol. (1998) „Bacterial isolates degrading aliphatic polycarbonates,“ FEMS Microbiol. Lett. 161 (2), 255-261).

B. Metabolizmus anorganických zlúčenín

Bunky, napríklad bakteriálne bunky obsahujú veľké množstvá rozličných molekúl, ako vodu, anorganické ióny a organické látky (napríklad proteíny, sacharidy a iné makromolekuly). Podstatná časť hmoty typickej bunky pozostáva zo 4 druhov atómov: uhlíka, kyslíka, vodíka a dusíka. I keď tieto predstavujú len menší percentuálny obsah bunky, anorganické látky sú rovnako dôležité pre správnu funkciu bunky. Také molekuly obsahujú fosfor, síru, vápnik, horčík, železo, zinok, mangán, meď, molybdén, volfrám a kobalt. Mnohé z týchto zlúčenín sú kritické pri tvorbe takých dôležitých molekúl, akými sú nukleotidy (fosfor) a aminokyseliny (dusík a síra). Ostatné anorganické ióny sú kofaktormi enzýmových reakcií alebo prispievajú k osmotickému tlaku. Baktérie musia prijímať všetky takéto molekuly z okolitého prostredia.

Každú z týchto anorganických zlúčenín môže baktéria prijímať v takej forme, ktorá najviac vyhovuje štandardným metabolickým mechanizmom bunky. Avšak baktéria môže naraziť na také prostredia, v ktorých tieto výhodné formy nie sú ľahko dostupné. Za účelom prežitia za týchto okolností, je pre baktériu dôležité, aby mala pomocné biochemické mechanizmy, ktoré sú schopné menej metabolický aktívne, ale ľahko dostupné formy týchto anorganických zlúčenín premieňať na také, ktoré sa môžu využiť v bunkovom metabolizme. Baktérie majú často mnoho génov kódujúcich enzýmy na tieto účely, ktoré sa neexprimujú, kým nie je dostupný požadovaný anorganický druh. Takto, tieto gény metabolizmu rozličných anorganických zlúčenín poskytujú ďalší nástroj, ktorý môžu baktérie použiť pri adaptácii na suboptimálne podmienky.

Po uhlíku je najdôležitejším prvkom v bunke dusík. Typická bakteriálna bunka obsahuje 12-15 % dusíka. Dusík je zložkou aminokyselín a nukleotidov, ako aj mnohých iných dôležitých molekúl v bunke. Okrem toho dusík môže nahrádzať kyslík, ktorý je koncovým akceptorom elektrónov v energetickom metabolizme. Dobrými zdrojmi dusíka sú mnohé organické a anorganické zlúčeniny, ako plynný amoniak alebo amónne soli (napr. NH₄CI, (NH₄)₂SO₄ alebo NH₄OH), dusičnany, močovina, aminokyseliny, alebo zložité dusíkaté zdroje ako macerovaný kukuričný mok (com steep liquor), sójová múčka, sójový proteín, kvasinkový extrakt, mäsový extrakt apod. Amoniakálny dusík sa fixuje pomocou špeciálnych enzýmov: glutamátdehydrogenázy, glutamínsyntetázy a glutamín-2-oxoglutarátaminotransfe

-23rázy. Prenos aminodusíka z jednej organickej molekuly na druhú sa dosiahne pomocou aminotransferáz, triedy enzýmov, ktoré prenášajú jednu aminoskupinu z alfa-aminokyseliny na alfa-ketokyselinu. Dusičnany sa môžu redukovať účinkom nitrátreduktázy, nitritreduktázy a ďalších redoxných enzýmov, až kým sa nekonvertujú na molekulový dusík alebo amoniak, ktoré sa môžu ľahko zužitkovať bunkou v štandardných metabolických dráhach.

Fosfor sa typicky vyskytuje intracelulárne, tak v organickej ako aj anorganickej forme, a bunka ho môže tiež prijímať v ktorejkoľvek z týchto foriem, i keď väčšina mikroorganizmov uprednostňuje anorganický fosfát. Konverzia organického fosfátu na formu, ktorú môže bunka zužitkovať, vyžaduje pôsobenie fosfatáz (napr. fytázy, ktoré hydrolyzujú fytát poskytujúci fosfát a deriváty inozitolu). Fosfát je kľúčovým prvkom pri syntéze nukleových kyselín a má tiež signifikantnú úlohu v bunkovom energetickom metabolizme (napr. pri syntéze ATP, ADP aAMP).

Síra je potrebná na syntézu aminokyselín (napr. metionínu a cysteínu), vitamínov (napr. tiamínu, biotínu a kyseliny lipoovej) a proteínov obsahujúcich železo a síru. Baktérie získavajú síru primárne z anorganického sulfátu, i keď tiosulfát, sulfit a sulfid sa tiež bežne využívajú. V podmienkach, kde tieto zlúčeniny nie sú ľahko dostupné, mnohé baktérie exprimujú gény, ktoré im umožňujú zužitkovať sulfónové zlúčeniny, také ako 2-aminosulfonát (taurín) (Kertesz, M. A. (1993) „ Proteins induced by sulfate limitation in Escherichia coli, Pseudomonas putida, or Staphylococcus aureus“ J. Bacteriol. 175,1187-1190).

Ďalšie anorganické atómy, napr. kovové alebo vápenaté ióny sú tiež rozhodujúce pre životaschopnosť buniek. Napríklad železo má kľúčovú úlohu v redoxných reakciách a je kofaktorom vproteínoch obsahujúcich železo-síru, hémových proteínoch a cytochrómoch. Príjem železa do bakteriálnych buniek sa môže dosiahnuť účinkom siderofórov, chelátotvorných činidiel, ktoré viažu extracelulárne ióny železa a premiestnia ich do vnútra bunky. Na vyhľadanie informácií o metabolizme železa a ďalších anorganických zlúčenín, pozri: Lengeler a kol. (1999) Biology of Prokaryotes, Thieme Verlag Stuttgart; Neidhardt, F. C., eds. Escherichia coli and Salmonella. AMS Press, Washington, D C Sonnenshein, A. L. a kol., eds. (199?) Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, ASM Press;

-24Washington, D. C.; Voet, D. and Voet, J. G. (1992) Biochémie, VCH; Weinheim;

Brock, T. D. and Madigan, M. T. (1991) Biology of Microorganisms, 6. ed. Prentice

Halí; Englewood Cliffs, str. 267-269; Rhodes, P. M. and Stanbury, P. F. Applied

Microbial Physiology - A Practical Approach, Oxford Univ. Press; Oxford.

C. Enzýmy a proteolýza

Intracelulárne podmienky, ktoré sú optimálne pre také baktérie ako C. glutamicum, sú často iné, ako podmienky, v ktorých by sa biochemické reakcie normálne uskutočňovali. Aby sa takéto reakcie uskutočňovali aj vo fyziologických podmienkach využívajú bunky enzýmy. Enzýmy sú biologické katalyzátory proteínového pôvodu, so schopnosťou priestorovej orientácie reagujúcich molekúl alebo schopnosťou poskytovania špeciálneho prostredia tým, že znižujú energetickú bariéru biochemickej reakcie. Rôzne enzýmy katalyzujú rôzne reakcie a každý enzým môže byť subjektom pre transkripčnú, translačnú alebo potranslačnú reguláciu, takže reakcia sa bude uskutočňovať vo vhodných podmienkach a v špecifikovaných časoch. Enzýmy môžu prispievať k degradácii (napr. proteázy), syntéze (napr.syntázy) alebo modifikácii (napr. transferázy alebo izomerázy) zlúčenín, pričom každý je schopný produkovať potrebné zlúčeniny vo vnútri bunky. Toto naopak prispieva k udržaniu bunkovej homeostázy.

Avšak fakt, že enzýmy sú optimalizované na aktivitu vo fyziologických podmienkach, pri ktorých je baktéria najživotaschopnejšia, znamená, že keď sa okolité podmienky narušia, existuje signifikantná možnosť, že bude tiež narušená enzýmová aktivita. Napríklad tepelné zmeny môžu spôsobiť odchylné skladanie proteínov, ale to isté platí aj pre zmeny pH - skladanie proteínov je veľmi závislé na elektrostatických a hydrofóbnych interakciách aminokyselín v rámci polypeptidového reťazca, a tak každá zmena nábojov na jednotlivých aminokyselinách (ktoré by mohli vznikať zmenou v bunkovom pH) môže mať nesmierny vplyv na schopnosť proteínu správne sa poskladať. Zmeny teploty účinne menia množstvo kinetickej energie, ktorú má polypeptidová molekula, ktorá ovplyvňuje schopnosť polypeptidu vytvoriť správne poskladanú, energeticky stabilnú konfiguráciu. Deregulované proteíny môžu byť škodlivé pre bunku z dvoch príčin. Po prvé, chybne poskladaný proteín môže mať tiež chybnú aktivitu alebo môže byť bez akejkoľvek aktivity. Po druhé, deregulované proteíny môžu stratiť

-25konformačné oblasti, ktoré sú potrebné na vhodnú reguláciu pomocou ďalších bunkových systémov, a tak môže pokračovať jeho aktívny stav, ale nekontrolovaným spôsobom.

Bunka má mechanizmus, pomocou ktorého môže deregulované enzýmy a regulačné proteíny rýchlo rozložiť, predtým ako sa vyskytne akékoľvek poškodenie bunky proteolýzu. Proteíny ako la/lon rodina a CIp rodina špecificky rozpoznávajú a degradujú deregulované proteíny (pozri napr. Sherman, M. Y., Goldberg, A. L. (1999) EXS 77, 57-78 a odkazy tam uvedené a Porankiewicz, J. (1999) Molec. Microbiol. 32(3), 449-58 a odkazy tam uvedené; Neidhardt, F. C., a kol. (1996) E. coli and Salomonella, ASM Press, Washington, D. C. a odkazy tam uvedené; a Pritchard, G. G. and Coolbear, T. (1993) FEMS Microbiol. Rev. 12(1-3), 179-206 a odkazy tam uvedené). Tieto enzýmy sa viažu na deregulované alebo neposkladané proteíny a degradujú ich ATP-dependentným spôsobom. Proteolýza tak funguje ako dôležitý mechanizmus, ktorý bunka využíva na ochranu pred poškodením normálnych bunkových funkcií pri zmenách okolitého prostredia a v ďalšom umožňuje bunkám prežiť v podmienkach a v prostrediach, ktoré by boli ináč toxické, z dôvodu deregulovaných a/alebo chybných enzýmových a regulačných aktivít.

Proteolýza má tiež významné funkcie v bunke v optimálnych podmienkach prostredia. V rámci normálnych metabolických procesov pomáhajú proteázy hydrolyzovať peptidové väzby, pri katabolizme zložitých molekúl poskytujú potrebné degradačné produkty a modifikujú proteíny. Sekretované proteázy majú dôležitú úlohu v katabolizme externých živín, dokonca uprednostňujú vstup týchto zlúčenín do bunky. Okrem toho proteolytická aktivita samotná môže mať regulačné funkcie; vie sa, že sporulácia v B. subtilis a progresia bunkového cyklu v Caulobacter druhoch je regulovaná kľúčovými proteolytickými zásahmi v každom z týchto druhov (Gottesman, S. (1999) Curr. Opin. Microbiol. 2,(2), 142-147). Proteolytické procesy sú teda kľúčom na bunkové prežitie aj v suboptimálnych aj v optimálnych pomienkach prostredia a prispievajú k celkovému udržaniu homeostázy v bunkách.

D. Produkcia bunkovej steny a jej prestavba

Zatiaľ čo biochemický mechanizmus bunky je schopný ľahko sa adaptovať na rôzne, a snáď i nevhodné prostredia, bunka jednako potrebuje všeobecný mechanizmus, pomocou ktorého by sa mohla chrániť proti prostrediu. Pre mnohé baktérie poskytuje bunková stena takúto ochranu a má funkciu pri adhézii, bunkovom raste a delení, a prenose požadovaných rozpustených látok a odpadových materiálov.

Za účelom fungovania vyžaduje bunka intracelulárne koncentrácie metabolitov a iných molekúl, ktoré sú podstatne vyššie ako tie, ktoré sú v obklopujúcom médiu. Pretože tieto metabolity majú do značnej miery zamedzený odchod z bunky prítomnosťou hydrofóbnej membrány, tendencia systému je prijímať molekuly vody z externého média bunkou tak, že vnútorné koncentrácie rozpustených látok zodpovedajú vonkajším koncentráciám. Molekuly vody sú schopné ľahko prechádzať cez bunkovú membránu, a táto membrána nie je schopná vydržať napučanie a tlak, ktorý môže viesť kosmotickej lýze bunky. Rigidita bunkovej steny veľmi zlepšuje schopnosť bunky tolerovať tieto tlaky a poskytuje ďalšiu bariéru pre nežiaducu difúziu týchto metabolitov a požadovaných rozpustených látok z bunky. Podobne, bunková stena zabraňuje tiež vstupovaniu nežiaduceho materiálu do bunky.

Bunková stena sa podieľa aj na mnohých ďalších bunkových procesoch, ako adhézii a bunkovom raste a delení. Pretože bunková stena úplne obklopuje bunku, akúkoľvek interakciu bunky sokolím musí sprostredkovať bunková stena. Teda bunková stena sa musí podieľať na každej adhézii bunky k iným bunkám a požadovaným povrchom. Okrem toho, bunka nemôže rásť alebo deliť sa bez sprievodných zmien v bunkovej stene. Pretože ochrana, ktorú stena poskytuje, si vyžaduje jej prítomnosť počas rastu, morfogenézy a množenia, jeden z kľúčových krokov v bunkovom delení je syntéza bunkovej steny v rámci bunky, takže nová bunka sa oddelí zo starej. Takto je často biosyntéza bunkovej steny regulovaná spolu s bunkovým rastom a bunkovým delením (pozri napr. Sonenshein, A. L. a kol., eds. (1993) Bacillus subtilis and Other Gram-positive Bacteria, ASM, Washington, D. C.).

Štruktúra bunkovej steny je rôzna u grampozitívnych a gramnegatívnych baktérií. Ale v oboch typoch zostáva základná štruktúrna jednotka steny podobná:

-27mriežka, ktorú prekrývajú dva polysacharidy, N-acetylglukózoamín (NAG) aNacetylmuramová kyselina (NAM), ktoré sú zosieťované prostredníctvom aminokyselín (najčastejšie L-alanínom, D-glutamátom, kyselinou diaminopimelovou a D-alanínom), ktorá sa nazýva „peptidoglykán“. Procesy zapojené do syntézy bunkovej steny sú známe (pozri napr. Michal, G., ed. (1999) Biochemical Pathways, An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York).

Gramnegatívne baktérie majú vnútornú bunkovú membránu pokrytú jednovrstvovým peptidoglykánom (približne 10 nm hrúbky), nazvanom mureínsakulus. Táto peptidoglykánová štruktúra je veľmi rigidná a jej štruktúra určuje tvar organizmu. Vonkajší povrch mureínového sakulusu je pokrytý s vonkajšou membránou, ktorá obsahuje poríny a iné membránové proteíny, fosfolipidy a lipopolysacharidy. Aby sa udržalo tesné spojenie s vonkajšou membránou, gramnegatívna bunková stena má tiež rozptýlené lipidové molekuly, ktorými sa zakotvuje k obklopujúcej membráne.

Grampozitívne baktérie, také ako Corynebacterium glutamicum majú cytoplazmatickú membránu pokrytú multivrstvovým peptidoglykánom, ktorého hrúbka je v intervale od 20-80 nm (pozri napr. Lengeler a kol. (1999) Biology of Prokaryotes, Thieme Verlag, Stuttgart, str. 913-918, str. 875-899 a str. 88-109 a odkazy tam uvedené). Grampozitívna bunková stena obsahuje tiež kyselinu teichoovú, polymér glycerolu alebo ribitolu viazaného prostredníctvom fosfátových skupín. Kyselina teichoová je tiež schopná spájať sa s aminokyselinami a vytvárať kovalentné väzby s kyselinou muramovou. V bunkovej stene sa tiež môže nachádzať kyselina lipoteichoová a kyselina teichurónová. Ak sú prítomné tieto kyseliny, tak bunkové flagelovité alebo kapsulovité povrchové štruktúry budú tiež zakotvené v tejto vrstve.

III. Pojmy a metódy vynálezu

Predložený vynález je založený, aspoň sčasti, na objave nových molekúl, uvádzaných v tomto dokumente ako HA nukleovokyselinové a proteínové molekuly, ktoré sa podieľajú na udržiavaní homestázy v C. glutamicum, alebo ktoré vykonávajú funkciu zapojenú do adaptácie tohto mikroorganizmu na rôzne podmienky prostredia. V jednom uskutočnení sa HA molekuly podieľajú na

-28biosyntéze alebo prestavbe bunkovej steny v C. glutamicum, na metabolizme anorganických zlúčenín, na modifikácii alebo degradácii aromatických alebo alifatických zlúčenín, alebo majú enzýmovú alebo proteolytickú aktivitu. Vo výhodnom uskutočnení, aktivita HA molekúl podľa predloženého vynálezu vzhľadom k biosyntéze a prestavbe bunkovej steny C. glutamicum, metabolizmu anorganických zlúčenín, modifikácii alebo degradácii aromatických alebo alifatických zlúčenín, alebo enzýmovej a proteolytickej aktivite má vplyv na produkciu požadovanej špeciálnej chemikálie týmto organizmom. V predovšetkým výhodnom uskutočnení HA molekuly podľa tohto vynálezu, sú modulované na aktivitu tak, že C. glutamicum bunkové procesy, na ktorých sa HA molekuly podieľajú (napr. C. glutamicum biosyntéza alebo prestavba bunkovej steny, metabolizmus anorganických zlúčenín, modifikácia alebo degradácia aromatických alebo alifatických zlúčenín alebo enzýmová alebo proteolytická aktivita) majú tiež zmenenú aktivitu, ktorá buď priamo alebo nepriamo moduluje výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie pomocou C. glutamicum.

Pojem „HA“ proteín“ alebo „HA polypeptid“ zahrňuje proteíny, ktoré sa podieľajú na mnohých bunkových procesoch súvisiacich s homeostázou C. glutamicum alebo schopnosťou C. glutamicum buniek adaptovať sa na nevhodné podmienky prostredia. Napríklad, HA proteín môže byť zapojený do biosyntézy alebo prestavby bunkovej steny C. glutamicum, do metabolizmu anorganických zlúčenín v C. glutamicum, do modifikácie alebo degradácie aromatických alebo alifatických zlúčenín v C. glutamicum, alebo môže mať C. glutamicum enzýmovú alebo proteolytickú aktivitu. Príklady HA proteinov zahrňujú tie, ktoré sú kódované HA génmi, uvedenými v tabuľke 1 a tie, ktoré sú kódované nepárne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO:. Pojmy „HA gén“ alebo „HA sekvencia nukleovej kyseliny zahŕňajú sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej HA proteín, ktoré sa skladajú z kódujúcej oblasti a tiež príslušných netranslatovaných 5'-a 3'-sekvenčných oblastí. Príklady HA génov sú uvedené v tabuľke 1. Pojmy „produkcia“ alebo „produktivita“ sú uznané v danej oblasti techniky a zahŕňajú koncentráciu fermentačného produktu (napríklad požadovanej špeciálnej chemikálie), ktorý sa vytvoril za stanovený čas a v stanovenom fermentačnom objeme (napr. kg produktu za hodinu na liter). Pojem „účinnosť produkcie“ znamená čas, ktorý je potrebný na

-29to, aby sa dosiahla príslušná produkcia (napríklad, ako dlho trvá bunke dosiahnutie príslušnej rýchlosti produkovania špeciálnej chemikálie). Pojem „výťažok“ alebo „produkt/výťažok uhlíka“ je uznaný v danej oblasti techniky a znamená účinnosť premeny zdroja uhlíka na produkt (t.j. špeciálnu chemikáliu). Toto sa bežne uvádza napríklad ako kg produktu na kg zdroja uhlíka. Prostredníctvom zvyšovania výťažku alebo produkcie zlúčeniny sa množstvo získaných molekúl alebo úspešne získaných molekúl tejto zlúčeniny v stanovenom množstve kultúry nad stanovený čas zvyšuje. Pojem „biosyntéza“ alebo „biosyntetická dráha“ sú uznané v danej oblasti techniky a znamenajú syntézu zlúčeniny, predovšetkým organickej zlúčeniny, bunkou z intermediárnych zlúčenín, čo môže byť viackrokový a veľmi regulovaný proces. Pojmy „degradácia“ alebo „degradačná dráha“ sú uznávané v danej oblasti techniky a znamenajú rozklad zlúčeniny, predovšetkým organickej zlúčeniny, bunkou na degradačné produkty (všeobecne povedané, menšie alebo menej zložité molekuly), ktorý môže byť viackrokový a vysoko regulovaný proces. Pojem „metabolizmus“ je uznaný v danej oblasti techniky a znamená súhrn biochemických reakcií, ktoré sa uskutočňujú v organizme. Metabolizmus príslušnej zlúčeniny, zahrňuje potom (napr. metabolizmus aminokyseliny ako glycínu) celkové biosyntetické, modifikačné a degradačné dráhy v bunke týkajúce sa tejto zlúčeniny. Pojem „homeostáza“ je uznaný v danej oblasti techniky a zahŕňa všetky mechanizmy využívané bunkou na udržanie konštantného intracelulárneho prostredia napriek prevahe extracelulárnych podmienok prostredia. Nelimitujúcim príkladom takéhoto procesu je využitie bunkovej steny na zabránenie osmotickej lýzy zapríčinenej vysokými koncentráciami intracelulárne rozpustených zložiek. Pojem „adaptácia“ alebo „adaptácia na podmienky prostredia“ je uznaný v danej oblasti techniky a zahŕňa mechanizmy využívané bunkou, ktoré spôsobia to, že bunka je schopná prežiť v nevýhodných podmienkach prostredia (všeobecne povedané, takých podmienkach prostredia, v ktorých chýba jedna alebo viac živín, alebo v ktorých také podmienky, ako teplota, pH, osmolarita, percentuálny obsah kyslíka a podobne nespadajú do optimálneho rozpätia na prežitie bunky). Mnohé bunky, vrátane buniek C. glutamicum, vlastnia gény kódujúce proteíny, ktoré sa exprimujú v takých podmienkach prostredia, a ktoré umožňujú pokračovanie rastu v takých suboptimálnych podmienkach.

-30V ďalšom uskutočnení, HA molekuly podľa tohto vynálezu, sú schopné modulovať produkciu takej požadovanej molekuly ako je špeciálna chemikália, v takom mikroorganizme ako C. glutamicum. Existuje mnoho mechanizmov, pomocou ktorých premena HA proteínu podlá tohto vynálezu, môže priamo ovplyvniť výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie špeciálnej chemikálie z kmeňa C. glutamicum inkorporáciou takéhoto zmeneného proteínu. Napríklad, genetickou manipuláciou s enzýmami, ktoré modifikujú alebo degradujú aromatické alebo alifatické zlúčeniny, tak, že sa zvyšuje alebo znižuje aktivita alebo počet týchto enzýmov, je možné modulovať produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií, ktoré sú modifikačnými alebo degradačnými produktami týchto zlúčenín. Podobne, enzýmy, ktoré sú zahrnuté do metabolizmu anorganických zlúčenín, poskytujú kľúčové molekuly (napr.molekuly fosforu, síry a dusíka) na biosyntézu takých špeciálnych chemikálií ako aminokyselín, vitamínov a nukleových kyselín. Menením aktivity alebo počtu týchto enzýmov v C. glutamicum je možné zvýšiť konverziu týchto anorganických zlúčenín (alebo použiť alternatívne anorganické zlúčeniny), aby sa takto umožnili zvýšené rýchlosti inkorporácie anorganických atómov do týchto špeciálnych chemikálií. Genetickou manipuláciou s enzýmami podieľajúcimi sa na celkových bunkových procesoch sa môže tiež priamo zlepšiť produkcia špeciálnej chemikálie, pretože mnohé z týchto enzýmov priamo modifikujú špeciálne chemikálie (napr. aminokyseliny) alebo enzýmov, ktoré sa podieľajú na syntéze špeciálnej chemikálie alebo sekrécii. Modulácia aktivity alebo množstva bunkových proteáz môže mať tiež priamy vplyv na produkciu špeciálnej chemikálie, pretože mnohé proteázy môžu degradovať špeciálne chemikálie alebo enzýmy zahrnuté do produkcie alebo rozkladu, špeciálnych chemikálií.

Okrem toho, vyššie uvedené enzýmy, ktoré sa podieľajú na aromaticko/alifatickej modifikácii alebo degradácii, všeobecnej biokatalýze, metabolizme anorganickej zlúčeniny alebo proteolýze sú samotné špeciálnymi chemikáliami, požadovanými pre ich aktivitu v rôznych in vitro priemyselných aplikáciách. Menením počtu kópií génu pre jeden alebo viac týchto enzýmov v C. glutamicum je možné zvýšiť množstvo týchto proteínov produkovaných bunkou, a tým zvýšiť potenciálny výťažok alebo účinnosť produkcie týchto proteínov z mnohých C. glutamicum alebo príbuzných bakteriálnych kultúr.

-31 Menením HA proteínu, podľa tohto vynálezu, sa môže tiež nepriamo ovplyvniť výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie špeciálnej chemikálie z kmeňa C. glutamicum inkorporáciou takto zmeného proteínu. Napríklad, pomocou modulovania aktivity a/alebo množstva týchto proteínov zapojených do výstavby alebo prestavby bunkovej steny, je možné modifikovať štruktúru bunkovej steny samotnej, tak že bunka je schopná lepšie odolávať mechanickým a iným stresom, ktoré sú prítomné pri fermentácii kultúry vo veľkom rozsahu. Aj rast C. glutamicum vo veľkom rozsahu vyžaduje významnú produkciu bunkovej steny. Modulácia aktivity alebo množstva enzýmov pri biosyntéze bunkovej steny alebo jej degradácii umožňuje väčšie rýchlosti biosyntézy bunkovej steny, ktoré naopak dovoľujú zvýšené rastové rýchlosti tohto mikroorganizmu pri kultivácii a tak zvyšujú množstvo buniek produkujúcich požadovanú špeciálnu chemikáliu.

Modifikovaním HA enzýmov podľa tohto vynálezu, možno tiež nepriamo ovplyvňovať výťažok, produkciu alebo účinnosť produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z C. glutamicum. Napríklad mnohé z hlavných enzýmov v C. glutamicum môžu mať signifikantný vplyv na celkové bunkové procesy (napr. regulačné procesy), ktoré naopak majú signifikantný vplyv na metabolizmus špeciálnych chemikálií. Podobne, proteázy, enzýmy, ktoré modifikujú alebo degradujú možné toxické aromatické alebo alifatické zlúčeniny a enzýmy, ktoré podporujú metabolizmus anorganických zlúčenín, všetky zvyšujú životaschopnosť C. glutamicum. Proteázy napomáhajú selektívne odstraňovať chybne poskladané alebo deregulované proteíny, také ako tie, ktoré sa môžu vyskytnúť v relatívne stresových podmienkach prostredia, ktoré sa vyskytujú počas fermentácie kultúry vo veľkom rozsahu. Menením týchto proteínov sa môže v ďalšom zvýšiť táto aktivita a zlepšiť životaschopnosť kultúry C. glutamicum. Aromaticko/alifatické modifikácie alebo degradácie proteínov nielenže detoxikujú tieto odpadové zlúčeniny, (ktoré sa môžu vyskytnúť ako nečistoty v médiu kultúry alebo ako odpadové produkty zo samotných buniek), ale tiež umožňujú bunkám využívať alternatívne zdroje uhlíka, ak optimálny zdroj uhlíka je limitujúci pri kultivácii. Zvýšením ich množstva a/alebo aktivity sa prežitie buniek C. glutamicum v kultúre môže zvýšiť. Anorganický metabolizmus proteínov, podľa tohto vynálezu, zásobuje bunky anorganickými molekulami potrebnými pre všetky proteínové a nukleotidové (okrem iných) syntézy atak sú kritické pre celkovú životaschopnosť bunky.

-32Zvýšenie množstva životaschopných buniek produkujúcich jednu alebo viac požadovaných špeciálnych chemikálií pri kultivácii vo veľkom rozsahu by malo viesť k súčasnému zvýšeniu výťažku, produkcie a/alebo účinnosti produkcie špeciálnej chemikálie v kultúre.

Sekvencie izolovaných nukleových kyselín, ktoré sú predmetom tohto vynálezu sú zahrnuté v genóme kmeňa Corynebacterium glutamicum dostupného prostredníctvom americkej zbierky kultúr .Američan Type Culture Collection“ pod označením ATCC 13032. Nukleotidové sekvencie izolovaných C. glutamicum HA DNA sú uvedené v Sekvenčnom zázname s nepárne očíslovanými SEQ ID NO: a predpokladané aminokyselinové sekvencie C. glutamicum HA proteínov sú uvedené v Sekvenčnom zázname s párne očíslovanými SEQ ID NO:. Vykonali sa komputerové analýzy, ktoré klasifikujú a/alebo identifikujú tieto nukleotidové sekvencie ako sekvencie, ktoré kódujú proteíny podieľajúce sa na biosyntéze a prestavbe bunkovej steny C. glutamicum, metabolizme anorganických zlúčenín, modifikácii alebo degradácii aromatických alebo alifatických zlúčenín, alebo také, ktoré majú C. glutamicum enzýmovú alebo proteolytickú aktivitu.

Predložený vynález sa tiež týka proteínov, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je v podstate homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s párne očíslovanou sekvenciou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V tomto dokumente sa uvádza, že proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu v podstate homológnu s vybranou aminokyselinovou sekvenciou, je najmenej asi na 50 % homológny s vybranou aminokyselinovou sekvenciou, napr. celou vybranou aminokyselinovou sekvenciou. Proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je v podstate homológna s vybranou aminokyselinovom sekvenciou, môže byť tiež najmenej asi na 50-60 %, výhodne najmenej asi na 6070% a výhodnejšie najmenej asi na 70-80%, 80-90% alebo 90-95% a najvýhodnejšie najmenej asi na 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológny s vybranou sekvenciou aminokyselín.

HA proteín alebo jeho biologicky aktívna časť alebo fragment, podľa tohto vynálezu, sa môže podieľať na udržiavaní homeostázy v C. glutamicum, alebo môže mať funkciu v adaptácii tohto mikroorganizmu na rôzne podmienky prostredia, alebo má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1.

-33Rôzne aspekty vynálezu sa detailnejšie opisujú v nasledujúcich odstavcoch.

A. Molekuly izolovaných nukleových kyselín

Vynález sa týka molekúl izolovaných nukleových kyselín, ktoré kódujú HA polypeptidy alebo ich biologicky aktívne časti, ako aj fragmentov nukleových kyselín vhodných na použitie ako hybridizačné sondy alebo priméry na identifikáciu alebo amplifikáciu HA-kódujúcich nukleových kyselín (napr. HA DNA). Pojem „molekula nukleovej kyseliny“, tak ako sa v tomto dokumente používa, označuje molekuly DNA (napr. cDNA alebo genómovú DNA) a molekuly RNA (napr. mRNA) a analógy DNA alebo RNA vytvorené použitím nukleotidových analógov. Tento pojem zahrňuje tiež netranslatovanú sekvenciu na oboch 3'- a 5'- koncoch kódujúcej oblasti génu: najmenej asi 100 nukleotidovú sekvenciu lokalizovanú na 5'- konci kódujúcej oblasti génu proti smeru (upstream) transkripcie a najmenej asi 20 nukleotidovú sekvenciu lokalizovanú na 3'- konci kódujúcej oblasti génu v smere (downstream) transkripcie. Molekula nukleovej kyseliny môže byť jednovláknová alebo dvojvláknová, ale prednostne je dvojvláknová DNA. „Izolovanou“ molekulou nukleovej kyseliny je práve tá, ktorá je separovaná od iných molekúl nukleových kyselín, ktoré sú prítomné v prirodzenom zdroji nukleovej kyseliny. Výhodne, “izolovaná“ nukleová kyselina neobsahuje sekvencie, ktoré prirodzene lemujú (flank) nukleovú kyselinu (t.j. sekvencie lokalizované na 5-'a 3'-koncoch nukleovej kyseliny) v genómovej DNA organizmu, z ktorého je nukleová kyselina odvodená. Napríklad, v rôznych uskutočneniach, izolovaná HA molekula nukleovej kyseliny môže obsahovať menej ako asi 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb alebo 0,1 kb nukleotidových sekvencií, ktoré prirodzene lemujú molekulu nukleovej kyseliny v genómovej DNA bunky, z ktorej je nukleová kyselina odvodená (napr. bunky C. glutamicum). Navyše, „izolovaná“ molekula nukleovej kyseliny, ako DNA molekula, môže byť v podstate bez iného bunkového materiálu alebo kultivačného média, keď sa vytvorila pomocou rekombinantných techník, alebo chemických prekurzorov alebo iných chemikálií, ak sa syntetizovala chemicky.

Molekula nukleovej kyseliny, podľa predloženého vynálezu, napr. molekula nukleovej kyseliny ktorá má nepárne očíslovanú nukleotidovú sekvenciu SEQ ID

-34NO: v Sekvenčnom zázname, alebo jej časť, sa môže izolovať s použitím štandardných techník molekulárnej biológie a informácií o sekvencii poskytnutých v tomto dokumente. Napríklad, C. glutamicum HA DNA sa môže izolovať z knižnice C. glutamicum použitím celej sekvencie alebo časti jednej zo sekvencii s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname ako hybridizačná sonda štandardnými hybridizačnými technikami (napr. ako sa to opisuje v Sambrook, J., Fritsh, E. F., a Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Okrem toho, molekula nukleovej kyseliny obsahujúca celú alebo časť jednej zo sekvenciínukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu (napr. s nepárne očíslovanými SEQ ID NO:) sa môže izolovať polymerázovou reťazovou reakciou použitím oligonukleotidových primérov skonštruovaných na základe tejto sekvencie (napr. molekula nukleovej kyseliny obsahujúca celú alebo časť jednej zo sekvencii nukleovej kyseliny podlá tohto vynálezu (napr. s nepárne očíslovanými SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) sa môže izolovať polymerázovou reťazovou reakciou použitím oligonukleotidových primérov skonštruovaných na základe tejto istej sekvencie). Napríklad, mRNA sa môže izolovať z normálnych endotelových buniek (napr. pomocou guanidíniumtiokyanátovej extrakčnej metódy podľa Chirgwim a kol. (1979) Biochemistry 18, 5294-5299) a DNA sa môže pripraviť použitím reverznej transkriptázy (napr. Moloney MLV reverznej transkriptázy dostupnej od Gibco/GRL, Bethesda, MD; alebo AM V reverznej transkriptázy dostupnej od Seikagaku America, Inc., St. Petergurg, FL). Syntetické oligonukleotidové priméry pre amplifikáciu polymerázovou reťazovou reakciou sa môžu skonštruovať na základe jednej z nukleotidových sekvencii uvedených v Sekvenčnom zázname. Nukleová kyselina podľa tohto vynálezu sa môže amplifikovať použitím cDNA, alebo alternatívne, genómovej DNA, ako templátu a vhodných oligonukleotidových primérov podľa štandardných PCR amplifikačných techník. Nukleová kyselina takto amplifikovaná sa môže klonovať do vhodného vektora a charakterizovať pomocou vhodnej sekvenčnej analýzy DNA. Okrem toho, oligonukleotidy zodpovedajúce HA nukleotidovej sekvencii sa môžu pripraviť pomocou štandardných syntetických techník napr. použitím automatického syntetizéra DNA.

-35Vo výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu zahrňuje jednu z nukleotidových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname. Sekvencie nukleových kyselín, podlá tohto vynálezu, tak ako sú uvedené v Sekvenčnom zázname, zodpovedajú Corynebacterium glutamicum HA DNA podľa tohto vynálezu. Táto DNA pozostáva zo sekvencií kódujúcich HA proteíny (t.j. „kódujúcej oblasti“ indikovanej v každej nepárne očíslovanej sekvencií SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), ako aj z 5'netranslatovaných sekvencií a 3'-netranslatovaných sekvencií, ktoré sa tiež indikovali v každej nepárne očíslovanej sekvencií SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname. Alternatívne, molekula nukleovej kyseliny môže obsahovať len kódujúcu oblasť každej zo sekvencií vsekvenciách nukleových kyselín v Sekvenčnom zázname.

Pre účely tejto prihlášky treba rozumieť, že každá zo sekvencií nukleovej kyseliny a aminokyselinových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname je identifikovaná RXA, RXN, RXS alebo RXC číslovaním, ktoré má označenie „RXA,“ „RXN,“ „RXS,“ alebo „RXC“ s následnými 5 číslami (t.j. RXA02458, RXN00249, RXS00153, alebo RXC00963). Každá zo sekvencií nukleovej kyseliny sa skladá až z troch častí: 5'- protismernej oblasti, kódujúcej oblasti a oblasti v smere transkripcie. Každá z týchto troch oblastí je identifikovaná rovnakým RXA, RXN, RXS alebo RXC označeniami, aby sa zabránilo zámene. Slovné spojenie „jedna zo sekvencií s nepárnym číslovaním v Sekvenčnom zázname“ teda odkazuje na ktorúkoľvek zo sekvencií nukleovej kyseliny v Sekvenčnom zázname, ktorá môže byť rozlíšiteľná pomocou ich rozdielnych RXA, RXN, RXS alebo RXC označení. Kódujúca oblasť každej z týchto sekvencií je translatovaná na príslušnú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je tiež uvedená v Sekvenčnom zázname ako párne očíslovaná sekvencia SEQ ID NO: priamo nasledujúca po príslušnej sekvencií nukleovej kyseliny. Napríklad, kódujúca oblasť pre RXA02548 je uvedená v SEQ ID NO:1, zatiaľ čo aminokyselinová sekvencia, ktorú kóduje je uvedená ako SEQ ID NO:2. Sekvencie molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, sú určené rovnakými RXA, RXN, RXS alebo RXC označeniami ako molekuly aminokyselín, ktoré kódujú, takže sa môžu ľahko korelovať. Napríklad, aminokyselinová sekvencia označená RXA02458 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXA02548,

-36aminokyselinová sekvencia označená RXN00249 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXN00249, aminokyselinová sekvencia označená RXS00153 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXS00153 a aminokyselinová sekvencia označená RXC00963 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidových sekvencií molekúl nukleovej kyseliny RXC00963., zhoda medzi RXA, RXN, RXS a RXC nukleotidovými sekvenciami a aminokyselinovými sekvenciami podľa tohto vynálezu a im pridelené SEQ ID NO: čísla sú uvedené v tabuľke 1.

Niektoré z génov, podlá tohto vynálezu sú „F-označené gény“. F-označené gény zahŕňajú tie gény uvedené v tabuľke 1, ktoré majú „F“ pred RXA, RXN, RXS, alebo RXC označením. Napríklad, SEQ ID NO:5 označuje, ako je ukázané v tabuľke 1, taký F-gén, ktorý má označenie „F RXA00249 SEQ ID NO: 11 taký F-gén, ktorý má označenie „F-RXA02264 “, SEQ ID NO: 15 taký gén, ktorý má označenie „F-RXA02227 “ a SEQ ID NO: 33 taký gén, ktorý má označenie „F RXA00675 “.

V jednom uskutočnení, molekuly nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu sa nedajú zahrnúť do tých, ktoré sú zostavené do tabuľky 2., a to v prípade dapD génu, ktorého sekvenciu publikoval Wehrmann, A. a kol. (1998) v J. Bacteriol. 180 (12), 3159-3165. Avšak sekvencia získaná vynálezcami predloženej prihlášky je významne dlhšia, ako je publikovaná verzia. Predpokladá sa, že publikovaná verzia vychádzala z nesprávneho štartovacieho kodónu, a tak predstavuje len fragment skutočnej kódujúcej oblasti.

Vínom výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, zahrňuje molekulu nukleovej kyseliny, ktorá je komplementárna s jednou zo sekvencií nukleotidov podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním sekvencie SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), alebo s jej časťou. Molekulou nukleovej kyseliny, ktorá je komplementárna s jednou z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu, je tá, ktorá je dostatočne komplementárna s jednou z nukleotidových sekvencií v Sekvenčnom zázname (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO:),

-37takže sa môže hybridizovať s jednou z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu, v dôsledku čoho sa vytvára stabilný duplex.

V ešte inom výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej asi na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, a výhodnejšie najmenej asi na 71 %,72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, 93 %, 94 % alebo dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológna s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) alebo jej časťou. Intervaly alebo identita medziľahlých hodnôt s vyššie citovanými hodnotami (napr. 70-90% identické alebo 80-95 % identické) spadajú tiež do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, intervaly hodnôt identity využívajúce kombináciu akýchkoľvek vyššie uvedených hodnôt ako horné a/alebo dolné hranice taktiež spadajú do rozsahu vynálezu. V ďalšom výhodnom uskutočnení obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny podlá tohto vynálezu nukleotidovú sekvenciu, ktorá sa hybridizuje, napr. sa hybridizuje v stringentných podmienkach, s jednou nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, alebo jej časťou.

Okrem toho, molekula nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu môže obsahovať len časť kódujúcej oblasti sekvencie jednej z nepárne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname, napríklad fragment, ktorý sa môže použiť ako sonda alebo primér, alebo fragment kódujúci biologicky aktívnu časť HA proteínu. Nukleotidové sekvencie určené z klonovania HA génov z C. glutamicum umožňujú vytváranie sond a primérov určených na použitie pri identifikácii a/alebo klonovaní HA homológov v iných typoch buniek alebo organizmov, a tiež HA homológov z iných Corynebacteria alebo príbuzných druhov. Sonda/primér typicky obsahuje podstatne purifikovaný oligonukleotid. Oligonukleotid typicky obsahuje oblasť nukleotidovej sekvencie, ktorá sa hybridizuje v stringentných podmienkach najmenej asi s 12, výhodne asi s 25, výhodnejšie asi so 40, 50, alebo 75 po sebe idúcimi nukleotidmi zmysluplného (sense) vlákna jednej z nukleotidových sekvencií

-38podľa tohto vynálezu (napr. jednej zo sekvencií s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), nezmyselnú (antisense) sekvenciu jednej z týchto sekvencií, alebo ich prirodzene sa vyskytujúce mutanty. Priméry založené na nukleotidovej sekvencií podľa tohto vynálezu sa môžu použiť pri PCR reakciách na klonovanie HA homológov. Sondy založené na HA nukleotidových sekvenciách sa môžu použiť na detekciu transkriptov alebo genómových sekvencií kódujúcich tie isté alebo homológne proteíny. Vo výhodných uskutočneniach, sonda ďalej obsahuje značkovú skupinu pripojenú k nej, napr. značkovou skupinou môže byť rádioizotop, fluorescenčná zlúčenina, enzým alebo enzýmový kofaktor. Takéto sondy môžu byť súčasťou diagnostického testovacieho kitu na identifikáciu buniek, ktoré chybne exprimovali HA proteín, napríklad meraním množstva HA-kódujúcej nukleovej kyseliny vo vzorke buniek, napr. detegovaním HA mRNA hladín alebo stanovením, či genómový HA gén mutoval alebo deletoval.

V jednom uskutočnení molekula nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, kóduje proteín, alebo jeho časť, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr.sekvenciou s párnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), takže proteín alebo jeho časť si udržiava schopnosť podieľať na udržaní homeostázy v C. glutamicum, alebo vykonávať funkciu zapojenú do adaptácie tohto mikroorganizmu na rôzne podmienky prostredia. Ak sa užíva v tomto dokumente, slovné spojenie „dostatočne homológny“ odkazuje sa ním na proteíny alebo ich časti, ktoré majú aminokyselinové sekvencie, ktoré obsahujú minimálny počet identických alebo ekvivalentných (napr. aminokyselinový zvyšok, ktorý má podobný bočný reťazec ako aminokyselinový zvyšok v sekvencií jednej z párne očíslovaných SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) aminokyselinových zvyškov k aminokyselinovej sekvencií podlá tohto vynálezu, takže proteín alebo jeho časť je schopný podieľať sa na udržaní homeostázy v C. glutamicum, alebo vykonávať funkciu zapojenú do adaptácie tohto mikroorganizmu na rôzne podmienky prostredia. Proteíny zapojené do biosyntézy C. glutamicum bunkovej steny alebo do jej prestavby, metabolizmu anorganických zlúčenín, modifikácie alebo degradácie aromatických alebo alifatických zlúčenín alebo tie, ktoré majú C. glutamicum enzýmovú alebo proteolytickú aktivitu, ako sa opisuje v tomto dokumente, môžu mať funkciu pri produkcii asekrécii jednej alebo viacerých

-39špeciálnych chemikálií. Príklady takýchto aktivít sú tiež opísané v tomto dokumente.

Takto, „funkcia HA proteínu“ vplýva buď priamo alebo nepriamo na výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií. Príklady HA proteínových aktivít sú uvedené v tabuľke 1.

V inom uskutočnení je proteín najmenej asi na 50-60 %, výhodne najmenej asi na 60-70% a výhodnejšie najmenej asi na 70-80%, 80-90%, 90-95% a najvýhodnejšie najmenej asi na 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s párne očíslovanou sekvenciouSEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname).

Časťami proteínov kódovaných molekulami HA nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu sú predovšetkým biologicky aktívne časti jedného z HA proteínov. Ako sa používa v tomto dokumente, slovné spojenie „biologicky aktívna časť HA proteínu“, mieni sa tým časť, napr.doména/motív HA proteínu, ktorá sa môže podieľať na udržiavaní homeostázy v C. glutamicum, alebo časť, ktorá môže mať funkciu zapojenú do adaptácie tohto mikroorganizmu na rôzne podmienky prostredia, alebo ktorá má aktivitu uvedenú v tabuľke 1. Aby sa stanovilo, či HA proteín alebo jeho biologicky aktívna časť sa môže podieľať na biosyntéze C. glutamicum bunkovej steny alebo na jej prestavbe, metabolizme anorganických zlúčenín, modifikácii alebo degradácii aromatických alebo alifatických zlúčenín, alebo má, C. glutamicum enzýmovú alebo proteolytickú aktivitu, treba vykonať skúšku enzýmovej aktivity. Takéto skúšobné metódy sú dobre známe odborníkom, ktorí pracujú v danej oblasti techniky, ako sa podrobne opisuje v príklade 8 v príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Ďalšie fragmenty nukleovej kyseliny kódujúce biologicky aktívne časti HA proteínu sa môžu pripraviť izoláciou časti jednej z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencie s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), expresiou kódovanej časti HA proteínu alebo peptidu (napr. pomocou rekombinantnej expresie in vitro) a stanovením aktivity kódovanej časti HA proteínu alebo peptidu.

Vynález ďalej zahrňuje molekuly nukleových kyselín, ktoré sa odlišujú od jednej z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencie

-40s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO:v Sekvenčnom zázname) (a jej častí) v dôsledku degenerácie genetického kódu, atak kódujú rovnaký HA proteín ako ten, ktorý kódujú nukleotidové sekvencie opísané vo vynáleze. V inom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, má nukleotidovú sekvenciu kódujúcu proteín, ktorého aminokyselinová sekvencia je uvedená v Sekvenčnom zázname (napr. s párne očíslovanou SEQ ID NO:). V ešte ďalšom uskutočnení, kóduje molekula nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu celú dĺžku C. glutamicum proteínu, ktorý je v podstate homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (ktorá je kódovaná otvoreným systémom čítania prislúchajúcou SEQ ID NO: uvedenou s nepárnym očíslovaním v Sekvenčnom zázname).

Odborník, ktorý je skúsený v danej oblasti, si bude vedomý toho, že v jednom uskutočnení sekvencie podľa tohto vynálezu nie sú mienené tak, aby zahrňovali sekvencie známe z doterajšieho stavu techniky, t.j. sekvencie zGenbanky uvedené v tabuľke 2 a 4. V jednom uskutočnení vynález obsahuje nukleotidové a aminokyselinové sekvencie, ktoré majú percento identity s nukleotidovou alebo aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu väčšie, v porovnaní s doteraz známymi sekvenciami v danej oblasti techniky (napr. Genbankové sekvencie (alebo proteín kódovaný týmito sekvenciami) uvedené v tabuľkách 2 alebo 4). Napríklad v jednom uskutočnení vynález zahrňuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je väčšia ako a/alebo najmenej na 39 % identická s nukleotidovou sekvenciou označenou RXA00471 (SEQ ID NO: 293), nukleotidovú sekvenciu, ktorá je väčšia a/alebo najmenej na 41 %identická s nukleotidovou sekvenciou označenou RXA00500 (SEQ ID NO: 143) a nukleotidovú sekvenciu, ktorá je väčšia a/alebo najmenej na 35 %identická s nukleotidovou sekvenciou očíslovanou RXA00502 (SEQ ID NO: 147). Odborník v danej oblasti techniky by bol schopný vypočítať dolný prah percenta identity pre akúkoľvek danú sekvenciu vynálezu pomocou skúšania GAP-vypočítaného percenta identity skóre uvedeného v tabuľke 4 pre každý z troch najlepších troch aktívnych záznamov pre danú sekvenciu a to pomocou odpočítania najvyššieho GAP-vypočítaného percenta identity od 100%. Odborník v danej oblasti techniky si bude tiež vedomý, že sekvencie nukleových kyselín a aminokyselín, ktoré majú percento identity väčšie ako takto vypočítaný dolný prah (napr.sú najmenej 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %,

-41 55%, 56%, 57%, 58%, 59% alebo 60%, výhodne najmenej asi 61 %, 62%, %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, výhodnejšie najmenej asi %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, 93 %, % a dokonca najvýhodnejšie najmenej asi 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac identické) sú tiež zahrnuté do vynálezu

Okrem C. glutamicum HA nukleotidových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname s nepárne označenými SEQ ID NO:, môžu odborníci skúsení v danej oblasti techniky usúdiť, že DNA sekvenčné polymorfizmy, ktoré vedú k zmenám v aminokyselinových sekvenciách HA proteínov sa môžu vyskytovať v rámci populácie (napr. C. glutamicum populácie). Takýto genetický polymorfizmus v HA géne môže existovať medzi jedincami v rámci populácie v dôsledku prirodzenej variácie. Ak sa používajú v tomto dokumente pojmy „gén“ a „rekombinantný gén“, vzťahujú sa tieto na molekuly nukleovej kyseliny, ktoré otvoreným systémom čítania kódujú HA proteín, výhodne C. glutamicum HA proteín. Také prirodzené variácie môžu väčšinou spôsobovať 1-5% variáciu nukleotidovej sekvencie HA génu. Hociktoré a všetky takéto nukleotidové variácie a následné aminokyselinové polymorfizmy v HA, ktoré vyplývajú z prirodzenej variácie a také, ktoré nemenia funkčnú aktivitu HA proteínov sú zahrnuté do rozsahu tohto vynálezu.

Molekuly nukleovej kyseliny zodpovedajúce prirodzeným variantom a ne-C. glutamicum homológom C. glutamicum HA DNA podlá vynálezu sa môžu izolovať na základe ich homológie s C. glutamicum HA nukleovou kyselinou opísanou v tomto dokumente použitím C. glutamicum DNA, alebo jej časti, ako hybridizačnej sondy podľa štandardných hybridizačných metodík v stringentných hybridizačných podmienkach. Podľa tohto, v inom uskutočnení má molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu najmenej 15 nukleotidovú dĺžku a hybridizuje sa v stringentných podmienkach s molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu s nepárne označenou SEQ ID NO:v Sekvenčnom zázname. V ďalších uskutočneniach, má nukleová kyselina dĺžku najmenej 30, 50, 100, 250 alebo viac nukleotidov. Tak ako sa používa v tomto dokumente pojem „hybridizuje sa v stringentných podmienkach“, opisujú sa tým podmienky na

-42hybridizáciu a premytie, pri ktorých sú nukleotidové sekvencie najmenej na 60 % navzájom homológne a charakteristicky zostávajú navzájom hybridizované. Výhodné podmienky sú také, že sekvencie sú najmenej asi na 65 %, výhodnejšie najmenej asi na 70 % a dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 75 % alebo viac navzájom homológne a charakteristicky zostávajú navzájom hybridizované. Takéto stringentné podmienky sú známe skúseným odborníkom v danej oblasti techniky a dajú sa zistiť v Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Výhodným, nelimitujúcim príkladom stringentných hybridizačných podmienok sú hybridizácie v 6X chloride sodnom/citráte sodnom (SSC) pri približne 45 °C, s následným jedným alebo viacerými premytiami v 0,2 X SSC, 0,1 % SDS pri 50-65 °C. Výhodne, molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, ktorá sa hybridizuje v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu sa zhoduje s prirodzene sa vyskytujúcou molekulou nukleovej kyseliny. Ak sa v tomto dokumente používa pojem „prirodzene sa vyskytujúca“ molekula nukleovej kyseliny, odkazuje sa tým na molekuly RNA alebo DNA, ktoré majú nukleotidovú sekvenciu vyskytujúcu sa v prírode (napr. kódujúcu prirodzene sa vyskytujúci proteín). V jednom uskutočnení, nukleová kyselina kóduje prirodzene sa vyskytujúci C. glutamicum HA proteín.

Okrem prirodzene sa vyskytujúcich variantných HA sekvencií, ktoré sa môžu vyskytovať v populácii, si odborník v danej oblasti techniky bude v ďalšom vedomý, že zmeny, ktoré sa môžu zaviesť do nukleotidovej sekvencie podľa tohto vynálezu mutáciou, vedú aj k zmenám v aminokyselinovej sekvencií kódovaného HA proteínu, bez zmeny funkčnej schopnosti HA proteínu. Napríklad, nukleotidové substitúcie, ktoré vedú k aminokyselinovým substitúciám na „neesenciálnych“ aminokyselinových zvyškoch, sa môžu uskutočniť v nukleotidovej sekvencií podľa tohto vynálezu. „Neesenciálny“ aminokyselinový zvyšok je zvyšok, ktorý môže byť zmenený z „divého“-typu (wild-type) sekvencie jedného z HA proteínov (napr. s párnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) bez zmenenia aktivity spomínaného HA proteínu, kým „esenciálny“ aminokyselinový zvyšok sa vyžaduje na aktivitu HA proteínu. Ďalšie aminokyselinové zvyšky, však (napr. tie, ktoré nie sú zachované alebo len polozachované v doméne s HA aktivitou) nemusia byť esenciálne pre aktivitu, a teda pravdepodobne podliehajú zmene bez zmenenia HA aktivity.

-43Podľa toho sa vynález ďalej týka molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich HA proteíny, ktoré obsahujú zmeny v aminokyselinových zvyškoch, ktoré nie sú esenciálne pre HA aktivitu. Takéto HA proteíny sa líšia aminokyselinovou sekvenciou od sekvencie s párnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname, pričom si udržali najmenej jednu z HA aktivít opísaných v tomto dokumente. V jednom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu najmenej asi na 50 %homológnu s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu a je schopný podieľať sa na udržaní homeostázy v C. glutamicum, alebo môže vykonávať funkciu zahrnutú do adaptácie tohto mikroorganizmu na rôzne podmienky prostredia, alebo má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1. Výhodne, proteín kódovaný molekulou nukleovej kyseliny je najmenej asi na 50-60 % homológny s aminokyselinovou sekvenciou jednej z nepárne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname, výhodnejšie najmenej asi na 60-70 % homológny s jednou z týchto sekvencií, dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 70-80 %, 80-90 %, 90-95 %homológny s jednou z týchto sekvencií a najvýhodnejšie najmenej asi na 96%, 97%, 98%, alebo 99 % homológny s jednou z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu.

Aby sa stanovilo percento homológie dvoch aminokyselinových sekvencií (napr. jednej z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu a jej mutantnej formy) alebo dvoch nukleových kyselín, sekvencie sa zoradili za účelom optimálnych porovnaní (napr. medzery (gaps) sa môžu zavádzať do sekvencie jedného proteínu alebo nukleovej kyseliny na optimálne zoradenie s ďalším proteínom alebo nukleovou kyselinou). Aminokyselinové zvyšky alebo nukleotidy v prislúchajúcich aminokyselinových pozíciách alebo nukleotidových pozíciách sa potom porovnajú. Keď je pozícia v jednej sekvencií (napr. jednej aminokyselinovej sekvencií podľa tohto vynálezu) obsadená tým istým aminokyselinovým zvyškom alebo nukleotidom ako prislúchajúca pozícia v inej sekvencií (napr. mutantnou formou aminokyselinovej sekvencie), tak molekuly sú homológne na túto pozíciu (t.j. ak sa v tomto dokumente používa spojenie aminokyselinová alebo nukleovokyselinová „homológia“, je to ekvivalentné aminokyselinovej alebo nukleovokyselinovej „identite“). Percento homológie medzi dvoma sekvenciami

-44závisí od počtu identických pozícií spoločných podľa sekvencii (t.j. % homológie = # identických pozícií / celkových # pozícií x 100).

Molekula izolovanej nukleovej kyseliny kódujúca HA proteín homológny k proteínovej sekvencii podľa tohto vynálezu (napr. sekvencia s párne očíslovanou SEQ ID NO: v:Sekvenčnom zázname) sa môže vytvárať zavedením jednej alebo viacerých nukleotidových substitúcií, adícií alebo delécii do nukleotidovej sekvencie podľa tohto vynálezu tak, že jedna alebo viac aminokyselinových substitúcií, adícií alebo delécii sa zavedú do kódovaného proteínu. Mutácie sa môžu zaviesť do jednej z nukleotidových sekvencii podľa tohto vynálezu pomocou takých štandardných metód ako polohou usmernených mutagenéz a PCR sprostredkovaných mutagenéz. Výhodne, konzervatívne aminokyselinové substitúcie sa uskutočnili na jednom alebo viacerých predikovaných neesenciálnych aminokyselinových zvyškoch. „Konzervatívna aminokyselinová substitúcia“ je taká, pri ktorej sa aminokyselinový zvyšok nahradí s aminokyselinovým zvyškom, ktorý má podobný bočný reťazec. Rodiny aminokyselinových zvyškov, ktoré majú podobné bočné reťazce sú definované v danej oblasti techniky. Tieto rodiny obsahujú aminokyseliny so zásaditými bočnými reťazcami (napr. lyzín, arginín, histidín), s kyslými bočnými reťazcami napr. (kyselina asparágová, kyselina glutámová), polárnymi bočnými reťazcami bez náboja (napr. glycín, asparagín, glutamín, serín, treonín, tyrozín, cysteín), nepolárnymi bočnými reťazcami (napr. alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, fenylalanín, metionín, tryptofán), betarozvetvenými bočnými reťazcami (napr. treonín, valín, izoleucín) a aromatickými bočnými reťazcami (napr. tyrozín, fenylalanín, tryptofán, histidín). Takto predikovaný neesenciálny aminokyselinový zvyšok v HA proteíne je výhodne nahradený s iným aminokyselinovým zvyškom z tej istej rodiny bočných reťazcov. Alternatívne, v inom uskutočnení, sa mutácie môžu zavádzať náhodne, pozdĺž celej alebo pozdĺž časti HA kódujúcej sekvencie, napríklad saturačnou mutagenézou a vytvorené mutanty sa môžu podrobiť kontrole na HA aktivitu opísanú v tomto dokumente, aby sa identifikovali mutanty, ktoré si udržali HA aktivitu. Následnou mutagenézou jednej z nepárne očíslovaných nukleotidových sekvencii SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname sa môže kódovaný proteín rekombinantné exprimovať a aktivita proteínu sa môže stanoviť, napríklad pomocou skúšok uvedených v tomto dokumente (pozri príklad 8 v príkladoch uskutočnenia vynálezu).

-45Okrem molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich HA proteíny, ktoré sa opísali vyššie, sa vynález ďalej týka molekúl izolovanej nukleovej kyseliny, ktoré sú navyše nezmyselné (antisense). „Nezmyselná“ nukleová kyselina obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je komplementárna k „zmysluplnej “(sense) nukleovej kyseline kódujúcej proteín, napr. komplementárna ku kódujúcemu vláknu dvojvláknovej DNA molekuly alebo komplementárna k mRNA sekvencií. Podľa toho sa nezmyselná nukleová kyselina môže viazať vodíkovou väzbou so zmysluplnou nukleovou kyselinou. Nezmyselná molekula nukleovej kyseliny môže byť komplementárna k celému HA kódujúcemu vláknu, alebo len k jeho časti. V jednom uskutočnení je nezmyselná molekula nukleovej kyseliny nezmyselná ku „kódujúcej oblasti“ na kódujúcom vlákne nukleotidovej sekvencie kódujúcej HA proteín. Pojem „kódujúca oblasť“ sa vzťahuje na oblasť nukleotidovej sekvencie obsahujúcej kodóny, ktoré sa translatujú na aminokyselinové zvyšky (napr. celá kódujúca oblasť SEQ ID NO:.3 (RXN00249) obsahuje nukleotidy 1 až 957). V inom uskutočnení, nezmyselná molekula nukleovej kyseliny je nezmyselná ku „nekódujúcej oblasti“ na kódovacom vlákne nukleotidovej sekvencie kódujúcej HA. Pojem „nekódujúca oblasť“ sa vzťahuje na 5-'a 3-'sekvencie, ktoré lemujú kódujúcu oblasť, takže nie sú translatované na aminokyseliny (t.j. označované tiež ako 5-'a 3'- netranslatované oblasti).

Z uvedených sekvencií kódujúceho vlákna, ktoré kódujú HA, opísaných v tomto dokumente (napr. sekvencie uvedené s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), sa môžu navrhnúť nezmyselné nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu podľa pravidiel Watsonovho a Crickovho párovania báz. Nezmyselná molekula nukleovej kyseliny môže byť komplementárna k celej kódujúcej oblasti HA mRNA, ale výhodnejšie je to oligonukleotid, ktorý je nezmyselný len k časti kódujúcej alebo nekódujúcej oblasti HA mRNA. Napríklad, nezmyselný oligonukleotid môže byť komplementárny k oblasti obklopujúcej miesto štartu translácie HA mRNA. Nezmyselný oligonukleotid môže mať napríklad dĺžku 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 alebo 50 nukleotidov. Nezmyselná nukleová kyselina podľa tohto vynálezu sa môže vytvoriť chemickou syntézou a enzýmovými ligačnými reakciami, pričom sa používajú postupy, ktoré sú známe v danej oblasti techniky. Napríklad, nezmyselná nukleová kyselina (napr. nezmyselný oligonukleotid) sa môže chemicky syntetizovať použitím prirodzene sa

-46vyskytujúcich nukleotidov alebo rôzne modifikovaných nukleotidov určených na zvýšenie biologickej stability molekúl alebo na zvýšenie fyzikálnej stability duplexu vytvoreného medzi nezmyselnými a zmysluplnými nukleovými kyselinami, napr. sa môžu použiť fosforotionátové deriváty a akridínom substituované nukleotidy. Príklady modifikovaných nukleotidov, ktoré sa môžu použiť na vytváranie nezmyselných nukleových kyselín zahŕňajú 5-fluóruracil, 5-brómuracil, 5-chlóruracil, 5-jóduracil, hypoxantín, xantín, 4-acetylcytozín, 5- (karboxyhydroxy-metyl)uracil, 5karboxymetylaminometyl-2-tiouridín, 5-karboxymetylamino-metyluracil, dihydrouracil, beta-D-galaktozylcheozín, inozín, N6-izopentenyladenín, 1metylguanín, 1-metylinozín, 2,2-dimetylguanín, 2-metyladenín, 2-metylguanín, 3metylcytozín, 5-metylcytozín, N6-adenín, 7-metylguanín, 5-metylaminometyluracil, 5-metoxyaminometyl-2-tiouracil, beta-D-manozylcheozín_± 5'-metoxykarboxymetyluracil, 5-metoxyuracil, 2-metyltio-N6-izopentenyladenín, kyselina uracil-5-oxyoctová (v), wybutoxozín, pseudouracil, cheozín, 2-tiocytozín, 5-metyl-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metyluracil, metylester kyseliny uracil-5-oxyoctovej, uracil-5-oxyacetic acid (v), 5-metyl-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-karboxypropyl)uracil, (acp3 )w a 2,6diaminopurín. Alternatívne sa nezmyselná nukleová kyselina môže vytvoriť biologicky použitím expresného vektora, do ktorého sa nukleová kyselina subklonovala v nezmyselnej orientácii (t.j. RNA transkribovaná z vloženej nukleovej kyseliny bude mať nezmyselnú orientáciu k danej cieľovej nukleovej kyseline, podrobnejšie opísanej v nasledujúcom odstavci).

Molekuly nezmyselnej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu sú typicky aplikované do bunky alebo sa vytvárajú in situ tak, že sa hybridizujú s alebo viažu na bunkovú mRNA a/alebo genómovú DNA kódujúcu HA proteín, aby týmto spôsobom inhibovali expresiu proteínu, napr. inhibovaním transkripcie a/alebo translácie. Hybridizáciou sa môže bežnou nukleotidovou komplementaritou vytvoriť stabilný duplex, alebo napríklad v prípade nezmyselnej molekuly nukleovej kyseliny, ktorá sa viaže na DNA duplexy prostredníctvom špecifických interakcií v hlavnej ryhe dvojitej skrutkovnice. Nezmyselná molekula sa môže modifikovať tak, že sa špecificky viaže na receptor alebo antigén exprimovaný na zvolenom povrchu bunky, napr. viazaním nezmyselnej molekuly nukleovej kyseliny na peptid alebo protilátku, ktorá sa viaže na bunkový povrchový receptor alebo antigén. Molekula nezmyselnej nukleovej kyseliny sa môže tiež doručiť k bunkám použitím

-47vektorov opísaných v tomto dokumente. Aby sa dosiahli postačujúce intracelulárne koncentrácie nezmyselných molekúl, uprednostňujú sa také konštrukty vektora, v ktorých molekula nezmyselnej nukleovej kyseliny je regulovaná silným prokaryotickým, vírusovým alebo eukaryotickým promótorom.

V ešte inom uskutočnení, molekulou nezmyselnej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu je α-anomérna molekula nukleovej kyseliny. α-Anomérna molekula nukleovej kyseliny vytvára špecifické dvojvláknové hybridy s komplementárnou RNA, v ktorých na rozdiel od obvyklých β-jednotiek, sú vlákna navzájom paralelné (Gaultier akol.(1987) Nucleic Acids. Res.15, 6625-6641). Nezmyselná molekula nukleovej kyseliny môže tiež obsahovať 2'-o-metylribonukleotid (Inoue a kol. (1987) Nucleic Acid Res. 15, 6131-6148) alebo chimérový RNA-DNA analóg (Inoue a kol. (1987) FEBS Lett. 215.:327-330).

V ešte ďalšom uskutočnení, nezmyselnou nukleovou kyselinou podľa tohto vynálezu je ribozým. Ribozýmy sú katalytické molekuly RNA s ribonukleázovou aktivitou, ktoré sú schopné štiepiť jednovláknovú nukleovú kyselinu ako mRNA, ku ktorej majú komplementárnu oblasť. Takto ribozýmy (napr. „kladivkovité“ ribozýmy (hammerhead) (opísané v Haselhoff aGerlach (1988) Náture 334. 585-591)) sa môžu použiť na katalytické štiepenie HA mRNA transkriptov, v dôsledku čoho sa inhibuje translácia HA mRNA. Ribozým, ktorý má špecificitu pre HA-kódujúcu nukleovú kyselinu sa môže navrhnúť na základe nukleotidovej sekvencie HA DNA molekuly uvedenej v tomto dokumente (t.j. SEQ ID NO:.3 (RXN00249)). Napríklad, derivát Tetrahymena L-19 IVS RNA sa môže skonštruovať tak, že má nukleotidovú sekvenciu aktívneho miesta komplementárnu s nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa má rozštiepiť v HA-kódujúcej mRNA. Pozri, napr. Cech a kol., americký patentový spis US č 4,987,071 a Cech a kol., amer. patentový spis US č. 5,116,742. Alternatívne sa HA mRNA sa môže použiť na selekciu katalytickej RNA, ktorá má špecifickú ribonukleázovú aktivitu zo zásoby (pool) RNA molekúl. Pozri, napr. Bartel, D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261,1411-1418.

Alternatívne sa expresia HA génu môže inhibovať cieľovou nukleotidovou sekvenciou komplementárnou k regulačnej oblasti HA nukleotidovej sekvencie (napr. HA promótora a/alebo zosilňovačov), aby sa vytvorili trojité skrutkovnicové štruktúry, ktoré zamedzujú transkripciu HA génu v cieľových bunkách. Pozri

-48všeobecne, Helene C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6), 569-84; Helene, C. a kol.

(1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36; a Maher, L. J. (1992) Bioassays 14 (12).

807-15.

B. Rekombinantné expresné vektory a hostiteľské bunky

Vynález sa ďalej týka vektorov, výhodne expresných vektorov, ktoré obsahujú nukleovú kyselinu kódujúcu HA proteín (alebo jeho časť). Tak ako sa používa v tomto dokumente, pojem „vektor“ označuje molekulu nukleovej kyseliny, ktorá je schopná transportovať inú nukleovú kyselinu, s ktorou sa spojí. Jedným typom vektorov je „plazmid“, ktorý označuje kruhovú dvojvláknovú DNA slučku, do ktorej sa ďalšie segmenty DNA môžu ligovať. Iným typom vektora je vírusový vektor, ktorým sa ďalšie DNA segmenty môžu ligovať do vírusového genómu. Určité vektory sú schopné autonómnej replikácie v hostiteľskej bunke, do ktorej sú zavedené (napr. bakteriálne vektory, ktoré majú bakteriálny pôvod replikácie a epizomálne vektory cicavcov). Ďalšie vektory (napr. ne-epizomálne vektory cicavcov) sú integrované do genómu hostiteľskej bunky tak, že sa zavedú do hostiteľskej bunky a týmto spôsobom sa replikujú súčasne s hostiteľským genómom. Okrem toho, určité vektory sú schopné riadiť expresiu génov, ku ktorým boli funkčne pripojené. Tieto vektory sa v tomto dokumente označujú ako „expresné vektory“. Vo všeobecnosti, expresné vektory využívané v rekombinantných DNA metódach sú často vo forme plazmidov. V uvedenej prihláške pojmy „plazmid“ alebo „vektor“ sa môžu zameniteľné používať, aj keď plazmid je najbežnejšie používaným tvarom vektora. Ale vo vynáleze je snaha zahrnúť také tvary expresných vektorov, ako vírusové vektory (napr. replikačné detektívne retrovírusy a adenovírusy a adenoasociované vírusy), ktoré majú ekvivalentné funkcie.

Rekombinantné expresné vektory podľa tohto vynálezu obsahujú nukleovú kyselinu podľa tohto vynálezu v tvare vhodnom na expresiu nukleovej kyseliny v hostiteľskej bunke, čo znamená, že rekombinantné expresné vektory obsahujú jednu alebo viac regulačných sekvencií zvolených podľa hostiteľských buniek, ktoré sa použijú na expresiu, ktoré sú funkčne pripojené k sekvencií nukleovej kyseliny, ktorá sa má exprimovať. V rámci rekombinantného expresného vektora, „funkčne pripojiť“ znamená, že daná nukleotidová sekvencia sa pripojí k regulačnej sekvencií(iám) takým spôsobom, ktorý umožní expresiu nukleotidovej sekvencie

-49(napr. v in vitro transkripčnonn /translačnom systéme alebo i v hostiteľskej bunke, ak je vektor zavedený do hostiteľskej bunky). Pojem „regulačná sekvencia“ zahrňuje promótory, zosilňovače a iné riadiace prvky expresie (napr. polyadenylačné signály). Tieto regulačné sekvencie sú opísané, napríklad vGoeddel; Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulačné sekvencie zahŕňajú tie, ktoré riadia konštitutívnu expresiu nukleotidovej sekvencie v mnohých typoch hostiteľských buniek a tie, ktoré riadia expresiu nukleotidovej sekvencie len v určitých hostiteľských bunkách. Výhodné regulačné sekvencie sú, napríklad také promótory, ako cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet, Ipp-, lac-, Ιρρ-lac-, lacl^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara, SP6-, arny, SPO2, λ-Ρ_Η’ alebo X-P_L, ktoré sa používajú predovšetkým v baktériách. Ďalšie regulačné sekvencie sú, napríklad, promótory z kvasiniek a húb ako ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, promótory z rastlín ako CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos alebo ubikvitínové alebo fazeolínové promótory. Tiež je možné použiť syntetické promótory. Odborník skúsený v danej oblasti techniky budú vedieť odhadnúť či konštrukcia expresného vektora môže závisieť na takých faktoroch akými je výber hostiteľskej bunky, ktorá sa má transformovať, úrovni expresie požadovaného proteínu, a pod. Expresné vektory podľa tohto vynálezu sa môžu zavádzať do hostiteľských buniek, v dôsledku čoho sa produkujú proteíny alebo peptidy, vrátane fúznych proteínov alebo peptidov kódovaných nukleovými kyselinami, ako sa opisuje v tomto dokumente (napr. HA proteíny, mutantné formy HA proteínov, fúzne proteíny a pod.).

Rekombinantné expresné vektory podlá tohto vynálezu sa môžu skonštruovať na expresiu HA proteínov v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách. Napríklad, HA gény sa môžu exprimovať v bakteriálnych bunkách, takých ako C. glutamicum, bunkách hmyzu (použitím baculovírusových expresných vektorov), kvasinkových a iných bunkách húb (pozri Romanos, M.A. a kol., (1992) „Foreign gene expression in yeast: a review“, Yeast 8, 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. a kol. (1991) „Heterologous gene expression in filamentous fungi“ v: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds.,str. 396-428: Academic Press: San Diego; a van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi“, v: Applied

-50Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. a kol., eds., str. 1-28, Cambridge University Press, Cambridge), v riasach a v bunkách mnohobunkových rastlín (pozri Schmidt, R and Willmitzer, L. (1988) „High efficiency Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants“ Plánt Celí Rep, 583-586) alebo v bunkách cicavcov. O vhodných hostiteľských bunkách sa diskutuje ďalej v Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzvmoloqy 185. Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternatívne, rekombinantný expresný vektor sa môže transkribovať a translatovať in vitro, napríklad použitím T7 promótorových regulačných sekvencií a T7 polymerázy.

Expresia proteínov v prokaryotoch sa najčastejšie uskutočňuje s vektormi obsahujúcimi konštitutívne alebo indukovateľné promótory, ktoré riadia expresiu buď fúznych alebo ne-fúznych proteínov. Fúzne vektory pridávajú mnoho aminokyselín ku kódovanému proteínu, obvykle k amino-koncu rekombinantného proteínu, ale tiež k C-koncom, alebo sa fúzujú s vhodnými oblasťami v proteínoch. Takéto fúzne vektory majú typicky tri funkcie: 1) zvyšujú expresiu rekombinantného proteínu; 2) zvyšujú rozpustnosť rekombinantného proteínu; a 3) pomáhajú purifikovať rekombinantný proteín tým, že majú funkciu ligandov pri afinitnej purifikácii. Často sa fúznymi expresnými vektormi zavádza proteolytické štiepne miesto na spojenie fúznej časti a rekombinantného proteínu, aby sa umožnila separácia rekombinantného proteínu z fúznej časti s následnou purifikáciou fúzneho proteínu. Takéto enzýmy, a ich príbuzné rozpoznávacie sekvencie, obsahujú Faktor Xa, trombín a enterokinázu.

Charakteristické fúzne expresné vektory obsahujú pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Jihnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40), ktoré fúzujú glutatiónS-transferázu (GST), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), ktoré fúzujú maltózu E-viažuci proteín a pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), ktoré fúzujú proteín A k cieľovému rekombinantnému proteínu. V jednom uskutočnení, sekvencia kódujúca HA proteín je klonovaná do pGEX expresného vektora, aby sa vytvoril vektor kódujúci fúzny proteín začlenením z N-konca k C-koncu GSTtrombínového štiepneho miesta-X proteínu. Fúzny proteín sa môže purifikovať pomocou afinitnej chromatografie za použitia glutatiónagarózovej živice.

-51 Rekombinantný HA proteín. ktorý nebol fúziou pripojený na GST sa môže získať štiepením fúzneho proteínu s trombínom.

Príkladmi vhodných induktívnych ne-fúznych E. coli expresných vektorov sú: pTrc (Amann a kol., (1988) Gene 69, 301-315) pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN 111113-B1, λ gt11, pBdC1 a pET 11d (Studier a kol., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; a Pouwels a kol., (1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018). Cieľová génová expresia zpTrc vektora sa zakladá na RNA polymerázovej transkripcii z hybridného trp-lac fúzneho promótora. Cieľová génová expresia zpET 11d vektora sa zakladá na transkripcii zT7 gn 10-lac fúzneho promótora sprostredkovanej pomocou koexpresie s vírusovou RNA polymerázou (T7 gn 1). Táto vírusová polymeráza je poskytovaná hostiteľskými kmeňmi BL21 (DE3) alebo HMS174(DE3) z rezidentného Xprofágu prechovávajúceho T7 gn1 gén pod transkripčnou reguláciou lacUV 5 promótora. Na transformáciu ďalších druhov baktérií sa môžu vybrať vhodné vektory. Napríklad plazmidy plJ101, plJ364, plJ702 a plJ361 sa úspešne používajú na transformovanie Streptomyces, zatiaľ čo plazmidy pUB110, pC194 alebo pBD214 sú vhodné na transformáciu Bacillus druhov. Niekoľko plazmidov sa používa pri prenose genetickej informácie do Corynebacterium, a to pHM1519, pBL1, pSA77 alebo pAJ667 (Pouwels a kol., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018).

Jednou stratégiou na maximalizáciu rekombinantnej proteínovej expresie je expresia proteínu v hostiteľskej baktériovej bunke s oslabenou schopnosťou proteolytického štiepenia rekombinantného proteínu (Gotteman.S., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Ďalšou stratégiou je meniť nukleovokyselinovú sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá sa má vložiť do expresného vektora, takže individuálne kodóny pre každú aminokyselinu sú tie, ktoré sa prednostne využívajú v baktérii vybratej na expresiu, napríklad C. glutamicum (Wada a kol. (1992) Nucleic Acids Res. 20. 2111-2118). Takáto zmena nukleovokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu sa môže uskutočniť pomocou štandardných metód syntézy DNA.

V ďalšom uskutočnení, HA proteínovým expresným vektorom je kvasinkový expresný vektor. Príkladmi vektorov na expresiu v kvasinkách S. cerevisiae sú: pYepSed (Baldari a kol., (1987) Embo J. 6, 229-234), 2 μ, pAG-1, Yep6, Yep13, pEMBLYYe23, pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Celí 30, 933-943), pJRY88 (Schultz a kol., (1987) Gene 54, 113-123) apYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektory a metódy na konštrukciu vektorov vhodných na použitie v ďalších hubách, takých ako vláknitých hubách, sú detailne zhrnuté vo: van den Hondel, C.A.M.J.J & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi“, v: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy a kol., eds., str. 1-28, Cambridge University Press, Cambridge, a Pouwels a kol., eds.(1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York (IBSN 0 444 904018).

Alternatívne sa HA proteíny podľa tohto vynálezu môžu exprimovať v bunkách hmyzu použitím baculovírusových expresných vektorov. Baculovírusové vektory dostupné na expresiu proteínov pri kultivácii buniek hmyzu (napr. buniek Sf9) zahrňujú pAc série (Smith a kol., (1983) Mol. Celí Biol. 3, 2156-2165) a pVL série (Lucklow and Summers (1989) Viroloqy 170, 31-39).

V inom uskutočnení sa HA proteíny podľa tohto vynálezu môžu exprimovať v bunkách jednobunkových rastlín (napríklad v riasach) alebo v rastlinných bunkách vyšších rastlín (napr. spermatofytoch, ako napríklad poľnohospodárskych plodín). Príklady rastlinných expresných vektorov sú detailne zhrnuté v: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) „New plánt binary vectors with selectable markers located proximal to the left border Plánt Mol. Biol. 20, 11951197; aBevan, M.W. (1984) „Binary Agrobacterium vectors for plánt transformation“, Nucl. Acid. Res. 12. 8711-8721 a zahŕňajú pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 a pDH51 (Pouwels a kol., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018).

V ešte inom uskutočnení, sa nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu exprimujú v bunkách cicavcov použitím expresného vektora cicavcov. Príkladmi expresných vektorov cicavcov sú pCDM8 (Seed, B.(1987) Náture 329-840) apMT2PC (Kaufman a kol. (1987) EMBO J. 6, 187-195). Ak sa použijú bunky cicavcov, tak regulačné funkcie expresných vektorov často plnia vírusové regulačné elementy. Napríklad, bežne používané promótory sa často odvodzujú od polyoma,

-53Adenovirusu 2, cytomegalovirusu aSimian Vírusu 40. Ďalšie vhodné expresné systémy, tak pre prokaryotické ako aj eukaryotické bunky, sa uvádzajú v kapitole 16 a 17 v Sambrook, J., Fritsh. E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning, A Laboratory

Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory

Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

V ďalšom uskutočnení rekombinantný expresný vektor cicavcov je schopný riadiť expresiu nukleovej kyseliny prednostne vo zvláštnom type bunky (napr. na expresiu nukleovej kyseliny sa používajú tkanivovo-špecifické regulačné elementy). Tkanivovo-špecifické regulačné elementy sú známe v danej oblasti techniky. Nelimitujúcimi príkladmi vhodných tkanivovo-špecifických promótorov sú: albumínový promótor (pečeňovo-špecifický; Pinkert a kol., (1987) Genes Dev. 1, 268-277), lymfoid-špecifické promótory (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43, 235-275), predovšetkým promótory v receptoroch T buniek (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8, 729-733) a immunoglobulíny (Banerji a kol., (1983) Celí 33, 729-740; Queen and Baltimore (1983) Celí 33, 741-748), neurón-špecifické promótory (napr. neurofilament-promótor; Byme and Ruddle (1989) PNAS 86, 5473-5477), pankreas-špecifické promótory; (Edlund a kol. Science 230, 912-916) a špecifické promótory mliečnej žľazy cicavcov (napr. promótor mliečnej srvátky; americký patentový spis č. US 4,873,316 a publikovaná európska prihláška č. 264 166). Vývojovo-regulované promótory sú tiež zahrnuté, napríklad myšacie hox promótory (Kessel aGruss, (1990) Science 249, 374-379) a a-fetoproteínový promótor (Campes a Tilghman, (1989) Genes Dev. 3, 537-546).

Vynález v ďalšom poskytuje rekombinantný expresný vektor obsahujúci molekulu DNA podľa tohto vynálezu klonovanú do expresného vektora v nezmyselnej orientácii. Znamená to, že molekula DNA je funkčne pripojená k regulačnej sekvencii takým spôsobom, ktorý umožňuje expresiu (pomocou transkripcie molekuly DNA) molekuly RNA, ktorá je nezmyselná k HA mRNA. Regulačné sekvencie funkčne spojené s nukleovou kyselinou klonovanou v nezmyselnej orientácii sa môžu vybrať také, aby riadili kontinuálnu expresiu nezmyselnej molekuly RNA v rôznych typoch buniek, napríklad vírusové promótory a/alebo zosilňovače, alebo regulačné sekvencie sa môžu zvoliť tak, aby riadili konštitutívnu, tkanivovo-špecifickú alebo podľa typu bunky špecifickú expresiu

-54nezmyselnej RNA. Nezmyselný expresný vektor môže mať formu rekombinantného plazmidu, fágomidu alebo zoslabeného vírusu, v ktorom sa nezmyselná nukleová kyselina produkuje pod kontrolou vysoko účinnej regulačnej oblasti, aktivita ktorej sa môže stanoviť pomocou typu bunky, do ktorej je vektor zavedený. Podrobnejšie informácie o regulácii génovej expresie použitím nezmyselných génov, pozri Weintraub, H. a kol., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1), (1986).

Vynález sa ďalej týka hostiteľských buniek, do ktorých sa zaviedol rekombinantný expresný vektor podľa tohto vynálezu. Pojem „hostiteľská bunka a „rekombinantné hostiteľská bunka“ sa používa navzájom zameniteľné v tomto dokumente. Rozumie sa, že takéto pojmy označujú nielen príslušný subjekt bunky, ale aj progén alebo potenciálny progén takejto bunky. Pretože určité modifikácie sa môžu vyskytnúť v nasledujúcich generáciách v dôsledku buď mutácie alebo vplyvov prostredia, takýto progén nemôže byť v skutočnosti identický s rodičovskou bunkou, ale ešte stále je zahrnutý do rozsahu pojmu ako sa používa v tomto dokumente.

Hostiteľskou bunkou môže byť akákoľvek prokaryotická alebo eukaryotická bunka. Napríklad, HA proteín sa môže exprimovať v baktériových bunkách, takých ako C. glutamicum, bunkách hmyzu, kvasinkách alebo bunkách cicavcov (takých ako ovariálnych bunkách čínskeho Škrečka (CHO) alebo COS bunkách). Ďalšie vhodné hostiteľské bunky sú známe odborníkom v danej oblasti techniky. Mikroorganizmy príbuzné ku Corynebacterium glutamicum, ktoré sa môžu obyčajne používať ako hostiteľské bunky pre nukleovú kyselinu a molekuly proteínov podľa tohto vynálezu, sú uvedené v tabuľke 3.

Vektor DNA sa môže zaviesť do prokaryotických a eukaryotických buniek prostredníctvom bežných transformačných a transfekčných metodík. Tak ako sa používa v tomto dokumente, pojmy „transformácia a „transfekcia“, „konjugácia“ a „transdukcia“ sú mienené tak, že odkazujú na rôzne, v danej oblasti techniky známe, metódy na zavádzanie cudzej nukleovej kyseliny (napr. lineárnej DNA alebo RNA (napr. linearizovaný vektor alebo samotný génový konštrukt bez vektora) alebo nukleovej kyseliny vo forme vektora (napr. plazmidu, fágu, „fazmidu“, „fagemidu“, transpozónu alebo inej DNA) do hostiteľskej bunky, vrátane koprecipitácie s fosforečnanom vápenatým alebo chloridom vápenatým, DEAE

-55dextránovo sprostredkovanej transfekcie, lipofekcie, prirodzenej kompetencie, chemicky sprostredkovaného transferu alebo elektroporácie. Vhodné metódy na transformovanie alebo transfekovanie hostiteľských buniek sa dajú nájsť v Sambrook, a ko\. (Molecular Cloning: A Laboratory manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) a ďalších laboratórnych príručkách.

Pri stabilnej transfekcii buniek cicavcov, ako je známe, v závislosti na expresnom vektore a použitej transfekčnej metodike, len malá frakcia buniek môže integrovať cudziu DNA do svojho genómu. Za účelom identifikácie a selekcie týchto integrácií sa gén, ktorý kóduje selekčný markér (napr. rezistenciu na antibiotiká) bežne zavádza do hostiteľských buniek spolu s génom, ktorý je predmetom záujmu. Výhodné markéry selekcie sú tie, ktoré prepožičiavajú rezistenciu na liečivo ako G418, hygromycín ametotrexát. Nukleová kyselina kódujúca selektovateľný markér sa môže zaviesť do hostiteľskej bunky na tom istom vektore, ktorý kóduje HA proteín alebo sa môže zaviesť na zvláštnom vektore. Bunky stabilne transfekované so zavedenou nukleovou kyselinou sa dajú identifikovať napríklad selekciou liečiva (napr. bunky, ktoré inkorporovali selekčný markérový gén prežijú, kým ostatné bunky odumrú).

Za účelom vytvorenia homológneho rekombinantného mikroorganizmu, sa pripraví vektor, ktorý obsahuje aspoň časť HA génu, do ktorého sa zaviedla delécia, adícia alebo substitúcia, aby sa týmto spôsobom zmenil, napr. funkčne rozrušil HA gén. Výhodne, týmto HA génom je Corynebacterium glutamicum HA gén, ale tento môže byť homológny s príbuznou baktériou alebo dokonca so zdrojmi z cicavcov, kvasiniek alebo hmyzu. Vo výhodnom uskutočnení, je vektor skonštruovaný tak, že homológnou rekombináciou je endogénny HA gén funkčne narušený (t.j. už ďalej nekóduje funkčný proteín; tiež porovnaj s „knock out“ vektorom). Alternatívne, vektor môže byť skonštruovaný tiež tak, že na základe homológnej rekombinácie, endogénny HA gén zmutuje alebo sa ináč zmení, ale ešte stále kóduje funkčný proteín (napr. protismerná regulačná obasť sa môže zmeniť tak, že sa zmení expresia endogénneho HA proteínu). V homológnom rekombinantnom vektore, zmenená časť HA génu lemuje jeho 5'- a 3'- konce pomocou dodatkovej nukleovej kyseliny HA génu, čo umožní homológnu

-56rekombináciu medzi exogénnym HA génom prenášaným prostredníctvom vektora a endogénnym HA génom v mikroorganizme. Dodatková lemujúca HA nukleová kyselina má dostatočnú dĺžku na úspešnú homológnu rekombináciu s endogénnym génom. Charakteristicky, niekoľko kilobáz lemujúcej DNA (na oboch 5'- a 3'koncoch) je zahrnutých do vektora (pozri opis homológnych rekombinantných vektorov napr. Thomas, K. R., and Capecchi, M.R. (1987) Celí 51, 503 ). Vektor sa zavádza do mikroorganizmu (napr. pomocou elektroporácie) a bunky, v ktorých sa zavedený HA gén homológne rekombinoval s endogénnym HA génom sa selektujú pomocou metód známych v danej oblasti techniky.

V ďalšom uskutočnení sa môžu produkovať rekombinantné mikroorganizmy, ktoré obsahujú zvolené systémy, ktoré poskytujú regulovanú expresiu zavedeného génu. Napríklad, inklúzia HA génu na vektor, umiestnený tak, že je regulovaný lac operónom, umožňuje expresiu HA génu len v prítomnosti IPTG. Takéto regulačné systémy sú dobre známe v danej oblasti techniky.

V ďalšom uskutočnení je endogénny HA gén v hostiteľskej bunke narušený (napr. homológnou rekombináciou alebo ďalšími genetickými spôsobmi známymi v danej oblasti techniky) tak, že expresia jeho proteínového produktu nenastane. V ďalšom uskutočnení sa endogénny alebo zavedený HA gén v hostiteľskej bunke zmenil jednou alebo viacerými bodovými mutáciami, deléciami alebo inverziami, ale stále ešte kóduje funkčný HA proteín. V ešte ďalšom uskutočnení, jedna alebo viac regulačných oblastí (napr. promótor, represor alebo induktor) HA génu v mikroorganizme sa zmenili (napr. deléciou, trunkáciou, inverziou alebo bodovou mutáciou) tak, že expresia HA génu je modulovaná. Odborník v danej oblasti techniky si bude vedomý, že hostiteľské bunky, obsahujúce viac ako jednu z opísaných HA génových a proteínových modifikácií sa dajú ľahko produkovať s použitím spôsobov podľa tohto vynálezu a sú zahrnuté do rozsahu predloženého vynálezu.

Hostiteľská bunka podľa tohto vynálezu, taká ako prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka, sa môže použiť na kultiváciu, aby produkovala (t.j. exprimovala HA proteín. V súlade s uvedeným, vynález v ďalšom poskytuje spôsoby produkcie HA proteínov s použitím hostiteľských buniek podľa tohto vynálezu. V jednom uskutočnení, metóda pozostáva z pestovania hostiteľskej

-57bunky podlá tohto vynálezu, (do ktorej sa zaviedol rekombinantný expresný vektor kódujúci HA proteín, alebo do genómu ktorej sa zaviedol gén, kódujúci „divý“-typ alebo zmenený HA proteín) vo vhodnom médiu, až kým sa produkuje HA proteín.

V .dälšom uskutočnení sa spôsob dálej týka izolácie HA proteínov z média alebo z hostiteľskej bunky.

C. Izolované HA proteíny

Vynález sa dálej týka izolovaných HA proteínov a ich biologicky aktívnych častí. “Izolovaný“ alebo „purifikovaný“ proteín, alebo jeho biologicky aktívna časť, je v podstate bez celulárneho materiálu vtedy, ak bol produkovaný rekombinantnými DNA metódami, alebo bez chemických prekurzorov alebo iných chemikálií vtedy, ak bol syntetizovaný chemicky. Pojem „v podstate bez bunkového materiálu“ označuje preparáty HA proteínu, v ktorých sa proteín oddelí od celulárnych zložiek buniek, z ktorých sa prirodzene alebo pomocou rekombinácie produkuje. V jednom uskutočnení, pojem „v podstate bez celulárneho materiálu“ označuje preparáty HA proteínu, ktoré majú menej ako asi 30 % (v sušine) ne-HA proteínu (tiež označené v tomto dokumente ako „kontaminujúci proteín“), výhodnejšie menej ako asi 20 % ne-HA proteínu, ešte výhodnejšie menej ako asi 10% ne-HA proteínu a najvýhodnejšie menej ako asi 5 % ne-proteínu. Ak HA proteín alebo jeho biologicky aktívna časť sa produkuje rekombinantne, tiež je výhodne, že je v podstate bez kultivačného média, t.j. kultivačné médium predstavuje menej ako asi 20%, výhodnejšie menej ako asi 10% a najvýhodnejšie menej ako asi 5% objemu proteínového preparátu. Spojenie, „v podstate bez chemických prekurzorov alebo iných chemických látok“ označuje preparáty HA proteínu, v ktorých je proteín oddelený od chemických prekurzorov alebo iných chemikálií, ktoré sú zapojené do syntézy proteínu. V jednom uskutočnení, spojenie „v podstate bez chemických prekurzorov alebo iných chemických látok“ označuje preparáty HA proteínu, ktoré majú menej ako asi 30 % (v sušine) chemických prekurzorov alebo ne-HA chemických látok, výhodnejšie menej ako asi 20 % chemických prekurzorov alebo ne-HA chemických látok, ešte výhodnejšie menej ako asi 10% chemických prekurzorov alebo ne-HA chemických látok a najvýhodnejšie menej ako asi 5 % chemických prekurzorov alebo ne-HA chemických látok. Vo výhodných uskutočneniach, izolované proteíny alebo ich biologicky aktívne časti neobsahujú

-58kontaminujúce proteíny z toho istého organizmu, z ktorého bol HA proteín odvodený. Charakteristicky, sa takéto proteíny produkujú rekombinantnou expresiou, napríklad C. glutamicum HA proteín vtákom mikroorganizme, ako je C.

glutamicum.

Izolovaný HA proteín alebo jeho časť, podľa tohto vynálezu, sa môže podieľať na reparácii alebo rekombinácii DNA, na transpozícii genetického materiálu, na expresii génu (t.j. procesoch transkripcie alebo translácie), na skladaní proteínu, alebo na sekrécii proteínu v Corynebacterium glutamicum, alebo má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1. Vo výhodných uskutočneniach, proteín alebo jeho časť obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s párnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), takže proteín alebo jeho časť si udržiava schopnosť podieľať sa na udržiavaní homeostázy v C. glutamicum,. alebo vykonáva funkciu zahrnutú do adaptácie tohto organizmu na rôzne podmienky prostredia. Časť proteínu je výhodne biologicky aktívna časť, ako sa to uvádza v tomto dokumente. V ďalšom výhodnom uskutočnení, má HA proteín podlá tohto vynálezu aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená s párnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname. V ešte dálšom výhodnom uskutočnení má HA proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO:v Sekvenčnom zázname). V ešte inom výhodnom uskutočnení, má HA proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá je najmenej asi na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, výhodnejšie najmenej asi na 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% alebo %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, alebo 90 % alebo %, 92 %, 93 %, 94 % a dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %,

98%, 99% alebo viac homológna s nukleotidovými sekvenciami podľa tohto vynálezu, alebo s ich časťou. Rozsahy a medziľahlé hodnoty identity k vyššie uvedeným hodnotám (napr.na 70 až 90 % identické alebo na 80 až 95 % identitické) spadajú taktiež do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, rozsahy

-59hodnôt identity využívajúce kombináciu z akýchkoľvek vyššie vymenovaných hodnôt ako horné a/alebo dolné medze taktiež spadajú do rozsahu vynálezu. Výhodné HA proteíny podľa predloženého vynálezu majú tiež výhodne najmenej jednu z HA aktivít, ktoré sa opisujú v tomto dokumente. Napríklad, výhodný HA proteín podľa predloženého vynálezu obsahuje aminokyselinovú sekvenciu kódovanú nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, a ktorá sa môže podieľať na udržiavaní homeostázy v C. glutamicum, alebo môže vykonávať funkciu zapojenú do adaptácie tohto mikroorganizmu na rôzne podmienky prostredia, alebo ktorá má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1.

V iných uskutočneniach, HA proteín je v podstate homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) a uchováva si funkčnú aktivitu proteínu jednej z aminokyselinových sekvencii podľa tohto vynálezu, ale odlišuje sa od aminokyselinovej sekvencie, v dôsledku prirodzenej variácie alebo mutagenézy, ako sa to opisuje detailne v I. odseku vyššie. Podľa toho, v inom uskutočnení, HA proteínom je proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je najmenej asi na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, výhodnejšie najmenej asi na 71 %,72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, 93 %, 94 % a dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95%, 96%, 97%, 98%, 99% alebo viac homológna s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, a ktorá má najmenej jednu z HA aktivít opísaných v tomto dokumente. Rozsahy a medziľahlé hodnoty identity k vyššie citovaným hodnotám (napr. na 70-90 % identitické alebo na 80-95 % identitické) spadajú taktiež do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, rozsahy hodnôt identity využívajúce kombináciu z akýchkoľvek vyššie vymenovaných hodnôt ako horné a/alebo dolné medze spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. V ďalšom uskutočnení sa vynález sa týka celej dĺžky proteínu C. glutamicum, ktorý je v podstate homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu.

-60Biologicky aktívne časti HA proteínu obsahujú peptidy, ktoré majú aminokyselinové sekvencie odvodené z aminokyselinovej sekvencie HA proteínu, napr. aminokyselinovej sekvencie s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname alebo aminokyselinovej sekvencie proteínu homológneho s HA proteínom, ktorý zahrňuje menej aminokyselín, nezje celá dĺžka HA proteínu, alebo celú dĺžku proteínu, ktorý je homológny s HA proteínom a vykazuje najmenej jednu aktivitu HA proteínu. Typicky, biologicky aktívne časti (peptidy, napr. peptidy, ktoré sú napríklad 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 alebo viac aminokyselín dlhé) obsahujú doménu alebo motív s najmenej jednou aktivitou HA proteínu. Okrem toho, ďalšie biologicky aktívne časti, v ktorých sú ďalšie oblasti proteínu deletované, sa môžu pripraviť pomocou rekombinantných metód a ohodnotiť na jednu alebo viac aktivít opísaných v tomto dokumente. Výhodne, biologicky aktívne časti HA proteínu obsahujú jednu alebo viac vybraných domén/motívov alebo ich častí, ktoré majú biologickú aktivitu.

HA proteíny sú výhodne produkované pomocou DNA rekombinantných metodík. Napríklad, molekula nukleovej kyseliny kódujúca proteín sa klonuje do expresného vektora (ako je opísané vyššie), expresný vektor sa zavedie do hostiteľskej bunky (ako je opísané vyššie) a HA proteín sa exprimuje v hostiteľskej bunke. HA proteín sa môže potom izolovať z buniek pomocou vhodných purifikačných postupov, a to použitím štandardných metód na purifikáciu proteínov. Alternatívne na rekombinantnú expresiu sa HA proteín, polypeptid, alebo peptid môžu syntetizovať chemicky použitím štandardných metód na syntézu peptidov. Okrem toho, natívny HA proteín sa môže izolovať z buniek (napr. endotelových buniek), napríklad použitím anti-HA protilátky, ktorá sa môže produkovať pomocou štandardných metód využívajúcich HA proteín alebo jeho fragment podľa tohto vynálezu.

Vynález tiež poskytuje HA chimérové alebo fúzne proteíny. Tak ako sa používa v tomto dokumente, HA „chimérový proteín“ alebo „fúzny proteín“. zahrňuje

HA polypeptid, ktorý je účinne spojený sne-HA polypeptidom. „HA polypeptid“ označuje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia sa zhoduje s HA proteínom, zatiaľ čo „ne-HA polypeptid“ označuje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia zodpovedá proteínu, ktorý nie je v podstate homológny

-61 s HA proteínom, napr. proteínom, ktorý sa odlišuje od HA proteínu, a ktorý je odvodený z toho istého organizmu alebo odlišného organizmu. V rámci fúzneho proteínu sa chce pojmom „účinne spojený“ vyjadriť, že HA polypeptid ane-HA polypeptid sa vzájomne „in-frame“ fúziou spoja. Ne-HA-polypeptid sa môže spojiť fúziou s N-koncom a C-koncom HA polypeptidu. Napríklad v jednom uskutočnení fúznym proteínom je GST-HA fúzny proteín, v ktorom HA sekvencie sa fúziou spojili s C-koncovými GST sekvenciami. Takéto fúzne proteíny môžu uľahčiť purifikáciu rekombinantných HA proteínov. V ďalšom uskutočnení, fúznym proteínom je HA proteín obsahujúci heterológnu signálnu sekvenciu na svojom N-konci. V určitých hostiteľských bunkách (napr. hostiteľských bunkách cicavcov), expresia a/alebo sekrécia HA proteínu sa môže zvýšiť prostredníctvom použitia heterológnej signálnej sekvencie.

Výhodne sa HA chimérový alebo fúzny proteín podľa tohto vynálezu produkuje pomocou štandardných DNA rekombinantných metód. Napríklad, fragmenty DNA kódujúce rôzne polypeptidové sekvencie sa ligujú spolu „in-frame“ podľa bežných metód, napríklad sa používa tupý (zarovnaný) (blunt-ended) alebo posunutý (neprekrývajúci sa) (stagger-ended) koniec na ligáciu, digescia s reštrikčným enzýmom na poskytnutie vhodného konca, doplnenie kohéznych koncov na prijateľné konce, spracovanie alkalickou fosfatázou na zamedzenie neželateľného pripojenia, a enzýmová ligácia. V inom uskutočnení sa fúzny gén môže syntetizovať pomocou bežných metód, vrátane automatických DNA syntetizátorov. Alternatívne sa PCR amplifikácia génových fragmentov môže uskutočniť použitím zakotvených primérov, ktoré spôsobujú komplementárne prečnievania medzi dvoma za sebou nasledujúcimi génovými fragmentárni, ktoré môžu byť potom tepelne hybridizované (annealed) a reamplifikované, aby sa generovala chimérová génová sekvencia (pozri, napríklad Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel a kol., John Wiley & Sons, 1992). Okrem toho, mnohé expresné vektory, ktoré kódujú fúzny podiel sú komerčne dostupné (napr. GST polypeptid). HA-kódujúca nukleová kyselina sa môže klonovať do takéhoto expresného vektora, takže fúzny podiel je „in-frame“ spojený s HA proteínom.

Homológy HA proteínu sa môžu vytvárať mutagenézou, napr. diskrétnou bodovou mutáciou alebo trunkáciou HA proteínu. Tak ako sa používa v tomto

-62dokumente, pojem „homológ označuje rôzne formy HA proteínu, ktoré pôsobia agonisticky alebo antagonistický na aktivity HA proteínu. Agonista HA proteínu môže udržiavať v podstate rovnaké, alebo podprahové biologické aktivity HA proteínu. Antagonista HA proteínu môže inhibovať jednu alebo viac aktivít prirodzene sa vyskytujúcej formy HA proteínu, napríklad prostredníctvom, kompetetívneho viazania so smerovým alebo protismerovým členom biochemickej kaskády, ktorá obsahuje HA proteín, viazaním s cieľovou molekulou, s ktorou HA proteín interaguje tak, že nie je možná žiadna funkčná interakcia alebo pomocou viazania priamo na HA proteín a inhibovaním jeho normálnej aktivity.

V alternatívnom uskutočnení sa homológy HA proteínu môžu identifikovať skríningom kombinatorických knižníc mutantov, napr. trunkačných mutantov, HA proteínu na HA proteínovú agonistickú alebo antagonistickú aktivitu. V jednom uskutočnení sa variegátna knižnica (variegated library) HA variantov vytvára pomocou kombinatorickej mutagenézy na úrovni nukleovej kyseliny a je kódovaná variegátnou génovou knižnicou. Variegátna knižnica HA variantov sa môže získať pomocou napríklad enzýmovej ligácie zmesi syntetických oligonukleotidov do génových sekvencií tak, že degenerovaný súbor potenciálnych HA sekvencií je exprimovateľný ako individuálne polypeptidy, alebo alternatívne, ako súbor väčších fúznych proteínov (napr. na fágový displej) obsahujúcich súbor HA sekvencií tam uvedených. Existujú rôzne metódy, ktoré sa môžu použiť na vytváranie knižníc potenciálnych homológov HA z degenerovanej oligonukleotidovej sekvencie. Chemická syntéza degenerovanej génovej sekvencie sa môže uskutočniť v automatickom DNA syntetizátore, a syntetický gén sa potom liguje do vhodného expresného vektora. Použitie degenerovaného súboru génov umožňuje zabezpečiť v jednej zmesi všetky sekvencie kódujúce požadovaný súbor potenciálnych HA sekvencií. Metódy na syntetizovanie degenerovaných oligonukleotidov sú známe v danej oblasti techniky (pozri napr. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39,3; Itakura a kol., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53,323; Itakura a kol., (1984) Science 198,1056; Ike a kol., (1983) Nucleic AcidRes. H, 477).

Okrem toho, knižnice fragmentov kódujúcich HA proteín sa môžu použiť na vytváranie variegátnej populácie HA fragmentov na skríning a následnú selekciu homológov HA proteínu. V jednom uskutočnení sa knižnica kódujúcich

-63sekvenčných fragmentov môže vytvárať pomocou spracovania dvojvláknového PCR fragmentu HA kódujúcej sekvencie s nukleázou v podmienkach, v ktorých medzera (nick) sa vyskytuje len raz na molekulu, denaturáciou dvojvláknovej DNA, renaturáciou DNA na vytvorenie dvojvláknovej DNA, ktorá môže obsahovať zmysluplné/ nezmyselné páry produktov s rôznym počtom medzier, odstránením jednovláknových častí z novovytvorených duplexov pomocou spracovania sS1 nukleázou a ligovaním výsledného fragmentu knižnice do expresného vektora. Pomocou tejto metódy sa môže odvodiť taká expresná knižnica, ktorá kóduje Nkoncové, C-koncové a vnútorné fragmenty rôznych veľkostí HA proteínu.

Viacero metodík je známych v danej oblasti techniky na skíning génových produktov kombinatorických knižníc vytvorených bodovými mutáciami alebo trunkáciou a na skríning cDNA knižníc na génové produkty, ktoré majú zvolené vlastnosti. Takéto metódy sú prispôsobiteľné na rýchly skríning génových knižníc vytvorených kombinatoriálnou mutagenézou HA homológov. Najviac používané metódy, ktoré sú vhodné na vysokoúčinnú „through-puť analýzu na skríning veľkých génových knižníc, typicky zahrňujú klonovanie génovej knižnice do replikovateľných expresných vektorov, transformovanie vhodných buniek s výslednou knižnicou vektorov a exprimovanie kombinatorických génov v podmienkach, v ktorých detekcia požadovanej aktivity uľahčuje izoláciu vektora kódujúceho gén, ktorého produkt sa detegoval. Rekurzívna množina mutagenézy (REM), nová metóda, ktorá zlepšuje frekvenciu funkčných mutantov v knižniciach, sa môže použiť v kombinácii so skríningovými skúškami na identifikáciu HA homológov (Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89,7811-7815; Delgrave a kol., (1993) Protein Engineering 6(3), 327-331).

V inom uskutočnení sa skúšky na báze bunky môžu využiť na analýzu variegátnej HA knižnice, ak sa použijú metódy, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky.

D. Použitie a spôsoby vynálezu

Molekuly nukleovej kyseliny, proteíny, proteínové homológy, fúzne proteíny, priméry, vektory a hostiteľské bunky opísané v tomto dokumente sa môžu použiť v jednej alebo vo viacerých nasledovných spôsoboch: identifikácia C. glutamicum

-64a príbuzných organizmov; mapovanie genómov organizmov príbuzných C. glutamicum; identifikácia a lokalizácia C. glutamicum sekvencií, ktoré sú predmetom záujmu; evolučné výskumy; stanovenie oblastí HA proteínu potrebných na funkčnosť; modulácia HA proteínovej aktivity; modulácia metabolizmu jednej alebo viacerých anorganických zlúčenín; modulácia modifikácie alebo degradácie jednej alebo viacerých aromatických alebo alifatických zlúčenín; modulácia syntézy bunkovej steny alebo jej prestavba; modulácia enzýmovej aktivity alebo proteolýzy; a modulácia celulárnej produkcie požadovanej zlúčeniny, takej ako špeciálna chemikália.

Molekuly HA nukleovej kyseliny, podlá tohto vynálezu, majú rozmanité použitia. Po prvé, môžu sa použiť na identifikáciu organizmu, akým je Corynebacterium glutamicum alebo príbuzných organizmov. Taktiež sa môžu použiť na identifikáciu prítomnosti C. glutamicum alebo príbuzných organizmov v zmiešanej populácii mikroorganizmov. Vynález poskytuje sekvencie nukleových kyselín mnohých C. glutamicum génov; pomocou sondovania extrahovanej genómovej DNA kultúry jednotnej alebo zmiešanej populácie mikroorganizmov v stringentných podmienkach so sondou prekleňujúcou oblasť C. glutamicum génu, ktorá je osobitá pre tento organizmus, možno určiť, či je tento organizmus prítomný. I keď Corynebacterium glutamicum samotná je nepatogénna, je príbuzná s patogénnymi druhmi, takými ako Corynebacterium diphtheriae. Corynebacterium diphtheriae je kauzatívny agens diftérie, rýchle sa vyvíjajúcej, akútnej horúčkovitej infekcie s následkami tak lokálnej ako aj systémovej patológie. Pri tejto chorobe, sa vyvíja lokálne poškodenie horného respiračného traktu s nekrotickým poškodením epitelových buniek; bacily vylučujú toxín, ktorý sa rozšíri cez toto poškodenie do distálnych vnímavých telesných tkanív. Degeneratívne zmeny spôsobené inhibíciou proteosyntézy v takých tkanivách, ako v srdci, svale, periférnych nervoch, nadobličkách, obličkách, pečeni a slezine, majú za následok systémovú patológiu choroby. Diftéria pretrváva s vysokým výskytom v mnohých častiach sveta, vrátane Afriky, Ázie, východnej Európy a v nezávislých štátoch bývalého Sovietskeho zväzu. Pokračujúca epidémia diftérie vo východnej Európe a nezávislých štátoch bývalého Sovietskeho zväzu si vyžiadala najmenej 5000 úmrtí od roku 1990.

-65V jednom uskutočnení vynález poskytuje spôsob na identifikáciu prítomnosti alebo aktivity Corynebacterium diphtheriae v subjekte. Týmto spôsobom sa deteguje jedna alebo viacej nukleovokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencií uvedených s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), alebo aminokyselinových sekvencií (napr. sekvencie uvedené s párnym očíslovaním SEQ ID NO:v Sekvenčnom zázname) v subjekte, čím sa deteguje prítomnosť alebo aktivita Corynebacterium diphtheriae v subjekte. C. glutamicum a C. diphtheriae sú príbuzné baktérie a mnoho molekúl nukleových kyselín a proteínových molekúl v C. glutamicum je homológnych s C. diphtheriae molekulami nukleovej kyseliny a proteínovými molekulami, a preto sa môžu použiť na detekciu C. diphtheriae v subjekte.

Molekuly nukleových kyselín a proteínov podľa tohto vynálezu môžu byť tiež markérmi špecifických oblastí genómu. Je to využiteľné nielen pri mapovaní genómu, ale tiež pri funkčných výskumoch proteínov C. glutamicum. Napríklad, na to, aby sa identifikovala oblasť genómu, ku ktorej sa viaže určitý C. glutamicum DNA-väzbový proteín, by sa mal genóm C. glutamicum podrobiť digescii a fragmenty inkubovať s DNA-väzbovým proteínom. Tie, ktoré viažu proteín môžu byť dodatočne sondované s molekulami nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, výhodne s ľahko detegovateľnými značkami; viazanie takejto molekuly nukleovej kyseliny s genómovým fragmentom umožňuje lokalizáciu fragmentu na genómovej mape C. glutamicum, a keď sa to uskutoční viacnásobne s rôznymi enzýmami, uľahčí to rýchle stanovenie sekvencie nukleovej kyseliny, ku ktorej sa viaže proteín. Ďalej, molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu môžu byť dostatočne homológne so sekvenciami príbuzných druhov, takže molekuly nukleových kyselín môžu fungovať ako markéry pri konštrukcii genómovej mapy v príbuzných baktériách, takých ako Brevibacterium lactofermentum.

Molekuly HA nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sú tiež využiteľné pri evolučných výskumoch a výskumoch proteínovej štruktúry. Procesy zapojené do adaptácie a udržania homeostázy, na ktorej sa molekuly podľa tohto vynálezu podieľajú, sú využívané veľkým množstvom druhov; porovnaním sekvencií molekúl nukleových kyselín podľa predloženého vynálezu s tými, ktoré kódujú podobné enzýmy u iných organizmov sa môže určiť evolučná príbuznosť organizmov.

-66Podobne, také porovnanie umožňuje určiť, ktoré oblasti sekvencie sú zachované, a ktoré nie, čo môže pomôcť pri stanovení takých oblastí proteínu, ktoré sú esenciálne pre fungovanie enzýmu. Tento druh stanovenia je hodnotný pre výskumy proteínového manipulovania a môže byť indikáciou, čo proteín môže tolerovať pri mutagenéze bez straty funkcie.

Manipulácia s molekulami HA nukleových kyselín podľa tohto vynálezu môže zapríčiniť to, že sa produkujú HA proteíny, ktoré sú funkčne odlišné od „divého“ typu HA proteinov. Tieto proteíny môžu mať zvýšenú účinnosť alebo aktivitu, môžu byť prítomné v bunkách vo väčších počtoch ako obyčajne, alebo môžu mať zníženú účinnosť alebo aktivitu.

Vynález poskytuje spôsoby na skríning molekúl, ktoré modulujú aktivitu HA proteínu, buď pomocou interakcie so samotným proteínom alebo substrátom alebo väzbovým partnerom HA proteínu, alebo modulovaním transkripcie alebo translácie molekuly HA nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu. Pri týchto spôsoboch sa mikroorganizmus, ktorý exprimuje jeden alebo viac HA proteinov podľa tohto vynálezu, uvedie do kontaktu s jednou alebo viacerými testovanými zlúčeninami a stanoví sa vplyv každej testovanej zlúčeniny na aktivitu alebo rozsah expresie HA proteínu.

Modulácia aktivity alebo počtu HA proteinov zapojených do biosyntézy alebo prestavby bunkovej steny môže ovplyvňovať produkciu, výťažok a/alebo účinnosť produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z buniek C. glutamicum. Napríklad menením aktivity týchto proteinov je možné modulovať štruktúru alebo hrúbku bunkovej steny. Bunková stena funguje vo veľkej miere ako ochranný prostriedok proti osmotickej lýze a externým zdrojom poškodenia; modifikáciou bunkovej steny je možné zvýšiť schopnosť C. glutamicum odolávať mechanickým a strihovým silám, ktoré pôsobia na mikroorganizmus pri fermentácii kultúry vo veľkom rozsahu. Ďalej, každá bunka C. glutamicum je obklopená tenkou bunkovou stenou, a tak významná časť biomasy prítomnej pri fermentácii vo veľkom rozsahu sa skladá z bunkovej steny. Zvýšením rýchlosti, ktorou sa bunková stena syntetizuje alebo aktiváciou syntézy bunkovej steny (prostredníctvom genetického manipulovania HA proteinov bunkovej steny podlá tohto vynálezu) je možné zvýšiť rastovú rýchlosť tohto organizmu. Podobne, ak sa zníži aktivita alebo

-67počet proteínov zapojených do degradácie bunkovej steny alebo sa zníži represia biosyntézy bunkovej steny, môže sa dosiahnuť celkové zvýšenie produkcie bunkovej steny. Zvýšenie počtu životaschopných buniek C. glutamicum (ktoré môže byť uskutočnené pomocou ktorejkoľvek už opísanej zmeny proteínu) by mohlo zvyšovať počet buniek produkujúcich požadovanú špeciálnu chemikáliu pri fermentácii kultúry vo veľkom rozsahu, čím by sa mohli zvýšiť výťažky alebo účinnosť produkcie týchto zlúčenín z kultúry.

Modulácia aktivity alebo počtu C. glutamicum HA proteínov, ktoré sa podieľajú na modifikácii alebo degradácii aromatických alebo alifatických zlúčenín môže mať tiež priame alebo nepriame vplyvy na produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z týchto buniek. Určité aromatické alebo alifatické modifikačné alebo degradačné produkty sú požadovanými špeciálnymi chemikáliami (napr. organické kyseliny alebo modifikované aromatické a alifatické zlúčeniny); a tak pomocou modifikovania enzýmov, ktoré vykonajú tieto modifikácie (napr. hydroxyláciu, metyláciu alebo izomerizáciu) alebo degradačné reakcie, je možné zvýšiť výťažky týchto požadovaných chemikálií. Podobne, znížením aktivity alebo počtu proteínov zapojených do dráh, ktoré ďalej degradujú modifikované alebo rozložené produkty vyššie uvedených reakcií, je možné zvýšiť výťažky týchto špeciálnych chemikálií z buniek. C. glutamicum v kultúre.

Tieto aromatické a alifatické modifikačné a degradačné enzýmy sú samotné špeciálnymi chemikáliami. V purifikovanom stave sa tieto enzýmy môžu použiť na degradáciu aromatických a alifatických zlúčenín (napr. takých toxických chemikálií ako sú ropné produkty), buď pri bioregenerácii znečistených miest, pri regulovanej dekompozícii odpadov, alebo na veľkorozmernú a ekonomicky prijateľnú produkciu požadovaných aromatických alebo alifatických zlúčenín alebo ich rozkladných produktov, niektoré z nich sa dajú bežne použiť ako uhlíkaté alebo energetické zdroje pre ďalšie špeciálne chemikálie produkujúce zložky pri kultivácii (pozri, napr. Faber, K. (1995) Biotransformations in Organic Chemistry, Springer, Berlín a odkazy tam uvedené; aRoberts, S.M., ed. (1992-1996) Preparative Biotransformations, Wiley, Chichester a odkazy tam uvedené). Ak sa proteíny geneticky zmenia tak, že ich regulácia pomocou iných celulárnych mechanizmov je znížená alebo odstránená, umožní sa tým zvýšiť celkový počet alebo aktivitu týchto

-68proteínov, a tým zvýšiť nielen výťažok týchto špeciálnych chemikálií, ale aj aktivitu takto získaných proteínov.

Modifikácia týchto aromatických a alifatických modifikačných a degradačných enzýmov môže mať tiež nepriamy vplyv na produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií. Mnohé aromatické a alifatické zlúčeniny (také ako tie, ktoré sa môžu vyskytnúť ako nečistoty v kultivačnom médiu alebo ako odpadné produkty zcelulárneho metabolizmu) sú toxické pre bunky; pomocou modifikácie a/alebo degradácie týchto zlúčenín sa tieto môžu ľahko odstrániť alebo rozložiť, čo by malo zvýšiť životaschopnosť bunky. Ďalej, tieto enzýmy môžu modifikovať alebo degradovať tieto zlúčeniny takým spôsobom, že výsledné produkty môžu vstúpiť do zvyčajných uhlíkových metabolických dráh bunky a tak, umožnia bunke využiť tieto zlúčeniny ako alternatívne zdroje uhlíka a energie. Pri kultivácii vo veľkom rozsahu, kedy môžu byť limitované optimálnymi uhlíkovými zdrojmi, poskytujú tieto enzýmy spôsob, pomocou ktorého môžu bunky nepretržite rásť a deliť sa, pričom využívajú aromatické alebo alifatické zlúčeniny ako živiny. V jednom i druhom prípade následné zvýšenie počtu C. glutamicum buniek v kultúre produkujúcej požadovanú špeciálnu chemikáliu by malo naopak spôsobovať zvýšené výťažky a alebo účinnosť produkcie špeciálnej (ych) chemikálie (ií).

Modifikácie aktivity alebo počtu HA proteínov zapojených do metabolizmu anorganických zlúčenín môžu tiež priamo alebo nepriamo vplývať na produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z C. glutamicum alebo príbuzných baktériových kultúr. Napríklad mnohé z požadovaných špeciálnych chemikálií ako nukleové kyseliny, aminokyseliny, kofaktory a vitamíny (napr. tiamín, biotín a kyselina lipoová) nemožno syntetizovať bez fosforitých, dusičnanových a síranových anorganických molekúl a anorganických molekúl železa. Anorganický metabolizmus proteínov podľa tohto vynálezu umožňuje bunke získať tieto molekuly z rozmanitých anorganických zlúčenín a odkláňa ich do rôznych biosyntetických dráh pre špeciálne chemikálie. Preto, pomocou zvyšovania aktivity alebo počtu enzýmov, zapojených do metabolizmu týchto anorganických zlúčenín, je možné zvýšiť zásobu týchto snáď limitujúcich anorganických molekúl a v dôsledku toho priamo zvyšovať produkciu alebo účinnosť produkcie rôznych špeciálnych chemikálií z buniek C. glutamicum, ktoré obsahujú takto zmenené

-69proteíny. Modifikácia aktivity alebo počtu anorganický metabolizovaných enzýmov podlá tohto vynálezu môže tiež spôsobiť to, že C. glutamicum je schopná lepšie využívať zásoby limitovaných anorganických zlúčenín, alebo využívať anorganické zlúčeniny, ktoré nie sú optimálne na syntézu aminokyselín, vitamínov, kofaktorov alebo nukleových kyselín, ktoré sú všetky potrebné na kontinuálny rast a replikáciu bunky. Zvyšovaním životaschopnosti týchto buniek pri kultivácii vo veľkom rozsahu sa môže tiež zvýšiť počet buniek C. glutamicum produkujúcich jednu alebo viac špeciálnych chemikálií v kultúre samotným zvyšovaním výťažkov alebo účinnosti produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií.

C. glutamicum enzýmy pre základné procesy sú samotné požadovanými špeciálnymi chemikáliami. Špecifické vlastnosti enzýmov (t.j. okrem iného regioa stereošpecificita) im umožňujú úspešne katalyzovať chemické reakcie in vitro. Tiež celé C. glutamicum bunky sa môžu inkubovať s vhodným substrátom tak, že požadovaný produkt je produkovaný enzýmami v bunke, alebo požadované enzýmy sa môžu nadmerne produkovať a purifikovať z C. glutamicum kultúr (alebo im príbuznej baktérie) a následne využiť na in vitro reakcie v priemyselnom merítku (buď v roztoku alebo imobilizované na vhodnej imobilnej fáze). V jednej i druhej situácii, enzým môže byť buď prirodzený C. glutamicum proteín, alebo sa môže zmutovať, aby mal zmenenú aktivitu; charakteristické sú priemyselné použitia takýchto enzýmov ako katalyzátorov v chemickom priemysle (napr. v syntetickej organickej chémii), ako potravinové aditíva, kŕmne doplnky, pri spracovaní ovocia, preparácii kože, v detergentoch, v analýze a medicíne a v textilnom priemysle (pozri, napr. Yamada, H. (1993) „Microbial reactions for the production of useful organic compounds“, Chimica 47, 5-10; Roberts, S.M. (1998) „Preparative biotransformations: the employment of enzymes and whole-cells in synthetic chemistry, J.Chem.Soc. Perkin. Trans. 1, 157-169; Zaks, A. and Dodds, D.R. (1997) .Application of biocatalysis and biotransformations to the synthesis of pharmaceuticals“, DDT 2, 513-531; Roberts, S.M. and Williamson, N.M. (1997) „The use of enzymes for the preparation of biologically active natural products and analogues in optically active form“, Curr. Organ. Chemistry 1, 1-20; Faber, K. (1995) Biotransformations in Organic Chemistry, Springer, Berlín; Roberts, S.M., ed. (1992-96) Preparative Biotransformations, Wiley, Chichester, P.S.J. (1995) „The applications of enzymes in industry“ v Handbook of Enzýme Biotechnology, 3^rd ed.,

-70Wiseman, A., ed., Elis, Horwoood, str. 419-552; aUllmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987), vol. A9, Enzymes, str. 390-547). Tak, pomocou zvyšovania aktivity alebo počtu týchto enzýmov, je možné tiež zvýšiť schopnosť bunky premieňať dodané substráty na požadované produkty, alebo nadmerne produkovať tieto proteíny na zvýšenie výťažkov pri kultivácii vo veľkom rozsahu. Ďalej, mutagenézou týchto proteínov je možné odstrániť inhibíciu spätnou väzbou alebo iné represívne bunkové regulačné riadenia, takže väčšie počty týchto enzýmov sa môžu produkovať a aktivovať bunkou, v dôsledku toho iniciovať väčšie výťažky, produkciu alebo účinnosť produkcie týchto špeciálnych chemikálií pri kultivácii vo veľkých rozmeroch. Okrem toho, manipulovaním s týmito enzýmami sa môže meniť aktivita jednej alebo viacerých C. glutamicum metabolických dráh, ako sú dráhy pre biosyntézu alebo sekréciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií.

Mutagenéza proteolytických enzýmov podľa tohto vynálezu, ktorou sa mení ich aktivita alebo počet, môže tiež priamo alebo nepriamo pôsobiť na výťažok, produkciu, a/alebo účinnosť produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z C. glutamicum. Napríklad, zvyšovaním aktivity alebo počtu týchto proteínov, je možné zvýšiť schopnosť baktérie prežiť pri kultivácii vo veľkom rozsahu, v dôsledku zvýšenia schopnosti bunky rýchlo degradovať chybne poskladané proteíny pri zareagovaní na vysoké teploty, pH, ktoré nie je optimálne a na iné stresy, ktoré sa vyskytujú počas fermentácie kultúry.

Zvýšené počty buniek v týchto kultiváciách zvyšujú výťažky alebo účinnosť produkcie jednej alebo viacerých požadovaných špeciálnych chemikálií, a to v dôsledku väčšieho množstva buniek produkujúcich tieto zlúčeniny pri kultivácii. Navyše, bunky C. glutamicum majú rozmanité bunkovo-povrchové proteázy, ktoré štiepia externé živiny na molekuly, ktoré bunky môžu ľahko inkorporovať ako uhlíkové/energetické zdroje alebo živiny iných druhov. Zvýšenie aktivity alebo počtu týchto enzýmov môže zvýšiť ich premeny a zvýšiť množstvá využiteľných živín, a týmto spôsobom zvyšovať bunkový rast alebo produkciu. Takto, modifikáciami proteáz podľa tohto vynálezu, sa môže nepriamo ovplyvniť C. glutamicum produkcia špeciálnych chemikálií.

-71 Priamejší dosah na produkciu špeciálnych chemikálií v závislosti na modifikácii jednej alebo viacerých proteáz podľa tohto vynálezu môže nastať, ak sú tieto proteázy zapojené do produkcie alebo degradácie požadovanej špeciálnej chemikálie. Pomocou znižovania aktivity proteázy, ktorá degraduje špeciálnu chemikáliu alebo proteín zapojený do syntézy špeciálnej chemikálie, je možné zvýšiť množstvo tejto špeciálnej chemikálie (v dôsledku zníženej degradácie alebo zvýšenej syntézy zlúčeniny). Podobne, pomocou zvyšovania aktivity proteázy, ktorá degraduje zlúčeninu, z ktorej sa odvodzuje špeciálna chemikália alebo proteín zapojený do degradácie špeciálnej chemikálie, mal by sa dosiahnuť podobný výsledok: zvýšené hladiny požadovanej špeciálnej chemikálie z buniek C. glutamicum obsahujúcich tieto manipulované proteíny.

Vyššie spomenuté stratégie mutagenézy HA proteínov, ktoré majú za následok zvýšené výťažky špeciálnej chemikálie z C. glutamicum, nie sú mienené ako limitujúce; variáce týchto stratégií sú očividne ľahké pre odborníkov, ktorí pracujú v danej oblasti techniky. Použitím takýchto stratégií a inkoroporáciou mechanizmov opísaných v tomto dokumente, molekuly nukleovej kyseliny a proteínové molekuly podľa tohto vynálezu sa môžu využiť na vytváranie C. glutamicum alebo príbuzných kmeňov baktérií, v ktorých expresia mutovaných HA molekúl nukleovej kyseliny a proteínových molekúl je taká, že výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie požadovanej zlúčeniny sa zvýši. Požadovanou zlúčeninou môže byť akýkoľvek produkt produkovaný C. glutamicum, vrátane konečných produktov biosyntetických dráh a medziproduktov prirodzene sa vyskytujúcich metabolických dráh, ako aj molekúl, ktoré sa prirodzene nevyskytujú v metabolizme C. glutamicum, ale ktoré sú produkované kmeňom C. glutamicum podľa tohto vynálezu.

Tento vynález je v ďalšom ilustrovaný pomocou nasledovných príkladov, ktoré by sa nemali chápať ako limitujúce. Obsahy všetkých literárnych odkazov, patentových prihlášok, patentov, publikovaných patentových prihlášok, tabuliek a sekvenčných záznamov, ktoré sú citované v tejto prihláške, sú týmto zahrnuté ako odkaz.

ω x ><λ

> >. c <β> α

Α ο je c u_i

°t o

4— ω] η (Q Ι-

	0)
	CD		Tt
CO	CO	00	o
0)	ID	CO
CM	CO	h-	CM

>55 ä

O			00	CM	CM	CD	r*.
o	o	CO	CD	O	00		co
00	CO	ID	CM		|x	'’t	fx
CO	t—			CM	CM	CO	00

	0)			o	CM	tn	CM	CM
CO	O		CM	CM	CO	o	O
CM	m		tn		CD	T“	CD	|X
	00	CO	TT	Ä	i	CM	CM	b-
ID		CD	tn	CD	CD CD	CD	CM
ID		ID	tn	tn	m	in	tn	’t
CD	Q	CD	CD	CD	CD	CD	CD	rx
O	CM	O	o	o	α	o	o	o
O	O	O	o	o	o	o	o	o

	s	fx	tn CM
	h*	rt	CM
CM	CM	in	CO
CO	0)	co	o
b-	v	ro	CM
	ž	co	tT

CM l·-

o

CM

ν-

co

©

to

CO

©

©

©

b.

CM

O

CM

©

o

b-

©

©

o

to

O

to

b>

©

CM

o

b-

αό

©

©

r*

o

N

CO

r·

CM

©

to

©

©

b*

©

©

b*

b* b*

o

©

b.

©

©

to

to

©

©

CO

to

CO

to

O

b-

Φ

o

i—

O

to

CM

CM

©

©

co

o

O

©

© ©

o

©

©

o

©

b.

o

©

to

©

CM

b*

©

4

to

4

© to

©

©

©

τ’

to

to

o

T“

CO

to

to to

©

©

©

T·

©

Φ

o

©

©

CM

M

©

tJ-

b-

©

©

©

to

CM

O

to

o

©

O

CM

©

to

o

b*

φ

b.

CM

CM

©

b*

to

©

©

©

φ

©

b.

CM

©

o

O

©

©

©

©

b.

CM

©

©

b-

CM

©

CM

©

©

to

b*

1-

©

©

©

©

CM

CM

O

CM

©

•Φ

©

to

CM

©

©

©

O

CM

CM

©

©

o

©

b*

©

o

b.

Φ

CM

©

CM

CM

©

©

b*

co

©

O

O

o

O

O

©

O

©

O

O

O

O

o

O

©

o

o

o

O

Q

O

O

o

O

o

O

O

O

o

O

T-

o

o

CO

© © O CM © © © CD © © ©

O CM b. b·

	©	©	o	CM	’Φ	©	©	O
b.	b-	b-	©	©	CO	©	CO	to

CM cn

OCM-M-©®OCMxf

Μ·©®ΟΟΟΟΟί-τ-ι-

© CO © O CM © ^ ^(0 á o > £ 'S □ Q.

W -S -,5 U. U- L. n y x φ φ φ s £ Ό Ό Ό

Ô S >» c C C w Q- N α) φ ω £ JL tť O θ Ό ???

tototoinmtototototo CÓCOCOCÓCÓCÓCÓCOCOCÓ ΟΟΟϋΟΟΟΟϋϋ UJLUUJLUUJUJUJUJLUUJ

SQJ 'UJ 'Ul §£££ ? 6 £ E ΐα3 8.ΖΛ >»Q o <V Φ Φ

□ <

£3 (U fll — — ® P Ό — — Λ _Σ ' Λ Λ·

I*q s Sgs

S5

P CE CC r>

bCM

CO to b* O) CO CO CO CO 00 .x JC O Q

Φ CD'

C Φ

Φ 5 *C ^Ä

C OJ

C C'<'< UJ UJ z ® ® ZZtECE<

λι m << *í* __ _O 5» Τ» L-l í_l £<<og co

CM to

CM

O) t·

CM

CO to b* O) τΟ O O O 7CM CM CM CM CM <D je a> <D < < Q. O Q. Q.^ φ ’JľD m m — — Ό Š tob-OJT-cotob-OJT-cOtob·· totototototototorsNH>b>>

Q- CL 0LU UJ UJ CL CL CL OOO Q Q Q Z Z Z UJ UJ UJ • >> rJ >» >»“ C N ^w N N E Q -3 -M O φ UJ φ φ

M!

:3 r- Z

OO W LLI UJ P

OOOOOOOOOO xxxxxxxxxx QQQQQQQOQQ

XXXXIXXXIIrJTtOÄ^^

OOOOOOOOOOu, 2 2 2 QQQQQQQQQQ * ~T* ä Ό Ό Ό ca <= > > >

Φ C m >

α	O|
u>	z
ž	Q
o
c	σ
E	UJ
<	ω!
(0

UJ U1 UJ H H H OOO CE CE CE

CL Q. 0_ OOO * X *

000 OOO < < < ω tn co ÓÓÓ

N 5, φ C <0 ” <u f £ = S CO -Φ ~

CE u. CC 000

O t- CM OOO to to to OOO OOO αϋ u ΰ >*>.>» 5>

_Ä 'Φ Φ Ό coX O 2

SJ?

Q Q Z Z Z >>UJUJo xx g g s tu IU O O / Q Q X X b Q O Q 05 >>>->-□ xxxxW UJ UJ UJ UJ y qqqqS žžzzg —~= LL LL =J x x q <

D Z>> N

X 5Í X'< ....... Q

X o x

UJ £<<OO<<x°Oz§:§:ujujOOt

Χ(ηω2Σ_Ι_13ι-ι--·’·— _ MJ -w = 'W W v v £>ώ£ £££SS >» uí r ο. ω

Q X o CE LU CL •2 £ r5 fi <*“ Ό MD Ό Ό ² e C C C φ φ o o O o *- *- Q. Q. Q. Q.

čixxmmSSz

O

O

CM

b-

τ-

1—

<

T“

03

o

CO

o o

Ο

CO

CD

T“

O

O

O

CO

r*.

’M· CO

CM

o

t·

CO

b-

CO

to

CO

CO

b-

CO

T·

CM

b-

03

CM

CM

CM

*“

í- cô

to

co

CO

to

03

7“

to

CD

r*

^·

o

CO

O)

K

o

CO

ω

Q

to

CO

CO

CO

O

CO

M*

CM

to Tt

CM

to

Tí-

co

to

CM

CO

CO

CD

o

to

CO

CM

O to

03

o

b«

b-

T·

CO

CM

r-

4—

CM

CM

b-

b- T-

to

CO

CO

T·

CO r- o o> o o OOO p CE CE §00

O

S b- co w co O O) o o o o o o

O

OCĽÔifflCíEtEÍEÍĽíEQZCEO

005000000000Ž to CM to O 03 O) b>

to rn to o 2 p O G3 rco r* O T H

00 b- CM CM x cr o x x x x

0 Ž 0 CD 0 CD

1Λ loco.in — in m b co 5° cm cm R cm w o o S o 2

LO LO o LO

CM

’M-

CD

CO

o

CM

xj-

co

co

o

CM

CD

CO

O

CM

to

00

o

CM

Tf

co

00

O

CM

Tf

CD

CO

O

CM

Tf

CD

00

O

CM

to

to

in

to

ω

ω

to

to

to

b*

b-

r*.

b-

b-

CO

00

00

CD

oo

03

G)

G3

03

G)

O

O

O

O

O

CM

CM

r—

T“

r-

T“

*·

v-

v-

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

Μ^- o LU

CO xb h* bO LLl

CO CN cô cô o

LU

CM CO

M· G) a> cô

M·

G) G)

CÔ

CO

O UJ in co O ĽLI

CD CO

D S _i >

CC o

CO ΟΟ CO 00 CD ri — „O O τη τη CO LU LU

0) c CO > O >o <0

1— x o Q.

Ol ° £3

Q S roj |_>M

I—

0'3 w-o

CC

Q >

X

Q

X O

CL LLl

CM CM CM CN CM CÔ CÔ CÔ CÔ CÔ O Q O O O LLl LU LU UJ UJ « o c > x o x o ŕ'*

O □ o. N o a:

CO CO

CM

CM CM G) o CO 0)

o Ľ

Q > X X X X Ľ x o o o o o

N N N N N X X X X X

D □ D Ώ Ώ X X X X X

UJ UJ LU UJ LU fj

X X X X X-in__ x x x x x 5ť< >

ω O w.«

Z S‘O .S ω 5 cc gž q ω ^ÓÓÓÓÓ Φ 5| 2 £ H Q Q Q Q Q > LU I—

Q3< <<<< d <χωωωωωχ

CO in m o xf oo

CM CO

M“ o o CO f- CD cd

Ό

W co m

O) b3 co CO CO

CO O) bo o CM

CD t- b. b- co i- bb. co co G) CD b* CD Ώ G)co co i- m cob* cn o m b- *-cn o o o o coo

O O O O CNO

CC CC CC CC O tr

00(0050 cr ccccO< o Q q¹ n > > cc x x □ lULU

LLl x

X

- w'£ FSO z^<oo

CM < tfí — — ío ° o Q X Z Q

CD O CO CO x- CO M· TCD CN CD M* CD b- cn -e in cp CN CO b· CN CO xb O G) O O O O O x- O O O O CC o CC CC CC CC oSoooo ľľ ľľ X O Q Q-< z OOb^ x x Ί < ψψίΗ \

v) \JJ □ o Š > x x t g <

co co

O

Z

Q ω ~5

Q O

CL ii

UJ · ·

CM

Q LU xb xb

O)G)G)G)0)0)G)G)0Í 0000)00)0)0)0) - * * b- b· |< [< |<

b* b*

A CL CL ac cc cc < < < z z z

OOOOOOOOO

LULUUJUJUJUJLUUJUJ

LU'>->-'> '-'Z Z Z o o-o o ω O LL

Z o LL ω o LL

N O .< co fgä jh sä? ,a> x Φ H O o< “ Q. H u.

o — uj ·

CM

P” h o ίο¹

X x o _i

O ω LU —i > CC <

CM O tu

CO

-a

Q), ω

UJ

O

N

O t

ä

LU

X

Q

O < ύ

O uj Sb < ϊχο.2 ó

H 'í a:

< CL ω < O N

UJ o o x Q > X Ul Q

CO CM l<

CM

UJ ΙΟ a: o_

LU ω s o υ

c

CO

CD 0)0 o in in cm O) *“ m χ-

	CO
co	CO	b.	tn		m	b-	b*			b.
co	00	CO		G)	CN		M-	CO	b.	CO
co	(D	b.		O	m	co	in	in	o	CD
CM	v—	x-	b*	CD	CD	CO	r-	CD	σ>	in

CO m b-

o	CN
CN	M*			o	00	i- CN	CO	o	CD
CO	r—	o	CD	m	co	CO CO	b*	Xŕ	CO
G)	00	CO	m	o	m	m· o	m	b.	b*
CN	4“	CD	b.	b*	b.	co	▼*	T“	CO

0) m m b* x- CM CO x—

CĎ CN ⁰³ bCN xb x- bCO T- o o

CD *CO CN T- CO

OOOOOOOOO m<< < ALULULUUJLUUJLUUJnjAaZj •SíffiEžWSSS xxxxxxxxxt:“-^“uxxxxxxxx$^>> _ι_i _j _i _i _i _i _i_i < O O O <<<<<<<<< CDOQO ooooooooooppo bDDDDDDDDD^^^ qqqoqqoqqo££X UJUJUJUJUJUJUJLUUJLUttt ccccccccccccccccocaczzz

	CD	b-	CD	G)	O	o	o	G)	v»	G)
	b*	bF	b·	b.					CN	CD
CD	co	Φ co	CO	CO CO	CO	CD	G		O
Xf	o	M· o	O	m o	o	O	o	O	O	O
V“	o	T- o	O	t- O	o	o	o	o	o	O

OXOXXPXXXXXXX žo^oosooooooo

Q_ CL

CC CC < <

CO

CN

CO r<

CN

ô.

tč

UJ > o $ Q_ í CN

UJ

Z z ’uj'uj o o o o flC CĽ UJ UJ n n z z < < . _ OO Z z ^m

D D'Šf (D O H í- 11 yoogg ooSSoot -----2 tr z .< h uj

UJ LU cn O Q O Q_ UJ Q I CL x

LL

O LU l< r<

Φ C (Q > O >o (0

L· o Q.

(0 (0 oi o ω ä

CO cc x '> c *o (Q je £ ΤΟ φ 2 co φ ω >

o c E <

<_P'_r- I— -y u. p^zS CO □ ω

LL ~ ^ωο£ l_ < < ^C7 e cc tr Coo X*9 bt ht=j=5u)Š ESEEnn^u. č^ee H H t ^{0 33} Z ^ω·5, bco ω

CN m r*

UJ

O ω CC □ CL O

0)

CD r- b

CD ID CO CN CO CD CD CN CN CN t- ~ to o

CD CO n

S

CN

CO CN σ> co

CO o

O — CC oc

CD b· CO o V- CD o o o o CO

CM O CO

CO CE ll = Z Ol

Z z uj'uj H ΓΟΟ

Z

LU o o O

S

O CC 0ô

D

Z ±

CL

Q <

< UJ £15 Q £ < y LĹI Q,Z

Z'3 t Zj LU

d. O O H E t m o HíEa*Kj“^^GC í í < o- Z z č a„oozzzwox^z ·. UJ UlOOO Z I- o zo 5553555'5 S'£S

DCĽ O CE UJ UJ tr u_ o 5 N Q Z O CC z

OJ ω c

□ LL co ’o

C

D

S

M* o in CO Ν’

s. CO CM cn bb· r?co

0) σ> co co o

0)

CO

0) b« b·

CO CO CO <0

M· o CM CO M·

Ol O ω

O CM

Tt LD rCM i-

Q

n

CO

CN

00

tn

tn

b-

CN

0)

in

CO

CN

O

O

co

O

00

CN

CO

CO

CD

0)

LO

b-

CN

CN

tn

0)

o

b·

0)

CO

b-

T-

CN

CN

CD

CO

Ύ— T“

00

CO

CN

CN

CO

b.

CO o oížžlč

CO r- O CD t- CN CD O O O O O

O o o

CN

O

3 r- r- moom o o o

5(20000 n o

CN O

CC ČCČ § ooo§ co O) CN O O a o o _ CC CC (50 co -e o tn o f f b*

CN

Ί“

O —

Q

K0 bCO o

o

3? o S co o o co co co LD bo o

CO o CO

CD CO CN co o τι- co e O τ- τΟ O O o co co in o So b- cn g b. b- b- CO X O CN CN o 7 o o o o σ> in o o

CO CO CD bCO O »- O

O O _ _ Z Z Z O XXXX CC CC CC CC

T- co co m cô S o o

O CN cô cô

M* cô

CO

CO

OD O

1- CN CO CO

CN M- CD CN CN CN CO CO CO

CN CO

O

CO CO

CN CO CO

Ms

CC

N.Z e uj D h— *o ω ľ

o..

£ O z 'uj ac a.

> z m O Q O a.

UJ i ω o LL ~1 Ul

O □ $ <

Ž MujTfuj o ^gc <cc

CL X LL <

o

CC

CL

Š O tr r 0 CO CD'O CÔ CÔ o o 2 UJ IU g 10 ω O LL i o

CL____

O O O ω Q x x τ o w uj · - · ~

LL Z

CL

CC

UJ

CL ô3 u Q.

LL Q cc o σί co co 5^ ty. o o <· e ľ S α. a. i²* D Q UJ E L φ~— o LL ω O ll oo !Z * O D Q Q oo O Q r r

S Σ

N

O_Ä-C o-5'< U- LL LL W -I -I 0^3 u- ω ω

tťl « σ

c o x

CD

CO CO

CO CO

CO

		o	CO
CD	CO	CN	CN
in	co			CO
CN	b-	O	Φ	CO
CO	CN	r		CN

CD í?

CO

CM

G)

T“

CO o s

0)

CO

O

Ž

CO CD O CO

O O

CM ’T

O__

555

CN

O

O

O__

CC CC CC

00

CN o o o

ID CN

O ____o Z Z Z Z Z co CN co v- b- co b> 0) co τ- CN O O O O

CO bb· o o x

'> c *c CO JÉ s c Φ

CC o M· CO

CN

CO (0

E

N

CN CO CN r*, σί ω Obr O O ΤΟ O O φ O w|z

Q

q.£ uj E cd!<

O

C E <

*5 O - Z α

O UJ CO co co o in co

LL aj aj aj ai CM CM CM CM O O O Q

UJ UJ UJ UJ z Ul z o a. S o x. s o ô ô ľď □ T I x x ίο o o o > ŽSSS.f

O o z z Q Q UJ UJ 4 4 Q Q OO Q- Q. -«'<'< > > > > oooo i— i”'í£ OOQ z z z OOj 11 i m Z

4 UJ Q Q ω O O-> a. o. z

Φ c ra > o >o ra a: D U. —I ω

•X O Q.

CQ a X c □ u cg q x c

□ u.

o < m _z

O-Š CC t

UJ CC I- tĽ Z UJ Ul u.

ra o c

□

a.

Σ O * uj uj ΰί ur£· xzzza oooog S222< 2 2 2 2°·

Z Z Z Z 0 0 0 0 CN < < < < 0 2 S S S S

δ in in in irí in in co co co «á äi8 á <

N* • UJ cd £ΟΟϋ £ w uj. uj 0 <0

Q1

O zl te o x c □ □1 o 55 zl ižž'íg t UJ O I □ h

Ul 3 Q ω ώ O

Q i

S5 °° oc ?

0- Ν'

Z-g CM 2 5·« x ° co ?UJO0O jQh>O í- b~< x z o CO

SOK

X

CM x

r o ^r. OJ > □L

CM

U W Ť >ar A IOH uj > Ψ oxg CO N- X

ΙΊΙ D D D Q Q Q Ul Ul UJ □r oc ac OOO Q Q Q XXX _ooo > z z z ŕ-OO-O z z z

T T x OOO

UJ s

Q

γ.

b-

CO

b.

CO

CN

UJ

o

b. CO

00

’t

co

Φ

CO

CO

CN

in

b.

CN

0)

N- 4

00

co

CO

Ν’

UJ

0)

CN

CN

CO

CO

CO

CN CN

<2

CO

co

N-

4

CO

£

CO

in

CN

¢0 CD t-

co

m

γ$·

r-

7-

CN

00

CO

t—

CN

CN

CD CO Γm xŕ 8 oj o 55

O1 o 55 H Z co CO O) r- rOJ CO Λ « m r- w m m

I— 10 m* r7- m *- uj oj co cn m CN b- CO

C c o x.

§3 o g 4· o o O I- o gccoa: <o o 5 o .S c o ď

CO N* o co o o

CM m o o CC e>

NrxT CN

O UJ o cm rrΝ’ _ M

O) in co o t- o _ o cc a: o S00S

T3 o '> c

KJ CD g c Φ Ό

Ol

O

ΌΙ

O

0) >o o

N J=

O x o •Q Ό m xr n- S *- co Q cm b· co co S O 1- cn 5 o o o c *o rt c CD TJ ffl t a ffl Ν’ O)

T“ 7— o O z z ZŠ '> c *o CC

ΟΟ

CO s

Ν’ CO

OJ Yt CO s

0) CO

LO CD CO o o

u.

u.

ra E o 1ra ra c *Q

CO x g c Φ Ό

LO

CM

55555Í r- m o CM o o o o

UJ CO CN o

Ν’ OJ o 8! o o ίο

555§555§ o CN o o in CN o o

CO

Od p •3· CO

ΤΟ r- cn co O CO CN O CO ΤΟ o o

I—

CO o §§55

CN o LO o o

CO CN O cocooco^-cocococococoea: CNOOCOb.O)5^,CNa)Y-COOCO OOJOOOJCOOJOJCOCOr-inCO COWCOCOC\JOOr-C.*. C“*· ooooooooooo

CO OJ 0) O OJ CM ~ “j co co co ·»- <r COCOr-inCOCOlDN*COCO OOJOCNCNOCNOt-t— — ''OOOOOOO z z z z z z z

cn co cn

M· o LU

LU “3 Q O X <

IX _l < £ o 3 b·

CO ·: o

Yt LU o UJ

Φ c co > o >0

CQ je o S <0 '5 JÉ c □ LL x s CD*< h

CM 111 F Q

-J o

F o LU S

LU X < _ X b—1 CO< ^2 .Ο·> m nj N Zz W og-> -£<> Sgš c?O=>

>coD ž h ω

CN φ Z

T-UJ -011 ----O yiz

LU

CD ><

O

O

Oô W

U £2 <1

I CM

CM CO cn

CO n

(0 H

CO CO CO CO CO

73· F Y3- F F

M* M* M· M* M o LU oi o ω

Cl « »55 g

s.

•o o c >0 (0 ite c Φ Ί3 _sc c Φ >0

N t

Z) □ tu tt tu '

O cr o_ < ω cr o N

Z LLI cn o Q □ OOOO lll LU Hl lll ill

CM

CO cô

CJ g rt E o cB (D o '«J Ό E 01 Φ Ό O o c Φ o Q. Λ N

LU O í Z

-j ⁰ < tr

a.

.s α

X c 2

Z

		b-	4-	LO	b“	CO	CO
0	co	O)	LO	CM	0	CM	10	CM
in	F	co	LO	O	F	O	CO	10
0)	T“	CO	LO	CO		O	4*	CO
10	T-				T“	yT		CM

α o

OT b· co

CM CO

O in o N. in o bCO Yt

		CO	0)
	CO		CO
5	CO	F	L0
CM	CM	Q)	CO
		CO

CO ω

g o o b·

O

CM

Y“

O-55$

CO		O)	M*	0)
CM	CM	0	h·	M·
	CO	0	T	CM
O	0	0	0	O
	s	5

7- <0 b- co m t- Yt CO O T- ΤΟ O O z z z

0) >0 o

N ta (0 >55

1z σ

T C o

7- CO CO

SO) 10

O) CO

O 7- o 000 lllžžž cn b. co LO b- CO O y- O) CM O O

Z Z 8

CO

CO a '> c *CJ <0 -X E c Φ T5 οουοο LU LU LU LU UJ »1—ΉΗ—H—4“ Lll LU LU LU LLI IXCĽCCÍ < < < < <x!í u. x x x x 7 -J -I □ -I -I £ <<<<<£

LU z o 0» < < < < < £ tu

O O O O O < x

O Ô Ô ČĎ ČĎ H 2 X X X X X $.S OOOOOiŕ oooooow zzzzzz' OOOOOS žžížž§ ížäžä^ _l _i _j _j __j x < < < < < CM

Z Z Z Z Z Q UJ tu tu tu tu Q cr bCM O MCM

4^-

CO

CO

CO CO LO o CM CO o

<0 U)

OJ

0) bč

O b· o a>

£

CO r* co h* co co o CO

CM

CO o CO

CM CO

CD N

O

CO o

O _ tr x CD CD

b.

o o o

O) lo o

x x x x (D (D (D (D o «0 b. o o

S o o

0) bCO o o

OJ CN O) g co CM g CO o 9 o o 3 o z ž

LL os co co το co tn co co o> co Y- CM T CM OOOO

(01 c

Φ (ň >

Ίΰ > o Φ

-X ' □ z o LU ω!

O) O Yf

CO LO

Y T

Yf Yf

b. T“ *?

O) t—

CM

4· cn CM Yf m CM 4·

Ό ra ra o -ra

ca c
Φ
ω
> _iŕ	0
oj	z
> 0	o
Φ
Jd	0
3	UJ
zj	ωι

N O) rCM CM CO

4· 4· co co m CO yt b» CO 73* cn co γχ

Tabuľka 2 Vylúčené gény

Literárny odkaz

Bachmann, B. et al. DNA fragment coding for phosphoenolpyruvat corboxylase, recombinant DNA carrying said fragment, strains carrying the recombinant DNA and method for producing L-aminino acids using said strains, Patent: EP 0358940-A 3 03/21/90

Moeckel, B. et al. Production of L-isoleucine by means of recombinant micro-organisms with deregulated threonine dehydratase,“ Patent: WO 95 19442-A 5 07/20/95

Kobayashi, M. et al. Cloning, sequencing, and characterization of the ftsZ gene from coryneform bacteria,“ Biochem. Biophys. Res. Commun., 236(2):383-388(1997)

Wachi, M. et al. “A murC gene from Coryneform bacteria,“ Appl. Microbioi. BiotechnoL, 5 1 (2):223-228 ( 1 999)

Kimura, E. et al. Molecular cloning of a novel gene, dtsR, which rescues the detergent sensitivity of a mutant derived from Brevibacterium lactofermentum Biosci. Biotechnol. Biochem., 60(10): 1565-1570 (1996)

Funkcia génu

Fosfoenolpyruvátkarboxyláza

Treoníndehydratáza

| D-glutamátracemáza

Transketoláza

Glutamín: 2-oxoglutarát-aminotransferáza veľké a malé podjednotky

Akonitáza

| Replikačný proteín |

Replikačný proteín; aminoglykozidadenyltransferáza

N-acetylglutamát-5semialdehyddehydrogenáza

Glutamínsyntetáza |

Cykláza |

Argininosukcinosyntetáza |

Ornitínkarbamolytransferáza |

3-dehydrochinátdehydratáza |

Pyruvátkarboxyláza

Názov génu

□) θα.

murC; ftsQ; ftsZ

murC; ftsQ

£Ľ ω Ό

cm CC Ϊ Ό

L— □ E

2 **

gltB; gltD

acn

Q. Φ i—

rep; aad

ω (Q

< c O)

LL· ω lc

argG |

arg F |

Q o u. CQ

Q >. CL

GenBank™ AKCESNÉ Č.

A09073 '

OjT-comr»· S· CO 00 00 CO lo 10 lo lo 10 LO LO LO LO LO ’T ’T ’T ’T ’T < < < < <

AB003132

ABO 15023

ABO 18530

|ABO 18531

|AB020624

[AB023377

AB024708

’T CM ’T m CM O CQ <

’T r. r*. CM o co <

AB027715

AF005242

|AF005635 |

|AF030405 |

|AF030520 |

|AF031518 |

[AF036932 |

[AF038548 |

ο

ο	□
ÍQ	ο
Ό	E
C	S
(0	D

-- φ	kí
·£ w « 3
	E
CQ .tť	CQ
-0 Ό	x:
Q c	q
CQ

CO

Q/

m		<ť
Φ		Φ
u		Q
CO		CO

ID © m

id

CO

Z)

CO Z)

O

b* αο

σ>		0)
CM	0)	r-
co		<n
o		y—
co	CO	CO
x	x	x

CC

Tabuľka 2 (pokračovanie)

Ruimy, R. et al. Phylogeny of the genus Corynebacterium deduced from analyses of small-subunit ribosomal DNA sequences,11 Int. J. Syst. Bacterial., 45(4):740-746(1995)

Serebrijski, 1. et al. “Multicopy suppression by asd gene and osmotic stressdependent complementation by heterologous proA in proA mutants,“ J. Bacterial., 177(24):7255-7260(1995)

Serebrijski, I. et al. “Multicopy suppression by asd gene and osmotic stressdependent complementation by heterologous proA in proA mutants,“ J. Bacterial., 177(24):7255-7260(1995)

Pascual, C. et al. “Phylogenetic analysis of the genus Corynebacterium based on 16S rRNA gene sequences,“ Int. J. Syst. Bacterial., 45(4):724-728 (1995)

Wehrmann et al. “Functional analysis of sequences adjacent to dapE of C. glutamicum proline reveals the presence of aroP, which encodes the aromatic amino acid transportér, J. Bacterial., 177(20):599 1-5993 (1995)

Sakanyan, V. et al. “Genes and enzymes of the acetyl cycle of arginine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum: enzýme evolution in the early steps of the arginine pathway,“ Microbiology, 142:99-108 (1996)

Reinscheid, D.J. et al. “Cloning, sequence analysis, expression and inactivation of the Corynebacterium glutamicum pta-ack operon encoding phosphotransacetylase and acetate kinase,“ Microbiology, 145:503-513 (1999)

Le Marrec, C. et al. Genetic characterization of site-specific integration functions of phi AAU2 infecting Arthrobacter aureus C70,“ J. Bacterial., 178(7): 1996-2004 (1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. “Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996)

16S ribozómová RNA

Aspartátsemialdehyddehydrogenáza; ?

Gama-glutamylfosfátreduktáza

16S ribozómová RNA

Permeáza aromatickej aminokyseliny, ?

Acetylglutamátkináza; N-acetyl-gamaglutamylfosfátreduktáza; acetyl: ornitin-aminotransferáza; ornitín : karbamoyl-transferáza; glutamát-Nacetyl-transferáza

Fosfátacetyltransferáza; acetátkináza

Miesto pripojenia

Promótorový fragment Fl

Promótorový fragment F2

Promótorový fragment F10

Promótorovýr fragment F13

16SrDNA

asd; lysC I

proA

< z Q to <0

aroP; dapE

argB; argC; argD; arg F; argJ

p ta; ack A

attB

X8206I

X82928

X82929

X84257

X85965

X86T57

X89084

X89850

X90356

X90357

X90358

X90359

CQ

Tabuľka 2 (pokračovanie)

Patek, M. et al. “Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif/1 Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. “Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from C. glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142: 1297-1309 (1996)

Patek, M. et al. “Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. “Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. “Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. “Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif,“ Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Siewe, R.M. et al. “Functional and genetic characterization of the (methyl) ammonium uptake carrier of Corynebacterium glutamicum,“ J. Biol. Chem., 271 (10):5398-5403(1996)

Peter, H. et al. “Isolation, characterization, and expression of the Corynebacterium glutamicum betP gene, encoding the transport systém for the compatible solute glycine betaine,11 J. Bacteriol., 178(17):5229-5234 (1996)

Patek, M. et al. “Identification and transcriptional analysis of the dapB-ORF2dapA-ORF4 operon of Corynebacterium glutamicum, encoding two enzymes involved in L-lysine synthesis, Biotechnol. Letí., 19:1 1 13-1 1 17 (1997)

Vrljic, M. et al. “A new type of transportér with a new type of cellular function: L-lysine export from Corynebacterium glutamicum,“ Mol. Microbiol., 22(5):6 1 5-826 (1 996)

Promótorový fragment F22

Promótorový fragment F34

Promótorový fragment F37

Promótorový fragment F45

Promótorový fragment F64

Promótorový fragment F75

Promótorový fragment PF101

Promótorový fragment PF104

Promótorový fragment PF109

Amónium-transportný systém

Glycín-betaínový transportný systém I

Proteín pre export lyzínu; Regulačný proteín pre export lyzínu

amt

Q. Φ

orf4

lysE; lysG

X90360

X9036I

X90362

X90363

X90364

X90365

X90366

X90367

X90368

X93513

X93514

X95649

X96471

ο σ>

σ>

	dtxR
<	lll
σι	<0
(0	cn

Tabuľka 3

Kmene Corynebacterium a Brevibacterium, ktoré sa môžu uplatniť v praxi

Rod	Druh	ATCC	FERM	NRRL	CECT	NCIMB	CBS	NCTC	DSMZ
Brevibacterium	ammoniagenes	21054
Brevibacterium	ammoniagenes	19350
Brevibacterium	ammoniagenes	19351
Brevibacterium	ammoniagenes	19352
Brevibacterium	ammoniagenes	19353
Brevibacterium	ammoniagenes	19354
Brevibacterium	ammoniagenes	19355
Brevibacterium	ammoniagenes	19356
Brevibacterium	ammoniagenes	21055
Brevibacterium	ammoniagenes	21077
Brevibacterium	ammoniagenes	21553
Brevibacterium	ammoniagenes	21580
Brevibacterium	ammoniagenes	39101
Brevibacterium	butanicum	21196
Brevibacterium	divaricatum	21792	P928
Brevibacterium	flavum	21474
Brevibacterium	flavum	21129
Brevibacterium	flavum	21518
Brevibacterium	flavum			BI1474
Brevibacterium	flavum			B11472
Brevibacterium	flavum	21127
Brevibacterium	flavum	21128
Brevibacterium	flavum	21427
Brevibacterium	flavum	21475
Brevibacterium	flavum	21517
Brevibacterium	flavum	21529
Brevibacterium	flavum	21127
Brevibacterium	flavum			B11474
Brevibacterium	healii	15527

Rod	Druh	ATCC	FERM	NRRL	CECT	NCIMB	CBS	NCTC	DSMZ
Brevibacterium	ketoglutamicum	21089
Brevibacterium	ketosoreductum	21914
Brevibacterium	lactofermentum				70
Brevibacterium	lactofermentum				74
Brevibacterium	lactofermentum				77
Brevibacterium	lactofermentum	21798
Brevibacterium	lactofermentum	21799
Brevibacterium	lactofermentum	21800
Brevibacterium	lactofermentum	21801
Brevibacterium	lactofermentum			BI1470
Brevibacterium	lactofermentum			B11471
Brevibacterium	lactofermentum	21086
Brevibacterium	lactofermentum	21420
Brevibacterium	lactofermentum	21086
Brevibacterium	lactofermentum	31269
Brevibacterium	linens	9174
Brevibacterium	linens	19391
Brevibacterium	linens	8377
Brevibacterium	paraffmolyticum					11160
Brevibacterium	spec.						717.73
Brevibacterium	spec.						717.73
Brevibacterium	spec.	14604
Brevibacterium	spec.	21860
Brevibacterium	spec.	21864
Brevibacterium	spec.	21865
Brevibacterium	spec.	19240
Corynebacterium	acetoacidophilum	21476
Corynebacterium	acetoacidophilum	13870
Corynebacterium	acetoglutamicum			B11473
Corynebacterium	acetoglutamicum			B11475

Rod	Druh	ATCC	FERM	NRRL	CECT	NCIMB	CBS	NCTC	DSMZ
Corynebacterium	acetoglutamicum	21491
Corynebacterium	acetoglutamicum	31270
Corynebacterium	acetophilum			B3671
Corynebacterium	ammomagenes	6872						2399
Corynebacterium	ammomagenes	15511
Corynebacterium	fujiokense	21496
Corynebacterium	glutamicum	14067
Corynebacterium	glutamicum	39137
Corynebacterium	glutamicum	21254
Corynebacterium	glutamicum	21255
Corynebacterium	glutamicum	31830
Corynebacterium	glutamicum	13032
Corynebacterium	glutamicum	14305
Corynebacterium	glutamicum	15455
Corynebacterium	glutamicum	13058
Corynebacterium	glutamicum	13059
Corynebacterium	glutamicum	13060
Corynebacterium	glutamicum	21492
Corynebacterium	glutamicum	21513
Corynebacterium	glutamicum	21526
Corynebacterium	glutamicum	21543
Corynebacterium	glutamicum	13287
Corynebacterium	glutamicum	21851
Corynebacterium	glutamicum	21514
Corynebacterium	glutamicum	21516
Corynebacterium	glutamicum	21299
Corynebacterium	glutamicum	21300
Corynebacterium	glutamicum	39684
Corynebacterium	glutamicum	21488
Corynebacterium	glutamicum	21649

Rod	Druh	ATCC	FERM	NRRL	CECT	NCIMB	CBS	NCTC	DSMZ
Corynebacterium	glutamicum	19223
Corynebacterium	glutamicum	13869
Corynebacterium	glutamicum	21157
Corynebacterium	glutamicum	21158
Corynebacterium	glutamicum	21159
Corynebacterium	glutamicum	21355
Corynebacterium	glutamicum	31808
Corynebacterium	glutamicum	21674
Corynebacterium	glutamicum	21562
Corynebacterium	glutamicum	21563
Corynebacterium	glutamicum	21564
Corynebacterium	glutamicum	21565
Corynebacterium	glutamicum	21566
Corynebacterium	glutamicum	21567
Corynebacterium	glutamicum	21568
Corynebacterium	glutamicum	21569
Corynebacterium	glutamicum	21570
Corynebacterium	glutamicum	21571
Corynebacterium	glutamicum	21572
Corynebacterium	glutamicum	21573
Corynebacterium	glutamicum	21579
Corynebacterium	glutamicum	19050
Corynebacterium	glutamicum	19051
Corynebacterium	glutamicum	19052
Corynebacterium	glutamicum	19053
Corynebacterium	glutamicum	19054
Corynebacterium	glutamicum	19055
Corynebacterium	glutamicum	19056
Corynebacterium	glutamicum	19057
Corynebacterium	glutamicum	19058

Γιε

Rod	Druh	ATCC	FERM	NRRL	CECT	NCIMB	CBS	NCTC	DSMZ
Corynebacterium	glutamicum	19060
Corynebacterium	glutamicum	19185
Corynebacterium	glutamicum	13286
Corynebacterium	glutamicum	21515
Corynebacterium	glutamicum	21527
Corynebacterium	glutamicum	21544
Corynebacterium	glutamicum	21492
Corynebacterium	glutamicum			B8183
Corynebacterium	glutamicum			B8182
Corynebacterium	glutamicum			B12416
Corynebacterium	glutamicum			B12417
Corynebacterium	glutamicum			B12418
Corynebacterium	glutamicum			B11476
Corynebacterium	glutamicum	21608
Corynebacterium	lilium		P973
Corynebacterium	nitrilophilus	21419				11594
Corynebacterium	spec.		P4445
Corynebacterium	spec.		P4446
Corynebacterium	spec.	31088
Corynebacterium	spec.	31089
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	15954							20145
Corynebacterium	spec.	21857
Corynebacterium	spec.	21862
Corynebacterium	spec.	21863

ATCC: Američan Type Culture Collection, Rockville, MD, USA

PERM: Fermentation Research Inštitúte, Chiba, Japan

NRRL: ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, ÍL, USA

CECT: Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Valencia, Spain

NCIMB: National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, UK

CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, N L

NCTC: National Collection of Type Cultures, London, UK

DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany

Na porovnanie pozri Sugawara, H. et al. (1993) World directory of collections of cultures of microorganisms: Bacteria, fungi and yeasts (4* edn), World federation for culture collections world data center on microorganisms, Saimata, Japan

ctí

CO CD

0)

σ>

tj-

CO

0)

CD

CO

0)

02

CO

CO

0)

00

CO

b*

s?

c

O>

q

0)

q

0)

CT)

0)

0)

05

0)

05

05

0)

0)

q

0)

Φ

CM

4

cô

M-

CD

6

10

CD

CD

05

10

CD

CÓ

CM

>N O

Ó

O b-

O r<

o CD

O CM

o CM

o r<

o CM

q M

O

o ó

O CD

O

o

o ó

q

D

o

o

T“

CM

O

o

O

T”

O

O

CO

o

CM

<0

CO

CO

10 O 7- co

CM

O CD

N

05

CO

O

o

O

4·

’ď

CO 0) O> CM τΓ o O -4

CO

b-

b- O

10

CD

10

CO

ow

CO

O_

05

q

φ

CO

t-_«

O

CD

05

10

o

CM

CO

h.“

b·“

O Ó* 10* O)

Ó*

0)

t-“ lÓ-

0)

cn“

o’

CM

O

10

CO

CO

co

tT Tf CO CO

M“

CO

M* CO

CO

0)

M-

10

CO

(D > d CD	CQ > d ω	Φ — o □ >S O n	c Φ Q_ CQ tn	q> o E (Q □ D O	D tn ω ω u o S =	□ tn ® ω Q O S =
CQ N r*	N b	KE 0) V) H □	o E o	C § o □	o “ £2	g o Q 0)
o	O	ω S	x	O cn	s s	S £

m σ>

Q

	b- CD	10 CO	7t	CO
O r*	JofSS CM JP	10 b· 10	5 o	b- <n 21
3	c\| O b* o o o		U5	8 s
05	X UJ Ξ)	σ	O	S $
S	< < <	<	<	< S

O			4*
CO O CO			O
xr i0 co co	b-	CM	7j-	LD
b- CO O 7-	4*	41	CO
CM CM 05 4*	CD	10	CO	10

4· σ> id τ-

ο

			CD	10	4-
4		b. CD	CO 10 10	CO 10 b-	CO o
0 ω	CD CD	S o	b· O D	10	10 σ
D	10	n	<f	0	4
4	o	LU	10 CO	<.
ω	ω	<	05
γ-	γ-	CM		ω	ω
4	4	4	to	to	ω
CD	CD	CD	LU	0
CD	CD	CD	CD	CD	m
o	o	o	o	0	0

	O
	7“	CM	o
10	05	(0	CD
CM	10
φ	4-	O	CM
CM	CD	O	r-
Q	§	o	LL
ω	b-'	<	<
	H·	cô	CM
<	ω	X	<
CD 1	LU I	Ο-	“l
1 CD	1 CD	Ι CD	CD
Φ	Φ	Φ	0

CO	0)	0)
CD	O	CD	o
CO	10	CM	CD	b-
CO	0)	05	CO
CO	10	0)	0)	0)
N	X	X	N	N
				O
CO			CO	O
7~	b-		CD	o
CO	co	CO	CD	o
CO	e	co	CO
CO	co	b*	CO
				to1
05	0	Ω_	8	Si
10	X	Z	Tt	o
v—	UJ	o	CM
>	Q	_J	o
O	CO	UJ	<	UJ
H	H	—1	Q_	O
S	S	m	ω
7~	r	T—		0
<	<	<	_l	H
CD 1	CD 1	CD I	Ο- ι	X|
1 CD	1 CD	1 CD	1 CD	cn
0	0	0	0	Φ 7-

CO

CD

CM

CM

4” CO

CO

CD	CM		CM	CO	b-	0)
	CM	r*		τ-	CO	CO	CO
	O	o				T~
	o	o	o	Ο	o	o	o
W	o	o	o	O	o	o	o
g|	CO	CO	CO	CO	to	to	CQ
č	č	č	č	č	č	Č

00

ω

οο

00

05

0)

C0

Ο)

00

00

00

0)

Ν

xt 05

0)

05

σ>

05

σ>

Ο)

05

05

05

05

05

q

05

05

05 05

O)

φ

CM

CO

ό

00

C0

φ

Xt

co

φ

•r-

05

Φ

CXJ ŕ

05

ο

τ-

Ο

Ο

Ο

ο

Ο

ο

©

τ-

Ο

Ο

τ- τ-

O

η

φ

CXJ

φ

cxj

cxj

φ

Μ·

Ο

CM CO

ô

ο

CXJ

ο

CXJ

Ο

ο

ο

CM

Q

CXJ

ο

χ-

O CM

o

o

co

05

05

00

N.

tn

φ

0)

o

3

X“

o

O CO

Xt

o

O

O

CO

o

Φ

CM

CD_

o

CO

O O

tn

O)

o

CM

CM

0)

CM

CM

xt

o

h-

h*

b. cm

Si

có

CO

s

(ó

N

lÓ

CD

Ó

có

O

Y·

có

N

co K

b*

tn

CO

CO

CO

CO

tn

xt

CO

x“

xt

CO

CO

CO CO

CO

Uí E ™	o c	IU o	>N
c	5 «	C ©	C JÉ
2 25 > 3 .E	>-i. o n c	> 0) cn	O < m
O) . 0) £> »- >>	45 o.	*<0 c	SO

©	D	o	D
O	Q	cn	Q
Q. >> £	E CO	0) Ξ	E (0
(0	•5	o k_	S
CO	Oi	Q) CO	O

O

CO CO

Φ tn

g

N CO

CO o

xt

3

Φ

tn co

tn

T“

o o

CM

btn

3

CO CXJ

Φ tn

Φ b-

CM

if

o X“

bco

CO

ŕ

05 fc

o o

O o

o ©

CO

CO b-

co o

o

O O

CO

o

00

o Φ

N © O x-

u

u_

0

□

σ

LL

m

LL·

u

in

S -1

Φ

<

<

<

<

<

<

<

<

<

x

° <

x

o

Φ

h*

σ>

T“

b.

Φ

o

3

05

Xt

O

rt

0)

CM

Φ

φ Φ

CO

CO

CXJ

CO

CM

xt

CM

CXJ

CM

xt (£>

tn

CO

r*

tn

5

CO

Φ

b-

tn

CD

b*

05

x- CO

φ

CO

CO

xt

CD

CO

T“

CM

CM

tn

CO

CO b-

co

Φ xt

CO CO

ω

in

ŕ

φ tn

R

Φ in

CD O

s

CO CO

> -J

CL

tn CO

o

£

2 <

<

Φ

T—

CO

o

CC

z

> o

>- 0

CM O

o o

CO σ

bg

tn co

b*

CM O

o cr

O UJ

CD

T )—

co co h* co O “D

o Q-

H

W

IL

o

<

<

u.

m

LL

o

0

u.

0

gw

o

s.

2

<

<

in

in

<

<

<

o

O

<

Q

® T

Q

<

5

ώ □C

ω ω

ω ω

ä

<

š>

5!

<

s>

<

H co < CC

21

cd

CO

m

0-,

°ι

0

m

“l

®l

m

CQ

CD

CD

0-,α.,

CL

1 m

Γ0

m

OD

ω

m

m

m

CQ

m

CD

CD

CD

CD CD

CD

0

0

0

0

0 co

0 r-

0

0

0

0

0

0

0

0 0

0

σ) co μ·

Ο σ>

CM	Φ	0)
in	CM	xt
	CM	CM
O	O	O
o	O	o
CO	to	to
c	č	c

	CM
o	in	05
	CM	CO
	CO
0)	CM	O
CD CM	3	b* xt
O	O	O
O	o	O
to	to	CO
s	2	£

CD	CD co	O G)	G) 0)	05	05	05
q	G)	q	0)	q	0) 0)	q	0)	05
	CO		G)		4 N	7—	F	CM
q	o	o	O	o	o o		O	O
F	CO	CD	G)	cô	4 CM	Τ-	CÔ	CO
CM		CM	CM	CM	o o	ι-	O	CM

05	00	05	05		N	CO	0)	CO
05	0)	q	q	05 0)	q	0)	CD	q
CM	CM			cô cô	T“	CD	CÔ
O		t—	T·	q q	O	O	O	o
CÔ	05	CÔ	cô	ví F	CM	F	O)	cd
CM	O	CM	CM	o o	CM	T“	CM	CM

CO	•Ί·		i- LD	cm ro	CM	CO	CM	CM	f—	CD	CD
IÍ5	05	CO	CO O	CO h*	CD	CO	CO	CD	ľ*»	’t
		q	r- q	05 CD	Tj-	r-	o_	q	CO	ro	1Λ
cd“	G)	cd	cd co“	<t cm“	cd	o“	vj		co“	co“	cd
CO	CO	co	CO CO	CO M-	CO	M*	CO	CO	ro	CO	CO

1- CM

CM CM

h- CM

0

CD

CD

ro

0

0

CO 05 O

O

00

h-

CM t-

CM CD

CD

0)

0)

05

CM

CO

CO

CM CD 7-

CO

ro

h* t—

r- 7-

M- vf

7“

0)

*“

T“

M- CO CM

CD

CM

ro

ro

ro <D CO O bCM 2 2 0 w 0 5 g* 7; CM

ví-

M*

Τ-

ro ro 0 SJ V- CM F OO,A 0 0 S2

x >

b- ®UJ 0 tc

0) rv 3 0 0

7-* CO O O

tO CO 00 CM LL

CO CO CO CM LL

05 CM 3

Q S G) O ω

Ο 05 0) O cô

CO O O

ro CO 00 N O

CD T· CM CO T O

H LU

X LU

0

O

<

<

CC

T

X

0 0 X

F

LL

LL

F Φ

< CO

<

<

CM

ČM

o

ľD 3 r

S

<

<

7— 7“

ŕ-

•Φ F

Ťŕ

0

Φ

0

0

ČM F 0

Ť—

ČM

ČM

< <

< <

oc ω

x

CC

F

F

<

F

F

< < F

<

<

<

mm

o. m

CL UJ I i

Q.

CL

I,

r

m 1

X,

X 1

cd m x 1 1 1

CD 1

tn 1

CD 1

1 1 m m

1 1 m m

1 1 m cd

m1

00

CD

CD1

1 m

m

m

CD CD CD

m

CD

m

ω 0

0 0

0 o

0

0

0

0

0

o

0

00 0

0

0

0

CO T“ CO

m· 0 M-

co 05 r-

0 s

ro U5 T“

CD CM h-

CO	0)	CO	S	o cn	G) 0) 0)	g>	cn
σι	σ>	o	0) 0)	0) 0) 0)	& 0)	0)
co*	CO		CO	tfi có	OJ CN 6	in
o	o	o	o	o o	O O y	o	o
r<	lD	có	CO	aj CO	in co có	0)	CD
r-	o	CN	o	y- v—	o o o	o	OJ

g	Φ CO 0) 0)	0) cn	b- 0)	o cn	0) 0)	0) 0)	b- 0)
ID	-r-’ Ó	ó	0)	CN	LO		Ó
O	o *-	T—	o	o	o	o
CÓ	LO y^		cn	ó	có	0)	CN
CN	O	CN	CN	CN	Y-	OJ	CN

O

O

0)

O

b- CO

t- b* CO

0)

γ-

CO

CO b·

b.

b·

b*

T—

0)

o

cn

b. co

Od CO b-

m

o

CO CN

CO

b»

b-

o

OW

τ-

o

Tí CO-

b·-y- O

CO

o

^-

CO O

in

CD

CO

cô

in

CN

ó*

ΟΝ

o*

ID CO

tí Ó* CO*

T—

CÓ*

in

CÓ* CN

in

in

in

5

CÓ

Tí

LD

TÍ

CO CO

in in tí

m

CO

co

CO T

co

TÍ

Tí

m

«	j o	tn Ό
,tŕ		u
2		•<0
CD		C
£ u.	o	a
O	>

kloň IMAGE: 1021 248 5', mRNA sekvencia.

CD
CN	OJ	Tj*
	b·	CO
OJ		m
O	CN	m
-J		Q
<	>-	-j

co
CO		cn
o	CN	ro
s	CO	CN
0)
	CD	< CL
CO	Ϊ	n_ -j
n	ÍL	o
>	m	o
F-	w	o
S	o	UJ
T“	Y“	y—
<·	<	<
cn	cn	mi
m	m	m
ω	σ	0

bCN	3	3	Y- CD <n CO	0)
CO	m	m	S	b-		CD	00
Y“	CD	CO	CO	in	Ä
CO	o	o	CN 2	o	CN	CO	có
	o	o	o O	o	K	CO	tn
LL	O	O	_J o	ω	O		0)
<	<	<	< <	<	UJ	5	3

CO Q	xr Q □ <	cn co < a
	CO CO 0) CD r-	0) OJ
o	0) O	CO 0)
CD	tJ· (o	O CO
CO	CO T~ V—	CO CN

r*CN CO T— CD LL <	CO o o O í <	o o O ž	CO cd In Q 2 88 ω <	0) £ tn o o Q <	.Έ07294	:BACALDl·	:PPU9633Í	bľ 3 < ô CO	CD 3 $ b-' T“
CN		Y- CO	ôj	H		CN
		_i	< tr	<	<	<	CD	CD
CD	CL	a.	CD CL		a_	cn	cn	UJ	UJ
cn1	CD	co1	m'm1	m	m1	m1	m1	m	m1
ω	0	o	0 0	0	0	0	0	0	0

Tí
in	γ-	CD
	ΙΟ
čn	*	0)
in	a	in
b.	oo
CD	CD	b-
O	O	o
o	O	o
	CO	CO
s	ž<	s

b·	G)	G)	0)	G) 0)	ro	ro	CD	ro
G)	O)	ro	ro	ro ro	ro	ro	ro	ro
CM	ro	ro	ro	CO CM	ro	co	CD	CD
O	o	o	o	o o	o	o	o	o
CM	CO	CO	00	b* ro	CO	ro	ro	CM
T“	o	o	o	CM o	o	o		o

ro	|x	ro	ro	CD	CO	ro ro	ro	ro
ro	0)	ro	ro	ro	0)	ro ro	G)	OJ
rx		ro	CM	b*	CM	Tí CM	CM	CD
o	O	o	o	o		o o	q	o
co	CD	cn	b·’	CO		ro	tj-	o
CM			CM	Y“		CM CM	CM	ľ“

CD

CO

CO

rx

CM b

ro

CD Tľ CD

ro

o

tí

00

ro

fx

CD 00

CO

CM

b*

rx

ro

cd ro

co

T“ r-

CD

o

CD

ro

ro

o ro

ro

rx

CD

CD

ro

ro co

CM

CD N CM

IX

b*

ID

CM

o

LD

cd rx

IX

o

O

CO

CD

ro

4 cm

rx

co ro ro

rx

o

Y

cm

cm“

co

v-‘ ro

ro

oo

Tf

CO

CO

co

ro ττ

co

co co co

CO

CO

tT

CO

Tj- CO

co

CO

8	ro ro	CM	oo CM O	rx CD	o “ cm u z:	rx co
CO	co	CO	CD CO	o	C0 r p	b-		O
ro	G)	θ	ro cd	CD	r- b*	G)	Γ-
o	o	ro	ro co	o	ro «> «£	CD	s	ΟΟ
o	o	o	CD o	o	T“ « O	b-	o	CO CO u.
O	O	o	O <	o	Ώ O < _i m >	σ	D
<	<	Q	í*	<	<	b—
CO	cô	<	CO	ro	X	CO
0	0		tn	0	T“ T“ CD	ω		H
1—	H	x	< <2	H	< < ω	ω	<	ω
I	X	CL I	m 0	x	CD CD 0 1 1 1	°ι	CD I	LU I
1 m	1 CD	1 CD	mm	1 CD	1 1 1 CD CD CD	m	1 CD	tn
0	0	0	00	0	0 0 0	0	0	0

z	O	o
D	>	>
° < ω Z	UJ	UJ
2 X	z	z
8 E	£	$
	O	O
E ”	Z	Z
ω ®	UJ	UJ

u	UJ	UJ
§ Φ	® > s O	CD t	tn í
E Λ	9 Q 2n=	C	♦ . T“

O			ro o
CO			00 CD
	CD	CD	Tt ro
CD	ro	G>
ro	co	CD	tí CM
	co	ro	b.
co	o	CD	CO
CD	G)	b·	CO
CD	O	b-	ro co
ro	o		CO o
o	o	CO	ro o
o	<		(D O
Q		*<.	X <
<	00	ro CM
Ťŕ	1—	H	CD “ 0
X	ω	ω	X H
X I	UJ 1	UJ	X X 1 I
1 CD	1 CD	cd1	1 1 CD CD
0	0	0	0 0
(D			CO
CD
Tj-			CD

CO CO

CO o o CO

Ó τ—

M)

3

co

CO

05

CO

CO CO

OJ

CD

0)

CD

05

0)

00 CO O)

CO CO CO

3

3

3

0)

CD

0)

0)

q 0)

CD

CD

0)

0)

0)

0)

05 oj 05

05 0) OJ

Ô

co

CO

CM

xt x-

CO

CO

CO

05

co

Ν' CM x—

xt CN Xt

Ó

CO

Ô

o

O

o

T“

O x-

o

O

O

O

o

q

O X- T-

q r- q

o

in

ó

CD

có

Τ'

cn cn

CO

Ν'

co

CO

CD

xt

CO x- CO

CO X“ co

CN

ó

CN

CN

O

O x-

o

O

o

CN

o

CN

O O CN

ooo

O

CO

O

O

O

CO

x~

0)

b·

b·

CO

CN

0) CO

CO

O

b·

1- v- CO

x“

x- CN

CD

O

T—

CM

CN

b-

O

in

CO

CO

in

CO

Xt CO

b-

o

CN

b- b> x-

CO

CO CN

<0

CO

UJ

CN

CO

co

b*

b-

n*

N.

CO x-;

q

uj

o q q

m

U) CN

CO

b-

UJ

CD

CO

0)

CD

CD

CN

CM

CD*

CM

tn o“

in

co

T-“

b* N 0)

N

K K

0)

CN

0>

CO

CO

05

05

oj

(0

CO

CO

CO

co xt

co

co

xt

CD OJ CO

0)

CD CO

CO

Ν’

CO

E E ω c Φ

Q.

Φ d

□ 3

E □

©

W

O E o T

	©
	CD
	Q
É
Ό	CO
C Φ

CD S uj 0J x

CN O UJ δ

r* t~ UJ Ν' UJ

CO CN xt O CD O

CD CD UJ O o UJ <

o 2 b- CD 3£ o o U- UJ < <

UJ CN CO 0) CO CN

CO CN 0J 05 CD σ <

CN O CO b* co ϋ) <

OQ§ u> CO CN b- o q co CM □ b 9 <

O 0) O UJ CO UJ b- o bCO CN CO

3 £> CO o CD <

UJ O CN oj

CO O b* O CO III

£

<

r-

Uj r*»

o

CO

CO

CN

o 0J

CO

CN

xt

CO

b- co

0J

b-

oj

b·

b·

b*

CN

05 x-

T“

CO

0)

CO CD 0)

00

OO CO

b*

CO

UJ

N-

CD

CO

O

v

co x-

CO

b-

CO CD CO

00

00 CO

o

CN

CO

UJ

U)

>—

CN x-

b.

N-

Ν'

UJ UJ x-

UJ

UJ UJ

0J

ω	ω	Z
OJ	CO
2	s	0	CD			CO	CO	o S	CN
O o ω z	o o ω z	xt U. CC o	< D_ < Q	b- UJ	o o UJ CD O b-	CN Xt o CD o	CD UJ O o	ω « gg	u U) σ
o	o	0	b		CN CD	UJ	UJ	E uj	ω
		o	CD	UJ		<	<	<<	r
o	0 H			H	H 1-	OJ	čn	35!	CN
h-	<r	4	<	< <	<	<	ÍL
I	x	CD	CO	0-,	CL 0. CD	CD	CL (D	Q_
m	m	m	CD	CD	CD CD 0	m	m'tn1	(D
0	0	0	0	0	0 0 0	0	0 0	0

CO	CM
CM	O					Q)
0)	CO b-	8		3	UJ CO	05 b-
0)	CO	O OJ 0J	O CD O	b-	CN	CN
	0)	UJ CO CM	UJ CO UJ	CN		m
□		b- O 05	b- o b-	CO		o
<		CO CM CD	CO CN 00		u_	CD
xt	b·'	b- 05 x	n σ> b	CD	<	<
ω		H F CO	1— 1- t-
UJ	Φ	< < tr	< < <		<	<
°l	UJ	CL Q. Q.	CL Q- CL	m	“l	CD
m	m	m m m	CD CD CD	CD	CD	CD
0	0	0 0 0	0 0 0	0	0	0

CO (O	00 CO	CO	Ν'	b-	CO	UJ
o	b·	CO	CM	CN	xt	UJ
Τ'		b.	0)	CO	CN	Ν’
CO	b.	CO	UJ	CD	b-
CO	b.	o	O	O	O	CD
CD	CO	05	05	05	05	05
O	o	O	O	O	O	O
O	o	O	O	O	O	O
©	ω	©	©	©	©	©
č	S	č	č	č	Č	Č

CO

CO

05

05

05

02

0)

b-

05

CO

M- 05

05

05

05

CO

05 05

CO

CO

A

0)

05

0)

CD

05

0)

05

05

05

05 05

05

05

05

05

05 05

05

05

cxj

CD

b^

b-’

r<

CO

oj

05

CD

io CO

05

05

CD

b- CÔ

CD

Ó

o

o

o

o

o

o

o

r~

O

O O

O

O

O

O

O O

O

τη

CO

o

CO

cô

CO

CÔ

cm

05

CÔ

r<

co oi

CO

CO

CÔ

CD

7^ CÔ

b-j

OJ

CO

OJ

CM

OJ

o

o

OJ

CM

▼-

t- O

O

O

OJ

OJ

O 7-

v-

O

CO

ιϊ>

CD

co

CO

OJ

CD

CD

m·

b-

b· 7-

05

05

co

CO

OJ 7-

IO

o

CO

CO

IO

ID

O

OJ

OJ

o

co

co vo

05

05

05

OJ

CM CO

o

in

(D

CD

OJ

OJ

CM

i-

o in

N

r\

CO T-

b·

0)

T“

o

00

CO

CD

05*

0)

CD

b·“ b·“

05*

σΓ

b.“

co“

OJ

co“

CO

CO

CO

CO

in

in

ID

ID co

CO

co

CO

io

CO CO

CO

Τ-	O	CD
Ο		O
in	b.	m
	Tť	Tf
CM	IO
N	X	UJ

CM	CM	CO
LO r·	LO	3
CO	CO	CO
O	O	o
o	O	o
Q	Q	o
<	<	<

co

in	m	LO
Tt	b-
o	co	o
v—	CM	o
O	O	o
Q	UJ	<

	o	o	05
05	o	o		CO		CO
b-	o	o	CM	05	co	Τ-
in	Tt		b.	O	CO	Ο
CO	CM	CM	CO	CO		T—

t 05 Q)	Ό	o	O
O	>	>
CO	*<D C	UJ	UJ
E	Q.	z	z
o	*·□	<	<
c 05 CT	C	>	>
O	o	O
	O)	z	z
C	Z	UJ	UJ
Q.	to	$	$
O	•ä w	x ω	x UJ
Ž	BS	ω	ω

CM	xj
CO	in	LO	Ta-
b-	T		b-	T“
05	CO	CO	lo
O	o	O	co	CO
	o	o	m	LO
-J	o	O	b*	t—
<	<	<	<	5
in
m	CM	CM
CO	CM	CM	05	O
CM	b*	b*	05	o
	7“		CM	r-

lO O

	<	CM in	CM ιο	CO 3	CO m
U)	UJ		CO	CO	00	Q
0 CC <r	i x	CO o IO	o o Q	o o Q	o o Q	UJ Z	LO bCO CM	o o o
	0		<	<	<	>	O	<
m	q	UJ	ôi	ôi	cô	S	UJ	D
	T—	H	0	0	0		H	T
<	<	<	H	μ-	H	<	<	Ťt
ω	CD	CL	r,	ι I	I,	m I	CL I	CĽ
1 03	1 m	1 m	1 m	1 CD	CD	CD	1 CO	Q_ I
0	0	a	0	0	0	0	0	CD

	D_	xt	Tí-	Ta-		CM CO
	UJ	m	in	b-	m	00 CM
	D-			lo	J—	CO CD		CM
CO O g	s cm < x s b. 1- o	CO o o O <	<o o o o <	CD LD b- <	□ O o <	05 O b- O O <f op	CO o o 5	CO O 5
Σ	ω φ	CO	cô	CM CO	m	<<	s	o
	ŕ- j—	0	0	H	T“	ČM	T“
<	< <	H	H	ω	<	CC 2J	<	<
CD i	CD CD I 1	X,	X	UJ I	CD •	0-,0-,	CO I	tn I
1 CD	1 1 CD CD	CD	m	1 CD	• CD	1 1 m m	1 m	1 m
0	0 0	0	0	0	0	σ o	o	ω

cm

CD

O ’ď-

CM

CO b-

CM	CO
CO	CO	CO
0)	0)	05
o	o	O
o	o	O
(0	to	CO
č	č	C

03

O)

Φ 03

CD

CD

S

03

CO CD

rx co

3

0)

CD

03

03

£>

CD

q

σ> cn

CD

CD

0)

G)

0) o>

0) 03

0)

0)

03

q

03

0)

CD

γ-j

r^ *-*

CD

Q

Ó

O)

fx CD

00 CD

Ó

Ó

Y-4

CM

CM

O

r-

o i-

O

T—

O

q q

o o

o

r-

y—

T“

O

o

|x

CO

CD CÓ

|x

to

to

to

γ-j γ—’

cm r^

CM

CÔ

CD

03

r<

|X

o

CM

t- CM

t-

CM

CM

o

O T-

CM 1-

CM

CM

CM

t-

o

o

0)	CO	CO	CO	cd rx	O Tŕ		s	3	CO	CD	CM
CD			tí	CD Tf	|X CO		’t	CO
fx	CM	CM	O	|x (D	to M-	O	CO	q	q	to	in
co	CD*	CD	rx*	CD* fx	-r-* O*	rx*	T}·’	Tt*	*t*	CD*
CO	CO	CO	co	CO	CD CD		CO	CO	CO	CO	<0

CO	CO μο.	CO	CO 4 CL
σ	2	σ	2
CM	'>	CM	>
CM	z	CM	Z
ω	<	Φ	<
E	>	. E	>
*8 o E'	O Zô LU O	□ o P N í E'	O z ô Ul O
2	h ω	© o CO b	H «

s elegán:	s elegán:	s elegán:

rx m CD o LO

CO CM Z CD O Tí-

Ε5 £ CM ž Y— 00 O O O M-

CD CM > O

CD •MOO 03 O O O

0) •»t CD CD O O O

0) CD rx CD rx

m Tt £ §3 o <

O CD OJ T- CM C

t u?

CD > LU Q

Ž E □

g s S-

to ΤΟ) O

to S o

LL <

to T

LU to < X

H ς

< Ťŕ

< Ťr

LL <

O to

UJ o

CD O

O) Q

ôj

CO

CM &

CD

CD

CM

CM H

Y— Y—

í-J

0

0

4—

<

OC

< oc

<

f—

F—

<ť

< ω

< <

<

H

μ-

<

<

s

CL

CD D-

CD 1

r 1

I I

m I

m uj I 1

CD CD t I

m l

I t

ι,

I

CD |

CD I

CD1

1 CO

m'm'

1 CD

1 CD

1 CD

cn

1 1 CD CD

1 1 CD CD

1 CD

I (D

CD

CD

CD

CD

0

0

0 0

CD

CD

0

0

00

00

0

0

0

0

0

0

05	0)	05 05	05	0)	10	i©	xŕ 05	05	05
05	O)	05 05	05	O)	0)	05	05 05	05	05
		lb	lb	b·	l<	CU	ib	ib
O	O	7- O	O	O	o		o o	o	o
CU	CU	05 10	10	in	N		co 05	N	CD
CU	CU	7“ O	o	o	CU		O y-	CU	CXJ

b- b.	co	CD	CD	CO 0)	00	05 b- 05	05	CO
05	05	05	05	05	05 05	05	05	05 05	05	05
ib	cb	CD	CU	05	CD	6	CM	10 cxi	CO	CD
q	o	o	v—	O	O T-		O	O O	q	q
	0)	ľ<	Ó	f<	CO x“	N	l<	σι r<
		7~	7—	O	7— 7~	7“	o	CU o	CU	CM

05 b-

r-

10

o

O)

O Xŕ

^ŕ

o

CD

o

CO

b-

7—

10 CO

o

10

10

CU

CO

b-

CU CO

o co m

b.

o

c©

CO 05

05

o

05

05

CU

CD

xŕ in

xŕ

CU

3

CM t-

CD 05 05

05

Xf

0)

CO o

o

5

10

CO

CU

CU

CM

CM C2

CD

CO

q

Xt

xf

7— CD

co 10

CO*

^ŕ

CU

xŕ LO

in

b“

in

co

05

05*

05*

in b·*

CO*

10*

CD

’ŕ

CU

b·*

Xŕ CO

CO CO CO

CO

CO

CO

xŕ CO

CO

«

CO

CO

10

10

CO

10 CO

CO

10

CO

10

CD

10

GB_HTG3:AC010515 41038 AC010515 Homo saplens chromozóm 19 kloň LLNL-R 249H9, *** Homo sapiens 33,564 15.09.99

SEKVENOVANIE VO VÝVOJI ***, 31 neusporiadaných úsekov.

	n α> σ> o n m	b-
CU CU	xŕ ä	CU b· t—	O CD O	o CD O	3 O	10 CD 05	V“ 10 S
b- 00	b· 00	-J	O O	δ	1^ O	10 b.	CD 05
x x	<	<	<	<	ω	I

CM	xŕ	xŕ
05		CU
	CU	CU
O	o	o
co	<d	CC
£	c	č

CD	o	F Uí E CD
	c	Ό x~
CO	ω	c co
	05	φ II
D	CO	O) Φ
C	LL·	kú (d
O Jŕ	b. C X“	«0-

		Xŕ	xŕ	xf	CU		T—	CD	CD
	CD		O	CD	b·		CO	10	Q
05	10	b.	b·	CD	co		co	o	O)
m	(D	CD	CD	CM	xŕ	CO	xŕ	o	Τ’“
	CU		r~	10	CO	CO	CO	xt

10 CO 05	10 05 CO 05	oo	05 CO CO O 0)	UJ O b- T*	10 CU O ΰ	00 o 00	s o	xŕ CO > 0	F O IO
in b. CO	X 10		o LL· <	LL· <	UJ q	N	1— 2	CO 5	O «
o	H CO	□ ί-	>	ä	7—	I CO	<	<	<
CC,	LU i	α-o	O	Ο- Ι	Z I	UJ I	CD I	CD 1	m |
CD	1 CD	m m	1 CD	CD	1 CD	1 m	1 m	CD	1 CD
0	ω	0 0	ω	0	0	0	0	0	0

o	b.	CU	CO	00	05
10	b-	o	o	o	O
CU	CU	CO	CO	CO	CO
o	o	o	o	o	o
co	cd	co	cd	cd	cd
č	2	2	e	e	2

b*

CO

CO

N

CO

CD 02

0

0

02

CO CO

0

0

O) 02

02

0

0 02

0

cn

O)

0

0

o> 0

o

0

0

02 CD

02

02

0 02

0

0

0 0

ó

CM

6

4

ó 4

CO

CO

T“

CO CO

CÓ

0

CO Ó

Ó

0

0 CO

T—

o

o

o

·*- o

o

o

τ-

o o

O

O

O i-

O

O O

CD

4

r<

0

CD

b-'

CD

0

ού

0 0

b*

r<

CM 0

0

b*

iri CM

CM

CM

CM

o

CM

O CM

o

o

CM

CM CM

O

o

O O

O

T“

r—

< 0

		LO	LO CO	0	CO	O	b-	0	0
O	0	LO	LO 0	O	0	0	0 0	0	0
0	b«	CO	0 0	CM	0	0	0 ®	0	0
cm“	0“	ď	0 cm	0“	0“	O“	b*“ 10	b.	LO
’Ť	0	o-	’t	0	0		0 0	0	0

.52

S

CO o CO CD

Ό

E Ό

C OJ O)

		0		0	3		r	r—
b-	$ 0 0	0	S	0	s.	b» b-	Ό-
0	0	0	T“	O O
0 0	0 O	g	0	CM	O O O O	τΟ	Ι- Ο
0	LL	σ		G	UJ UJ	CD	m
5	t-	<	<	<	<	< <	< »c	<

0
0
			0	0
CM	0	0	0
r~	0	CM	0	0
CM		0	0	CM
	0	CM
O		0 0		<
CM	O	Q		L
O O	0 CM	co	5	z UJ
m □	O <	3	g	CL CO
co			0	>
cn	£	ó C\J	<	ŕ
T·	CO	H	H
<	CO	CO	<	<
m	°|	UJ I	CL «	(D 1
1 m	m	i CD	m	CD
<D	0	0	Φ	0
				’t
	4			O
	0			O
	r·			CM

g

0 O			T—
	0	0	0
0 5	0	0	b.
CM CM			v—

0 0	0	0 0
	b. CM 0

0	0	CM
0	0	T“
0	0
O	O	O
CO	CO	CO
č	Č	£

	0
0 0	0	O	0
0 0	b-	b-	0
O O	0	O	0
0 0	CM	CM	0
	r-
0 0	0	0	0
O*		T“	O
b- b*			O
O O			0
O O	T—		O
O O	O	O	Q
LU LU	m	CD	O <
< < ČM ČM	<	<
< <	<	<	X
CD CD 1 1	CD	CD 1	CL
1 1 m cd	CD	1 0	CD
0 0	0	c	0
0			0
b-	0
	CM		0
r~	b*		b*

σ

	b-
0	0	0	0 b*
			0 O

CM 0 CO

CO 0 t“ CO T-

	m
b- 0 CM 0	b* 0 CM 0	CO	0 0 CM ▼- 10 8 i“ 0 £Q MGg
O O	O O	0 0
O	O	>
<	<	H	to m
0	0	2	S <
0	0		ŕ- 4-
l·-	H	<	< <
x	X	CD 1	m m
1 m	CD	CD	tn'tn
0	0	0	0 0
		CD
		g

0	T“	b*	0
0	b-	O	O
	0	0	0
T“			T“
O	O	0	O
CO	CO	CO	CD
S	S	£	C

ο

b.

Φ

Φ

ω

φ

ω

φ φ

05

05

05

05 05

05

Φ

φ

b*

s

q

05

05

σ)

05

05

05 05

q

05

05

05 0)

05

0)

05

0)

bí

0>

0)

ιη

05

05

Ν

10 6

b^

10

<t Ó

Ó

Φ

ιη

6

ο

q

q

ο

ο

Ο

ο

Ο ν-

ο

Ο

Ο

Ο ι-

Τ

Ο

ο

|<

Μ·

ό

CM

Ν

Ν

φ

Ι< Ν

6

05

CN

ί—*

φ

φ

ο

ο

φ

Ο

τ-

ο

Ο Ο

CN

CN

Ο

CN Ο

Ο

CN

ω

05

b·

b*

CN

m

Ο CN CN OJ

ο

b.

Ο

b· ·»-

ο

0)

b·

2

05

Φ

Φ

Φ

CN

4

Ύ“

φ

05 ιη

ιη

b·

T“

b-

b-

CO

Φ

Φ

n·

Φ b.

ιη

05

Τ-

cn ω

φ

CN

CN

CO

Ν

ιη

ιη

Ν

Κ

Ο)

CO b?

φ

Ν

05“

φ’ Ν

b·’

Φ“

Ν

ω“

Φ

C0

Ν’

φ

Φ

φ

05

m ιη

φ

Φ

Φ

φ φ

φ

Φ

Φ

φ

<0

V)

□

ο

>» Q.

<η

ω

ο ω ω

Μ

Ε

V)

cn

c φ ο.

c φ ’ο.

φ ο Ε

c Ο 03

Φ Q

c Φ *Ο_

c φ ο.

8.® > Ο.

C Φ ’ο.

3 *Ε ω £ cn

3 3 Q

D □ O

Φ OT

Φ V)

(0 □ Ο

φ *Ε

3·» Ε

(0 &

φ C0

Φ cn

E ® ο ω

φ ω

ο ο Φ □

<0 3

cn 2

Ο

ο

ČE

Φ (Λ

*Φ

Ο

ο

Ο

α. °

Ο

ο S

E

E

Ε

Ε

V)

Ν

ο

Ε

Ε

®Ε

Ε

8 ω

cn

cn

ο

ο

Ο D

*Φ

Φ

φ

ο

ο

ä ο

ο

3

3

X

X

Ο ο)

ζ

ζ

X

X

X

ω x

X

S £

S

S

CN in s? o b· σ

s φ o o o UJ <

ω CN nΦ in S <

CO 0) Φ CN

φ φ mm· o o

φ φ mno o

CN CN 05 Φ T“ □

ξ?Ο Z- CO Φ °

0) in o o

P o Ν’ hb. O

0) in r** o o

in ΊΤ IO cn m o Ύ— O LU O

in n· in 0) o 8

< CM > O

CN m CN 0) Φ Q

O Φ Φ CN N $

< ŤJ·

s 2

φ CN

O u. <

O <

O <

0 O

Φ a ω

UJ <

< in

O <

Q < ω ŕ>

< či

H S

CN

4ŕ

ω

I-

φ

Φ

CN

P

CN

ω

Zŕ

CD

CD

P

cn

Ó

ω

>

X

X

<

< <

<

co

X

< Ι-

J—

<

ω

cn

°ι

X

UJ 1

O,

x,

CL

m 1

m x 1 1

m I

0 1

X

Ε I i i

m

UJ I

LU 1

00

m

m

m

m

m1

1 m

1 1 m m

1 m

1 m

1 m

1 1 m m

m

m1

1 m

1 m

0

o

CD

0

0

0

CD

CD CD

CD

CD

0

00

CD

CD

CD

CD

CD τΤ Φ

>ο Cti

O Q.

D .Q

Cti H

CO

to to

©

b- ©

©

to ©

co o>

©

©

©

©

to

to

to

to

to

to

to to

to

to to

to

to to

to to

to

to

ω

to

to

to

to

to

to

©

to cd

CD

© ©

CD

b»

Ó t-*

o

r<

co

b^

CÓ

cd

CM

cd

cô

Q

O Q

O

o o

o

t- o

v t—

r-

Q

o

O

o

o

o

o

o

r*.’

CM

Tt in

r<

cd to

CD cd

CD

cd

id

cd

r<

r<

b·

ó

6

Q CM

CM T-

CM t-

O CM

O

CM

CM

CM

CM

CM

CM

T

o	φ ©	to	1- ©	Φ	© O	T- o	©	© b- to	CM	CM	o
©	to	b-	T- ©	to	© to	© o	CM	m o ©	o	o
to	©e ®b	CD	cn	O	O ©	to ©	b-	©fc σ> ©^	©	©Ä	©
to	b· o’	©**	©** m		to to	•Φ to	K	in ®* ©	©‘	©“	N
©	©	©	© ©	©	© ©	© ©	©	©co ©	©	©	©

X X		^•γ— w w “UJ Žr-(DDCL O1	4S Jí VM X X CM	0.0 I
CM o © 82 o	ω CM to Τ» CM Q	© ® to CM φ © φ Φ	N ® © ©	© o 8	© s? b.	(0 yA CM © CD R ° R A	© to b© o R
Y“ N <	-J <	to bN -i	β	© N	5	D _J <<	Q <

to -Φ	b.	© © Φ CM	3
to	CM	W	© Tŕ	©
©	r-	o	© T-	©
CM	M*	to	V r-	•Φ

5	Z 2 s- © re\ O	©	CM 2 si	o <	CD O	© 9	© o to n b. Q	© to b-
CM	CO X	©		r-	CM	b»	© o	©
>·	X o	o	o K	>	CM	Y~	o to	o
o	X X	>	_j o	O	D	□	o ©	o
1—	o co	H	2 £2	H	ω	Q	O ω	O
5	x x	Σ	í?	S	x	X	< x	<
	ái ▼-		T“	Y“	čd	Y“	σι m	cd
<	< <	<	s <	<	X	<	X X	X
m	m cd	m t	l“l	m t	0-	m |	X,X,	X
m1	m'm1	1 m	m co	CD	m	m	mm	ω
0	0 0	0	00	0	0	0	O0	0

c	c	c	c	c	c
ω	Φ	Φ	ω	Φ	Φ
Q.	q.		a	’q.	a
Cti	ca	ca	ca	ca	CO
Vi	m	Vi	Vi	Vi	(0
O	o	o	o	o	o
E	E	E	E	E	E
o	o	o	o	o	o
T	x	I	x	X	x

o Vi
	<a
H	C
cd	c
UJ	c
T“	o
Q	<0
Ý	«ca
X rn	> o

© s 8 o	© CM N © b-	© CM O © O Q	© o φ b. CO	© ΤΟ τΤ b. ω	CM « O © O o	u © CM ® O O O	w © CM © O O O
O	CD	g	X	I	Q	<	<
<	cd	<			<	©	cd
éd	ω	©	0	0	ŤJ-	0	0
X	ω	x	H	H	X	H	H
X	σι	x,	X	X,	X,	X,	X(
CD1	m	1 m	CD	m	m	CD	CD
CD	0	0	0	0	0	CD	0

O CM	©
O	CM	©
	b.	to

to	©	©
	©	©	Y-
©	©	©	to
O	o	o	o
CO	ca	ca	CO
e	K		í$

CM	©	T—
©	©	b.
to	to	to
o	o	o
ca	co	co
2	č	S

CO	©	03	03	CO
σ>	03	03	03	03
CD	CO	N	N	CO
o	o	O	O	O
CN	CM	ó	ó	©
o	o	OJ	CM	O

CO	CO CO	03	03
0)	0) 03	03	03
CO	03 CD	CÓ
O	O O	O	O
CD	i< r<	N	CD
O	O Y-	CM	CM

N 03	03 03	03	03 b- 03
03 0)	03 03	0)	03 03 03
03 CD	CD CO	CÓ	CÓ 03 CM
O O	O O	O	O O O
CD ©	CM CÓ	CÓ	y-‘ 03 CM
CM O	CM CM	CM	CO CM O

00	03 CO	03
03	03	03	03
Ó	©	©	CM
Y·	O	O	O
CÓ	CM	CÓ	03
O	Y	O	O

CD

CO

o

o

00

CO

CM LD

co

CM

CM N

CM O

S

LD LD LD

CO

LD

©

N

o

03

CO

00

CO 03

o

N

b- LD

CO 03

CD

CD CO CO

CO

co

N

o

r\

CD

r* cq.

CO

03

(0 LD

CD N

©

CN CN CN

03

CO

cq

CD

03

fs?

CM*

b.

y- CM*

CO*

CM* y-*

03* OO*

N*

CO CO* CD

b-*

O*

o’

CO*

CO

CO

N

co

N

CO

N CO

CD

©

N N

CO CO

(0

LD LD LD

CO

N

N

CD

C 03	CO >	c CD	c Φ
o.	'o.	’o.
CO	CO	CO	CO
<fí	CO	CO	(0
o	CO	o	o
E	N	E	E
o	ŕ	o	o
T	o	z	x

2	ô «
u	to
CO □ E	c u o íl =
	Q. O a.
(0	Q) O 03
□	t- XXD
2	m 2 2

O	φ	o
E	Ž	E
o	ω	o
Z	(0	Z

CD

y—

CM

03

CM

CM

O

CO

o

CO

b-

(D

CD

(0

b·.

CD

CD

CD

03

CO

CO

CM

m

oo

b-

CM

CM

CO

03

O

O

N

©

CO

CO

r

N

0)

03

T“

©

N

N

N

CO

CO

CM

CO

CO

CM

b-

r-

N

CM

CD

CD

b-

b-

(0

CD

2

©

©

CM LD

CM LD

Q

N CO

LD CD

© ©

©

LD

©

©

CO

H

O

O

o

Ô y—	ó	Q CM	O CN	u t m S	to
to	ω	H	H	v- r-	A
ω	ω	to	to	< <	<
0	°l	UJ I	UJ I	m m i i	m 1
1 m	m	1 CO	1 CO	mm	1 CO
0	Φ	0	0	0 0	0

©	b»	©	©	τ-
				Ό
o	o	O	o
CN	CN	CN	CN	CN
O	O	O	O	O
(0	(0	(0	CO	0
c	č	ŽS	2S	č

©	©	ϋ
©	b-
CM	CN	CM
CN	CN	CN
O	O	O
CO	CO	0
£	c	č

GB_BA2:AF056321 5482 AF056321 Actinomyces naeslundii ureázová gama podjednotka UreA (ureA), Actinomyces naeslundii 63,686 09.02.99 ureázová beta podjednotka UreB (ureB), ureázová alfa podjednotka UreC (ureC), ureázový akcesný proteín UreE (ureE), ureázový akcesný proteín UreF(ureF), ureázový akcesný proteín UreG (ureG), a ureázový akcesný proteín UreD (ureD) gény, úplná cds.

CO

O)

T CO

OJ

OJ

b.

O)

CD

OJ

OJ

Q?

OJ

m

oj

q

q

a oj

OJ

OJ

q

OJ

q

OJ

OJ

OJ

OJ

OJ

OJ

’T

0) OJ

CO

co

oj

Τ-

ej

oj

ej

f<

oi

CD

O

O

o o

q

q

o

O

Ο

Ύ—

1—

q

o

o

CD

CO

CD ó

τ

τ

(D

Ó

ó

CO

CO

CO

t·

CO

CO

CM

o

OJ 1-

CM

Od

CO

o

o

o

cm

T“

o

	OJ CM	s	CO
CD	t- CO	b·
	CD CO	CM	in
oj“	oj“ co“	cm“	T
CO	CO CO	CO	co

		Q.
		m
		M-í
	c	C
	m	m
	o	o
(ň	.2	ω
C OJ q. CO 0)	ω o o	ω δ1 ° «	CQ > (Β 0J	1> α 0)
o E	E D φ	ω Ε	(0 £	(0 £
o	c	C ο	L	c
X	Q.	0. χ:	Ο	ο

	CD in	T“ CO
00	T	CM 10	O
’T	LO	CD ®
CM	O	o ®	LP
ΙΌ	OJ	S p	O
CO	Τ’	CM LJ-	O
D	m	□ <	<

o
o	O	o	CO
o	CO	CO	b-
o“	CO	CD	OJ
o	o’	N	in“
v	CD	CO	CO

CO	CM	b-	t- T
b·	CD	CM	**· b-
q	0)	CM	T (0
in	cd“	oj“	O b.“
co	CO	0)	’T CO

CO o	CO		CM	CM b· b-
	CM	b*	•t—
LD	O	b-	O	cô
o	m	CM	O	o
O	co	O)	o	—1
<	D	N	□	<

’T T

CD CD

		cô CO	CO
S	UÍ8	o o	CM O
UJ f—\	Cg IO	LP UJ	m	N
Vj m	S co	o o	co	>-
U> Τ’	O g	σσ	D	O
CO	S U-	< <	ω	1—
cb	0- <	čo čo	o	S
CD CD	Ľ^í	ω ω ω ω	<	<
0	CL Ο- ι i	°ι°ι	ωι	CD |
CD1	1 I m m	m m	00	1 CD
0	Φ Φ	00	0	0

CM	CM	T	CD
f:	b· b.	OJ CD	b-	CO T“
CO	S	O CM	CM m	3
o	o	O		o
—J	-J	m	in	-J
<	<	<	T	<

in o CD	T OJ	T“ O
▼“	CM	i—

CM O O o	CM UJ in CM CM ω x	CM UJ m a ω x	CM UJ m CM CM (D x	T CM CD O CM O m	b· CM tn m X	O CO o o ω z Q
□	(M	ój	CM	<	T*
r-	0	0	0		H	cd
<	H	H	H	<	ω	CD
OO	X I	I	X,	m i	UJ I	°i
1 CD	1 CD	m1	1 CD	1 m	1 CD	CO
0	0	0	0	G	0	0

OJ

CM	m	CD	CO
b*	CO	T	o
OJ	b.	b.	T-

b>	T	Υ-
	CO	ΙΌ
CO	CO	CO
CM	CM	CM
o	o	O
CO	<0	CO
δ	s	s

0)	0)	CD	CD G)	CD	CD	rx	CD	CD
q	CD	CD	G) q	q	G)	G)	CD	CD
o	ó	Ó	r- τ-	γ-j	CÔ	co	CM	to
	T“		Ο T-	τ-	O	o	▼-	O
CD	CÔ	CÔ	to ó	Ο	CÓ	CM	rx	rx
T“			r- CM	CM	O			CM

CD	CD	CO	to xt	'M-	o	O	Y—
CD	CD		CD CD	M-	CD	CO	CD
Xf	xt	T-	CO CO	CM	to	fx	O
rx	rx	CD	cm co	to	o	co“	fx'
CO	CO	CO	ΧΓ CO	CO	M·	CO	CO

® g ÍC 5» Q. O o £ <o a> 2 ®	aj 8 C 2* Q. O o E m cd 2ô	aj £8 c ? Q. O o E co cd O Q)	□ *3 ’ík w 2 OT 2 °* S-g °-s >< 2	(0 ω Q. O Ό ÍQ S	Φ = O E 3 5 8 § g E E S'S « o □ =	aj ω ♦5 m 2 *8 S o o Φ BÍ -C Q.	VI Φ £φ E| 2-o CL C φ Φ 4= >
Q E	Q E	Q E	S <	<	O a>2	CC ω	ω ®

113

Y—		CD
CD	0)	CD
		O
O	o	rx
CO	CO	co
		T“
	xt	to
to	to	rx
o	o	co
o	o	(D
		o
o	o	Q
O <;	0 <	O <
Ťt	xŕ	xfr
0	0	0
I-	f—	H
x,	η	X I
m	m	I m
0	0	CD

xt (D	S	O	xT P
CO CM	CM	T“	CO	O	rx
rx xr		n	CM	3	3
co co	CO	CM
			fx
			to	—f
o o	CD	CD H	to	o	xf
(D CM	CM	0)	CL	ľx
CM CM	CM	μ	co	CL	CO
CC 05 t ® ? <	Gi O tn <	í 0 p		> CL to CC	rx CM LL <
y— * *		T·	1—	Ť—	Ôj
< -I	-j	<	ω	<	< CD I
ma.	n. 1	m	LU i	CD 1
1 1 m m	1 CD	1 m	1 CD	1 CD	1 cn
0 0	0	0	0	0	0

Od

CO

CO rx rx

CM (0

CO

CD

CO		CD
	CO
to	to	to
CM	CM	CM
O	o	o
cd	cd	cd
C	C	č

č

0)	0)	CD	0)	03	0)	03	0)	tn σ>
cn	0)	q	0)	q	0)	0)	0)	0)	q
ιη	b^		cm	χί-	CD	CO	Ó	b.*
o	O	τ-	Q	Ο	O	O	T—	O	V“
s	CD	Φ	CD	τ—’			CO	b^	CO
M	X“	CM	Q	CM	7“	T-	T“	v	CM

T	b·	CD	CO	O	CO	LD	05	CD	b-
	O	CO	O	M*	O	CM	CO	CO	lí>
M*	05	b.	CJ	CO-	o	q	O	O	q
CD	co“	CO*		Xt	b.*	o“	CO*	05*	in
CO	CO	CO	xt	M*	CO	M-	CO	CO	co

CM xt b-	b-	o s
CD CO 00	b· O CO b»	s CO
7— xt b*	CD	CM O
o	s
<
xt	00	bí
	CM
CO	b“	π-
CO	CO	ω
0 I	UJ I	UJ I
1 m	1 m	1 CD
0	0	0

in	CM	OO
	CD	o
£	ID	(D
CD S	00	CD
CD		0)
b> CO		7“ CD
CM	CM	CM
C	b·	b-
<	<	<
o	CM	CM
	CO	CO
CO	H	F—
CO	CO	CO
	UJ	UJ I
m	m1	1 CD
0	(5	0

00
xt		b-
00		05
3	in
	CO
	S	Y“ in
CM		bd
3	3	φ
CM	CD	CM
O O	05 CM	“O O
O	X	CO
<	xt	X
xt	H-	éo
CC	ω	CC
Q_	UJ	CL I
CD*	1 CD	1 CD
0	0	0

CO	05	y—
05	CD	CO
O	CO
x“	X	X”
00	m	Xt
m	CD	b-
m	m	m
CM	CM	CM
o	o	o
co	CO	CO
£	2	£

ro q

f q

b* CD 0) 0)

CO 03

00 0)

0) 0)

0) 05

03 q

CD CD

03 0)

oo 03

ro q

8

03 q

8

03 q

03 q

CO 03

o

Ó Ó

CO

ó

ro

CO

ro

CM

00

CD

cô

03

0>

F

F

co

CO

q

q

q

q

q

q

O

O

o

O

o

o

q

q

O

F

CM

CM Ó

ro

CD

F

TÍ-

F

ro

F

F

03

CO

CO

ro

F

cô

F

O

O t-

o

CM

o

o

CM

O

o

o

o

o

CM

*“

fx.

03 0)

ro co

ro

CD

CD

ro cm

03

CD

F

o

ro

00

CO

b» bo T-

co co

o

bo

CM

CM

t- 03

CM

O

00

CM

03

CO

03

c> q. ®

q q

q

03

q

00

O 7-

q

03

CM

q

03

ro

CM

CO

F F in

co σΓ

F

F

O

03 0>“

ro“

o“

O

co“

co“

co“

03“

CO

co co co

ro co

co

CO

Tb

M-

M*

vr

co

CO

CO

CO

cn

Q.

<0 □

S cn □

E □

O E o I

b*

co o CM F

CO σ <

CO

CO

SN iCO CO o

CO ’t F

CD		O	O 03
bo		ro	O 0)
o	F	o	ro 03	o
CM	ro	ro	ro τ-	CO
CM	o	F	ο CM
O	o	F	o o	ro
_l	O	<	-j -j
<	<	<	< <	□
	o
o			e o	ro
tí-	bo		o ro	F
F	F	00	CO T-	CD
CO	F		F co	CO
CM		CM	CO t-	CO

CO o

F	a	CM Ul
vf	<0	CD
o CM CC	> LU p	Ž p
ČM	T-	t-
F	0	0
G	H	H
Ul	X,	X I
1 CD	m	1 o
G	0	e

co CO o o CO co

F 03	o m	CO	CO
CO			Q		O	F	F
03		*e	ro	CO	00	ro	ro
Tf	CO			F vr		o	o
CO	CM	F	F	CO M-	ro	ro	ro
o	O	ro		-J O		03	03
<	Č	o Q	3	yč	D _)	<	<
ČM	s	O <	03	S 5	S	F CO	F CO
ω	F		F	Ύ- Ť—	7“	F	F
CD	<	ČM	CD	< <	<	CO	CD
e	“l	Z I	UJ I	co m I 1	CD i	UJ I	Ul |
1 CD	m	1 G	1 CO	1 i m m	1 ffl	1 CO	m
G	0	G	G	0 o	0	G	G

F CO

CM	y—		CD
O	F	F	CM
CO	CM	CM	CO
F	CM CM CO ro	0) y— 03 tJro	F
T		o	O
>	>	>	§
<	<	<	ŕ
	ro	ČM
CO	co	CO
F	F	F
G	G	G	<
Ul I	UJ	UJ 1	CD |
m	1 m	1 CD	1 CD
0	G	G	0

CM

	03
00	vr	7”
CD	03	T“
00	CO
03	CM	CO
CO	03	o
ro	ro	(D
CM	CM	CM
o	O	O
cd	cd	cd
č	S	e

CO r—

CO

CM

CO

ro

O cd

C0	<Ο	8	C0	Φ	rx cn σ>
φ	0)	0)	Φ	Λ Ô) G)
c\i	G)	ΙΌ	cd	cd	cm oj rx
	ο	Ο	ο	ο	o o o
CO	ΙΌ	τί	rx	CO	i-: cm
ο	Ο	»-		ο	o O CM

σ> σ> ω σ» τί ό ο τC\i ό Γ- CM

		o
ΙΌ	00	o	ro	0Ď
CM	CO	o	CQ	CO
	oo	o	fx	CD
ΙΌ	co	o	g>“	ro
ΙΌ	Tí		CO	CO

Gi Tt O	o co o
ro co b*	o co co
co 0) rx	TT v- co
co ro ro	co ro co
co co co	ro tí ω

φ Ο Λ Χ>

OT C CQ Ο) Φ

Φ ω .2?

·= c ο Φ CÚ Φ

C0 Ο

o fc	rx	G) CO	Γ-	c0 CO b.		o ing	O O CO Tf CO
b-	CO	o	Ο)	CO		co 2 « w 8® N <	co ro <o
CM	ro		CO	o	ro	co co 2
O U_	?	o 2	s	g	«í CO	228
<	ZJ	N	<	D	>< <
				o			TÍ Tí
CO			CM			co	ro co
CO	00	OO	rx		b-	ro	ro co co
CO	CO	CO	co	CO	co	G) o	v- T- o
o	G)	CO	G)		00	O CM	CO CO i-
CO	CO	ro	CM	CM	CO	cm rx	co i- i-
				CO		o
o rx bIX CM o	b. S Ξ)	G) cô o •J	00 CO CO > o	CO rx 00 o o O	Tí ro Tí CO □	og Q w 2 co H <	CO Q r® 5 o to io to CO CO co Γ P o >0.0
x <	< ω	δ	H Σ	< cd	x CD	UJ ro O co
ČM	CM	τ		0		3 *“
<	<	<	<	H	<	z ω
CD	CQ	CQ 1	m 1	X|	CD I	“ UJ | t	m io_ i 1 i
CD1	1 CQ	1 CD	1 cn	CD	CD	1 1 CD CD	CD CD CD
0	0	0	0	0	0	00	000

ΟΟ

ΙΌ

CD

Ο

-117Príkladv uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava celkovej genómovej DNA Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Kultúra Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) sa pestovala cez noc pri 30 °C za intenzívneho pretrepávania v BHI médiu (Difco). Bunky sa zbierali centrifugáciou, supernatant sa odhodil a bunky sa resuspendovali v 5 ml tlmivého roztoku-l (5 % pôvodného objemu kultúry - všetky vyznačené objemy boli kalkulované, na 100 ml objem kultúry). Zloženie tlmivého roztoku-l: 140,34 g/l sacharózy, 2,46 g/l MgSO₄ x 7 H₂O, 10 ml/l KH₂PO₄ roztoku (100 g/l, pH upravené s KOH na 6,7), 50 ml/l M12 koncentrátu (10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l NaCl, 2 g/l MgS0₄ x 7 H₂O, 0,2 g/l CaCI₂, 0,5 g/l kvasinkového extraktu (Difco), 10 ml/l zmesi stopových prvkov (200 mg/l FeSO₄ x H₂O, 10 mg/l ZnSO₄x 7 H₂O, 3 mg/l MnCI₂ x H₂O, 30 mg/ H₃BO₃, 20 mg/ CoCI₂ x 6 H₂O, 1 mg/l NiCI₂ x 6 H₂O, 3 mg/l Na₂Mo0₄ x 2 H₂O, 500 mg/l komplexotvorného činidla (EDTA alebo kyseliny citrónovej), 100 ml/l zmesi vitamínov (0,2 mg/l biotínu, 0,2 mg/l kyseliny listovej, 20 mg/l kyseliny p -aminobenzoovej, 20 mg/l riboflavínu, 40 mg/l Ca-pantotenátu, 140 mg/l kyseliny nikotínovej, 40 mg/l pyridoxín hydrochloridu, 200 mg/l myoinozitolu). Lyzozým sa pridal k suspenzii na konečnú koncentráciu 2,5 mg/ml. Po asi 4 h inkubácii pri 37 °C, sa rozložila bunková stena a výsledné protoplasty sa zbierali centrifugáciou. Sediment sa raz premyl s 5 ml tlmivého roztoku-l a raz s 5 ml TEtlmivého roztoku (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8). Sediment sa resuspendoval v 4 ml TE-tlmivého roztoku a pridalo sa 0,5 ml roztoku SDS (10 %) a 0,5 ml roztoku NaCl (5 M) Po pridaní proteinázy K na konečnú koncentráciu 20 pg/ml sa suspenzia inkubovala cca 18 hodín pri 37 °C. DNA sa purifikovala extrakciou s fenolom, fenolom-chloroformom-izoamylakoholom a chloroformomizoamylalkoholom podľa štandardných metód. Potom sa DNA vyzrážala pridaním 1/50 objemu 3 M octanu sodného a 2 objemov etanolu s následnou 30 minútovou inkubáciou pri -20 °C a 30 minútovou centrifugáciou pri 12 000 otáčkach za minútu (rpm) vo vysokorýchlostnej centrifúge s použitím SS34 rotora (Sorvall). DNA sa rozpustila v 1 ml TE-tlmivého roztoku obsahujúceho 20 pg/ml RNázy A a dialyzovala pri 4 °C proti 1000 ml TE-tlmivého roztoku najmenej 3 hodiny. Počas tohto času sa tlmivý roztok trikrát vymenil. K 0,4 ml alikvotným podielom

-118dialyzovaného roztoku DNA sa pridalo 0,4 ml 2 M LiCI a 0,8 ml etanolu. Po 30 minútovej inkubácii pri -20 °C cenrifugácie (13 000 otáčok za minútu (rpm), Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau, Nemecko). DNA sediment sa rozpustil vTEtlmivom roztoku. DNA pripravená týmto postupom sa môže použiť na všetky účely, vrátane metódy južných odtlačkov (southern blotting) alebo konštrukcie genómových knižníc.

Príklad 2

Konštrukcia genómových knižníc Corynebacterium glutamicum ATCC13032 v

Escherichia coli

DNA pripravená podľa opisu v príklade 1 sa použila na konštruovanie kozmidových a plazmidových knižníc podľa známych a dobre zavedených metód (pozri napr. Sambrook, J. a kol. (1989) „Molecular Cloning: A Laboratory Manuaľ, Cold Spring Harbor Laboratory Press, alebo Ausubel, F. M. a kol. (1994) „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley & Sons.).

Použiť sa môže akýkoľvek plazmid alebo kozmid. Predovšetkým sa použili plazmidy pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl. Sci. USA, 75, 3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134, 1141-1156), plazmidy sérií pBS (pBSSK + pBSSK - a ďalšie; Stratagene, LaJolla, USA), alebo kozmidy ako SuperCos 1 (Stratagene, LaJolla, USA) alebo Lorist6 (Gibson, T.J., Rosenthal, A. and Waterson, R.H. (1987) Gene 53, 283-286. Génové knižnice špecifické na použitie v C. glutamicum môžu byť konštruované použitím plazmidu pSL 109 (Lee, H.S. and A.J. Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4, 256-263).

Príklad 3

Sekvenovanie DNA a komputerová funkčná analýza

Na sekvenovanie DNA podľa štandardných metód sa použili genómové knižnice, opísané v príklade 2, predovšetkým sa použila metóda reťazovej terminácie použitím ABI377 sekvenčných prístrojov (pozri napr. Fleischman, R.D. a kol. (1995) „Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd“., Science, 269, 496-512). Použili sa sekvenčné priméry

-119s nasledovnými nukleotidovými sekvenciami: 5'-GGAAACAGTATGACCATG-3' SEQ ID NO:441 alebo 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' SEQ ID NO:442.

Príklad 4

In vivo mutagenéza

In vivo mutagenéza Corynebacterium glutamicum sa môže uskutočniť pasážovaním plazmidu (alebo iného vektora) DNA do E. coli alebo iných mikroorganizmov (napr. do druhov Bacillus alebo kvasiniek ako Saccharomyces cerevisiae), čím sa zhorší ich schopnosť udržať si integritu genetickej informácie. Typické mutátorové kmene mali mutácie v génoch reparačného systému DNA (napr. mutHLS, mutD, mutT, atd’.; na porovnanie pozri Rupp, W.D.(1996) DNA repair mechanisms, v Escherichia coli and Salmonella, str. 2277-2294, ASM, Washington.) Takéto kmene sú dobre známe odborníkom, ktorí sú skúsení v danej oblasti techniky. Použitie takýchto kmeňov je uvedené napríklad v Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7, 32-34.

Príklad 5

Transfer DNA medzi Escherichia coli a Corynebacterium glutamicum

Niekoľko Corynebacterium a Brevibacterium druhov obsahuje endogénne plazmidy (ako napr. pHM1519 alebo pBL1), ktoré sa autonómne replikujú (pozri prehľad, napr. Martin, J.F. a kol. (1987) Biotechnology, 5, 137-146). „Shuttle“ vektory pre Escherichia coli a Corynebacterium glutamicum sa môžu ľahko konštruovať použitím štandardných vektorov pre E. coli (Sambrook, J. a kol. (1989), „Molecular Cloning: A Laboratory Manuaľ, Cold Spring Harbor Laboratory Press alebo Ausubel, F.M. a kol., (1994) „ Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley & Sons), ku ktorým sa pridal pôvodný alebo na tento účel replikovaný a vhodný markér z Corynebacterium glutamicum . Takáto replikácia je výhodná pri použití endogénnych plazmidov izolovaných z Corynebacterium alebo Brevibacterium druhov. Predovšetkým výhodné pre tieto druhy je použitie génov zodpovedných za rezistenciu na kanamycín (takých, ktoré sú odvodené zTn5 alebo Tn903 transpozónov) alebo na chloramfenikol (Winnacker, E.L. (1987) „From Genes to Clones - Introduction to Gene technology, VCH, Weinheim) ako

-120transformačných markérov. V literatúre existuje mnoho príkladov na konštrukciu „divého“ typu „shuttle“ vektorov, ktoré sa replikujú aj v E. coli aj v C. glutamicum, a ktoré sa môžu použiť na niekoľko účelov, vrátane nadmernej expresie génu (na porovnanie pozri napr. Yoshihama, M. a kol. (1985) J. Bacterioi. 162. 591-597, Martin J.F. a kol. (1987) Biotechnology, 5, 137-146 a Eikmanns, B.J. a kol. (199V Gene, 102, 93-98).

Použitím štandardných metód je možné klonovať gén, ktorý je predmetom záujmu, do jedného zo „shuttle“ vektorov opísaných vyššie a zaviesť takéto hybridné vektory do kmeňov Corynebacterium glutamicum. Transformácia C. glutamicum sa môže dosiahnuť pomocou protoplastovej transformácie (Kastsumata, R. a kol.(1984) J. Bacterioi. 159. 306-311), elektroporácie (Liebl, E. a kol. (1989) FEMS Microbioi. Letters, 53, 399-311) a v prípadoch, keď sa použijú špeciálne vektory, tiež pomocou konjugácie (ako sa to opisuje napr. v Schäfer, A. a kol. (1990) J. Bacterioi. 172, 1663-1666). Tak isto je možný transfer „shuttle“ vektorov pre C. glutamicum do E. coli pomocou preparácie plazmidovej DNA z C. glutamicum (použitím štandardných metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky) a jej transformovaním do E. coli. Takýto transformačný krok sa môže uskutočniť použitím štandardných metód, ale výhodné je použiť Mcr-deficitný kmeň E. coli, ako napríklad NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166.1-19).

Gény sa môžu nadmerne exprimovať v kmeňoch C. glutamicum použitím plazmidov, ktoré obsahujú pCG1 (americký patentový spis č. US 4,617,267) alebo ich fragmentov a voliteľne gén rezistencie na kanamycín z TN903 (Grindley, N.D. a Joyce, C.M. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(12), 7176-7180). Okrem toho sa gény môžu nadmerne exprimovať v kmeňoch C. glutamicum použitím plazmidu pSL 109 (Lee, H.-S. and A.J. Sinskey (1994) J. Microbioi. Biotechnol. 4, 256-263).

Okrem použitia replikačných plazmidov sa nadmerné exprimovanie génu môže tiež dosiahnuť pomocou integrácie do genómu. Genómová integrácia v C. glutamicum alebo iných Corynebacterium alebo Brevibacterium druhoch sa môže uskutočniť pomocou takých metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky ako je homológna rekombinácia s genómovou(ými) oblasťou(ami), integrácia usmernená reštrikčnou endonukleázou (REMI) (pozri napr. nemecký patentový spis DE 19823834), alebo prostredníctvom použitia transpozónov. Tak isto je

- 121 možné modulovať aktivitu génu, ktorý je predmetom záujmu, pomocou modifikovania regulačných oblastí (napr. promótora, represora a/alebo zosilňovača) pomocou sekvenčnej modifikácie, inzercie alebo delécie, využijúc miestne cielené metódy (ako je homológna rekombinácia) alebo metódy založené na náhodných prípadoch (ako transpozónová mutagenéza alebo REMI). Sekvencie nukleových kyselín, ktoré majú funkciu transkripčných terminátorov, sa tiež môžu vložiť 3' ku kódovacej oblasti jedného alebo viacerých génov podľa tohto vynálezu; takéto terminátory sú dobre známe v danej oblasti techniky a sú opísané napríklad voWinnacker, E.L. (1987) From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology. VCH, Weinheim.

Príklad 6

Stanovenie expresie mutantných proteínov.

Pozorovania aktivity mutovaných proteínov v transformovanej hostiteľskej bunke sa opierajú o fakt, že mutantný proteín je exprimovaný rovnakým spôsobom a v rovnakom množstve ako „divý“-typ proteínu. Na určenie úrovne transkripcie mutantného génu existuje užitočná metóda (indikovanie množstva mRNA dostupnej na transláciu na génový produkt), a to metóda severných odtlačkov (Northern blot) (na porovnanie pozri napríklad Ausubel a kol.(1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York), pri ktorej sa primér určený na naviazanie ku génu, ktorý je predmetom záujmu, označí s detegovateľnou značkou, (obyčajne rádioaktívnou alebo chemoluminiscenčnou) tak, že keď sa celková RNA kultúry organizmu vyextrahuje, spracuje na géli, transferuje sa na stabilnú matricu a inkubuje s touto sondou, naviazanie a kvantita naviazania sondy indikuje prítomnosť a tiež množstvo mRNA pre tento gén. Táto informácia je dôkazom stupňa transkripcie mutantného génu. Celková bunková RNA sa môže pripraviť z Corynebacterium. glutamicum pomocou niekoľkých metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky, ako ich opisujú vBormann, E.R. a kol. (1992) Mol. Microbiol. 6, 317-326.

Na stanovenie prítomnosti alebo relatívneho množstva proteínu translatovaného z tejto mRNA sa môžu použiť štandardné metódy, také ako metóda západných odtlačkov (Western blot), (pozri napríklad Ausubel, a kol. (1988)

-122Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York). Pri tomto procese sa celkový bunkový proteín extrahuje, gélovou elektroforézou sa separuje, prenesie sa na nitrocelulózovú matricu, ainkubuje sa so sondou, ako napríklad protilátkou, ktorá sa špecificky viaže na požadovaný proteín. Táto sonda je obvykle označená s chemoluniniscenčnou alebo kolorimetrickou značkou, ktorá sa dá ľahko detegovať. Prítomnosť a kvantita pozorovanej značky poukazuje na prítomnosť a množstvo požadovaného mutantného proteínu prítomného v bunke.

Príklad 7

Rast geneticky modifikovanej Corynebacterium glutamicum - médiá a podmienky kultivácie

Geneticky modifikovaná Corynebacterium. glutamicum sa pestuje na syntetickom alebo prírodnom rastovom médiu. Celý rad rôznych rastových médií pre Corynebacteria sú aj dobre známe, aj ľahko dostupné (Lieb, a kol., (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 205-210; von der Osteň, a kol., (1998) Biotechnology Letters, H, 11-16; nemecký patentový spis DE 4,120,867; Liebl (1992) „The Genus Corynebacterium, v The Procaryotes, Volume II, Balows, A. a kol., eds. SpringerVerlag). Tieto médiá sa skladajú z jedného alebo viacerých zdrojov uhlíka, zdrojov dusíka, anorganických solí, vitamínov a stopových prvkov. Výhodnými zdrojmi uhlíka sú sacharidy ako mono-, di-, alebo polysacharidy. Napríklad, glukóza, fruktóza, manóza, galaktóza, ribóza, sorbóza, ribulóza, laktóza, maltóza, sacharóza, rafinóza, škrob alebo celulóza sú veľmi dobrými zdrojmi uhlíka. Tak isto je možné dodávať sacharid do média prostredníctvom komplexných zlúčenín, takých ako melasy alebo vedľajších produktov pri rafinácii cukru. Tak isto sa môžu výhodne dodávať zmesi rôznych zdrojov uhlíka. Ďalšími možnými zdrojmi uhlíka sú alkoholy a organické kyseliny ako metanol, etanol, kyselina octová alebo kyselina mliečna. Zdrojmi dusíka sú obyčajne organické a anorganické zlúčeniny dusíka, alebo materiály, ktoré obsahujú tieto zlúčeniny. Príkladnými zdrojmi dusíka sú plynný amoniak alebo amónne soli ako NH₄CI alebo (NH₄)₂SO₄ NH₄OH, dusičnany, močovina, aminokyseliny alebo komplexné dusíkové zdroje ako macerovaný kukuričný mok, sójová múčka, sójový proteín, kvasinkový extrakt, mäsový extrakt a iné.

- 123 Zlúčeniny anorganických solí, ktoré sa môžu zahrnúť do médií sú soli vápnika, horčíka, sodíka, kobaltu, molybdénu, draslíka, mangánu, zinku, medi a železa vo forme chloridov, fosforečnanov alebo síranov. Aby sa udržali ióny kovov v roztoku, môžu sa pridať do média chelátotvorné zlúčeniny. Predovšetkým užitočnými chelátotvornými zlúčeninami sú dihydoxyfenoly, ako katechol alebo protokatechinát alebo organické kyseliny, také ako kyselina citrónová. Médiá zvyčajne obsahujú aj ďalšie rastové faktory ako vitamíny alebo rastové promótory, napríklad také ako biotín, riboflavín, tiamín, kyselinu listovú, kyselinu nikotínovú, pantotenát a pyridoxín. Rastové faktory a soli často pochádzajú z komplexných zložiek média ako kvasinkového extraktu, melasy, macerovaného kukuričného moku a ďalších. Presné zloženie média veľmi závisí od bezprostredného pokusu a rieši sa individuálne pre každý špecifický prípad. Informácie o optimalizácii médií sú dostupné v príručke .Applied Microbiol. Physiology, A practical Approach (eds. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) str. 53-73, ISBN 019 963577 3). Tiež je možné, aby sa zvolilo rastové médium od komerčných dodávateľov, ako štandard 1 (Merck) alebo BHI („grain heart infusion“, DIFCO) alebo ďalšie.

Všetky zložky média sa sterilizujú, buď tepelne (20 minút pri 1,5 bar a 121 °C) alebo sterilnou filtráciou. Zložky sa môžu sterilizovať spolu, alebo ak je to nutné, tak oddelene. Všetky zložky médií môžu byť prítomné na začiatku rastu, alebo sa môžu voliteľne pridávať kontinuálne alebo po dávkach.

Podmienky kultivácie sú určené pre každý pokus osobitne. Teplota by mala byť v rozsahu od 15 °C do 45 °C. Teplota sa môže udržiavať konštantná, alebo sa môže v priebehu pokusu meniť. Hodnota pH média by mala byť v rozpätí od 5 do 8,5, výhodne okolo 7,0 a dá sa udržiavať pomocou prídavku tlmivých roztokov k médiu. Príkladným tlmivým roztokom na tento účel je tlmivý roztok fosforečnanu draselného. Alternatívne alebo súbežne sa môžu používať syntetické tlmivé roztoky ako MOPS, HEPES, ACES a iné. Konštantné pH sa pri kultivácii môže tiež udržať pridaním NaOH alebo NH₄OH počas rastu. Ak sa použijú komplexné zložky do média ako kvasinkový extrakt, nutnosť používať dodatočné tlmivé roztoky sa môže znížiť, v dôsledku toho, že mnohé komplexné zlúčeniny majú vysokú tlmivú kapacitu. Ak sa na kultiváciu mikroorganizmov používa fermentor, tak pH sa dá tiež regulovať použitím plynného amoniaku.

-124Inkubačný čas je obvykle v rozpätí od niekoľkých hodín až do niekoľkých dní. Tento čas sa zvolí tak, aby sa umožnilo maximálne nazhromaždenie produktu v živnom kvapalnom médiu. Opísané rastové pokusy sa môžu uskutočňovať v rôznych nádobách, napríklad mikrotitračných platniach, sklenených skúmavkách alebo sklenených bankách alebo sklenených alebo kovových fermentoroch rôznych veľkostí. Na skríning veľkého množstva klonov by sa mal mikroorganizmus pestovať v mikrotitračných platniach, sklenených skúmavkách alebo trepacích bankách, buď s alebo bez miešacích zarážok. Výhodne sa používajú 100 ml trepacie banky naplnené na 10 % (objemových) s požadovaným rastovým médiom. Banky by sa mali trepať na rotačnej trepačke (rozkmit 25 mm) pri rýchlostnom rozsahu 100 - 300 otáčok za minútu. Straty odparovaním sa môžu znížiť pomocou udržiavania vlhkého ovzdušia; alternatívne by sa mala uskutočniť matematická korekcia strát odparovaním.

Ak sa testujú geneticky modifikované klony, mal by sa tiež testovať nemodifikovaný kontrolný kloň alebo kontrolný kloň obsahujúci základný plazmid bez akejkoľvek inzercie. Médium sa inokuluje na 0,5 - 1,5 OD₆₀₀ použitím buniek kultivovaných na agarových platniach ako napríklad CM platniach (10 g/l glukóza, 2,5 g/l NaCI, 2 g/l močovina, 10 g/l polypeptón, 5 g/l kvasinkový extrakt, 5 g/l mäsový extrakt, 22 g/l agar, pH 6,8 s 2 M NaOH), potom sa inkubuje pri 30 °C. Inokulácia média sa dosiahne buď tým, že sa naočkuje suspenzia buniek C. glutamicum z CM platní vo fyziologickom roztoku alebo sa pridá kvapalná predkultivovaná baktéria.

Príklad 8

In vitro analýza funkcie mutantných proteínov

Stanovenie aktivít a kinetických parametrov enzýmov je v danej oblasti techniky zavedené. Pokusy stanoviť aktivitu akéhokoľvek zmeneného enzýmu sa musia prispôsobiť špecifickej aktivite „divého“-typu enzýmu, čo je v schopnostiach odborníka skúseného v odbore. Všeobecný prehľad o enzýmoch, ako aj špecifické detaily týkajúce sa , M., and Webb, E.C., (1979) Enzymes, Longmans, London; Fersht, (1985) Enzýme Structure and Mechanism. Freeman, New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, San Francisco; Price, N.C.,

-125Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press, Oxford; Boyer, STR. D., ed. (1983) The Enzymes, 3^rd ed. Academic Press, New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2^rded. VCH, Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Grapi, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3^rd ed., vol. I -XII, Verlag Chemie, Weinheim; a Ullmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, „Enzymes“. VCH, Weinheim, str. 352-363.

Aktivita proteínov, ktoré sa viažu na DNA sa môže merať pomocou niekoľkých dobre zavedených metód, ako DNA skúškou pásového posunu (bandshift) (tiež nazývanou gélová retardačná skúška). Vplyv takýchto proteínov na expresiu ďalších molekúl sa môže merať pomocou skúšok s reportérovým génom (tak ako to opisuje Kolmar, H. a kol. (1995) EMBO J. 14. 3895-3904 a odkazy tam citované). Testovacie systémy reportérového génu sú dobre známe a zavedené na aplikovanie tak v prokaryotických, ako aj eukaryotických bunkách, použitím takých enzýmov ako beta-galaktozidázy, zeleného fluorescenčného proteínu a niekoľkých ďalších.

Stanovenie aktivity membránovo-transportných proteínov možno uskutočniť podlá takých metodík, aké sa opisujú v Gennis, R.B. (1989) „ Pores, Channels and Transporters“, v Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer, Heidelberg, str. 85-137 a 270-322.

Príklad 9

Analýza vplyvu mutantného proteínu na produkciu požadovaného produktu

Vplyv genetickej modifikácie v C. glutamicum na produkciu požadovanej zlúčeniny (takej ako aminokyseliny) sa môže stanoviť modifikovaním mikroorganizmu vo vhodných podmienkach (ako sú vyššie opísané) a analyzovaním média a/alebo bunkovej zložky na zvýšenú produkciu požadovaného produktu (t.j. aminokyseliny). Takéto analytické metódy sú dobre známe odborníkom, ktorí pracujú v danej oblasti techniky a zahŕňajú spektroskopiu, tenkovrstvovú chromatografiu, vyfarbovacie metódy rôzneho druhu, enzýmové a mikrobiologické metódy a analytickú chromatografiu, ako napríklad vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu (pozri napríklad: Ullman's Encyclopedia of Industrial

-126Chemistry, vol. A2, str. 89-90 a str. 443-613, VCH, Weinheim (1985); Fallon, A. a kol.,(1987) „Applications of HPLC in Biochemistry“ v Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm a kol., (1993) Biotechnology, vol. 3, Chapter III: „Product recovery and purification“, str. 469-714, VCH, Weinheim; Belter, P.A. a kol. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery process for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D. (1988) Biochemical separations, v Ulmann s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, str. 1-27, VCH, Weinheim; and Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Okrem merania konečného produktu fermentácie, je tiež možné analyzovať ďalšie zložky metabolických dráh, ktoré sa využívajú na produkciu požadovanej zlúčeniny, také ako medziprodukty a vedľajšie produkty, aby sa stanovil celkový výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie zlúčeniny. Metódy analýz zahrňujú merania hladiny živín v médiu (napr. sacharidov, uhľovodíkov, zdrojov dusíka, fosfátu a ďalších iónov), merania zloženia a rastu biomasy, analýzu produkcie bežných metabolitov biosyntetických dráh a meranie plynov produkovaných počas fermentácie. Štandardné metódy pre tieto merania sú načrtnuté v Applied Microbial Physiology, APractical Approach, P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, eds., IRL Press, str. 103-129; 131-163; and 165-192 (ISBN 0199635773) a odkazoch tam citovaných.

Príklad 10

Purifikácia požadovaného produktu z kultúry C. glutamicum

Získanie požadovaného produktu z buniek C. glutamicum alebo supernatantu vyššie opísanej kultúry sa môže uskutočniť rôznymi metódami, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky. Ak požadovaný produkt nie je vylučovaný z buniek, bunky sa môžu zbierať z kultivácie pomocou centrifugácie pri nízkych otáčkach, potom sa bunky lyžujú štandardnými metódami, ako napríklad mechanickým zásahom alebo sonifikáciou. Bunkový debris sa odstráni centrifugáciou a supernatantná frakcia obsahujúca rozpustné proteíny sa nechá na

-127dälšiu purifikáciu požadovanej zlúčeniny. Ak je produkt vylučovaný z C. glutamicum buniek, tak bunky sa odstránia z kultúry pomocou centrifugácie pri nízkych otáčkach a supernatantná frakcia sa nechá na ďalšiu purifikáciu.

Supernatantná frakcia z oboch purifikačných metód sa podrobí chromatografii s vhodnou živicou, pri ktorej je požadovaná molekula buď zadržaná na chromatografickej živici, zatiaľ čo mnohé nečistoty nie; alebo pomocou živice sa zadržia nečistoty a nie vzorka. Takéto chromatografické kroky sa môžu opakovať, ak je potrebné, použitím rovnakej alebo rôznych chromatografických živíc. Odborník v danej oblasti techniky by mal byť veľmi skúsený vo výbere vhodných chromatografických živíc, v ich najúčinnejšej aplikácii na príslušnú molekulu, ktorá sa má purifikovať. Purifikovaný produkt sa môže zahustiť pomocou filtrácie alebo ultrafiltrácie a uchovávať pri teplote, pri ktorej stabilita produktu je maximálna.

V danej oblasti techniky je známych veľa purifikačných metód a predchádzajúca metóda purifikácie nie je limitujúcou. Takéto purifikačné metódy sú opísané napr. vBailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-HilI, New York (1986).

Identita a čistota izolovaných zlúčenín sa môže stanoviť štandardnými metódami v danej oblasti techniky. Tieto zahŕňajú vysokúčinnú kvapalinovú chromatografiu (HPLC), spektroskopické metódy, vyfarbovacie metódy, tenkovrstvovú chromatografiu, NIRS, enzýmovú .alebo mikrobiologickú skúšku. Takéto metódy analýzy sú zhrnuté v: Patek, a kol. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60, 133-140; Malakhova a kol. (1996) Biotekhnologiya 11, 27-32; avSchmidt a kol., (1998) Bioprocess Engineer. 19, 67-70. Ulmannš Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH, Weinheim, str. 89-90, str. 521-540, str. 540-547, str. 559-566, 575-581 and str. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways, An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. a kol., (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in Biochemistry in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol.17.

Príklad 11

Analýza génových sekvencii podľa vynálezu

- 128Porovnanie sekvencií a určenie percenta homológie medzi dvoma sekvenciami sú v danej oblasti techniky známe metódy a môžu sa uskutočniť použitím matematického algoritmu ako algoritmu podľa Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-68, modifikovaného podľa Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 90, 5873-77. Takýto algoritmus je inkorporovaný do NBLAST a XBLAST programov (VERSION 2.0), Altschul, a kol. J. Mol. Biol. 215. 403-10. BLAST nukleotidové vyhľadávanie sa môže uskutočňovať s NBLAST programom, „score = 100“, „wordlenght = 12“, aby sa získali nukleotidové sekvencie homológne s HA molekulami nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu. BLAST proteínové vyhľadávanie sa môže uskutočniť s XBLAST programom, „score = 50“, „wordlength = 3, aby sa získali aminokyselinové sekvencie homológne s HA proteínovými molekulami podľa tohto vynálezu. Aby sa kvôli porovnaniam získali zoradenia s medzerami, môže sa využiť Gapped BLAST, ako to opisuje v Altschul a kol., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17), 3389-3402. Keď sa používajú programy BLAST a Gapped BLAST, odborník skúsený v danej oblasti techniky bude vedieť, ako treba optimalizovať parametre programu (napr. XBLAST a NBLAST) na to, aby sa mohla analyzovať špecifická sekvencia

Ďalším príkladom matematického algoritmu využívaného sa porovnanie sekvencií je algoritmus podľa: Meyers and Miller ((1988) Comput. Appl. Biosci. 4, 11-17). Takýto algoritmus je inkorporovaný do ALIGN programu (verzia 2,0), ktorý je súčasťou GCG sekvenčného zoraďovacieho súboru programov. Ak sa používa na porovnávanie aminokyselinových sekvencií ALIGN program, môže sa použiť PAM120 „weight residue table“, „gap length penalty 12“ a „gap penalty 4“. Dodatkové algoritmy pre sekvenčnú analýzu sú známe v danej oblasti techniky, a zahŕňajú ADVANCE a ADAM opísané vTorelIi a Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10, 3-5; a FASTA opísané v Pearson and Lipman (1988) P.N.A.S. 85, 24448.

Percento homológie medzi dvoma aminokyselinovými sekvenciami sa môže tiež stanoviť použitím GAP programu v GCG súbore programov (dostupných na http//www.gcg.com.), použitím buď Blosum 62 matice alebo PAM 250 matice a „gap weight“ 12, 10, 8, 6 alebo 4 a „length weight“ 2, 3 alebo 4. Percento homológie medzi dvoma nukleotidovými sekvenciami sa môže stanoviť použitím GAP

-129programu vGCG súbore programov, pri použití štandardných parametrov „gap weight“ 50 a „lenght weight“ 3.

Porovnávacia analýza génových sekvencií podľa tohto vynálezu s tými, ktoré sú uvedené v Genbank sa uskutočnila pomocou metód, ktoré sú známe v danej oblasti techniky (pozri napr. Bexevanis and Ouellete, eds. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. John Wiley and Sons, New York). Génové sekvencie podľa tohto vynálezu sa porovnali s génmi uvedenými v Genbanke trojkrokovým postupom. V prvom kroku sa uskutočnila BLASTIN analýza (napr. lokálna zorad’ovacia analýza) pre každú sekvenciu podľa tohto vynálezu voči nukleotidovým sekvenciám uvedeným v Genbanke a najlepších 500 aktívnych záznamov (nálezov) sa odložilo na ďalšie analýzy. Ďalšie FASTA vyhľadávanie (napr. kombinovaná lokálna a globálna analýza zoradenia, v ktorej limitované oblasti sekvencií sú zoradené), sa uskutočnilo na týchto 500 aktívnych záznamoch. Každá génová sekvencia podľa tohto vynálezu bola ďalej globálne priradená ku každému z najlepších troch FASTA aktívnych záznamov, použitím GAP programu v GCG súbore programov (použitím štandardných parametrov). Za účelom získania správnych výsledkov, sa dĺžka sekvencie, vyňatá zGenbanky, upravila na dĺžku vyhľadávaných sekvencií pomocou metód dobre známych v danej oblasti techniky. Výsledky tejto analýzy sú uvedené v tabuľke 4. Výsledné údaje vyžadovali signifikantne kratšie komputerové časy v porovnaní s takouto širokou databázovou GAP (globálnou) analýzou, avšak sú identické s tými, ktoré by sa boli získali samostatne vykonanou GAP (globálnou) analýzou na každom géne podľa tohto vynálezu v porovnaní so všetkými odkazmi v Genbanke. Sekvencie podľa tohto vynálezu, pre ktoré sa nezískali žiadne zoradenia mimo „cutoff“ hodnôt sú uvedené v tabuľke 4 tak, že tam chýbajú informácie o zoradení. Odborník skúsený v odbore si bude ďalej vedomý toho, že GAP percento homológie zoradenia, ktoré sa uvádza v tabuľke 4 pod hlavičkou „% homológie (GAP)“ je uvedené v európskom numerickom tvare, v ktorom - , predstavuje desatinnú čiarku. Napríklad hodnota „40,345“ v tejto kolónke predstavuje „40,345 %“.

Príklad 12

Konštrukcia a funkcia DNA mikromatríc

-130 Sekvencie podľa tohto vynálezu sa môžu okrem toho použiť na konštrukciu a aplikáciu DNA mikromatríc (zostavenie, metodológia a použitia DNA mikromatríc sú dobre známe v danej oblasti techniky a sú opísané napríklad v Schena, M, a kol., (1995) Science 270, 467-470; Wodicka, L. a kol. (1997) Náture Biotechnology 15, 1359-1367; DeSaizieu, A. a kol., (1998) Náture Biotechnology 16, 45-48; a DeRisi, J.L. a kol. (1997) Science 278, 680-686).

DNA mikromatrice sú pevné alebo flexibilné podklady skladajúce sa z nitrocelulózy, nylonu, skla, silikónu alebo iných materiálov, k povrchu ktorých sa molekuly nukleovej kyseliny môžu pripojiť v určitom usporiadaní. Po vhodnom označkovaní sa môžu ďalšie nukleové kyseliny alebo zmesi nukleových kyselín hybridizovať s imobilizovanými molekulami nukleovej kyseliny a značka sa môže použiť na monitorovanie a meranie individuálnych signálnych intenzít hybridizovaných molekúl v určených oblastiach. Táto metodológia umožňuje súčasne kvantifikovať relatívne alebo absolútne množstvo všetkých alebo zvolených nukleových kyselín v použitej vzorke nukleovej kyseliny alebo zmesi. DNA mikromatrice preto umožňujú analýzu expresie veľkého počtu (až 6800 alebo viac) nukleových kyselín paralelne (pozri napr. Schena, M. (1996) BioEssays 18(5), 427-431).

Sekvencie podľa tohto vynálezu sa môžu tiež použiť na konštrukciu oligonukleotidových primérov, ktoré sú schopné amplifikovať definované oblasti jedného alebo viacerých C glutamicum génov pomocou takej nukleovokyselinovej amplifikačnej reakcie akou je polymerázová reťazová reakcia. Výber a konštrukcia 5'- alebo 3'-oligonukleotidových primérov alebo vhodných spojovníkov umožňuje kovalentné pripojenie výsledných PCR produktov k povrchu podporného média, opísaného vyššie (a tiež opísaného napríklad v Schena, M. a kol. (1995) Science 270, 467-470).

Nukleovokyselinové mikromatrice sa môžu tiež konštruovať pomocou oligonukleotidovej syntézy in situ podľa Wodicka, L. a kol. (1997) Náture Biotechnology 15, 1359-1367. Pomocou fotolitografických metód sa presne určené oblasti matrice exponujú na svetle. Ochranné skupiny, ktoré sú fotolabilné, sa týmto spôsobom aktivujú a podliehajú nukleotidovej adícii, zatiaľ čo oblasti, ktoré sú maskované pred svetlom nepodliehajú žiadnej modifikácii. Nasledujúce cykly

-131 ochrany a aktivácie svetlom umožňujú syntézu rôznych oligonukleotidov v definovaných pozíciách. Malé, definované oblasti génov podľa tohto vynálezu sa môžu syntetizovať na mikromatriciach pomocou syntézy oligonuleotidov v pevnej fáze.

Molekuly nukleovej kyseliny podlá tohto vynálezu prítomné vo vzorke alebo zmes nukleotidov sa môžu hybridizovať s DNA mikromatricami. Tieto molekuly nukleovej kyseliny sa môžu značkovať podľa štandardných metód. Stručne, molekuly nukleovej kyseliny (napr. mRNA molekuly alebo DNA molekuly) sa značia pomocou inkorporácie izotopicky alebo fluorescečne značených nukleotidov, napr. počas reverznej transkripcie alebo syntézy DNA. Hybridizácia značených nukleových kyselín s DNA mikromatricami je opísaná (napr. v Schena, M. a kol., (1995); Wodicka, L. a kol., (1997), citované vyššie; aDeSaizieu A. a kol. (1998), citované vyššie). Detekcia a kvantifikácia hybridizovanej molekuly je prispôsobená špecificky inkorporovanému značeniu. Rádioaktívne značenia sa môžu detegovať (napríklad podľa Schena, M. a kol., (1995) citované vyššie;) a fluorescenčné značenia sa môžu detegovať napríklad podľa metódy Shalon a kol. (1996) Genome Research 6, 639-645).

Použitie sekvencií podľa tohto vynálezu na DNA mikromatricovú technológiu, ako sa opisuje vyššie, umožňuje porovnávacie analýzy rôznych kmeňov C. glutamicum alebo iných Corynebacteria. Napríklad, výskumy interkmeňových variácií založených na individuálnych transkripčných profiloch a identifikácia génov, ktoré sú dôležité pre špecifické a/alebo požadované vlastnosti kmeňa, také ako patogenita, produktivita a odolnosť voči stresu sú uľahčené použitím nukleovokyselinových matricových metodík. Nukleovokyselinové matricové technológie je možné použiť tiež na porovnania profilu expresie génov podľa tohto vynálezu v priebehu fermentačnej reakcie.

Príklad 13

Analýza dynamiky bunkových proteínových populácií (proteómov)

Gény, kompozície a spôsoby podľa tohto vynálezu sa môžu aplikovať na výskum interakcií a dynamiky populácií proteínov, nazývaných „proteómy“. Proteínové populácie, ktoré sú predmetom záujmu, obsahujú, ale nie sú

-132obmedzené na, celkovú proteínovú populáciu C. glutamicum (napr. v porovnaní s proteínovými populáciami iných organizmov) a tie proteíny, ktoré sú aktívne v špecifických podmienkach prostredia alebov špecifických metabolických podmienkach (napr. počas fermentácie, pri vysokej alebo nízkej teplote, alebo pri vysokom alebo nízkom pH) alebo tie proteíny, ktoré sú aktívne počas špecifických fáz rastu a vývoja.

Proteínové populácie sa môžu analyzovať pomocou rôznych dobre známych metód, ako napríklad gólovou elektroforézou. Bunkové proteíny sa môžu získať, napríklad, lýzou alebo extrakciou a môžu sa navzájom separovať použitím rôznych elektroforetických metód. Polyakrylamidová gólová elektroforéza s dodecylsulfátom sodným (SDS-PAGE) separuje proteíny prevažne na základe ich molekulovej hmotnosti. Izoelektricko-fokusačná polyakrylamidová gólová elektroforéza (IEFPAGE) separuje proteíny pomocou ich izoelektrického bodu (ktorý odráža nielen aminokyselinovú sekvenciu, ale tiež potranslačné modifikácie proteínu). Ďalšou, výhodnejšou metódou proteínovej analýzy je následná kombinácia oboch IEFPAGE a SDS-PAGE metód, známych ako 2-D-gélová elektroforéza (opísaná napríklad vHermann a kol. (1998) Electrophoresis, 19, 3217-3221; Fountoulakis, a kol. (1998) Electrophoresis, 19,1193-1202; Langen, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1184-1192; Antelmann, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1451-1463). Na proteínovú separáciu sa môžu tiež použiť ďalšie separačné metódy ako napríklad kapilárna gólová elektroforéza; tieto metódy sú dobre známe v danej oblasti techniky.

Proteíny, ktoré sa separovali pomocou týchto metodík, sa môžu vizualizovať štandardnými metódami, takými ako vyfarbovanie alebo značkovanie. Vhodné vyfarbovacie činidlá sú známe v danej oblasti techniky a zahŕňajú Coomassie Brilliant Blue, striebro alebo fluorescenčné farbivá, také ako Sypro Ruby (Molekulové sondy). Zahrnutie rádioaktívne značených aminokyselín alebo ďalších proteínových prekurzorov (napr. ³⁵S-metionínu, ³⁵S-cysteínu, ¹⁴C-značených aminokyselín, ¹⁵N-aminokyselín, ¹⁵NO3 alebo ¹⁵NH4⁺ alebo ¹³C-značených aminokyselín) do média C.glutamicum umožňuje označiť proteín z týchto buniek pred ich separáciou. Podobne sa môžu použiť fluorescenčné značky. Tieto

-133značené proteíny sa môžu extrahovať, izolovať a separovať podľa doteraz opísaných metodík.

Proteíny vizualizované týmito metodikami sa môžu v ďalšom analyzovať meraním množstva použitého farbiva alebo značky. Množstvo určitého proteínu sa môže v ďalšom stanoviť kvantitatívne použitím, napríklad, optických metód a môže sa porovnať s množstvom iných proteinov v tom istom géli alebo v iných géloch. Porovnania proteinov na géloch sa môžu urobiť napríklad optickým porovnaním, spektroskopicky, zobrazovacím snímaním a analýzou gélov, alebo použitím fotografických filmov a zobrazení. Takéto metódy sú dobre známe v danej oblasti techniky.

Aby sa stanovila identita ktoréhokoľvek daného proteínu, môže sa použiť priame sekvenovenie alebo iné štandardné metódy. Napríklad sa môže použiť Na/alebo C-koncové aminokyselinové sekvenovanie (ako Edmanova degradácia) , ako aj hmotnostná spektrometria (výhodne MALDI alebo ESI metódy (pozri napr. Langen, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1184-1192)). Tu poskytnuté proteínové sekvencie sa môže použiť na identifikáciu C. glutamicum proteinov pomocou týchto metodík.

Informácie získané týmito metódami sa môžu použiť na porovnanie podôb proteínovej prítomnosti, aktivity alebo modifikácie medzi rôznymi vzorkami z rozličných biologických podmienok (okrem iného napr. rôzne organizmy, časové podmienky fermentácie, stav média alebo rôzne biotopy). Údaje získané z takýchto pokusov samotných, alebo v kombinácii s ďalšími technológiami, sa môžu použiť na také rôzne aplikácie, ako na porovnanie správania sa rôznych organizmov v určitej (napr. metabolickej) situácii, na zvýšenie produktivity kmeňov, ktoré produkujú špeciálne chemikálie alebo na zvýšenie účinnosti produkcie špeciálnych chemikálií.

Ekvivalenty

Odborníci skúsení v danej oblasti techniky zistia alebo budú schopní len pomocou bežnej rutinnej praxe zistiť mnohé ekvivalenty ku špecifickým uskutočneniam podľa vynálezu, opísaným v tomto dokumente. Také ekvivalenty uskutočnení spadajú do rozsahu nasledujúcich patentových nárokov.

Claims (38)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny z Corynebacterium glutamicum kódujúca HA proteín, alebo jeho časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiadne F-označené gény uvedené v tabuľke 1.
2. 2. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa nároku 1, kde uvedená molekula nukleovej kyseliny kóduje HA proteín zapojený do produkcie špeciálnej chemikálie.
3. 3. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny Corynebacterium glutamicum zvolená zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, alebo jej časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden F-označený gén uvedený v tabuľke 1.
4. 4. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá kóduje polypeptidovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID N v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
5. 5. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá kóduje prirodzene sa vyskytujúci alelický variant polypeptidu zvolený zo skupiny aminokyselinových sekvencií zahrňujúcich sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
6. 6. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50 % homológna s nukleotidovou sekvenciou zvolenou zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, alebo jej časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
7. 7. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahujúca najmenej 15 nukleotidový fragment nukleovej kyseliny obsahujúci nukleotidovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO

   -135- v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
8. 8. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá sa hybridizuje s molekulou nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 v stringentných podmienkach.
9. 9. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, vyznačujúca sa tým, že obsahuje molekulu nukleovej kyseliny podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 alebo jej časť a nukleotidovú sekvenciu kódujúcu heterológny polypeptid.
10. 10. Vektor, obsahujúci molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9.
11. 11. Vektor podľa nároku 10, ktorý je expresným vektorom.
12. 12. Hostiteľská bunka transfekované s expresným vektorom podľa nároku 11.
13. 13. Hostiteľská bunka podľa nároku 12, kde uvedenou bunkou je mikroorganizmus.
14. 14. Hostiteľská bunka podľa nároku 13, kde uvedená bunka patrí do rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium.
15. 15. Hostiteľská bunka podľa nároku 12, kde expresiou uvedenej molekuly nukleovej kyseliny sa moduluje produkcia špeciálnej chemikálie z uvedenej bunky,
16. 16. Hostiteľská bunka podľa nároku 15, kde uvedená špeciálna chemikália je zvolená zo skupiny pozostávajúcej z organických kyselín, aminokyselín proteínového a neproteínového pôvodu, purínových a pyrimidínových báz, nukleozidov, nukleotidov, lipidov, nasýtených a nenasýtených mastných kyselín, diolov, sacharidov, aromatických zlúčenín, vitamínov, kofaktorov, polyketidov a enzýmov.
17. 17. Spôsob produkcie polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu hostiteľskej bunky podľa nároku 12, vo vhodnom kultivačnom médiu, pričom sa produkuje polypeptid.

    -136-
18. 18. Izolovaný HA polypeptid z Corynebacterium glutamicum, alebo jeho časť.
19. 19. Polypeptid podľa nároku 18, kde uvedený polypeptid je zapojený do produkcie špeciálnej chemikálie.
20. 20. Izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
21. 21. Izolovaný polypetid obsahujúci prirodzene sa vyskytujúci alelický variant polypeptidu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, alebo jeho časť, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
22. 22. Izolovaný polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 21, ktorý ďalej obsahuje heterológne aminokyselinové sekvencie.
23. 23. Izolovaný polypeptid, ktorý je kódovaný molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50 % homológna s nukleovou kyselinou zvolenou zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiadne F-označené molekuly nukleovej kyseliny uvedené v tabuľke 1.
24. 24. Izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50 % homológna s aminokyselinovou sekvenciou zvolenou zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
25. 25. Spôsob produkcie špeciálnej chemikálie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu bunky obsahujúcej vektor podľa nároku 12, pričom sa produkuje špeciálna chemikália.

    -137-
26. 26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob ďalej zahrňuje krok získania špeciálnej chemikálie z uvedenej kultúry.
27. 27. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob ďalej zahrňuje krok transfekcie uvedenej bunky s vektorom podľa nároku 11, pričom sa získa bunka obsahujúca uvedený vektor.
28. 28. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená bunka patrí do rodov Corynebacterium alebo Brevibacterium.
29. 29. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená bunka je zvolená zo skupiny pozostávajúcej z Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitrilophilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium healii, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium paraffinolyticum, a tých kmeňov, ktoré sú uvedené v tabuľke 3.
30. 30. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že expresiou molekuly nukleovej kyseliny z uvedeného vektora sa moduluje produkcia uvedenej špeciálnej chemikálie.
31. 31. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená špeciálna chemikália je zvolená zo skupiny pozostávajúcej z organických kyselín, aminokyselín proteínového a neproteínového pôvodu, purínových a pyrimidínových báz, nukleozidov, nukleotidov, lipidov, nasýtených a nenasýtených mastných kyselín, diolov, sacharidov, aromatických zlúčenín, vitamínov, kofaktorov, polyketidov a enzýmov.
32. 32. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedenou špeciálnou chemikáliou je aminokyselina.
33. 33. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedená aminokyselina je zvolená zo skupiny zahrňujúcej lyzín, glutamát, glutamín, alanín, aspartát,

    -138- glycín, serín, treonín, metionín, cysteín, valín, leucín, izoleucín, arginín, prolín, histidín, tyrozín, fenylalanín a tryptofán.
34. 34. Spôsob produkcie špeciálnej chemikálie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu bunky, ktorej genómová DNA sa zmenila inklúziou molekuly nukleovej kyseliny, podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9.
35. 35. Spôsob diagnostikovania prítomnosti alebo aktivity Corynebacterium diphtheríae v subjekte, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje detekciu prítomnosti jednej alebo viacerých sekvencií z 1 až 440 sekvencií SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname v subjekte, pričom sekvencie nie sú alebo nie sú kódované žiadnou z F-označených sekvencií uvedených v tabuľke 1, čím sa diagnostikuje prítomnosť alebo aktivita Corynebacterium diphtheríae v subjekte.
36. 36. Hostiteľská bunka obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú zo skupiny molekúl nukleových kyselín, ktoré sú uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, kde molekula nukleovej kyseliny je porušená.
37. 37. Hostiteľská bunka obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú zo skupiny molekúl nukleových kyselín, ktoré sú uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, kde molekula nukleovej kyseliny obsahuje jednu alebo viac nukleovokyselinových modifikácií sekvencií, ktoré sú uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname.
38. 38. Hostiteľská bunka obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú zo skupiny zahrňujúcej molekuly nukleových kyselín uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, kde regulačná oblasť molekuly nukleovej kyseliny je modifikovaná v porovnaní s regulačnou oblasťou „divého“-typu molekuly.