SK18872001A3 - Gény Corynebacterium glutamicum kódujúce proteíny zapojené do metabolizmu uhlíka a produkcie energie - Google Patents

Description

Príbuzné prihlášky

Táto prihláška si nárokuje prioritu z predošlej americkej predbežnej patentovej prihlášky č. 60/141031, podanej 25 júna 1999, americkej predbežnej patentovej prihlášky 60/143208, podanej 9. júla 1999 a americkej predbežnej patentovej prihlášky č. 60/151572, podanej 31. augusta 1999. Táto prihláška si tiež nárokuje prioritu z nemeckej patentovej prihlášky č. 19931412.8, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky, č. 19931413.6, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931419.5, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931420.9, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931424.1, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931428.4, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931431.4, podanej .8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931433.0, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931434.9, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931510.8, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931562.0, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19931634.1, podanej 8. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932180.9, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932227.9, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932230.9, podanej 9. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932924.9, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19932973.7, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19933005.0, podanej 14. júla 1999, nemeckej patentovej prihlášky č. 19940765.7, podanej 27. augusta 1999, nemeckej patentovej prihlášky č 19942076.9, podanej 3. septembra 1999, nemeckej patentovej prihlášky

č. 19942079.3, podanej 3. septembra 1999, nemeckej patentovej prihlášky

č. 19942086.6, podanej 3. septembra 1999, nemeckej patentovej prihlášky

č. 19942087.4, podanej 3. septembra 1999, nemeckej patentovej prihlášky

č. 19942088.2, podanej 3. septembra 1999, nemeckej patentovej prihlášky

č. 19942095.5, podanej 3. septembra 1999, nemeckej patentovej prihlášky

č. 19942123.4, podanej 3. septembra 1999, a nemeckej patentovej prihlášky

č. 19942125.0, podanej 3. septembra 1999. Celý obsah všetkých vyššie uvedených prihlášok je tu týmto výslovne začlenený formou odkazu.

Doterajší stav techniky

Určité produkty a vedľajšie produkty prirodzených metabolických pochodov v bunkách majú široké priemyselné uplatnenie, vrátane potravinárskeho, krmovinárskeho, kozmetického a farmaceutického priemyslu. Do tejto skupiny molekúl súhrnne nazývaných ako špeciálne chemikálie („fine chemicals“) patria organické kyseliny, aminokyseliny proteínového, respektíve neproteínového pôvodu, nukleotidy a nukleozidy, lipidy a mastné kyseliny, dioly, sacharidy, aromatické zlúčeniny, vitamíny a kofaktory, a enzýmy. Ich produkcia sa najvhodnejšie uskutočňuje prostredníctvom veľkého počtu kultúr baktérií vyvinutých na výrobu asekréciu veľkého množstva jednej alebo viacerých požadovaných molekúl. Jedným predovšetkým vhodným organizmom na tieto účely je grampozitívna, nepatogénna baktéria Corynebacterium glutamicum. Pomocou kmeňovej selekcie sa vyvinulo mnoho mutantných kmeňov, ktoré produkujú veľké množstvo požadovaných zlúčenín. Avšak selekcia kmeňov so zvýšenou produkciou príslušnej molekuly je časovo náročný a ťažký proces.

Podstata vynálezu

Predmetom predloženého vynálezu sú nové molekuly bakteriálnych nukleových kyselín, ktoré majú rôznorodé použitia. Tieto zahŕňajú identifikáciu mikroorganizmov, ktoré sa dajú využiť na produkciu špeciálnych chemikálií, na moduláciu produkcie špeciálnych chemikálií v C. glutamicum alebo v príbuzných baktériách, ria klasifikáciu alebo identifikáciu C. glutamicum alebo príbuzných baktérií, ako referenčné body pri mapovaní genómu C. glutamicum a ako markéry transformácie. Tieto nové molekuly nukleových kyselín kódujú proteíny, označované v tomto dokumente ako proteíny metabolizmu sacharidov a oxidačnej fosforylácie (SMP, sugar metabolism and oxidative phosphorylation proteins).

C. glutamicum je grampozitívna aeróbna baktéria, ktorá sa bežne používa na priemyselnú výrobu rôznych špeciálnych chemikálií vo veľkom rozsahu a tiež na degradáciu uhľovodíkov (ako napríklad v prípadoch ropných únikov) a na oxidáciu terpenoidov. Molekuly SMP nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sa preto dajú využiť na identifikáciu mikroorganizmov, ktoré sa môžu použiť na produkciu špeciálnych chemikálií, napríklad pomocou fermentačných procesov. Modulácia expresie SMP nukleových kyselín podľa tohto vynálezu alebo modifikácia sekvencie

SMP molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sa môžu použiť na moduláciu produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z mikroorganizmov (napríklad na zlepšenie výťažku alebo produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z druhov Corynebacterium alebo Brevibacterium).

SMP nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu sa dajú tiež použiť na

I identifikáciu takého organizmu akým je Corynebacterium glutamicum alebo veľmi príbuzného druhu, alebo na identifikáciu prítomnosti C. glutamicum alebo príbuzného druhu v zmiešanej populácii mikroorganizmov. Vynález poskytuje sekvencie nukleových kyselín mnohých génov C. glutamicum. Skúmaním extrahovanej genómovej DNA jednej kultúry alebo zmiešanej populácie mikroorganizmov v stringentných podmienkach so zameraním sa na takú oblasť C. glutamicum génu, ktorá je charakteristická pre tento organizmus, sa dá zistiť, či je tento organizmus prítomný. Hoci Corynebacterium glutamicum samotná je nepatogénna, dáva sa do súvisu s takými humánnymi patogénnymi druhmi ako Corynebacterium diphtheriae (spôsobujúcimi záškrt); detekcia takýchto organizmov má signifikantný klinický význam.

Molekuly SMP nukleových kyselín podľa predloženého vynálezu sú aj referenčnými bodmi pri mapovaní C. glutamicum genómu alebo genómov príbuzných organizmov. Podobne sú tieto molekuly alebo ich variantné formy alebo ich časti markérmi pri génových manipuláciách s druhmi Corynebacterium alebo Brevibacterium.

SMP proteíny kódované novými molekulami nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sú napríklad funkčne zapojené do metabolizmu uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov, alebo do vytvárania energetických molekúl pomocou procesov ako je oxidačná’fosforylácia v Corynebacterium glutamicum. Tým, že sa v Corynebacterium glutamicum môžu použiť klonovacie vektory, tak ako to opisujú Šinskey a kol., v americkom patentovom spise US 4,649,119, a metódy génovej manipulácie C. glutamicum a príbuzných druhov Brevibacterium (napr. lactofermentum) (Yoshihama a kol., J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985); Katsumata a kol., J. Bacteriol. 159: 306- 311 (1984); a Santamaria a kol., J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246 (1984)), môžu sa molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu využiť pri génových manipuláciách tohto organizmu s cieľom zlepšiť alebo zefektívniť produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií. Zvýšená produkcia alebo účinnosť produkcie špeciálnej chemikálie sa dá dosiahnuť priamou manipuláciou s génom podľa tohto vynálezu alebo sa to dá dosiahnuť nepriamym účinkom takejto manipulácie.

Existuje mnoho mechanizmov, pomocou ktorých sa zmenou SMP proteínu podľa tohto vynálezu, môže priamo ovplyvniť výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie špeciálnej chemikálie z kmeňa C. glutamicum, a to inkorporáciou takéhoto zmeneného proteínu. Degradácia vysokoenergetických uhlíkatých molekúl, akými sú napríklad sacharidy, a konverzia zlúčenín, akými sú napríklad NADH alebo FADH₂. na zlúčeniny, ktoré obsahujú vysokoenergetické fosfátové väzby, prostredníctvom oxidačnej fosforylácie poskytuje mnoho zlúčenín, ktoré samotné môžu byť požadovanými špeciálnymi chemikáliami, ako napríklad pyruvát, ATP, NADH a mnohé medziproduktové sacharidové zlúčeniny. Ďalej, energetické molekuly (napríklad ako ATP) a redukčné ekvivalenty (napríklad ako NADH alebo NADPH), ktoré vznikajú v týchto metabolických dráhach, sa v bunke využívajú na pohon reakcií, ktoré by ináč boli energeticky nevýhodné. Do takýchto nevýhodných reakcií patria mnohé biosyntetické dráhy pre špeciálne chemikálie. Zvyšovaním schopnosti bunky využívať určitý sacharid (napr. pomocou manipulácie s génmi, ktoré kódujú enzýmy zapojené do degradácie a konverzie takéhoto sacharidu na energiu pre bunku) sa dá zvýšiť množstvo energie dostupnej na to, aby sa umožnil priebeh nevýhodných, ale požadovaných metabolických reakcií (napr. biosyntéza požadovanej špeciálnej chemikálie).

Mutagenézou jedného alebo viacerých SMP génov podľa tohto vynálezu môžu tiež vznikať SMP proteíny so zmenenými aktivitami, ktoré nepriamo vplývajú na produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z C. glutamicum. Napríklad zvyšovaním účinnosti využitia jedného alebo viacerých sacharidov (tak, aby sa konverzia sacharidu na vhodné energetické molekuly zvýšila) alebo zvyšovaním účinnosti konverzie redukčných ekvivalentov na vhodné energetické molekuly (napr. zvyšovaním účinnosti oxidačnej fosforylácie alebo aktivity ATPsyntázy) sa môže zvýšiť množstvo týchto vysokoenergetických zlúčenín použiteľných bunkou na pohon bežne nevýhodných metabolických procesov. Do týchto procesov patrí konštrukcia bunkových stien, transkripcia, translácia a biosyntéza zlúčenín potrebných na rast a delenie buniek (napr. nukleotidov, aminokyselín, vitamínov, lipidov atď.) (Lengeler a kol., (1999) Biology of

Prokaryotes, Thieme Verlag: Stuttgart, str. 88-109; 913-918; 875-899). Zvyšovaním rastu a rozmnožovaním týchto geneticky manipulovaných buniek sa dá zvýšiť tak životaschopnosť buniek pri fermentácii vo veľkom rozsahu, ako aj rýchlosť ich delenia tak, že relatívne väčšie množstvo buniek môže prežiť vo fermentačnej kultúre. Výťažok, produkcia alebo účinnosť produkcie sa môže zvýšiť prinajmenšom prítomnosťou väčšieho počtu životaschopných buniek, ktoré všetky produkujú požadovanú špeciálnu chemikáliu. Mnohé degradačné produkty vznikajúce v priebehu sacharidového metabolizmu zužitkúva tiež bunka ako prekurzory alebo medziprodukty pri produkcii iných požadovaných produktov ako napríklad špeciálnych chemikálií. Atak by sa zvyšovaním schopnosti bunky metabolizovať sacharidy malo tiež zvýšiť množstvo týchto degradačných produktov dostupných pre bunku na ďalšie procesy.

Vynález poskytuje nové molekuly nukleových kyselín kódujúce proteíny, ktoré sa v tomto dokumente označujú ako SMP proteíny; ktoré sú napríklad schopné fungovať v metabolizme uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov, a vytvárať energetické molekuly prostredníctvom takých procesov ako je oxidačná fosforylácia v Corynebacterium glutamicum. Molekuly nukleových kyselín kódujúce SMP proteín sa v tomto dokumente označujú ako SMP molekuly nukleových kyselín. Vo výhodnom uskutočnení sa SMP proteín podieľa na konverzii uhlíkatých molekúl a ich degradačných produktov na energiu, ktorú bunka zužitkúva na metabolické procesy. Príkladmi takýchto proteínov sú tie, ktoré sú kódované génmi uvedenými v tabuľke 1.

Vynález sa ďalej týka molekúl izolovaných nukleových kyselín (napr. cDNA, DNA alebo RNA) s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou SMP proteín alebo jeho biologicky aktívne časti, ako aj fragmentov nukleových kyselín, ktoré sú vhodnými primérmi alebo hybridizačnými sondami na detekciu alebo amplifikáciu SMP kódujúcich nukleových kyselín (napr. DNA alebo mRNA). V predovšetkým výhodných uskutočneniach obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny jednu z nukleotidových sekvencii, ktorá je uvedená s nepárne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname (Sequence Listing) (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 ....) alebo kódujúcu oblasť alebo komplementárny úsek jednej z týchto nukleotidových sekvencii. V ďalších predovšetkým výhodných uskutočneniach obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu nukleotidovú sekvenciu, ktorá sa hybridizuje na alebo je najmenej asi na 50 %, výhodne najmenej asi na 60 %, výhodnejšie najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % alebo dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológna s nukleotidovou sekvenciou uvedenou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 ....) alebo jej časťou. V iných výhodných uskutočneniach kóduje molekula izolovanej nukleovej kyseliny jednu z aminokyselinových sekvencií uvedených s párne očíslovanými SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname napr. (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 ....). Výhodné SMP proteíny podľa tohto vynálezu majú výhodne aspoň jednu z SMP aktivít opísaných v tomto dokumente.

V ďalšom uskutočnení kóduje molekula izolovanej nukleovej kyseliny proteín alebo jeho časť, pričom proteín alebo jeho časť obsahuje takú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. takou, ktorá má párne očíslovanú sekvenciu SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), ktorá je napr. dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu tak, že proteín alebo jeho časť si udržuje SMP aktivitu. Proteín alebo jeho časť kódovaný molekulou nukleovej kyseliny si výhodne zachováva schopnosť fungovať v metabolizme uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov, alebo vytvárať energetické molekuly (napr. ATP) prostredníctvom procesov, ako je oxidačná fosforylácia v Corynebacterium glutamicum. V jednom uskutočnení je proteín kódovaný molekulou nukleovej kyseliny najmenej asi na 50 %, výhodne asi na 60 %, predovšetkým výhodne asi na 70 %, 80 % alebo 90 % a najvýhodnejšie asi najmenej na 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s celou sekvenciou aminokyselín vybratou zo sekvencií s párne očíslovanými SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V inom výhodnom uskutočnení má proteín úplnú dĺžku proteínu C. glutamicum, ktorá je v podstate homológna s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (kódovanou systémom otvoreného čítania súboru uvedeného v príslušnom Sekvenčnom zázname s nepárne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO (napr. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7...).

Ί

V ďalšom výhodnom uskutočnení je molekula izolovanej nukleovej kyseliny odvodená z C. glutamicum a kóduje proteín (napr. SMP fúzny proteín), ktorý obsahuje biologicky aktívnu doménu, ktorá je najmenej asi na 50 % alebo viac homológna s jednou z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. s jednou z aminokyselinových párne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) a má schopnosť fungovať v metabolizme uhlíkatých zlúčenín ako napríklad sacharidov alebo vytvárať energetické molekuly (napr. ATP) prostredníctvom takých procesov ako je oxidačná fosforylácia v Corynebacterium glutamicum alebo má jednu alebo viac aktivít, ktoré sú uvedené v tabuľke 1, a ktoré tiež obsahujú heterológne sekvencie nukleových kyselín kódujúcich heterológne polypeptidové alebo regulačné oblasti.

V ďalšom uskutočnení má izolovaná molekula nukleovej kyseliny dĺžku aspoň 15 nukleotidov a hybridizuje sa v stringentných podmienkach s molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu podľa tohto vynálezu (napr. so sekvenciou s nepárne očíslovanou SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) A. Výhodne sa izolovaná molekula nukleovej kyseliny zhoduje s prirodzene sa vyskytujúcou molekulou nukleovej kyseliny. Ešte výhodnejšie kóduje izolovaná nukleová kyselina prirodzene sa vyskytujúci SMP proteín C. glutamicum alebo jeho biologicky aktívnu časť.

Vynález sa ďalej týka vektorov, napr. rekombinantných expresných vektorov obsahujúcich molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu a hostiteľských buniek, do ktorých sa tieto vektory zaviedli. V jednom uskutočnení sa takáto hostiteľská bunka použila na produkciu SMP proteínu, a to kultiváciou hostiteľskej bunky vo vhodnom médiu. SMP proteín sa potom môže izolovať z média alebo z hostiteľskej bunky.

Vynález sa ďalej ešte týka geneticky zmeneného mikroorganizmu, do ktorého sa zaviedol SMP gén alebo ktorý sa modifikoval. V jednom uskutočnení sa zmenil genóm mikroorganizmu zavedením molekuly nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, kódujúcej „divý“ (wild) typ sekvencie alebo zmutovanej SMP sekvencie ako transgénu. V ďalšom uskutočnení bol endogénny SMP gén v rámci genómu mikroorganizmu zmenený, napr. funkčne narušený homológnou rekombináciou so zmeneným SMP génom. V ďalšom uskutočnení sa endogénny alebo zavedený SMP gén v mikroorganizme menil mutáciami, deléciami alebo inverziami v jednom alebo viacerých bodoch, ale stále kódoval funkčný SMP proteín. V ešte ďalšom uskutočnení sa jedna alebo viac regulačných oblastí (napr. promótor, represor alebo induktor) SMP génu v mikroorganizme menila (napr. deléciou, trunkáciou, inverziou alebo bodovou mutáciou) tak, že expresia SMP génu sa modulovala. Vo výhodnom uskutočnení patril mikroorganizmus do rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium, pričom Corynebacterium glutamicum bol predovšetkým výhodný. Vo výhodnom uskutočnení sa mikroorganizmus tiež použil na produkciu požadovanej zlúčeniny, napríklad aminokyseliny, predovšetkým výhodne lyzínu.

Vynález sa ďalej týka spôsobu na identifikáciu prítomnosti alebo aktivity Corynebacterium diphtheriae v subjekte. Tento spôsob sa týka detekcie jednej alebo viacerých sekvencii nukleových kyselín alebo aminokyselín podľa tohto vynálezu (napr. sekvencii uvedených v Sekvenčnom zázname ako SEQ ID NO: 1 až 782) v subjekte, čím sa deťeguje prítomnosť alebo aktivita Corynebacterium diphtheriae v subjekte.

Vynález sa ešte ďalej týka izolovaného SMP proteínu alebo jeho časti, napr. jeho biologicky aktívnej časti. Vo výhodnom uskutočnení je izolovaný SMP proteín alebo jeho časť schopný fungovať v metabolizme uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov, a vytvárať energetické molekuly (napr. ATP) prostredníctvom takých procesov ako je oxidačná fosforylácia v Corynebacterium glutamicum. V inom výhodnom uskutočnení je izolovaný SMP proteín alebo jeho časť dostatočne homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s párne očíslovanou sekvenciou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) tak, že proteín alebo jeho časť si udržiava schopnosť fungovať v metabolizme uhlíkatých, zlúčenín, ako napríklad sacharidov, a vytvárať energetické molekuly (napr. ATP) prostredníctvom takých procesov ako je oxidačná fosforylácia v Coiynebacterium glutamicum.

Vynález tiež poskytuje izolovaný preparát SMP proteínu. Vo výhodných uskutočneniach má SMP proteín aminokyselinovú sekvenciu podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciu s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V inom výhodnom uskutočnení sa vynález týka celej dĺžky izolovaného proteínu, ktorý je v podstate homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), (ktorá je kódovaná otvoreným systémom čítania prislúchajúcou SEQ ID

NO: uvedenou s nepárnym očíslovaním v Sekvenčnom zázname). Veste inom uskutočnení je proteín najmenej asi na 50 %, výhodne najmenej asi na 60 % a výhodnejšie najmenej asi na 70 %, 80 % alebo 90 % a najvýhodnejšie najmenej asi na 95%, 96%, 98% alebo 99% alebo viac homológny súplnou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. so sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V iných uskutočneniach má izolovaný SMP proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je homológna najmenej na 50 % alebo viac s jednou z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. so sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) a je schopný fungovať v metabolizme uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov, alebo vytvárať energetické molekuly (napr. ATP) prostredníctvom takých procesov, ako napríklad oxidačnej fosforylácie v Corynebacterium glutamicum alebo má jednu alebo viac aktivít, ktoré sú uvedené v tabuľke 1.

Alternatívne môže izolovaný SMP proteín obsahovať aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach alebo je najmenej asi na 50%, výhodne najmenej asi na 60% a výhodnejšie najmenej asi na 70%, 80% alebo 90 % a dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homológna s jednou nukleotidovou sekvenciou s párne očíslovaných sekvencií SEQ ID NO uvedených v Sekvenčnom zázname. Je tiež výhodné, že výhodné formy SMP proteínov majú tiež jednu alebo viac SMP bioaktivít, ktoré sa uvádzajú v tomto dokumente.

SMP polypeptid alebo jeho biologicky aktívna časť sa môže účinne spojiť s polypeptidom, ktorý nemá SMP aktivitu za vzniku fúzneho proteínu. Vo výhodných uskutočneniach má tento fúzny proteín odlišné aktivity v porovnaní so samotným SMP proteínom. V ďalších výhodných uskutočneniach je tento fúzny proteín schopný fungovať v metabolizme uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov, alebo vytvárať energetické molekuly (napr. ATP) prostredníctvom takých procesov ako je oxidačná fosforylácia v Corynebacterium glutamicum. V predovšetkým výhodných uskutočneniach sa integrovaním tohto fúzneho proteínu do hostiteľskej bunky moduluje produkcia požadovanej zlúčeniny bunkou.

Vynález sa ďalej týka spôsobu skríningu molekúl, ktoré modulujú aktivitu

SMP proteínu buď pomocou interakcie so samotným proteínom, alebo substrátom alebo väzobným partnerom SMP proteínu, alebo pomocou modulácie transkripcie alebo translácie molekuly SMP nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu.

Vynález sa ďalej týka spôsobu produkcie špeciálnej chemikálie. Tento spôsob spočíva v kultivácii bunky obsahujúcej vektor, ktorý riadi expresiu molekuly SMP nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu tak, aby sa produkovala špeciálna chemikália. Vo výhodnom uskutočnení tento spôsob v ďalšom zahŕňa krok získavania bunky obsahujúcej takýto vektor, pričom pri tomto spôsobe sa bunka transfekuje s vektorom riadiacim expresiu SMP nukleovej kyseliny. V inom výhodnom uskutočnení zahŕňa okrem toho tento spôsob krok získavania špeciálnej chemikálie z kultúry. V predovšetkým výhodnom uskutočnení sa použila bunka rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium, alebo sa vybrala z kmeňov, ktoré sú uvedené v tabuľke 3.

Vynález sa ďalej týka spôsobov modulovania produkcie molekuly z mikroorganizmu. Takéto spôsoby zahŕňajú spôsoby kontaktovania bunky s agensom, ktorý moduluje aktivitu SMP proteínu alebo expresiu SMP nukleovej kyseliny tak, že bunková aktivita sa mení v porovnaní s rovnakou aktivitou v neprítomnosti agensa. Vo výhodnom uskutočnení sa bunka moduluje na jednu alebo viacero uhlíkatých metabolických dráh v C. glutamicum alebo na produkciu energie prostredníctvom takých procesov ako napríklad oxidačnej fosforylácie, takže výťažky alebo rýchlosť produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie týmto mikroorganizmom sa zvýšia. Agensom, ktorý moduluje aktivitu SMP proteínu, môže byť agens, ktorý stimuluje aktivitu SMP proteínu alebo expresiu SMP nukleovej kyseliny. Príkladmi agensov, ktoré stimulujú aktivitu SMP proteínu alebo expresiu SMP nukleovej kyseliny, sú malé molekuly, aktívne SMP proteíny a nukleové kyseliny kódujúce SMP proteíny, ktoré boli zavedené do bunky. Príkladmi agensov, ktoré inhibujú SMP aktivitu alebo expresiu sú malé molekuly a nezmyselné (antisense) molekuly SMP nukleových kyselín.

Vynález sa ďalej týka spôsobov modulovania výťažkov požadovanej zlúčeniny z bunky, medzi ktoré patrí zavádzanie „divého“ alebo mutovaného typu

SMP génu do bunky, buď udržiavaného na separátnom plazmide alebo integrovaného do genómu hostiteľskej bunky. Pri integrácii do genómu môže nastať náhodná integrácia alebo homológna rekombinácia, takže natívny gén sa nahradí zavedenou kópiou a spôsobí produkciu požadovanej zlúčeniny bunkou, ktorá sa má modulovať. Vo výhodnom uskutočnení sa uvedené výťažky zvyšujú. V inom výhodnom uskutočnení je vyššie uvedenou chemikáliou špeciálna chemikália. V predovšetkým výhodnom uskutočnení je vyššie uvedenou špeciálnou chemikáliou aminokyselina. V obzvlášť výhodných uskutočneniach je uvedenou aminokyselinou L-lyzín.

Podrobný opis vynálezu

Predložený vynález poskytuje SMP nukleovokyselinové a proteínové molekuly, ktoré sú zapojené do metabolizmu uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov, a vytvárania energetických molekúl prostredníctvom takých procesov ako je oxidačná fosforylácia v Corynebacterium glutamicum. Molekuly podľa tohto vynálezu sa môžu využiť na moduláciu produkcie špeciálnych chemikálií z mikroorganizmov, ako napríklad C. glutamicum, a to buď priamo (napr. tam, kde nadmerná expresia alebo optimalizácia proteínu glykolytickej dráhy má priamy vplyv na výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie napríklad pyruvátu z modifikovanej C. glutamicum) alebo môžu mať nepriamy vplyv, ktorý však predsa spôsobuje zvýšený výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie požadovanej zlúčeniny (napr. tam, kde modulácia proteínov zapojených do oxidačnej fosforylácie spôsobuje zmeny v množstve energie použiteľnej na potrebné metabolické procesy a iné celulárne funkcie, ako napríklad biosyntézu nukleových kyselín a proteínov a transkripciu/transláciu). Aspekty vynálezu sú vysvetlené v ďalšom texte.

I. Špeciálne chemikálie

Pojem „špeciálne chemikálie“ je zaužívaný technický pojem a zahŕňa molekuly produkované organizmom, ktoré majú rôznorodé priemyselné použitia, v takých priemyselných odvetviach, ale nielen v nich, akými sú farmaceutický, poľnohospodársky a kozmetický priemysel. Tieto zlúčeniny zahŕňajú také organické kyseliny, ako kyselinu vínnu, kyselinu itakonovú a kyselinu diaminopimelovú, aminokyseliny proteínového aj neproteínového pôvodu, purínové a pyrimidínové bázy, nukleozidy anukleotidy (ako sa to opisuje napr. v Kuninaka, A. (1966), Nucleotides and related compounds, str. 561-612, v Biotechnology vol. 6, Rehm a kol., eds. VCH, Weinheim a v odkazoch tam uvedených), lipidy, nasýtené aj nenasýtené mastné kyseliny (napr. kyselinu arachidonovú), dioly (napr. propándiol a butándiol), sacharidy (napr. kyselinu hyalurónovú a trehalózu), aromatické zlúčeniny (napr. aromatické amíny, vanilín a indigo), vitamíny a kofaktory (podľa opisu v Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, „Vitamins“, str.. 443-613 (1996) VCH, Weinheim a v odkazoch tam uvedených avOng, A.S., Niki, E.& Packer, L. (1995) „Nutrition, Lipids, Health and Disease“ Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and Society for Free Radical Research - Asia, konanej 1.-3. septembra 1994 v Penang, Malajzia, AOCS Press, (1995)), enzýmy, polyketidy (Čane a kol., (1998) Science 282, 63-68) a všetky ďalšie chemikálie opísané v Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 a v tam uvedených odkazoch. Metabolizmus a použitie určitých špeciálnych chemikálií sa vysvetľuje v ďalšom texte.

A. Metabolizmus aminokyselín a použitia

Základnými štruktúrnymi jednotkami všetkých proteínov sú aminokyseliny a ako také sú esenciálne pre normálnu bunkovú činnosť vo všetkých organizmoch. Pojem „aminokyselina“ je zaužívaný technický pojem. Aminokyseliny proteínového pôvodu, ktorých je 20 druhov, sú štrukturálnymi jednotkami proteínov, v ktorých sú viazané peptidovými väzbami, kým aminokyseliny neproteínového pôvodu (ktorých sú známe stovky) sa spravidla nevyskytujú v proteínoch (pozri Ulmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, str. 57-97 VCH, Weinheim (1985)). Aminokyseliny môžu byť v D- alebo L-optickej konfigurácii, i keď L- aminokyseliny sú vo všeobecnosti jediný druh, ktorý sa zistil v prirodzene sa vyskytujúcich proteínoch. Biosyntetické a degradačné dráhy každej z 20 aminokyselín proteínového pôvodu sú dobre známe v prokaryotických, ako aj v eukaryotických bunkách (pozri napr. Stryer, L. Biochemistry, 3. vydanie, strany 578-590 (1988)). „Esenciálne“,aminokyseliny· (histidín, izoleucín, leucín, lyzín, metionín, fenylalanín, treonín, tryptofán avalín), ktoré sa takto nazývajú, pretože sú obvykle nutritívnou požiadavkou z dôvodu zložitosti ich biosyntéz, sa ľahko jednoduchými biosyntetickými dráhami menia na ostatných 11 „neesenciálnych“ aminokyselín (alanín, arginín, asparagín, aspartát (kyselina asparágová), cysteín, glutamát (kyselina glutámová), glutamín, glycín, prolín, serín atyrozín). Vyššie živočíchy si udržiavajú schopnosť syntetizovať niektoré z týchto aminokyselín, ale esenciálne aminokyseliny sa musia dodať výživou, aby mohla prebiehať normálna biosyntéza. proteínov.

Bez ohľadu na ich funkciu v biosyntéze proteínov, sú tieto aminokyseliny zaujímavé chemikálie so sebe vlastnými schopnosťami a mnohé našli uplatnenie v rôznych aplikáciách v potravinárskom, krmovinárskom, chemickom, kozmetickom, poľnohospodárskom a farmaceutickom priemysle. Lyzín je dôležitá aminokyselina nielen vo výžive ľudí, ale aj monogastrických živočíchov ako hydiny a ošípaných. Glutamát sa najčastejšie používa ako chuťová prísada (glutamát sodný), (monosodium glutamate, MSG) a používa sa vo veľkom rozsahu v rámci potravinárskeho priemyslu, tak ako aj aspartát, fenylalanín, glycín a cysteín. Glycín, L-metionín a aj tryptofán sa využívajú vo farmaceutickom priemysle. Glutamín, valín, leucín, izoleucín, histidín, arginín, prolín, serín a alanín sa používajú aj vo farmaceutickom aj v kozmetickom priemysle. Treonín, tryptofán a D/L-metionín sú bežnými kŕmnymi aditívami (Leuchtenberger, W. (1996) Amino aids - technical production and use, str. 466-502 v Rehm a kol., (eds.) Biotechnology vol. 6, chapter 14a, VCH, Weinheim), Okrem toho sa zistilo, že tieto aminokyseliny sú vhodnými prekurzormi na syntézu syntetických aminokyselín a proteínov, ako N-acetylcysteínu, Skarboxymetyl-L-cysteínu, (S)-5-hydroxytryptofánu a ďalších, ktoré sa opisujú vlllmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, str.. 57-97, VCH, Weinheim, 1985.

Biosyntéza týchto prírodných aminokyselín takými organizmami schopnými ich produkcie ako sú baktérie, je dobre známa (pozri prehľad o bakteriálnej biosyntéze aminokyselín a jej regulácii Umbarger, H. E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47, 533-606). Glutamát sa syntetizuje redukčnou, amináciou a-ketoglutarátu, medziproduktu v cykle kyseliny citrónovej. Glutamín, aj prolín a arginín vznikajú potom z glutamátu. Biosyntéza serínu je trojkrokový proces, ktorý sa začína od 3fosfoglycerátu (medziproduktu pri glykolýze) a končí touto aminokyselinou po kroku oxidácie, transaminácie a hydrolýzy. Aj cysteín aj glycín vznikajú zo serínu; cysteín kondenzáciou homocysteínu so serínom a glycín prenosom bočného reťazca βuhlíkového atómu na tetrahydrofolát reakciou, ktorú katalyzuje seríntranshydroxymetyláza. Fenylalanín atyrozín sa syntetizujú zprekurzorov glykolytickej a pentózafošfátovej dráhy erytróza-4-fosfátu a fosfoenolpyruvátu 9krokovou biosyntetickou cestou, ktorá sa líši len v konečných dvoch krokoch po syntéze prefenátu. Tryptofán vzniká tiež z týchto dvoch počiatočných molekúl, ale jeho syntéza je 11- kroková dráha. Tyrozín sa môže tiež syntetizovať z fenylalanínu reakciou, ktorú katalyzuje fenylalanínhydroxyláza. Alanín, valín a aj leucín sú biosyntetické produkty pyruvátu, konečného produktu glykolýzy. Aspartát vzniká z oxalacetátu, medziproduktu cyklu kyseliny citrónovej. Asparagín, metionín, treonín a aj lyzín vznikajú konverziou aspartátu. Izoleucín vzniká ztreonínu. Zložitá 9kroková dráha končí vznikom histidínu z 5-fosforibozyl-1-pyrofosfátu, aktivovaného sacharidu.

Viac aminokyselín ako je potrebných na syntézu proteínov sa nemôže uchovávať v bunke a namiesto toho sa degradujú, pričom poskytujú medziprodukty pre hlavné metabolické dráhy bunky (pozri prehľad Stryer, L. Biochemistry 3. ed., Ch. 21 „Amino Acid Degradation and Urea Cycle“str. 495-516 (1988)). Hoci bunka je schopná konvertovať nežiaduce aminokyseliny na užitočné metabolické medziprodukty, je produkcia aminokyselín z energetického hľadiska náročná, vyžaduje prekurzorové molekuly a enzýmy na ich syntézu. Tak nie je prekvapujúce, že biosyntéza aminokyselín je regulovaná inhibíciou spätnou väzbou, pri ktorej prítomnosť určitej aminokyseliny spôsobí spomalenie alebo celkom zastavenie jej produkcie (pozri súhrn o mechanizmoch spätnej väzby v aminokyselinových biosyntetických dráhach v Stryer, L. Biochemistry, 3. ed. Ch. 24: Biosynthesis of Amino Acids and Herne“ str. 575-600 (1988)). Takto je produkcia každej jednotlivej aminokyseliny limitovaná množstvom tej aminokyseliny, ktorá je prítomná v bunke.

B. Metabolizmus vitamímov, kofaktorov a „nutraceutík“ a použitia

Vitamíny, kofaktory a nutraceutiká predstavujú ďalšiu skupinu molekúl, ktorých schopnosť syntézy vyššie živočíchy stratili, atak sa musia prijímať potravou, i keď iné organizmy, napríklad baktérie, ich ľahko syntetizujú. Tieto molekuly sú samotné buď bioaktívnymi látkami, alebo sú prekurzormi biologicky aktívnych látok, ktoré sú prenášačmi elektrónov alebo sú to medziprodukty v rozmanitých metabolických dráhach. Okrem ich nutritívnej hodnoty majú tieto zlúčeniny tiež signifikantnú priemyselnú hodnotu ako farbivá, antioxidanty a katalyzátory alebo iné technologické pomocné látky. (Pozri napr. súhrn o štruktúre, aktivite a priemyselných aplikáciách týchto zlúčenín v Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, „Vitamins“ vol. A27, str. 443-613, VCH, Weinheim, 1966). Pojem „vitamín“ je zaužívaný technický pojem a zahŕňa živiny, ktoré organizmus potrebuje na normálne fungovanie, ale ktoré si organizmus nevie sám syntetizovať. Do skupiny vitamínov možno zahrnúť kofaktory a nutraceutické zlúčeniny. Pojem „kofaktor“ predstavuje zlúčeniny neproteínového pôvodu, ktoré sú potrebné na normálnu enzymatickú aktivitu. Tieto zlúčeniny môžu byť organické alebo anorganické; kofaktorové molekuly v predloženom vynáleze sú výhodne organické. Pojem „nutraceutikum“ zahŕňa potravinové doplnky, ktoré majú užitočný vplyv na zdravotný stav rastlín, zvierat a hlavne ľudí. Príkladmi takýchto molekúl sú vitamíny, antioxidanty a tiež niektoré lipidy (napr. polynenasýtené mastné kyseliny).

Biosyntéza týchto molekúl v organizmoch, ktoré sú schopné ich produkcie, napríklad v baktériách, je zoširoka opísaná (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, „Vitamins“ vol. A27,str. 443-613, VCH, Weinheim, 1966; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways, An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A. S., Niki, E & Packer, L (1995) „Nutrition, Lipids, Health and Disease“ Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research - Asia, konanej 1.-3. septembra 1994 vPenang, Malajzia, AOCS Press, Champaign, ILX, 374 S).

Tiamín (vitamín Bi) sa tvorí chemickým viazaním podielov pyrimidínu atiazolu. Riboflavín (vitamín B2) sa syntetizuje z guanozín-5'-trifosfátu (GTP) a ribóza-5'-fosfátu. Riboflavín sa využíva na syntézu flavínmononukleotidu (FMN) a flavínadeníndinukleotidu (FAD). Rodina zlúčenín so spoločným názvom „vitamín B₆“ (napr. pyridoxín, pyridoxamín, pyridoxal-5'-fosfát a komerčne používaný hydrochlorid pyridoxínu) sú všetko deriváty spoločnej štruktúrnej jednotky, 5hydroxy-6-metylpyridínu. Pantotenát (kyselina pantoténová, (R)-(+)-N-(2,4dihydroxy-3,3-dimetyl-1-oxobutyl)^-alanín) sa môže vyrábať buď chemickou syntézou alebo fermentačne. Konečné kroky pri biosyntéze kyseliny pantoténovej pozostávajú z ATP-riadenej kondenzácie β-alanínu a kyseliny pantoovej. Enzýmy! zodpovedné za biosyntetické kroky konverzie na kyselinu pantoovú, β-alanín a za kondenzáciu na kyselinu pantoténovú sú známe. Metabolický aktívna forma pantotenátu je koenzým A, ktorého biosyntéza je 5 krokový enzymatický postup. Pantotenát, pyridoxal-5'-fosfát, cysteín a ATP sú prekurzory koenzýmu A. Tieto enzýmy, nielenže katalyzujú tvorbu pantotenátu, ale tiež produkujú (R)-pantoovú kyselinu, (R)-pantolaktón, (R)-pantenol (provitamín B₅.), panteteín (a jeho deriváty) a koenzým A.

Biosyntéza biotínu z prekurzorovej molekuly pimeloyl-CoA v mikroorganizmoch sa detailne študovala a identifikovali sa niektoré gény zapojené do tohto procesu. Zistilo sa, že mnohé príslušné proteíny sú zapojené do syntézy Fe-clasteru a sú členmi nifS triedy proteínov. Kyselina lipoová je odvodená z kyseliny oktánovej a je koenzýmom v energetickom metabolizme, ktorý je súčasťou pyruvátdehydrogenázového komplexu a a-ketoglutarátdehydrogenázového komplexu. Foláty sú skupinou látok, ktoré sú všetky derivátmi kyseliny listovej, ktorá je samotná odvodená z kyseliny L- glutámovej, p-aminobenzoovej kyseliny a 6-metylpterínu. Biosyntéza kyseliny listovej a jej derivátov, začínajúca sa od metabolických medziproduktov guanozín-5'-trifosfátu (GTP), L-glutámovej kyseliny a kyseliny p-aminobenzoovej, sa podrobne skúmala v určitých mikroorganizmoch.

Korinoidy (ako kobalamíny a predovšetkým vitamín B12) a porfyríny patria do skupiny chemikálií vyznačujúcich sa tetrapyrolovým kruhovým systémom. Biosyntéza vitamínu B12 je tak zložitá, že nie je úplne charakterizovaná, ale mnohé enzýmy a substráty zapojené do biosyntézy sú už známe. Kyselina nikotínová (nikotinát) a nikotínamid sú pyridínové deriváty, ktoré sa tiež označujú ako „niacín“. Niacín je prekurzorom dôležitých koenzýmov NAD (nikotínamidadeníndinukleotidu) a NADP (nikotínamidadeníndinukleotidfosfátu) a ich redukovaných foriem.

Výroba týchto chemikálií vo veľkom rozsahu je väčšinou odkázaná na bezbunkové chemické syntézy, i keď niektoré tieto chemikálie, ako riboflavín, vitamín B₆, pantotenát a biotín, sa tiež vyrobili kultiváciou mikroorganizmov vo veľkom rozsahu. Len vitamín B₁₂ sa vyrába výhradne fermentačne, a to kvôli zložitosti jeho syntézy. In vitro metodológie vyžadujú značné materiálové vstupy a čas, často pri vysokých nákladoch.

i .

C. Metabolizmus purínov, pyrimidínov, nukleozidov a nukleotidov a použitia

Gény metabolizmu purínov a pyrimidínov a im prislúchajúce proteíny sú významými cieľmi terapie nádorových ochorení a vírusových infekcií. Pojem „purín alebo pyrimidín“ označuje dusíkaté bázy, ktoré sú zložkami nukleových kyselín, koenzýmov a nukleotidov. Názov „nukleotid“ zahrňuje základné štruktúrne jednotky molekúl nukleových kyselín, ktoré pozostávajú z dusíkatej bázy, pentózového sacharidu (v prípade RNA je sacharidom ribóza; v prípade DNA je sacharidom D17 deoxyribóza) a kyseliny fosforečnej. Pojem „nukleozid“ zahŕňa molekuly, ktoré sú prekurzormi nukleotidov, ale ktoré neobsahujú ako zložku kyselinu fosforečnú, túto obsahujú nukleotidy. Inhibovaním biosyntézy týchto molekúl alebo ich aktivovaním na tvorbu molekúl nukleových kyselín, sa dá inhibovať syntéza RNA a DNA; inhibovaním tejto aktivity spôsobom cieleným na karcinogénne bunky sa môže inhibovať schopnosť nádorových buniek deliť sa a replikovať sa. Navyše sú to nukleotidy, ktoré nevytvárajú molekuly nukleových kyselín, ale skôr fungujú ako energetické zásoby (t.j. AMP) alebo ako koenzýmy (t.j. FAD a NAD).

Niekoľko publikácií opisuje použitie týchto chemikálií na lekárske indikácie pomocou ovplyvňovania purínového a/alebo pyrimidínového metabolizmu (napr. Christopherson, R. I. and Lyons, S. D. (1990) „Potení inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents“ Med. Res. Reviews, 10, 505-548). Výskumy enzýmov zapojených do purínového a pyrimidínového metabolizmu sa zamerali na vývoj nových liečiv, ktoré by sa mohli použiť napríklad ako imunosupresíva alebo antiproliferatiká (Smith, J. L., (1995) „Enzymes in nucleotide synthesis“ Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 752-757; (1995) Biochem Soc. Transact. 23, 877-902). Avšak purínové a pyrimidínové bázy, nukleozidy a nukleotidy majú ďalšie využitia: ako medziprodukty pri biosyntéze viacerých špeciálnych chemikálií (napr. tiamínu, S-adenozyl-metionínu, folátov alebo riboflavínu), ako bunkové energetické prenášače (napr. ATP alebo GTP) ,a äko samotné chemikálie sa bežne používajú ako prostriedky na zvýraznenie chuti a vône (napr. IMP alebo GMP) alebo vo viacerých lekárskych aplikáciách (pozri napr. Kunianaka, A. (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology, vol.6, Rehm a kol., VCH, Weiheim, str. 561-612). Taktiež enzýmy, podieľajúce sa na metabolizme purínov, pyrimidínov, nukleozidov alebo nukleotidov čoraz viac slúžia ako ciele, proti ktorým boli vyvinuté chemikálie na ochranu poľnohospodárskych plodín ako fungicídy, herbicídy a insekticídy.

Metabolizmus týchto zlúčenín sa charakterizoval v baktériách (pozri napr.

prehľad Zalkin, H. and Dixon, J. E. (1992) „de novo purine nucleotide biosynthesis“, v Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, vol. 42, Academic

Press, str. 259-287; a Michal, G. (1999) „Nucleotides and Nucleosides“, Chapter 8 v Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley,

New York). Purínový metabolizmus bol predmetom intenzívneho výskumu a je esenciálny pre normálne fungovanie bunky. Oslabený purínový metabolizmus môže u vyšších živočíchov spôsobovať závažné choroby ako napríklad dnu. Purínové nukleotidy sa syntetizujú z ribóza-5-fosfátu sériovými krokmi cez medziproduktovú zlúčeninu inozín-5'-fosfát (IMP), končiacimi vznikom guanozín-5'-monofosfátu (GMP) alebo adenozín-5'-monofosfátu (AMP), z ktorých sa ľahko vytvárajú trifosfátové formy využiteľné ako nukleotidy. Tieto zlúčeniny sa tiež využívajú ako energetické zásoby, pretože ich degradácia poskytuje energiu pre mnohé rôzne biochemické procesy v bunke. Biosyntéza pyrimidínov pokračuje tvorbou uridín-5'monofosfátu (UMP) z ribóza-5'-fosfátu. UMP sa zase konvertuje na cytidín-5'trifosfát (CTP). Deoxyformy všetkých týchto nukleotidov vznikajú jednokrokovou redukčnou reakciou z difosfátribózovej formy nukleotidu na difosfátdeoxyribózovú formu nukleotidu. Na základe fosforylácie sú tieto molekuly schopné podieľať sa na syntéze DNA.

D. Metabolizmus trehalózy a použitia

Trehalóza pozostáva z dvoch glukózových molekúl viazaných α,α-1,1 väzbou. Zvyčajne sa používa v potravinárskom priemysle ako sladidlo, aditívum pre sušené alebo mrazené potraviny a v nápojoch. Ale uplatňuje sa tiež vo farmaceutickom, kozmetickom a biotechnologickom priemysle (pozri napr. Nishimoto a kol., (1998) americký patentový spis č. US 5,759,610; Singer, M.A. and Lindquist, S. (1998) Trends Biotech., 16, 460-467; Paiva, C.L.A. a Panek, A:D. (1996) Biotech. Ann. Rev.,_2, 293 - 314; a Shiosaka, M. (1977) J. Japan 172, 97 102). Trehalózu produkujú pomocou enzýmov mnohé mikroorganizmy a prirodzene sa vylučuje do okolitého média, z ktorého sa môže zachytávať metódami známymi v danej oblasti techniky.

II. Zužitkovanie sacharidových a uhlíkatých molekúl a oxidačná fosforylácia

Uhlík je prvok, ktorý má kritický význam pri tvorbe všetkých organických zlúčenín, a preto je nutritívne potrebný nielen na rast a delenie C. glutamicum, ale tiež na nadmernú produkciu špeciálnych chemikálií z tohto mikroorganizmu. Predovšetkým dobrými zdrojmi uhlíka sú sacharidy ako napríklad mono-, di- alebo polysacharidy, a preto štandardné rastové médiá typicky obsahujú jednu alebo viac z týchto zložiek: glukózu, fruktózu, manózu, galaktózu, ribózu, sorbózu, ribulózu, laktózu, maltózu, sacharózu, rafinózu, škrob alebo celulózu (Ullmann’s

Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, “Enzymes”, VCH: Weinheim). Alternatívne sa môžu v médiách zužitkovať komplexnejšie sacharidové formy ako napríklad melasa alebo iné vedľajšie produkty pri rafinácii cukru. Okrem sacharidov sa môžu ako alternatívne zdroje uhlíka použiť ďalšie zlúčeniny, ako sú alkoholy (napr. etanol alebo metanol), alkány, sacharidové alkoholy, mastné kyseliny a organické kyseliny (napr. kyselina octová alebo kyselina mliečna). Na porovnanie zdrojov uhlíka a ich zužitkovanie mikroorganizmami v kultúre pozri prehľad: Ullman’s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, “Enzymes”, VCH: Weinheim; Stoppok, E. and Buchholz, K. (1996) “Sugar-based raw materials for fermentation applications” v Biotechnology (Rehm, H.J. a kol., eds.) vol. 6, VCH: Weinheim, str. 5-29; Rehm, H.J. (1980) Industrielle Mikrobiológie, Springer: Berlín; Bartholomew, W.H., and Reiman, H.B. (1979). Economics of Fermentation Processes v: Peppler, H.J. and Perlman, D., eds. Microbial Technology 2^nd ed., vol. 2, chapter 18, Academic Press: New York; a Kockova-Kratachvilova, A. (1981) Characteristics of Industrial Microorganisms, v: Rehm, H.J. and Reed, G., eds. Handbook of Biotechnology, vol. 1, chapter 1, Verlag Chemie: Weinheim.

Po príjme sa musia tieto energeticky bohaté uhlíkaté molekuly spracovať tak, aby boli schopné degradácie v jednej z hlavných sacharidových metabolických dráh. Takéto dráhy vedú priamo k užitočným degradačným produktom ako napríklad ribóza-5-fosfátu a fosfoenolpyruvátu, ktoré sa môžu ďalej konvertovať na pyruvát. V baktériách existujú tri najdôležitejšie dráhy sacharidového metabolizmu: Embden-Meyerhoff-Pamasova (EMP) dráha (známa tiež ako glykolytická alebo fruktóza-bisfosfátová dráha), hexóza-monofosfátová (HMP) dráha (známa tiež ako pentózový skrat alebo pentóza-fosfátová dráha) a Entner-Doudoroffova (ED) dráha (pozri prehľad: Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley: New York, a Stryer, L. (1988) Biochemistry, Chapters 13-19, Freeman: New Yórk, a odkazy tam uvedené).

EMP dráha konvertuje hexózové molekuly na pyruvát a týmto procesom vznikajú dve molekuly ATP a dve molekuly NADH. Vychádzajúc z glukóza-1-fosfátu (ktorý sa môže buď priamo prijímať z média alebo alternatívne sa môže vytvárať z glykogénu, škrobu alebo celulózy) sa molekula glukózy izomerizuje na fruktóza-6fosfát, fosforyluje sa a štiepi na dve 3-uhlíkaté molekuly glyceraldehyd-3-fosfátu. Po dehydrogenácii, fosforylácii a za sebou nasledujúcimi prešmykmi vzniká pyruvát.

HMP dráha konvertuje glukózu na redukčné ekvivalenty ako napríklad NADPH a produkuje pentózové a tetrózové zlúčeniny, ktoré sú potrebnými medziproduktmi a prekurzormi v mnohých ďalších metabolických dráhach. V HMP dráhe sa glukóza-6-fosfát konvertuje na ribulóza-5-fosfát dvoma za sebou nasledujúcimi dehydrogenázovými reakciami (ktoré tiež uvoľňujú dve molekuly NADPH) a karboxylačným krokom. Ribulóza-5-fosfát sa môže tiež konvertovať na xylulóza-5-fosfát a ribóza-5-fosfát; xylulóza-5-fosfát môže podliehať sériám biochemických premien na glukóza-6-fosfát, ktorý môže vstúpiť do EMP dráhy, zatiaľ čo ribóza-5-fosfát sa bežne zužitkúva ako medziprodukt v ďalších biosyntetických dráhach vo vnútri bunky.

ED dráha sa začína s glukózovou zlúčeninou alebo glukonátom, ktorá sa v ďalšom fosforyluje adehydratuje za vzniku 2-dehydro-3-deoxy-6-P-glukonátu. Glukuronát a galakturonát sa tiež môžu konvertovať na 2-dehydro-3-deoxy-6-Pglukonát prostredníctvom zložitejších biochemických dráh. Táto vzniknutá molekula sa potom ďalej štiepi na glyceraldehyd-3-Ρ a pyruvát; samotný glyceraldehyd-3-Ρ sa môže tiež konvertovať na pyruvát.

EMP a HMP dráhy majú mnohé funkcie, vrátane funkcií medziproduktov a enzýmov. EMP dráha poskytuje najväčšie množstvo ATP, ale neprodukuje ribóza-5-fosfát, ktorý je dôležitým prekurzorom napríklad biosyntézy nukleových kyselín, ani erytróza-4-fosfát, ktorý je dôležitý pri biosyntéze aminokyselín. Mikroorganizmy, ktoré sú schopné využívať len EMP dráhu na zužitkovanie glukózy, a nie sú teda schopné rásť na jednoduchom médiu s glukózou ako jediným zdrojom uhlíka, patria k náročným organizmom a ich rast vyžaduje prísuny komplexnejších organických zlúčenín, ako napríklad tých, ktoré sa zistili v kvasinkovom extrakte.

Napriek tomu, že HMP dráha produkuje všetky prekurzory potrebné na biosyntézu aj nukleových kyselín aj aminokyselín, poskytuje len polovičné množstvo ATP-energie ako EMP dráha. HMP dráha produkuje tiež NADPH, ktorý sa môže použiť na redoxné reakcie v biosyntetických dráhach. Avšak HMP dráha neprodukuje priamo pyruvát, a tak tieto mikroorganizmy musia tiež mať túto časť EMP dráhy. Preto nie je prekvapujúce, že mnoho mikroorganizmov, predovšetkým fakultatívne anaeróbne mikroorganizmy sa vyvinuli tak, že vlastnia obidve tieto dráhy.

ED dráha sa teda zďaleka nevyskytuje len v baktériách. I keď je táto dráha čiastočne spojená s HMP dráhou v reverznom smere pri tvorbe prekurzorov, ED dráha vytvára priamo pyruvát aldolázovým štiepením 3-ketodeoxy-6fosfoglukonátu. ED dráha môže existovať na tomto základe a využíva ju väčšina striktne aeróbnych mikroorganizmov. Čistý výnos je podobný výnosu z HMP dráhy, hoci jeden mól ATP sa môže vytvoriť len ak sa atómy uhlíka konvertujú nie na prekurzorové molekuly, ale na pyruvát.

Molekuly pyruvátu produkované ktoroukoľvek z týchto dráh sa môžu ľahko konvertovať na energiu prostredníctvom Krebsovho cyklu (známeho tiež ako cyklus kyseliny citrónovej, citrátový cyklus alebo cyklus trikarboxylových kyselín (TCA cyklus)). V tomto procese sa najprv dekarboxyluje pyruvát za vzniku jednej molekuly NADH, jednej molekuly acetyl-CoA a jednej molekuly CO₂. Acetylová skupina acetyl-CoA potom reaguje so 4-uhlíkatou jednotkou, oxalacetátom, čo vedie k vzniku kyseliny citrónovej, 6-uhlíkatej organickej kyseliny, dehydratácii a uvoľneniu dvoch ďalších molekúl CO₂. Napokon sa oxalacetát regeneruje a môže opäť fungovať ako akceptor acetylu a tak sa cyklus uzatvára. Elektróny uvoľnené počas oxidácie medziproduktov v TCA cykle sa transferujú na NAD⁺ za vzniku NADH.

Pri procese dýchania sa elektróny transferujú z NADH na molekulový kyslík alebo iné koncové akceptory elektrónov. Tento proces je katalyzovaný pomocou dýchacieho reťazca, systému transportu elektrónov pozostávajúceho tak z integrálnych membránových proteínov ako aj z membránovo-asociovaných proteínov. Tento systém má tieto dve základné funkcie: prvú, prijímať elektróny od donora elektrónov a transferovať ich na akceptor elektrónov a druhú, konzervovať časť energie uvoľnenej počas transferu elektrónov prostredníctvom syntézy ATP. Známych je niekoľko typov oxidačno-redukčných enzýmov a transportných proteínov elektrónov, ktoré sú zapojené do takýchto procesov, vrátane NADH dehydrogenáz, prenášačov elektrónov obsahujúcich flavín, proteínov obsahujúcich železo a síru a cytochrómov. NADH dehydrogenázy sú lokalizované na cytoplazmovom povrchu membrány plazmy a transferujú vodíkové atómy z NADH na flavoproteíny a naopak zasa prijímajú elektróny z NADH. Flavoproteíny predstavujú skupinu prenášačov elektrónov, ktoré majú flavínovú prostetickú skupinu, ktorá sa alternatívne redukuje, ak sa prijímajú elektróny a oxiduje, ak sa elektróny odovzdávajú. Známe sú tri skupiny flavínov, ktoré sa podieľajú na týchto reakciách: riboflavín, flavínadeníndinukleotid (FAD) a flavínmononukleotid (FMN). Proteíny obsahujúce železo a síru obsahujú cluster atómov železa a síry, ktorý sa neviaže na hémovú skupinu, ale ktorý je ešte stále schopný podieľať sa na dehydratačných a rehydratačných reakciách. Sukcinátdehydrogenáza a akonitáza sú vzorovými proteínmi obsahujúcimi železo a síru; ich Fe-S komplexy prijímajú a odovzdávajú elektróny v rámci celkového reťazca prenášajúceho elektróny. Cytochrómy sú proteíny, ktoré obsahujú Fe-porfyrínový kruh (hém). Existuje mnoho rôznych tried cytochrómov, ktoré majú odlišné redukčné potenciály. Funkčne majú tieto cytochrómy vytvorené dráhy, v ktorých sa elektróny môžu transferovať na ďalšie cytochrómy, ktorých pozitívne redukčné potenciály sa stále zvyšujú. Známa je aj ďalšia trieda neproteínových elektrónových prenášačov: chinóny rozpustné v lipidoch (napr. koenzým Q). Tieto molekuly tiež fungujú ako akceptory vodíkového atómu a donory elektrónov.

Činnosťou dýchacieho reťazca sa vytvára protónový gradient cez bunkovú membránu, ktorý poskytuje protónovú hnaciu silu. Túto silu využíva bunka na syntetizovanie ATP pomocou enzýmu prekleňujúceho membránu, ATP-syntázy. Tento enzým je multiproteínovým komplexom, v ktorom transport H⁺ molekúl cez membránu spôsobuje fyzikálnu rotáciu intracelulárnych podjednotiek a súčasnú fosforyláciu ADP za vzniku ATP (pozri prehľad Fillingame, R.H. and Divall, S. (1999) Novartis Found. Symp. 221: 218-229, 229-234).

Nehexózové uhlíkaté substráty môžu byť tiež zdrojmi uhlíka a energie pre bunku. Takéto substráty sa môžu najprv konvertovať na hexózové sacharidy v glukoneogenézovej dráhe, v ktorej sa glukóza najprv syntetizuje bunkou a potom sa degraduje, aby sa vytvorila energia. Východiskovým materiálom pre túto reakciu je fosfoenolpyruvát (PEP), ktorý je jedným z kľúčových medziproduktov v glykolytickej dráhe. PEP sa môže vytvoriť aj z iných ako sacharidových substrátov, napríklad z kyseliny octovej alebo dekarboxyláciou oxalacetátu (ktorý sám osebe je medziproduktom vTCA cykle). Reverziou glykolytickej dráhy (využitím kaskády iných enzýmov v porovnaní s pôvodnou glykolytickou dráhou) sa môže vytvárať glukóza-6-fosfát. Konverzia pyruvátu na glukózu vyžaduje zužitkovanie šiestich vysokoenergetických fosfátových väzieb, kým glykolýza produkuje len dve molekuly ATP pri konverzii glukózy na pyruvát. Ale kompletná oxidácia glukózy (glykolýza, konverzia pyruvátu na acetyl-CoA, cyklus kyseliny citrónovej a oxidačná fosforylácia) poskytuje od 36 do 38 ATP, a tak čistú stratu vysokoenergetických fosfátových väzieb podrobených glukoneogenéze vyvažuje celkove väčší výťažok vysokoenergetických molekúl, ktoré vznikajú pri oxidácii glukózy.

III. Pojmy a spôsoby vynálezu

Predložený vynález je založený, aspoň sčasti, na objave nových molekúl, uvádzaných v tomto dokumente ako SMP nukleovokyselinové a proteínové molekuly, ktoré sa podieľajú na konverzii sacharidov na užitočné degradačné produkty a energiu (napr. ATP) v C. glutamicum, alebo ktoré sa môžu podieľať na produkcii užitočných vysokoenergetických molekúl (napr. ATP) prostredníctvom ďalších procesov ako napríklad oxidačnej fosforylácie. V jednom uskutočnení sa SMP molekuly podieľajú na metabolizme uhlíkatých zlúčenín ako napríklad sacharidov alebo na vytváraní energetických molekúl (napr. ATP) prostredníctvom procesov ako je oxidačná fosforylácia v Corynebacterium glutamicum. Vo výhodnom uskutočnení sa aktivitou SMP molekúl podľa predloženého vynálezu podporuje metabolizmus uhlíka alebo produkcia energie v C. glutamicum, čo má vplyv na produkciu požadovanej špeciálnej chemikálie týmto organizmom. V predovšetkým výhodnom uskutočnení sú SMP molekuly podľa tohto vynálezu modulované na aktivitu tak, že metabolické a energetické dráhy C. glutamicum, do ktorých sú SMP proteíny podľa tohto vynálezu zapojené, sú modulované na výťažok, produkciu a/alebo účinnosť produkcie tak, že sa buď priamo alebo nepriamo moduluje výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie požadovanej špeciálnej chemikálie z C. glutamicum.

Pojem „SMP“ proteín“ alebo „SMP polypeptid“ zahrňuje proteíny, ktoré sú funkčne zapojené do metabolizmu uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov, alebo do vytvárania energetických molekúl pomocou procesov ako je oxidačná fosforylácia v Corynebacterium glutamicum. Príklady SMP proteínov zahrňujú tie, ktoré sú kódované SMP génmi, uvedenými v tabuľke 1 a tie, ktoré sú kódované nepárne očíslovanými sekvenciami SEQ ID NO. Pojmy „SMP gén“ alebo „SMP sekvencia nukleovej kyseliny“ zahŕňajú sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce SMP proteín, ktoré sa skladajú z kódujúcej oblasti a tiež príslušných netranslatovaných 5'- a 3'-sekvenčných oblastí. Príklady SMP génov sú uvedené v tabuľke 1. Pojmy „produkcia“ alebo „produktivita“ sú známe v danej oblasti techniky a zahŕňajú koncentráciu fermentačného produktu (napríklad požadovanej špeciálnej chemikálie), ktorý sa vytvoril za stanovený čas a v stanovenom fermentačnom objeme (napr. kg produktu za hodinu na liter). Pojem „účinnosť produkcie“ znamená čas, ktorý je potrebný na to, aby sa dosiahla príslušná produkcia (napríklad, ako dlho trvá bunke dosiahnutie príslušnej rýchlosti produkovania špeciálnej chemikálie). Pojem „výťažok“ alebo „výťažok produkt/uhlík“ je známy v danej oblasti techniky a znamená účinnosť konverzie zdroja uhlíka na produkt (t.j. špeciálnu chemikáliu). Toto sa bežne uvádza napríklad ako kg produktu na kg zdroja uhlíka. Zvyšovaním výťažku alebo produkcie zlúčeniny sa množstvo získaných molekúl alebo úspešne získaných molekúl tejto zlúčeniny v stanovenom množstve kultúry v stanovenom čase zvyšuje. Pojmy „biosyntéza“ alebo „biosyntetická dráha“ sú známe v danej oblasti techniky a znamenajú syntézu zlúčeniny, výhodne organickej zlúčeniny, bunkou z medziproduktových zlúčenín, čo môže byť viackrokový a vysoko regulovaný proces. Pojmy „degradácia“ alebo „degradačná dráha“ sú známe v danej oblasti techniky a znamenajú rozklad zlúčeniny, výhodne organickej zlúčeniny, bunkou na degradačné produkty (všeobecne povedané, menšie alebo menej zložité molekuly), ktorý môže byť viackrokový a vysoko regulovaný proces. Pojem „degradačný produkt“ je známy v danej oblasti techniky a znamená rozkladné produkty zlúčeniny. Tieto produkty sa môžu samotné zužitkovať ako prekurzorové (štartovací bod) alebo medziproduktové molekuly, ktoré treba na biosyntézu ďalších zlúčenín bunkou. Pojem „metabolizmus“ je známy v danej oblasti techniky a znamená súhrn biochemických reakcií, ktoré sa uskutočňujú v organizme. Metabolizmus príslušnej zlúčeniny (napr. metabolizmus aminokyseliny glycínu) zahrňuje potom celkové biosyntetické, modifikačné a degradačné dráhy v bunke týkajúce sa tejto zlúčeniny.

V ďalšom uskutočnení sú SMP molekuly podľa tohto vynálezu schopné modulovať produkciu takej požadovanej molekuly, ako je špeciálna chemikália, v mikroorganizme, ako je C. glutamicum. Existuje mnoho mechanizmov, pomocou ktorých sa zmenou SMP proteínu podľa tohto vynálezu, môže priamo ovplyvniť výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie špeciálnej chemikálie z kmeňa C. glutamicum, a to inkorporáciou takéhoto zmeneného proteínu. Degradácia vysokoenergetických uhlíkatých molekúl, akými sú napríklad sacharidy, a konverzia zlúčenín, akými sú napríklad NADH alebo FADH₂, na užitočnejšie formy prostredníctvom oxidačnej fosforylácie poskytuje mnoho zlúčenín, ktoré samotné môžu byť požadovanými špeciálnymi chemikáliami, ako napríklad pyruvát, ATP, NADH a mnohé medziproduktové sacharidové zlúčeniny. Ďalej energetické molekuly (napríklad ako ATP) a redukčné ekvivalenty (napríklad ako NADH alebo NADPH), ktoré vznikajú v týchto metabolických dráhach, sa v bunke využívajú na pohon reakcií, ktoré by ináč boli energeticky nevýhodné. Takéto nevýhodné reakcie sa vyskytujú v mnohých biosyntetických dráhach pre špeciálne chemikálie. Zvyšovaním schopnosti bunky využívať určitý sacharid (napr. pomocou manipulácie s génmi, ktoré kódujú enzýmy zapojené do degradácie a konverzie takéhoto sacharidu na energiu pre bunku) sa dá zvýšiť množstvo energie dostupnej na to, aby sa umožnil priebeh nevýhodných, ale požadovaných metabolických reakcií (napr. biosyntéza požadovanej špeciálnej chemikálie).

Mutagenézou jedného alebo viacerých SMP génov podľa tohto vynálezu môžu tiež vznikať SMP proteíny so zmenenými aktivitami, ktoré nepriamo vplývajú na produkciu jednej alebo viacerých požadovaných špeciálnych chemikálií z C. glutamicum. Napríklad zvyšovaním účinnosti využitia jedného alebo viacerých sacharidov (tak, aby sa konverzia sacharidu na vhodné energetické molekuly zvýšila) alebo zvyšovaním účinnosti konverzie redukčných ekvivalentov na vhodné energetické molekuly (napr. zvyšovaním účinnosti oxidačnej fosforylácie alebo aktivity ATP-syntázy) sa môže zvýšiť množstvo týchto vysokoenergetických zlúčenín použiteľných bunkou na pohon bežne nevýhodných metabolických procesov. Do týchto procesov patrí konštrukcia bunkových stien, transkripcia, translácia a biosyntéza. zlúčenín potrebných na rast a delenie buniek (napr. nukleotidov, aminokyselín, vitamínov, lipidov atď.) (Lengeler a kol., (1999) Biology of Prokaryotes, Thieme Verlag: Stuttgart, str. 88-109; 913-918; 875-899). Zvyšovaním rastu a rozmnožovaním týchto geneticky manipulovaných buniek sa dá zvýšiť tak životaschopnosť buniek pri fermentácii vo veľkom rozsahu, ako aj zvýšiť ich rýchlosť delenia, tak že relatívne väčšie množstvo buniek môže prežiť vo fermentačnej kultúre. Výťažok, produkcia alebo účinnosť produkcie sa môže zvýšiť prinajmenšom prítomnosťou väčšieho počtu životaschopných buniek, ktoré všetky produkujú požadovanú špeciálnu chemikáliu. Ďalej veľa degradačných a medziproduktových zlúčenín produkovaných v priebehu metabolizovania sacharidov sú potrebné prekurzory a medziprodukty pre ďalšie biosyntetické dráhy nachádzajúce sa v bunke. Napríklad mnohé aminokyseliny sa syntetizujú priamo zo zlúčenín bežne vznikajúcich pri glykolýze alebo v TCA cykle (napr. serín sa syntetizuje z 3-fosfoglycerátu, glykolytického medziproduktu). Takto zvyšovaním účinnosti konverzie sacharidov na užitočné energetické molekuly sa práve taktiež môže zvýšiť množstvo užitočných degradačných produktov.

Sekvencie izolovaných nukleových kyselín, ktoré sú predmetom tohto vynálezu sú zahrnuté v genóme kmeňa Corynebacterium glutamicum dostupného prostredníctvom americkej zbierky kultúr .Američan Type Culture Collection“ pod označením ATCC 13032. Nukleotidové sekvencie izolovaných C. glutamicum SMP DNA sú uvedené v Sekvenčnom zázname s nepárne očíslovanými SEQ ID NO a predpokladané aminokyselinové sekvencie C. glutamicum SMP proteínov sú uvedené v Sekvenčnom zázname s párne očíslovanými SEQ ID NO. Uskutočnili sa komputerové analýzy, ktoré klasifikujú a/alebo identifikujú tieto nukleotidové sekvencie ako sekvencie, ktoré kódujú proteíny zapojené do metabolizmu uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov, alebo do vytvárania energetických molekúl prostredníctvom takých procesov ako je oxidačná fosforylácia v Corynebacterium glutamicum.

Predložený vynález sa tiež týka proteínov, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je v podstate homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s párne očíslovanou sekvenciou SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname). Tak ako sa v tomto dokumente uvádza, proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu v podstate homológnu s vybranou sekvenciou aminokyselín, je najmenej asi na 50 % homológny s vybranou aminokyselinovou sekvenciou, napr. celou vybranou aminokyselinovou sekvenciou. Proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je v podstate homológna s vybranou aminokyselinovou sekvenciou, môže byť tiež najmenej asi na 50-60 %, výhodne najmenej asi na 60-70 % a výhodnejšie najmenej asi na 70-80 %, 80-90 % alebo 90-95 % a najvýhodnejšie najmenej asi na 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológny s vybranou sekvenciou aminokyselín.

SMP proteín alebo jeho biologicky aktívna časť alebo jeho fragment podľa tohto vynálezu sa môže podieľať na metabolizme uhlíkatých zlúčenín ako napríklad sacharidov alebo na vytváraní energetických molekúl (napr. ATP) prostredníctvom takých procesov ako je oxidačná fosforylácia v Corynebacteríum glutamicum alebo môže mať jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1.

Rôzne aspekty vynálezu sa detailnejšie opisujú v nasledujúcich odstavcoch.

A. Molekuly izolovaných nukleových kyselín

Vynález sa týka molekúl izolovaných nukleových kyselín, ktoré kódujú SMP polypeptidy alebo ich biologicky aktívne časti, ako aj fragmentov nukleových kyselín vhodných na použitie ako hybridizačné sondy alebo priméry na identifikáciu alebo amplifikáciu SMP-kódujúcej nukleovej kyseliny (napr. SMP DNA). Pojem „molekula nukleovej kyseliny“, tak ako sa v tomto dokumente používa, označuje molekuly DNA (napr. cDNA alebo genómovú DNA) a molekuly RNA (napr. mRNA) a analógy DNA alebo RNA vytvorené použitím nukleotidových analógov. Tento pojem zahrňuje tiež netranslatovanú sekvenciu lokalizovanú na oboch 3'- a 5'- koncoch kódujúcej oblasti génu: najmenej asi 100 nukleotidovú sekvenciu lokalizovanú na 5'- konci kódujúcej oblasti génu proti smeru (upstream) transkripcie a najmenej asi 20 nukleotidovú sekvenciu lokalizovanú na 3'- konci kódujúcej oblasti génu v smere (downstream) transkripcie. Molekula nukleovej kyseliny môže byť jednovláknová alebo dvojvláknová, ale prednostne je dvojvláknová DNA. „Izolovanou“ molekulou nukleovej kyseliny je práve tá, ktorá je separovaná od iných molekúl nukleových kyselín, ktoré sú prítomné v prirodzenom zdroji nukleovej kyseliny. Výhodne „izolovaná“ nukleová kyselina neobsahuje sekvencie, ktoré prirodzene lemujú nukleovú kyselinu (t.j. sekvencie lokalizované na 5-a 3'-koncoch nukleovej kyseliny) v genómovej DNA organizmu, z ktorého je nukleová kyselina odvodená. Napríklad, v rôznych uskutočneniach, molekula izolovanej SMP nukleovej kyseliny môže obsahovať menéj ako asi 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb alebo 0,1 kb nukleotidových sekvencií, ktoré prirodzene lemujú molekulu nukleovej kyseliny

I ’ · v genómovej DNA bunky, z ktorej je nukleová kyselina odvodená (napr. bunka C. glutamicum). Navyše, molekula „izolovanej“ nukleovej kyseliny, ako DNA molekula, môže byť v podstate bez iného bunkového materiálu alebo kultivačného média, ak sa vytvorila pomocou rekombinantných techník, alebo chemických prekurzorov alebo iných chemikálií, ak sa syntetizovala chemicky.

Molekula nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu, napr. molekula nukleovej kyseliny, ktorá má nepárne očíslovanú nukleotidovú sekvenciu SEQ ID

NO v Sekvenčnom zázname, alebo jej časť, sa môže izolovať s použitím štandardných techník molekulárnej biológie a informácií o sekvencií poskytnutých v tomto dokumente. Napríklad, C. glutamicum SMP DNA sa môže izolovať z knižnice C. glutamicum použitím celej sekvencie alebo časti jednej zo sekvencií s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname ako hybridizačná sonda a štandardnými hybridizačnými technikami (napr. ako sa opisuje v Sambrook, J., Fritsh, E. F., a Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Okrem toho, molekula nukleovej kyseliny obsahujúca celú alebo časť jednej zo sekvencií nukleových kyselín podľa tohto vynálezu (napr. s nepárne očíslovanými SEQ ID NO:) sa môže izolovať polymerázovou reťazovou reakciou použitím oligonukleotidových primérov skonštruovaných na základe tejto sekvencie (napr. molekula nukleovej kyseliny obsahujúca celú alebo časť jednej zo sekvencií nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu (napr. s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) sa môže izolovať polymerázovou reťazovou reakciou použitím oligonukleotidových primérov skonštruovaných na základe tejto istej sekvencie). Napríklad, mRNA sa môže izolovať z normálnych endotelových buniek (napr. pomocou guanidíniumtiokyanátovej extrakčnej metódy podľa Chirgwim a kol., (1979) Biochemistry 18, 5294-5299) a DNA sa môže pripraviť použitím reverznej transkriptázy (napr. Moloney MLV reverznej transkriptázy, dostupnej od Gibco/GRL, Bethesda, MD; alebo AMV reverznej transkriptázy dostupnej od Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Syntetické oligonukleotidové priméry pre amplifikáciu polymerázovou reťazovou reakciou sa môžu skonštruovať na základe jednej z nukleotidových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname. Nukleová kyselina podľa tohto vynálezu sa môže amplifikovať použitím cDNA, alebo alternatívne, genómovej DNA, ako templátu a vhodných oligonukleotidových primérov podľa štandardných PCR amplifikačných techník. Nukleová kyselina takto amplifikovaná sa môže klonovať do vhodného vektora a charakterizovať pomocou vhodnej sekvenčnej analýzy DNA. Okrem toho oligonukleotidy, zodpovedajúce SMP nukleotidovej sekvencií, sa môžu pripraviť pomocou štandardných syntetických techník, napr. použitím automatického syntetizátora DNA.

Vo výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu obsahuje jednu z nukleotidových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname. Sekvencie nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, tak ako sa uvádzajú v Sekvenčnom zázname, zodpovedajú Corynebacterium glutamicum SMP DNA podľa tohto vynálezu. Táto DNA pozostáva zo sekvencií kódujúcich SMP proteíny (t.j. „kódujúcej oblasti zaznamenanej v každej nepárne očíslovanej sekvencii SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), ako aj z 5'netranslatovaných sekvencií a 3'-netranslatovaných sekvencií, ktoré sa tiež zaznamenali v každej nepárne očíslovanej sekvencii SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname. Alternatívne, molekula nukleovej kyseliny môže obsahovať len kódujúcu oblasť ktorejkoľvek zo sekvencií nukleových kyselín v Sekvenčnom zázname.

Pre účely tejto prihlášky treba rozumieť, že každá zo sekvencií nukleovej kyseliny a aminokyselinových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname je identifikovaná RXA, RXN alebo RXS číslovaním, ktoré má označenie „RXA,“ „RXN“ alebo „RXS“ s následnými 5 číslicami (t.j. RXA01626, RXN00043 alebo RXS0735). Každá zo sekvencií nukleovej kyseliny sa skladá až z troch častí: 5'- protismernej oblasti, kódujúcej oblasti a oblasti v smere transkripcie. Každá z týchto troch oblastí je identifikovaná rovnakým RXA, RXN alebo RXS označeniami, aby sa zabránilo zámene. Slovné spojenie „jedna zo sekvencií s nepárnym číslovaním v Sekvenčnom zázname“ teda odkazuje na ktorúkoľvek zo sekvencií nukleovej kyseliny v Sekvenčnom zázname, ktorá môže byť tiež rozlíšiteľná pomocou ich rozdielnych RXA, RXN alebo RXS označení. Kódujúca oblasť každej z týchto sekvencií je translatovaná na príslušnú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je tiež uvedená v Sekvenčnom zázname ako párne očíslovaná sekvencia SEQ ID NO: priamo nasledujúca po príslušnej sekvencii nukleovej kyseliny. Napríklad, kódujúca oblasť pre RXA02735 je uvedená v SEQ ID NO:1, zatiaľ čo aminokyselinová sekvencia, ktorú kóduje, je uvedená ako SEQ ID NO:2. Sekvencie molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sú určené rovnakými RXA, RXN áíebo RXS označeniami ako molekuly aminokyselín, ktoré kódujú, takže sa môžu ľahko korelovať. Napríklad, aminokyselinová sekvencia označená RXA00042 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXA00042, aminokyselinová sekvencia označená RXN00043 je translatovaná z kódujúcej oblasti nukleotidovej sekvencie molekuly nukleovej kyseliny RXN00043; zhoda medzi RXA, RXN a RXS nukleotidovými a aminokyselinovými sekvenciami podľa tohto vynálezu a im pridelené SEQ ID NO sú uvedené v tabuľke 1.

Niektoré z génov podľa tohto vynálezu sú „F-označené gény“. F-označené gény zahŕňajú tie gény uvedené v tabuľke 1, ktoré majú „F“ pred RXA označením. Napríklad, SEQ ID NO: 11 označuje, ako je ukázané v tabuľke 1, taký F-gén, ktorý má označenie „F RXA01312“, (SEQ ID NO: 29 taký F-gén, ktorý má označenie „FRXA02803“, SEQ ID NO: 33 taký gén, ktorý má označenie „F-RXA02854“ a SEQ ID NO: 39 taký gén, ktorý má označenie „F RXA01365).

V jednom uskutočnení, molekuly nukleovej kyseliny podľa predloženého vynálezu nemožno zahrnúť do tých, ktoré sú zostavené do tabuľky 2, a to v prípade dapD génu, ktorého sekvenciu publikoval Wehrmann, A. a kol. (1998) v J. Bacteriol. 180 (12), 3159-3165. Avšak, sekvencia získaná vynálezcami predloženej prihlášky je významne dlhšia, ako je publikovaná verzia. Predpokladá sa, že publikovaná verzia vychádzala z nesprávneho štartovacieho kodónu, a tak predstavuje len fragment skutočnej kódujúcej oblasti.

Vínom výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, zahrňuje molekulu nukleovej kyseliny, ktorá je komplementárna s jednou zo sekvencií nukleotidov podľa tohto vynálezu (nápr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním sekvencie SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) alebo s jej časťou. Molekulou nukleovej kyseliny, ktorá je komplementárna s jednou z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu, je práve tá, ktorá je dostatočne komplementárna s jednou z nukleotidových sekvencií v Sekvenčnom zázname (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO:), takže sa môže hybridizovať s jednou z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu, v dôsledku toho sa vytvára stabilný duplex.

V ešte inom výhodnom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej asi na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 % alebo 70 %, a výhodnejšie najmenej asi na 71 %,72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, 93 %, 94 % a dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 95%, 96%, 97%, 98%, 99% alebo viac homológna s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) alebo jej časťou. Intervaly alebo identita medziľahlých hodnôt s vyššie uvedenými intervalmi (napr.na 70-90% identické alebo na 80-95 % identické) patria tiež do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, intervaly hodnôt identity využívajúce kombináciu akýchkoľvek vyššie uvedených hodnôt ako horné a/alebo dolné hranice taktiež patria do rozsahu vynálezu. V ďalšom výhodnom uskutočnení obsahuje molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu nukleotidovú sekvenciu, ktorá sa hybridizuje, napr. sa hybridizuje v stringentných podmienkach, s jednou nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, alebo jej časťou.

Okrem toho, molekula nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu môže obsahovať len časť kódujúcej oblasti sekvencie jednej z nepárne očíslovaných sekvencii SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, napríklad fragment, ktorý sa môže použiť ako sonda alebo primér, alebo fragment kódujúci biologicky aktívnu časť SMP proteínu. Nukleotidové sekvencie určené z klonovania SMP génov z C. glutamicum umožňujú vytváranie sond a primérov určených na použitie pri identifikácii a/alebo klonovaní SMP homológov v iných typoch buniek a organizmov, a tiež SMP homológov z iných Corynebactería alebo príbuzných druhov. Sonda/primér typicky obsahuje v podstate purifikovaný oligonukleotid. Oligonukleotid typicky obsahuje oblasť nukleotidovej sekvencie, ktorá sa hybridizuje v stringentných podmienkach najmenej asi s 12, výhodne asi s 25, výhodnejšie asi so 40, 50 alebo 75 po sebe idúcimi nukleotidmi zmysluplného (sense) vlákna jednej z nukleotidových sekvencii podľa tohto vynálezu (napr. jednej zo sekvencii s nepárnym očíslovaním SEQ ID, NO v Sekvenčnom zázname), nezmyselnú sekvenciu jednej z týchto sekvencii, alebo ich prirodzene sa vyskytujúce mutanty. Priméry založené na nukleotidovej sekvencii podľa tohto vynálezu sa môžu použiť pri PCR reakciách na klonovanie SMP homológov. Sondy založené na SMP nukleotidových sekvenciách sa môžu použiť na detekciu transkriptov alebo genómových sekvencii kódujúcich tie isté alebo homológne proteíny. Vo výhodných uskutočneniach, sonda ďalej obsahuje k nej pripojenú značkovú skupinu, napr. značkovou skupinou môže byť rádioizotop, fluorescenčná zlúčenina, enzým alebo enzýmový kofaktor. Takéto sondy môžu byť súčasťou diagnostického testovacieho kitu na identifikáciu buniek, ktoré chybne exprimujú SMP proteín, napríklad meraním hladiny SMP-kódujúcej nukleovej kyseliny vo vzorke buniek, napr. detegovaním SMP mRNA hladín alebo stanovením, či genómový SMP gén mutoval alebo deletoval.

V jednom uskutočnení molekula nukleovej kyseliny, podľa tohto vynálezu, kóduje proteín, alebo jeho časť, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr.sekvenciou s párnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname), takže proteín alebo jeho časť si zachováva schopnosť fungovať v metabolizme uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov alebo vytvárať energetické molekuly (napr. ATP) prostredníctvom procesov ako je oxidačná fosforylácia v Corynebacterium glutamicum. Tak ako sa používa v tomto dokumente, spojenie „dostatočne homológny“ odkazuje na proteíny alebo ich časti, ktoré majú aminokyselinové sekvencie, ktoré obsahujú minimálny počet identických alebo ekvivalentných (napr. aminokyselinový zvyšok, ktorý má podobný bočný reťazec s aminokyselinovým zvyškom v sekvencií jednej z párne očíslovaných SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) aminokyselinových zvyškov k aminokyselinovej sekvencií podľa tohto vynálezu, takže proteín alebo jeho časť je schopný fungovať v metabolizme uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov, alebo vytvárať energetické molekuly (napr. ATP) prostredníctvom procesov ako je oxidačná fosforylácia v Corynebacterium glutamicum. Proteínové členy takýchto sacharidových metabolických dráh alebo systémy, ktoré produkujú energiu, ako sa opisuje v tomto dokumente, môžu mať svoju funkciu pri produkcii alebo sekrécii jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií. Príklady takýchto aktivít sa tiež opisujú v tomto dokumente. Takto „funkcia SMP proteínu“ prispieva buď priamo alebo nepriamo k výťažku, produkcii a/alebo účinnosti produkcie jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií. Príklady SMP proteínových aktivít sú uvedené v tabuľke 1.

V inom uskutočnení je proteín najmenej asi na 50-60 %, výhodne najmenej asi na 60-70 % a výhodnejšie najmenej asi na 70-80 %, 80-90 %, 90-95 % a najvýhodnejšie najmenej asi na 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. s párne očíslovanou sekvenciou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname).

Časťami proteínov kódovaných molekulami SMP nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu sú predovšetkým biologicky aktívne časti jedného z SMP proteínov. Ako sa používa v tomto dokumente, slovné spojenie „biologicky aktívna časť SMP proteínu“, mieni sa tým časť, napr.doména/motív SMP proteínu, ktorá sa podieľa na metabolizme uhlíkatých zlúčenín ako napríklad sacharidov alebo na dráhach vytvárajúcich energiu v C. glutamicum alebo má aktivity, ktoré sú uvedené v tabuľke 1. Aby sa stanovilo, či sa SMP proteín alebo jeho biologicky aktívna časť môže podieľať na metabolizme uhlíkatých zlúčenín alebo na produkcii vysokoenergetických molekúl v C. glutamicum, je možné uskutočniť skúšku enzýmovej aktivity. Takéto skúšobné metódy sú dobre známe odborníkom, ktorí pracujú v danej oblasti techniky, ako sa to podrobne opisuje v príklade 8 v časti príklady uskutočnenia vynálezu.

Ďalšie fragmenty nukleovej kyseliny kódujúce biologicky aktívne časti SMP proteínu sa môžu pripraviť izoláciou časti jednej z aminokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencie s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), expresiou kódovanej časti SMP proteínu alebo peptidu (napr. pomocou rekombinantnej expresie in vitro) a stanovením aktivity kódovanej časti SMP proteínu alebo peptidu.

Vynález ďalej zahrňuje molekuly nukleových kyselín, ktoré sa odlišujú od jednej z nukleotidových sekvencií podľa tohto vynálezu (näpr. sekvencie s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) (a jej častí) v dôsledku degenerácie genetického kódu, a tak kódujú rovnaký SMP proteín ako ten, ktorý kódujú nukleotidové sekvencie opísané vo vynáleze. V inom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, má nukleotidovú sekvenciu kódujúcu proteín, ktorého aminokyselinová sekvencia sa uvádza v Sekvenčnom zázname (napr. s párne očíslovanou SEQ ID NO:). V ešte ďalšom uskutočnení, kóduje molekula nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu celú dĺžku C. glutamicum proteínu, ktorý je v podstate homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, (ktorá je kódovaná otvoreným systémom čítania prislúchajúcou SEQ ID NO: uvedenou s nepárnym očíslovaním v Sekvenčnom zázname).

Odborník, ktorý je skúsený v danej oblasti, si bude vedomý toho, že v jednom uskutočnení, sekvencie podľa tohto vynálezu nie sú mienené tak, aby zahrňovali sekvencie známe z doterajšieho stavu techniky, t.j. sekvencie z Genbanky uvedené v tabuľkách 2 a 4, ktoré boli k dispozícii pred týmto vynálezom. V jednom uskutočnení vynález zahrňuje nukleotidové a aminokyselinové sekvencie, ktoré majú percento identity s nukleotidovou alebo aminokyselinovou sekvenciou podľa vynálezu väčšie, v porovnaní s doteraz známou sekvencou v danej oblasti techniky (napr. Genbanková sekvencia (alebo proteín kódovaný takouto sekvenciou) uvedenou v tabuľkách 2 alebo 4). Napríklad vynález zahrňuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je viac ako a/alebo najmenej na 58% identická s nukleotidovou sekvenciou označenou RXA00014 (SEQ ID NO: 41), nukleotidovú sekvenciu, ktorá je viac ako a/alebo najmenej na% identická s nukleotidovou sekvenciou označenou RXA00195 (SEQ ID NO: 399) a nukleotidovú sekvenciu, ktorá je viac ako a a/alebo najmenej na 42 % identická s nukleotidovou sekvenciou označenou RXA00196 (SEQ ID NO: 401). Odborník v danej oblasti techniky by bol schopný vypočítať dolný prah percenta identity pre akúkoľvek danú sekvenciu podľa vynálezu pomocou skúšania skóre GAPvypočítaného percenta identity uvedeného v tabuľke 4 pre každý z troch najlepších aktívnych záznamov pre danú sekvenciu a to odpočítaním najvyššieho GAPvypočítaného percenta identity od 100 %. Odborník v danej oblasti techniky si bude tiež vedomý, že sekvencie nukleových kyselín a aminokyselín, ktoré majú percento identity väčšie ako takto vypočítaný dolný prah (napr. sú najmenej na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69 % alebo 70%, výhodnejšie najmenej asi na 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % alebo 90% alebo 91 %, 92%, 93%, 94% a dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac identické) sú tiež zahrnuté do vynálezu

Okrem C. glutamicum SMP nukleotidových sekvencií uvedených v Sekvenčnom zázname s nepárne očíslovanými SEQ ID NO, môžu odborníci skúsení v danej oblasti techniky usúdiť, že v rámci populácie sa môžu vyskytovať DNA sekvenčné polymorfizmy, ktoré vedú k zmenám v aminokyselinových sekvenciách SMP proteínov (napr. C. glutamicum populácie). Takýto genetický polymorfizmus v SMP géne môže existovať medzi jedincami v rámci populácie v dôsledku prirodzenej variácie. Ak sa používajú v tomto dokumente pojmy „gén“ a „rekombinantný gén“, tieto sa vzťahujú na molekuly nukleovej kyseliny, ktoré otvoreným systémom čítania kódujú SMP proteín, výhodne C. glutamicum SMP proteín. Takéto prirodzené variácie môžu typicky spôsobovať 1-5% variáciu nukleotidovej sekvencie SMP génu. Ktorékoľvek a všetky takéto nukleotidové variácie a následné aminokyselinové polymorfizmy v SMP, ktoré vyplývajú z prirodzenej variácie a také, ktoré nemenia funkčnú aktivitu SMP proteínov, sú zahrnuté do rozsahu tohto vynálezu.

Molekuly nukleovej kyseliny zodpovedajúce prirodzeným variantom aneC. glutamicum homológom SMP DNA C. glutamicum podľa vynálezu sa môžu izolovať na základe ich homológie s C. glutamicum SMP nukleovou kyselinou opísanou v tomto dokumente použitím C. glutamicum DNA, alebo jej časti, ako hybridizačnej sondy podlá štandardných hybridizačných metodík v stringentných hybridizačných podmienkach. V súlade s uvedeným, vdálšom uskutočnení má molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu najmenej 15 nukleotidovú dĺžku a hybridizuje sa v stringentných podmienkach s molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu s nepárne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname. V dálších uskutočneniach má nukleová kyselina dĺžku najmenej 30, 50, 100, 250 alebo viac nukleotidov. Tak ako sa používa v tomto dokumente pojem „hybridizuje sa v stringentných podmienkach“, opisujú sa tým podmienky na hybridizáciu a premytie, pri ktorých sú nukleotidové sekvencie najmenej na 60% navzájom homológne a charakteristicky zostávajú navzájom hybridizované. Výhodne sú podmienky také, že sekvencie sú najmenej asi na 65 %, výhodnejšie najmenej asi na 70 % a dokonca najvýhodnejšie najmenej asi na 75 % alebo viac navzájom homológne a charakteristicky zostávajú navzájom hybridizované. Takéto stringentné podmienky sú známe skúseným odborníkom v danej oblasti techniky a dajú sa zistiť v Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Výhodným, nelimitujúcim príkladom stringentných hybridizačných podmienok sú hybridizácie v 6 X chloride sodnom/citráte sodnom (SSC) pri približne 45 °C s následným jedným alebo viacerými premytiami v 0,2 X SSC, 0,1 % SDS pri 50-65 °C. Výhodne sa molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, ktorá sa hybridizuje v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu zhoduje s prirodzene sa vyskytujúcou molekulou nukleovej kyseliny. Ak sa v tomto dokumente používa pojem „prirodzene sa vyskytujúca“ molekula nukleovej kyseliny, odkazuje sa tým na molekulu RNA alebo DNA, ktoré majú nukleotidovú sekvenciu vyskytujúcu sa v prírode (napr. kódujúcu prirodzene sa vyskytujúci proteín). V jednom uskutočnení, kóduje nukleová kyselina prirodzene sa vyskytujúci C. glutamicum SMP proteín.

Okrem prirodzene sa vyskytujúcich variantov SMP sekvencii, ktoré sa môžu vyskytovať v populácii, si odborník v danej oblasti techniky bude v ďalšom vedomý, že zmeny, ktoré sa môžu zaviesť do nukleotidovej sekvencie podľa tohto vynálezu mutáciou, vedú aj k zmenám v aminokyselinovej sekvencii kódovaného SMP proteínu, bez zmeny funkčnej schopnosti SMP proteínu. Napríklad, podľa tohto vynálezu sa môžu v nukleotidovej sekvencii uskutočniť nukleotidové substitúcie, ktoré vedú k aminokyselinovým substitúciám na „neesenciálnych“ aminokyselinových zvyškoch. „Neesenciálny“ aminokyselinový zvyšok je zvyšok, ktorý sa môže zmeneniť z „divého“ typu (wild-type) sekvencie jedného z SMP proteínov (napr. s párnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) bez zmenenia aktivity spomínaného SMP proteínu, kým „esenciálny aminokyselinový zvyšok sa vyžaduje na aktivitu SMP proteínu. Ďalšie aminokyselinové zvyšky, však (napr. tie, ktoré nie sú zachované alebo len polozachované v doméne s SMP aktivitou) nemôžu byť esenciálne pre aktivitu, a teda pravdepodobne podliehajú zmene bez zmenenia SMP aktivity.

Podľa toho sa vynález ďalej týka molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich SMP proteíny, ktoré obsahujú zmeny v aminokyselinových zvyškoch, ktoré nie sú esenciálne pre SMP aktivitu. Takéto SMP proteíny sa líšia aminokyselinovou sekvenciou od sekvencie s párnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname, pričom si ešte udržali najmenej jednu z SMP aktivít opísaných v tomto dokumente. V jednom uskutočnení, molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu najmenej asi na 50 % homológnu s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu a je schopný podieľať sa na metabolizme uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov, alebo na biosyntéze vysokoenergetických zlúčenín v C. glutamicum alebo má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1. Výhodne, proteín kódovaný molekulou nukleovej kyseliny je najmenej asi na 50-60 % homológny s aminokyselinovou sekvenciou jednej z nepárne očíslovaných sekvencii SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, výhodnejšie najmenej asi na 6070 % homológny s jednou z týchto sekvencii, dokonca ešte výhodnejšie najmenej asi na 70-80%, 80-90%, 90-95% homológny s jednou z týchto sekvencii a najvýhodnejšie najmenej asi na 96%, 97%, 98% alebo 99% homológny s jednou z aminokyselinových sekvencii podľa tohto vynálezu.

Aby sa stanovilo percento homológie dvoch aminokyselinových sekvencii (napr. jednej z aminokyselinových sekvencii podľa tohto vynálezu a jej mutantnej formy) alebo dvoch nukleových kyselín, sekvencie sa zoradili za účelom optimálnych porovnaní (napr. medzery (gaps) sa môžu zavádzať do sekvencie jedného proteínu alebo nukleovej kyseliny na optimálne zoradenie s ďalším proteínom alebo nukleovou kyselinou). Aminokyselinové zvyšky alebo nukleotidy v prislúchajúcich aminokyselinových pozíciách alebo nukleotidových pozíciách sa potom porovnajú. Keď je pozícia v jednej sekvencii (napr. jednej aminokyselinovej sekvencii podľa tohto vynálezu) obsadená tým istým aminokyselinovým zvyškom alebo nukleotidom ako prislúchajúca pozícia v inej sekvencii (napr. mutantnou formou aminokyselinovej sekvencie), tak molekuly sú homológne na túto pozíciu (t.j. ak sa v tomto dokumente používa spojenie aminokyselinová alebo nukleovokyselinová „homológia“, je to ekvivalentné aminokyselinovej alebo nukleovokyselinovej „identite“). Percento homológie medzi dvoma sekvenciami je funkciou počtu identických pozícií podieľajúcich sa na sekvenciách (t.j. % homológie= # identických pozícií / celkových # pozícií x 100).

Molekula izolovanej nukleovej kyseliny kódujúca SMP proteín homológny k proteínovej sekvencii podľa tohto vynálezu (napr. sekvencia s párne očíslovanou SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname) sa môže vytvárať zavedením jednej alebo viacerých nukleotidových substitúcií, adícií alebo delécii do nukleotidovej sekvencie podľa tohto vynálezu tak, že jedna alebo viac aminokyselinových substitúcií, adícií alebo delécii sa zavedú do kódovaného proteínu. Mutácie sa môžu zaviesť do jednej z nukleotidových sekvencii podľa tohto vynálezu pomocou takých štandardných metód, ako polohou usmernených mutagenéz a PCR sprostredkovaných mutagenéz. Výhodne sa uskutočnili konzervatívne aminokyselinové substitúcie na jednom alebo viacerých predikovaných neesenciálnych aminokyselinových zvyškoch. „Konzervatívna aminokyselinová substitúcia“ je taká, pri ktorej sa aminokyselinový zvyšok nahradí aminokyselinovým zvyškom, ktorý má podobný bočný reťazec. Rodiny aminokyselinových zvyškov, ktoré majú podobné bočné reťazce, sú definované v danej oblasti techniky. Do týchto rodín patria aminokyseliny so zásaditými bočnými reťazcami (napr. lyzín, arginín, histidín), s kyslými bočnými reťazcami (napr. kyselina asparágová, kyselina glutámová), polárnymi bočnými reťazcami bez náboja (napr. glycín, asparagín, glutamín, serín, treonín, tyrozín, cysteín), nepolárnymi bočnými reťazcami (napr. alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, fenylalanín, metionín, tryptofán), betarozvetvenými bočnými reťazcami (napr. treonín, valín, izoleucín) a aromatickými bočnými reťazcami (napr. tyrozín, fenylalanín, tryptofán, histidín). Takto predikovaný neesenciálny aminokyselinový zvyšok v SMP proteíne je výhodne nahradený s iným aminokyselinovým zvyškom z tej istej rodiny bočných reťazcov. Alternatívne, v inom uskutočnení sa mutácie môžu zavádzať náhodne, pozdĺž celej alebo pozdĺž časti SMP kódujúcej sekvencie, napríklad saturačnou mutagenézou a vytvorené mutanty sa môžu podrobiť skríningu na SMP aktivitu opísanú v tomto dokumente, aby sa identifikovali mutanty, ktoré si udržali SMP aktivitu. Následnou mutagenézou jednej z nepárne očíslovaných nukleotidových sekvencii SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname sa môže rekombinantne exprimovať kódovaný proteín a aktivita proteínu sa môže stanoviť, napríklad pomocou skúšok uvedených v tomto dokumente (pozri príklad 8 v časti príklady uskutočnenia vynálezu).

Okrem molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich SMP proteíny, ktoré sú opísané vyššie, sa vynález ďalej týka molekúl izolovanej nukleovej kyseliny, ktoré sú navyše nezmyselné. „Nezmyselná“ nukleová kyselina obsahuje nukleotidovú sekvenciu, ktorá je komplementárna k „zmysluplnej “nukleovej kyseline kódujúcej proteín, napr. komplementárna ku kódujúcemu vláknu dvojvláknovej DNA molekuly alebo komplementárna k mRNA sekvencii. Podľa toho sa nezmyselná nukleová kyselina môže viazať vodíkovou väzbou so zmysluplnou nukleovou kyselinou. Nezmyselná nukleová kyselina môže byť komplementárna k celému SMP kódujúcemu vláknu alebo len k jeho časti. V jednom uskutočnení je nezmyselná molekula nukleovej kyseliny nezmyselná ku „kódujúcej oblasti“ na kódujúcom vlákne nukleotidovej sekvencie kódujúcej SMP proteín. Pojem „kódujúca oblasť“ sa vzťahuje na oblasť nukleotidovej sekvencie obsahujúcej kodóny, ktoré sa translatujú na aminokyselinové zvyšky (napr. celá kódujúca oblasť SEQ ID NO 3 (RXA01626) zahrňuje nukleotidy 1 až 345). V inom uskutočnení, nezmyselná molekula nukleovej kyseliny je nezmyselná ku „nekódujúcej oblasti“ na kódovacom vlákne nukleotidovej sekvencie kódujúcej SMP. Pojem „nekódujúca oblasť“ sa vzťahuje na 5'- a 3'-sekvencie, ktoré lemujú kódujúcu oblasť, takže nie sú translatované na aminokyseliny (t.j. označované tiež ako 5'- a 3'- netranslatované oblasti).

Z uvedených sekvencií kódujúceho vlákna, ktoré kódujú SMP, opísaných v tomto dokumente (napr. sekvencie uvedené s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname), sa môžu navrhnúť nezmyselné nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu podľa pravidiel Watsonovho a Crickovho párovania báz. Nezmyselná molekula nukleovej kyseliny môže byť komplementárna k celej kódujúcej oblasti SMP mRNA, ale výhodnejšie je to oligonukleotid, ktorý je nezmyselný len k časti kódujúcej alebo nekódujúcej oblasti SMP mRNA. Napríklad, nezmyselný oligonukleotid môže byť komplementárny k oblasti obklopujúcej miesto štartu translácie SMP mRNA. Nezmyselný oligonukleotid môže mať napríklad dĺžku 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 alebo 50 nukleotidov. Nezmyselná nukleová kyselina podľa tohto vynálezu sa môže vytvoriť chemickou syntézou a enzýmovými ligačnými reakciami, pričom sa používajú postupy, ktoré sú známe v danej oblasti techniky. Napríklad, nezmyselná nukleová kyselina (napr. nezmyselný oligonukleotid) sa môže chemicky syntetizovať použitím prirodzene sa vyskytujúcich nukleotidov alebo rôzne modifikovaných nukleotidov určených na zvýšenie biologickej stability molekúl alebo na zvýšenie fyzikálnej stability duplexu vytvoreného medzi nezmyselnými a zmysluplnými nukleovými kyselinami, napr. sa môžu použiť fosforotionátové deriváty a akridínom substituované nukleotidy. Príklady modifikovaných nukleotidov, ktoré sa môžu použiť na vytváranie nezmyselnej nukleovej kyseliny, zahŕňajú 5-fluóruracil, 5-brómuracil, 5-chlóruracil, 5-jóduracil, hypoxantín, xantín, 4-acetylcytozín, 5-(karboxyhydroxýmetyl)uracil, 5karboxymetylaminometyl-2-tiouridín, 5-karboxymetylaminometyluracil, dihydrouracil, beta-D-galaktozylcheozín, inozín, N6-izopentenyladenín, 1-metylguanín, 1metylinozín, 2,2-dimetylguanín, 2-metyladenín, 2-metylguanín, 3-metylcytozín, 5metylcytozín, N6-adenín, 7-metylguanín, 5-metylaminometyluracil, 5metoxyaminometyl-2-tiouracil, beta-D-manozylcheozín, 5'-metoxy karboxymetyluracil, 5-metoxyuracil, 2-metyltio-N6-izopentenyladenín, kyselinu uracil-5-oxyoctovú (v), wybutoxozín, pseudouracil, cheozín, 2-tiocytozín, 5-metyl-2-tiouracil, 2-tiouracil,

4-tiouracil, 5-metyluracil, metylester kyseliny uracil-5-oxyoctovej, uracil-5-oxyoctovú kyselinu (v), 5-metyl-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-karboxypropyl)uracil, (acp3)w a 2,6-diaminopurín. Alternatívne sa nezmyselná nukleová kyselina môže vytvoriť biologicky použitím expresného vektora, do ktorého sa nukleová kyselina subklonovala v nezmyselnej orientácii (t.j. RNA transkribovaná z vloženej nukleovej kyseliny bude mať nezmyselnú orientáciu k danej cieľovej nukleovej kyseline, podrobnejšie opísanej v nasledujúcom odstavci).

Molekuly nezmyselnej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu sú typicky aplikované do bunky alebo sa vytvárajú in situ tak, že sa hybridizujú s alebo viažu na bunkovú mRNA a/alebo genómovú DNA kódujúcu SMP proteín, aby týmto spôsobom inhibovali expresiu proteínu, napr. inhibovaním transkripcie a/alebo translácie. Hybridizáciou sa môže bežnou nukleotidovou komplementaritou vytvoriť stabilný duplex, alebo napríklad v prípade nezmyselnej molekuly nukleovej kyseliny, ktorá sa viaže na DNA duplexy, a to prostredníctvom špecifických interakcií v hlavnej ryhe dvojitej skrutkovnice. Nezmyselná molekula sa môže modifikovať tak, že sa špecificky viaže na receptor alebo antigén exprimovaný na zvolenom povrchu bunky, napr. pripájaním nezmyselnej molekuly nukleovej kyseliny k peptidu alebo protilátke, ktorá sa viaže na povrchový receptor bunky alebo antigén. Molekula nezmyselnej nukleovej kyseliny sa môže tiež doručiť k bunkám použitím vektorov opísaných v tomto dokumente. Aby sa. dosiahli postačujúce intracelulárne koncentrácie nezmyselných molekúl, uprednostňujú sa také konštrukty vektora, v ktorých je molekula nezmyselnej nukleovej kyseliny regulovaná silným prokaryotickým, vírusovým alebo eukaryotickým promótorom.

V ešte inom uskutočnení, molekulou nezmyselnej nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu je α-anomérna molekula nukleovej kyseliny. α-Anomérna molekula nukleovej kyseliny vytvára špecifické dvojvláknové hybridy s komplementárnou RNA, v ktorých na rozdiel od obvyklých β-jednotiek, sú vlákna navzájom paralelné (Gaultier a kol., (1987) Nucleic Acids. fíes.15, 6625-6641). Nezmyselná molekula nukleovej kyseliny môže tiež obsahovať 2'-o-metylribonukleotid (Inoue a kol., (1987) Nucleic Acid Res. 15, 6131-6148) alebo chimérový analóg RNA-DNA (Inoue a kol., (1987) FEBS Lett. 215, 327-330).

V ešte ďalšom uskutočnení, nezmyselnou nukleovou kyselinou podľa tohto vynálezu je ribozým. Ribozýmy sú katalytické molekuly RNA s ribonukleázovou aktivitou, ktoré sú schopné štiepiť jednovláknovú nukleovú kyselinu ako mRNA, ku ktorej majú komplementárnu oblasť. Takto ribozýmy (napr. „kladivkovité“ ribozýmy (opísané vHaselhoff aGerlach (1988) Náture 334, 585-591)) sa môžu použiť na katalytické štiepenie SMP mRNA transkriptov, v dôsledku čoho sa inhibuje translácia SMP mRNA. Ribozým, ktorý má špecificitu pre SMP-kódujúcu nukleovú kyselinu sa môže navrhnúť na základe nukleotidovej sekvencie SMP cDNA molekuly uvedenej v tomto dokumente (t.j. SEQ ID NO: 3 (RXA01626)). Napríklad, derivát Tetrahymena L-19 IVS RNA sa môže skonštruovať tak, že má nukleotidovú sekvenciu aktívneho miesta komplementárnu s nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa má rozštiepiť v SMP-kódujúcej mRNA. Pozri, napr. Cech a kol., americký patentový spis US č. 4,987,071 a Cech a kol., americký patentový spis US č. 5,116,742. Alternatívne sa SMP mRNA môže použiť na selekciu katalytickej RNA, ktorá má špecifickú ribonukleázovú aktivitu zo zásoby RNA molekúl. Pozri, napr. Bartel, D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261.1411-1418.

Alternatívne sa expresia SMP génu môže inhibovať cieľovou nukleotidovou sekvenciou komplementárnou k regulačnej oblasti SMP nukleotidovej sekvencie (napr. SMP promótora a/alebo zosilňovačov), aby sa vytvorili trojité skrutkovnicové štruktúry, ktoré zamedzujú transkripciu SMP génu v cieľových bunkách. Pozri všeobecne, Helene C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6), 569-84; Helene, C. a kol., (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36; a Maher, L. J. (1992) Bioassays 14 (12). 807-15.

B. Rekombinantné expresné vektory a hostiteľské bunky

Vynález sa ďalej týka vektorov, výhodne expresných vektorov, ktoré obsahujú nukleovú kyselinu, ktorá kóduje SMP proteín (alebo jeho časť). Tak ako sa používa v tomto dokumente, pojem „vektor“ označuje molekulu nukleovej kyseliny, ktorá je schopná transportovať inú nukleovú kyselinu, ktorá bola k nej pripojená. Jedným typom vektorov je „plazmid“, ktorý označuje kruhovú dvojvláknovú DNA slučku, do ktorej sa môžu ligovať ďalšie segmenty DNA. Iným typom vektora je vírusový vektor, ktorým sa ďalšie DNA segmenty môžu ligovať do vírusového genómu. Určité vektory sú schopné autonómnej replikácie v hostiteľskej bunke, do ktorej sú zavedené (napr. bakteriálne vektory, ktoré majú bakteriálny pôvod replikácie aepizomálne vektory cicavcov). Ďalšie vektory (napr. neepizomálne vektory cicavcov) sú integrované do genómu hostiteľskej bunky tak, že sa zavedú do hostiteľskej bunky a týmto spôsobom sa replikujú súčasne s hostiteľským genómom. Okrem toho, určité vektory sú schopné riadiť expresiu génov, ku ktorým boli funkčne pripojené. Takéto vektory sa v tomto dokumente označujú ako „expresné vektory“. Vo všeobecnosti, expresné vektory využívané v rekombinantných DNA metódach sú často vo forme plazmidov. V uvedenej prihláške sa pojmy „plazmid“ a „vektor“ môžu zameniteľné používať, pretože plazmid je najbežnejšie používanou formou vektora. Ale vynález je mienený tak, že zahrňuje aj také formy expresných vektorov, ako vírusové vektory (napr. replikačné detektívne retrovírusy aadenovírusy a adenoasociované vírusy), ktoré majú ekvivalentné funkcie .

Rekombinantné expresné vektory podľa tohto vynálezu obsahujú nukleovú kyselinu podľa tohto vynálezu vo forme vhodnej na expresiu nukleovej kyseliny v hostiteľskej bunke, čo znamená, že rekombinantné expresné vektory obsahujú jednu alebo viac regulačných sekvencií, zvolených podľa hostiteľských buniek použitých na expresiu, ktoré sú funkčne pripojené k sekvencií nukleovej kyseliny, ktorá sa má exprimovať. V rámci rekombinantného expresného vektora, „funkčne pripojiť“ znamená, že nukleotidová sekvencia, ktorá je predmetom záujmu, sa pripojí k regulačnej sekvencií(iám) takým spôsobom, ktorý umožní expresiu nukleotidovej sekvencie (napr. v in vitro transkripčnom/translačnom systéme alebo v hostiteľskej bunke, ak je vektor zavedený do hostiteľskej bunky). Pojem „regulačná sekvencia“ zahrňuje promótory, zosilňovače a iné expresné riadiace prvky (napr. polyadenylačné signály). Takéto regulačné sekvencie sú opísané, napríklad vGoeddel; Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulačné sekvencie zahŕňajú tie, któré riadia konštitutívnu expresiu nukleotidovej sekvencie v mnohých typoch hostiteľských buniek a tie, ktoré riadia expresiu nukleotidovej sekvencie len v určitých hostiteľských bunkách. Výhodné regulačné sekvencie sú, napríklad také promótory, ako cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet, Ipp-, lac-, Ιρρ-lac-, lací^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SPO2, X-P_R' alebo X-P_L, ktoré sa používajú predovšetkým v baktériách. Ďalšími regulačnými sekvenciami sú, napríklad, promótory z kvasiniek a húb ako ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, promótory z rastlín ako CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos alebo ubikvitínové alebo fazeolínové promótory. Tiež je možné použiť syntetické promótory. Odborník skúsený v danej oblasti techniky si bude vedomý toho, že konštrukcia expresného vektora môže závisieť na takých faktoroch, akými je výber hostiteľskej bunky, ktorá sa má transformovať, na úrovni expresie požadovaného proteínu, a pod. Expresné vektory podlá tohto vynálezu sa môžu zavádzať do hostiteľských buniek, v dôsledku čoho sa produkujú proteíny alebo peptidy, vrátane fúznych proteínov alebo peptidov kódovaných nukleovými kyselinami, ako sa opisuje v tomto dokumente (napr. SMP proteíny, mutantné formy SMP proteínov, fúzne proteíny a pod.).

Rekombinantné expresné vektory podľa tohto vynálezu sa môžu skonštruovať na expresiu SMP proteínov v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách. Napríklad, SMP gény sa môžu exprimovať v bakteriálnych bunkách, takých ako C. glutamicum, bunkách hmyzu (použitím baculovírusových expresných vektorov), kvasinkových a iných bunkách húb (pozri Romanos, M.A. a kol., (1992) „Foreign gene expression in yeast: a review“, Yeast 8, 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. a kol., (1991) „Heterologous gene expression in filamentous fungi“ v: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., str. 396-428: Academic Press: San Diego; a van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi“, v: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. a kol., eds., str. 1-28, Cambridge University Press, Cambridge), v riasach a v bunkách mnohobunkových rastlín (pozri Schmidt, R. and Willmitzer, Ľ. (1988) „High efficiency Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants“ Plánt Celí Rep., 583-586) alebo v bunkách cicavcov. O vhodných hostiteľských bunkách sa diskutuje dálej vGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternatívne, rekombinantný expresný vektor sa môže transkribovať a translatovať in vitro, napríklad použitím T7 promótorových regulačných sekvencii a T7 polymerázy.

Expresia proteínov v prokaryotoch sa najčastejšie uskutočňuje s vektormi obsahujúcimi konštitutívne alebo indukovateľné promótory, ktoré riadia expresiu buď fúznych alebo ne-fúznych proteínov. Fúzne vektory pridávajú mnoho aminokyselín ku kódovanému proteínu, obvykle kamino-koncu rekombinantného proteínu, ale tiež k C-koncu alebo sa fúzujú s vhodnými oblasťami v proteínoch.

Takéto fúzne vektory majú typicky tri funkcie: 1) zvyšujú expresiu rekombinantného proteínu; 2) zvyšujú rozpustnosť rekombinantného proteínu; a 3) pomáhajú purifikovať rekombinantný proteín tým, že majú funkciu ligandov pri afinitnej purifikácii. Často sa fúznymi expresnými vektormi zavádza proteolytické štiepne miesto na spojenie fúznej časti a rekombinantného proteínu, aby sa umožnila separácia rekombinantného proteínu z fúznej časti s následnou purifikáciou fúzneho proteínu. Takéto enzýmy a ich príbuzné rozpoznávacie sekvencie obsahujú Faktor Xa, trombín a enterokinázu.

Charakteristickými fúznymi expresnými vektormi sú pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40), ktoré fúzujú glutatión-S-transferázu (GST) k cieľovému rekombinantnému proteínu, pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA), ktoré fúzujú maltózu E-viažuci proteín k cieľovému rekombinantnému proteínu apRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), ktoré fúzujú proteín A k cieľovému rekombinantnému proteínu. V jednom uskutočnení je sekvencia, ktorá kóduje SMP proteín klonovaná do pGEX expresného vektora, aby sa vytvoril vektor, kódujúci fúzny proteín, ktorý má od N-konca k C-koncu začlenený proteín GST-trombínového štiepneho miesta-X. Fúzny proteín sa môže purifikovať pomocou afinitnej chromatografie za použitia glutatiónagarózovej živice. Rekombinantný SMP proteín. ktorý nebol fúziou pripojený na GST sa môže získať štiepením fúzneho proteínu s trombínom.

Príkladmi vhodných induktívnych ne-fúznych E. coli expresných vektorov sú: pTrc (Amann a kol., (1988) Gene 69, 301-315) pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN III113-B1, λ gt11, pBdC1 a pET 11 d (Studier a kol., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; a Pouwels a kol., (1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018). Cielená génová expresia z pTrc vektora sa zakladá na hostiteľskej RNA polymerázovej transkripcii z hybridného trp-lac fúzneho promótora. Cielená génová expresia z pET 11 d vektora sa zakladá na transkripcii z T7 gn10-lac fúzneho promótora sprostredkovanej pomocou koexpresie s vírusovou RNA polymerázou (T7 gn1). Táto vírusová polymeráza je poskytovaná hostiteľskými kmeňmi BL21 (DE3) alebo HMS174(DE3) z rezidentného Xprofágu prechovávajúceho T7 gn1 gén pod transkripčnou reguláciou lacUV 5 promótora. Na transformáciu ďalších druhov baktérií sa môžu vybrať vhodné vektory. Napríklad plazmidy plJ101, plJ364, plL702 a pl J361 sa úspešne používajú na transformovanie Streptomyces, zatiaľ čo plazmidy pUB110, pC194 alebo pBD214 sú vhodné na transformáciu Bacillus druhov. Niekoľko plazmidov sa používa pri prenose genetickej informácie do Corynebacterium, a to pHM1519, pBĽI, pSA77 alebo pAJ667 (Pouwels a kol., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018).

Jednou stratégiou na maximalizáciu rekombinantnej proteínovej expresie je expresia proteínu v hostiteľskej baktérii s oslabenou schopnosťou proteolytického štiepenia rekombinantného proteínu (Gottesman.S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119128). Ďalšou stratégiou je meniť nukleovokyselinovú sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá sa má vložiť do expresného vektora tak, že individuálne kodóny pre každú aminokyselinu sú tie, ktoré sa prednostne využívajú v baktérii vybratej na expresiu, napríklad ako C. glutamicum (Wada a kol., (1992) Nucleic Acids Res. 20, 21 lížu 8). Takáto zmena nukleovokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu sa môže uskutočniť pomocou štandardných metód syntézy DNA.

V ďalšom uskutočnení je SMP proteínovým expresným vektorom kvasinkový expresný vektor. Príkladmi vektorov na expresiu v kvasinkách S. cerevisiae sú: pYepSed (Baldari a kol., (1987) Embo J. 6, 229-234), 2 μ, pAG-1, Yep6, Yep13, pEMBLYYe23, pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Celí 30, 933-943), pJRY88 (Schultz a kol., (1987) Gene 54, 113-123) apYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektory a metódy na konštrukciu vektorov vhodných na použitie v ďalších hubách, takých ako vláknitých hubách, sú detailne zhrnuté vo: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi“, v: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy a kol., eds., str. 1-28, Cambridge University Press, Cambridge, a Pouwels a kol., eds.(1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York (IBSN 0 444 904018).

Alternatívne sa SMP proteíny podľa tohto vynálezu môžu exprimovať v bunkách hmyzu použitím baculovírusových expresných vektorov. Baculovírusové vektory dostupné na expresiu proteínov pri kultivovácii buniek hmyzu (napr. buniek Sf9) zahrňujú pAc série (Smith a kol., (1983) Mol. Celí Biol. 3, 2156-2165) a pVL série (Lucklow and Summers (1989) Virology 170, 31-39).

V inom uskutočnení sa SMP proteíny podľa tohto vynálezu môžu exprimovať v bunkách jednobunkových rastlín (napríklad v riasach) alebo v rastlinných bunkách vyšších rastlín (napr. spermatofytoch ako napríklad poľnohospodárskych plodín). Príklady rastlinných expresných vektorov sú detailne zhrnuté v: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) „New plánt binary vectors with selectable markers located proximal to the left border Plánt Mol. Biol. 20, 11951197; aBevan, M.W. (1984) „Binary Agrobacterium vectors for plánt transformation“, Nucl. Acid. Pes. 12, 8711-8721 a zahŕňajú pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 a pDH51 (Pouwels a kol., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier, New York IBSN 0 444 904018).

Veste inom uskutočnení sa nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu exprimujú v bunkách cicavcov použitím expresného vektora cicavcov. Príkladmi expresných vektorov cicavcov sú pCDM8 (Seed, B.(1987) Náture 329-840) apMT2PC (Kaufman a kol., (1987) EMBO J. 6, 187-195). Ak sa použijú bunky cicavcov, tak regulačné funkcie expresných vektorov často plnia vírusové regulačné elementy. Napríklad, bežne používané promótory sa často odvodzujú od polyoma, Adenovirusu 2, cytomegalovirusu aSimian Virusu 40. Ďalšie vhodné expresné systémy, tak pre prokaryotické ako aj eukaryotické bunky, sa uvádzajú v kapitole 16 a 17 v Sambrook, J., Fritsh. E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

V ďalšom uskutočnení je rekomblnantný expresný vektor cicavcov schopný riadiť expresiu nukleovej kyseliny prednostne v špecifickom type bunky (napr. na expresiu nukleovej kyseliny sa používajú tkanivovo-špecifické regulačné elementy). Tkanivovo-špecifické regulačné elementy sú známe v danej oblasti techniky. Nelimitujúcimi príkladmi vhodných tkanivovo-špecifických promótorov sú: albumínový promótor (pečeňovo-špecifický; Pinkert a kol., (1987) Genes Dev. 1, 268-277), lymfoid-špecifické promótory (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43, 235-275), predovšetkým promótory v receptoroch T buniek (Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8, 729-733) a imunoglobulíny (Banerji a kol., (1983) Celí 33, 729-740; Queen and Baltimore (1983) Celí 33, 741-748), neurón-špecifické promótory (napr. neurofilament-promótor; Byme and Ruddle (1989) PNAS 86, 5473-5477), pankreas-špecifické promótory; (Edlund a kol., (1985) Science 230.

912-916) a špecifické promótory mliečnej žľazy cicavcov (napr. promótor mliečnej srvátky; americký patentový spis č. US 4,873,316 a publikovaná európska prihláška č. 264 166). Vývojovo-regulované promótory sú tiež zahrnuté, napríklad myšacie hox promótory (Kessel a Gruss, (1990) Science 249, 374-379) a a-fetoproteínový promótor (Campes a Tilghman, (1989) Genes Dev. 3, 537-546).

Vynález v ďalšom poskytuje rekombinantný expresný vektor obsahujúci molekulu DNA podľa tohto vynálezu klonovanú do expresného vektora v nezmyselnej orientácii. Znamená to, že molekula DNA je funkčne pripojená k regulačnej sekvencii takým spôsobom, ktorý umožňuje expresiu (pomocou transkripcie molekuly DNA) molekuly RNA, ktorá je nezmyselná k SMP mRNA. Regulačné sekvencie funkčne spojené s nukleovou kyselinou klonovanou v nezmyselnej orientácii sa môžu vybrať také, aby riadili kontinuálnu expresiu nezmyselnej molekuly RNA v rôznych typoch buniek, napríklad vírusové promótory a/alebo zosilňovače, alebo regulačné sekvencie sa môžu zvoliť tak, aby riadili konštitutívnu, tkanivovo-špecifickú alebo podľa typu bunky špecifickú expresiu nezmyselnej RNA. Nezmyselný expresný vektor môže mať formu rekombinantného plazmidu, fágomidu alebo zoslabeného vírusu, v ktorom sa nezmyselná nukleová kyselina produkuje pod kontrolou vysoko účinnej regulačnej oblasti, aktivita ktorej sa môže stanoviť pomocou typu bunky, do ktorej je vektor zavedený. Podrobnejšie informácie o regulácii génovej expresie použitím nezmyselných génov, pozri Weintraub, H. a kol., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1), (1986).

Vynález sa ďalej týka hostiteľských buniek, do ktorých sa zaviedol rekombinantný expresný vektor podľa tohto vynálezu. Pojem „hostiteľská bunka“ a „rekombinantná hostiteľská bunka“ sa používa navzájom zameniteľné v tomto dokumente. Rozumie sa, že takéto pojmy označujú nielen príslušný subjekt bunky, ale aj progén alebo potenciálny progén takejto bunky. Pretože určité modifikácie sa môžu vyskytnúť v nasledujúcich generáciách v dôsledku buď mutácie alebo vplyvov prostredia, takýto progén nemôže byť v skutočnosti identický s rodičovskou bunkou, ale ešte stále je zahrnutý do rozsahu pojmu ako sa používa v tomto dokumente.

Hostiteľskou bunkou môže byť akákoľvek prokaryotická alebo eukaryotická bunka. Napríklad, SMP proteín sa môže exprimovať v baktériových bunkách, takých ako C. glutamicum, bunkách hmyzu, kvasinkách alebo bunkách cicavcov (takých ako ovariálnych bunkách čínskeho škrečka (Chinese hamster ovary, CHO) alebo COS bunkách). Ďalšie vhodné hostiteľské bunky sú známe odborníkom v danej oblasti techniky. Mikroorganizmy príbuzné ku Corynebacteríum glutamicum, ktoré sa môžu obyčajne používať ako hostiteľské bunky pre nukleovú kyselinu a molekuly proteínov podľa tohto vynálezu, sú uvedené v tabuľke 3.

Vektor DNA sa môže zaviesť do prokaryotických a eukaryotických buniek prostredníctvom bežných transformačných a transfekčných metodík. Tak ako sa používa v tomto dokumente, pojmy „transformácia a „transfekcia“, „konjugácia“ a „transdukcia“ sú mienené tak, že odkazujú na rôzne, v danej oblasti techniky známe, metódy na zavádzanie cudzej nukleovej kyseliny (napr. lineárnej DNA alebo RNA (napr. linearizovaný vektor alebo samotný génový konštrukt bez vektora) alebo nukleovej kyseliny vo forme vektora (napr. plazmidu, fágu, „fazmidu“, „fagemidu“, transpozónu alebo inej DNA) do hostiteľskej bunky, vrátane koprecipitácie s fosforečnanom vápenatým alebo chloridom vápenatým, DEAEdextránovo sprostredkovanej transfekcie, lipofekcie, prirodzenej spôsobilosti, chemicky sprostredkovaného transferu alebo elektroporácie. Vhodné metódy na transformovanie alebo transfekovanie hostiteľských buniek sa dajú nájsť v Sambrook, a kol., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) a ďalších laboratórnych príručkách.

Pri stabilnej transfekcii buniek cicavcov, ako je známe, v závislosti na expresnom vektore a použitej transfekčnej metodike, len malá frakcia buniek môže integrovať cudziu DNA do svojho genómu. Za účelom identifikácie a selekcie týchto integrácií sa gén, ktorý kóduje selekčný markér (napr. rezistenciu na antibiotiká) bežne zavádza do hostiteľských buniek spolu s génom, ktorý je predmetom záujmu. Výhodné markéry selekcie sú tie, ktoré prepožičiavajú rezistenciu na liečivá, také ako G418, hygromycín ametotrexát. Nukleová kyselina kódujúca selekčný markér sa môže zaviesť do hostiteľskej bunky na tom istom vektore, ktorý kóduje SMP proteín alebo sa môže zaviesť na separátnom vektore. Bunky stabilne transfekované so zavedenou nukleovou kyselinou sa dajú identifikovať napríklad selekciou liečiva (napr. bunky, ktoré inkorporovali selekčný markérový gén prežijú, kým ostatné bunky odumrú).

Za účelom vytvorenia homológneho rekombinantného mikroorganizmu sa pripraví vektor, ktorý obsahuje aspoň časť SMP génu, do ktorého sa zaviedla delécia, adícia alebo substitúcia, aby sa týmto spôsobom zmenil, napr. funkčne rozrušil, SMP gén. Výhodne, týmto SMP génom je Corynebacterium glutamicum SMP gén, ale týmto môže byť homológ z príbuznej baktérie alebo dokonca zo zdrojov z cicavcov, kvasiniek alebo hmyzu. Vo výhodnom uskutočnení, je vektor skonštruovaný tak, že homológnou rekombináciou je endogénny SMP gén funkčne narušený (t.j. už ďalej nekóduje funkčný proteín; tiež označený ako „knock out“ vektor). Alternatívne, vektor môže byť skonštruovaný tiež tak, že na základe homológnej rekombinácie sa endogénny SMP gén zmutuje alebo sa ináč zmení, ale ešte stále kóduje funkčný proteín (napr. protismerná regulačná oblasť sa môže zmeniť tak, že sa zmení expresia endogénneho SMP proteínu). V homológnom rekombinantnom vektore, zmenená časť SMP génu lemuje jeho 5'- a 3'- konce pomocou dodatkovej nukleovej kyseliny SMP génu, čo umožní homológnu rekombináciu medzi exogénnym SMP génom prenášaným prostredníctvom vektora a endogénnym SMP génom v mikroorganizme. Dodatková lemujúca SMP nukleová kyselina má dostatočnú dĺžku na úspešnú homológnu rekombináciu s endogénnym génom. Charakteristicky, niekoľko kilobáz lemujúcej DNA (na oboch 5'- a 3'koncoch) je zahrnutých do vektora (pozri opis homológnych rekombinantných vektorov napr. Thomas, K. R., a Capecchi, M.R. (1987) Celí 51, 503 ). Vektor sa zavádza do mikroorganizmu (napr. pomocou elektroporácie) a bunky, v ktorých sa zavedený SMP gén homológne rekombinoval s endogénnym SMP génom sa rozdeľujú pomocou metód známych v danej oblasti techniky.

V ďalšom uskutočnení sa môžu produkovať rekombinantné mikroorganizmy, ktoré obsahujú zvolené systémy, ktoré umožňujú regulovanú expresiu zavedeného génu. Napríklad, inklúzia SMP génu na vektor, umiestnený tak, že je regulovaný lac operónom, umožňuje expresiu SMP génu len v prítomnosti IPTG. Takéto regulačné systémy sú dobre známe v danej oblasti techniky.

V ďalšom uskutočnení je endogénny SMP gén v hostiteľskej bunke narušený (napr. homológnou rekombináciou alebo ďalšími genetickými spôsobmi známymi v danej oblasti techniky) tak, že expresia jeho proteínového produktu nenastane. V ďalšom uskutočnení sa endogénny alebo zavedený SMP gén v hostiteľskej bunke zmenil jednou alebo viacerými bodovými mutáciami, deléciami alebo inverziami, ale stále ešte kóduje funkčný SMP proteín. V ešte ďalšom uskutočnení sa jedna alebo viac regulačných oblastí (napr. promótor, represor alebo induktor) SMP génu v mikroorganizme zmenili (napr. deléciou, trunkáciou, inverziou alebo bodovou mutáciou) tak, že expresia SMP génu je modulovaná. Odborník v danej oblasti techniky si bude vedomý, že hostiteľské bunky, obsahujúce viac ako jednu z opísaných SMP génových a proteínových modifikácií sa dajú ľahko produkovať s použitím spôsobov podľa tohto vynálezu a sú zahrnuté do rozsahu predloženého vynálezu.

Hostiteľská bunka podľa tohto vynálezu, taká ako prokaryotická alebo eukaryotická hostiteľská bunka, sa môže použiť na kultiváciu, aby sa produkoval (t.j. exprimoval) SMP proteín. V súlade s uvedeným, vynález v ďalšom poskytuje spôsoby produkcie SMP proteínov s použitím hostiteľských buniek podľa tohto vynálezu. V jednom uskutočnení, spôsob pozostáva z pestovania hostiteľskej bunky podľa tohto vynálezu, (do ktorej sa zaviedol rekombinantný expresný vektor kódujúci SMP proteín, alebo do genómu ktorej sa zaviedol gén, kódujúci „divý“ typ alebo zmenený SMP proteín) vo vhodnom médiu, až kým sa produkuje SMP proteín. V ďalšom uskutočnení sa spôsob ďalej týka izolácie SMP proteínov z média alebo z hostiteľskej bunky.

C. Izolované SMP proteíny

Vynález sa ďalej týka izolovaných SMP proteínov a ich biologicky aktívnych častí. „Izolovaný alebo „purifikovaný“ proteín, alebo jeho biologicky aktívna časť, je v podstate bez bunkového materiálu vtedy, ak bol produkovaný rekombinantnými DNA metódami, alebo bez chemických prekurzorov alebo iných chemických látok vtedy, ak bol syntetizovaný chemicky. Pojem „v podstate bez bunkového materiálu“ označuje preparáty SMP proteínu, v ktorých sa proteín oddelil od celulárnych zložiek buniek, v ktorých sa prirodzene alebo pomocou rekombinácie produkuje. V jednom uskutočnení, pojem „v podstate bez celulárneho materiálu“ označuje preparáty SMP proteínu, ktoré majú menej ako asi 30 % (v sušine) ne-SMP proteínu (tiež označené v tomto dokumente ako „kontaminujúci proteín“), výhodnejšie menej ako asi 20 % ne-SMP proteínu, ešte výhodnejšie menej ako asi 10 % ne-SMP proteínu a najvýhodnejšie menej ako asi 5 % ne-SMP proteínu. Ak sa SMP proteín alebo jeho biologicky aktívna časť produkuje rekombinantne, tiež je výhodne v podstate bez kultivačného média, t.j. kultivačné médium predstavuje menej ako asi 20 %, výhodnejšie menej ako asi 10 % a najvýhodnejšie menej ako asi 5 % objemu proteínového preparátu. Slovné spojenie, „v podstate bez chemických prekurzorov alebo iných chemických látok“ označuje preparáty SMP proteínu, v ktorých je proteín oddelený od chemických prekurzorov alebo iných chemických látok, ktoré sú zapojené do syntézy proteínu. V jednom uskutočnení, slovné spojenie „v podstate bez chemických prekurzorov alebo iných chemických látok” označuje preparáty SMP proteínu, ktoré majú menej ako asi 30 % (v sušine) chemických prekurzorov alebo ne-SMP chemických látok, výhodnejšie menej ako asi 20 % chemických prekurzorov alebo ne-SMP chemických látok, ešte výhodnejšie menej ako asi 10% chemických prekurzorov alebo ne-SMP chemických látok a najvýhodnejšie menej ako asi 5 % chemických prekurzorov alebo ne-SMP chemických látok. Vo výhodných uskutočneniach izolované proteíny alebo ich biologicky aktívne časti neobsahujú kontaminujúce proteíny z toho istého organizmu, z ktorého bol SMP proteín odvodený. Charakteristicky sa takéto proteíny produkujú rekombinantnou expresiou, napríklad C. glutamicum SMP proteín v takom mikroorganizme, ako je C. glutamicum.

Izolovaný SMP proteín, alebo jeho časť, podľa tohto vynálezu sa môže podieľať na metabolizme uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov, alebo na vytváraní energetických zlúčenín (napr. prostredníctvom oxidačnej fosforylácie), ktoré sa využívajú na pohon nevýhodných metabolických dráh, alebo má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1. Vo výhodných uskutočneniach má proteín alebo jeho časť, aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je dostatočne homológna s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), takže proteín alebo jeho časť si udržiava schopnosť fungovať v metabolizme uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov, alebo vytvárať energetické molekuly prostredníctvom takých procesov, ako je napríklad oxidačná fosforylácia v Corynebacterium glutamicum. Časť proteínu je výhodne biologicky aktívna časť, ako sa to uvádza v tomto dokumente. V ďalšom výhodnom uskutočnení má SMP proteín podľa tohto vynálezu aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená s párnym očíslovaním SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname. V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení má SMP proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou podlá tohto vynálezu (napr. sekvenciou s nepárne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname). V ešte inom výhodnom uskutočnení má SMP proteín aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je kódovaná nukleotidovou sekvenciou, ktorá je najmenej asi na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %,

I

67%, 68%, 69 % alebo 70 %, výhodnejšie najmenej asi na 71%, 72%, 73 %,74 %,75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, 93 %, 94 % a dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológna so sekvenciami nukleových kyselín podľa tohto vynálezu alebo s ich časťou. Rozsahy a medziľahlé hodnoty identity k vyššie uvedeným hodnotám (napr. na 70 až 90 % identické alebo na 80 až 95 % identitické) taktiež spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, rozsahy hodnôt identity využívajúce kombináciu z ktorýchkoľvek vyššie vymenovaných hodnôt ako horné a/alebo dolné medze sú taktiež zahrnuté. Výhodné SMP proteíny podľa predloženého vynálezu majú tiež výhodne najmenej jednu z SMP aktivít, ktoré sa opisujú v tomto dokumente. Napríklad, výhodný SMP proteín podľa predloženého vynálezu má aminokyselinovú sekvenciu kódovanú nukleotidovou sekvenciou, ktorá sa hybridizuje, napr. hybridizuje sa v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, a ktorá môže byť funkčne zapojená do metabolizmu uhlíkatých zlúčenín, ako napríklad sacharidov, alebo do vytvárania energetických molekúl (napr. ATP) prostredníctvom takých procesov ako je oxidačná fosforylácia v Corynebacterium glutamicum alebo má jednu alebo viac aktivít uvedených v tabuľke 1.

V iných uskutočneniach, SMP proteín je v podstate homológny s aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu (napr. sekvenciou s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) a uchováva si funkčnú aktivitu proteínu jednej z aminokyselinových sekvencii podľa tohto vynálezu, ale odlišuje sa od aminokyselinovej sekvencie, v dôsledku prirodzenej variácie alebo mutagenézy, ako sa to opisuje detailne v I. odstavci vyššie. Podľa toho, v inom uskutočnení, SMP proteínom je proteín, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je najmenej asi na 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % alebo 60 %, výhodne najmenej asi na 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %,

68%, 69% alebo 70%, výhodnejšie najmenej asi na 71 %,72%, 73%, 74%, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 % alebo 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 % alebo 90 % alebo 91 %, 92 %, 93 %, 94 % a dokonca výhodnejšie najmenej asi na 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % alebo viac homológna s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu, a ktorá má najmenej jednu z SMP aktivít opísaných v tomto dokumente. Rozsahy a medziľahlé hodnoty identity k vyššie uvedeným hodnotám (napr. na 70-90 % identitické alebo na 8095 % identitické) taktiež spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. Napríklad, rozsahy hodnôt identity využívajúce kombináciu ktorýchkoľvek z vyššie vymenovaných hodnôt ako horné a/alebo dolné medze spadajú do rozsahu predloženého vynálezu. V ďalšom uskutočnení sa vynález týka celej dĺžky proteínu C. glutamicum, ktorý je v podstate homológny s celou aminokyselinovou sekvenciou podľa tohto vynálezu.

Biologicky aktívne časti SMP proteínu obsahujú peptidy, ktoré majú aminokyselinové sekvencie odvodené z aminokyselinovej sekvencie SMP proteínu, napr. aminokyselinovej sekvencie s párne očíslovanou SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname alebo aminokyselinovej sekvencie proteínu homológneho s SMP proteínom, ktorý obsahuje menej aminokyselín, než je celá dĺžka SMP proteínu, alebo celú dĺžku proteínu, ktorý je homológny s SMP proteínom, a vykazujú najmenej jednu aktivitu SMP proteínu. Typicky, biologicky aktívne časti (peptidy, napr. peptidy, ktoré sú napríklad 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 alebo viac aminokyselín dlhé) obsahujú doménu alebo motív s najmenej jednou aktivitou SMP proteínu. Okrem toho, ďalšie biologicky aktívne časti, v ktorých sú ďalšie oblasti proteínu deletované, sa môžu pripraviť pomocou rekombinantných metód a ohodnotiť na jednu alebo viac aktivít opísaných v tomto dokumente. Výhodne, biologicky aktívne časti SMP proteínu obsahujú jednu alebo viac vybraných domén/motívov alebo ich častí, ktoré majú biologickú aktivitu.

SMP proteíny sú výhodne produkované pomocou DNA rekombinantných metodík. Napríklad, molekula nukleovej kyseliny kódujúca proteín sa klonuje do expresného vektora (ako je opísané vyššie), expresný vektor sa zavedie do hostiteľskej bunky (ako je opísané vyššie) a SMP proteín sa exprimuje v hostiteľskej bunke. SMP proteín sa môže potom izolovať z buniek pomocou vhodných purifikačných postupov, a to použitím štandardných metód na purifikáciu proteínov. Alternatívne k rekombinantnej expresii sa SMP proteín, polypeptid, alebo peptid môžu syntetizovať chemicky použitím štandardných metód syntézy peptidov. Okrem toho, natívny SMP proteín sa môže izolovať z buniek (napr. endotelových buniek), napríklad použitím anti-SMP protilátky, ktorá sa môže produkovať pomocou štandardných metód využívajúcich SMP proteín alebo jeho fragment, podľa tohto vynálezu.

Vynález tiež poskytuje chimérové alebo fúzne proteíny. Tak ako sa používa v tomto dokumente, SMP „chimérový proteín alebo „fúzny proteín“ zahrňuje SMP polypeptid, ktorý je účinne spojený s ne-SMP polypeptidom. „SMP polypeptid“ označuje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia sa zhoduje s SMP proteínom, zatiaľ čo „ne-SMP polypeptid“ označuje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia zodpovedá proteínu, ktorý v podstate nie je homológny s SMP proteínom, napr. proteínu, ktorý sa odlišuje od SMP proteínu, a ktorý je odvodený z toho istého organizmu alebo odlišného organizmu. V rámci fúzneho proteínu sa chce pojmom „účinne spojený“ vyjadriť, že SMP polypeptid a ne-SMP polypeptid sa vzájomne fúziou „in frame“ spoja. Ne-SMP-polypeptid sa môže spojiť fúziou s N-koncom alebo C-koncom SMP polypeptidu. Napríklad v jednom uskutočnení fúznym proteínom je GST-SMP fúzny proteín, v ktorom SMP sekvencie sa fúziou spojili s C-koncovými GST sekvenciami. Takéto fúzne proteíny môžu uľahčiť purifikáciu rekombinantných SMP proteínov. V ďalšom uskutočnení, fúznym proteínom je SMP proteín obsahujúci heterológnu signálnu sekvenciu na svojom N-konci. V určitých hostiteľských bunkách (napr. hostiteľských bunkách cicavcov) sa expresia a/alebo sekrécia SMP proteínu môže zvýšiť prostredníctvom použitia heterológnej signálnej sekvencie.

Výhodne sa SMP chimérový alebo fúzny proteín podľa tohto vynálezu produkuje pomocou štandardných DNA rekombinantných metód. Napríklad, fragmenty DNA kódujúce rôzne polypeptidové sekvencie sa spolu ligujú „in frame“ podľa bežných metód, napríklad sa používajú tupé (zarovnané) (blunt-ended) alebo posunuté (neprekrývajúce sa) (stagger-ended) konce na ligáciu, digescia s reštrikčným enzýmom na poskytnutie vhodných koncov, ak treba, doplnenie kohéznych koncov, spracovanie alkalickou fosfatázou na zamedzenie nežalateľného pripojenia, a enzýmová ligácia. V inom uskutočnení sa fúzny gén môže syntetizovať pomocou bežných metód, vrátane automatických DNA syntetizátorov. Alternatívne sa PCR amplifikácia génových fragmentov môže uskutočniť použitím zakotvených primárov, ktoré spôsobujú komplementárne prečnievania medzi dvoma za sebou nasledujúcimi génovými fragmentmi, ktoré môžu byť potom tepelne hybridizované a reamplifikované, aby sa generovala chimérová génová sekvencia (pozri, napríklad Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel a kol., John Wiley & Sons, 1992). Okrem toho, mnohé expresné vektory, ktoré kódujú fúzny podiel sú už komerčne dostupné (napr. GST polypeptid). SMP-kódujúca nukleová kyselina sa môže klonovať do takéhoto expresného vektora, takže fúzny podiel je „in-frame“ spojený s SMP proteínom.

Homológy SMP proteínu sa môžu vytvárať mutagenézou, napr. diskrétnou bodovou mutáciou alebo trunkáciou SMP proteínu. Tak ako sa používa v tomto dokumente, pojem „homológ označuje rôzne formy SMP proteínu, ktoré pôsobia agonisticky alebo antagonistický na aktivity SMP proteínu. Agonista SMP proteínu môže udržiavať v podstate rovnaké alebo podprahové biologické aktivity SMP proteínu. Antagonista SMP proteínu môže inhibovať jednu alebo viac aktivít prirodzene sa vyskytujúcej formy SMP proteínu, napríklad prostredníctvom kompetitívneho viazania sa so smerovým alebo protismerovým členom kaskády metabolizmu sacharidových molekúl, alebo inhibovať dráhu, v ktorej sa vytvára energia a je do nej zapojený SMP proteín.

V alternatívnom uskutočnení sa homológy SMP proteínu môžu identifikovať skríningom kombinatorických knižníc mutántov, napr. trunkačných mutantov, SMP proteínu na SMP proteínovú agonistickú alebo antagonistickú aktivitu. V jednom uskutočnení sa variegátna knižnica (variegated library) SMP variantov vytvára pomocou kombinatorickej mutagenézy na úrovni nukleovej kyseliny a je kódovaná variegátnou génovou knižnicou. Variegátna knižnica SMP variantov sa môže získať napríklad pomocou enzýmovej ligácie zmesi syntetických oligonukleotidov do génových sekvencii tak, že degenerovaný súbor potenciálnych SMP sekvencii je exprimovateľný ako individuálne polypeptidy, alebo alternatívne, ako súbor väčších fúznych proteinov (napr. na fágový displej) obsahujúcich súbor SMP sekvencii tam uvedených. Existujú rôzne metódy, ktoré sa môžu použiť na vytváranie knižníc potenciálnych homológov SMP zdegenerovanej oligonukleotidovej sekvencie. Chemická syntéza degenerovanej génovej sekvencie sa môže uskutočniť v automatickom DNA syntetizátore a syntetický gén sa potom liguje do vhodného expresného vektora. Použitie degenerovaného súboru génov umožňuje zabezpečiť v jednej zmesi všetky sekvencie kódujúce požadovaný súbor potenciálnych SMP sekvencií. Metódy na syntetizovanie degenerovaných oligonukleotidov sú známe v danej oblasti techniky (pozri napr. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura a kol., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53, 323; Itakura a kol., (1984) Science 198. 1056; Ike a kol., (1983) Nucleic Acid Res. H, 477).

Okrem toho, knižnice fragmentov kódujúcich SMP proteín sa môžu použiť na vytváranie variegátnej populácie SMP fragmentov na skríning a následnú selekciu homológov SMP proteínu. V jednom uskutočnení sa knižnica kódujúcich sekvenčných fragmentov môže vytvárať pomocou spracovania dvojvláknového PCR fragmentu SMP kódujúcej sekvencie s nukleázou v podmienkach, v ktorých medzera (nick) sa vyskytuje len raz na molekulu, denaturáciou dvojvláknovej DNA, renaturáciou DNA, aby sa vytvorila dvojvláknová DNA, ktorá môže obsahovať zmysluplné/nezmyselné páry produktov s rôznym počtom medzier, odstránením jednovláknových častí z novovytvorených duplexov pomocou spracovania sS1 nukleázou aligovaním knižnice výsledného fragmentu do expresného vektora. Pomocou tejto metódy sa môže odvodiť taká expresná knižnica, ktorá kóduje Nkoncové, C-koncové a vnútorné fragmenty rôznych veľkostí SMP proteínu.

Viacero metodík je známych v danej oblasti techniky na skríning génových produktov kombinatorických knižníc vytvorených bodovými mutáciami alebo trunkáciou a na skríning cDNA knižníc na génové produkty, ktoré majú zvolené vlastnosti. Takéto metódy sú prispôsobiteľné na rýchly skríning génových knižníc vytvorených kombinatoriálnou mutagenézou SMP homológov. Najviac používané metódy, ktoré sú vhodné na vysokoúčinnú „through-put“ analýzu na skríning veľkých génových knižníc, typicky zahrňujú klonovanie génovej knižnice do replikovateľných expresných vektorov, transformovanie vhodných buniek s výslednou knižnicou vektorov a exprimovanie kombinatorických génov v podmienkach, v ktorých detekcia požadovanej aktivity uľahčuje izoláciu vektora kódujúceho gén, ktorého produkt sa detegoval. Rekurzívna množina mutagenézy (REM, recursive ensemble mutagenesis), nová metóda, ktorá zlepšuje frekvenciu funkčných mutantov v knižniciach, sa môže použiť v kombinácii so skríningovými skúškami na identifikáciu SMP homológov (Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89,7811-7815; Delgrave a kol., (1993) Protein Engineering 6 (3), 327-331).

Vínom uskutočnení sa skúšky na báze bunky môžu využiť na analýzu variegátnej SMP knižnice, ak sa použijú metódy, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky.

D. Použitie a spôsoby vynálezu

Molekuly nukleovej kyseliny, proteíny, proteínové homológy, fúzne proteíny, priméry, vektory a hostiteľské bunky opísané v tomto dokumente sa môžu použiť v jednom alebo vo viacerých nasledovných spôsoboch: identifikácia C. glutamicum a príbuzných organizmov; mapovanie genómov organizmov príbuzných C. glutamicum; identifikácia a lokalizácia C. glutamicum sekvencií, ktoré sú predmetom záujmu; evolučné výskumy; stanovenie oblastí SMP proteínu potrebných na funkčnosť; modulácia SMP proteínovej aktivity; modulácia metabolizmu jedného alebo viacerých sacharidov, modulácia produkcie vysokoenergetickej molekuly v bunke (t.j. ATP, NADPH) a modulácia produkcie požadovanej zlúčeniny, ako napríklad špeciálnej chemikálie, bunkou.

Molekuly SMP nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu majú rozmanité použitia. Po prvé, môžu sa použiť na identifikáciu organizmu, akým je Corynebacterium glutamicum alebo veľmi príbuzných organizmov. Taktiež sa môžu použiť na identifikáciu prítomnosti C. glutamicum alebo príbuzných organizmov v zmiešanej populácii mikroorganizmov. Vynález poskytuje sekvencie nukleových kyselín mnohých C. glutamicum génov; pomocou sondovania extrahovanej genómovej DNA jednotnej kultúry alebo zmiešanej populácie mikroorganizmov v stringentných podmienkach so sondou prekleňujúcou oblasť C. glutamicum génu, ktorá je osobitá pre tento organizmus, možno určiť, či je tento organizmus prítomný. I keď Corynebacterium glutamicum samotná je nepatogénna, je príbuzná s patogénnymi druhmi, takými ako Corynebacterium diphtheriae. Corynebacterium diphtheriae je kauzatívny agens diftérie, rýchle sa vyvíjajúcej, akútnej horúčkovitej infekcie s následkami tak lokálnej ako aj systémovej patológie. Pri tejto chorobe sa vyvíja lokálne poškodenie horného respiračného traktu s nekrotickým poškodením epitelových buniek; bacily vylučujú toxín, ktorý sa rozšíri cez toto poškodenie do distálnych vnímavých telesných tkanív. Degeneratívne zmeny spôsobené inhibíciou proteosyntézy v takých tkanivách ako v srdci, svale, periférnych nervoch, nadobličkách, obličkách, pečeni a slezine majú za následok systémovú patológiu choroby. Diftéria pretrváva s vysokým výskytom v mnohých častiach sveta, vrátane

Afriky, Ázie, východnej Európy a v nezávislých štátoch bývalého Sovietskeho zväzu. Pokračujúca epidémia diftérie vo východnej Európe a nezávislých štátoch bývalého Sovietskeho zväzu si vyžiadala najmenej 5000 úmrtí od roku 1990.

V jednom uskutočnení vynález poskytuje spôsob na identifikáciu prítomnosti alebo aktivity. Corynebacteríum diphtheríae v subjekte. Týmto spôsobom sa deteguje jedna alebo viacej nukleovokyselinových sekvencií podľa tohto vynálezu (napr. sekvencií uvedených s nepárnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname), alebo aminokyselinových sekvencií (napr. sekvencie uvedené s párnym očíslovaním SEQ ID NO: v Sekvenčnom zázname) v subjekte, čím sa deteguje prítomnosť alebo aktivita Corynebacteríum diphtheríae v subjekte. C. glutamicum a C. diphtheríae sú príbuzné baktérie a mnohé z molekúl nukleových kyselín a proteínových molekúl v C. glutamicum je homológnych s C. diphtheríae molekulami nukleovej kyseliny a proteínovými molekulami, a preto sa môžu použiť na detekciu C. diphtheríae v subjekte.

Molekuly nukleových kyselín a proteínov podľa tohto vynálezu môžu byť tiež markérmi špecifických oblastí genómu. Je to využiteľné nielen pri mapovaní genómu, ale tiež pri funkčných výskumoch proteínov C. glutamicum. Napríklad, na to, aby sa identifikovala oblasť genómu, ku ktorej sa viaže určitý C. glutamicum DNA-väzbový proteín, by sa mal genóm C. glutamicum podrobiť digescii a fragmenty inkubovať s DNA-väzbovým proteínom. Tie, ktoré viažu proteín, môžu byť dodatočne sondované s molekulami nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu, výhodne s ľahko detegovateľnými značkami; viazanie takejto molekuly nukleovej kyseliny s genómovým fragmentom umožňuje lokalizáciu fragmentu na genómovej mape C. glutamicum, a keď sa to uskutoční viackrát s rôznymi enzýmami, uľahčí to v rýchle stanovenie sekvencie nukleovej kyseliny, ku ktorej sa viaže proteín. Ďalej, molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu môžu byť dostatočne homológne so sekvenciami príbuzných druhov, takže molekuly nukleových kyselín môžu fungovať ako markéry pri konštrukcii genómovej mapy v príbuzných baktériách, takých ako Brevibacterium lactofermentum.

Molekuly SMP nukleových kyselín podľa tohto vynálezu sú tiež využiteľné pri evolučných výskumoch a výskumoch proteínovej štruktúry. Metabolické a energiu uvoľňujúce procesy, na ktorých sa molekuly podľa tohto vynálezu podieľajú, využíva veľa rozmanitých druhov prokaryotických a eukaryotických buniek, porovnaním sekvencií molekúl nukleových kyselín podľa predloženého vynálezu s tými, ktoré kódujú podobné enzýmy u iných organizmov sa môže určiť evolučná príbuznosť organizmov. Podobne, takéto porovnanie umožňuje určiť, ktoré oblasti sekvencie sú zachované a ktoré nie, čo môže pomôcť pri stanovení takých oblastí proteínu, ktoré sú esenciálne pre fungovanie enzýmu. Tento druh gtanovenia je hodnotný pre výskumy proteínového manipulovania a môže byť indikáciou, čo proteín môže tolerovať pri mutagenéze bez straty funkcie.

Manipulácia molekúl SMP nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu môže viesť k produkcii SMP proteínov, ktoré sa funkčne odlišujú od „divého“ typu SMP proteínov. Tieto proteíny môžu mať zvýšenú účinnosť alebo aktivitu, môžu sa nachádzať vo väčších množstvách v bunke ako obyčajne alebo môžu mať zníženú účinnosť alebo aktivitu.

Vynález tiež poskytuje spôsoby na skríning molekúl, ktoré modulujú aktivitu SMP proteínu, buď interakciou so samotným proteínom alebo substrátom alebo väzobným partnerom SMP proteínu alebo modulovaním transkripcie alebo translácie molekuly SMP nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu. Pri týchto spôsoboch sa mikroorganizmus, ktorý exprimuje jeden alebo viac SMP proteínov, podľa tohto vynálezu, kontaktuje s jednou alebo viacerými testovanými zlúčeninami, a takto sa dá stanoviť vplyv každej testovanej zlúčeniny na aktivitu alebo úroveň expresie SMP proteínu.

Existuje mnoho mechanizmov, pomocou ktorých sa zmenou SMP proteínu podľa tohto vynálezu, môže priamo ovplyvniť výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie špeciálnej chemikálie z kmeňa C. glutamicum, a to inkorporáciou takéhoto zmeneného proteínu. Degradácia vysokoenergetických uhlíkatých molekúl, ako napríklad sacharidov, a konverzia zlúčenín, ako napríklad NADH a FADH₂ na užitočnejšie formy prostredníctvom oxidačnej fosforylácie poskytuje mnoho zlúčenín, ktoré samotné môžu byť požadovanými špeciálnymi chemikáliami, ako napríklad pyruvát, ATP, NADH a mnohé medziproduktové sacharidové zlúčeniny. Ďalej energetické molekuly (napríklad ako ATP) a redukčné ekvivalenty (napríklad ako NADH alebo NADPH), ktoré vznikajú v týchto metabolických dráhach, sa v bunke využívajú na pohon reakcií, ktoré by ináč boli energeticky nevýhodné. Do takýchto nevýhodných reakcií patria mnohé biosyntetické dráhy pre špeciálne chemikálie. Zvyšovaním schopnosti bunky využívať určitý sacharid (napr.

pomocou manipulácie s génmi, ktoré kódujú enzýmy zapojené do degradácie a konverzie takéhoto sacharidu na energiu pre bunku) sa dá zvýšiť množstvo energie dostupnej na to, aby sa umožnil priebeh nevýhodných, ale požadovaných metabolických reakcií (napr. biosyntéza požadovanej špeciálnej chemikálie).

Ďalej, modulácia jednej alebo viacerých dráh zapojených do zužitkovania sacharidov umožňuje optimalizáciu konverzie energie, ktorá sa nachádza v molekule sacharidu, na produkovanie jednej alebo viacerých požadovaných špeciálnych chemikálií. Napríklad, ak sa redukuje aktivita enzýmov zapojených napríklad do glukoneogenézy, tak je viac ATP dostupných na pohon požadovaných biochemických reakcií (napríklad na biosyntézy špeciálnych chemikálií) v bunke. Celková produkcia energetických molekúl zo sacharidov sa môže tiež modulovať, aby sa zaistila maximalizácia produkcie energie bunkou z každej molekuly sacharidu. Neefektívne zužitkovanie sacharidov môže spôsobiť nadmernú produkciu CO₂ a nadbytok energie, čo môže viesť k neproduktívnym metabolickým cyklom. Zvyšovaním metabolizmu sacharidových molekúl by mala byť bunka schopná účinnejšie fungovať, a to pri nižšom nároku na uhlíkaté molekuly. Toto by malo viesť k zvýšenému pomeru: produkt špeciálnej chemikálie/sacharidová molekula (zvýšenému výťažku uhlíka) a umožniť zníženie množstva sacharidov, ktoré sa musia pridať do média pri fermentácii kultúry ako napríklad takto manipulovanej C. glutamicum, vo veľkom rozmere.

Mutagenézou jedného alebo viacerých SMP génov podľa tohto vynálezu môžu tiež vznikať SMP proteíny so zmenenými aktivitami, ktoré nepriamo vplývajú na produkciu jednej alebo viacerých špeciálnych chemikálií z C. glutamicum. Napríklad zvyšovaním účinnosti využitia jedného alebo viacerých sacharidov (tak, aby sa konverzia sacharidu na vhodné energetické molekuly zvýšila) alebo zvyšovaním účinnosti konverzie redukčných ekvivalentov na vhodné energetické molekuly (napr. zvyšovaním účinnosti oxidačnej fosforylácie alebo aktivity ATPsyntázy) sa môže zvýšiť množstvo týchto vysokoenergetických zlúčenín použiteľných bunkou na pohon bežne nevýhodných metabolických procesov. Do týchto procesov patrí konštrukcia bunkových stien, transkripcia, translácia a biosyntéza zlúčenín potrebných na rast a delenie buniek (napr. nukleotidov, aminokyselín, vitamínov, lipidov atď.) (Lengeler a kol., (1999) Biology of Prokaryotes, Thieme Verlag: Stuttgart, str. 88-109; 913-918; 875-899). Zvyšovaním rastu a rozmnožovaním týchto geneticky manipulovaných buniek sa dá zvýšiť tak životaschopnosť buniek pri fermentácii vo veľkom rozsahu a tiež zvýšiť ich rýchlosť delenia, tak že relatívne väčšie množstvo buniek môže prežiť vo fermentačnej kultúre. Výťažok, produkcia alebo účinnosť produkcie sa môže zvýšiť prinajmenšom prítomnosťou väčšieho počtu životaschopných buniek, ktoré všetky produkujú požadovanú špeciálnu chemikáliu.

Ďalej, mnohé degradačné produkty vznikajúce v priebehu sacharidového metabolizmu sa tiež samotné zužitkúvajú bunkou ako prekurzory alebo medziprodukty na produkciu ďalších užitočných zlúčenín, z ktorých niektoré sú špeciálnymi chemikáliami. Napríklad, pyruvát sa konvertuje na aminokyselinu alanín a ribóza-5-fosfát je integrálnou časťou napríklad nukleotidových molekúl. Rozsah a účinnosť sacharidového metabolizmu má potom veľký vplyv na využiteľnosť týchto degradačných produktov bunkou. Zvyšovaním schopnosti bunky spracovávať sacharidy buď v účinných, už existujúcich dráhach (napr. takou manipuláciou enzýmov zapojených do týchto dráh, že sa ich aktivita optimalizuje) alebo zvyšovaním využiteľnosti enzýmov zapojených do týchto dráh (napr. zvyšovaním počtu týchto enzýmov prítomných v bunke) sa tiež môže zvýšiť využiteľnosť týchto degradačných produktov v bunke, čím by sa zase mala zvyšovať produkcia mnohých, od seba odlišných, požadovaných zlúčenín v bunke (napr. špeciálnych chemikálií).

Vyššie spomenuté stratégie mutagenézy SMP proteínov, ktoré poskytujú zvýšené výťažky požadovanej špeciálnej chemikálie z C. glutamicum, nie sú mienené ako limitujúce; variácie týchto stratégií mutagenézy sú očividne jasné pre odborníkov, ktorí sú skúsení v danej oblasti techniky. Pomocou takýchto stratégií a inkorporáciou tu uvedených mechanizmov sa molekuly nukleovej kyseliny a proteínové molekuly podľa tohto vynálezu môžu využiť na vytváranie C. glutamicum alebo príbuzných kmeňov baktérií, v ktorých expresia mutovaných SMP molekúl nukleovej kyseliny a proteínových molekúl je taká, že výťažok, produkcia a/alebo účinnosť produkcie požadovanej zlúčeniny sa zvýši. Požadovanou zlúčeninou môže byť akýkoľvek produkt produkovaný C. glutamicum, vrátane konečných produktov biosyntetických dráh a medziproduktov prirodzene sa vyskytujúcich metabolických dráh, ako aj molekúl, ktoré sa prirodzene nevyskytujú v metabolizme C. glutamicum, ale ktoré sú produkované kmeňom C. glutamicum podľa tohto vynálezu.

Tento vynález je v ďalšom ilustrovaný pomocou nasledovných príkladov, ktoré by sa nemali chápať ako limitujúce. Obsahy všetkých literárnych odkazov, patentových prihlášok, patentov, publikovaných patentových prihlášok, tabuliek a sekvenčných záznamov, ktoré sú uvedené v tejto prihláške, sú týmto zahrnuté ako odkaz.

ro ω

C

D Lľ

Q1 o 55 iz •c ra >55

in

1- O b· b* o tn co 4· oj ω n co *- CO W Od OJ

CO
o	o co ί- -e b- ’í
ω	O y- IDO't
o	co in co co co
OJ	Od v r- t- v i-

		oj xr o			o	O b- T- OJ
		in in o		OJ	co	CO CO Od CO 0)
Ó	£	TT CD OJ O O O	d	s	CO o	co co y- CO o o o o o	d
c	o	O O O	Q	o	o	o o o o o
O	>	CC CC X	O	>	CC	> CC CC CC CC	o
*	>	0 00	£1	>	0	>oooo

n
c
ω	O
ω	Z
>
	Q
o
c	σ
E	LU
<	ω

b

in

0)

in

CM

CM

CD

b

CO

Tf

1“

CM

CO

CO

CD

M”

O

y—

o

b

O CM

O

m

b

lo

CO

CM

CD

b

CO ’t

O

O)

j—

CD

CO

CD

m

CD

CM

4*

’t

0)

Q

0)

CM

03

b

o

0)

CM

co

CM

r·

tn

LO CD

T“

03

CM

03

4“

CO

O

cô

O r-

co

CD

®

«t

00

CM

y—

CD

b

03

b

CD

O

CM

O

CD

co

CO

O

to

CM

CM

CO

LO

CD CO

M“

o

co

IO

CO

T- M- CO

CD

CM

CM

CO

m

in

CO

CM

CO

CM

CD

CM

CM

1“

b

CO

CO

LD

CM

LD

03

CM

CM

03

CM xŕ i- m

T—

CO

LD

’Φ

lo

CO

ω

y—

03

t—

U)

V“

CO

03

(D

in

Τ-

V

CM

in

b

LD

CM

CM

CO

10

LO

CM

o

03

03 O O

c?

o

O

co

co

IO

CM

CO

CO

b

b

CM

Ο

ΙΛ

^-

b

O

CD

03

Tt

CO

O

03

T“

CD

in

CO

03 Tt b

03

LO

rŕ

t- 03

o

co

co

o

’t

co

LD

M“

0)

lí)

IO

CM

LO

y—

CO

T-

CO

CD

CO

CO

CO

10

CO

CD

CM

03

CM V CM

CO

CO

CM

CM

t- CM

CO

0)

b

ιο

CO

m

CO

co

b.

CM

t-

CO

(D y- y-

CM

(D

CD

CM

t-

CM

CD

LD

CM

CM

CM

T—

b

CM CM

IO CD CM

CO

CO w- CO

t—

CM

M“ T“ T“

CO

CO

CM

m

CO

(D

b

T-

b

CO

03

o

CM

CD

CM

03

CD

03

^·

Tt

’t

CD

ω

^J·

to

03

03

b

in

CM

CO

CO

CO

to

CO

b

LD

ID

in

LD

CO

o

CO

to

LO

b

CO

O

10

o

b

O

CD

O

co

IO

CD

s

CO

CD

CD

o

CO

03

b

b.

O

o

o

o

o

O

O

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

o

LDLOLOCDCDCDCDCDb ,- co m h* σ> i- co coiDbO3T-coiObO3^-comb03Ooooo·»-·»bbbbcococococD0303030)0)i-^’-^,r“·»-·»-·»in s ω rt- y- y- AJ

co CO lf)O O NS(O OxtCD OinCMCDCOi^- COCOOCOCO CDEDCOCOCD’d-T-T-CVJN-in CMinCMCOCMlOi-CMCDi-lO

M·

O

CO Φ

N. O

O

Od

CM

LD

CO

O)

CO

CD

*4*

CD

0)

CM

cn

b.

CO

CM

CO

CO

CM

0)

tn

σ>

m

CO

CM

0

cn

CM

CO

CO

V“

CO

CM

CM

10

in

CD

CM

CM

in

(D

10

CO

10

CM

CM

CO O CO CO TÍ- 7-lOCÚ b- 4σ> b. r** tn m r- 4- co cn co cm v

CD CD ID v- CT> CD <D τ- O CD T co

CO^-i-COCO^-CÄ^^-CMCDCdininCOCM

0 co tn 0

CO tn co

0 b.

b-

CO

n

b-

b.

tn

σ>

co

CD

0

0

CO

b·

0

CO

CO

CM

Oi

CO

cn

CM

4·

4-

b*

CM

CM

b.

r-

co

ČĎ

Y“

tn

CO

CO

CO 1-

CO

CO

CM

Od

b.

m

CO

O)

CO

Od

T-

O

tn

(0

CO

b.

T~

tn

T-

N

CO

T“

CD

CM

T~

CO

0)

CO

CM

b·

CM

CD

0

O)

0

tn

tn

0

tn

CO

CO

CO

CM

CM

tn

CO

Tf

CM

CO

O)

LD

b-

CO

cn

0

0

0

0

0

0

0

0

O

co

0

O

O

O

CM

0

0

O

CO

CO

0

0

0

0

0 rr“

0 rr*

0 n-

0

0 rr

0

0 fr·

O

O

0

0

O

O

O

O

0

0

O

0

O

0

0

0

co *0

Q1 O ♦-> ω

H Z

CD CO CO O CM CM co m co o b* o^-cococo^·

CM T- Τ' CM »-

CD			N
CO		CM	O
o	CO	CD	CO
		O	CM
CM		CO	CM

0)	Τ-
	CD	CO	Ο)
0>	CO	o	o
	b·	CO	CM
CM		CO	CM

o	O X2	CO c Φ	o
z					(Q	ω	z
Q					O	£ o	o
a ĽU	CD CD	O O	CM O	O	E	c E	σ LU
ω		CM	CM	CM		<l	ω

	o z
CO c	Q
Φ	σ
V) jä	U1 čž5l

0)

in

CO

b-

0)

0)

m

m

in

O

CD

CM

m

0)

LO

b-

o

o

CD

T“

O

in

m

CM

CO

cn

CO

O)

σ>

o

CO

o

CD

Tŕ

CM

CM

co

N

b-

CO

T-

CM

CM

t—

CD

CO

<0

CO

σ>

b-

CD

CO

Tj-

in

o

CO

T—

b-

N

CO

O

CM

b*

CM

CD

CM

CD

CD

CO

CD

0)

£

CO

b-

Q

C0

b»

CO

0)

cn

o

O

U)

m

CM

CO

•e

CM

CD

co

T“

’r—

CO V-

r—

CM

0>

CM

CO

CO CO CO ®

SSSt-nintoo'-wMDN

222°0>-OOtOT-OC\IO

OOOOqooOOOOOO

Nukleová Aminokyselina Identifikačný kód Kontig. NT Štart NT Stop Funkcia kyselina SEQ ID NO

SEQ ID NO

237 238 RXA02474 GR00715 8082 7309 (S, S)-bután-2,3-dioldehydrogenáza (EC 1.1.1.76)

239 240 RXA02453 GR00710 6103 5351 ACETOÍN (DIACETYL)-REDUKTÁZA (EC 1.1.1.5)

241 242 RXS01758 W0112 27383 28399 ALKOHOLDEHYDROGENÁZA (EC 1.1.1.1)

0)

.2 c CQ > O >o <0 ffl Ό c □ LL·

Q UJ

CM

CM eú oj oj □ 0 UJ UJ

UJ 0 o CC Q > X UJ Q

I

E33

SľS-S < •O ω x □ _j 0

UJ ω < CC < CC oi o 0

b. b.

o OJ xr ω o bCD xt <0 £ 2 Q

CO H •c CO ω

□ o

CL s δ o ~5 D _1 > X O m cc $ UJ Q < O O —> D _1

O ffl (X $

UJ Q ω o ~i D —i > X O m oc $ UJ Q

z UJ	z UJ	Z UJ
0	0	0
o	o	o
CC	CC	CC
o	o	o
>	>	>
x	r	I
UJ	UJ	UJ
o	Q	o
F	F	F
'<	'<	'<
z	Z	Z
o	O	o
x	x	x
Ώ	Ξ)	D
_l	_1	_l
0	0	0
Ο-	.O	~o
υ- 2	π-	V UL
ω ·*	ω	X w
Or	O	r O
u.	LL	1- LL
ώ -T	<O	A ώ

xt ’t“ o

in

CD CD CO o UJ

CM σ> σ> σί S

0) O> 0) T< oj in in q N OOOľjO uj uj uj _i 0 —I > O > O CC > Q_ —i O

F F F ľ)3ľ) 5S5 333 ΌΌΌ

Z Z Z < < < ix cc oc > > > Q. CL tL ooo

UJ 0 o □: Q > I Ul Q ώ tu

CQ o Jť c

Q1 O ω

CO OJ

N CXJ O

UJ

0) 0) b·’ l< b>* Od CM Q O UJ UJ >CC O LL· ω O u. O CC > cl

UJ UJ LL LL ω ω <<oc CC CC UJ uj ^LL· 0 z ž ” <

<CM^^ r<r)OC) ΚΓοϊίΰωω «2 0 j< N) ” g uj E Ψ LL UΕωω hs U· i— uZ UJ 0 O CC Q > r ω

Od l<

oj O

UJ

O xt l< boj

Q w

S*

S

CU xt U UJ ť > > > > Z Q Q Q Q UJS25 t í

D >

I ' UJ ' O ώ 'Í ň -o >

z < D .

LL 4- 0-<ΊίΊί ui'ií'ií ť<<>n^OOO°9 fcNNŠPll-U-lLU.U.

E-OOÄHr Λ Λ Λ + ω 2 qX X z V < < > <t -J =| ž φ φ s.g'O'O'O'019

Ía.O.ÍZDD00ffO 3D30S0000QO

OJ

00

O

m

Od

O

b.

b·

b*

CO

’í’

ΙΌ

D)

CO

CD

Xí

O

o

CO

0)

Od

od

Od

Od

CD

0)

m

b·

CO

CO

xŕ

xr

C\J

CO

G)

O

in

CD

Od

od

xŕ

xt

m

CO

CO

·»—

V-

0)

b*

in

0>

in

CD

T“

CO

UJ

O OC D > I UJ Q

CM rt Ό c

□ LL

N O Z

Ó >

οι o

O o OJ CO

ta ffl

tn n

CU

0)

σ>

CM

b-

CM

»0

co

CO

ΙΏ

CM

tn

CO

CO

o

»0

0)

CD

CO

V“

r·

N

CO

xt

O

b.

CO

m

co

o

xt N.

CD

Od

CO

Xŕ

b-

CM

CO

O

r~

CO

CO

CO

CO

CO

b.

co

0)

CO

CO

xt CM

CM

CM

f-

CO

Xt

CD

Od

CO

Z

Xt

r- m

Od CM

Od

0)

m

CO

co

CO

CO

xt xt

b·

od

Z

•o Ό *> C

Ό CC

O)

7“

Od xt s b· o o

CC___

0000

CO CD b. o o _ cr cc b·, co bCM o

CO (D o o o b* Od o o □z

CD O 7“ O $

CO CD od o o

CC g

c o x

CO D) O O

I

OJ bo o

CC — 0000

D) xt bO o

CC

CD hZ o o

CQ bCO bo o _

CC CC b0 CO

O o

CD

CD o o

Od in co o o_____

CC CC CC CC oc oc 000000

CD co o o o o o o

CD Od CD o o

CO Χίο o ž

CD CO xŕ o o

OJ o o o oc S cc ž 0 0 0 0

CO 0 bO O

OJ Od Od O O σ

c o X

0) CO m o o (X O co cn m CO CO CD b b O Od w o o o o 333 --CC

CĹ CC cn O) CD o o z x CC s σ> o o

CC

LL

O (Q V3

JC O f o

Ό Ό -iÉ *>

C >o ffl

CD O) 0 Od

O

CU O) xt m cd CM Od o o cc tr LL· ll

CM

in

CD

0)

00

Od

b-

CO

xt

Q

o

0

0

b-

00

0

CM

0

N

0

θ

b.

0

CU

m

Xt

CM

Od

O

CM

CO

O

O

θ

0

0

00

CM

CM

od

Od

o

τ-

CU

G

o

O

O

O

o

O

O

O

o

Ο

O

O

CC CC

33333x^3

-------Q.

cr oc.oc cc cc oc u_

CQ □

O ό

Ό '> C

X3 CO

Aí

Ľ” c Φ •D b* CD CO

T“ O

ÍĽ

		O
co		CM	s	o	o
CO	CO	m	CO	m		CD
ω	ω	o	CO		o	o	M-
LO	7—	7—	h*	00	m h*	CO	ID CD CO

								CO	CD		r*
CD	CD	CO			CO	O	<D	7“	O	r-	bx
CD	CD	OJ	O)	CM	CO	CO	CD		7±		CM
CD	in	CO	h-	LD	CO	CO	0)	00	CO	o	O
r*	CO	CD	ΙΌ	LO	CM	CO	CM		CM	r-	y-

b*

CO

h*

b*

CM

O

m

CD

CD

CM

m

ID

tJ-

o

00

CO

CD

in

in

in

CD

CO

CM

CO

o

CD

CO

CM

CM

CO

CD

in

in

T-

j—

CD

r-

CO

CD

ľx.

r-

o	ID	(D	0)	CD	CO	fx.		(D
0)	b*	b*	CM	CM	o	CM	CM	O
o	O	O	O	O	o		O	o
o	o	O	O	O	o	O	O	O

m	m m ’T (D S o ΓΜ X Ύ-	m o	£J w CO o b* q o	CD ľo	CM CO CO CM
CD CM	O ° O	o	CM 2 g £ O O Zf O	O	O ID O CM
O	s°s		o o S o		O O
Z	x z x	X	< Z £ Z	X	< <
X	cc x cc	CC	x x x	CC	X X
í	LL CC LL	u_	cc tr ll tr	LL	CC CC

° Z □

CO

CO* CO* CO* + • · · CM

CA \O

co co CO CO

CO in CM

CO

C0

N 15 *čô E o in tn CM CM xt _ CM ríríríäuj m m tn — 00055 UJ UJ LLl·' LL ω o Ll

I CD < ej O UJ

CM O

LL

CM CO O

UJ (0 N UJ CC tid

Z Z ™ Z

UJ UJ Z Z>= __UJ UJ ¹¹¹

OO 77 >

UJ u u — — H < < o o o — (X.

¹ Q.

' Z O __i cr > > tu _ LL UJ >>>>-> CC CC CC OC CC OOOOO LL LL LL LL LL ω ω ω ω ω ej ω O

UJ crw °O

St* ω 3 tr ~CL^U

CM g r o o rf b n ^'<

<í^3·

CM b b cm’ cm OO UJ UJ

Ό CC UJ CL O

OO LL LL (0 CO

E EfhP

2 z z z -£>>>

S

O-o Q Φ co<* CO Xt“ xt ej o ň Uj. O < UJ k) £ ω ω co rj.. u i P u_ u. u. „„ ω ω

ΙϋίΛτκιΧ'Λ^ΟΟΟ τ~ r- + ψ. *- 11 i > n ’T . «i 11 r> tn tn . . ~ b CM

CD

I CD _ -r ň á í o-o-o z z z < < <

<<000000005< ^ui^ui00000000<0 xt xt ľ_i ľ_i x-‘x-’0 0

000000

LL

LL LL ω ω' z z b

H

CO Q r iu in irí co cô

UJ UJ xt

CM CM CM x- 3 OOO<Č LL UJ UJ

LL UJ cr o N tr

D

UJ cr cô < °C^'< ? CD cc'uj ra uj uj i—

Q O UJ UJ UJ t— h^- LL « ω

LL LL Z__

CO CO < < < w o o tr tr cr 5 LL u. t- ~

LL LL CO ώ e“

Z Z«^_k= — ~ =··<< <<55555^-p ggňňňňňSg ď CC UJ UJ ‘UJ U 52 52 ' · · > «2 S tn K⁵ žzz£££í5 -- - - itf'p *<0 ’T *<0 C c 0-0

CO »J2 LOS: = 0.3 o ll o j- > ?XXX ooo UJ UJ u D Q Q

I I t

O O-O'O-O-O-O g m ”XXXXX<ÓU_33333ŽZ³ qqCD0055 ti*99 OOOUUií <<<<<33 zŕžžžoa

O CD

I I << LL LL -I -J 5< xt xt

Λ< ll ll ll ll o DOOOO^ N N N N N N E j— H I- I— H ΐιΐ·<-<'<'< C 5 Z Z Z Z rf qOOOOJ

b

O

CM

CM

xt

in

b-

CO

CM

CM

tn

o

m

CM

CO

CO

CD

b

CO

tn

CO

xt

00

T

CM

tn

co

CO

b.

CD

CO

CD

CO

T“

o

0)

03

tn

CO

b

co

o

m

co

CD

b

xt

CM

xt

CM

O

o

m

co

CM

CM

^-

tn

o

o

o

CO

CO

b-

Xŕ

CM

CO

CO

co

o

b.

b.

CO

b·

CO

CO

CO

CD

tn

b

o

co

b

o

00

b

CD

CO

CO

CM

CM

CD

CM

03

03

T

CD

CO

tn

o

b

o

in

CD

CO

o

o

co

Ί

CM

in

CO

CO

CD

CM

xf

b-

χ~

tn

CO

T·

T

1-

CM

0)

t·

V“

X“

xt

T·

xt CM

b

CM

in

CO

T-

t-

CO

CO

CM

CM

co

s

m

1-

v-

CO 5ŕ

CM

CD

CM

0)

CO

b·

CO

tn

Τ’

co

CO

▼«

CD

CM

0)

00

CO

CO

Ί

O

CO

b

xf

xt

CO

b

CO

b

b

y—

o

CD

in

to

0)

CD

b-

in

in

CD

CO

b.

CO

CO

0)

b

CO

0)

CO

X“

CO

CM

x±

CM

in

b

CO

CM

m

CM

CM

CO

σ)

σ>

b-

CO

m

o

CO

O

xf

b.

b»

CO

xl

O

CM

b

b

0)

CM

CM

in

y—

Ί

o

b

b

b

b

CO

CM

CM

m

co m x- x- x-

CO x-

x- CO

CM CO CM x-

T~

m

CO b.

X“

X“

CM

tn

tn

X“

r- CM

CD

CO

m

CO

CO

CO

T“

CM

CM CD

CO

CO

b

CO 0) CO

CO

CD CO

y—

X- CO

03 CM CD

incMCOCMOiinoo

CO o

CM

'b

O 03 b CM

CO

xf CM CO CM

ω cn xr

xr

CO O

CO

£2

CO

CO CO

CO CM CO

b

LDCOb-CDCMCOCOCO

CO CO

G)

Xt-

03 o

b

CM CM O CM

CO

fs.

x- co in co

CM

CO CO b

b

CO

in co

χ^-

CD CD

CD xj- in

CM

LObbbbCOOO

03

xr xr

Q)

CM

T- O

CM

ιη ιη o χί-

co

o

CO

O CD b O

ooo

o

χ-

o o

ο

CO

O o

OOO

oooooooo

o o

o

O

V- O

ο o o o

co

o

CO

o o o o

O

ooo

o

Ο

o o

o

O

o

o o

ooo

o

oooooooo

o

o o

o

O

O °

o

o o o o

o

o

x- O O O

>

ÍĽ CC oc

CC

>

CC CC

>

x

>

CC CC

□C CC CC

>

CCCCCCCĽCCCCCCCC

>

a: cc

>

CC

> ro

>

CC CC CC CC

>

CC

>

a: cc tr cr

>

0000

>

00

>

0

>

0 0 0 0 0

>

00000000

£

00

0

> 0

£

0 0 0 0

0

£

0 0 0 0

©I c (Λ o c

E <1

O z

xj-

<o

co

o

CM

CD

CD

o

CM

Xt

CO

CD

O

CM

xt

CO

CO

O

CM

Xt

CO

CO

o

CM

CO

CO

o

CM

CO

CD

O

CM

xt

CD

in

m

m

CD

CO

CO

CO

CO

b

b

b

b

b

CO

CO

CO

03

CD

03

03

03

03

0)

o

O

o

o

o

r“

x—

V

Τ'

CM

CM

CM

CM

CO

co

co

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

xt

xt

xt

Xt

xt

xt

'í'

Xt

xt

xt

xt

xt

CO O CM xt CD CO O

CM CO CO CO CO CO xt Tt xt xt xr xt xt

CO

Xt b σ> i- co m

CM CM CO CO CO

Xt Xt xt xt xt

ο r-

CD

N

in

CO

0)

CM

co

CO

CO

CO

CO

TŽ

CM

^í-

σ>

O)

CM

O

m

co

T?·

10

T}·

CO

Tŕ

CD

o

O

Tj-

o

O

00

m

Tf

b-

Tf

m

CM

CO

co

in

CO

’T

’í

Y~

CO

m

Tt

s

o

o

CM

CM

CM

O

V“

Y“

CM

O

CO

o

co

0>

CD

CM

CD

b.

s

CM

o

CO

•«t

CD

Y“

b-

CD

CM

o

t—

Ύ—

CM

CO CO

10

V“

CM

m

CO

CM

CO

CM

CD

CO

b-

O

CD

CD

b-

CN

CO

N*

CD

CD

CM

CO

M

CO

σ>

CO

CO

O

CN

4-

0)

CO

O

CN

b.

CD

CD

O

CM

CM

O

O

0)

CM

CO

(D

CD

in

O.

CN

b-

CO

O

CM

CO

CM

O

in

0

T“

CM

CO

CO

CM

b-

CN

CO

co

CD

CO

b>

CO

O

10

CM

b-

CM

CO

b.

CM

CM

CO

in

CN

CO

m

CN

m

CO

CM

4·

CO

b.

b-

b.

O)

CO

CM

CM

CM

CM

CD

m

LO

m

m

CO

CO

01

m

CN

b·

O

o>

b-

CO

o

CO

CM

CD

0

0

O

0

CO

(D

CN

0

CN

O

CD

T“

σι

in

CN

O)

CN

o

o

o

O

O

0

0

O

0

O

O

0

O

0

o

0

CN

CO

o

o

o

O

O

O

0

0

O

0

0

O

O

0

O

O

O

Q

0

0

O

O

O

CO

0

-e 10

CO

0

T“

in

0

ID

(D v

CO

b-

LD

m

CO Q

CO

CD v-

CO

CM

CN

CD

b-

1-

CN

co

CO CN

CN A

CN

CN

CN

tn y-

tn

CO

O

CN

0

h*

r- co

O)

CO CO

b.

UJ

CN

Q

CO

CO b-

CO

CO

CN O

CM

o

CD b-

O

CO

CO

CO

m 0

0

0

TJ-

CN

co co

m

CO m

LD

CN

θ

CN

Q

CN

CN CN

CO

CO

Tf

10 O

0

O

CN

co

CO CO

0 5

O

O

O

t- co

CO

CO

0

CN

O

V* Τ'

τ-

0 0

CM

CO

CO

-X

O

O O

O

O

O

O τ-

V

Y—

Y“ Y

0 0

O

O

O

0 0

0

0

0

O

O

O

o 0

Ο

0 0

O

O

S

O

s

O

O O

O

O

O

Ο O

O

O

O

0

O O

z x —. ZV

<;

z z z

Z

z

z z

Z

Z Z

z z tn ω tn

x rr

ω

x ZV

000000

OO

0 o 0 0 0 0

ina	IDN0
o	σ
CD >	W
	tn

©

©

o

CO

to

CM

o

r—

T

co

O

m

CO

0)

o

CD

to

©

©

M-

CM

CM

b-

CO

b.

CO

©

M-

b-

to

o

o

©

M-

b-

©

O

O

©

CO

©

CM

CO

CO

o

CO

CO

©

CO

©

CM

©

©

CD

©

©

M

©

to

cn

1-

Ί—

T—

04

CM

CM

y-

CO

-t

to

M-

©

t—

CM

©

©

O

O						b-				CD
▼-·	b-	©	© O	M-	o	O	©	©	©	©	©
b-		Φ	b> CO	CO	o	©	O	©	to	©	to
©	©	©	CO o	to	CM		©	©	©	CM	©

r·	©	CM	©	©		©	M-		T	©
to	©	©	©	©		to	M-	©		©	©
M-	CM	to	o	O	to		b-	’T	to	to	M-
©	©	M	CM	CM	©	4	M*	o	fs.	CM	O
O	O	O	O	O		o	O	o	o	O	O
O	O	O	O	O	o	o	O	o	o	O	o

to	©	©	©	Tt	©	©
©	©	to	o	©	©	©
©	©	©	h-	CM	CM
		T“	T~	CM	CM	CM
o	o	O	O	O	O	O

©

©

O

CM

M-

©

m

o

CM

©

©

o

CM

*ŕ

tJ-

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

b.

b*

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

Γ4 Γ-

co co b-	in CM CD
h* b* t- r-	r- O b*
LO b. O O	¢0 CO O CD
i- CMCD O)	in 10 b· *- τ- o

0)	b-.				CO		O	O
CO			to	b.	o		CM	CD
o	CD			o	0)	O		10
CO	Ti-	CM	Tt	CO		03	CM	O)
	o		00	CD				CO
CO	o		CO	CO	b.			O
T	CO		(0	CO	(0		CD	O

<

cn rCQ > O >o

CO rt O X c □ x

CO CO ó ó

OO LU LU

CO ó o tu

O1 o ω co CO CD co

CO CO CO CO

CO CO CO CO OOOO UJ UJ UJ UJ

H H H J— < < < < U.ILU.LL ω ω ca ω OOOO U. U. U. LL I— I— I— I—

OOOO x x x x

ĽJ O O CD OOOO .. .. _ω ..

to o

LL U. ω ω OO LL· LL ω O u.

« u Jŕ c D X

CN
CO	Ν’
m	CD
b-	CN
CN CD	CO

oi o Si I— z

CQ £ D <0 H •ei rt >55 r* co CD CN 'O CO

CD in 05

CO

CD

CO CN •a rt >55 σ

c o *

K τΟ

I m in o o o _ x x OO in ’t CD O O

CN

O ž

S c X-) a .x fe c

0) Ό bCO O o b* co o o

X

CD O)

CN O x

CD

CN O

Z x x •o Ό A '> c

KJ rt a £ c

0) Ό $ o z Q lll “5 D O x oo z z Q Q

UJ UJ Ό -5 DO.... O O'UJ'UI - - - z

UJ O o , ca Q z ‘tlj'uJ J— ΙΟ o Ľ CC CL CL CL CL < D O O O O O

CL CL Z

LU

O Q m X X z

Q Q·,?·

-J -J OO Z Z x x g g m m > >

=?=?«τ «v

O Z Q UJ ~5 D O X

CO O)

CO os o LLI

CO CO O) O)

CO 05

CO O) x O t <

x

O ž

B CO O N ží o

o UJ “3 D O X <

o o LU UJ

O LU o UJ ši po CL Z UJ D CL UJ

Í3____ oooooo X X X X X X

QOOQ H I— H H X X X X LUUJllJUJ X X X X

ÍJlJÍJÍJ dZ x w °o o x

Q UJ “J Q O X r- < m ® > > zoo

CO iri CD

O LU

CO in CD

O LU co co iri in CD CD oo LU LU

CO CO CN U) U) Q CD CD LU T-' T-: N

O O,í W Wlľ

Z ω ΙΟ x x •O'> x*9 o O

É o

UJ

D O UJ

X

CO $

Q x o —I o z

I (J m φ Q

S___________

-O 'ΓΌΌΌΌΌΌΌ'ΟΌΌΌ

X ----------r o o 5= o $ δ z D UJ “□ O o x o *

0) CO ooooí

----UJ UJ LU LU^J^

Zľ _ z _ _ _ľ uj UJ

OOO O O UJ,X X UJ LU

CO 05 05

CD o

LU

CO in CD

O LU m ω O o-ozzzž CL CC X X X X uj x o-----O

UJ x ω

LL

I Φ x UJ ω LU xxxxxxxxxxx ΖΧΧΧΧΙΧΧΧΧΧ ooooooooooo ooooooooooo ΰ-Ο O O Q O O O O O Q O CC

CO Ó o in co CN

N b*

O

Ν’

Ν'

O

Q O >Q

X

OOO ODO LU LU LU XXX LU UJ LU LL U- LL

ΙΙΧΙΙΙΪ □ QQQQOUJ <<<<<< X Z Z Z Z Z Z X

CN

CO

o

b-

CO

00

b-

in

CO

h.

05

(0

N*

in

CD

N-

CN

0)

05

LD

N

r~

O)

CD

05

CO

o

CD

00

CO

CN

in

m

CO

T“

O

CN

Ν'

Ν’

CN

r~

CO

O

05

CN

CD

CN

O

CN

co.

05

o

CO

Ν’

o

CN

m

CN

m

CN

CO

o

Ν’

Ν’

O

CO

y—

o

ν-

Ν’

3

CO

T-

CD CD

N· CO

CN Ν’

CD

T“

CO

t-

t-

co

r—

r—

T“

CN

t-

CN

CN

05

r*-

CO

ΟΝ

CO

Ν’

CO m N

CN

in

Ν’

in

CO

05

CO

CD

CN

05

U5 05

CO

CN

CO

CO

05

CN

CN

CD

CD

05

CN

CN

CO

CN

CO

Ν’

N CO

y—

o

in

05

CD

CO

O

05

b*

CN

Ν’

b-

O

r-

CO

Ν’

d) co

Ν’

t—

CD

CO

CO

CD

CO

Ν’

m

CN

CD

CN

CN

N

CO

co

CN

r- b*

05

T“

b*

Ν’

CN

CN

CN

CN

T“

CO

co

CO U5 CN CN

CN m in CN

CD

TJCO

CN CO bo o

T“

O O x 0 tjO) o o

CO o o o o__ x x x _ .

O O O O O

0) o o

CN CO O

O o co o o o — x x

Ν’ CO O O ž

I*. £ o o___

CC CZ CC CC

N

T“ N

O O o o o>

o o o m m o o

X_____________

000ΟΦ000ΟΟΦ0

O) CO CD O x x x x x x x co CD b* O — oo m m co o o

CN CO in o o b* o O

K

ΤΟ o

CN CO O O O

CN CO o o

O — x x oo

CN o

ž

CN 05 r· O š

Ν'

CN

O

X X X X OOOO

O CD

O O ľ*.

CN O

O

CN CD

O O

CD CD O O

I tn n· m no b* o ίο o 33 CC CC x

LL m co _w , o bw 00 CD CO CO b- MO ·»“ o o

CN O

Í33§

X X X X

0) τΟ

X x

o

CO

CN O

CD Ν’ CN O $ x x

CN	Ν’	O	CO	b*	in	o	05	Ν’	in
N-	Ν’	Ν’	N*	CN	CD	CD	N CN	CN
		b-	b-	CN	CO	CD	CD	CN	CN
CN	CN	CN	CN			O	O	O	o
O	O	O	O	O	o	O	O	O	o

o Ν’ t—

CN O__

333 XXX

CD o

CD 3^333x x x x x x x m 05 m o o Z x x co o <0 O o

LL

CO

O) o o

O) o o o 05 bO O O O 33 X x co CO tJO O

0)

CD

m

CO

CD

CO

O

CD

o

O)

b-

b*

O)

CD

CO

CM

CD

o

tn

CO

CM

b·

CD

ID

00

in

b-

Φ

b.

cn

b.

m

b·

b*

CO

o

o

CD

0)

o

«t

CD

CD

o

CD

CD

CM

b*

T“

O

o

CD

CD

b.

T—

CO

V- CO

N

xf

o

CM

ID

V“

CD

r-

b-

CO

CO

LD cô

CM

ID

CO

cd in

CM

CD

CO

CO

cô

T- M- CO

CM

00

M-

00

eo

m

CD

in

CM

CD

CO

CD

T-

V“

CD

CM

CD

b*

CO

00

CM

’t

CO

CO

’M·

CD

CM

CO

▼**

r-

m

tn

v—

D)

co

CD

b-

O

CD

CO

tn

CD

tn

CO

CO

o

CD

in

CD

CO

CD

CM

in

tn

CM

o

CD

r—

CO

CD

o

CM

o

o

o

CM

tn

b*

CD

v

CM

CD

CD

CD

j—

T“

CO CD

CM CM

CD

T“

CM

CD

m

T—

tn

CM

CM

CM

t—

CO

co

τ-

CM

^r

CD

00

o

CM

(0

CO

O

CM

CD

00

o

CM

Tt

CD

CD

O

CM

O

o

O

o

T“

CM

CM

CM

CM

CM

CO

CO

CO

CO

CO

xt

b-

b·

b-

b-

b-

£

b-

b-

b-

b-

b-

b.

b.

b-

b.

b.

b.

b-

Tabuľka 1 (pokračovanie)

Nukleová Aminokyselina Identifikačný kód Kontia. NT Štart NT Stop Funkcia kyselina SEQ ID NO

SEQ ID NO

767 768 RXN02821 W0121 324 85 ATP-SYNTÁZA C REŤAZEC (EC 3.6.1.34)

769 770 F RXA02821 GR00802 139 318 ATP-SYNTÁZA C REŤAZEC (EC 3.6.1.34)

O Ί OJ O CD O OJ r- CM

Ol CO CO r%. r* r- r* rs. b- b. bhb* co LO b- Γχ ľx- b* bb» (0 3 E N Ô Ä (Q ω E f o E ^kO

LC O O

O

CO o JC c □ u_

Q| o ω i— Z ti ra

H Z ό c

		O
*<ΰ		z
Ž 0)	lina	Q
	0)	a
3	(0 j>	UJ
Z		ω

CO b.

CO -m· in o co o od Od

CO o co in o ,οα ιm m o oj o o

TABUĽKA 2 Vylúčené gény

Literárny odkaz

Bachmann, B. et al. “DNA fragment coding for phosphoenolpyruvat corboxylase, recombinant DNA carrying said fragment, strains carrying the recombinant DNA and method for producing L-aminino acids using said strains, Patent: EP 0358940-A 3 03/21/90

Moeckel, B. et al. Production of L-isoleucine by means of recombinant micro-organisms wŕth deregulated threonine dehydratase, Patent: WO 95 19442-A 5 07/20/95

Kobayashi, M. et al. Cloning, sequencing, and characterization of the ftsZ gene from coryneform bacteria, Biochem. Biophys. Res. Commun., 236(2):383-388(1997)

Wachi, M. et al. A murC gene from Coryneform bacteria, Appl. Microbioi. BiotechnoL, 5 1 (2):223-228 (1 999)

Kimura, E. et al. “Molecular cloning of a novel gene, dtsR, which rescues the detergent sensitivity of a mutant derived from Brevibacterium lactofermentum Biosci. Biotechnol. Biochem., 60(10): 1565- 1570 (1996)

Funkcia génu

Fosfoenolpyruvátkarboxyláza

T reoníndehydratáza

D-glutamátracemáza |

transketoláza |

Glutamín : 2-oxoglutarát-aminotransferáza veľké a malé podjednotky

akonitáza |

Replikačný proteín |

Replikačný proteín; aminoglykozidadenyltransferáza

N-acetylglutamát-5semialdehyddehydrogenáza

Glutamínsyntetáza |

cykláza |

Argininosukcinosyntetáza |

Ornitínkarbamolytransferáza |

|3-dehydrochinátdehydratáza |

Pyruvátkarboxyláza

Názov génu

n_ o

murC; ftsQ; ftsZ

murC; ftsQ

dtsR

dtsRI;dtsR2 |

A 3 E

s

Q σ> m“ *» O)

acn |

Q. E

rep; aad

ω cn u. CQ

< c CD

hisF |

Φ CD a CQ

|argF |

Q O L·. CQ

O >» Q

GenBank™ AKCESNÉ Č.

A09073

0) i- co tn n r- co co co co to lo m io lo m lo lo lo in < < < < <

AB003132

ABO 15023

ABO 18530

I ABO 18531 I

OJ (O o CXJ o m <

N Γ-. CO CO Od O cn <

AB024708

CM xr 10 CM o m <

N rCM O ffi <

AB027715

AF005242

10 CO (0 10 O o <

L0 O O CO o u. <

O CM 10 O CO o u. <

|AF031518 |

|AF036932 |

AF038548

TABUĽKA 2 (pokračovanie)

Wehmeier, L. et al. “The role of the Corynebacterium glutamicum rel gene in (p)ppGpp metabolism, Microbiology, 144:1853-1862 (1998)

J

Park, S. et al. Isolation and analysis of met A, a methionine biosynthetic gene encoding homoserine acetyltransferase in Corynebacterium glutamicum, Mol. Cells., 8(3):286-294(1998)

Dusch, N. et al. Expression of the Corynebacterium glutamicum panD gene encoding L-aspartate-alpha-decarboxylase leads to pantothenate overproduction in Escherichia coli,“ Appl Environ. Microbioi., 65(4)1530- 1539(1999)

Proteín viažuci dipeptid; adenínfosforibozyltransferáza; GTPpyrofosfokináza

jArginínový represor

| Inozitolmonofosfátfosfatáza

| Arginínsukcinátlyáza

N-acetylglutamylfosfátreduktáza; ornitínacetyltransferáza; Nacetylglutamátkináza; acetylornitíntransamináza; ornitínkarbamoyltransferáza; arginínový represor; arginínsukcinátsyntáza; arginínsukcinátlyáza

|Enoylacylreduktáza (prenášačový proteín)

| ATP-fosforibozyltransferáza

Fosforibozylformimino-5-amino-1 - fosforibozyl-4-imidazolkarboxyamidizomeráza

Homoserín-O-acetyltransferáza

Dehydrochinátsyntetáza |

Glutamínamidotransferáza |

Fosforibozyl-ATP-pyrofosfohydroláza

5-enolpyruvátšikimát-3-fosfátsyntáza

L-aspartát-alfa-dekarboxylázový prekurzor

3-dehydrochináza; šikimátdehydrogenáza

Chorizmátsyntáza; šikimátkináza; 3dehydrochinátsyntáza; putatívna cytoplazmatická peptidáza

dciAE; apt; rel

x D) b. CO

< Cl E

X D) CO

argC; argj; argB; argD; argF; argR; argG; argH

< .c

O CO JZ

his A

metA

CO O k— CO

X ω x:

UJ ω íc

aroA

Q C CO Q.

aroD; aroE

aroC; aroK; aroB; pepQ

inhA |

inhA

AF038651

|AF041436

CO G) 0) m o LL <

|AF048764

AF049897

0) O T“ o m o LL <

co (D O cn o LJ_ <

AF051846

AF052652

|AF053071 |

|AF060558 |

AF086704

AF1 14233

API 16184

AF124518

AF 124600

|ÄF145897 |

AF145898

CO r-

TABUĽKA 2 (pokračovanie)

Peter, H. et al. Corynebacterium glutamicum is equipped with four secondary carriers for compatible solutes: Identification, sequencing, and characterization of the proline/ectoine uptake systém, ProP, and the ectoine/proline/glycine betaine carrier, EctP.'V. Bacteríal., 180(22):6005-6012 (1998)

Wehrmann, A. et al. “Different modes of diaminopimelate synthesis and their role in celí wall integrity: A study with Corynebacterium glutamicum/' J. Bacteríal., 180(12):3 159-3 165 (1998)

Jakoby, M. et al. Nitrogen regulation in Corynebacterium glutamicum; Isolation of genes involved in biochemical characterization of corresponding proteins, FEMS Microbioi, 1 73(2):303-3 10(1 999)

Molenaar, D. et al. Biochemical and genetic characterization of the membrane-associated malate dehydrogenase (acceptor) from Corynebacterium glutamicum, Eur. J. Biochem., 254(2):395-403 (1998)

Lichtinger, T. et al. Biochemical and biophysical characterization of the celí wall porin of Corynebacterium glutamicum: The channel is formed by a low molecular mass polypeptide, Biochemistry, 3 7(43): 15024-15032 (1998)

Vertes et al. Isolation and characterization of IS3 1 83 1, a transposable element from Corynebacterium glutamicum, Mot Microbioi., 11 (4): 739-746 (1994)

Usuda, Y. et al. Molecular cloning of the Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum AJ 12036) odhA gene encoding a novel type of 2-oxoglutarate dehydrogenase, Microbiology, 142:3347-3354 (1996)

Katsumata, R. et al. Production of L-thereonine and L-isoleucine, Patent: JP 1987232392-A 1 10/12/87

Katsumata, R. et al. Production of L-thereonine and L-isoleucine, Patent: JP 1987232392-A 2 10/12/87

Matsui, K. et al. Tryptophan operon, peptide and proteín coded thereby, utilization of tryptophan operon gene expression and production of tryptophan, Patent: JP 1987244382-A 1 10/24/87

Transport ektoínu.glycínu, betaínu, prolínu

Tetrahydrodipikolinátsukcinyláza (neúplná1)

Fosfoenolpyruvátkarboxyláza; ?; vysokoafinitný amóniový transportný proteín (pre príjem); putatívna ornitíncyklodekarboxyláza; sarkozínoxidáza

Zapojený do bunkového delenia; Pil proteín;; uridylotransferáza (enzým odstraňujúci uridyl-) signálna rozpoznávacia častica; nízkoafinitný amóniový transportný proteín (pre príiem)

Chloramfenikolacetoyltransferáza

L-malát: chinón-oxidoreduktáza

NADH-dehydrogenáza |

Porín

TranspozónIS31831

2-oxoglutarátdeghydrogenáza

Homoseríndehydrogenáza; homoserínkináza

Protismerový (upstream) štartový kodón homoserínkinázového génu

Tryptofánový operón |

Vedúci peptid; antranilátsyntáza

ectP

dapD

ppc; secG; amt; ocd; soxA

ftsY, glnB, glnD; srp; amtP

4(0 o

mqo I

£2 C

porA

od h A

hdh; hk

trpL; trpE

AJ001436

AJ004934

AJ007732

AJO103I9

AJ 13296

AJ224946

O LO OJ CO CO OJ 3

AJ238703

D 17429

C\J o co o

Ε0135Θ

E01359

|E01375 |

E01376

ο CD

UJ υ φ V) σ> m CM ω

ο σ> ω co m ιο b- b* b* CM CM CM □ ω ui

CO b. CM ω

r*

CM o b* b* CM

L0

CO bbCM

L0

N

CO

TABUĽKA 2 (pokračovanie)

Hatakeyama, K. et al. Glucose-6-phosphate dehydrogenase and DNA capable of coding the samé, Patent: JP 1997224661 -A 1 09/02/97

Moeckel, B. et al. Functional and structural analysis of the threonine dehydratase of Corynebacterium glutamicum,“./ Bacteríal., 174:8065-8072 (1992)

Chen, C. et al. The cloning and nucleotide sequence of Corynebacterium glutamicum 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthase gene, FEMS Microbiol. Lett., 107:223-230(1993)

Keilhauer, C. et al. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: molecular analysis of the UvB-ilvN-ilvC operon, J. Bacteríal., 175(17):5595- 5603(1993)

Fouet, A et al. Bacillus subtilis sucrose-specific enzýme II of the phosphotransferase systém: expression in Escherichia coli and homology to enzymes II from enteric bacteria,“ PNAS USA, 84(24):8773-8777 (1987); Lee, J.K. et al. Nucleotide sequence of the gene encoding the Corynebacterium glutamicum mannose enzýme II and analyses of the deduced protein sequence, FEMS Microbiol. Lett., 1 19(1 -2): 137-145 (1994)

Lee, H-S. et al. Molecular characterization of aceB, a gene encoding malate synthase in Corynebacterium glutamicum, J. Microbiol. Biotechnoi, 4(4):256-263 (1994)

Jetten, M. S. et al. Structural and functional analysis of pyruvate kinase from Corynebacterium glutamicum, Appl. Environ. Microbiol., 60(7):250 1-2507 (1994)

Oguiza, J.A. et al. Molecular cloning, DNA sequence analysis, and characterization of the Corynebacterium diphtheríae dtxR from Brevibacterium lactofermentum,''./ Bacteríol., 177(2):465-467(1995)

Follettie, M.T. et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of the Corynebacterium glutamicum pheA gene,“ J. Bacteríol., 167:695-702 (1986)

Park, Y-H. et al. Phylogenetic analysis of the coryneform bacteria by 56 rRNA sequences, J. Bacteríol., 169:1801-1806(1987)

Sano, K. et al. Structure and function of the trp operon control regions of Brevibacterium lactofermentum, a glutamic-acid-producing bacterium, Gene, 52:191-200(1987)

Sano, K. et al. Structure and function of the trp operon control regions of Brevibacterium lactofermentum, a giutamic-acid-producing bacterium, Gene, 52:191-200(1987)

Glukóza-6-fosfátdehydrogenáza

Treoníndehydratáza

3-deoxy-D-arabinoheptulózonát-7- fosfátsyntáza

Syntéza acetohydroxylovej kyseliny, vei1<á podjednotka; Syntéza acetohydroxylovej kyseliny, malá podjednotka; Izomeroreduktáza acetohydroxylovej kyseliny

Fosfoenolpyruvát: sacharid-fosfotransferáza

Malátsyntáza

Pyruvátkináza

Isocitrátlyáza |

Represor toxínu záškrtu

Prefenátdehydratáza

Antranilátsyntáza, 5'-koniec

Tryptopfánsyntáza, 3'-koniec

llvA

EC 4.2.1. 15

llvB; ilvN; ilvC

PtsM

aceB

aceA |

dtxr

5S rRNA

trpE

trpA

El3655

LOI508

L07603

L09232

Ll 8874

L27I23

L27126

O CO £5 2i

L35906

Ml 3774

M16175

Ml 6663

Ml 6664

OJ

CO

TABUĽKA 2 (pokračovanie)	O'Regan, M. et al. Cloning and nucleotide sequence of the Phosphoenolpyruvate carboxylase-coding gene of Corynebacteríum glutamicum ATCC 13032, Gene, 77(2):237-25 1 (1989)	Roller, C. et al. Gram-positive bacteria with a high DNA G+C content are characterized by a common insertion within their 23 S rRNA genes, J. Gen. Microbiol, 138:1167-1175(1992)	Roller, C. et al. Gram-positive bacteria with a high DNA G+C content are characterized by a common insertion within their 23S rRNA genes, J. Gen. Microbioi., 1 38: 1 1 67-1 1 75 (1 992)	Rossol, I. et al. The Corynebacteríum glutamicum aecD gene encodes a C-S lyase with alpha, beta-elimination activity that degrades aminoethylcysteine, J. Bacterial, 1 74(9):2968-2977 (1992); Tauch, A. etal. Isoleucine uptake in Corynebacteríum glutamicum ATCC 13032 is directed by the brnQ gene product,n Árch. Microbioi, 169(4):303-312(1998)	Herry, D.M. et al. Cloning of the trp gene cluster from a tryptophanhyperproducing strain of Corynebacteríum glutamicum: identification of a mutation in the trp leader sequence, Appl. Environ. Microbioi, 59(3):79 1 -799 (1993)	O'Gara, J.P. and Dunican, L.K. (1994) Complete nucleotide sequence of the Corynebacteríum glutamicum ATCC 21850 tpD gene. Thesis, Microbiology Department, University College Galway, Ireland.	Schafer, A. et al. Cloning and characterization of a DNA región encoding a stress-sensitive restriction systém from Corynebacteríum glutamicum ATCC 13032 and analysis of its role in intergeneric conjugation with Escherichia coli,“ J. Bacterial, 1 76(23):7309-73 1 9 (1994); Schafer, A. et al. The Corynebacteríum glutamicum cglIM gene encoding a 5-cytosine in an McrBCdeficient Escherichia coli strain, Gene, 203(2):95-101 (1997)		Ankri, S. et al. Mutations in the Corynebacteríum glutamicumproline biosynthetic pathway: A natural bypass of the proA step, J. Bacterial, 178(15):4412-4419(1996)	Ankri, S. et al. Mutations in the Corynebacteríum glutamicumproline biosynthetic pathway: A naturel bypass of the proA step, J. Bacterial, 178(15):4412-4419(1996)	Ankri, S. et al. Mutations in the Corynebacteríum glutamicumproline biosynthetic pathway: A naturel bypass of the pro A step, J. Bacterial, 178(15):4412-4419(1996)
Fosfoenolpyruvátkarboxyláza	Gén 23S rRNA inzerčnej sekvencie	Gén 23S rRNA inzerčnej sekvencie	Beta C-S lyáza; transportný prenášač rozvetveného aminokyselinového reťazca; hypotetický proteín yhbw	Vedúci gén (promótor)	Antranilátfosforibozyltransferáza	Putatívny typ II 5-cytozínmetyltransferázy; putatívny typ II reštrikčnej endonukleázy; putatívny typ I alebo typ III reštrikčnej endonukleázy			L-prolín: NADP+ 5-oxidoreduktáza	?;gama- glutamylkináza; podobná Dizomérnym špecifickým 2-hydroxyacid dehydrogenázam
			aecD; brnQ; yhbw	Q.	trpD	cglIM; cglIR; clgUR	| recA	X Q. Q.	proC	obg; proB; unkdh
M258I9	M85106	M85107, M85108	M89931	S59299	UI1545	U 13922	|U 14965	U31224	U31225	U31230

TABUĽKA 2 (pokračovanie)

Serebriiskii, I.G., Two new members of the bio B superfamily: Cloning, sequencing and expression of bio B genes of Methylobacillus flagellatum and Corynebacterium glutamicum, Gene, 175:15-22 (1996)

Jáger, W. et al. A Corynebacterium glutamicum gene encoding a two-domain protein similar to biotin carboxylases and biotin-carboxyl-carrier proteins, Árch. Microbiol., 166(2);76-82(1996)

Jáger, W. et al. A Corynebacterium glutamicum gene conferring multidrug resistance in the heterologous host Escherichia coli, J. Bacterial., 179(7):2449-2451 (1997)

Matsui, K. et al. Complete nucleotide and deduced amino acid sequences of the Brevibacterium lactofermentum tryptophan operon, Nucleic Acids Res., 14(24):101 13-101 14(1986)

Yeh, P. et al. Nucleic sequence of the lysA gene of Corynebacterium glutamicum and possible mechanisms for modulation of its expression, Mol. Gen. Genet., 212(1):1 12-1 19 (1988)

Eikmanns, B.J. et al. “The Phosphoenolpyruvate carboxylase gene of Corynebacterium glutamicum: Molecular cloning, nucleotide sequence, and expression, Mol. Gen. Genet., 218(2):330-339 (1989); Lepiniec, L. et al. Sorghum Phosphoenolpyruvate carboxylase gene family: structure, function and molecular evolution, Plánt. Mol. Biol, 21 (3):487-502 (1993)

Von der Osteň, C.H. et al. Molecular cloning, nucleotide sequence and finestructural analysis of the Corynebacterium glutamicum fda gene: structural comparison of C. glutamicum fructose-1,6-biphosphate aldolase to class I and class II aldolases,“ Mol. Microbiol.,

Bonnassie, S. et al. Nucleic sequence of the dapA gene from Corynebacterium glutamicum, Nucleic Acids Res., 1 8(2 1 ):642 1 (1 990)

Cianciotto, N. et al. “DNA sequence homology between att B-related sites of Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium glutamicum , and the attP site of lambdacorynephage, FEMS. Microbiol, Lew., 66:299-302(1990)

Marcel, T. et al. Nucleotide sequence and organization of the upstream región of the Corynebacterium glutamicum lysA gene, Mol. Microbiol., 4(1 1):1819- 1830(1990)

Biotínsyntáza

Tiosulfátsulfurtransferáza; acyl- CoAkarboxyláza

Proteín multiliekovej rezistencie i

|ATP-väzbový proteín teplotného šoku

|3'-, 5“-aminoglykozidfosfotransferáza

Corynebacterium glutamicum neidentifikovaná sekvencia zapojená do biosyntézy histidínu, čiastočná sekvencia

Tryptofánový operón

DAP-dekarboxyláza (mezodiaminopimelátdekarboxyláza,- EC4. 1. 1.20)

Fosfoenolpyruvátkarboxyláza i

Fruktóza-bisfosfátaldoláza

L-2, 3-dihydrodipikolinátsyntetáza (EC 4.2.1.52)

AttB-príbuzné miesto

Arginyl-tRNA syntetáza; Diaminopimelátdekarboxyláza

bioB

thtR; accBC

cmr

CQ Q. O

CO <t .c Q. CO

trpA; trpB; trpC; trpD; trpE; trpG; trpL

lys A

!EC 4.1. 1.31

GJ Ό H—

dapA

argS; lysA

U31281

U35023

U43535

[U43536

[U53587 |

U89648

X04960

X07563

XI4234

XI7313

X53993

X54223

X54740

TABUĽKA 2 (pokračovanie)

Heery, D.M. et al. “Nucleotide sequence of the Corynebacterium glutamicum trpE gene, NudeicAcids Res., \ 8(23):7 138(1 990)

Han, K.S. et al. The molecular structure of the Corynebacterium glutamicum threonine synthase gene, Mol. Microbioi, 4(10): 1693- 1702 (1990)

Cianciotto, N. et al. DNA sequence homology between an B-related sites of Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium glutamicum , and the attP site of lambdacory nephage, FEMS. Microbioi, Lett., 66:299-302(1990)

Kalinowski, J. et al. Genetic and biochemical analysis of the Aspartokinase from Corynebacterium glutamicum, Mol. Microbioi, 5(5): 1 197-1204 (1991); Kalinowski, J. et al. Aspartokinase genes lysC alpha and lysC beta overlap and are adjacent to the aspertate beta-semialdehyde dehydrogenase gene asd in Corynebacterium glutamicum, Mol. Gen. Genet., 224(3):3 1 7-324 (1 990)

Eikmanns, B.J. Identification, sequence analysis, and expression of a Corynebacterium glutamicum gene cluster encoding the three glycolytic enzymes glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 3-phosphoglycerate kinase, and triosephosphate isomeras,./ Bacterioi, 174(19):6076-6086 (1992)

Bormann, E.R. et al. Molecular analysis of the Corynebacterium glutamicum gdh gene encoding glutamate dehydrogenase, Mol. Microbioi, 6(3):3 17-326 (1992)

Seep-Feldhaus, A.M. et al. Molecular analysis of the Corynebacterium glutamicum lysí gene involved in lysine uptake,“ Mol. Microbioi., 5(12):2995- 3005(1991)

Joliff, G. et al. Cloning and nucleotide sequence of the cspl gene encoding PS1, one of the two major secreted proteins of Corynebacterium glutamicum: The deduced N -terminál región of PS1 is similar to the Mycobacterium antigén 85 complex,“ Mol. Microbioi, 6(16):2349-2362 (1992)

Eikmanns, B.J. et al. Cloning sequence, expression and transcriptional analysis of the Corynebacterium glutamicum gltA gene encoding citrate synthase, Microbioi, 140:1817-1828 (1994)

Peyret, J.L. et al. Characterization of the cspB gene encoding PS2, an ordered surface-layer proteín in Corynebacterium glutamicum,1' Mol. Microbioi, 9(1):97-109 (1993)

Bonamy, C. et al. Identification of IS 1206, a Corynebacterium glutamicum IS3-related insertion sequence and phylogenetic analysis, Mol. Microbioi, 14(3):57 1-581 (1994)

Putatívny vedúci peptid; antranilátsyntázový komponent 1

Treonínsyntáza

Miesto pripojenia

Aspartátkináza-alfa-podjednotka Aspartátkináza-beta-podjednotka aspartátbeta-semialdehyddehydrogenáza

Glyceraldehyde-3-fosfát; fosfoglycerátkináza; triózofosfátizomeráza

Glutamátdehydrogenáza

Ľ-lyzínpermeáza

Psi proteín

Citrátsyntáza

Dihydrodipikolináreduktáza

Proteín povrchovej vrstvy PS2

I S3 príbuzný inzerčný element

trpL; trpE

thrC

attB-related site

lysC-alpha; lysC-beta; . asd

gap.pgk; tpi

gdh

lysí

CL O o

4-» ’o

CD CL (0 TO —1

CXJ CL ω o

X55994

X56037

X56075

X57226

X59403

X59404

X60312

X66078

X66112

b* CO b- (D X

X69103

X69104

TABUĽKA 2 (pokračovanie)

Patek, M. et al. Leucine synthesis in Corynebacterium glutamicum: enzýme activitles, structure of leuA, and effect of leuA inactivation on lysine synthesis,“ /tyy?/. Environ. Microbioi, 60(1): 133-140 (1994)

Eikmanns, B.J. et al. Cloning sequence analysis, expression, and inactivation of the Corynebacterium glutamicum icd gene encoding isocitrate dehydrogenase and biochemical characterization of the enzýme, J. Bacteríal., 177(3):774-782(1995)

Heery, D.M. et al. “A sequence from a tryptophan-hyperproducing strain of Corynebacterium giutamicum encoding resistance to 5-methyltryptophan, Biochem. Biophys. Res. Commun., 20 1(3): 1255-1262 (1994)

Fitzpatrick, R. et al. Construction and characterization of recA mutant strains of Corynebacterium glutamicum and Brevibacteríum lactofermentum, Appl. Microbioi Biotechnoi, 42(4):575-580 (1994)

Reinscheid, D.J. et al. Characterization of the isocitrate lyase gene from Corynebacterium glutamicum and biochemical analysis of the enzýme, J. Bacterioi, 176(12):3474-3483 (1994)

Ludwig, W. et al. Phylogenetic relationships of bacteria based on čomparative sequence analysis of elongation factor Tu and ATP-synthase beta-subunit genes, Antónie Van Leeuwenhoek, 64:285-305 (1 993) '

Ludwig, W. et al. Phylogenetic relationships of bacteria based on čomparative sequence analysis of elongation factor Tu and ATP-synthase beta-subunit genes, Antónie Van Leeuwenhoek, 64:285-305 (1993)

Billman-Jacobe, H. Nucleotide sequence of a recA gene from Corynebacterium glutamicum,“ DNA Seq., 4(6):403-404 (1994)

Reinscheid, D.J. et al. Malate synthase from Corynebacterium glutamicum pta-ack operon encoding phosphotransacetylase: sequence analysis,“ Microbiology, 1 40:3099-3 1 08 (1 994)

Rainey, F.A. et al. Phylogenetic analysis of the genera Rhodococcus and Norcardia and evidence for the evolutionary origin of the genus Norcardia from within the radiation of Rhodococcus species, Microbioi., 141:523-528 (1995)

Kronemeyer, W. et al. Structure ofthe gluABCD cluster encoding the glutamate uptake systém of Corynebacterium glutamicum,“ J. Bacterioi., 177(5):1 152-1 158 (1995)

Wehrmann, A. et al. Analysis of different DNA fragmente of Corynebacterium glutamicum complementing dapE of Escherichia coli, Microbiology, 40:3349-56 (1994)

Izopropylmalátsyntáza

Izocitrátdehydrogenáza (NADP+)

| Glutamátdehydrogenáza (NADP+)

5-metyltryptofánová rezistencia

Čiastková izocitrátlyáza ?

ATP-ázová-beta-podjednotka

Elongačný faktor T u

Malátsyntáza

16S ribozómová RNA

Glutamátový transportný systém

Sukcinyldiaminopimelátdesukcinyláza

leuA 1

icd

< x Q 0

mtrA

recA

ace A; thiX

tuf

recA

ace B

16SrDNA

gluA; gluB; gluC; gluD

dapE

X70959

X71489

[X72855

X75083, X70584

X75085

X75504

X76875

X77034

X77384

X78491

X80629

55 CO X

X81379

CO CD

TABUĽKA 2 (pokračovanie)

Ruimy, R. et al. “Phylogeny of the genus Corynebacterium deduced from analyses of small-subunit ribosomal DNA sequences, Int. J. Syst. Bacterial., 45(4):740-746(1995)

Serebrijski, I. et al. “Multicopy suppression by asd gene and osmotic stressdependent complementation by heterologous proA in proA mutants, J. Bacterial., 177(24):7255-7260(1995)

Serebrijski, I. et al. ''Multicopy suppression by asd gene and osmotic stressdependent complementation by heterologous proA in proA mutants, J. Bacterial., 177(24):7255-7260(1995)

Pascual, C. et al. Phylogenetic analysis of the genus Corynebacterium based on 16S rRNA gene sequences,1' Int. J. Syst. Bacterial., 45(4):724-728 (1995)

Wehrmann et al. Functional analysis of sequences adjacent to dapE of C. glutamicum proline reveals the presence of aroP, which encodes the aromatic amino acid transportér, J. Bacterial., 177(20):599 1-5993 (1995)

Sakanyan, V. et al. Genes and enzymes of the acetyl cycle of arginine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum: enzýme evolution in the early steps of the arginine pathway, Microbiology, 142:99-108 (1996)

Reinscheid, D.J. et al. Cloning, sequence analysis, expression and inactivation of the Corynebacterium glutamicum pta-ack operon encoding phosphotransacetylase and acetate kinase, Microbiology, 145:503-513 (1999)

Le Marrec, C. et al. “Genetic characterization of site-specific integration functions of phi AAU2 infecting Arthrobacter aureus C70, J. Bacterial., 178(7): 1996-2004 (1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

Patek, M. et al. Promoters from Corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif, Microbiology, 142:1297-1309(1996)

16S ribozómová RNA

Aspartátsemialdehyddehydrogenáza; ?

Gama-glutamylfosfátreduktáza

16S ribozómová RNA

Permeáza aromatickej aminokyseliny, ?

Acetylglutamátkináza; N-acetyl-gamaglutamylfosfátreduktáza; acetyl: ornitín-aminotransferáza; ornitín : karbamoyl-transferáza; glutamát-Nacetyl-transferáza

Fosfátacetyltransferáza; acetátkináza

Miesto pripojenia

Promótorový fragment Fl

Promótorový fragment F2

Promótorový fragment F10

Promótorovýr fragment F13

16SrDNA

asd; lysC

proA

< z Q ω CD

aroP; dapE

argB; argC; argD; argF; argJ

pta; ack A

attB

X8206I

Χ82928

Χ82929

X84257

X85965

X86157

X89084

X89850

X90356

X90357

X90358

X90359

ΓΟΟ

□	p
ο	<3
E (0	§
	c
z
ϋι
o
E	E
□	(0 □ ω
*x. Φ
o	c
m	Φ
φ	ω
φ	c
c	o
	u
o	<0
O	k.
o
E	«Ψ-
o	•C
4=	o k.
(/)	(0
k_	Φ
Φ	ω
O	ό
E o	c CO
u. CL	OT m

E <0

o.	s
Φ	“t
-O	o

O
CD	CD
CO	CO
O	O
σι	01
x	x

CM	CO
CD	CD
CO	CO
O	O
0)	(D
x	x

	IO
CD	CD
CO	CO
O	O
0)	CD
x	x

CO
in	ID
co	CO
01	CT)
x	x

01	T-
xf	N
CD
in	co
01	σι
x	x

TABUĽKA 2 (pokračovanie)

Sahrn, H. et al. D-pantothenate synthesis in Corynebacterium glutamicum and use of panBC and genes encoding L-valine synthesis for D-pantothenate overproduction, Appl. Environ. Microbiol., 65(5): 1 973-1 979 (1 999)

Ramos, A. et al. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding elongation factor P in the ami no-acid producer Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum ATCC 13 869), Gem?, 198:217-222(1997)

Mateos, L.M. et al. Nucleotide sequence of the homoserine kinase (thrB) gene of the Brevibacterium lactofermentum,“ NudeicAcids Res., 15(9):3922 (1987)

Ishino, S. et al. Nucleotide sequence of the meso-diaminopimelate Ddehydrogenase gene from Corynebacterium glutamicum, NudeicAcids Res., 15(9):3917(1987)

Mateos, L.M. et al. Nucleotide sequence of the homoserine dehydrogenase (thrA) gene of the Brevibacterium lactofermentum, Nucleic Acids Res., 15(24):10598(1987)

Peoples, O.P. et al. Nucleotide sequence and fine structural analysis of the Corynebacterium glutamicum hom-thrB operon, Mol. Microbiol., 2(1):63-72 (1988)

Honrubia, M.P. etal. Identification, characterization, and chromosomal organization of the ftsZ gene from Brevibacterium lactofermentum, Mol. Gen. Genet., 259(1):97-104 (1998)

Peter, H. et al. Isolation of the putP gene of Corynebacterium glutamicum pro line and characterization of a low-affinity uptake systém for compatible solutes, Árch. Microbiol., 168(2): 143-151 (1997)

Peters- Wendisch, P.O. et al. Pyruvate carboxylase from Corynebacterium glutamicum: characterization, expression and inactivation of the pyc gene, Microbiology, 144:915-927(1998)

Patek, M. et al. Analysis of the leuB gene from Corynebacterium glutamicum, /fflp/. Microbiol. Biotechnol., 50(1):42-47(1998)

Moreau, S. et al. Site-specific integration of corynephage Phi-16: The construction of an integration vector, Microbiol., 145:539-548 (1999)

Peter, H. et al. Corynebacterium glutamicum is equipped with four secondary carriers for compatible solutes: Identification, sequencing, and characterization of the proline/ectoine uptake systém, ProP, and the ectoine/proline/glycine betaine carrier, EctP.V. Bacterioi, 180(22):6005-6012 (1998)

3-metyl-2oxobutanoáthydroxymetyltransferáza;pantoát -beta-alanínligáza; xylulokináza

Inzerčná sekvencia IS 1207 and transpozáza

Elongačný factor P

Homoserínkináza

Mezodiaminopimelát-D-dehydrogenáza (EC 1.4.1.16)

Homoseríndehydrogenáza

Homoseríndehydrogenáza; homoserínkináza

UPD-N-acetylmuramátalanínligáza;proteín iniciácie delenia alebo proteín bunkového delenia; proteín bunkového delenia

Vysokoafinitný prolínový transportný systém

Pyruvátkarboxyláza

3-izopropylmalátdehydrogenáza

Miesto pripojenia bakteriofágu Phi-16

Proteín prolín/ektoínového transportného systému(pre príjem)

panB; panC; xyiB

thrB

ddh

thrA

horn; thrB

murC; ftsQ/divD; ftsZ

putP

O Q.

CO □ Φ

O. o Q.

X96580

OJ (0 0) (0 0) X

X99289

O o o >

Y00151

Y00476

Y00546

Y08964

Y09I63

Y09548

Y09578

Y 12472

Y12537

TABUĽKA 2 (pokračovanie)

Jakoby, M. et al. Isolation of Corynebacterium glutamicum glnA gene encoding glutamine synthetase 1,“ FEMS Microbiol. Lett., 154(1):81-88 (1997)

Moreau, S. et al. Analysis of the integration functions of φ304L: An integrase module among corynephages, Virology, 255(1): 150-159 (1999)

Oguiza, J.A. et al. A gene encoding arginyl-tRN A synthetase is located in the upstream región of the lysA gene in Brevibacterium lactofermentum: Regulation of argS-lysA cluster expression by arginine, J. Bacteríoi.,\75(22):7356-7362 (1993)

Pisabarro, A. et al. A cluster of three genes (dapA, orf2, and dapB) of Brevibacterium lactofermentum encodes dihydrodipicolinate reductase, and a third polypeptide of unknown function,“./ Bacteríoi, 175(9):2743-2749 (1993)

Malumbres, M. et al. Analysis and expression of the thrC gene of the encoded threonŕne synthase, Appl. Environ. Microbiol., 60(7)2209-2219 (1994)

Oguiza, J.A. et al Multiple sigma factor genes in Brevibacterium lactofermentum: Characterization ofsigAand sigB, J. Bacteríoi., 178(2):550- 553(1996)

Oguiza, J.A. et al The galE gene encoding the UDP-galactose 4-epimerase of Brevibacterium lactofermentum is coupled transcriptionally to the dmdR gene, Gene, 1 77: 1 03-1 07 (1 996)

Oguiza, J.A. et al Multiple sigma factor genes in Brevibacterium lactofermentum: Characterization ofsigAand sigB, J. Bacteríoi., 178(2):550- 553(1996)

Correia, A. et al. Cloning and characterization of an IS- like element present in the genome of Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Gene, 170(1):91-94(1996)

1 Sekvencia pre tento gén bola publikovaná vo vyznačenom odkaze. Avšak sekvencia, ktorú získali autori predloženej prihlášky je signifikantne dlhšia ako je publikovaná verzia. Predpokladá sa, že publikovaná verzia vychádzala z nesprávneho štartovacieho kodónu a tak predstavuje len fragment aktuálnej kódovacej oblasti.

Glutamínsyntetáza I

Dihydrolipoamiddehydrogenáza

Miesto pripojenia Corynephage 304L

Arginyl-tRNA- syntetáza; diaminopimelátdekarboxyláza (čiastková)

Dihydrodipikolinátsyntáza; dihydrodipikolinátreduktáza

Treonínsyntáza

Gén pre 16S ribozómovú RNA |

SigA sigma faktor

Katalytická aktivita UDP-galaktóza-4eplmerázy; regulačný proteín toxínu diftérie

?; SigB sigma faktor

T ranspozáza

glnA

Ipd I

argS; lysA

dap A; dapB

thrC

< z Q ω (D

< D) *(/)

galE; dtxR

orf 1 ; sigB

YI3221

Y 16642

Y 18059

Z21501

Z21502

Z29563

(Z46753 |

Z49822

Z49823

Z49824

Z66534

TABUĽKA 3

Kmene Corynebacterium a Brevibacterium, ktoré sa môžu uplatniť pri využití tohto vynálezu v praxi

	Druh.l·^,í Jlí'Kŕl	^ÄTCCä:	ferm	NRRL	CECT	NCIMB	Ó'CBS·;	nctc	DSMZ
Brevibacterium	ammoniagenes	21054
Brevibacterium	ammoniagenes	19350
Brevibacterium	ammoniagenes	19351
Brevibacterium	ammoniagenes	19352
Brevibacterium	ammoniagenes	19353
Brevibacterium	ammoniagenes	19354
Brevibacterium	ammoniagenes	19355
Brevibacterium	ammoniagenes	19356
Brevibacterium	ammoniagenes	21055
Brevibacterium	ammoniagenes	21077
Brevibacterium	ammoniagenes	21553
Brevibacterium	ammoniagenes	21580
Brevibacterium	ammoniagenes	39101
Brevibacterium	butanicum	21196
Brevibacterium	divaricatum	21792	P928
Brevibacterium	flavum	21474
Brevibacterium	flavum	21129
Brevibacterium	flavum	21518
Brevibacterium	flavum			BI1474
Brevibacterium	flavum			B11472
Brevibacterium	flavum	21127
Brevibacterium	flavum	21128
Brevibacterium	flavum	21427
Brevibacterium	flavum	21475
Brevibacterium	flavum	21517
Brevibacterium	flavum	21528
Brevibacterium	flavum	21529
Brevibacterium	flavum			B11477
Brevibacterium	flavum			BI1478			í ,
Brevibacterium	flavum	21127
Brevibacterium	flavum			BI1474
Brevibacterium	healii	15527
Brevibacterium	ketoglutamicum	21004
Brevibacterium	ketoglutamicum	21089
Brevibacterium	ketosoreductum	21914
Brevibacterium	lactofermentum				70
Brevibacterium	lactofermentum				74
Brevibacterium	lactofermentum				77
Brevibacterium	lactofermentum	21798
Brevibacterium	lactofermentum	21799
Brevibacterium	lactofermentum	21800
Brevibacterium	lactofermentum	21801
Brevibacterium	lactofermentum			B11470

	dŕuh)ÄTÄ.>·,:·.-;	^ATCC·:	ferm	NRRL	CECT	NCIMB	•CBS	nctc	DSMZ
Brevibacterium	lactofermentum	21086
Brevibacterium	lactofermentum	21420
Brevibacterium	lactofermentum	21086
Brevibacterium	lactofermentum	31269
Brevibacterium	linens	9174
Brevibacterium	linens	19391
Brevibacterium	linens	8377
Brevibacterium	paraffinolyticum					11160
Brevibacterium	spec.						717.73
Brevibacterium	spec.						717.73
Brevibacterium	spec.	14604
Brevibacterium	spec.	21860
Brevibacterium	spec.	21864
Brevibacterium	spec.	21865
Brevibacterium	spec.	21866
Brevibacterium	spec.	19240
Corynebacterium	acetoacidophilum	21476
Corynebacterium	acetoacidophilum	13870
Corynebacterium	acetoglutamicum			BI 1473
Corynebacterium	acetoglutamicum			BI 1475
Corynebacterium	acetoglutamicum	15806
Corynebacterium	acetoglutamicum	21491
Corynebacterium	acetoglutamicum	31270
Corynebacterium	acetophilum			B3671
Corynebacterium	ammoniagenes	6872						2399
Corynebacterium	ammoniagenes	15511
Corynebacterium	fujiokense	21496
Corynebacterium	glutamicum	14067
Corynebacterium	glutamicum	39137
Corynebacterium	glutamicum	21254
Corynebacterium	glutamicum	21255
Corynebacterium	glutamicum	31830
Corynebacterium	glutamicum	13032
Corynebacterium	glutamicum	14305
Corynebacterium	glutamicum	15455
Corynebacterium	glutamicum	13058
Corynebacterium	glutamicum	13059
Corynebacterium	glutamicum	13060
Corynebacterium	glutamicum	21492
Corynebacterium	glutamicum	21513
Corynebacterium	glutamicum	21526
Corynebacterium	glutamicum	21543
Corynebacterium	glutamicum	13287
Corynebacterium	glutamicum	21851
Corynebacterium	glutamicum	21253
Corynebacterium	glutamicum	21514
Corynebacterium	glutamicum	21516
Corynebacterium	glutamicum	21299

Rod ·	Druh ' <	<ÄTCC-	FERM	NRRL	CECT	ncimb	CBS	nctg	DSMZ
Corynebacterium	glutamicum	21300
Corynebacterium	glutamicum	39684
Corynebacterium	glutamicum	21488
Corynebacterium	glutamicum	21649
Corynebacterium	glutamicum	21650
Corynebacterium	glutamicum	19223	1
Corynebacterium	glutamicum	13869
Corynebacterium	glutamicum	21157
Corynebacterium	glutamicum	21158
Corynebacterium	glutamicum	21159
Corynebacterium	glutamicum	21355
Corynebacterium	glutamicum	31808
Corynebacterium	glutamicum	21674
Corynebacterium	glutamicum	21562
Corynebacterium	glutamicum	21563
Corynebacterium	glutamicum	21564
Corynebacterium	glutamicum	21565
Corynebacterium	glutamicum	21566
Corynebacterium	glutamicum	21567
Corynebacterium	glutamicum	21568
Corynebacterium	glutamicum	21569
Corynebacterium	glutamicum	21570
Corynebacterium	glutamicum	21571
Corynebacterium	glutamicum	21572
Corynebacterium	glutamicum	21573
Corynebacterium	glutamicum	21579
Corynebacterium	glutamicum	19049
Corynebacterium	glutamicum	19050
Corynebacterium	glutamicum	19051
Corynebacterium	glutamicum	19052
Corynebacterium	glutamicum	19053
Corynebacterium	glutamicum	19054
Corynebacterium	glutamicum	19055
Corynebacterium	glutamicum	19056
Corynebacterium	glutamicum	19057
Corynebacterium	glutamicum	19058
Corynebacterium	glutamicum	19059
Corynebacterium	glutamicum	19060				•
Corynebacterium	glutamicum	19185
Corynebacterium	glutamicum	13286
Corynebacterium	glutamicum	21515
Corynebacterium	glutamicum	21527
Corynebacterium	glutamicum	21544
Corynebacterium	glutamicum	21492
Corynebacterium	glutamicum			B8183
Corynebacterium	glutamicum			B8182
Corynebacterium	glutamicum			B12416
Corynebacterium	glutamicum			B12417

	Druh Γ$·	a:ätcc')<	FERM	NRRL	CEGT	NCIMB	CBS	NCTC	DSMZ
Corynebacterium	glutamicum			B12418
Corynebacterium	glutamicum			BI1476
Corynebacterium	glutamicum	21608
Corynebacterium	lilium		P973
Corynebacterium	nitrilophilus	21419				11594
Corynebacterium	spec.		P4445
Corynebacterium	spec.		P4446
Corynebacterium	spec.	31088
Corynebacterium	spec.	31089
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	31090
Corynebacterium	spec.	15954							20145
Corynebacterium	spec.	21857
Corynebacterium	spec.	21862
Corynebacterium	spec.	21863

ATCC: Američan Type Culture Collection, Rockville, MD, USA

FERM: Fermentation Research Inštitúte, Chiba, Japan

NRRL: ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, IL, USA

CECT: Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Valencia, Spain

NCIMB: National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, UK

CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, NL

NCTC: National Collection of Type Cultures, London, UK

DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany

Na porovnanie pozri Sugawara, H. et al. (1993) World directory of collections of cultures of microorganisms: Bacteria, fungi and yeasts (4* edn), World federation for culture collections world data center on microorganisms Saimata, Japan

E

.S c

σι

σι

CD

CO

r- co

00

CD

CD

CO

b*

00

□

φ

0)

CD

CD

0)

σ> σι

CD

CD

G)

σ>

CD

CD

ra

>N λ

b-’

CD

CD

CO

00 oi

Tt

CO

b·'

iri

Ô

r<

D

Q

O

O

O

O

o o

O

O

O

o

t—

o

5

cô

ó

O

co oo

Ó

A

CM

CM

CM

CD

T—

CM

CM

O CM

CM

t—

T-

γ—

CM

T—

CO	00	00	o	σ> γ-	CO			σ>	in
	CD	CD	M-	οο co	00	CD	M1	CO
T“	in	in	T—	in co	CM	CD		CD	o	lÔ
b*“			co“	K irí	ΙΩ	cm“		(D	oo“	co“
CO	CO	CO	in	id io		'M-		CO	XT	CO

CD CM	co	a CM tw	bCO
	r-	r*· σ>	T“
CM	05	CM
(D	CO		CD
X	Q	<	O

	co	CO						o
	co	CO	O	ir				N
	in	LO	CO	in o				CO	o	o
	o	o	CO	CM CM	r-		b-	(D	Ό—	CO
00	co	CO	lO	CO i-	co	00	co	CO	00 .	(D
in ,			CM	CD	r-		CO	T“	CD	in

ID	o	o		_ Z)		Ti-
γόο f σ	CM ΌF O O o	CM ΌF O O o	CM < co > O	m d Q 0-	CO f 05 CO Q	CD CM b- CD <	b* CD r CM CD Q	CD CD O O	CO f o co Q	ID CM m o
<	<	<	F	-1 <		00 CM		u.	LL	LL
Ό-	či	či	S	S ω	CM	CM	<	<	<
ω	O	0		γ— Ύ—	1—	1—	H	CM	CM	CM
ω	F	F	<	< <	ω	CD	CD	<	<	<
o I	X,	X I	m I	m m I	LU <	LU	LU |	CD I	m I	CD
1 m	1 CO	1 m	1 CD	1 m co	CO	1 m	i CD	1 CD	m	CD
ω	0	0	0	00	0	O	0	0	0	0
								CM
CD			CO		CO			CO
D5			o		Tr-			CD
Iro			CD		ID

LD σ>

boj ó co o

CD ω ó δ

<0 b· _ΛΓ C CO CD A Ln 2 O) O) Ó ^J O O r^05^.° co rr >*b* co o 2>> o CM

OJ

CD

N

Λ? F ®

b*

CO

CO

CO

CD

CD

CD

CD

CO

CD

CD

CO

oj

CD

OJ

CD

CD

O)

CD

CD

CD

σ>

CD

CD

CD

CD

ó

Ó

. O CD

4

N

CD

CD

CM

CM

CM

CM

CD

CD

CD

CD

T“

*“

Φ 2 P

o

O

O

O

t—

τ-

▼“

Τ-

o

o

O

O

|x

oo

CC 2!·

OJ

b-*

b^

b*

CO

Ο

CO

Ο

rx

OJ

ID

OJ

O

o

Í=-> CM

V“

CM

T“

Ύ—

o

t—

o

T—

t—

T—

T- CO

b-

b- CO

ľ- Ί—

CD

CD

CO

rx

CO

rx

co

V“

in

CM

CO

CO (D

CD

CO b-

CD OJ

N

LD

CO

03

m

CO

m

co

o

o

co

t- OJ

o

O CD

Γχ

b- CM

in in

CD

CD

CD

X

CD

co

o

O

fx

O CD

OJ

σί cd

4

xf o'

in

cm’

N

CD

N

O

rx’

in

T“

,x

tn

fx? t-’

CD

o

CD

σ> ·μ·

CD OJ

CO

CO

CO

CO

CD

CD

co

m

in

co

tn m-

E

O = Q Q)

CD C Φ

Q_ Ctí o

E o X

2® 2 φ E o 2 (λ(Λ ϋ

E

E

E

E

E

E

E

E

3

□

3

p

3

□

p

p

'k_

ω

*L_

OT

c ω

ω

’l_

ω

έ ω

‘l.

ω

*u.

Φ *—»

’co

Φ Φ-

’ω

® OT

φ 4—»

'ω

Φ

’ω

2 ω

Φ

’ω

φ

’ω

O

O

o

O

o o

O

p

O

O

o O

o

p

o

p

Ctí

□

ctí

3

5 =

Ctí

3

(tí

□

2 3

Ctí

3

ctí

D

n

u

XJ

O

5 o

XJ

Q

X)

Q

-9 □

XJ

o

XJ

o

o

k_

o

k_

o X-

O

o

k-

o ί-

O

x-

O

U-

o

Φ

o

Φ

O Φ

O

Φ

o

Φ

ο Φ

O

Φ

ω

Φ

>.£>

>»XJ

>5 X)

>%XJ

s

□ φ-

Z>

3 φ*

Σ 2

2

3 Φ-

s

3 Φ*

Σ2

s

3

s

3 «Α

φ co

Q.

E E

3 ” *C W Φ Φ 'ČÄ +—i φ- x* o o o Ctí Ctí -n DD C O O g Q Q φ >* >^X2

3	CD
N	fx.
O	rx
Ctí £ O ctí	CD m tn in
ω	ω
φ	o
O.	2
3	c
C	φ
Ό CD	ctí CL
	N
X3	Tt
.S	p
o	O
c	C
Φ	Φ
Ž	č
Φ	Φ
ω	ω

(tí Ctí

^·	CO rx	o CD	ľt CO	M
CM		rx	CM o	CM
			x co
CD			CD co	CD
CM	<	LU	™ Z)	CM

o (D	uu CD §ľ3	o CO	M/ •Φ O co	, o M- CO
b-	b·	CM M	cm r~-
Ύ™	co 5^		s Fť?	cô Zľ
LU F	CM S Γ-i	LU H	CM Ul jž9	CM LU H H
<	< 5	<	< 5	< <
ΟΙ	Q. Ξ I 1	Q. I	Q. ?
S	1 1 m m	1 z	i 1 m m	m S
ω	o CD	LU	CD CD	CD ui

CM

CO

*<tí

c	c
Φ		Φ
E		E
D)		CD
Φ		Φ	(D
ω		ω	in
• ·		. -	^r
E		E	>*
o		Ό
c		C	3
Φ		Φ	CZ O
O)		CD
		'>
c		C	N
Q.		CL	Ctí
'3		*3	’o
>		>	c
CC		á	Φ
rx		rx	_s£
co		co	φ
X		X	ω
ω		«	ω
’ω		‘ω	’ω
o		O	o
3		3	3
E		O	Q
(D		Φ	Φ
XJ		XJ	X2
3		□	3
a		Φ*
E		E	E
3		p	3
u- Φ		φ	Φ
O		o	O
CC	CM	co	ctí
X)	X) ζί	X3
o	CD	o CD	O
u		o	O
>» s	M·	S CD	>»

in	CD	m
rx	in	rx
v-		V“
>.		>.
3	3	3
C	CZ	C
O	o	O
-X		J£
N	N	N
Ctí	Ctí	Ctí
Ό	Ό	Ό
c	c	c
Φ	Φ	Φ
> -X	>	£
Φ	Φ	Φ
ω	CD	CD
ω	CD	CD
’ω	‘CD	CD
O	O	O
3	3	3
e	Q	O
φ	Φ	Φ
.Ω	Xi	X2
□	3	3
φ>*	φ^
E	E	E
3	3 ·	.2
Φ	L· Φ	k_ φ
O	O	o
Ctí	Ctí	Ctí
X3	xs	X3
O	o	O
O	o	O
	>»	>»
S	s	5

c	C	c
Φ	Φ	<D
E	E	E
CD	CD	ώ φ
Φ	Φ
CD	CD	o m
. -	. -	c ..
E	E	g E
Ό	o	5 o
CZ	c	φ c
Φ	Φ
CD	O)	Jr CT
*>	*>s
C	C	S 2
Q.	Q.	O Q.
'3	O	σ> ·=
>	>	CM >
X	X	in q;
ix.	IX.	“m
CO	CO
x	X	Ό X
CD	CD	E «
CD	CD	N CD
O	O	O O
3	3	-X -J
O	O	Φ P
Φ	Φ	S φ
Xi	XJ	CLX2
3	3	Φ 3
φ-	φ-·	—X φ-«
E	E	E E
3	p	3 3
Φ	Φ	*k_ Φ Φ
O	Q ·	O O
<0	Ctí Q	ctí ctí £J
Λ CM	Xi CD	XJ XJ CD
o	o Z“	O O Ξ
O S CD	£ CD ^CM	>->.CM

	N.
fx		o
	CO		o
in	CO		o
o	*M*	CO	b.
O	00	o	0) b-
Q	CD	-J
<	o	<	N
CD		b-	O
CD	CO	CO	o
rx	CM	CO	CD
05	σ>	o	cn
C)			CO
	CO CO		bQ
	M·		O
in o	CD CD	b. <
o	LD	in	o
o	ω	CD	1-
<		ω	s
ω		T—
CC	<	<	<
CL	m	m	m
m1	m1	m1	m1
CD	CD	CD	0

	T“ O	cn	O
	O	o	o
	O	O	o
	O	o	o
	o	o	o
rx	o	o	Q
N	<	<	<
O	CD	CD	CO
o		O
CO	CO		CO
CD	b-	CO
CO	CO		co
rx	CO	m	CD
b-	m	rx	m
CM
>	>	>	>
CD	0	0	0
1-	tn	ω	ω
S			S
	T“
<	<	<	<
CD	(D	m	m
m	m1	m	m
0	0	0	0

in
O		M-	-t •Cf
	o	CM	CM CM
	b-	o	CO O
	σ>		CO ’t
Q	b-	b-	rx h*
<	N	N	A N
CD	O		in t-
O	o	cn	co cn
	CO	σ>	cn cn
OO	CO	σ>	cd cn
	CO	CO	CO CO
in	b.	xľ	tn O <n
S·	b-	rx	m ix.
v	CM	CM	X cm
>-	>-	>	m >-
0	o	Q	0 o
tn	1-	L—	tn i-
S			Σ 5
T“			T T
<	<	<	< <
m	OD	(U	CD CD
m1	CD1	m1	cq'cd1
0	0	0	0 0

rx	co
co		CO	rx	Tj-
CM	rx	CO	OJ	00
	T”	CM		CD
CO	CO	CO	cn	in
	cn		M-	OJ
o	o	T“
o	o	O	δ	o
o	o	O	o	o
Ctí	Ctí	Ctí	Ctí	ctí
c	c	í	C	ŽS

(D σ>

00

00

CO b-

σι

σ>

b- O

σ>

CD

CO

CD

CO

cd

cd

00

CO

σ>

CD

cd σ>

o

o

CD 0)

σ>

O)

q

O)

CD

q

q

CD

CD

CD

CO

co

CN

CM

CD CD

có

irí

ó

CO

CD

Y”

in

CD

CÓ

ο

o

o o

O

O

O O

q

q

v

o

O

o

o

O

q

CD

cd

r< có

CN

CM

b^ CO

in

10)

00

CO

có

CD

l<

T—

·»“

CN T“

O

O

t- CN

o

CN

CN

CN

T—

o

T“

t—

CO

CD

CM

CD

CD

tx

CN

CN

CD

CD

T“

CD

CD

CO

CM

CD

CD

V“

T—

co

o

1—

CO

CO

LD

ID

O

CO

ID

in

CN

CO

CN

Φ

CO

CD

CD

O

CO

rx

ID

CO

LO

b-

CD

CO

00

CN

K

CÓ

co

CO

oo

CÓ

co

CD

00

in

tfí

CO

CO

CO

M*

ω

LD

CO

CO

co

CO

CO

CO

CD

’C cn © ω	UJ .= έ 3	□ U	3 Q
o o		CO	M	(0
co 5	c	3	3	3
•2 o O Jr	CO 3	E	E	E
O G)	tá	cn	CO	CO
	CO	3	3	3
5 2	a:	S	S	S

co	CD
CO CM	CD	o
CD	CD	CO
CN CN	O	CM
CD O	y—	CN
CD -1	—1	CO
N <	<	Z3

T

Ύ—

0J

OJ (x

o

ID

o

CD

CD

ID

00 CO

CD

CD

O

CD

b*

y—

CD

CD

b- CO

O

b-

CO CN

CD

CD

N

ID

CD

CN

CD

CD

O Ί~

CD

CD

-e o

CO

b*

tí-

b.

o

CO

ID

00

b-

CO

CO.

r- CO

M*

Tj· b-

CN

CN

CM

b-

lo ,

co

CO

Tf ιχ OJ > O H

M fx OJ > O J—

m n ® 2 m CC ID tn oj u S I- <

MCO CN O CD CO <

o CO CN O CD CO <

rx CO CM co m o

o UJ <o Q

O CO CN CN CO ZD —n

m í UJ UJ Q

O) 00 CD O) o o O <

CO rx o co o

CO MO m CN CO 0 <

CO 5 CD bCD <

CM 0 O > Q J-

CO LD b- CD O u_

S

s

< ·CĽ *“

CD CN

<b CN

ss

to

m

CL

có

u_ «£

T—

co

2

<

L

x Ι-

P-

ρ-

•r· v

f—

L-

L-

0

to

1—

τ—

ČN

<

<

Ο ω

ω

ω

< <

<

<

<

H

Ó

to

ω

<

<

m 1

m |

CC UJ 1 I

uj |

UJ I

m m I I

m I

cn t

m I

X

CC I

UJ I

m I

cn I

cn

1 m

1 1 m m

1 cn

CD

mm

m

1 tn

1 m

1 m

1 m

m

1 CD

m

1 m

0

0

00

0

0

00

0

0

0

0

0

0

0

0

0

	in
00	CD	CD	b-	CD
CO	o	ΊΓ-	o	O
b*	»“		T“	(D
CD	CN	CD		in
CD	o	O	CN	CN
	CN	CN	CN	CN
O	O	O	O	O
o	O	O	O	O
CO	cO	CO	CO	CO
2	s	2	2	ŽS

CO p

05	b	σ>	CO	OO	CO	CD CO	05	IO		05	σ>
05	05	σ>	O)	O)	05	o> σ>	05	05	05	05	05
05	05	CM	CO	CD	CD	cô cô	CÔ	σ>	*r~	CD	CM
O	O	o	o	O	O	p o	O	o	T“	p	7—
b	05	r<	b	CO	CO	cô m·	CO	CD	CO		CM
CM	CM	o	T“	T“	T“	o o	O	o	o	t—	O

CO	00	CM	m	O	O)	CO 10	05	b	10	CM	o
CM	CD	o	b*	CO	co	05 10	O	O)	T“	O	05
b	CO	p	co	CO	b	CO CO	10	05	05	p	CO
CO			CM	O	T--	0) 0)	co	cm’	b	γ^	co’
LO	in	m	M-	’ď’		CO	CO	M-	CO		CO

b (fí CO

CX (0 u

Έ Q.

Ξ CX

E

E

E

CX co cn

CO

CO 3 4-* o

ω

CO

(0

ω

O

O

□

3

3

<0

c

c

c

c

Φ

4o (0

E L·.

E u.

*k— φ 4-·

ω ’ω

‘x_ Φ 4-^

(0 ’C ω S

ω ’co

c O

Φ ‘cx

O .Ω

φ cx

Φ Q_

Φ 'ex

rt

** CO cb

Q

Φ

Φ

O

o

O

o o

E

(Q

CQ

CQ

CQ

f“

O)

O

ω y—

ω

£ “

£

CQ

3

cn

3 g

3

o

(0

CQ

(0

CO

CO

JL. ri

o

φ c

^3 u

o =! L_ — to 'o

□ CQ

0 O O

ϋ Φ

X2 o o

o *8 u- o Φ o

U u- Φ

σ 3 Φ

O E

CO Φ Ό

o E

O E

O E

O ω λ

C CQ

Ό

Q

m

Φ «

Φ

X5

>7

0 >»

n

CO

o

Φ

o

o

o

u

Φ

<

m

m

w CD

ω

S

D 4-^

s

a s

2

Q.

r

<

T

I

I

o

E

G)

segment	segment	segment
E	E	E
O	O	Ό
c	c	C
Φ	Φ	Φ
CJ>	CD	CD
		->
c	c	C
Q.	CX	Q.
O	*3	*3
>	>	>
CC	(X	d
r*	r.	b
CO	CO	CO
I	ľĽ	x
CO	<0	CO
(0	<0	CO
o	o	o
3	3	3
O	O	□
Φ	Φ	Φ
0	0	0
3	3	3
		+*
E	E	E
_3	_3	_3
Φ	Φ	Φ
O	O	O ·
CQ *	CO cm	CO CM
xs ™	xi cd	XI CD
O to	O T	O T“
O	O ÍF	o
>ΊΟ Σ CM	s £	r?

<	*<0
c		o
. o	cx	Φ	CD
A	'3	’c	10 O)
	C XD	o .x
Si	O)	ČO	H I
O -o		<
•«J c	CO	z	’T
c ® Q. CT	cx	Q o	£ *>
'3 W		CO	CQ
c c Φ	«□	c Φ	‘«Τ'

o	CO	00		a> —	O)
LO				05	05					UJ	CD
10	CD	T—	CM			— M-	10	CO	CM	CO	O
CM	10	CM	CD	05	O)	O CD		CO	CO	CM	t—
	CD	M		O	O	to o>			O	’O
O	CO	O	b.	O	O	O CD	T“	ž		CO	O
LL	O	05	b	-J	_J	ĽL r—	U_	CM	CD	b»	O
<	UJ	O	N	<	<	< m	<	1—	S	<	<

b co co b CO

CO

	CO	o	O	CD
o	CO	CD	T—	10	10	CO	b				CM
05	O	CO	CM	CO	CO	CO 0)	CO	CO	co	CM	CD
CD	10	CD	b	05	05	O CD	00			7—	CO
CM	7—	t-	CO	CD	CD	r- M-	r-	cô	CM	CD	T“

	m
	O		1-	0
05	10		I	0
b	10	CO	Q	CM
CO CD O	CM O	LO CO CO	< 0	> 0
U-	u_	O	<	1-
<	<	UJ	CQ	2
čm	cm	H
<	<ť	<	<	<
m	m	CL	CQ	CQ
m	m	CQ	CQ*	CQ
ω	0	0	0	0
	CO
	10
	T—			CO
	t-			CD
	CD
	tT			10
	CM			CM
	O			O
	O			O
	CQ			Φ
	2			X L—

		Z- CD	05 ’í	CO CO CO	0 s	CD CO CM	O) CD O T“
0 0 >	0 0 >	0 05 ίο co o	10 ’t	u. Σ	co b	Τ- Ο Q
F-	H	n CQ	T~	1—	ZJ	CM CO	<
2	S	< «	Ll_ <		T	ώ
	•Y^	CM 0	CM	H		H	0
<	<	<£	ω	x	ω	1-
CQ	CD	CQ 0		LU	D-	Ul	I
CQ	CQ	CQ CD	CD	CD	CD	1 CD	1 CD
0	0	00	0	0	0	0	0
		M-		10			b
		CO		CO			CD
		7“		0			cn
		7“		r-			CM
		CO		CO			CD
		CO		05			cn
		CM		CM			CM
		O		O			0
		O		O			0
		CO		CQ			CQ
		č		2			S

b-

05

05

m

CO

05

05

CO

CM

CM

CO

CO

CO

CO

05

CO

05

05

05

05

05

CD

0)

0)

0)

05

O)

0)

0)

05

05

05

05

0)

05

O)

05

05

05

05

05

CD

có

CM

05

V“

CM

O)

05

Ó

CM

CM

ID

LÍ5

IO

to

b·.’

iri

CD

CO

CÓ

05

05

O

V“

O

o

O

O

τ-

i—

t—

O

O

o

o

o

o

O

p

O

O

O

Ó

CM

CM

CM

CO

05

05

Ο)

T-*

τ-Σ

05

05

O)

CD

r<

có

có

CÓ

CD

CD

CM

O

O

CM

CM

O

T-

t—

O

O

o

T-

V“

»—

CM

CM

CM

O

O

CO

CO

t O CO

CO

O

>4· CO

CO

CD CO

CM

04 CO

O

LO

IÍ5

05

05

CO

CD

CD O CD

CD

M

CO o

CM

CM O

M

CO

't

IO

CO

b-

b-

04

CD

CD O OJ

04

CD

CD CO

CO

CD 04

LO CO

04

ID

Υ-

O

in

C0* «4*

co

co“

5Γ 04*

04*

04* CM

00*

CO ID

CO*

CD*

U)

ΙΟ

CO

CO

CO CO CO

CO

CD

CD CO

CO

CO M

CO

CD CO

CD

CD

CO

CO

CO

ω cn

		CO (0			φ Φ
		D D u. > > ω			ω ω (Q CQ
ω		ω	ω	O O
c Φ	Φ	k. U. f- θ θ « Φ	c , Φ	c Φ	ω ω D D
Q.	« c§	~ g ,i ’ČL	Q.	’q.
CQ	~r~ 0)	E E > cb	CQ	CQ	O O
ω	CL O	CB « ce J?	CO	ω	CQ CQ o ô
o E	o £ CO CO 2 04	o o o £ u ’C u E	O E	o E	O O +O o
o	CQ CQ CO O	o	o	cg cb
T	Q E	> > > I	X	X

O o φ Φ
c o	O ·«
Jŕ	.x c	C
i	CL	Q.
ib	ID o	O
		• ·>
c	£ m	CB IO

ο CO

CM

CM

CM O

CO

CO

CO

00

00

CO

CO

o

O

CD

CO

(0

CO

O

N

o

CD

T

0)

o

’T

CM

05

1D

co

CO

05

b-

0)

05

O

05

bx

b-

CO

CD

cô

LO

05

05

00

00

00

05

T“

CO

0)

CD

CO

00

CO

LD

m

m

05

co

CO

CO

M*

CM

CO

CO

CO

CM

CM

7“

T“

T“

i- (

i“

T-

Τ’!

'T“

CO

CM

CM

CM

t CM

	m m Ul Ul	UJ u__
bx	ω ω	CĽ Q- 0- z
CO	< <	H HH 2
O)	0- Q.	ZD Z3 Σ)
o	H H	X Q. Q. O
o o	< < O Q
<	—1 —1	co co cn <
čo	y— T—	m
x	< <	< < < CC
x |	m m I I	m co m cl t 1 1 1
1 m	I 1 m m	1 1 1 1 m m m m
0	00	0000

o

CO 1T- 04 04 CD •’t iŕ O O	r-	04 CM CM		CD <
CM M >	M σ	bCO CM	CO 144
o o	O	<	▼—	Ul
O 0	1—	čm	LL	o
< <	s		<
m· m		čo	ä	0
CC CC	<	cn	H
Q-|Q-|	CO I		Q_ I	X
CQ CQ	CQ	CQ	1 CQ	1 CQ
0 0	0	0	0	0

H I m

	b.	05
CO	bx	b*	m	’t	CO	b*
in	b-	O		CO	CM	O
m	b-	LD	CD	Ύ-	»“	CO
o	bx	b-	00	05	O	05
		CM	CM	CM		b-
co	CO	CO	CO	CO	CO	CO
o	O	O	O	O	o	o
o	o	O	O	O	o	o
(Q	CQ	CQ	CQ	(Q	CQ	CQ
č	£	č	S	e	£	JS

i m

σ> OJ

0)

0)

CO

CO

0)

0>

co co

CD

cn

CD

00

0)

b*

0)

σ>

p

0)

p

0)

0)

σ>

σ> tn

σ>

o

O)

0)

0)

O

O

o

yj

N

0)

0)

CD

bl

cô co

CM

σ>

oj

CD

LO

CÓ

co

oj

Τ-

O

o

o

p

o

o o

τ-

o

Τ-

O

O

O

p

o

Ο

in

cm

CM

τί

CD

oi r<

Η

co

Ο

N

0)

CM

yX

CÓ

04

T—

o

O

T—

T“

CM i-

o

T-

T-

1—

04

CM

o

Od

CO

CO

CM

O

04 CM

04

m

CM

04

CO

CD

04

00

ID

CD

o in

tn

b*

CM

CM

τ-

CM

cn

Tŕ

T·

T“

i—

p

b· 00

00

00

O

O

Ο

CM

CD

t-

Τ-Γ

τ-Γ

y-ľ

co’ T-

Τ-Γ

cd“

o‘

O

OO

oo’

b·’

cd“

’t

M-

CO IO

in

co

CO

CD

CM

CO

CO

CO

CO	ω	cn	CO	CO L—	CO	ω E	E	CO
c	c	2	2	x:	c	c s	D	c
φ ’o.	Φ ’q.	□ O	2 O	E	Φ ‘q.	Φ 'c tn 0.2«	·ιζ ω ω ω	Φ ’o.
ro	ro	CO	CO	2	ro	co o o	u o	ro
cn	co	2	2	’o.	co	« « 3	S Ď	ω
o	o	E	E	>» <0	O	o -2 o x O	£ υ o	o
E	E	cn	C0	cn	E	E o g	Q Φ	E
o	o	2	2	O	o	O >»-O		o
x	X	S	S	0	X	153	S 5	X

o		O
ro	CO	ro
xo	2	X0
>»	S	>*
5 co	S £	5 00
co	-J £i	CO
0)	S ° TI	0)

^í·	<r-	CM	O
O	b·				in
o		o	CO	in	in	CD
o	o	O		in	Τ-	CO
o	o	o	CO	00	Ο
o	o	o	o	04	o	04
o	Q.	Q	00	0)	u_
<	<	<	N	N	' <	>

b-

00

y—

CD

M-

m

o

00

00

03

b· co

m

CD

CD

00

τ-

00

04

CO

CD

m

00

00 co

o

M-

T“

o

Ο

CO

00

CD

CD

CD

CD

CD

in O

o

CM

b·

b>

b-

b*

CM

CO

in

in

in

b*

T“

b-

CO

co

CM

T

»

CM

0)

0)

o

CD

ID

in

’t

CO

CO

CO

in

to

o

b-

CM

CO

ID

CD

m

in

cn

0)

Tb

co

Ύ~

^r

CD

τ-

O

Ύ—

in

o

o

o

CD

o

0. O

CM

o

CM

Ο

00

O

§

CD

co

CM

04

04

T

CM

o

K

C3

o

o

b>

T”

b-

ľ-

< CM

>“

o

>-

>

Li.

2 A

o

σ

<?

<

σ

Q- >

0

CL

0

LU

<

LL· f >

O

<

*<

<

CD H

CD

<

CD

H

Q

ω

j

<

CO CM

ČÓ C\l

CM CO

^ŕ

I 5

S

5

s

x

-1

ČM

ω

1—

H

H

CD

r-

0

T“

0

CM

0

ω

0

CO

ω

CD

CC <

<

H

<

<

H

CC

<

H

°ι

ω I

LU i

LLl I

o. m 1 1

ta t

X t

m I

m |

X 1

CL I

m I

X,

CD

1 CD

1 m

1 m

m

1 1 m m

m

tn

m

1 m

1 m

1 m

tn

m

0

0

0

0

O

00

0

ω

0

o

0

0

0

0

TT

b*

0)

CM

CO

cn

00

CM

CD

o

IO

b*

CO

cn

T-

y-

m

00

b-

CO

00

00

00

04

00

CO

co

CO

•M-

M-

o

o

o

O

O

o

o

o

O

o

ro

ro

ro

ro

ro

G3

G)

CO

cn cd

CD

CD

CD CD

CO

CD

b

CD

to

to

CD

b G)

CO

b

q

q

cn

G)

cn cn

CD

q

CD CD

q

CD

q

CD

CD

O)

q

q q

q

q

T“

Τ-

CD

σ>

b-' CM

CM*

m-

b-’ CO

T—'

CD

’ď·

CD

b

b

CO

CD

co

τ-

Ι“

o

o

o q

q

q

O O

T“

O

q

O

q

q

T“

O

O

o

C0

CO

b

ó

M- O*

T-

to

CM

b

b

M

Tj-

CO

CM CO

Ó

CM

CM

CM

T”

CM

T- CM

CM

CM

T- o

T—

o

CM

o

T“

CO

v-

G)

CM

9

co cn

CD

cn

CD CO

CD

CO

r-

CD

CM

CM

to

to

CO

o

CO

CD 00

CO

co

CD T-

CO

CO

Tf

G)

CM

CD CO

CD

CO

CM

ID CD

CO

co

CD CO

CD

q

CO

CO

S

CM

O

cd”

co

CD

CD

co' K

b

o

Cb O

oi

V

cn

oo“

co“ b

CD

CO

CO

to

to

-Φ CO

CO

Tf CD

-t

ω

m

to

co

CO CO

CO

CO	C/)	E	E	o	.$2		CD		O	o
c	c		.2	u	T		T*		O)	o
Φ	Φ	CO φ tn	'k_ φ	ω .2	TJ X)		TJ XJ		Φ Ž	CO
Q. CO ω	CL CO ω	JZ w o o CO s	g CO	+= x: CO u C Έ	CO £ *_	W	CO .c k.	CD	o c	x: o	φ c
Q	0	•2 o	n	E φ	o	c	o	c	CD	φ	o
E	E	o Φ	o o	O_c Φ Q	c Φ	CO D)	c Φ	CO CD	ZJ ti	£ o	E
o	o		>»	E ω	CO	Φ	(0	Φ	CO	CD	CO
I	X	S 2	5	ω ĽU	O	Φ	o	Φ	CC	UJ	ω

v—

ν-

o

CO

CD

CO

y—

00

Ύ“

τ-

00

to

V

to

b

b

to

to

CO

r- S?

ο

to

b (D

CM

O

CM

00

00

00

o 00

o

o

CO

CO

co

in $d

CD

to b

O

00

co

00

b*

b

o

CO θ

CO

to

to

to

to

co 2

O

CM

CO 00

o

CD

CD

CD

CO

CO

t-

o

to

O

co o

O

CO 1“

o

o

en

o

CO

CO

o

S f?

o

CO

b

b.

G)

CD

n> O

O

CD

b to

in

:□

<

o

T“

o

CD O

o

CD

R

R

N

X

Σ) <

<

<

=) =D

<

<

<

<

x

x

<

x <

<

x

Tt

M-

en

CO

O

OJ O

O

CM

CD

CO ’T-

o

CO

CM

CM

to

CD

CD CO

CO

CO r-

CD

o

o

00

CD 00

o

CD

to

b

co co

00

T—

00 b*

xr

CD

en

CD

CO

CO

M*

M*

00

OO

CM

b

oj en

CD

00

CM CO

CM

b

CM

b

o

1- O

00

T“

CO

CO

CM

T“

t- OJ

CM

, M* ·

-r- 00

CO

co

CO

T“

Ύ—

00

00 oo

CO

CO

	t—	oo		T”	V—	00	1
T“ o	T“ O	0		ID O)	CD	to	ID Js.	O
b	b	CM	s	CO <D	CD	CM	00 co
CM	CM	CM	t-	en o	O	O	co
	T“	>“		ľ~ o	O	CD	ľ»· LT)	Q
ĽU	UJ	O	0		O		Σ3 ľD	o
ω	ω	h-	ω	O <	<		O H	UJ
x	I	S	S	UJ či	CM	G) CM	UJ CD	<
či	či	T“	4í	CM 0	0	H	či ČM	ČM
cr	CC	<	<	< H	H	ω	< <	<
0-,	D-	m	m I	“Λ	I,	in |	mm	m 1
m	1 m	1 m	1 m	mm	1 m	m	mm	1 m
0	0	0	0	00	0	0	00	0

CO	co	CO				z			z
to CM 00	o CO	to CM co			b-	LU 0	b	00 in	UJ 0
CD	co	CD	u_	LL	00	m	00	o	m
o D <		O Ό <	CC O	CC O	o o	y: Ύ— oo	o o	-t o o	CO
CM CO	en	CM CO	< Q.	< Q_	O <	£	Q <	Q <	<Č
h“ ω	H ω	H ω	T“ <	<	ľí	□	3	či CC	Ľi
ω I	in I	ω I	m I	m I	0L I	Q. 1	Οι 1	D-	0. I
1 m	m	1 m	1 m	1 m	CQ	1 m	m	1 m	1 m
0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

to	00	co	o
T“	v—		CM
CD	b.		CO
v-	CM	b	00
Ύ“	T—	T”
to	to	to	in
o	o	o	o
o	o	o	o
CO	CO	CO	CO
č	s	č	£

00	o	en
b·	CD	co	T“
CO	00	CO	•3·
CM		^·	Tt
CO	to	G)	o
o	CO	b	CD
CO	CD	CD	CD
o	o	O	O
o	o	O	O
CO	CO	CO	CO
s	s	2	s

O)

CD

σ>

cn n>

CD

CD

CD

cn

b-

<D

00

<«-

CD

00

CD

CD

CD

CD

σ>

OJ OJ

O)

CD

CD

a>

CD

CD

CD

cn

CD

CD

CD

CD

to

CD

cd

oj τ2

t<

l<

CM

CM

có

b*

T—

CÓ

CD

Ó

CD

o

O

o

O τη

O

O

O

O

i“

o

O

O

i-

O

b-'

io

ιο

co iri

o

CÓ

CO

cn

CM

CM

CO

CM

CD

CD

Ó

o

Ύ“

CM T-

CO

O

O

o

t-

O

T”

CM

O

T“

i”

T“

CD

CD

CO CD

00

,—

T—

in

CO

•t—

CD

σ>

tb

b-

|b

b*

Tt CM

in

io

CO

CO

o

’tf·

CD

CM

co

00

T“

CD

CD

T“

•M*

b-

o

o

CM

(D

|b

b-

CD

cn

O

CD

b-”

N

b* «

CD

V-T

CÓ

CÓ

CD

O

K

CD

f

Υ-

CD*

CO

CO

CO CO

CO

CO

co

CO

•’t

CO

in

cn

ΙΟ

CO

xz	. - JC
ω	F o
*>»	r: >>
c	< c
cti	cd ra	Cti
Ό	CO Ό
Cti	m ra	’ô
CM.C	c
1 o	1 o	Φ
Q.	T— Q.	ž
(Λ	m m
□	• 3 CD Φ	Φ
Φ	ω
C	H c	<0
O	q 2	c
	v	Q.

CD	LO	LO	05 CO	o	o	o	o
tí	CM	CM	F OJ	CO		CM	CM
CO	CO	CO	T- CO	CD	o	00	00
CO	O	O	CO o	CD	CO	CD	O)
CM			o o	o	CD
O	o	o	o o		T”	o	o
CD	o	o	U LU	Σ3	>	_J	-J
<	<	<	< <	<	<	<	<

N	CD	CM cn f		CD	rb bM-
CD LO CM	b·	oj	CM	io
CD Tŕ	o Ľ	O £	o o CD	O CD σ
<	X	<	N	D	<

o

o

LO

CO

CO

T“

Ύ“

’t b·

CO

CM

CM

LO

00

t—

y—

b- O

b-

CM

CM

CD

LO

CD

O

M*

|b

b-

i- b-

CM

cn

O

O

Y”

•M·

b-

CD

CD

CM

LO

CO

CD

CD

00 O

T“

f

CD

CD

CO

LO

CD

O

CM

(D

LO

O

i—

t— t-

CM

CM

r-

T*

CO

CM

CO

CM

io

00 CD CD

m CM cn o ΤΟ

in CM cn o o

OJ CO F OJ r;00 00 O o o

’t < cc

O o CO CD Ί— š IO CO

S f cn “3 Q

2 ín ~3 O

CD CD CO ’ti’ 00

O bLO LO CD b*

rb Tf T— CD LO CM

CM 0 O

CM I

F CM >

co m o o CO

b» h* τΤ O CD O

CM o

U

U

o O

00

ω

ω

< Ťŕ CO

cc

f

O

Z)

<

CD <

< ω

< ôj

O LU < <

s Q

x Ój

x CM

CM

IO CM

< ϋ

O ω

F Σ

LU CC

IO T“

0

0

ŤŤ CM

H

0

0

ρ-

H

h“

^z

Τ'

^z

ČM

CD

F

H

CC <

T“ Z -“l

CO

F

F

ω

CD

ω

<

<

<

<

CD

Q.

I |

T,

CL CD I I

ω

X I

x |

UJ I

UJ I

UJ i

CO I

CD I

CO i

mi

0 I

1 CD

CD

CD

CD (D

1 CD

1 CD

1 CD

CD

1 CD

CD

1 m

1 CD

CD

1 CD

CD

CD

0

O

0

0 0

0

O

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

m

V“

CM b· CM cd

b.

CM

CD

CD O

CM

co co

CD

O O |b O o CO

CO

O bO

O CO

CN O

00

CO

00

o cd

cn

o

00

σ>

σ> σ>

b. σ>

o

00

00

σ>

O)

o

o o

o

Φ

CD

o

σ> o

o o

o

o

O

CD

co

τ-

CO

CÓ CO

l<

b*

CÓ

co

có co

Ó v—

CO

o

Ο

o

o o

o

O

O

o

o o

o

T—

Ι-

y—

in

r<

b^ ib

có

CÓ

có

b- co

t— ó

ô

r<

CO

Ο

o

OJ OJ

OJ

CM

o

CM

CM t-

o co

CO

CM

O

(O

b-

O CO

m

in

’t

o m

cn

LO

CM

co

CM

00

CM

o a>

co

co

CO

CO

b- ID

<- n-

o

00

T

o

cq

m co

t-

00

CO

T“

CO CO

00

CO

CM

ID

co“

co“

CN co

m“

in

in

o“

’T-“ b·’

-r-'co'

co“

co“

τ-Γ

co

CO

CO

co m

co

co

co

M·

CD CO

N· CO

CO

CD

’ď

CO

	φ	Φ k—
w	to	to	E		E	to	CO O)
c	c	c	.2		.3	c
Φ	Φ	Φ	*kZ	to	*c	Φ	□
’o.	’o.	Q.	φ	’«	Φ	‘q.	>
CO	(0	CO	o	o	o	CO	E
«	to	to	CO	□	CO	to	T
o	o	o	xs o	e	XS o	o	Φ
E	E	E	g	Φ	u o	E	Ό t_
o	o	o	>*	X)	>»	o	O

O	o o	00	CO	N	b*
v			O W	ID	ID	τ-	σ>	o>
CO	00	o	in co	r—		Ο	00	’tf·	oo
		o	in co	00	00	in		O)	co
CM	CO	b-	CO CN	O	o	o	CM
CM	o	o	o >-	o	o	o	o	o	CM
	CO	b.	_l LL	Q	o	O	-1	-J	00
	z	N	< <	<	<	<	<	<	N

fto ^-		ID	CO
CN ·Ν·		CM
CO CO	CO	σ>	ID	o
cn σ>	(Λ		O)	CM
T- tto	b-	CM	γ-	O
o o	O	o	Ο	00
U- _J			CO	CO
< <	<	<	<	X

				CM	CM	CD			CM
		O		03	α	N	O		’T
		O	O CM	b-		T“	o		O)
CO	Τ’	OO	CO *M-	00	00	b«	CM	b^	oo
	O	CD	b- 00			CO	b-	’ú-	CM
	CM	CO	CO CM		T“		CO	CO	t-

	00	00
	o	o	ID
	CM	CM	CM	b-	00
CD	00	00	O	t—	O
	CM	CM	CO		O
CO	t—	t—			b-

O

CO M W	00 ’t CD O CO z	Q o > O H	ps □ 2 O™ -J u-
	ib	S	S <
1—	ι-	T-	CM
ω	ω	<	< <
LU 1	ω |	m 1	CD CD I 1
1 cn	m	m	1 1 co m
ω	0	O	00

00	00
LD	in	n		CN
				cn --
co	CO	o	b·	cn ¢)
o	o	ID		T“ 1_
o	o	o	o	CD m
0	0	o	>	o T
<	<	O <	H	-J CD
CN	04	5	S x
0	0	CO	T“	ČN
1—	I-	CC	<	< CC
I |	I i	Ο-	CD I	CD d. I 1
1 cn	1 CD	Ι CO	CD	1 1 cn cn
0	0	0	0	00

fto tto

CD [to T-	σ> Ύ~	CO	a. CC
CN CO	CO	CN		<
CO “>	“0	CN	ID	<ŕ
CO Q	O	O	O)	«**» LL
oí	CD	>	O	CD
	I	f-	CD	O
< CN	ČN	S	<	CD
^0	0		y—
1—	<	<
Q- I i r	I,	CD 1	“l	CL I
1 1 cn tn	cn	1 CD	tn	1 CD
00	0	0	0	0

in	ID	oo	b-	b-
o	03	CM	CD	CM
o	CO	f—	h*	CM
			»“
CM	CO	tí*	03	O
00	00	G)	03	o
b.	b-	b-	b«	00
O	o	O	O	o
O	o	O	O	o
CO	CO	CO	CO	CO
c	ŽS	2	S·	č

CD

o>

CD

CD

oj

03

CO

CD

CO

co

Q)

CD

0)

03

b-

O)

CD

σ>

03

CD

O)

p

p

o>

03

p

p

CD

o>

CD

CD

σ>

CD

CD

CD

có

cd

ó

tri

iri

CO

O)

10

CO

CĎ

CD

CO

cm

O

CÓ

o

o

p

▼“

o

o

o

p

o

o

O

o

p

p

T“

N

N

có

o>

y-’

ó

CM

CM

có

in

LO

^ŕ

t—

T“

CM

T“

o

CM

CM

1-

O

1—

i—

*—

CM

o

o

CM

CO

CO

o

LD CM

CM

Xt

M

T“

CD O CD

h- O

b*

b*

in

00

00

00

CO

CO CO

O

T“

•y—

CO

ί- ί- CO

CO Tt

in

in

CD

CD

CM

p

b*

l\

CD

b- CD ID

co co

o

CM

cd’

CD CD

L0

in

cd

CD CD t-

cd T-“

xŕ

cm’

cd“

co“

CD

CO

CO M*

CO

CO

co

co

co co m

m- -T

co

co

CO

CO

CO

CO o

ω	W	CO	CO	E
c	□	c	c	D
Φ	D	Φ	Φ	•c cn 2 ω
Q.	U	’o.	Q.
cú	w	CO	CO	o o
ω	2	CO	CO	CO o
O	E	o	o	o y
E	CO	E	E	o Φ
o	□	o	o	>.XJ
X	s	T	x	S Ξ

£	f x:
O '>»	* o ,λ'*1
C	S2 c
CO	CO oj
Ό	CM T>
.ES Έ	cm ra
o -c

CO co in

CO	t-	b.		CD				00	T-	y— .
CD	CM	O>		CD		CO	CO	b	in	in
CM	O	00	b*	M	CD <D	b.	b*		co	co	CM
b·	CM	CD	h*	O	m cm	b*	b*	CD	o	o	b·.
O	CM	CO	CO		co cn	o	o	O	▼“		θ
O	O	CM	CD	o	CD CD	o	o	b*	o	o	CD
O	_J	“J		UL	05 CM	Q	O	<ζ	o	O	CD
<	<	<	X	<	xo	<	<	<	<	<	N

			o	o		o
o	CD		cn	05	O	b-
in	T” T”	CO	CD	CD	CD	b- CD CD
o	CD M-	10	h-	b-	CO	CM O 05
CD	C0 t“	in	CD	CD	O	CD CM CO
CD	CO	co			M*	i- CD v
	CO S § CM 2 co g O “		CD	CD		b-
o O in	CM x	CD CM bO	CD CM bO	CD ’Φ	S<g CD H X
T“ t	CO CM Ii	O O	O O	O >	ľľ) < o
r- Σ	-i US <	UJ O	< CM	< CM	FS	Q < uOO <
•Z-	F ČM	0	0		äľiS!
<	< <		h-	H	<
m I	m m 1 1	t	X |	X |	m	£L OL m
m	mm	m	1 m	m	1 m	m m m
0	0 o	o	0	0	0	000

	N CD	bCD	o	o	Ί-
CO	CM	CM			b^	σο
CO b-	00	CO	CD	o	o	CD
CO -I-	OO	00	O	CM	CM	00
b- CD	T“			CM	CM	CD
	*t		00 fK.			CO <
CO < in í”	CO N	co b-	Tŕ Q)	in CD	in CD
b O O	b* o o	o N	o o	o o	m o >
Q	o	5	o	Q	O
<	<	**< CD	<	<	1-
CĽ ®	CM	CM	Ťŕ	ŤŤ	2
T“ h“	□	0	1—	0	0
< ω	H	H	ω	1—	H	<
CD UJ I |	X I	x |	LU I	I,	x	m
mm	1 CD	1 m	m	m	1 m	1 m
0 0	0	0	0	0	0	0

cobinb.

oo

in	T“	CM
CM	b-	b-
00	CD	00
o	O	O
o	O	O
Φ	03	CO
č	2	£

r·	00	10
*T	10	y—	03
CM	10	i—	O
CM	03	CM	T“
03	03	CO	10	L0
b*	O			CD
CO	03	03	03	CD
O	O	O	O	O
o	O	O	O	O
CO	CO	CO	CO	<0
c	c	δ	2	S

CO

CO

cd

co

co

CO

CD

b-

b*

b-

00 b-

h*

b*

CD

LD

id

00

00

CO

σ>

O

CD

0)

o

CD

CD

<D

q

q

CD CD

0)

CD

q

CD

CD

CD

CD

CD

co

CD

cô

CO

cô

CM

CD

σ>

CM (D

O>

cď

r<

r<

r<

q

o

o

O

o

T~

O

o

^-

T“ O

O

o

τ—

q

q

q

q

q

m·

r<

l<

r<

LD

in

r<

CM

CD

rt CM

CM

CM

CÔ

tJ-

•M*

CM

CM

f-

T—

*»“

Y—

t—

O

CM

O O

O

o

CM

o

o

0

O

in

o

O

b*

b.

CO

o

LD

t- N

N

o

CM

CO

o

CO

CD

LD

M-

CM

ID

CD

CM

CO

xb

b·

CO

LD

co

Ί·

ra

CD

O

CO

CM

CD

0

ld

q

CO

v

q

00

CD

CO

CM

cqco_

CO

tT

q

LD

CD

q

có

co

CD

σ>

in

CO*

CD

C9

K

00 LD

in

ra

CD

CO

CD

ID

0

co

CO

CO

co

LD

LD

LD

co

CO

CO CO

w

cxj

CO

CO

CO

CO

’M'

Φ

Φ

Φ

»3

Φ

CC

(0

p

CM

L_

co	ω	<0	CO	o o	<0	CO	CO
c	c	c	c	CJ o	c	c	c
Φ	Φ	Φ	Φ	ee ro *r* *F	Φ	Φ	Φ
q.	q.	’q.	’q.	Q.	’q.	’q.
CO	CO	«5	CO	o o 'k. ’u.	(C	CO	CO
CO	CO	(0	CO	CO	CO	ω
o	o	o	o	φ Φ	o	o	o
E	E	E	E	£ -C O O	E	E	E
o	o	o	o	(0 CO	o	o	o
T	I	I	T	in m	r	I	I

u	O	O
c	c	c
«0	CO	CO
TJ	T3	’Q
.2	í £	í ”
c o	* O	* O
> O- Φ	8 « Q Φ	8’ « O Φ
: c	X c	X c
i	Q	X)
: ♦	C ť	c ť
> i	θ í	θ i
	—	.x_

o	EO	EO
>	o > k.	o >
UJ	J= ω	-C UJ
z	°ž	“ z
<	É<	c<
>		Φ >

		CD	CD	CD	b*
		O	M·	M-	’M’
o	O	CD	CM	CM		LD	co
CD	LD	oo	T“			CM	CO b*
CD	CO	O	CM	CM	co	00	CM Tľ
CO	CO	O	O	q	q	00	CD O
	00	-J	-I	U		r*.	CD LĽ
UJ	N	<	<	<	<	Li	N <

00	m	CO	CO	T“	b-
▼—				CM	O	CM
in	lÔ	ID	s.	CD CD 2	CD	O
CM	cxj	CM	o	b- b- S	CM
o	o	O		LD LD 2	M-
o	o	O	o	O CD 2	O	o
O	O	O	ZJ	CM CM 0	O	O
<	<	<	<		<	<

o

CD

ID

LD

LD

T—

CO

ω

' CO

CD

b-

CM

b-

’T

LD

LD

LD

b*

T“

CD

CM

CM

m

CO

CO

00

b.

b*

00

CO

CO

CO

CM

CM

CM

τ'-

O

CM

o

O

o

CD

CD

oo

-m-

CM

CM

CM

b*

b*

CD

CD

CD

co

CO

CM

00

•M-

O

-r-

ID

CO

CO

CO

LD

CM

CM

00

σ>

00

CO

CO

ra

CD

CO

co

M-

CO

CM

T“

00

b·

b-

CO

CO

CO

CD LD

co ra r-

00

00

cn o

CO o

CO

CD ID CM

00 v LD CM

LD o CO LD

0 0 CXJ r- b- Q in in Ý

bo CD CM

CM O

CO

r- ±

£ co 3

o

co

T”

o

o

o

og ><

O

O

CD

0 0 2

CD CD CO

> Q 1—

m o _l

o č

o Č

< b~ O

cn co 0o5 w_j£

CD D cn

o O <

o O <

—> Q cn

cxj cxj o O Q <

o σ <

o σ <

UJ

s

S

s

s

cn

S 5 <

m

CD ČM

CM

CM

x

UJ UJ 03

ČO

00

h-

T“

t-

T- T- CM

10

0

0

rä

»— T“

cn

cn

<

<

<

<

<

<

< < <

<

u 1-

J—

1—

CC

< < ω

cn

0

0-,

m

“l

m

m

m

m m m

m

r

I,

CL

m m 0

0

0

1 m

m1

cn

CD

m

CD

m co m

CD

co cn

cn1

CD

cn

cn cn m

cn1

cn

0

0

0

0

0

0

000

0

00

0

0

0

000

0

0

LD	CD	b-	ID
b-	CM	v“	^r	O
LD		ι-	co	CD
v	M“	τ-		τ-
CD	in	ΙΟ	00	Ο)
CD	1“	CM	M·	M-
<D	O	O	O	O
O		τ-	γ-
O	O	Ο	Ο	O
cO	(0	ro	(0	cú
c	í<	s	s	£

•ď	0	CD	0	0	b*	co 2 m	0
0	0	0	0	0	0	0
CM	0	CM	CM	co	0	b í!	0
T“	O	T—	O	o	O	o ’T	o
l<	b^	0	0	CM	T	6 S	CO
O	T-	CM		v-	O	t“ '—J	T-

*<0 ·<β

0

0

0

b-

-

c

0

r~-

c

'T

CM

in

0

m

0

0

0

cn

0

CM 0

Φ

0

σ>

CM ΙΛ

Φ

cn

0

<3>

0

cn

0

0

Ó

ó

Ó

o

0

ó

U f

o

ó

LO

0

co

O CM

O CM

7“ iri

b

T“ N

Φ oc

£

o 0

b

Φ

£

b

O tri

o

O b*

o cn

CM

CM

o

CM

O

>

o

o

>

CM

o

S

T-

o

O				O										0	O
o	T“		0	O	0	0	CO	o	0	0	0	γ—	0	0 0	O	0	0 b-	0
o	l·-	0		O	0	0	h.		Y—	γ—		0	Tf	0 0	O	0	0 0	0
o	r-	o	0	O		°°-	co	CM				0	0	’T. 0	O	b-	0 Tt	0
o	CO	N	0	O	b?	in	N	N	ω	0	ω	0*	G)	0 0	O	0“	0 0“	0
	co	0	0	t-	0	0	CO	0	0	0	0	0	0	0 i-		0	0 0	0

ω	ω	ω	(D	ω
C	c	c	C	c
Φ	φ	.2	.2	φ
Q. Q.	’o.	’o.	’o.
CO	<0	CO	CO	CO
CO	ω	ω	ω	ω
0	O	O	O	O
E	E	E	E	E
0	0	0	0	0
I	x	I	r	x

CD	>
3	— F
.1— >	ω □ ω ~
O	£2
<fí •w 4-·	p 0 2.8
<0	Q. O
CL	Φ O
Φ	Js >

	ω	0		0	0	Τ-			bY
	0	tí*		0	0	Ο			0
0	0	0	0	O	0	0			0	0	M·	0		0	0	0 0	0
0	0	T“			0	0	0	0		b*	0	0	0			O T“	0
		0	0	0	0	O	O	O	0	0	0		0	0	0	0 ’t
0	0	O	0	O	v	O	O	O	0	0	0	0	0	0	0	0 0	0
0	u_	LL	00	O	-J	O	O	Q	-J		O	Y“	O	b-	0	0 b·
:□	<	<	N	<	<	<	<	<	<	X	in	D	in	X	X	N N	Z)

CD	T“ 0	co	0	0	b-		0
0	0	0				O CD	CO	0	0	0	0	0	Y CM	0		O T-
0	0	0	0	0	0	h- CM	CO				0	0	cm m	0		0 0	0
b-	0		CD	0	γ—	r- cm	CO	0	0				<0 Y-			0 0	0
0	0	r-	h-	b*	0	t- CD	T-	t—		0			co <-			0 0	0

CM m 0 > O

0 0 •’ŕ 0 0

co cn cn LO Y O

0 M0 0 O

0 0 0 O O O CC

CD 5 O CD Y N O τΟ Τ-

0 CO cn 0 0 O

σ> o 0 Q

M* O) O O O

< 0 0 0

cn O CO <

·< 2 O)

0 0 s 3 X CD O cn

05 ΤΟ CO <

m Y UJ x 0 Λ

Z <0

0 0 Y“ 0 5

1-

U-

LL

Ο-

Ο CO

<

<

<

•5

O

0

—J 0

CD O

_j H

-j

S

š

<

<

Υ—

< I

čo

0

čo

Q

O

UJ

S w

LL· LLI

ωΣ

s

Y—

Y“

ČM

ČM

ω

čo čo

CD

0

0

H

t- H

X

i—

<

<

<

<

ω

x x

J-

H

H

<

<

< <

<

< <

<

m 1

CD 1

m 1

CD 1

0 |

XX,

I,

X 1

X

Z

CO

X |

CD X I t

m

m m I |

CD 1

m

1 CD

1 m

1 m

1 m

m m

m

m

I m

m1

1 m

1 5

m S

m1

m

CD CO

1 m

CD

0

CD

0

CD

CD CD

CD

CD

CD

CD

CD

LLI

CD UJ

CD

CD

CD CD

CD

Xf in co

	0
	b-	b-
	0	0
0	0
T~	0	0
Y”	0	0
T”		γ—
T“		Y“
0	0	O
CQ	CO	CO
S	2	t

in bo CO

in

ID

CO

O)

05

05

05

CO

CO

CO

05

05

CD

CO

CD

CO

05

05

05

q

q

05

05

05

05

05

q

05

05

05

q

05

05

q

q

0)

Lfj

ΙΓ5

ID

05

CM

CM

CD

CO

CD

oó

CO

co

CD

CM

ô

05

05

q

q

o

q

τη

τη

O

O

o

O

o

O

o

O

T“

r·

q

q

T“

Τ-

CD

in

r<

Ô

CD

CM

l<

l<

c*j

Ó

05

IÍ5

trí

O

Ο

CM

·»“

O

O

t-

CM

O

t—

1—

O

CM

CM

CD O

CD CO O O CD CD CM CM RIRI

CD

in

05

N

M·

V-

m

w

CM

CD

00

CM

CO

co

CO

CM

05

m

CD

b-

m

o

CM

CM

O

CO

T“

bs

CD

CD

CD

CO

M

▼“

O

CD

q

CM

O)

05

q

CO

N

CO

00

00

b·’

CO

in

co“

05

cm’

•r-T

CD

cn

05’

•M-’

cm’

T—“

in

05

05’

CO

CO

co

CO

CO

M

CO

co

CO

CD

CD

CD

co

CO

CO

$	S S	oj
£i	2 -d	c
C	2 c	Q.
o	o °	O
	cc >	C
>c Φ	Q >c < ω	*Φ D)

0)		Φ
ω o	σ> o	ω o
Ό	_i	Ό
c	CM	C
Φ	CM	Φ

·= T ~
O 7 CL^·	O Q.
ω c	ω
= O	D
c ·“	Φ C
CM ®	CM

CD b05 05 O >

CO	CM	CM
CM	CD	CD
’t	N	N	05
O	05	05	CO
O	O	O	m
o	O	O	CM
D.	O	O	05
<	<	<	N

LO CO r*

	CM o	o	CD	CD m	o CM	r~ a>	CM CM	CM CM
CO	CO	CO	CO	σ>		O	CO	b-	N
CM	CO	b-	b*	T—	o	O	m	O	O
CM	m	o	O	T“		o	o
05	o	o	O		o	o	o	O	O
CD	ll	O	O	CD	s	Q	O	O	ω
S	<	<	<	S	<	<	<	<	<

co b-

O N

O b-

o

CD

o

CD

CO o

CO CM

CO CM

o

O

co

M-

O

O

b*

Τ-

M*

o

K

b-

O)

M-

LD

m

b·

b-

CD

CD

co

M·

M·

05

Ο

CM

CO

m

in

CD

CO

O

’M·

O

O

LÍ5

in

in

LD

CD

CD

CO

CO

M-

m

CD

CD

CO

b-

O

b.

CD

CD

00

co

m

i—

T-

T“

CO

’φ

xr

CM

T“

CO

CO

T-

t-

T-

< < o Z Z I > > U) ν>ωω

CO CM M1 O

CM CD b· 05 O O

CM CD b* 05 O O

CM 0 O Ύ— >

in co b-

m o m —1 u.

CM O CO CO

O CO bo o

o CO bo o

3 Q U.

IÍ5 O O

CO Tť CO >

N 05 CD m

CM CM bO O

CM CM b- O O

O

o

o

o

d

Q

o

CC

>

0

o

o

o

□ 3o

n.

<

<

l·-

LL

O

u_

<

<

LU

H

ω

O

<

<

co co S

<

Φ

CD

s

<

Q

<

Ô5

čó

CO

S

<

CO

CO

0

0

T—

CM

y—

CM

0

0

y—

Y—

CO

0

0

< < <

-I

H

1-

<

<

<

<

1-

1-

<

<

<

cr

1-

1-

CD CD CO

0.

X,

T

m

m

“1

m

T

x

m

“l

CD

D_

x

x

III m m m

CO

CO

m

m1

m

m

m1

CD

CO

m

CD

CD

CD1

CD

CD

000

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

CO		CO
05	CO	CM	CD
O	CO		m
»“	05		T-
CM	M	CD	tn
O	O	T—	CM
CM	CM	CM	CM
	τ-	τ-
O	Ο	Ο	o
Φ	Φ	CO	(0
C	2	s	ž<

hO

CO

00

co

O)

0)

CD

D)

r-

N CO

O)

0)

CO

O)

’t 0)

CD

CD

CD

CD

03

CD

CD

A

O) O)

CD

CD

O)

O)

CD CD

Ó

T“

T

CM

Ó

Ó

Ó

V-’

CO ’t

O)

oi

CD

CO

t-

i—

O

t—

Ύ-

Τ-

Τζ

o o

O

o

T-

O

O τ-

co

cô

CO

τ-

CD

CD

Ο)

iri

T-’ 00

tri

iri

CM

CO

ι-1 CM

CM

CM

CM

Ο

T—

CM

o

CM i-

CM

CM

T”

CM

O O

CM

CD

’t

o

co

00

O)

LD

’t o

m

m

^t

CM

00 CD

CM

O)

o

h.

l·-

T—

CO

O ’t

co

co

O)

LD

CD τ-

h-

’t

CD_

o

t—

t—

h-

N-

CD CO

co

co

’t

(N

o o

CO

ld

in

o

N

N

O)

oí

k- <

CD

CO

oľ

cd

cd“ CD

CO

co

co

t—

ω

CO

LO

in

co co

co

CO

CO

’t

’t CO

Φ XZ tí O CL ω c CD CO

cg ’o c Φ

Φ CO *<0 c

Q. O

Q in

«

X2 co £ o c

Φ CO ω Q o CO c

Q.

*3 c Ό)

D) T5

Q.

E

O

E co

T*

O)

E □ ’u.

Φ

O (0 .Ω

Φ C 2? o

Φ CO

Q. Φ

o	O	(0	CO	CO	o	E	E	CO
o	O	C '	C	C	Q	D	3	c
cg	CO	Φ	Φ	Φ	cg	c ω S «	Φ	Φ
lc	lc	o.	‘o.	o.	lc	’o.
g *L_	u	CO	CO	CO	o	o o	Q	CO
‘l.	CO	CO	CO		S =	CO	CO
Φ	Φ	o	o	o	Φ	S 9	X)	o
.C o	x: Q	E	E	E	x: u	O o Φ	o o	E
ω	CO	o	o	o	CO		>»	o
LU	LU	x	x	x	LU	s a	s	x

h-	r-	h-
m				CD	CD
o in	o	’t o	CM	in o	LD o
u) CM O	00 CM σ>	00 CM O)	CD CD	o O	τΟ o
<	N	N	>	<	<
				n-	N
	o	o		00	00
	o	o	O	CM	CM
CO	o	o	O	CO	CO
00	O)	O)	00
in	T“		T“	T“

^t		CO	CO	52	N		LO
CM		O	CO	00	CO		’t
CO	CD	T“	CO	CO	’t	00	CM CM
CM	00	’t S	N·	N-	O		CM O>
r**	O	co 2	O	O	o	CM	O o
T“	00	O O	O	O	o	o	O o
ll	N-	CD Q	O	O	LU	XI	o U
<	ZJ	Q <	<	<	<	<	Z) <
		co	CD	CD			N
CO		CD CD	CM	CM	CD	CM	i- <0
CD	CD	CM CO	m	in	00	CD	t- K-
CM	m	CM ’t	LD	in	00	CD	’t in
^t	r*.	O ’t		T“	CO	CO	CO T—
		CM t-	CM	CM		LO	m cm

h-
in				κ-	N
o				ω	CD
m m CM	o	μω	o	in o	in o τ-
o	in	in	CL	o	Ο
<	o	o	-J 0 z %	O	O &
ô	LU	UJ	Ά.	Ά.
	0	o		šŕ
ω	T“	0	CD
ω 0 I	T“ z I	z 1	< m	1— I I	H X |
1 m	1 m	1 m	1 m	1 m	m
0	0	0	0	0	0

	CO	CO	in
A	<0	CO	co	oo	j-.
CM m CM K- Ύ-	co o 00 KZ)	o 5 * S P o P	co Ko o Q	00 r-o o O	00 ’t o o o	CO o >	CM CM g §9
LL	O	CD Q	<	<	LU	f-	o <
<	LU	Q <	m	čô	<		2 -e
(Ň	Čv	čô	0	0			^0
<	<	< CC	1—	H	<	<	< H
m |	m	m o. l i	I I	I I	m I	m t	m t I 1
m	1 m	1 1 m m	m	1 m	1 m	m	mm
0	0	0 0	0	0	0	0	0 0

CO CD

CO

CM
O		in
h-		CD
00	CM	N

CM

CO	CD	CM
’t	m	CD
CM	CM	CM
O	o	O
CO	CO	CO
č	c	2

	CM	LD
		CM
CO	CO	CO
o	o	O
CO	CO	CO
c	í	C

CD

σ>

(D

σ>

σ>

CD

σ>

cd

00

CO

CD

CO

r-

r-

σ>

σ>

OJ

q

q

Ο

ω

ο

σ>

ο

cd

cd

q

q

O)

q

q

CD

cd

cd

γ—

Τ-

04

04

σι

ό

04

CM

co

CD

lo

lo

04

τ-

ο

T“

Ο

ο

ο

ο

O

O

q

q

O

CM

04

γ^

b-’

CD

σ>

ιο

ιο

r<

CD

Ó

Γ-

M

Ô

co

CD

Ο

Ο

ο

Ο

CM

04

04

04

t-

7—

<0

CO

CD

<0

T—

Γ-

CO

CO

T“

CD

OJ

o

xi“

M“

00

oo

LO

T

CD

<0

04

ΟΟ

co

CD

7—

04

c»

Y

co

CM

r-.

m

CD

o

<0

CO

CO

(D

OJ

CD

O

Γ-

in

OJ

CM

CO

r-

CD

CO

<0

OJ

IO

id

xŕ

00

K

Γ-

od

r-“

co

co'

ΙΩ

oo“

o>

04

CO

C0

CO

CO

co

CO

LO

co

CO

co

xt

CO

CO

CO

CO

co

CO

CO

CO	CO
c	c	Φ
Φ	Φ	+-·
Q.	Q.	5 CO
CO	CO	sz oj
CO	CO	CL O
o	o	O £
E o	E o	ω ffl 2 ®
x	x	O E

0)		W		(0		E	CD w g 52 °
c Φ q.	E D	tw x> CO		A—» TJ x> CO		3 ’ZZ Φ 4·*	«
CO (0	•g. E	x:	CO	.c	CD	o CO	Ξ E	A CD
o	m o	O	c	o	c	-Q	o 3	D
u	ffl o	C	CO	c	CO	o	Ľ £	Q.
E	o Έ	Φ	cn	Φ	σ)	o	S c	£
o I	σ 2 < <0	CO O	(D Φ	(0 o	φ φ	>» s	£ co 5 X	(0 O

Φ c Λ

Φ ΧΖ 4·* ω ω ο. ο *Ό h CC <

E to

C

φ ο.

C0

	o	o
CD	Q.	CD	Q.
C	CD	C	CD
CO	□	CO	□
CD	Φ	O)	Φ
Φ	C	Φ	C

ο

in

LO

CD

N

b-

CM

CD

OJ

CO

r-

r-

χΓ

M“

co

T

O

00

LO

LO

CO

xr

xt

CM

CM

Y—

CM

CD

Γ-

Γ-

o

Γ-.

0)

m

m

CD

CD

r-

O

oj

ΙΟ

CD

CM

CO

CM

CO

b-

b-

O

O

o

o

τ-

o

O

O

CM

CD

o

LO

fs.

o

o

O

O

o

o

Ο

T“

O

O

ID

CO

LO

o

OJ

CM

o

o

Q

O

O

O

O

u_

O

O

OJ

00

σ

CD

O

CD

O

O

<

<

<

<

<

<

<

<

N

S

<

N

m

m

N

<

<

Γ-

r-

o

io

lo

T”

(0

CD

in

OJ

CD

CM

CM

O

O

CD

oo

00

b-

00

OJ

00

Γ-

b-

CO

o

CO

b·

CM

ľ-

T—

lo

m

LO

OJ

o

ΟΟ

CO

CO

T“

r-

CO

CD

r-

CM

CM

CM

o

o

CD

o

o

CD

xj-

CD

CD

Γ-

O

CM

CD

CD

CM

CM

CM

w.

CM

CD

CO

. co

CD

CO

OJ

xr

CM

CM

m

in

CD

r-

Γ-

OJ

OJ

m

CD CO

Γ-

Γ-

Ťt

4·

00

4

o

CM

in

m

T“ ,

o

y—

’T

CM

CM

CM

r-

Ύ-

—<

•M·

f-.

OJ

LO

LO

OJ

OJ

t-

O

00 CD CD

<0

co

m

z

OJ

m

CO

Γ-

Γ-

O

O

o

o

o

o

o

<

Ύ—

o

o

m

b-

O

o

O

O

o

o

o

o

o

CM

x

□

CM

o

OJ

>-

Q

o

O

O

O

O

O

O

O

>

z

<

>

o

o

0

o

<

<

<

<

<

iL

<

<

ŕ

<r

Č5

f-

ffl

m

1—

<

<

Ťŕ

Ϋ

ώ

ώ

čj

<

ČM

ČM

x

cô

čo

s

ib

in

0

0

0

0

0

ČM

0

0

7“

ω

7“

ω

ω

0

0

H

H

H

F

1—

<

1—

1—

<

<

ω

<

ω

ω

<

H

H

X,

X f

X,

X,

x,

m I

x I

x |

m I

m |

0 |

m I

0 I

0 I

CD I

X I

X

1 m

m

1 m

1 m

1 m

I m

m

m

1 m

CO

1 m

1 CO

1 ffl

CD

CD

1 CD

1 CD

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

CD ΓΙΟ

ΓΟ

Ο ιο co ο (ΰ

b-	LO	CD
CD	O	O
xt	CO	CM
*»		7~
LO	CD	b-
CD	CD	Γ-
CO	CO	ΟΟ
O	O	o
ca	CO	Φ
í	e	ži

00

N

cn

CD

r-

b-

b

CD

b-

CD

CD

h-

00

00

CD CD

co

CD

CD

CD

CD

<51

©

CD

©

CD

©

Oi

0)

©

CD

CD

CD

CD CD

CD

CD

r<

oj

τ-

CO

©

©

©

CÔ

00

©

co

©

©’

od co

ó

CM

o

O

Ο

O

o

o

o

o

o

o

q

o

o

q

o

o o

V-

o

CO

Ó

CÔ

©

©

©

©

©

©

CD

ó

CÔ

r< 5Γ

©

b*

o

©

CO

CM

OJ

OJ

o

o

T—

T-

o

o

©

o

CM CM

CM

o

T“	o o	CO	o o	Jt-ÍO	CM
CM	o	©	o	- CO CD	T“	b-
©	o’	b·	o“	O ’í CM		. ©
©’	o	co’	o	CO O)	©’	©
©	T“	©	»-	in io co	CO	CO

y—	CO	CM	©	© ©	© ©	o
	CM	©	’tf	O b-	o ©	©	©
	t—	CO	t—	© i-	© m	©
	CO		©’	©‘ CO	©~ CO	cm’	CO
©	CO		©	© ©	© ©	©	©

Ο) Ο

OT c cO g >

o Sk o Q.

3 0 O ©x

CO c

Φ 'q.

’o. (O

Φ CO

Q. Φ

Φ CO

o

E o I o

E o X

D □ ·“ · ω ω φ « o o ο ¢0 oj □ ΏΏ Q Ο Ο £ Ο Ο Φ >» ΣΣ3

OT

0.

Q. ω

σ> ο

CM rο u.

<

CO

T“	©		T“ h- h-	©
b*	©	©	CO CO CM	©
Ό·	o	o	CD O <O	T”
©	o	©	O CM O	o
©	o	©	CD O CO	b·
x	<	X	Q UJ ľD	<

©	CD	CO		h-		Ί- b·
©	M	CO				© ©
©	CO	r-	©	CO	O CT>	©	Tf	ľ-
o	CD	m	©		CM CD	© ’T-	O>	o
©	O	A	©	cô	O <0	Ti- ©	M-	CD
M-		o	©	o	O m	o o	CM	o
<	Zi	-J		_l	O cn	-J -J	r-	CD
<	<	<	D	<	2 N	< <	2	O

CM CD

©

CD

©

t—

©

b· ©

Tj- O

T“

©

©

b·

CO O

©

v-

©

M- ©

O

©

Tt

©

b.

©

©

CD O O

©

©

b

©

©

O

© ©

b- ©

©

• ©

©

©

©

©

M· CM 00

©

O

©

©

t—

© ©

Tt b-

©

©

©

©

T—

©

i- t- CM

©

©

M*

1—

©

© ©

© ©

Q

b.

©

© O b* © b* o

o ω ω S

© o © © o o

X O § 0.

CM CO _ O t- r- co CO CO co o ff O CM

© © V“ O b-

© © o ©

©

CO CO UJ

© © © © D

0 ©

o £ CM > So

CM CM CM (l. tn o O>

© © b. Z)

ro © o

U-

o

u

0

CD O I

©

o

Q

0

Q

o t

-i R

<

©

<

o

<

u

o ω ς;

©

0

0

o

0

=) Σ

2 2

CL

D

CM

T“

•R h 0

H

H

y—

T“

Ύ— T“

T“

T“

<

<

CC

<

< < 0

ω

ω

<

<

<

<

< <

< <

<

<

m

m

Q-

m

m o. 0

Ul

UJ

CD

CD

m

CD

CD CD

CD CD

CD

CD

m1

m

1 m

m1

CD CD tn

CD

CD1

CD1

m1

CD1

m

CD CD

1 1 co m

CD

CD1

o

0

0

0

0 0 0

0

0

0

0

0

0

0 0

0 0

0

0

O	’M’
o	r·	©
©	©	•’φ
		©
©	©	©
©	©	©
©
o	O	o
CO	CO	CO
c	s	c

©	©	o	©
©	©	©	©
©	©	©	©
	T“	I“	»“
©	©	©	o
b-	©	© ©	©
		© ©	©
o	o	o o	o
CO	cO	CO cO	CO
č	ŽS	Ž< 2	í

CD

0)

0)

CD

CO

CD

ω

CD

00

CO

CO

CO

0>

CO

CO

CD

CD

σ>

0)

0)

0)

CD

σι

0)

0)

0)

0)

0)

0)

CD

0)

CD

b

CM

Ó

Ó

CD

b

CO

CO

CO

CÔ

A

CD

CÔ

b

O

o

O

T“

O

7“

O

o

o

o

o

o

o

q

q

ό-

b

irí

CD

in

b

Ó

b

b

b

b

σ>

CÔ

ID

Ο

CM

o

CM

T“

T“

O

CO

o

o

o

o

CM

o

o

ω

o

b

v

m

o

in

CO

CD

in

o

o

in

CO

CM

CO

T—

CO

o

in

M-

T“

b

q

in

CD

o

b

CO

in

CD

CD

t—

in

CD

CO

CO

0)

0)

CO

b

LO

b

CO

b

in

in

CO

CO

lO

10

m

m

CO

m

CO

CO

0)	v-	00
in	m	05
q	co	w
M7	o	Ό7
CO		CO

Φ « « <0 = σ> j= o Q. c o <0 05

CO φ

4-4 ω (0 σ> ο c CO

Q.

O

CO _ .. _

O φ O φ D Γ “

EOE c *φ ο < Z X Ε οω

CO c d o E

CO 2 O o o o o 4-4 Q. Φ ω

CD	C0
Φ	. ®
O	Φ υ

CO >» Ε φ ο “ ο.

Φ

Ν Φ C Φ >

φ co

Ε φ ο “ **

Q. Φ

Ν Φ C Φ >

~ C0 φ w u o s = •2 o o *Q Φ >%X) 2ÍY d φ ‘ω Π φ

Φ CO c o E □ φ c Q.

cn c ’c φ E

CO

Φ ω ω 'φ ω

Φ ω ω □ φ ω

Ο) ω φ υ >* Ε ο ο. φ

Ο) ω φ ο > Ε ο

4-4

Ο. φ

CD □ Φ ω '1— O) ω Φ o >. E o

Q. Φ ω

Φ ω

Ο) ω φ ο >» Ε ο ο. φ

C0

U.

ζ φ c ο 4-4 ω ο χ: Q o

-g .® 6 4D >1 o Q.

CO c0 C CO h. Φ

CO c Φ q_ CO <0 o E o x

CO c Φ 'o.

CO CO o E o x

CO c Φ ‘cx

CO CO o E o x

Tabuľka 4 (pokračovanie)

CO

2? o

CO O **C

4D O)

O

A >»

O) (0 ££

CO o H— c 4D

O O A

O) '2 > O N O

C

E

CO

u.

I D. Q

Ό Φ L.

Q.

<

d Ό c φ ž φ ω <0 c ο.

ο c

*2 φ ο. ο ο ο

CO c Φ O) 5? o o c o E o m

C Φ Ε σι φ co

Φ

4-4

CD (0 O) o c 2 φ

E

OT = 05 — C Ό O. O

Φ

4-4 co (0 O) O c 2 φ E íc Ό

Q. Q _ .

8^82 2Í „ Do O o

C0 j= o =

Qω ό

ο c

ο. Ό σ> Ό CM CO II φ +ra _ CL w c ; O ;² ! -F cj < o O m E S “g φ □5-CO co S= ' c E I d) x; q. -o co I « o E cm'¹ <^Q

E c |>N CD C ·¥

I

Ý ' CO CL Q ^<ώ fiis

Φ A i

MX Q > C

41)

Ο)*φ

C

Ο. ο <

<

> O E

Ό C Φ > ο Ε ο c φ

W Ό υ c

C0 Ο α m c *φ 2Q. Q. i_ O ž· 8

- · X2 O ’φ* C Έ oj 'C (0 g* t

CO tí k_ Φ *ω c CO >% c

41) cn — O E in e O ? O φ

ΊΟ

Ε ο c φ σι c' ο.

*□ >

X b co X ω ω ο υ

V. φ .Q

O) p ô o E o. x: o

A

CO *O a

C

Φ > -C

Q ω

Α

CO Ό

Ό £ <4 CO

CO N Φ Ό W * C £ co T’é Q

Q. D ΙΌ

Φ n

E O E 2 Φ

C _ CLA cm 2 co CO _ «Τ- XD >*cd2

Ϊ- *

ΊΟ 4D >»

C0

CÔ

A <

CO E s> § c >» N O C E CO

o.-c

E o > >£ g ... Φ i ® e q.2 ra ™ 5 — D < CO A H

CO c φ <0 > .C υ ω

X

E Έ JC o o

Q

Φ 2 φ 2 N Φ

C Φ >

(0 Φ >* c 2

C0 φ

V» m— £ 8 O) CO ώ ’ • 0_ Q s o

Φ

L. Q.

C ·° σι-co uj CD w wj *—

Z3 0.3 d □ Q. □ 7? <2 co u2 Φ C O ω

® o t -C OU s o

Q.

C ·° -Φ “ cn-® <o — í! o

Φ

Q.

>» c tj o o ^40

CO c >Q p E o E T i| a 2 Ό Φ u_ CO Λ

Ό C —- kL >» Φ

Ό ·

E Y e e « o l*-o £ -g w £ CT ώ = Q. D

CO C0 B

CDg co Ό c φ £ φ (Λ

ο. φ d φ 2 Ν Φ C Φ > ω Φ ω >% Ε ο

4-4

Ο. φ

O

CO c: CO

4—» 2 E

CO 2

O O o υ o

Q. Φ ‘ h

Ό *2 Α ο ω Τ) ο <0 c ο.

(0 o H—

I

P Ό Q o ^m

Q. Φ

CD

O) co o 2 £ S2 t co N -O

CO > O E

C Φ _ o>x ω

> O E

Ό C Φ <υ a O

CO σ> σι o o o o E E o o x: xz o o .^c -^c '05 φ +22. Q- Q. U

Ό

CO p U> r^· “ p i CT E Q. C 0.0 č ľ F® ω c E ω co N -o □ ·> ’δ ct-S-Z

N O °

Φ <ο □ E cn g SŤ-¹ ® ô E A

Φ <^A

-7 Φ •χ « •9 ^ω

CD 2 , ι t

CO N O A

D) ω -=

Φ *2 Φ '2 φ '2 Φ co 2 co 2 co

0)40 ^w O φ 9

U *3 > CO E-S o >o

4—»

Q. d A ® n- CL + E-o ω

CD t: _ OW *E ”^w

0)40 ^W O φ 9

O 7= > CO

H

O CD

0)40 ^W O φ 9 o τ= >· 52 E « o o 4-«

Q. Φ

CD t ο <0 •c co ⁰⁵ <o 05 > φ o O ** e ^w E co 2 k> Q. Φ t CD

CM¹ ω TJ

O CQ II š CM Ä* ·_δ Ô CO g. O I ω ω'δ. X CD

b	05	05	CM	05	CO
b	F		CO	CM		T“
		CM		O	o	LD	0)
CO	cô	OO	0)	b	o	b	CO
b	F	T·	b	00	00	0)		Y“
o	O	00	o	O	CD	O	0)	O
x	LL.	b	x	X	0)	X	o	m
<	<	O	<	<	N	<	A	<

TJ CO A O ô>a^ ŕ (0

CO .2 Q- _ > ·? E ô £Ľ ω οχ

Eg o O λ o r t

C0 σ> ι X

CO	CO	CO	CO	m	o
Y“
			O	CM	ν-	in
				CO	Ο	CM
	Y“		CM		b	in
O	O	o	CM	CM	O
CD	m	CD	b	σ	α	x
<	<	<	Z)	<	<	<

o

O

O

O

O

’t

0)

CD

CM

o

O

Tj-

in

b

b

b

b

CO

O

CO

LO

CO

b

0)

cn

o

O

o

o

O

00

00

m

CD

in

y—

CO

§

M*

CO

m

CD

CM

CM

. CM

CM

b

o

00

M-

CD

CO

b

T-

CO

tT

CO

t-

Y—

▼

Tŕ

M-

CM

CM

CD

ω

’ď

m

b b

0) b

CM

0) CO T“

CM CM O

CO CD

CD In

0CD D.

CO T“ Tí

CO T Tľ

CO í

CO Y“ tT

O

CM CO CM

τΓ o b

o LO

CO b

cô b

CD OO

0) b o

b CO o

> o

b 0) O

Q O

O

o

T“ O

o

CM CM

σ <

o 0

CM m

O

o

F

u.

U-

1—

ÍL

0

CD

CD

CO

CO

D x

<

U-

x

x <

Q

<

<

<

Z

<

<

<

<

óó

<

CM

CM

T—

CM

CM

CM

CM

o

ω

CD

tT

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<r

ω

ω

OĽ

Z

Z

CO

m

co

CO

CD

CO

CO

CD

co

to

>,

°ι

0

CL

m

CD

m1

m

m1

CD

1 CD

m

CD

m

ω

co1

CO

CD

CQ1

CD

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

CD bσ>

CM 0) CO CD m in	o b LO
Y” Ύ-
O o	O
CO CO	CO
s s	2S

	05
CO	LO	0)
CM		b
b	CD	CM
	CM	CD
b	b	O
in	LO	CD
	T“	V“
o	O	O
CO	CO	CO
s	s	e

σι

cd

CD

CD

00

b-

b.

CD

CD

CD

in

CO

CD

03 LO

CD

CO

CD

σι

CD

<31

q

q

03

CD

CD

CD

CD

CD

cd σ>

σ>

CD

ι<

b-’

ó

Ó

CD

T“

yL

CD

CÓ

CD

r<

CD

CO

CD b*

CM

CÓ

ο

ο

V-

t—

O

t—

t—

O

q

O

o

O

O

q q

·*“

O

cn

5b

05

CD

CO

CD

CD

oj

T-

bj

có

GJ

l<

b^ có

to

bj

OJ

T“

T”

CM

OJ

GJ

O

T—

T—

T—

T-

OJ T-

o

GJ

ο

CD

CO

OJ

CN

y—

y—

y—

b-

o

CO

co

CO

CO

CO 5b

Gl

CO

CD

CD

T“

CD

5b

CO

q o

CN

co

T“

00

CO CO

CN

m

CM

CN

CO

CO

T-

in

q

o

q

b-

CD

b*

cm cq

CN

CO

5b

co“

co“

cd“

cd“

•N7

N

o

co“

cd“

cd“

CO

co“ LO

cd“

o

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

CO

T—

co

CO

CD

CO

CO CO

CO

^b

CO CN

CD o

o CD

o O)

b*

CD

OJ

LO CO

CO

LO

LO

LO

OJ

OJ

CM

OJ

s

b*

*b

CO

LO LO

CD

GJ

OJ

CO

CD

00

CO

5b

o

b-

CN

CO co

GJ

LD

LO

o

O

Y“

o

CN

CN

σ>

CO

CO

OJ CD

b* CD

O

o

O

CD

o>

05

o

OJ

LO

LO

b-

LO

O

u_

ú_

o

O

CD

CD

CD

O

“3

CD

γ—

T“

CD

-J T-

O

<

<

<

<

CD

N

N

<

<

N

Σ)

X

N

< D

<

<

y-

O

O

CD

b-

00

00

CD

O

CD

o o

LD

OJ

T—

T“

b·

b-

CO

OO

5t

T“

y—

T- *b

o

b-

b.

LO

00

OD

5t

O

CM

CD

b.

O

CO 00

CD

b*

CO

b.

OJ

OJ

v—

o

O

b*

5f-

o

CD

CO

LO

CD LO

b*

5b

CN

T“

5t

CN

CN

T“

CN

CM

CN

CO

CO .

CO CO

LO

CO

o

o

|x

CD

CN

to

CD

CD

CD

CD

CD

5f

’b

o

LO

03

LO

LO

CN

o

O

OJ

cn

<

T—

CD

LO CN LO

CO

CD

OD

o

O

CD

^b

5f

03 LO

UJ

b-

OJ

o

O

o

O

O

CN

CN

<

CO

P*

CD

O

o

o

05

m

m

o

CM

>-

o

T

CD «

o

O

cn

Z3

Σ)

0

<

o

U-

>

Οθ

<

0

u.

<

<

m

to

to

<

0

H

S Q

0

ŕ-

s ω 3 O

<

<

5b

m

m

m

GJ

o

Σ

o

s

5b CN

<55

Tf

0

0

to

T“

0

y—

Y“

Y“

T—

p-

to

(X

1-

H

CD

<

<

H

<

<

V“

<

<

< 9

to

to

o.

x

X

0

m

m

X

m

m

Z

m

m

CD ?

LU

0

m1

CD1

m1

m1

m

m

m

m1

m

1 m

CQ

CQ

CQ CQ

1 CO

CQ

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0 0

0

0

00

CD

to

LO

CM

O

OJ

LO

Y—

v-

Gl

CD

o

t-

v—

r·

cn

CM

to

to

CM

cn

CO

CO

O>

O

CD

CD

CD

b'

b-

Y“

T“

o

o

o

o

O

CO

CO

CO

CO

CO

c

c

2

c

2

co	b-	CO	CO	b· CO	CD	b·	b*
CD	CD	p	p	p p	p	p	p
CO	[b	V?	CD	CO τ~	yJ	CD	00
O	p	Ί“	O	O τ-	τ-	O	O
f<		CD	bL	ού CM	Ο	to	CD
v—	CO	CM	▼—	CM t-	CM	o	CM

	00	CO	CO	CO	GJ	CD	CD
p	p	CD	p	p	CD	CD	p
CD	CD	CD	CD	ó	CM	Ó	yj
O	O	O	p		O	T“	T-
t—	r<	rb	’ti·	ó	l<	CÓ	in
CM	r·	Ύ“	CM	CO	O	O

o

CO

00

y-

Tt cn

0)

r*

in

CO

05

co

b-

co

xt

m

CO

00

oo

CD CM

o

CM

F

b-

sŕ

CO

CD

LO

CD

CD

O

o

cn cn

CM

O

cn

F

o

O

tn

CO

CO

co

CO

CO

cm’

t-' cm'

05

O

rŕ

cm

05

o

00

co’

in

cd’

cn

CD

in

CD

cd in

cn

cn

CD

cn

CO

co

co

CO

CD

m

m

G)

CD

CO

r—

CM

m

b.

b·

00

T”

O

CO

Xf

CM

co

CO

CD

N

b.

b-

CD

CD

LO

CD

00

O

to

CD

00

o

CD

CM

b.

CD

CD

CM

in

00

CO

00

to

O

CO

CM

b*

o

CO

O

o

CD

00

o

o

CD

o

IO G)

O IL

3

O b-

CO GJ

o UJ

LD CD

O

O O

M CM

CO OO

CO CO

δ

g

o 0

LL

g

N

<

<

N

N

<

N

5

ľD

ΪΙ

N

N

<

<

<

<

<

CM

G)

CD

M-

O

T“

b>

b-

b-

CD

CD

CM

CD

CD

CO

CM

in

00

CD

00

in

CD

00

m

in

CD

CM

CO

CD

tn

CM

γ—

CM

O

CO

o

CD

LO

00

00

CD

00

F

CD

00

in

CD

CD

Tt

O

m

CD

O

Ύ“

CM

O

cn

CO

in

CO

CD

CO

CO

^b

t—

CO

^b

CM

cô

CO

in

Ύ—

co

CD

T“

CM m

CO CM CM

O

to

CD tn

CD 00

m

F O

fb Q

05 F in

CD

«φ cô

CD

cn o

τ-

C5

05

CM f

05

CD

G)

—1

CM

CM

CM

00

co

O

co

Ο

o

CO

T~

CM cň

0

GJ

GJ

LU

CM

CM

«ή-

ω

o

*Φ

o

>-

O

F

>

tn o

F

I

X

O

>-

>-

τ-

m

o

CO m

o

O

LL

Q

O

O o

LO

Q

Q

O

O

O

α

O

0

UJ T“

O

H

<

O

f—

_l UJ

ω

CO

CO

cn

L—

1—

<

o f x

<

u.

<

S

ω

s

s <

x

>

>

<

5

s

05

CJ <<

±z

<

in

ω

CM

cn

3

(\í

ω

ω

čm

0

<

ω

<

<

< <

CĽ

ľJ

<

<

<

ω

CM

ω

<

1—

m

°í

cn 1

cn 1

m cn 1 1

n. i

n. 1

0-,

m 1

m f

m I

0 1

Z —“l

°ι

m I

X

1 m

m

1 cn

1 m

f 1 tn cn

cn

í m

CÚ

1 cn

1 cn

cn

1 tn

1 m

tn

m

m

0

0

0

0

0 0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

^b ^b bo Cti

	O	in	CD	o
CD	’φ	CD	O	in
CO	-r—	b·	00	o
00			X“	i“
m	CO		y_	G)
M*	in		in	tn
b-	N	£	co	CO
y—
O	o	o	o	o
cti	co	Cti	Cti	cti
2	C	e	č	e

(D

CO

CO

CO

CO

00

b-

CO

σ>

0)

0)

O CO

0)

0)

σ>

O)

0)

o

CD

q

q

0)

0)

cd

CD

q

0) 0)

0)

0)

σ>

ó

CO

CD

CM

yJ

ó

CO

co

CM

CD

CM

CM

ó

q

o

T“

o

τ-

o

o

O

q

O T-

V-

v-

T-

CO

co

b

Ó

bl

ώ

00

bl

0)

bl

ó

CM co

co

có

y—

o

v—

T—

Ί—

CM

CM

t-

T“

CM

o

CM

O CM

o

o

O

σ>

CM

CD

00

cn

0)

m

CM

CO

CM

τ-

CD h-

b

b

O

CM

CD

’tf'

o

σ>

0)

o

0i

V“

CD

Ο

O O

CD

10

oo

q

CD

oo

CO

cd

00

’b

b

CM

m co

^b

CO

CO

co

CD

y—*

0)

co

CD

*b

b

o

b

CO

CD CM

cd

b

CD

CO

m

CO

m

m

CO

CO

CO

't

CO ’t

CO

CO

CO

ro

CD

o

CD

i—

T- o

b

b*

T*

o

00

CM

o

0)

CM D>

CO

^b

0)

O

CO

00

o

o

CM

CO

CM

r- cd

T“

T“

M*

CO

T“

O

O

ID

*b

o

CM

o

CD

t- r*-

00

00

CO

co

T-

T“

O

00

CO

CM

o

o

CD

CD CD

O

O

^b

o

O

CO

CM

CM

o

O

O IO

O

o

CM

LL

CO

-J

Q

o

b

^b

b

“J

0>

O

LU <r

O

o

“P

<

5

<

<

Z)

m

N

<

Q

<

< <

<

<

<

CD		O	CD
CM	CD	M-	10		o
CD	CD	CO	O	CD	10	b
CO	CD	r-	O	^b	CD	CO
CD	‘ m	CO	^b	T“	^b	CO
				o
ro o ’t CO ro	3 0 Ll- CC	10 O O >	CD ^b co > 0	tr Q <	ro n· CD CM b ZD	o o CM CM M-
LL	Ul	h-	U)	Z)	0	m
<	0	s	5	X	x	čô
ČM	t—	T-		y-	”b	ω
<	<	<	<	tr	CC	ω
m	m	m	m	Q.	0-,	0
m1	m1	m	m	m1	1 CO	m1
o	0	0	0	0	0	0

		σ>				0-	o-
b		Tb		CM		Tb	^b	CO
b	n*	CO		en		T		10
CO	00	CM	CM	co	CO	CO	CO	0)
10	1“	CM			en	O	O	CD
CO	o>	t-	in		IO	CO	CO	CM
	CD		T”		o	N.	h-
	O		0)			•’b	M-	CO
CO ^b	CM O	CD	CM CO	CM b	b CD	ro o	ro o	^b co
>·	o	U	T“			o	o	CM
o	O	o	σ	O		o	o	§
I-	t)	CD	<	LU	ω	<	<
s	ω	o	0)	<	s	CD	<
y-	T—	T-	0		H	c	0	0)
<	<	<	ω	<	0	1-	1-	<*
m	m	CD	0	m	Ul	x	x	m
m	m	CD*	m1	m1	m1	m	m	m
0	0	0	0	0	0	0	0	0

CO CO ’b

CO
τ-	b	CO
Ο	σ>	T—
·“	co	T“
^b	CD	b
00	ro	00
00	co	00
		T“
o	o	o
(0	CO	CO
č	ŽS	c

σ>

05

05

05

h* CO

05

co

CO

Tf

05

CO 05

CM

05

CO 05

co

in

O)

05

05

05

05 05

05

05

05

0)

05

05 05

05

05

05 05

05

05

có

00

l<

CO

CD

M-

ΙΓ5

CD

05

CÓ

ó irí

LO

CO

có có

o

O

O

O

O O

O

O

O

O

O

·»- O

O

O

O O

•ŕ“

O

cxi

CM

τ-

in

t— C\j

ΙΓ5

l<

CD

S

CM

^ŕ

•N*

in cd

LO

o

o

O

ΟΜ

o

O o

CM

O

t—

O

T-

O i-

O

CM

CM T-

CM

CN

05

05

N-

O

Tľ (D

o o

M-

co

CO

CO

co

C» Τ-

in

CN

CD

CD

Tt CO

o

in

m

in

CD

05 CD

co

05

Ο Tt

in

05

05

05

CD

o

CO t-

o

CM

o

in

CM CO

CM

in

CO cn

co

CM

CN

CN

có

o

b-' b·'

o

in

o“

05’

oT

05’ CD

cd’

N

CD -r-'

05

co

ω

CQ

CO CO

T“

CO

LO

cn

CO CO

in

CO

CO Tt

CD

CD

	co	O	CO			O
r*	ID	in	CM				v
05	CM 00	CM	Tj-	05	ID	CO	f- O	CD
CM	ľí	co	CO	LO	05	10	CO CO	CD
CO	in <D	CD	CO	00	o	CO	05 in
CM	cn p	CM	o	CO		O	O CD	05
	o U_	D	u.	CO	o	-J	LL 05	LO
<	> <	<	<	N	_J	<	< X	X

CO

co

CO

t—

o

Τ-

CD

m

CM

CN

00 CO

CO

CD

CM

o

ΟΝ τΤ

m

O

co

CM

in

m

CO

T—

LO CO

05

r*

O

T“

CM

r* co

o

CO

CO CM

b-

CN

CM

CM

cn

CM

t- cn

in

co

CD

r*

r*-

-T-

05

CO i-

co

CD

io

CD

CD T-

T-

CO

co

CO

1- CM

t-

T—

T- ςο

b-

T-

<

<

CM

LL U-

0

U_

H

ω

o

LĹ 0

ω

<

w >·

ω

CM

CM

CO CO

>

< <

o

<

2

S

m

< o

<

m

<8

CM

m

0

0

J—

I

p co

CM

p:

T—

či F

pz

0

CM H

1—

P

H

H

ω

_J CC

<

<

<

<

<

CC <

<

F

< ω

0

<

I,

I

LU I

5.

α-,η-

m I

CO I

tn |

m 1

tn I

o. m I 1

m I

I,

m uj i I

LU I

m 1

1 CD

1 m

1 CD

CO

m m

1 m

tn

1 m

1 CD

1 tn

mm

1 m

1 m

1 1 cn cd

1 CD

1 CD

0

0

0

0

00

0

0

0

0

0

00

0

0

00

0

0

T“

CO

CO

CD

CO

b-

in

co

o

CO

O

in

co

o

CO

ID

OO

CO

CD

00

»“

CD

co

in

r.

CN

05

co

cn

O)

o

CM

in

CO

co

00

CD

05

05

05

05

t·

T—

τ-

τ-

τ-

τ-

o

O

Ο

Ο

Ο

o

Ο

C0

CQ

(Q

CO

CQ

CQ

CQ

b

cd

co

b

CO 00

b

0)

O) CO

b

O)

CD

00

o>

b-

00

CD

CD

CD

CO

cd

σ>

p

p

CD O)

p

p

CD CD

(D

CD

σ>

CD

CD

05

CD

CD

CD

CD

CD

T-

oi

y-ľ

7--

CD

CO

CÓ CO

CÓ

b

CM

CD

CM

CM

CÓ

b

b

Ó

CM

7“

o

t-

T“

T P

p

o

O O

O

o

o

O

7“

Τ-

O

O

O

T—

τ-

CD

co

cô

CD

CM b

y—’

oi

n r<

CD

CÓ

CÓ

CÓ

Ο)

CM

v-

b

Ο

CM

CM

CM

CM

O t-

o

CM

CM 1-

T“

CM

o

7“

o

O

O

CM

T”

in

b

co

M*

CO CD

o

CD

CO Tt

CD

00

CO

in

CO

7“

•y—

CM

CO

m

CD

m

o

r-

b

CM b

o

CO

cn co

m

CM

CM

co

m

y—

7“

b

CD

o>

10

CM

CD

b-

p

p xt

7“

O

co cn

CO

CD

p

CM

b

b

p

CO

τ-

b

co“

b-*

in

«r-

CD

CM*

r-* 05*

CD

cd

cd

05*

b

b

b

CD

O

CD*

ο’

co

CD

CD

co

id m

CO

CO

CO to

m

CD

CD

CO

CO

CO

CO

m

M*

CO

ω 3	t CO 3 Q	cn 3 O ω	cn *£3 0	cn ’0 0	E 3 ‘k.	ω φ O ω >*
3	o	O		3	3	Φ	w E φ o g g s ?:ss
ω ω 3	o o o	o o >7	ω □	cn ω 3	CD ω 3	ω co 0
*6 Φ m	Q. Φ ω	0 Q. CO ω	(0 O 5?	‘Ô CO CD	O (0 m	o ω o Φ ra φ S 3 to cj

b

, b

CD

CO

CO

o

o

CO

CM

b

o

o

CO

CO

CO

tn

CO * Λ

o

TT

CO

Τ’ CM

00

T“

o

O

y—

CM

O

co

O

CO

CO

co

U J co

o

CM

CM

M*

CM

cm in

b

▼T

CD

CD

o

O

m

CO

CM

CD

b

CM

o

CO

b

t- D'

b

CO

10

CD

CM

o

o

O

b-

co

θ

o

O)

t”

b

CD

CO -M-

00

10

O

L0

CO

'M*

O

o

o

O

cn

<0

->

o

(D

LL

CD

CD

r~ cd

Ύ—

o

-J

(D

00

-I

O

Q

O

00

C

>

Q

N

<

X

N

X N

Σ)

<

<

N

=)

UJ

O

<

<

<

<

X

<

<

<

O

O

CM

CD

CM

10

in o

o

τ-

o

CO

M-

o

CM

i- co

CO

7“

Ο

CO

M*

^T

^r

CD

LO

LO

CO

CO

b

10

CO

CM

o o

o

r-~

b

10

CD

(D

CM

O

7“

CO

TJ-

o

y—

M*

7—

T“

r~ b-

CO

(D

M-

CO

M-

CO

CO

CM

^t*

LO

in

CO

Ý

b

CM

00

CO

CM

cn cm

CO

b-

CO

M*

CO

Tŕ

CM

CM .

00

b

. b

4

CO

bo o m 0

bCM CM CO

< m ir Q ω

o CM O O CQ 0

CC b- Z 0 LU 00

bco in CD LU

b b o 10 O <

CM CM CM TCM UJ CO 7q>:

O xt 10 CO M* D

o co tJ-

CM O

CD O O >

CO CO CO in o o O

CO m o co o o Q <

CO CO CM O O O <

O 0 —1 0

O LO CO bco <0 0

O CO 10 co CM O 1

u> > 0

ω

LL

x

to

to t

Q

CO

-J H

F—

CO

F-

<

H

1—

Q

<

to

00

<

ω

CQ

m 5

to

S 5

5

UJ

Q

5

b

<

<

w

4

00 CO

s

7“

CM

7“

Y-

CM

to

Y“ 7“

H

7“

ω

CM

c\i

to

|—

▼—

<

<

<

<

< <

ΪΙ

to

< <

<

<

<

<

H

ľi

ľl

<

to

ω

<

CQ

CQ I

m I

CO I

m m I I

Q. 1

°|

CO CQ 1

CD

Q. 1

CO I

m I

T I

Q.

Q. i

CQ t

°i

UJ

m

1 CQ

1 m

1 m

CO

1 1 CD CQ

1 m

CO

1 I co m

CO

1 m

1 CQ

1 m

CO

CQ1

1 CQ

1 CQ

CQ

1 m

1 m

0

0

0

0

00

0

0

0 0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

e

0

	o	y—	b	o	CO
O	CO		CD		m	M*
CM	CM	▼—	CO	CO	co	CO
b	10	*“	CM			CM
CO	CO	M*	CO	y_	co	O
CM	CM	10	10	CD	co	O
O	O	O	O	O	o
CM	CM	CM	CM	CM	CM	CM
O	O	O	O	O	O	O
CO	CO	CO	CO	CO	(0	(0
2<	C	C	C	C	s	S

CO

cd

b·

CD

CD

CO

CO

(D

CO

CD

CD

CO

CO

CO

00

o

o

(D

co

CO

CD

CD

G)

CD

CD

CD

CD

CD

CD

CD

CD

CD

G)

G)

CD

G)

o

Q

q

CD

CD

CD

CÓ

có

LO

CD

G)

CO

CO

Ó

CÓ

CÓ

CÓ

CO

CO

CO

CO

CM

cm’

có

CM

CM

O

o

O

O

O

O

q

O

O

O

o

o

O

o

O

O

q

T“

y—

b*

(D

(D

CÓ

LO

LO

LO

τ-

F

LO

F

LD

in

b*

có

oó

ó

yj

«Τ-

CÓ

CM

CM

o

T“

»“

·»“

Ο

»“

CM

O

Y“

T“

T—

'T—

T—

co

T—

Ι—

CM

00

in

CO

CD

00

a σ> n

CM

00

CO

b-

CD CD O

CD

σ>

00

CO

CD

CM

γ—

b*

CO

in

CO

<n <n cd

CD

io

o

T“

ιο io co

10

LO

CD

CO

CO

b-

CM

LD

CM

00

CO CO CD

CM

q

CO

t- Y- LO

CD

CD

b«

’T

co

10

00

00

b.

CO

t-“ -r-' co

b·“

in

b.

K

co co io

G)

<n

cd’

CD

co’

co

LO

CO

CO

CO

CO

IO ID CO

LO

co

'M’

in

CO CO LO

CO

co

CO

CO

CO

CO

ω ω

CO

φ φ

S S

(Q CQ

Q. Q.

Q. Q.

Φ φ

3

Φ Φ

Q.

—” —

E

CD « 8 » >- >_

O

«

CD

E E ω

E

cd Φ r \

to

E

E E E

to

tn

to

to

to

to

D

o

C

c

3 3 3 k.

3 ’C CD

CQ

_D

3 3 3 ‘C Έ Έ CD

C

c

c

• c

c

c

έ

(ΰ

Φ ’o.

Φ

C

(D

Φ ’o.

Φ Q.

Φ

Φ

Φ

Φ

Φ

1c

Q.

Φ Φ g Y-* T- V

2 «

U U-

O

Φ +·*

'to

Φ Φ Φ M T T* T*

’o.

CL

Q.

Q.

Q

O E O 3 m

o

CQ

CQ

U O CD

o o

E o

E

o

O

O O O O

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

(Q

(0

CD

CD

(Q (Q O

S □

2 ° o. 2 ® φ t o

o

CQ

□

CÚ CQ CQ -i

to

tn

to

to

to

to

X3 O O

e <8 £

Φ x: o

O E

O E

X5 X3 P O O O O CD

-Q U o tí υ Φ

Ό 3 Φ

X) o o

ω u. Φ

X> X> X3 Q O O O tí o υ o Φ

O E

o E

o E

o E

o E

o E

>»

CD

o

o

>* >% 3

>»X7

to

>»X3

>>>XJ

o

o

o

o

o

o

5

2m 8

III

X

X

5 5 Σ

5 2

ω 8

Q.

2

3

2 2 2 2

X

I

x

x

x

x

ο ο ♦r Q.

Φ

L.

Τ' ω

E

CM o

LO o CM

00 10

LO CD LO 00

b* 00 CO o

CD CD CO ® y- í- CO

m co

bG> CD

b. oo b. CO

CO 00

co co y- y- 00

O o LO

o o 10

G)

o

00

TA

00

00

CD

CN

τ-

CM

OO

00

CN

TT

CO

o “3

o G)

s

o o

oo b*

00 b*

o u_

o

3

Ο m

O b.

CO b.

00 b·

o

o o

o u

N

<

Q

<

<

Li

_1

<

N

<

<

N

_1

—1

N

<

<

LO	b-		b*
co	CD	’M’
07		M-	CO
O	b-	b-	b-
CM CD M	L0	10
<	<	Zj
<	<	<	<

	L0
M		00		CD
	cn			CO
L0	co	10	cn	O
CM	m	CO	CD	CM
CO	cn	T“	N-	CM

	10 O	LO CD	b. 00
O	CM		10	CO
CO	T“	rtl	00	o
	O			Y“
>“	o	LO	cn	o
o	O	o	<	0
H	Q	cn		<
S	ω	Q	b* CO	σ5
T—	y—	y—	F	0
<	<	<	ω	n
m	m	m	lll	I
CD	CD	CD	m	CD
0	0	0	0	0

CD CD	O			o	CD CD O
-M- Ν' CN	LO	CO	O	in	n· n· m
tn m cd		b-	10		in m
CD CD N-		CD	LO	•N-	CD co n-
co co cn ,	r O	CQ	10	co	cn co cn
cn cn					cn cn
oo					O O
r- ν					r- Ν’
tn tn _	o		N	o	m tn o
in in ® cn	CD Τ’	O	00 b-	o>	m tn o>
m m o	>	CO	CO	>	S S >
00m	O	co	T“ o	O	0 0 O
cn cn o	F	o	m	1—	cn cn i-
	S	ω	<	s	2 S 5
T“ T- · ·	y—	F			x— T- Y—
< < o	<	<	<	<	< < <
fflffitc 1 l 1	m 1	m 1	m	CD I	CD CD CO 1 1 1
lll m cd m	CD	1 m	1 CD	1 m	1 1 1 CD CD CD
000	O	0	0	O	000

10	LO				00
00	OO				(D
o	O	LO	co	co	CO
o	O	CO	b-	r**	T-
CO	CO		CO	co ,	CD
O.	o
1 o o	1 O o	LO CD	bCO	bCD	CO CL
LO	LO	O	b-	b-	b.
1—	1”	CM	LO	LO	b·
T“		G>			SI
o	o		<r		x
O	O			5	CD
<	< čo	«< ÔÓ CM	*4»		ω
čô	Ô	ó	x
0	0	H	F	1—	có
H	H	ω	ω	ω	X
T 1	I I	LU I	LLI |	LU I	Q_ I
tn	1 CD	1 CD	1 CD	1 CD	1 tn
0	0	CD	0	0	0

o	t-	N.
O		τ-	V
CM	b-	Ο	CO
	b·
O	CM	CO
M-			M*
	Y—
CM	CM	CM	CM
O	O	O	O
CO	CQ	(Q	CQ
e	2	2	b

cn

04

in

CO

CD

m

co

LO

0)

CO

00

05

CO

CO

cn

cn

o

0)

05

05

05

05

p

05

05

p

05

05

CM

r<

CM

CD

CM

LO

CD

LO

có

CD

’t

CD

CÓ

T—

o

o

O

O

p

O

O

o

o

O

O

O

O

CD

CM

í<

Ó

-T-L

CO

CD

ľx

CÓ

r<

CD

O

o

T-

1—

1—

co

O

CO

o

CM

T-

o

1—

CM

ο

ID

LO

O

Y—

v-

CM

CO

05

CO

CD

bx

LÍ5

b-

T—

co

05

05

T“

bx

m

05

CO

00

b-

o

CO

bx

O

CO

»—

CM

CM

O

p

00

co

CD

O

’ŕ

cm’

co

o

b-

05

O

co

0)

*3·

co

CO

T“

CD

CD

CO

CO

05

CO

05

CO

CO

E □ έ ω ω ω ο ο •g ο ο *Ο φ =?

Ε

Ε

Σ3

E Ε □ D έ ω έ Φ *7ň Φ 4-^ Ζί 4-J Ο ο ο CÚ τ (0 η □ η ο g ο ο φ ο >1

ketoacylreduktáza (fabG), enoylreduktáza (inhA) a ferochelatáza (mav272) gény, úplná eds.

CO	CO					CM			CO
CM				CD	CD		CM	CO
	. CM	CM				CD
CD	CO		o	05	CM	CM	CM	LO	CM
	05 00	T“ CD	CO	M- 05	M CD	O	CD	CM O	O O
LL	b»	CD	b*	05	b-	σ	b*	m	LL
<	<	X	N	N	S	<	2	<	<

	CO
00	CO
	CM
CM	O
O	O
_l	U
<	<

	CO	O CO	05 CM CD	cn
O		T—	CD	O	CO
CD	b*	o	b*	00 CO	(D	co
CO	LO .	CO	CO	CD CM	bx	cm
in
|X	CO				CM
o	CM			CL	CD	CL
x ID CD	CO 05 00	0 H	CD	. CC	•v— CM	CC Q.
r>	px	-J	>-	CQ <	O	<
m		0	o	Q P	σ	Q
5	CO H	0	J—	_j	<	H
UJ čm	o	s ▼”	5 *c CC	CO ω	< X
<ť	ω	<	<	< o	ω	ó
CQ	UJ	m	CO	CD CC	0	oc
CQ	cn1	m	CD	m'co1	CD	CD
ω	o	0	0	0 0	0	0

bx	CD	CD	b*
ID	CO	O	LD	O	CO
05		CO	05	CD	Tf
cn	LD	CM	04	CM	LD
CM		CD	CM	CO		, \
	CD		M-		CO
CM LD	CO CM	bx O	CM LD	bx O	CO τ'cm
CM	O		CM		o
O	O		O	r*	o
CD	LL	1—	CD	1—	u
<	<	Σ	<	5	<
	cm	T“			Qí
<	<	<	<	<
CD	CD	co	CD	CD	CD
CD	CD	CD1	1 CD	CD	CD
0	0	0	0	0	0

co £ ιη b-

CO σ>

bCO

b.

b- O)

CM

05

CO

CM

co

CO

CM

LD

CO

LO

co

co

05

05

05

05 O)

05

05

05

05

05

q

05

05

05

05

05

05

05

05

d

d

d

d

d

d

CD

τ-

d

CM

CO

CM*

CO

05

CM

O)

T“

o o

T-

q

o

Ύ“

O

Ο

i—

T-

q

O

O

O

có

t- co

d

r—

05

iri

05

d

LD

in

LÍ5

in

in

CM

CO

t—’

OJ

t- CM

o

t“

τ-

o

t—

o

O

i—

CM

CM

O

Ί—

O

o

O

o

σ> co

05

T—

CD

CO

CO

CM

b-

O

o

O

o

h-

05

T“

00

ID

05

b-

b·

b-

CD

<□

q

o

o

CM

CO

CO

’T. ^7

CM

05

T

CO

CM

N

CD

o’

d

o’

d

CO

O

CO

05 CO

oí

CD

M7

co’

y—

d

o

o

o

o

cn

CD

iri

CO CO

05

CO

CD

05

CD

CD

05

T-

T“

T“

T“

05

CO

co

CO	05 m	M-	CO		05	CO	05	CO	05	CO
o	in		o		M-	o	7“	b*	τ-	b-	CO
M	CO	CO		co	b-	M*	co	o	ΟΟ	o	CM
05	o	m	O)	ID	CM	05	m	05	ID	05	M
m	-j	05	in	05	CO	in	CM	o	CM	O	T
X	<	N	X	N	D	X	2	<	Σ	<	X

CO

o

o

CM

M

ID

05

M-

05

O

t}·

ID

in

ID

in

CM

T“

in

O

N

b-

O

b·

CO

O

CO

co

00

co

05

CO

05

co

O

O

co

O

LD

CO

CO

co

00

co

CM

•M-

LD

CO

CO

M

CO

M-

CM

CO

M-

M*

CO

CM

▼”

CM

*

M*

in

Tt CM

0

CO 05

0

CO 05 M-

05

0

Q

o

CM

05

m- CO

CD O) CD b-

CL a

CL CL

M bCM

CL a

CL m

CO

ηω

CO

O

UJ M* 05

O O

CM

čo o

<

ID

>

<

>

00

<

CL

b-

Q.

b·

CL

O

D

DO

0

o

o

0

o

D

0

d

05

d

05

a

o

u

O

O <

0

o

1-

0

H

<

0

O

o

O

O

0

ω

<

d

UJ ČM

o

ω

s

o

S

o

O

<

O

<

ω

x

CO

CM

r 0

y-

T“

CM

1-

T—

H

Y—

CO

0

<

< H

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

x

t—

m

CD X

CD

CD

CD

CD

m

CD

CD

CD

CL

“l

Q_

cn

fl-

x

CO

co m

CO

CD

CD1

CO

1 CD

CO

CD1

CD

CD

CD

CD

CD1

CD

CD

0

00

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

ID

CO

ID

05

o

CM

CO

O

O)

00

T“

CO

o

00

CD

b-

05

CM

05

LD

CD

b-

CO

05

CO

M

tn

in

LD

in

00

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

O

o

o

O

o

O

Φ

CC

CC

CC

CC

CO

c

2

2

2

č

ŽS

cn

CD

0)

b

CO

ω

CD

b

0

0

b

0

0

b

0

V“

b.

0

Y“

0

O)

CD

CD

A

CD

CD

CD

CD

CD

CD

0

0

0

0

0

0

o>

0

0

0

CD

CM

b

M*

0

0

iri

0

0

LO

0

0

tri

0

Ó

0

<35

Y“

0

γΖ

o

T—

o

O

O

O

O

t—

O

O

T“

O

o

T-

O

o

T—

O

T“

ηΖ

0

b

b

oó

b

CO

^Φ

b

00

0

Ó

cô

0

Ó

0

T“

o

T“

0

T-

T-

o

0

t—

O

0

T“

o

0

0

0

CM

T—

0

0

T—

l~

0

CM

b*

0

o

o

CO

05

05

b

O

o

0

o

0

o

0

Y

0

CM

b

^φ

o

o

co

ID

CO

o

o

0

0

0

0

b-

0_

r-

T“

05

0

o“

o

CO

CM

CM

0

o

o

0

^Φ

»“

v

0

o

0

<35

0’

ΙΛ

b

b

o

o

A

05'

O5~

•y—

o

o

CM

co“

b

0

0

CO

0

CO

0

CO

0

0

CO

05

<35

^Φ

’T—

T“

0

0

0

0

0

CO

(f) c Φ ω ’5>

co

Q.

CO σ

ω c Φ q.

φ o co

CD ω c φ ’o.

.sk-í-í O 3 Q 3 O 3 O 3 O 3 O 3 (/)

Σ 3 0 0)0 cnŽE 3 0 cnO σιΣ 2 O σθ □)<

E

’o.

CO o E o x (D C Φ

E o x

E o x

		0	in	m
0	0	0	0
O		0	0	0	0	0	0	0
O	0	’Φ	T”	0	0		0	T“
	0		0	0	0	0	0	O
o	V	b·	0	0	0	0	O	0
Q	ĽL	O	<	0	0	O	u_	0
<	<	<	<	N	N	>	<	N

	0 ’φ	CO Y	CO CM	0 b*	0 0
CO	0	0	CO	cn	r-	0	*φ·	Τ-	0	CM
Y	0		*Φ	co	r^		τφ	Ο	T“	CM
m	0	o	0	co	05	0	0	O	0	O
05	o	0	0	o	o	O	0	o	O	O
o	LL	0	O	u_	LL	0	ω	LLI	0	O
>	<	N	>	<	<	X	Z)	<	x	<

CM	0	O	O	0	0	b	0
0	«•Φ			0	0	0	b	CM	0	b	CM	0	b	CO	0	•tf-	0	0	0
0		b	0	0	0	CM	0	0	CM	0	Φ	CM	0		b	0	O	b
0	0	CM	O	CM	CM	b	0	0	b	0	0	b	0	05	b	0	0	b	b
t-	CM	0	0	CM	CM	0	0	M*	0	0		0	0	CO	t-			T“	Y—

05 O o

Y CO

0 0 0 *Φ

0 CM O) 0

CD 0 CM CM

CD 0 CM CM

o

CD Y cn

05 Y CO

o

0 0

05 Y CO

O

0 *φ 0

0 CM b

í

M“ 0

0 b T“

í

cn cn CM CM o o

o

in

b

0

>

>

>

CD

>

>-

0

>

>

0

b

—1

0 0

O

_J

O

O

CM T“

O

Q

U

CL

co o

O

Q.

0 o

O

CL

0 o

CD

0

Z)

O o

0

<

<

LL

<

F—

H

0

ll

F—

0

LL

1—

0

LL

(3 u_

CO

CQ

UJ

ω

ZD

čô

<

0

*φ

S

Q

<

S

O

<

Σ

Q

<

<

s

<

<

S

I

0

CM

ω

ŕ—

CM

CM

ČM

CM

CM

ČM

Ϋ

F—

<

ω

ω

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

ľJ

<

<

<

<

X

I,

CO

°|

ω 1

m

CO I

m t

CO I

CO I

CO

m

CO

CO

£D 1

D. i

CD

CD

CD

CO

X,

m

m

CD

CD

1 m

1 CO

1 CO

CO

CO

co1

CQ1

1 CD

1 CO

1 CO

1 CO

CD1

CD*

1 CD

1 CO

1 CO

0

0

0

O

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0	Y—	CD
CD	V“	0
b	0	CD
CM	CM	0
CD	CM	CM
CM	0	0
CM	CM	CM
O	O	O
CQ	CQ	(Q
S	ŽS	č

0	CD	0	0
0	v—	0	0
O	b	CM	O
Ύ-	*»“
b	0	CM	0
CM	0	0	0
0	0	0	0
CM	CM	CM	CM
O	O	O	O
(Ú	CQ	CQ	CQ
č	í	2	2S

σ>

10

10 10

10

b.

CD

CD

CD

σ>

CD

00

b-

00

b-

CO

CD

0)

CD

O) CD

CD

σ>

CD

Q)

O

p

05

CD

P

p

σ>

P

p

có

O)

CM

CD

CD

b^

CD

Ó

Ó

CO

Tt

CD

Ó

oó

CD

o

LD

o

o

O

O O

O

q

O

T

O

O

O

o

o

O

CM

cd

Ó

CD CO

CO

T“

CM

CO

CÓ

CO

r<

CM

CD

co

oó

CD

10

o

o

CM t

O

T—

O

O

O

O

CM

CM

T“

T“

o

ο OJ

O

O

K

o

o

in

CD

CD

CD

in

10

10

T“

O

O

05

CO

b-

σ>

q

O

05

CO

CO

CD

co

CO

o

CD

O

b-

CD

CO

Tfr

CD

co

o

O

r-

CD

b.

LO

O

co

CD

CD

O

O

b-

05

CO

O

O

'ŕ

o

O

cn

O)

O)

co’

LD

<o

cd’

CD

CD

CD

oo“

05

00

co“

b-“

CD

T”

T-

05

CD

CD

CD

CO

CD

CO

CO

CO

CO

CO

CD

CD

CO

CO

ω	ω	CO	E =	D ω	(0	CO
c	c	c		3	c	c
Φ	Φ	Φ	E □	Q «	co «t	Φ	. Φ
Q. CO	‘o. CO	Q. CO	Σ σ> = 2	O) CO	Q_ CO	’cx CO
W	ω	CO	‘Q	CO	CO
o	o	o		o °	o	o	o
E o	E o	E o	ω o	2 c 8 Σ	o t	E o	E o
r	I	I	O	«Ο	O	x	x

CD	CM
CO						o		▼-
CD		o	J—	CO	CO	T—	CM	CM
b-	O	CD	£2 05	CM	CD	b*	t-
O O O	10 10 b·	b* 00	2 S CD h-	£ íl	CD	o o O	O Q	o O
<	x	X x	>	<	<	<
o						co		M“
						ίο	T“
CO	b*	10	10 -M*	LO	CD	CM		•M“
b*	CM	O	CD CM	CM	CO	CO	CD	CD
CM	•M“	CD	Ί- O		10	b-	CO	CO
	CM	T“	CM CO	CM	IO	T“		T“
CD								^3“
00		<		CO		CM		x—
CO	<	Hl	m	LU		O	CM	CM
b· O o	UJ Q	o <	CD^ O) Sí	o <	CM O |_L	N o	O	T“ O
o	<	CC	CO <	CC	O	o	o
<	0	o	CD 0	o	u.	o	<	< có
CM	Q	o	— O	o	n.	<	CO
0	y—	y—		y—	y—		0	0
1-	<	<	< <	<	<	£Ľ	H	1-
I,	m	m	o. m	m	ffl	n.	I	T
m	m1	m	co m	m	CD	CD	m1	m1
0	0	0	00	0	0	0	0	0

10			CO	CD		CD
LD		CD	CM	CM		CO	CD
O	»s-	b-	’t	o>	CO
	P*	LD	b-	LO	CO	CD	CM
O		CD			CO	CM
LL <	CM CD O “5	^· CD S	$	§	LD CD N	*4·	LO LD S
					LD
b-	T“	CO			LO		CO
LO	t	LD	m-	CO	CM	L0	LO
	•M		b-	o	CM	b-	CO
b-	M-		co	co .	CM	CO
		S	CO	CD		CD	CO
		o	CM	CM		CO
10 10		ω	b* b-	10	b-	2	o O
o	<5	<			b>	CM	<
	x	.j			>-	3
S Σ <	D. m < CC	Q. cn < x	3 M	T“	O H S	’t	*·< s 1— ω
CM			|—	I—	T“	1—	Ί—
<	Σ	S	ω	ω	<	ω	<
CD I	o.	O I	LU I	lll |	co I	UJ 1	m
1 m	m	1 m	1 CD	CD	CD	co	co
0	0	0	0	0	0	0	0

b-	O
CD		o		CO
	CO	b-	00	CD
	CM	00	CD	CD
CD			LD	O
σ>	o	i—	CO	M*
CO	’Ť			Tt
CM	CM	CM	CM	CM
O	O	O	O	O
CO	CO	CO	CO	CO
í	č	c	ŽS	s

CD b00

CO

CM

CO

CO

CD

b in

CD

CD

CD

CO

CO

xr o

Q)

CD

CD

co

m

CD

cn

cd

G) CD

CD

CD

CD

q

CD

CD CD

CD

CD

CD

CD

cn

CD

co

CM

ó có

to

CÓ

CD

xŕ

CÓ

CÓ

CÓ

CÓ

b

CÓ

vi

CM

o

o

-F- o

o

O

O

o

O

O i-

O

O

O

O

o

O

ó

có

CÓ

CO

M*

CM

to

b

CÓ

CM

CM

CÓ

b

aj

b

co

t-

O T“

CM

CM

CM

CM

r-

O CM

O

O

i—

t-

O

CD

O

G) CD

b

t—

CM

to

CO «r-

CM

CM

b

co

CM

to

CD

to O

co

r—

b

CO

G> to

CM

CM

r—

b

O

CM

(D

CD to

b

to

o

to

CO O

00

CO

τ-

1—

CD

CÓ

có“

T-

CÓ“

to

CÓ

to’

7-Γ

b b

CD

co'

ο

in

to

CÓ

CO

CD

to

co

CO

xŕ

to

to

CO CO

CO

CO

to

co

to

to

	N	K
y- to	Τ-		to			b
CD b	Ο	o	CM	CD	CM	to
CD O	to	to		O	to	o
CM to	CO	CO	b	to		b
M- to	T-	T—	T“		cô

G)

to

to

n

00 b o CD o o

O o to CM co t- to b CM

CM O

O δ cd

O to o o o o

S 0 o. S

0 a CM > O

O co| o Φ o ľľ

CO CM CO O O O

CO CM co o o o

G) CM T“ b 7“ ľD

co CO o >

Mto CM 00 to o

H CL > X 0

tn

H

1—

o

tx

H

F

o co

<

<

CO

P

LL

<

<

m cm

U)

<

ω

2 T

CM

CM

£C

s

<

cn

T-

A* j—

7—

T

7—

T“

7—

t- CM

0

0

CM

CM

<

Scq

<

<

<

<

<

< tr

H

H

<

<

<

<

tu

O UJ

m

m

cn

tn

m

CD Q.

I

T

m

cn

tn

cn

cn1

tn'tn1

cn1

m1

m

cn

m

cn m

m1

cn

m

m

1 m

m1

0

0 0

o

0

0

0

0

0 0

0

0

0

0

0

0

CD

00

b

b

O

G)

CO

CD

b

’φ

O

to

CO

00

00

»—

cn

m

cn

cn

O)

O

<n

O)

co

CO

CD

cn

CO

co

CO

CD

xt CO

CD

LO

cn

cn

cn

O)

q

σ>

o

cn

cn

cn

cn

cn

cn

O)

cn

q

q q

cn

q

CM

b^

00

co

χί-

cn

CD

cn

CD

CD

cn

CD

ó

cô

CD

CM

cn cd

CM

in

o

o

o

O

Ο

o

p

o

O

O

o

q

o

o

o o

p

i<

CO

CM

CM

CD

CM

V-

CM

r<

r<

cň

xt

ô

iri

b-‘

Ó

cn b^

o

u5

o

O

CM

CM

▼“

o

X“

o

x-

x-

CM

CM

co

CM

CM x-

CM

CM

CM

CM

CM

CO

o

m

N

F

o

o

F

b-

F

CM

10

CD CO

O

CO

O

O

CM

CM

m

CM

CD

O

F

b-

CM

IO

CM

CO

b-

CO x-

cn

CD

CD

C3

O

co

Xt

o

F

<o

V

ω

σ>

CD

't

in

in

xt O

in

CO

CO

Xt

co

CD

CO

m

T—~

b-“

cn

co

b*

O

CO

o*

b-“ oo“

CO

bľ

in

ID

CO

CO

co

CO

CO

m

<0

CO

x-

CQ

CD

f

co

CD

ID CO

LD

ID

CM CM

cn	ω	CD	CD
		C	C
	n	Φ	Φ
D ω	3 ω	Q. ¢0	’o. CQ
ω	CD	(D	CD
3	3	O	O
O	Ô	E	E
Φ	cn	o	o
CQ	cn	I	I

φ cú

Q.

u- *<Q	CD	CQ	CD	CQ
CO Ό	C		C
Š ’n	Φ	O	Φ	O
O	’CL	Q.	‘o.	Q.
CD	CQ	CD	CO	CD
·- 3	CD	□	CD	□
S Τ’	O	Φ C	O	Φ C
3 tD Φ	E	CD	E	CD
o	O	o	O
m X3	X	T“	X

c Φ

E

O)

CO	(0		C
			Φ E
D	3		cn
E	E		Φ CD
CO	<0
N O	N Ό		E
C	C		o
CO	E		c
>»	>»		Φ O)
Q.	Q.
O	O
**	2		C Q.
CO	CO
CO	CO		*3
o	Cn		>
1 Q_	1 CL		X b·.
O	D		CO
Z)	ľD		X
(D	CD		CD
’CD	‘ČÔ		CD
O	O		O
3	3		3
O	E		O
Φ	. φ		Φ
Δ	CD J3	CD	X)
3	T? □	*o	3
	o ♦-	O	*-*

00

CD

CM

CM

CO

O

CO

CM

CM

cn

ID

CO

b-

xt

co co

X“

v—

CM

O ΖΛ

T“

o

O

CD

O

m

CO

CM

o

CM

LO CM

00

CO

LD

vw

o

o

CM

CD

CM

O

o

>- O

CO to

o

o

O

in

m

ID

CO

CO

CM

CM

CM

Ύ—

O)

o

O O>

o

o

O

CD

vJ

CD

CD

CD

T—

O

O

CD

CO

o

o co

CO CO

o

□

O

CD

Γ*

CD

Q)

0>

-J

—1

LL

cn

b.

Q

o F

α n

<

<

<

N

<

N

N

N

<

<

<

Z)

N

<

Z> N

M

CD

CD

co

CM

CM

o

o

cn

O

Xt

co

O M·

CD

in o

r*

b-

tn

C»

<n

o

o

CO

xt

00

O

co

b- T~

CO

b-

σ> cn

LO

m

o

CO

CD

CD

O)

cn

cn

S

b-

O

m

o

xt in

O

in

CO CM

co

co

cn

IO

CD

in

00

CO

CD

CO

b-

CM

CM

b*

CO CM

b*

m

CM xt

co

co

O

co

m k

co

CO

co

xt

CM

x“

x-

co

CO

CO CO

CO

CM

< CL

< Q § ZJ F _i

co CM co

CO CM CO

CM cn

X-

in o CD

T-

co

co

o x

CD

O xt

co CM v-

O CO

in

o . co

T“ m

Z LU 0

Z) 0

o

o

CM

<

CO

<

cp

CO

CM

in

CD

-i-

Ύ“

—1

X CD

o

o

m

b*

b*

F

>

>-

CM

O

CD

cn

>-

>-

s >

*

0

o 0

O

o

o o

o

O

p

O

ω

>

CM o

Ό

O

0

Sp

0

5

< U3

<

<

o

LL 11 1

x*.

LL 11 t

1-

F

x

F

U.

F

H

0

o H

ω

F

m m

ČÔ

ČÔ

<

LU Q

CM CO

LL) Q

2

S

S

<

5

S

Z) 5

ω

x— t—

0

0

CM

J—

0

ČM

y—

X“

T— T“

T—

< <

1—

F

2J

ω

—v

<

<

F

<

<

<

<

<

< <

<

<

m m | i

X,

X,

D_ I

|

UJ I

1

m I

m I

X I

tn I

m I

m |

m I

CQ |

cn m I I

CD 1

ca I

1 1 cn cd

1 CD

1 CD

1 m

1 CQ

1 CQ

1 CD

1 CD

1 cn

1 m

1 CD

1 cn

1 CD

CQ

1 m

1 1 CQ CD

CD

CD

0 0

0

0

ω

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0 0

0

0

O cn o>

CO

CD

CD

CD in in CM o

CO č

CM b*

O CO

CD

O)

CD

CD

b

CD

CD

CD

b

CD

CD

CD

CO

CD

xb co co

cn

cd

CD

CD

CD

CD

q

CD

CD

CD

CD

CD

cd

σ>

cd q q

có

cd

b

CD

LD

CÓ

T“

CÓ

CM

tn

tri

b

LD

CD

·»— ^· ^·

q

o

q

q

O

q

q

q

q

q

q

q

q

q

o o o

CM

CM

co

M*

CO

có

tn

ID

CO

j—-

Τ-

ó

b

b CD CD

T“

O

o

CM

T“

CM

o

o

T—

O

o

Ο

CM

T“

CM CM CM

co OJ

CO	CD	b	b	CO	CD	b*	tn	y—		CD	CO
LD	O	CD	CO	b	CO	CO	co	3	LD	cd
CO	CD	coe		CM	CO	CD	b	CO	q	xŕ
CD	K	Ó“	O)	CD*	co’	CD	CO	tn	cd’		o
CO	CO	LD	CO	LD	LD	CO	CO	co	CO		xf

m	T“	b-	T—	b
m	b	b	b.	b
			CO	CM
o	co	CO	b.	K
M-	CO	CO	LD	LD

ω	CO	(0
□	c	c
□	Φ	Φ
Q	’q.	Q.
ω	CO	CO
s	CO	CO
E	o	o
CO	E	E
3	o	o
Z	x	x

o E	CO □
CO D	o
-Q O	o
	o o
2? S	CO V—
O s	(0
Q O)	Q.

OJ		CM			5b		CO		CO	CO	b.
		CM		b		Τ-		xb	xb	O)
b	LD	CD	T“	CD	CD	b	Ο)	LD	CD	CD	CD
CO	CO	CD	CM	CD	in	CD	LD	O	xb	xb	O)
CO	O)	b*	CM	CD	Τ-	b	O		O	O	M“
T“	CD		O	CD	Ο	ID	O	cô	O	O	O
”3		LD	-J	xb	m	CD	O	LD	U	o	LL
<	N	<	<	O	<	Z	<	Σ3	<	<	<

v

IO

Pj

T CO σ> co co b0 MS S in

CO

CM

O)

▼“

tn

v-

0

r*

LD

T”

CO

T“

co

CM

CD

CM b

CO

CD

b

CD

xt

CM

CD

CD

CD

xb

00

tn m- co

CD

0

b

CM

CO

T“

in

CD

CO

CO

o

CM

xb i- co

Ύ-

CO

co

xt

v-

tn

co

CD

xb

xb

0

T“

«t

CM i- i—

u.

CD

CM

CC

ω

T“ b CO CO

CD O

CD CD b xb LD

ID CM O

CD CD CD CD xb

Mb CD LD

b CD b LD

CO

LD O CD LD

CO xb CD ’t O

CO •M CD O

b O) 00 CD

o o o z

0 CO CO >-

tr _J ín 1 1 ä D O 9 -1 -1

—j

<

ZD

o

CO

Z)

O

O

o

LU

O

<00

0

UJ o

O) CM

1—

<

m

z

s

o

(J

U-

O

H

x < <

Q

0.

<

CD

1-

s

<

<

<

Q.

S

S tn m

H

y—

H

CO

CO

CM

T-

<

ω

<

<

<

w

o

CC

CC

<

<

<

< < <

m

UJ

m

m

m

UJ

0.

£T

D.

CL,

m

m

m

co m m

m1

CQ1

m1

m

m1

m1

m

m1

m

m1

m

m

m

co1

CQ CD CD

0

0

o

0

0

0

c

0

0

0

0

0

0

0

0 0 0

	o	00
CM	tn	o
	CD	o
CD		X“
	o	Xt
CM	xb	tn
CD	CD	CD
CM	CM	CM
O	O	o
CO	CO	CO
č	£	č

	o	tn
Ύ“	CO	CD
CD	CD	o
CO	t—

CD	tn	xb
CD	b	CD
CD	CD	CD
CM	CM	CM
o	o	O
CO	CO	CO
s	c	s

’t Od

CO

b·

b-

CO

b-

oj oo

co

CO

CO

σ>

CO

CD

00

’t

oj

CD

cn

o

o

O)

O

σ> σ)

CD

CD

DJ

CD

CD

CD

CD

(D

CD

<D

CD

CD

CM

CD

CD

CD

cô

N

r<

CM

CM

CO

00

CÓ

o

o

o

τ-

O

f- o

O

o

o

O

o

O

t-

O

O

O

σ>

r<

Ο)

r<

ib ’t

O)

r<

’t

CM

Ó

’t

X

CM

CM

CM

CM

CM

CM

CM

T- CM

T—

CM

CM

t—

CM

CM

O

O

O

O

b-

CD

’t

OJ

O)

o LO O

co

CO

0)

CO

o

CO CO tn

in

b-

’t

co

LO

’t

io co

co

’t

CM

0)

CM

’t

K- h- O

o

CM

N

CO

o

f-

co10-

co

’t

CM

CO

’t

CD

ιη ιη τ-

T-

K

O

co

h-

CM

r- o>

co

CD

co

o

co

O)

ι- T- K

N

m

LD

CO

CO

’t

co o>

CO

CO

CD

CD

CO

CD

CO CO CO

CO

C Φ «£	.2 *c φ	o έ Φ ι-	Q. CO ω	o ’ΰΣ Φ
^3 ’p	o φ	o c	Ο ’c	o E	O C
Φ	φ	(0	CO	o	(0
cn	ω	0	Q	X	O
		CM	CM		CM

I	T	Q	T
£ °	c O	o	c Q
2 H	2 H	ω	2 H
* <	a <	c fll	A <
<Σ	<s	w ‘o	<5
z cn	z ω	CO	z cn
a 5	9š	ω O	Q Š o =
	•Et·	E Q	g t:
® o	® 0		® 0

S	O ->»	o	s	O '>%
XJ	C	Ύ—		C
c	CO	CO	C	CO
Q	TJ	’t	p	TJ
	Φ	cr		CO
>1 >c	Έ o Q.	o <	> >C	o Q.
Φ	ω	m	Φ	ω
E	□		E	3
	φ	L·		Φ
CD	c	P	co	C
LL	b-		LL	b-

O	CD	io		b-		O)	b·				b-
CD	CM	oo		o		CO	O	b-			’t
CD	CD	m			m	CO		co	LD	CO	CM
CD	’t	Ä		LO	CD		co	CM		CD
ID	O)	2 <o	CO	CO	CD	0)	CO	CM		δ	O
b-	’t	R cn	LD	o	CO	O	o	o	O)	o	O
<	<	O -r-	CD	-J		-J	-J	CD	0)	o	O
<	<	< ω	N	<	LU	<	<	<	N	D	<
		CM									co
		N	O	N		LD	b.		’t	τ-	CD
		t- O	CD	CO	o	T“	CO	CM	CM	00	CO
CO		O CO	b-	CO	CD	T“	CO	b-	CM	co	’t
CO	CM	LO CM	o	o	CM	CM	o	LO	CD	LD	b-
CM	T“ .	. t- CM	’t	t	CM	CM	’t	CM	CO	CO

CD	CO	O	<0
CM	CM	CD	CM	10
CD	CD	CO	CO
’t	’t	CO	’t	co
CD	CD	LD	CD	CM 10
’t	’t	b-	’t	2 m
í	3	í OJ	5 ib	O <o O m o ”
ID	ib	< UJ
1—	H	1—	H	3 ·“
ω	ω	cn	ω	CC <
UJ |	UJ t	LU I	UJ |	0-0.
1 m	1 m	m	1 m	„J CD CD
0	0	0	0	00

CO						’t CO CM
O) ’t δ	r^. < LO	10 10 CD co	CM CM O	r- < 10	r—CO CO CM o	CO m CD in 52 o -1 n° qgO
H	O		O	O	CD <	_1 o <
S	cn	UJ	ω	cn	S Σ3 čm
▼—	T“	H	T“	y—	γ—	0
<	<	<	<	<	<	< < H
m I	m I	O. I	m t	m I	CD |	co m T 1 1
1 m	1 m	cn	1 m	1 m	1 cn	1 1 1 cn cn cn
0	0	CD	0	0	0	000
		co			CO	CO
		o			CM	LD
		CM			CM	O
		t—			CM

©

Φ

CO

©

00 ©

b·

00

b·

tí- r-

CO

©

©

©

©

©

©

©

©

© © ©

©

©

©

© ©

©

©

©

©

©

©

©

©

©

© CO ©

©

ó

©

CO wfr

©

b·’

b.’

©

q

o

O

O

i— O O

q

τη

q

q q

q

q

q

q

T“

ó

©

©

CÔ

t^ ©

có

cô

v-

T^ ©

o

©

©

ó

cô

©

T“

©

O O ©

o

o

O

o o

©

©

©

co

©

ΙΩ

CX1

©

©

CD

σι

1- >- CO

©

T—

CM

cm in

b.

b-

b.

in

©

T—

b-

O O OJ

CO

©

IX

CD M-

T—

o

o

LD

©

T“

cd

’η.

CD

O

•M <

CO

CD

CO

τ-

in

CO

co

CO

co'

CD CD b·

©

00

TO

©

r<

b·'

ό*

t-T

CO

CO

CO

co

M- ·>Φ CO

CO

CO

CO

co m

in

co

co

Tŕ

CO

CO

cn ’>

E E

CO

c 3

w

co

E

ω

u Sk ffi

(0

co

(0

CO

c

C

□

.2 .2

c

Φ

c

3

□

cú

Vi

CO

c

C

3

C

Φ CL

Φ q_

cn

<Ď Φ +—· 4—·

Φ qľ

O cn

E-

Φ

c o

> Q.

UJ o >> >_

Φ ’o.

Φ 'o.

D O

Φ Q_

CQ

cn

*3

O Q

cn

n

o ®

Ík·

O

E

Φ

E o

cn

cn

<0

cn

CO O

CO o

cn D

cn cn d n

(0 o

Φ C

E o

<0 □

cn X)

o Ό

cn O)

o o rí O

CO o

CO o

3 E

<0 o

E

E

ΧΞ

U u Q O

E

ŕ

2 E

o

u O

3 (D

c

U. Φ m

E

E

CO

E

o

o

Q.

Sk Sk

o

o

= o

cn

Sk

(0

'1—

t O

o

o

3

o

X

x

UJ

Σ S

X

Q

O) X

CD

S

CL

<0

ω 8

X

X

S

X

o

T—

Ύ-

CD

τ-

fS.

©

©

©

in

in

LD

Ο

o

o

tT

©

©

in

m co 5*

b.

o o

©

t—

K

b·

CD

CM t- b-

CD

T—

©

©

©

b^

©

o

o

O

O

t- O g

m

in

o ©

©

o

o

T-

o

o

o

O

O

CD O Q

co

o m

o

o

o

o

o

O

O

CD

CD O O

©

O

©

o ©

Zj

O

O

>

—J

<

<

<

<

bj ZJ <

X

<

Z) D

<

<

<

<

<

©

©

h*

©

©

f T- b

b-

©

©

M*

cm co in

©

b*

Tŕ ©

©

©

©

©

©

©

CM co co

CO

m

©

© ©

o

©

b.

©

©

©

CO

co m CD

CO

o

©

© O

T—

©

©

T-

T“

v—

σ>

CO CD CO

©

*n*

©

© M·

©

©

©

o

▼—

z ľj

m

in

CD

m

©

©

O

0

T—

©

o

o

©

bč

© ’Ť

©

© M*

CO M- CD b-

CL

b* ©

©

CD

CD

£

0

o

o

o

©

in 52 o

H

s ©

M-

o

o

T“

cn

o

o

o

©

-*n°

111

Τ-

©

2i ©

0

o

o

K.

Z)

O

O

Q

O

qSp

m

Ο

ZJ

o Íl O Σ)

CO

O

O

<<

ω

<

<

<

O m

-J o <

0

<

u_

o ω

Q

<

<

—<

x

čo

©

©

UJ <

2 Z) ČM

p

©

m

r> n.

ω

ČM

ČM

© ©

0

0

0

—s

R R0

ω

T-

•R čm

0

0

0

H

1—

H

T“

< < 1-

<

ω

<

< <

<

H

1-

ω

H

T,

x I

X I

I

m tn x 1 1 1

m I

0 i

CO I

m m

m I

I,

X

LU

X

1 m

1 m

1 m

1 CD

1 1 1 cd m m

cn

cn

1 m

m'tn1

1 CD

1 tn

1 cn

m1

1 CD

0

0

0

0

000

0

0

0

0 0

0

0

0

0

0

©		©
©	©	©	o	©	©
o	Ύ—	o	©	©	b.
	▼—		©	©	©
t-	©	b.	©		©
		©	o	©	©
b-	b·	b*	©	©	©
©	©	©	©	©	©
O	O	o	o	o	o
cn	cn	cn	cn	cn	cn
e	č	č	č	C	č

CD	CD	CD	CO	CD	CD	CD	CO	OJ	b
q	q	CD	OJ	CD	OJ	CD	q	CD	0)
t—	Y—	CD	CM	CM	irj	CM	7“	OJ	CM
Y“		O	T-	O	O		O	O	Υ-
co	co	CM	aj	Ó	in		CD	CM	ΙΟ
CM	CM	O	CM		T-	O	CM	O

in	LO	o	in	Γ-	o		00
CD	(D	o	o	ΙΟ	CO	LO	CD	b	b
q	q	to	CD	q	xt	T“	b	Ό·	CO
T~	T”	cn	b“	co“	cd“	LO“	b“	co“	in“
		CD	CO		CO	CO	CO	CO	co

ω	(Λ
c	C	Φ
0)	Φ	4—«
’o.	q.	« g
(Q	(Q	Έ cn
W	CO	CL o
o	o	o S
E o	E o	« CO 2 ®
X	I	Q E

CD CN

	E Ό a:	m o 0	CL ω xz .Ω C
f CO	xz o '>» c	ca E	4 o x	C
0	cO	’Ň	o
cn 1	Ό	TJ	<	’C Q.
CO	Φ	m	φ cn
o	o	E	c	P 3 — Φ
O Z x	CL (0 3 Φ	in CO LO m	o •AC CM	fe &

3 £ O >» E o	M E co ° θ Z °· 5 §	c Q. '3 b
o	Y—
c	S®	CM
	O
3	i l—	CO
Ό	T- 5	CC
-JÉ	0- -	TJ E
3 •o	cl	CD
O	c *	N	CM
□L Φ	O =5 ·* O	O JJC	CD O
C	in >	oj“
>»	r		E
c o o	E > Ό O N <	E Ό N	N o

>	ca w	o c
O	o	Φ
-Je Φ	E	ž
(0	o	Φ
'3	X	cn

b CO o	xŕ CM b	'’T CO CO o	CM CO CD O	CM CD CO CO CM	CD xt	O CD CD OJ O	CD b O Xf o	OJ CO XT o 1-	£ O O
3	CD CD	o o	CO CO	O _J	OJ b	O O	o O	Zj	O UJ
<	N	<	<	<	X	<	<	<	<
		o				o
in	O	CM		O	O	CM	CM	CO	CO
CD	LO	b		CO	b	CO	CM	CD	b
Γ-	LO		CM	00	CM	Xf	CO
ΟΟ	CD	m	Y“	CD	CD	o	Y“	CO
4-	CO			Y-	CO	CM	’fr	CM

		4	CM			o
CD 0 cn	in m in	CD E o	CD CO O CO	cn	O	CD CO cn o	CD b O	CO CM OJ	CO o
ľD	CD	o	CO	LL	z	o	o	o	Q
ω	Z)	o	<	CO	_J	O	o	<	o
x	ω	<		o	_l	<	O	n_	LU
	ľC	cô	CD CM	ω	ω	in	<	ω	<
0	čô	0	J—		V“	0	čo	ČM	Č\j
H	CC	J—	ω	<	<	1-	X	-1	<
I,	n.,	I,	UJ I	m I	m I	X |	D-	CL I	CD I
1 CD	1 m	m	1 m	1 ffi	cn	m	1 m	CD	1 m
0	C	0	0	0	0	0	0	0	0

Y—	CO	CO
	CO	CO
T—	o	CM
*·“	1-
CD	in
Y”		CM
CM	CM	CM
CO	CO	CO
O	O	O
O	ω	cn
č	2	2

127

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava celkovej genómovej DNA Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Kultúra Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) sa pestovala cez noc pri 30 °C za intenzívneho pretrepávania v BHI médiu (Difco). Bunky sa zbierali centrifugáciou, supernatant sa odhodil a bunky sa resuspendovali v 5 ml tlmivého roztoku-l (5% pôvodného objemu kultúry - všetky vyznačené objemy boli kalkulované na 100 ml objem kultúry). Zloženie tlmivého roztoku-l: 140,34 g/l sacharózy, 2,46 g/l MgSO₄ x 7 H₂O, 10 ml/l KH₂PO₄ roztoku (100 g/l, pH upravené s KOH na 6,7), 50 ml/l M12 koncentrátu (10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l NaCI, 2 g/l MgSO₄ x 7 H₂O, 0,2 g/l CaCI₂, 0,5 g/l kvasinkového extraktu (Difco), 10 ml/l zmesi stopových prvkov (200 mg/l FeSO₄ x H₂O, 10 mg/l ZnSO₄x 7 H₂O, 3 mg/l MnCI₂ x 4 H₂O, 30 mg/ H3BO3, 20 mg/l CoCI₂ x 6 H₂O, 1 mg/l NiCI₂ x 6 H₂O, 3 mg/l Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 500 mg/l komplexotvorného činidla (EDTA alebo kyseliny citrónovej), 100 ml/l zmesi vitamínov (0,2 mg/l biotínu, 0,2 mg/l kyseliny listovej, 20 mg/l kyseliny p -aminobenzoovej, 20 mg/l riboflavínu, 40 mg/l pantotenátu vápenatého, 140 mg/l kyseliny nikotínovej, 40 mg/l pyridoxín hydrochloridu, 200 mg/l myoinozitolu). Lyzozým sa pridal k suspenzii na konečnú koncentráciu 2,5 mg/ml. Po asi 4 h inkubácii pri 37 °C sa bunková stena rozložila a výsledné protoplasty sa zbierali centrifugáciou. Sediment sa raz premyl s 5 ml tlmivého roztoku-l a raz s 5 ml TE-tlmivého roztoku (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8). Sediment sa resuspendoval v 4 ml TE-tlmivého roztoku a pridalo sa 0,5 ml roztoku SDS (10%) a 0,5 ml roztoku NaCI (5 M). Po pridaní proteinázy K na konečnú koncentráciu 200 pg/ml sa suspenzia inkubovala cca 18 hodín pri 37 °C. DNA sa purifikovala extrakciou s fenolom, fenolom-chloroformom-izôamylakoholom a chloroformom-izoamylalkoholom podľa štandardných metód. Potom sa DNA vyzrážala pridaním 1/50 objemu 3 M octanu sodného a 2 objemov etanolu s následnou 30 minútovou inkubáciou pri -20 °C a 30 minútovou centrifugáciou pri 12 000 otáčkach za minútu (rpm) vo vysokorýchlostnej centrifúge s použitím SS34 rotora (Sorvall). DNA sa rozpustila v 1 ml TE-tlmivého roztoku obsahujúceho 20 pg/ml RNázy A a dialyzovala pri 4 °C proti 1000 ml TE-tlmivého roztoku najmenej 3 hodiny. Počas tohto času sa tlmivý roztok trikrát vymenil. K 0,4 ml alikvotným podielom dialyzovaného roztoku DNA sa pridalo 0,4 ml 2 M LiCI

128 a 0,8 ml etanolu. Po 30 minútovej inkubácii pri -20 °C sa DNA získala cenrifugáciou (13 000 otáčok za minútu (rpm), Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau,

Nemecko). DNA sediment sa rozpustil v TE-tlmivom roztoku. DNA pripravená týmto postupom sa môže použiť na všetky účely, vrátane metódy južných odtlačkov (southern blotting) alebo konštrukcie genómových knižníc

Príklad 2

Konštrukcia genómových knižníc Corynebacteríum glutamicum ATCC13032 v Escherichia coli

DNA pripravená podľa opisu v príklade 1 sa použila na konštruovanie kozmidových a plazmidových knižníc podľa známych a dobre zavedených metód (pozri napr. Sambrook, J. a kol. (1989) „Molecular Cloning: A Laboratory Manuaľ, Cold Spring Harbor Laboratory Press, alebo Ausubel, F. M. a kol. (1994) „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley & Sons.).

Použiť sa môže akýkoľvek plazmid alebo kozmid. Predovšetkým sa použili plazmidy pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl. Sci. USA, 75, 3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134. 1141-1156), plazmidy sérií pBS (pBSSK+, pBSSK- a ďalšie; Stratagene, LaJolla, USA), alebo kozmidy ako SuperCos 1 (Stratagene, LaJolla, USA) alebo Loriste (Gibson, T.J., Rosenthal, A. and Waterson, R.H. (1987) Gene 53, 283-286. Génové knižnice špecifické na použitie v C. glutamicum môžu byť konštruované použitím plazmidu pSL109 (Lee, H.S. and A.J. Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4, 256-263).

Príklad 3

Sekvenovanie DNA a komputerová funkčná analýza

Na sekvenovanie DNA podľa štandardných metód sa použili genómové knižnice, opísané v príklade 2, predovšetkým sa použila metóda reťazovej terminácie použitím ABI377 sekvenačných prístrojov (pozri napr. Fleischman, R.D. a kol. (1995) „Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd.“, Science, 269, 496-512). Použili sa sekvenačné priméry s nasledovnými nukleotidovými sekvenciami: 5'-GGAAACAGTATGACCATG-3', SEQ ID NO:783 alebo 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3', SEQ ID NO:784.

129

Príklad 4

In vivo mutagenéza

In vivo mutagenéza Corynebacterium glutamicum sa môže uskutočniť pasážovaním plazmidu (alebo iného vektora) DNA do E. coli alebo iných mikroorganizmov (napr. do druhov Bacillus alebo kvasiniek ako napríklad Saccharomyces cerevisiae), čím sa zhorší ich schopnosť udržať si integritu svojej genetickej informácie. Typické mutátorové kmene majú mutácie v génoch reparačného systému DNA (napr. mutHLS, mutD, mutT, atd’.; na porovnanie pozri Rupp, W.D.(1996) DNA repair mechanisms in: Escherichia coli and Salmonella, str. 2277-2294, ASM, Washington.) Takéto kmene sú dobre známe odborníkom, ktorí sú skúsení v danej oblasti techniky. Použitie takýchto kmeňov je uvedené napríklad v Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7, 32-34.

Príklad 5

Transfer DNA medzi Escherichia coli a Corynebacterium glutamicum

Niektoré druhy Corynebacterium a Brevibacterium obsahujú endogénne plazmidy (ako napr. pHM1519 alebo pBL1), ktoré sa autonómne replikujú (pozri prehľad, napr. Martin, J.F. a kol. (1987) Biotechnology, 5, 137-146). „Shuttle“ vektory pre Escherichia coli a Corynebacterium glutamicum sa môžu ľahko konštruovať použitím štandardných vektorov pre E. coli (Sambrook, J. a kol. (1989), „Molecular Cloning: A Laboratory Manuaľ, Cold Spring Harbor Laboratory Press alebo Ausubel, F.M. a kol., (1994) „ Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley & Sons), ku ktorým sa pridal pôvodný alebo na tento účel replikovaný a vhodný markér z Corynebacterium glutamicum . Takéto zdroje replikácie sa výhodne zvolia z endogénnych plazmidov izolovaných z Corynebacterium alebo Brevibacterium druhov. Predovšetkým výhodné pre tieto druhy je použitie génov zodpovedných za rezistenciu na kanamycín (napríklad takých, ktoré sú odvodené z Tn5 alebo Tn903 transpozónov) alebo na chloramfenikol (Winnacker, E.L. (1987) „From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim) ako transformačných markérov. V literatúre existuje mnoho príkladov na konštrukciu „divého“ typu „shuttle“ vektorov, ktoré sa replikujú aj v E. coli aj v C. glutamicum, a ktoré sa môžu použiť na niekoľko účelov, vrátane nadmernej expresie génu (pozri odkaz napr.

130

Yoshihama, M. a kol. (1985) J. Bacteriol. 162, 591-597, Martin J.F. a kol. (1987)

Biotechnology, 5, 137-146 a Eikmanns, B.J. a kol. (1991) Gene, 102, 93-98).

Použitím štandardných metód je možné klonovať gén, ktorý je predmetom záujmu, do jedného zo „shuttle“ vektorov opísaných vyššie a zaviesť takéto hybridné vektory do kmeňov Corynebacterium glutamicum . Transformácia C. glutamicum sa môže dosiahnuť pomocou protoplastovej transformácie (Kastsumata, R. a kol.(1984) J. Bacteriol. 159, 306-311), elektroporácie (Liebl, E. a kol. (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53,399-303) a v prípadoch, keď sa použijú špeciálne vektory, tiež pomocou konjugácie (ako sa to opisuje napr. vSchäfer, A. a kol. (1990) J. Bacteriol. 172. 1663-1666). Tak isto je možný transfer „shuttle“ vektorov pre C. glutamicum do E. coli pomocou preparácie plazmidovej DNA z C glutamicum (použitím štandardných metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky) a jej transformovaním do E. coli. Takýto transformačný krok sa môže uskutočniť použitím štandardných metód, ale výhodné je použiť Mcr-deficitný kmeň E. coli, ako napríklad NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166,1-19).

Gény sa môžu nadmerne exprimovať v kmeňoch C. glutamicum použitím plazmidov, ktoré obsahujú pCG1 (americký patentový spis č. US 4,617,267) alebo ich fragmentov a voliteľne gén rezistencie na kanamycín zTN903 (Grindley, N.D. a Joyce, C.M. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(12), 7176-7180). Okrem toho sa gény môžu nadmerne exprimovať v kmeňoch C. glutamicum použitím plazmidu pSL 109 (Lee, H.-S. and A.J. Sinskey (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4, 256-263).

Okrem použitia replikačných plazmidov sa nadmerné exprimovanie génu môže tiež dosiahnuť pomocou integrácie do genómu. Genómová integrácia v C. glutamicum alebo iných Corynebacterium alebo Brevibacterium druhoch sa môže uskutočniť pomocou takých metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky, ako je homológna rekombinácia s genómovou(ými) oblasťou(ami), integrácia usmernená reštrikčnou endonukleázou (REMI) (pozri napr. nemecký patentový spis DE 19823834), alebo prostredníctvom použitia transpozónov. Tak isto je možné modulovať aktivitu génu, ktorý je predmetom záujmu, pomocou modifikovania regulačných oblastí (napr. promótora, represora a/alebo zosilňovača) pomocou sekvenčnej modifikácie, inzercie alebo delécie, využijúc miestne cielené metódy (ako je homológna rekombinácia) alebo metódy založené na náhodných prípadoch (ako transpozónová mutagenéza alebo REMI). Sekvencie nukleových kyselín, ktoré

131 majú funkciu transkripčných terminátorov, sa tiež môžu vložiť 3' ku kódovacej oblasti jedného alebo viacerých génov podľa tohto vynálezu; takéto terminátory sú dobre známe v danej oblasti techniky a sú opísané napríklad voWinnacker, E.L.

(1987) From Genes to Clones- Introduction to Gene Technology. VCH, Weinheim.

Príklad 6

Stanovenie expresie mutantných proteínov.

Pozorovania aktivity mutovaných proteínov v transformovanej hostiteľskej bunke sa opierajú o fakt, že mutantný proteín sa exprimuje podobným spôsobom a v porovnateľnom množstve ako „divý“ typ proteínu. Na určenie úrovne transkripcie mutantného génu existuje vhodná metóda (indikátor množstva mRNA dostupnej na transláciu na génový produkt), a to metóda severných odtlačkov (Northern blot) (pozri odkaz napríklad Ausubel a kol.(1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York), pri ktorej sa primér určený na naviazanie ku génu, ktorý je predmetom záujmu, označí s detegovateľnou značkou, (obyčajne rádioaktívnou alebo chemoluminiscenčnou) tak, že keď sa celková RNA kultúry organizmu vyextrahuje, spracuje na géli, transferuje sa na stabilnú matricu a inkubuje s touto sondou, naviazanie a množstvo naviazanej sondy indikuje prítomnosť a tiež množstvo mRNA pre tento gén. Táto informácia je dôkazom stupňa transkripcie mutantného génu. Celková bunková RNA sa môže pripraviť z Corynebacteríum. glutamicum pomocou niekoľkých metód, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky, ako je opísané v: Bormann, E.R. a kol. (1992) Mol. Microbiol. 6, 317-326.

Na stanovenie prítomnosti alebo relatívneho množstva proteínu translatovaného z tejto mRNA sa môžu použiť štandardné metódy, také ako metóda západných odtlačkov (Western blot), (pozri napríklad Ausubel, a kol. (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York). Pri tomto procese sa celkový bunkový proteín extrahuje, gólovou elektroforézou sa separuje, prenesie sa na matricu, ako je nitrocelulózová matrica, a inkubuje sa so sondou, ako napríklad protilátkou, ktorá sa špecificky viaže na požadovaný proteín. Táto sonda je obvykle označená s chemoluminiscenčnou alebo kolorimetrickou značkou, ktorá sa dá ľahko detegovať. Prítomnosť a množstvo pozorovanej značky poukazuje na prítomnosť a množstvo požadovaného mutantného proteínu prítomného v bunke.

Príklad 7

132

Rast geneticky modifikovanej Corynebacterium. glutamicum - médiá a podmienky kultivácie

Geneticky modifikované Corynebacteria sa pestujú na syntetickom alebo prírodnom rastovom médiu. Celý rad rôznych rastových médií pre Corynebacteria sú aj dobre známe, aj ľahko dostupné (Lieb, a kol., (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 205-210; von der Osteň, a kol., (1998) Biotechnology Letters, H, 11-16; nemecký patentový spis DE 4,120,867; Liebl (1992) „The Genus Corynebacterium, v The Procaryotes, Volume II, Balows, A. a kol., eds. SpringerVerlag). Tieto médiá sa skladajú z jedného alebo viacerých zdrojov uhlíka, zdrojov dusíka, anorganických solí, vitamínov a stopových prvkov. Výhodnými zdrojmi uhlíka sú sacharidy ako mono-, di-, alebo polysacharidy. Napríklad, glukóza, fruktóza, manóza, galaktóza, ribóza, sorbóza, ribulóza, laktóza, maltóza, sacharóza, rafinóza, škrob alebo celulóza sú veľmi dobrými zdrojmi uhlíka. Tak isto je možné dodávať sacharid do média prostredníctvom komplexných zlúčenín, ako je melasa alebo vedľajšie produkty pri rafinácii cukru. Tak isto sa môžu výhodne dodávať zmesi rôznych zdrojov uhlíka. Ďalšími možnými zdrojmi uhlíka sú alkoholy a organické kyseliny ako metanol, etanol, kyselina octová alebo kyselina mliečna. Zdrojmi dusíka sú obyčajne organické a anorganické zlúčeniny dusíka alebo materiály, ktoré obsahujú tieto zlúčeniny. Príkladnými zdrojmi dusíka sú plynný amoniak alebo amónne soli ako NH₄CI alebo (NH₄)₂SO_4] NH₄OH, dusičnany, močovina, aminokyseliny alebo komplexné dusíkové zdroje ako macerovaný kukuričný mok, sójová múčka, sójový proteín, kvasinkový extrakt, mäsový extrakt a iné.

Zlúčeniny anorganických solí, ktoré sa môžu zahrnúť do médií sú soli vápnika, horčíka, sodíka, kobaltu, molybdénu, draslíka, mangánu, zinku, medi a železa vo forme chloridov, fosforečnanov alebo síranov. Aby sa udržali ióny kovov v roztoku, môžu sa pridať do média chelátotvorné zlúčeniny. Predovšetkým užitočnými chelátotvornými zlúčeninami sú dihydroxyfenoly, ako katechol alebo protokatechinát alebo organické kyseliny, ako napríklad kyselina citrónová. Médiá zvyčajne obsahujú aj ďalšie rastové faktory, ako vitamíny alebo rastové promótory, napríklad ako biotín, riboflavín, tiamín, kyselinu listovú, kyselinu nikotínovú, pantotenát a pyridoxín. Rastové faktory a soli často pochádzajú z komplexných zložiek média ako kvasinkového extraktu, melasy, macerovaného kukuričného

133 moku a ďalších. Presné zloženie médií veľmi závisí od bezprostredného pokusu a rieši sa individuálne pre každý špecifický prípad. Informácie o optimalizácii médií sú dostupné v príručke „Applied Microbiol. Physiology, A practical Approach (eds. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) str. 53-73, ISBN 019 963577 3). Tiež Je možné, aby sa zvolilo rastové médium od komerčných dodávateľov, ako štandard 1 (Merck) alebo BHI („grain heart infusion“, DIFCO) alebo ďalšie. ¹

Všetky zložky média sa sterilizujú, buď tepelne (20 minút pri 1,5 bar a 121 °C) alebo sterilnou filtráciou. Zložky sa môžu sterilizovať spolu, alebo ak je to nutné, tak oddelene. Všetky zložky médií môžu byť prítomné na začiatku rastu, alebo sa môžu voliteľne pridávať kontinuálne alebo po dávkach.

Podmienky kultivácie sú určené pre každý pokus osobitne. Teplota by mala byť v rozsahu od 15 °C do 45 °C. Teplota sa môže udržiavať konštantná, alebo sa môže v priebehu pokusu meniť. Hodnota pH média by mala byť v rozpätí ód 5 do 8,5, výhodne okolo 7,0 a dá sa udržiavať pomocou prídavku tlmivých roztokov k médiám. Príkladným tlmivým roztokom na tento účel je tlmivý roztok fosforečnanu draselného. Alternatívne alebo súbežne sa môžu používať syntetické tlmivé roztoky ako MOPS, HEPES, ACES a iné. Konštantné pH sa pri kultivácii môže tiež udržať pridaním NaOH alebo NH₄OH počas rastu. Ak sa použijú komplexné zložky do média, ako kvasinkový extrakt, nutnosť používať dodatočné tlmivé roztoky sa môže znížiť v dôsledku toho, že mnohé komplexné zlúčeniny majú vysokú tlmivú kapacitu. Ak sa na kultiváciu mikroorganizmov používa fermentor, tak pH sa dá tiež regulovať použitím plynného amoniaku.

Inkubačný čas je obvykle v rozpätí od niekoľkých hodín až do niekoľkých dní. Tento čas sa zvolí tak, aby sa umožnilo maximálne nazhromaždenie produktu v živnom kvapalnom médiu. Opísané rastové pokusy sa môžu uskutočňovať v rôznych nádobách, napríklad mikrotitračných platniach, sklenených skúmavkách alebo sklenených bankách alebo sklenených alebo kovových fermentoroch rôznych veľkostí. Na skríning veľkého množstva klonov by sa mali mikroorganizmy pestovať na mikrotitračných platniach, v sklenených skúmavkách alebo trepacích bankách, buď s alebo bez miešacích zarážok. Výhodne sa používajú 100 ml trepacie banky naplnené na 10% (objemových) s požadovaným rastovým médiom. Banky by sa mali trepať na rotačnej trepačke (rozkmit 25 mm) pri rýchlostnom rozsahu 100 300 otáčok za minútu. Straty odparovaním sa môžu znížiť pomocou udržiavania

134 vlhkého ovzdušia; alternatívne by sa mala uskutočniť matematická korekcia strát odparovaním.

Ak sa testujú geneticky modifikované klony, mal by sa tiež testovať nemodifikovaný kontrolný kloň alebo kontrolný kloň obsahujúci základný plazmid bez akejkoľvek inzercie. Médium sa inokuluje na 0,5 - 1,5 OD₆oo použitím buniek kultivovaných na agarových platniach ako napríklad CM platniach (10 g/l glukóza, 2,5 g/l NaCI, 2 g/l močovina, 10 g/l polypeptón, 5 g/l kvasinkový extrakt, 5 g/l mäsový extrakt, 22 g/l agar, pH 6,8 s 2 M NaOH), potom sa inkubuje pri 30 °C . Inokulácia média sa dosiahne buď tým, že sa zavedie suspenzia buniek C. glutamicum z CM platní vo fyziologickom roztoku alebo prídavkom tejto kvapalnej predkultivovanej baktérie.

Príklad 8

In vitro analýza funkcie mutantných proteínov

Stanovenie aktivít a kinetických parametrov enzýmov je v danej oblasti techniky dobre zavedené. Pokusy stanoviť aktivitu akéhokoľvek zmeneného enzýmu sa musia prispôsobiť špecifickej aktivite „divého“ typu enzýmu, čo je v schopnostiach odborníka skúseného v odbore. Všeobecný prehľad o enzýmoch, ako aj špecifické detaily týkajúce sa štruktúry, kinetík, princípov, metód, aplikácií a príklady na stanovenie mnohých enzýmových aktivít sa dajú nájsť napríklad v nasledovných odkazoch: Dixon, M., and Webb, E.C., (1979) Enzymes, Longmans, London; Fersht, (1985) Enzýme Structure and Mechanism. Freeman, New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press, Oxford; Boyer, P. D., ed. (1983) The Enzymes, 3^rd ed. Academic Press, New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2^rded. VCH, Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Grapi, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3^rd ed., vol. I -XII, Verlag Chemie, Weinheim; a Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, „Enzymes“. VCH, Weinheim, str. 352-363.

Aktivita proteínov, ktoré sa viažu na DNA sa môže merať pomocou niekoľkých dobre zavedených metód, ako DNA skúškami pásového posunu (tiež nazývanými gélové retardačné skúšky). Vplyv takýchto proteínov na expresiu ďalších molekúl sa môže merať pomocou skúšok s reportérovým génom (tak ako to opisuje Kolmar, H. a kol. (1995) EMBO J. 14, 3895-3904 a odkazy tam citované). Testovacie systémy

135 reportérového génu sú dobre známe a zavedené na aplikovanie tak v prokaryotických, ako aj eukaryotických bunkách, použitím takých enzýmov ako beta-galaktozidázy, zeleného fluorescenčného proteínu a niekoľkých ďalších.

Stanovenie aktivity membránovo-transportných proteínov možno uskutočniť podľa takých metodík, aké sa opisujú vGennis, R.B. (1989) „ Pores, Channels and Transporters“, v Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer, Heidelberg, str. 85-137,199-234 a 270-322.

Príklad 9

Analýza vplyvu mutantného proteínu na produkciu požadovaného produktu

Vplyv genetickej modifikácie v C. glutamicum na produkciu požadovanej zlúčeniny (ako napríklad aminokyseliny) sa môže stanoviť kultiváciou modifikovaného mikroorganizmu vo vhodných podmienkach (opísaných vyššie) a analyzovaním média a/alebo bunkovej zložky na zvýšenú produkciu požadovaného produktu (t.j. aminokyseliny). Takéto analytické metódy sú dobre známe odborníkom, ktorí pracujú v danej oblasti techniky a zahŕňajú spektroskopiu, tenkovrstvovú chromatografiu, vyfarbovacie metódy rôzneho druhu, enzýmové a mikrobiologické metódy a analytickú chromatografiu, ako napríklad vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu (pozri napríklad: Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, str. 89-90 a str. 443-613, VCH, Weinheim (1985); Fallon, A. a kol.,(1987) „Applicátions of HPLC in Biochemistry“ v Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm a kol., (1993) Biotechnology, vol. 3, Chapter III: „Product recovery and purification“, str. 469-714, VCH, Weinheim; Belter, P.A. a kol. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery process for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D. (1988) Biochemical separations, v Ulmann 's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Chapter 11, str. 1-27, VCH, Weinheim; and Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Okrem merania konečného produktu fermentácie je tiež možné analyzovať ďalšie zložky metabolických dráh, ktoré sa využívajú na produkciu požadovanej zlúčeniny, ako napríklad medziprodukty a vedľajšie produkty, aby sa stanovila

136 celková účinnosť produkcie zlúčeniny. Analytické metódy zahrňujú merania hladiny živín v médiu (napr. sacharidov, uhľovodíkov, zdrojov dusíka, fosfátu a iných iónov), merania zloženia a rastu biomasy, analýzu produkcie bežných metabolitov biosyntetických dráh a meranie plynov produkovaných počas fermentácie. Štandardné metódy pre tieto merania sú načrtnuté v Applied Microbial Physiology, APractical Approach, P.M. Rhodés and P.F. Stanbury, eds., IRL Press, str. 103129; 131-163; a 165-192 (ISBN 0199635773) a odkazoch tam citovaných.

Príklad 10

Purifikácia požadovaného produktu z kultúry C. glutamicum

Získanie požadovaného produktu z buniek C. glutamicum alebo supernatantu vyššie opísanej kultúry sa môže uskutočniť rôznymi metódami, ktoré sú dobre známe v danej oblasti techniky. Ak požadovaný produkt nie je vylučovaný z buniek, bunky sa môžu zbierať z kultivácie pomocou centrifugácie pri nízkych otáčkach, potom sa bunky lyžujú štandardnými metódami, ako napríklad mechanickým zásahom alebo sonifikáciou. Bunkový debris sa odstráni centrifugáciou a supernatantná frakcia obsahujúca rozpustné proteíny sa nechá na ďalšiu purifikáciu požadovanej zlúčeniny. Ak je produkt vylučovaný z buniek C. glutamicum, potom sa bunky odstránia z kultúry pomocou centrifugácie pri nízkych otáčkach a supernatantná frakcia sa nechá na ďalšiu purifikáciu.

Supernatantná frakcia z oboch purifikačných metód sa podrobí chromatografii s vhodnou živicou, pri ktorej je požadovaná molekula buď zadržaná na chromatografickej živici, zatiaľ čo mnohé nečistoty nie; alebo pomocou živice sa zadržia nečistoty a nie vzorka. Takéto chromatografické kroky sa môžu opakovať, ak je potrebné, použitím rovnakej alebo rôznych chromatografických živíc. Odborník v danej oblasti techniky by mal byť veľmi skúsený vo výbere vhodných chromatografických živíc, v ich najúčinnejšej aplikácii na príslušnú molekulu, ktorá sa má purifikovať. Purifikovaný produkt sa môže zahustiť pomocou filtrácie alebo ultrafiltrácie a uchovávať pri teplote, pri ktorej stabilita produktu je maximálna.

V danej oblasti techniky je známych veľa purifikačných metód a predchádzajúca metóda purifikácie nie je limitujúcou. Takéto purifikačné metódy sú opísané napr. v Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-HilI, New York (1986)..

137

Identita a čistota izolovaných zlúčenín sa môže stanoviť štandardnými metódami v danej oblasti techniky. Tieto zahŕňajú vysokúčinnú kvapalinovú chromatograf i u (HPLC), spektroskopické metódy, vyfarbovacie metódy, tenkovrstvovú chromatografiu, NIRS, enzýmovú alebo mikrobiologickú skúšku. Takéto metódy analýzy sú zhrnuté v: Patek, a kol. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60, 133-140;

t

Malakhova a kol. (1996) Biotekhnologiya H, 27-32; av Schmidt a kol., (1998) Bioprocess Engineer. 19, 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH, Weinheim, str. 89-90, str. 521-540, str. 540-547, str. 559-566, 575-581 a str. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways, An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. a kol., ,(1987) Applications of HPLC in Biochemistry in Biochemistry in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol.17.

Príklad 11

Analýza génových sekvencií podľa vynálezu

Porovnanie sekvencií a určenie percenta homológie medzi dvoma sekvenciami sú v danej oblasti techniky známe metódy a môžu sa uskutočniť použitím matematického algoritmu, ako napríklad algoritmu podľa Karlina aAltschula (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-68, modifikovaného podľa Karlina a Altschula (1993) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 90, 5873-77. Takýto algoritmus je inkorporovaný do NBLAST aXBLAST programov (version 2.0), Altschul, a kol. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-10. BLAST nukleotidové vyhľadávanie sa môže uskutočňovať s NBLAST programom, „score = 100“, „wordlenght = 12“, aby sa získali nukleotidové sekvencie homológne s SMP molekulami nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu. BLAST proteínové vyhľadávanie sa môže uskutočniť sXBLAST programom, „score = 50“, „wordlength = 3“, aby sa získali aminokyselinové sekvencie homológne s SMP proteínovými molekulami podľa tohto vynálezu. Aby sa kvôli porovnaniam získali zoradenia s medzerami, môže sa využiť Gapped BLAST, ako sa to opisuje v Altschul a kol., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17), 3389-3402. Keď sa používajú programy BLAST a Gapped BLAST, odborník skúsený v danej oblasti techniky bude vedieť, ako treba optimalizovať parametre programu (napr. XBLAST a NBLAST) na to, aby sa mohla analyzovať špecifická sekvencia.

138

Ďalším príkladom matematického algoritmu využívaného na porovnanie sekvencií je algoritmus podľa: Meyers and Miller ((1988) Comput. Appl. Biosci. 4, 11-17). Takýto algoritmus je inkorporovaný do ALIGN programu (version 2.0), ktorý je súčasťou GCG sekvenčného zorad’ovacieho súboru programov. Ak sa používa na porovnávanie aminokyselinových sekvencií ALIGN program, môže sa použiť PAM120 „weight residue table“, „gap length penalty 12“ a „ga^ penalty 4“. Dodatkové algoritmy pre sekvenčnú analýzu sú známe v danej oblasti techniky, a zahŕňajú ADVANCE a ADAM opísané v: Torelli a Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10, 3-5; a FASTA opísané v: Pearson and Lipman (1988) P.N.A.S. 85, 24448.

Percento homológie medzi dvoma aminokyselinovými sekvenciami sa môže tiež stanoviť použitím GAP programu v GCG súbore programov (dostupných na http://www.gcg.com.), použitím buď Blosum 62 matice alebo PAM 250 matice a „gap weight 12, 10, 8, 6 alebo 4 a „length weight“ 2, 3 alebo 4. Percento homológie medzi dvoma nukleotidovými sekvenciami sa môže stanoviť použitím GAP programu v GCG súbore programov, pri použití štandardných parametrov „gap weight“ 50 a „lenght weight“ 3.

Porovnávacia analýza génových sekvencií podľa tohto vynálezu s tými, ktoré sú uvedené v Genbank sa uskutočnila pomocou metód, ktoré sú známe v danej oblasti techniky (pozri napr. Bexevanis and Ouellete, eds. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. John Wiley and Sons, New York). Génové sekvencie podľa tohto vynálezu sa porovnali s génmi uvedenými v Genbanke trojkrokovým postupom. V prvom kroku sa uskutočnila BLASTN analýza (napr. lokálna zoraďovacia analýza) pre každú sekvenciu podľa tohto vynálezu voči nukleotidovým sekvenciám uvedeným v Genbanke a najlepších 500 nálezov sa odložilo na ďalšie analýzy. Ďalšie FASTA vyhľadávanie (napr. kombinovaná lokálna a globálna analýza zoradenia, v ktorej sú limitované oblasti sekvencií zoradené) sa uskutočnilo na týchto 500 nálezoch. Každá génová sekvencia podľa tohto vynálezu bola ďalej globálne priradená ku každému z najlepších troch FASTA nálezov, použitím GAP programu v GCG súbore programov (použitím štandardných parametrov). Za účelom získania správnych výsledkov sa dĺžka sekvencie, vyňatá z Genbanky, upravila na dĺžku vyhľadávaných sekvencií pomocou metód dobre známych v danej oblasti techniky. Výsledky tejto

139 analýzy sú uvedené v tabuľke 4. Výsledné údaje vyžadovali signifikantne kratšie komputerové časy v porovnaní s takouto širokou databázovou GAP (globálnou) analýzou, avšak sú identické s tými, ktoré by sa boli získali samostatne vykonanou GAP (globálnou) analýzou na každom géne podľa tohto vynálezu v porovnaní so všetkými odkazmi v Genbanke. Sekvencie podľa tohto vynálezu, pre ktoré sa nezískali žiadne zoradenia mimo „cutoff“ hodnôt sú uvedené v tabuľke 4 tak, že tam chýbajú informácie o zoradení. Odborník skúsený v odbore si bude ďalej vedomý toho, že percento GAP homológie zoradenia, ktoré sa uvádza v tabuľke 4 pod hlavičkou „% homológie (GAP)“ je uvedené v európskom numerickom tvare, v ktorom · , · predstavuje desatinnú čiarku. Napríklad hodnota „40,345“ v tejto kolónke predstavuje „40,345 %“.

Príklad 12

Konštrukcia a funkcia DNA mikromatríc (DNA mikroradov)

Sekvencie podľa tohto vynálezu sa môžu okrem toho použiť na konštrukciu a aplikáciu DNA mikromatríc (zostavenie, metodológia a použitia DNA mikromatríc sú dobre známe v danej oblasti techniky a sú opísané napríklad v Schena, M. a kol., (1995) Science 270, 467-470; Wodicka, L. a kol. (1997) Náture Biotechnology 15, 1359-1367; DeSaizieu, A. a kol., (1998) Náture Biotechnology 16, 45-48; a DeRisi, J.L. a kol. (1997) Science 278. 680-686).

DNA mikromatrice sú pevné alebo flexibilné podklady skladajúce sa z nitrocelulózy, nylonu, skla, silikónu alebo iných materiálov, k povrchu ktorých sa molekuly nukleovej kyseliny môžu pripojiť v určitom usporiadaní. Po vhodnom označkovaní sa môžu ďalšie nukleové kyseliny alebo zmesi nukleových kyselín hybridizovať s imobilizovanými molekulami nukleovej kyseliny a značka sa môže použiť na monitorovanie a meranie individuálnych signálnych intenzít hybridizovaných molekúl v určených oblastiach. Táto metodológia umožňuje súčasne kvantifikovať relatívne alebo absolútne množstvo všetkých alebo zvolených nukleových kyselín v použitej vzorke nukleovej kyseliny alebo zmesi. DNA mikromatrice preto umožňujú analýzu expresie veľkého počtu (až 6800 alebo viac) nukleových kyselín paralelne (pozri napr. Schena, M. (1996) BioEssays 18(5), 427-431).

140

Sekvencie podľa tohto vynálezu sa môžu tiež použiť na konštrukciu oligonukleotidových primárov, ktoré sú schopné amplifikovať definované oblasti jedného alebo viacerých C glutamicum génov pomocou takej nukleovokyselinovej amplifikačnej reakcie akou je polymerázová reťazová reakcia. Výber a konštrukcia 5'- alebo 3'-oligonukleotidových primérov alebo vhodných spojovníkov umožňuje kovalentné pripojenie výsledných PCR produktov k povrchu podporného média, opísaného vyššie (a tiež opísaného napríklad vSchena, M. a kol. (1995) Science 270, 467-470).

Nukleovokyselinové mikromatrice sa môžu tiež konštruovať pomocou oligonukleotidovej syntézy in situ podľa Wodicka, L. a kol. (1997) Náture Biotechnology 15, 1359-1367. Pomocou fotolitografických metód sa presne určené oblasti matrice exponujú na svetle. Ochranné skupiny, ktoré sú fotolabilné, sa týmto spôsobom aktivujú a podliehajú nukleotidovej adícii, zatiaľ čo oblasti, ktoré sú maskované pred svetlom, nepodliehajú žiadnej modifikácii. Nasledujúce cykly ochrany a aktivácie svetlom umožňujú syntézu rôznych oligonukleotidov v definovaných pozíciách. Malé, definované oblasti génov podľa tohto vynálezu sa môžu syntetizovať na mikromatriciach pomocou syntézy oligonuleotidov v pevnej fáze.

Molekuly nukleovej kyseliny podľa tohto vynálezu prítomné vo vzorke alebo zmes nukleotidov sa môžu hybridizovať s DNA mikromatricami. Tieto molekuly nukleovej kyseliny sa môžu značkovať podľa štandardných metód. Stručne, molekuly nukleovej kyseliny (napr. mRNA molekuly alebo DNA molekuly) sa značia pomocou inkorporácie izotopicky alebo fluorescečne značených nukleotidov, napr. počas reverznej transkripcie alebo syntézy DNA. Hybridizácia značených nukleových kyselín s DNA mikromatricami jé opísaná (napr. v Schena, M. a kol., (1995); citované vyššie; Wodicka, L. a kol., (1997), citované vyššie; a DeSaizieu A. a kol. (1998), citované vyššie). Detekcia a kvantifikácia hybridizovanej molekuly je prispôsobená špecificky inkorporovanému značeniu. Rádioaktívne značenia sa môžu detegovať (napríklad podľa Schena, M. a kol., (1995) citované vyššie;) a fluorescenčné značenia sa môžu detegovať napríklad podľa metódy Shalon a kol. (1996) Genome Research 6, 639-645).

Použitie sekvencií podľa tohto vynálezu na DNA mikromatricovú technológiu, ako sa opisuje vyššie, umožňuje porovnávacie analýzy rôznych kmeňov

141

C. glutamicum alebo iných Corynebacteria. Napríklad, výskumy interkmeňových variácií založených na individuálnych transkripčných profiloch a identifikácia génov, ktoré sú dôležité pre špecifické a/alebo požadované vlastnosti kmeňa, ako je patogenita, produktivita a odolnosť voči stresu, sú uľahčené použitím nukleovokyselinových matricových metodík. Nukleovokyselinové matricové technológie je možné použiť tiež na porovnania profilu expresie génov podľa tohto vynálezu v priebehu fermentačnej reakcie.

Príklad 13

Analýza dynamiky bunkových proteínových populácií (proteómov)

Gény, kompozície a spôsoby podľa tohto vynálezu sa môžu aplikovať na výskum interakcií a dynamiky populácií proteínov, nazývaných „proteómy“. Proteínové populácie, ktoré sú predmetom záujmu, obsahujú, ale nie sú obmedzené na, celkovú proteínovú populáciu C. glutamicum (napr. v porovnaní s proteínovými populáciami iných organizmov) a tie proteíny, ktoré sú aktívne v špecifických podmienkach prostredia alebo v špecifických metabolických podmienkach (napr. počas fermentácie, pri vysokej alebo nízkej teplote, alebo pri vysokom alebo nízkom pH) alebo tie proteíny, ktoré sú aktívne počas špecifických fáz rastu a vývoja.

Proteínové populácie sa môžu analyzovať pomocou rôznych dobre známych metód, ako napríklad gélovou elektroforézou. Bunkové proteíny sa môžu získať, napríklad, lýzou alebo extrakciou a môžu sa navzájom separovať použitím rôznych elektroforetických metód. Polyakrylamidová gélová elektroforéza s dodecylsulfátom sodným (SDS-PAGE) separuje proteíny prevažne na základe ich molekulovej hmotnosti. Izoelektricko-fokusačná polyakrylamidová gélová elektroforéza (IEFPAGE) separuje proteíny pomocou ich izoelektrického bodu, (ktorý odráža nielen aminokyselinovú sekvenciu, ale tiež potranslačné modifikácie proteínu). Ďalšou, výhodnejšou metódou proteínovej analýzy je následná kombinácia oboch IEFPAGE a SDS-PAGE metód, známych ako 2-D-gélová elektroforéza (opísaná napríklad v Hermann a kol. (1998) Electrophoresis, 19, 3217-3221; Fountoulakis, a kol. (1998) Electrophoresis, 19,1193-1202; Langen, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1184-1192; Antelmann, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1451-1463). Na proteínovú separáciu sa môžu tiež použiť ďalšie separačné metódy, ako napríklad

142 kapilárna gólová elektroforéza; tieto metódy sú dobre známe v danej oblasti techniky.

Proteíny, ktoré sa separovali pomocou týchto metodík, sa môžu vizualizovať štandardnými metódami, takými ako vyfarbovanie alebo značkovanie. Vhodné vyfarbovacie činidlá sú známe v danej oblasti techniky a zahŕňajú Coomassie Brilliant Blue, striebro alebo fluorescenčné farbivá, ako Sypro Ruby (Molekulové sondy). Zahrnutie rádioaktívne značených aminokyselín alebo ďalších proteínových prekurzorov (napr. ³⁵S-metionínu, ³⁵S-cysteínu, ¹⁴C-značených aminokyselín, ¹⁵Naminokyselín, ¹⁵NO3 alebo ¹⁵NH₄ ⁺ alebo ¹³C-značených aminokyselín) do média C. glutamicum umožňuje označiť proteíny z týchto buniek pred ich separáciou. Podobne sa môžu použiť fluorescenčné značky. Tieto značené proteíny sa môžu extrahovať, izolovať a separovať podľa doteraz opísaných metodík.

Proteíny vizualizované týmito metódami sa môžu v ďalšom analyzovať meraním množstva použitého farbiva alebo značky. Množstvo určitého proteínu sa môže v ďalšom stanoviť kvantitatívne použitím, napríklad, optických metód a môže sa porovnať s množstvom iných proteínov v tom istom géli alebo v iných géloch. Porovnania proteínov na géloch sa môžu urobiť napríklad optickým porovnaním, spektroskopicky, zobrazovacím snímaním a analýzou gélov, alebo použitím fotografických filmov a zobrazení. Takéto metódy sú dobre známe v danej oblasti techniky.

Aby sa stanovila identita ktoréhokoľvek daného proteínu, môže sa použiť priame sekvenovenie alebo iné štandardné metódy. Napríklad sa môže použiť Na/alebo C-koncóvé aminokyselinové sekvenovanie (ako Edmanova degradácia) , ako aj hmotnostná spektrometria (výhodne MALDI alebo ESI metódy (pozri napr. Langen, a kol. (1997) Electrophoresis 18, 1184-1192)). Tú poskytnuté proteínové ’ sekvencie sa môžu použiť na identifikáciu C. glutamicum proteínov pomocou týchto metodík.

Informácie získané týmito metódami sa môžu použiť na porovnanie podôb proteínovej prítomnosti, aktivity alebo modifikácie medzi rôznymi vzorkami z rozličných biologických podmienok (okrem iného napr. rôzne organizmy, časové podmienky fermentácie, stav média alebo rôzne biotopy). Údaje získané z takýchto pokusov, samotných alebo v kombinácii s ďalšími technológiami, sa môžu použiť na také rôzne aplikácie, ako na porovnanie správania sa rôznych organizmov v určitej

143 (napr. metabolickej) situácii, na zvýšenie produktivity kmeňov, ktoré produkujú špeciálne chemikálie alebo na zvýšenie účinnosti produkcie špeciálnych chemikálií.

Ekvivalenty

Odborníci skúsení v danej oblasti techniky zistia alebo budú schopní len pomocou bežnej rutinnej praxe zistiť mnohé ekvivalenty ku špecifickým uskutočneniam podľa vynálezu, opísaným v tomto dokumente. Takéto ekvivalenty uskutočnení spadajú do rozsahu nasledujúcich patentových nárokov.

Claims (38)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny z Corynebacterium glutamicum kódujúca SMP proteín alebo jeho časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiadne F-označené gény uvedené v tabuľke 1.
2. 2. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny podľa nároku 1, kde uvedená molekula nukleovej kyseliny kóduje SMP proteín, ktorý je zapojený do produkcie špeciálnej chemikálie.
3. 3. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny z Corynebacterium glutamicum zvolená zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname alebo jej časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden F-označený gén uvedený v tabuľke 1.
4. 4. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá kóduje polypeptidovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
5. 5. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá kóduje prirodzene sa vyskytujúci alelický variant polypeptidu zvolený zo skupiny aminokyselinových sekvencií zahrňujúcich sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
6. 6. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50 % homológna s nukleotidovou sekvenciou zvolenou zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, alebo jej časť, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
7. 7. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny obsahujúca najmenej 15 nukleotidový fragment nukleovej kyseliny obsahujúci nukleotidovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiaden z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.

   145
8. 8. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, ktorá sa hybridizuje s molekulou nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 v stringentných podmienkach.
9. 9. Molekula izolovanej nukleovej kyseliny, vyznačujúca sa tým, že obsahuje molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 alebo jej časť a nukleotidovú sekvenciu kódujúcu heterológny polypeptid.
10. 10. Vektor, obsahujúci molekulu nukleovej kyseliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9.
11. 11. Vektor podľa nároku 10, ktorý je expresným vektorom.
12. 12. Hostiteľská bunka transfekovaná s expresným vektorom podľa nároku 11.
13. 13. Hostiteľská bunka podľa nároku 12, kde uvedenou bunkou je mikroorganizmus.
14. 14. Hostiteľská bunka podľa nároku 13, kde uvedená bunka patrí do rodu Corynebacterium alebo Brevibacterium.
15. 15. Hostiteľská bunka podľa nároku 12, kde expresiou uvedenej molekuly nukleovej kyseliny sa moduluje produkcia špeciálnej chemikálie z uvedenej bunky.
16. 16. Hostiteľská bunka podľa nároku 15, kde uvedená špeciálna chemikália je zvolená zo skupiny pozostávajúcej z organických kyselín, aminokyselín proteínového a neproteínového pôvodu, purínových a pyrimidínových báz, nukleozidov, nukleotidov, lipidov, nasýtených a nenasýtených mastných kyselín, diolov, sacharidov, aromatických zlúčenín, vitamínov, kofaktorov, polyketidov a enzýmov.
17. 17. Spôsob produkcie polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu hostiteľskej bunky podľa nároku 12, vo vhodnom kultivačnom médiu, pričom sa produkuje polypeptid.
18. 18. Izolovaný SMP polypeptid z Corynebacterium glutamicum, alebo jeho časť.
19. 19. Polypeptid podľa nároku 18, pričom uvedený polypeptid je zapojený do produkcie špeciálnej chemikálie.

    146
20. 20. Izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
21. 21. Izolovaný polypetid obsahujúci prirodzene sa vyskytujúci alelický variant polypeptidu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu zvolenú zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, alebo jeho časť, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
22. 22. Izolovaný polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 21, ktorý ďalej obsahuje heterológne aminokyselinové sekvencie.
23. 23. Izolovaný polypeptid, ktorý je kódovaný molekulou nukleovej kyseliny obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50 % homológna s nukleovou kyselinou zvolenou zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny neobsahuje žiadne F-označené molekuly nukleovej kyseliny uvedené v tabuľke 1.
24. 24. Izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je najmenej na 50 % homológna š aminokyselinovou sekvenciou zvolenou zo skupiny zahrňujúcej sekvencie uvedené s párne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom aminokyselinová sekvencia nie je kódovaná žiadnym z F-označených génov uvedených v tabuľke 1.
25. 25. Spôsob produkcie špeciálnej chemikálie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu bunky obsahujúcej vektor podľa nároku 12, pričom sa produkuje špeciálna chemikália.
26. 26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob ďalej zahrňuje krok získania špeciálnej chemikálie z uvedenej kultúry.
27. 27. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob ďalej zahrňuje krok transfekcie uvedenej bunky s vektorom podľa nároku 11, pričom sa získa bunka obsahujúca uvedený vektor.

    147
28. 28. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená bunka patrí do rodov Corynebacterium alebo Brevibacterium.
29. 29. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená bunka je zvolená zo skupiny pozostávajúcej z Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitrilophilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium healii, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium paraffinolyticum a tých kmeňov, ktoré sú uvedené v tabuľke 3.
30. 30. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že expresiou molekuly nukleovej kyseliny z uvedeného vektora sa moduluje produkcia uvedenej špeciálnej chemikálie.
31. 31. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená špeciálna chemikália je zvolená zo skupiny pozostávajúcej z organických kyselín, aminokyselín proteínového a neproteínového pôvodu, purínových a pyrimidínových báz, nukleozidov, nukleotidov, lipidov, nasýtených a nenasýtených mastných kyselín, diolov, sacharidov, aromatických zlúčenín, vitamínov, kofaktorov, polyketidov a enzýmov.
32. 32. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedenou špeciálnou chemikáliou je aminokyselina.
33. 33. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedená aminokyselina je zvolená zo skupiny zahrňujúcej lyzín, glutámát, glutamín, alanín, aspartát, glycín, serín, treonín, metionín, cysteín, valín, leucín, izoleucín, arginín, prolín, histidín, tyrozín, fenylalanín a tryptofán.
34. 34. Spôsob produkcie špeciálnej chemikálie, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kultiváciu bunky, ktorej genómová DNA sa zmenila inklúziou molekuly nukleovej kyseliny, podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9.
35. 35. Spôsob diagnostikovania prítomnosti alebo aktivity Corynebacterium diphtheriae v subjekte, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje detekciu prítomnosti

    148 jednej alebo viacerých sekvencií z 1 až 782 sekvencií SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname v subjekte, pričom sekvencie nie sú alebo nie sú kódované žiadnou z F-označených sekvencií uvedených v tabuľke 1, čím sa diagnostikuje prítomnosť alebo aktivita Corynebacterium diphtheriae v subjekte.
36. 36. Hostiteľská bunka, obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú zo skupiny molekúl nukleových kyselín, ktoré sú uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny je porušená.
37. 37. Hostiteľská bunka obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú zo skupiny molekúl nukleových kyselín, ktoré sú uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom molekula nukleovej kyseliny obsahuje jednu alebo viac nukleovokyselinových modifikácií sekvencií, ktoré sú uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname.
38. 38. Hostiteľská bunka obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny zvolenú žo skupiny zahrňujúcej molekuly nukleových kyselín uvedené s nepárne očíslovanými SEQ ID NO v Sekvenčnom zázname, pričom regulačná oblasť molekuly nukleovej kyseliny je modifikovaná v porovnaní s regulačnou oblasťou “divého typu molekuly.