EP1354051A1

EP1354051A1 - Neue für das cite-gen kodierende nukleotidsequenzen

Info

Publication number: EP1354051A1
Application number: EP01919248A
Authority: EP
Inventors: Mike Farwick; Klaus Huthmacher; Achim Marx; Brigitte Bathe; Walter Pfefferle
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-01-25
Filing date: 2001-01-25
Publication date: 2003-10-22
Also published as: WO2002059329A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polynukleotid enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe a) Polynukleotid, das mindestens zu 70 % identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält, b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70 % identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2, c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c), und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen zumindest das citE-Gen abgeschwächt vorliegt, und die Verwendung von Polynukleotiden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen enthalten, als Hybridisierungssonden.

Description

Neue für das citE-Gen kodierende Nukleotidsequenzen

Gegenstand der Erfindung sind für das citE-Gen kodierende Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren unter Verwendung von Bakterien, in denen das citE-Gen abgeschwächt wird.

Stand der Technik

L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.

Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser

Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L- Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure- Produktion untersucht.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von Aminosäuren bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L- Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L- Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L- Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist L-Lysin.

Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern auch die Salze wie z.B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.

Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das citE- Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,

b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b) ,

d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a) , b) oder c) ,

wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der Citrat- Lyase E aufweist.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls das oben genannte Polynukleotid, wobei es sich bevorzugt um eine replizierbare DNA handelt, enthaltend:

(i) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No.l, oder

(ii) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb der Degeneriertheit des genetischen Kodes entspricht, oder

(iii) mindestens eine Sequenz, die mit den zu den

Sequenzen (i) oder (ii) komplementären Sequenzen hybridisiert, und gegebenenfalls

(iv) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i) , die die Aktivität des Proteins/Polypeptids nicht verändern.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind schließlich Polynukleotide ausgewählt aus der Gruppe

a) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 1 und 601

b) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 602 und 1423

c) Polynukleotide enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide ausgewählt aus der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 zwischen den Positionen 1424 und 1964

Weitere Gegenstände sind:

ein replizierbares Polynukleotid, insbesondere DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID No .1 dargestellt;

ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt, enthält;

ein Vektor, enthaltend Teile des erfindungsgemäßen Polynukleotids, mindestens aber 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der beanspruchten Sequenz,

und coryneforme Bakterien, in denen das citE-Gen, insbesondere durch eine Insertion oder Deletion, abgeschwächt ist.

Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank eines coryneformen Bakteriums, die das vollständige Gen oder Teile davon enthält, mit einer Sonde, die die Sequenz des erfindungsgemäßen

Polynukleotids gemäß SEQ ID No.l oder ein Fragment davon enthält und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz.

Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung enthalten, sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um Nukleinsäuren beziehungsweise

Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren, die für die Citrat-Lyase E kodieren, oder um solche Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des citE-Gens aufweisen. Sie sind ebenso zum Einbau in sogenannte „arrays" , „micro arrays" oder „DNA chips" geeignet, um die entsprechenden Polynukleotide zu detektieren und zu bestimmen.

Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung enthalten, sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen hergestellt werden kann, die für die Citrat-Lyase E kodieren.

Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide enthalten mindestens 25, 26, 27, 28, 29 oder 30, bevorzugt mindestens 20, 21, 22, 23 oder 24, ganz besonders bevorzugt mindestens 15, 16, 17, 18 oder 19 aufeinanderfolgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40 oder mindestens 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nukleotiden. Gegebenenfalls sind auch

Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden geeignet.

„Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt .

„Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf

Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann.

Die Polynukleotide gemäß Erfindung schließen ein Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder ein daraus hergestelltes Fragment und auch solche ein, die zu wenigstens 70% bis 80%, bevorzugt zu wenigstens 81% bis 85%, besonders bevorzugt zu wenigstens 86% bis 90% und ganz besonders bevorzugt zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch sind mit dem Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder einem daraus hergestellten Fragmentes.

Unter „Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren enthalten.

Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen ein Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität der Citrat-Lyase E und auch solche ein, die zu wenigstens 70% bis 80%, bevorzugt zu wenigstens 81% bis 85%, besonders bevorzugt zu wenigstens 86% bis 90% und ganz besonders bevorzugt zu wenigstens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch sind mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und die genannte Aktivität aufweisen.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L- Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L- Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits Aminosäuren produzieren und in denen die für das citE-Gen kodierenden Nukleotidsequenzen abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert werden.

Der Begriff „Abschwächung" beschreibt in diesem

Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) , sind besonders die bekannten Wildtypstämme

Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020

und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten beziehungsweise Stämme, wie beispielsweise die L- Lysin produzierenden Stämme

Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 Corynebacterium glutamicum DM58-1 Corynebacterium glutamicum DG52-5 Corynebacterium glutamicum DSM5715 und Corynebacterium glutamicum DSM12866. Das neue, für das Enzym Citrat-Lyase E (EC Nr.4.1.3.6) kodierende citE-Gen von C. glutamicum wurde isoliert.

Zur Isolierung des citE-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575) angelegt wurde.

Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992) ) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmides pHC79 (Hohn und Collins, 1980, Gene 11, 291-298) .

Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25, 807-818) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19:259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich besonders solche E. coli-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind wie beispielsweise der Stamm

DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden oder anderen λ-Vektoren klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige für die DNA-Sequenzierung geeignete <-υ CO r ) μ¹

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Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben- Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung.

In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren Bestandteil der Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich ₍ aus SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.

Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255- 260 (1991)). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heisst, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflußt bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996) . Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5x SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50 °C - 68 °C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2x SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5x SSC (The DIG System User 's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim,

Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C - 68°C eingestellt wird. Es ist gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf 0,lx SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1 - 2°C von 50 °C auf 68 °C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% oder mindestens 96% bis 99% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Es ist ebenfalls möglich Polynukleotidfragmente zu isolieren, die eine vollständige Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z.B. DIG Easy Hyb von der Firma Röche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558) .

Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK,

1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).

Es wurde gefunden, daß corynefor e Bakterien nach Abschwächung des citE-Gens in verbesserter Weise Aminosäuren produzieren. co CO to NJ P> P>

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können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen,

Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen („missense mutations" ) oder Nichtsinnmutationen („nonsense utations" ) gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar (bp) in einem Gen führen zu

Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,

Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung („gene disruption" ) und des Gen-Austauschs („gene replacement" ) .

Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pKlδmob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pKlδmobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEMl (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al . (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"- Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'- Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.

Bei der Methode des Genaustausches („gene replacement") wird eine Mutation wie z.B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over" -Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over" -Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Alleis. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915 - 927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten.

In das citE-Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.

Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des citE-Gens eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert .

So kann für die Herstellung von L-Lysin zusätzlich zur

Abschwächung des citE-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335) ,

• das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992) , Journal of Bacteriology 174:6076-6086), • das für die Triosephosphat-Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),

• das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),

• das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661) ,

• das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A- 198 31 609) ,

• das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry

254, 395-403 (1998)),

• das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No.P26512; EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388), • das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222) ,

• das für das Zwal-Protein kodierende Gen zwal (DE: 19959328.0, DSM 13115)

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des citE-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),

• das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (US 09/396,478, DSM 12969), • das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE:1995 1975.7, DSM 13114),

• das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE: 19959327.2, DSM 13113) ,

• das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP-A-0131171) ,

• das für die Homoserin-Kinase kodierende Gen thrB (Peoples, O.W., et al., Molecular Microbiology 2 (1988): 63 - 72) , und

• das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende Gen panD (EP-A-1006192)

abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.

Die Abschwächung der Homoserin-Dehydrogenase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche, wie beispielsweise durch den Austausch von L-Valin gegen L-Alanin, L-Glycin oder L-Leucin an Position 59 des Enzymproteins, durch den Austausch von L-Valin gegen L-Isoleucin, L-Valin oder L- Leucin an Position 104 des Enzymproteins und/oder durch den Austausch von L-Asparagin gegen L-Threonin oder L-Serin an Position 118 des Enzymproteins erreicht werden.

Die Abschwächung der Homoserin-Kinase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche, wie beispielsweise durch den Austausch von L-Alanin gegen L-Valin, L-Glycin oder L- Leucin an Position 133 des Enzymproteins und/oder durch den Austausch von L-Prolin gegen L-Threonin, L-Isoleucin oder L-Serin an Position 138 des Enzymproteins erreicht werden.

Die Abschwächung der Aspartat-Decarboxylase kann unter anderem auch durch Aminosäureaustausche, wie beispielsweise durch die Austausche L-Alanin gegen L-Glycin, L-Valin oder L-Isoleucin an Position 36 des Enzymproteins erreicht werden. o IV) NJ P> o Cπ o Cn σ cπ

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Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.

Eine Reinkultur des Escherichia coli Stammes Top 10/pCR2. lcitEint wurde am 12. Januar 2001 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) als DSM13981 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.

Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien wie LB- oder TY- Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al. entnommen werden. Beispiel 1

Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus C. glutamicum ATCC 13032

Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wird wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168-179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA- Fragmente werden mit shri p alkalischer Phosphatase (Röche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250) dephosphoryliert . Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCosl (Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84:2160-2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCosl Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wird mit dem Restriktionsenzym Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Xbal, Code no. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.

Anschließend wird die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wird mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4- DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no.27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wird anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt.

Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al . 1988, Nucleic Acid Res. 16:1563-1575) werden die Zellen in 10 mM MgS0₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank werden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) + 100 mg/1 Ampicillin ausplattiert werden. Nach Inkubation über Nacht bei 37 °C werden rekombinante Einzelklone selektioniert .

Beispiel 2

Isolierung und Sequenzierung des Gens citE

Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wird mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27- 0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente werden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Röche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgt die Isolierung der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany) .

Die DNA des Sequenziervektors pZero-1 bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01) wird mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product No . 27- 0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 wird wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wird. Dieses Ligationsgemisch wird anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (-Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 87:4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol. Letters, 123:343-7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) mit 50 mg/1 Zeocin ausplattiert.

Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgt mit dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland) . Die Sequenzierung erfolgt nach der Dideoxy- Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74:5463- 5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990,

Nucleic Acids Research, 18:1067). Es wird der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgt in einem "Rotiphorese NF

Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29:1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland) .

Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten werden anschließend unter Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) Version 97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZerol-Derivate werden zu einem zusammenhängenden Contig asse bliert . Die computergestützte Kodierbereichsanalyse wird mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) angefertigt.

Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergibt ein offenes Leseraster von 821 bp, welches als citE-Gen bezeichnet wird. Das citE-Gen kodiert für ein Polypeptid von 273 Aminosäuren. Beispiel 3

Herstellung eines Integrationsvektors für die Integrationsmutagenese des citE-Gens

Aus dem Stamm ATCC 13032 wird nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C. glutamicum bekannten Sequenz des citE-Gens werden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerase Kettenreaktion ausgewählt (siehe auch SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4) :

citE-intl

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Die dargestellten Primer werden von der Firma MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und nach der

Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit der Taq-Polymerase der Firma Boehringer Mannheim (Deutschland, Produktbeschreibung Taq DNA Polymerase, Product No. 1 146 165) die PCR Reaktion durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen die Primer die Amplifikation eines 450 bp großen internen Fragmentes des citE-Gens. Das so amplifizierte Produkt wird in einem 0,8%igen Agarosegel elektrophoretisch geprüft.

Das amplifizierte DNA Fragment wird mit dem TOPO TA Cloning Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9:657-663) ligiert.

Anschließend wird der E. coli Stamm TOP10 mit dem Ligationsansatz (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol.I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) elektroporiert . Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgt durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), der mit 50 mg/1 Kanamycin supplementiert worden ist. Plasmid-DNA wird aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wird pCR2. lcitEint genannt und ist in Figur 1 dargestellt.

Beispiel 4

Integrationsmutagenese des citE-Gens in dem Stamm DSM 5715

Der in Beispiel 3 genannte Vektor pCR2. lcitEint wird nach der Elektroporationsmethode von Tauch et.al.(FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)) in

Corynebacterium glutamicum DSM 5715 elektroporiert. Bei dem Stamm DSM 5715 handelt es sich um einen AEC resistenten Lysin-Produzenten, der in der EP-B-04351342 beschrieben ist. Der Vektor pCR2. lcitEint kann in DSM5715 nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er ins Chromosom von DSM 5715 integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom integriertem pCR2. lcitEint erfolgt durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), der mit 15 mg/1 Kanamycin supplementiert worden ist.

Für den Nachweis der Integration wird das citEint-Fragment nach der Methode "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig- Hybridisierungskit der Firma Boehringer markiert. Chromosomale DNA eines potentiellen Integranten wird nach der Methode von Eikmanns et al . (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994) ) isoliert und jeweils mit den

Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI und Hindlll geschnitten. Die entstehenden Fragmente werden mittels der Agarosegel- Elektrophorese aufgetrennt und mit dem Dig-Hybrisierungskit der Firma Boehringer bei 68 °C hybridisiert. Das in Beispiel 3 genannte Plasmid pCR2. lcitEint hat innerhalb des chromosomalen citE-Gens ins Chromosom von DSM5715 inseriert. Der Stamm wird als DSM5715 : :pCR2. lcitEint bezeichnet.

Beispiel 5

Herstellung von Lysin

Der in Beispiel 4 erhaltene C. glutamicum Stamm DSM5715 : :pCR2. lcitEint wird in einem zur Produktion von Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.

Dazu wird der Stamm zunächst auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar mit Kanamycin (25 mg/1) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wird eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben) . Als Medium für die Vorkultur wird das Vollmedium CgIII verwendet.

Medium Cg III

NaCl 2,5 g/1

Bacto-Pepton 10 g/1

Bacto-Yeast-Extrakt 10 g/1

Glucose (getrennt autoklaviert) 2% (w/v)

Der pH-Wert wird auf pH 7.4 eingestellt Diesem wird Kanamycin (25 mg/1) zugesetzt. Die Vorkultur wird 48 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Von dieser Vorkultur wird eine Hauptkultur angeimpft, so daß die Anfangs-OD (660 nm) der Haupt ultur 0,1 OD beträgt. Für die Hauptkultur wird das Medium MM verwendet

Medium MM

CSL (Corn Steep Liquor) 5 g/1

MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) 20 g/1

Glucose (getrennt autoklaviert) 50g/l

Salze:

(NH₄)₂S0₄) 25 g/1

KH₂P0₄ 0,1 g/1

MgS0₄ * 7 H₂0 1,0 g/1

CaCl₂ * 2 H₂0 10 mg/1

FeS0₄ * 7 H₂0 10 mg/1

MnS0₄ * H₂0 5,0mg/l

Biotin (sterilfiltriert) 0,3 mg/1

Thiamin * HC1 (sterilfiltriert) 0,2 mg/1

Leucin (sterilfiltriert) 0,1 g/1

CaC0₃ 25 g/1

CSL, MOPS und die Salzlösung werden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend werden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das trocken autoklavierte CaC0₃ zugesetzt. Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wird Kanamycin (25 mg/1) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgt bei 33 °C und 80% Luftfeuchtigkeit .

Nach 72 Stunden wird die OD bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wird mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch lonenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.

In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt,

Tabelle 1

29

Folgende Figur ist beigefügt:

Figur 1: Karte des Plasmids pCR2. lcitEint .

Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung.

KmR: Kanamycin Resistenz-Gen

EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI

HindiII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Hindlll

BamHI : Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI

citEint : internes Fragment des citE-Gens

ColEl: Replikationsursprung des Plasmides ColEl

1APESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN

INTERNATIONALES FORMBLATT

Degussa Hüls AG

Kantstr. 2

33790 Halle/Künsebeck

EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7 1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

I KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS

Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezug.2eιchen Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER

Top 10/pCR2 . lcitEint

DSM 13981

II WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG

Mit dem unter I bezeichneten Mikroorganismus wurde

(X ) eine wissenschaftliche Beschreibung

(X ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht (Zutreffendes ankreuzen)

HI EINGANG UND ANNAHME

Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten M kroorganismus an, der bei ihr am 2 001 - 01 - 12 (Datum der Erstlnnterlegung)¹ eingegangen ist

IV EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG

Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist hei dieser Internationalen Hmferlegungsstelle am eingegangen (Datum der Ersthinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eme Hinterlegung gemäß Bndapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung)

V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE

Name DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Untersclιnft(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten

Anschrift Mascheroder Weg lb D- 81₂ Braunschweig <y, £ A- O

Datum 2001 - 01 - 17

Falls Regel 64 Buchstabe d zutrift ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen H nterlegungsstelle erworben worden ist Formblatt DSMZ BP/4 (einzige Seite) 0196 1APESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN

INTERNATIONALES FORMBLATT

Degussa Hüls AG

Kan str. 2

33790 Halle/Künsebeck

LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemäB Regel 102 von der unten angegebenen

INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

I HINTERLEGER II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS

Name Degussa Hüls AG Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE

Kantstr . 2 zugeteilte EINGANGSNUMMER: Anschrift 33790 Halle/Künsebeck DSM 13 981

Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung¹: 2 001 - 0 1 - 12

πi. LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG

Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 20 01 - 01 - 15 ² geprüft worden Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus

(X)¹ lebensfähig

( )' nicht mehr lebensfähig

IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFÄfflGKEITSPRÜFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST*

V INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE

Name. DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten

Anschrift: Mascheroder Weg lb D-₃S124 Braunschweig

Datum. 2001- 01- 17

Angabe des Datums der Ersthinterlegung Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hintsilegung oder Werterleitung.

In den in Regel 10 2 Buchstabe a Ziffer ii und m vorgesehenen Fallen Angabe der letzten Lebensf-higkeitsprtifung.

Zutreffendes ankreuzen

Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfling negativ waren

Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 0196 BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL

RECOGNΓΠON OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS

FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE

ΓNTERNAΉONAL FORM

Degussa Hüls AG

Kantstr. 2

33790 Halle/Künsebeck

RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT issued pursuant to Rule 7.1 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this pagc

I. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM

Identification reference given by the DEPOSITOR: Accession number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITΥ:

Top 10/pCR2 . lcitEint

DSM 13981

II. SCIENΗHC DESCRIPTION AND/OR PROPOSED TAXONO C DESIGNATION

The microorganism identified under I. above was accompanied by:

(X ) a scientific description

( ) a proposed taxonomic designation

(Mark with a cross where applicable).

III. RECEIPT AND ACCEPTANCE

This International Depositary Authorily accepts the microorganism identified under I. above, which was received by it on 20 01 - 0 1 - 12 (Date of the original deposit)'.

IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION

The microorganism identified under I above was received by this International Depositary Authority on (date of original deposit) and a request to convert the original deposit to a deposit under the Budapest Treaty was received by it on (date of receipt of request for conversion)

V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY

Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Signature(s) of person(s) having the power to represent the

MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH International Depositary Authority or of authorized offιcial(s):

Address: Mascheroder Weg lb D-₃81₂ Braunschweig

Date: 2001- 01 -17

¹ Where Rule 6. (d) applies, such date is the date on which the Status of international depositary authority was acquired. Form DSMZ-BP/4 (sole page) 0196 BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL

RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS

FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE

INTERNATIONAL FORM

Degussa Hüls AG

Kantstr. 2

33790 Halle/Künsebeck

VIABILITY STATEMENT issued pursuant to Rule 10.2 by the

INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page

¹ Indicate the date of original deposit or, where a new deposit or a transfer has been made, the most recent relevant date (date of the new deposit or date of the transfer).

² In the cases referred to in Rule 10--(a) (ii) and ( ϊ), refer to the most recent viability test Mark with a cross the applicable box.

⁴ Fill in if the Information has been requested and if the results of the test were negative.

Form DSMZ-BP/9 (sole page) 0196

Claims

Patentansprüche

1. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das citE-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosauresequenz enthält, die zu mindestens

70 % identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2

c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b) , und

d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a) , b) oder c) , wobei

e) das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der Citrat- Lyase E aufweist.

2. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist.

3. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid eine RNA ist.

4. Polynukleotid gemäß Anspruch 2, enthaltend die Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt.

5. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 2, enthaltend

(i) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder (ii) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz

(i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder

(iii) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls

(iv) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) .

6. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die Hybridisierung unter einer Stringenz entsprechend höchstens 2x SSC durchgeführt wird.

7. Polynukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, die für ein Polypeptid kodiert, das die in SEQ ID No. 2 dargestellte Aminosäuresequenz enthält.

8. Coryneforme Bakterien, in denen das citE-Gen abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet wird.

9. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L- Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, d a d u c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man folgende Schritte durchführt: i a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das citE-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen abschwächt, insbesondere ausschaltet;

b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und

c) Isolieren der L-Aminosäure.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.

12. Verfahren gemäß Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man die Expression des (der) Polynukleotides (e) , das (die) für das citE-Gen kodiert (kodieren) abschwächt, insbesondere ausschaltet.

13. Verfahren gemäß Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man die regulatorischen (bzw. katalytischen) Eigenschaften des Polypetids (Enzymprotein) verringert, für das das Polynukleotid citE kodiert.

14. Verfahren gemäß Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

14.1 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA,

14.2 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat- . Dehydrogenase kodierende Gen gap,

14.3 das für die Triosephosphat-Isomerase kodierende Gen tpi,

14.4 das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase kodierende

Gen pgk,

14.5 das für die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodierende Gen zwf,

14.6 das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende Gen pyc,

14.7 das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo,

14.8 das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,

14.9 das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE,

14.10 das für das Zwal-Protein kodierende Gen zwal

verstärkt bzw. überexprimiert .

15. Verfahren gemäß Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe

15.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck,

15.2 das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi,

15.3 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB

15.4 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2

15.5 das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom

15.6 das für die Homoserin-Kinase kodierende Gen thrB, und

15.7 das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende Gen panD

abschwächt, insbesondere die Expression verringert.

16. Coryneforme Bakterien, die einen Vektor enthalten, der Teile des Polynukleotids gemäß Anspruch 1, mindestens aber 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der beanspruchten Sequenz, trägt.

17. Isolierter Mikroorganismus des E.coli Stammes ToplO/pCR2. lcitEint, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig unter der Nummer DSM 13981 gemäß Budapester Vertrag.

18. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.

19. Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die für die Citrat-Lyase E kodieren oder eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des citE-Gens aufweisen, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man das Polynukleotid, enthaltend die Polynukleotidsequenzen gemäß den Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, als Hybridisierungssonden einsetzt.

20. Verfahren gemäß Anspruch 18, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man arrays, icro arrays oder DNA-chips einsetzt.