CN1298854C - 编码蔗糖pts酶ⅱ的dna - Google Patents

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Abstract

一种基因，该基因编码组成棒杆菌蔗糖PTS系统的蛋白质，应用序列盒-连接介导的PCR方法扩增棒杆菌蔗糖酶基因下游的结构域，因此获得一种编码蔗糖PTS酶Ⅱ的DNA，从而提供所述基因，所述蔗糖PTS酶Ⅱ是以下(A)或(B)描述的蛋白质：(A)具有序列表SEQ IDNO：2氨基酸序列的蛋白质；(B)具有序列表SEQ ID NO：2氨基酸序列因为取代、缺失、插入、增加或倒位一个或多个氨基酸而衍生的氨基酸序列并具有结合蔗糖活性的蛋白质。

Description

编码蔗糖PTS酶II的DNA
技术领域
本发明涉及一种编码蔗糖PTS酶II的DNA，PTS酶II是一种与棒杆菌细胞摄入蔗糖有关的蛋白质。
技术背景
细菌可以摄取多种碳源，而且存在各种特定系统用于细菌细胞跨膜运输。而且，大部分细菌可以对环境变化做出反应，以便在限制性条件下存活。它们的细胞备有监测环境的检测器，以便从各种碳源选择其营养物。此类跨膜运输系统和糖类检测器的例子包括PTS(磷酸烯醇丙酮酸/糖类磷酸转移酶系统或者磷酸烯醇丙酮酸-糖运输系统；关于PTS可参考《大肠杆菌和沙门氏菌细胞分子生物学》，第二版，ASM(美国微生物学会)出版社)。
PTS与跨膜运输和各种糖磷酸化(PTS糖)的调节、以及向这些碳源运动和很多代谢途径有关。PTS催化下列反应，其中PEP指磷酸烯醇丙酮酸：
PTS催化一种通过将胞内磷酸烯醇丙酮酸(以下称“PEP”)的磷酸基团转运给一种胞外糖而产生磷酸化糖和丙酮酸的反应。糖的磷酸化与糖的细胞跨膜运输相关，这些过程所需的能量由作为糖酵解途径中间体的PEP提供。
在大肠杆菌(Escherichia Coli和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)中，组成PTS的蛋白质催化以下反应：
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
在与上述反应有关的蛋白质中，EI(酶I)和Hpr(组氨酸蛋白质)是与所有PTS糖的磷酸化有关的胞质可溶蛋白质，被称为PTS普遍蛋白。
另一方面，EII(酶II)是PTS糖特异性的，根据糖的不同由若干个结构域或蛋白组成。例如，甘露糖醇特异性EII是由A、B和C三个结构域构成的膜结合蛋白。葡萄糖特异性EII和蔗糖特异性EII由膜结合蛋白IIB和IIC以及可溶性的IIA蛋白组成。在任一情况下，PEP的磷酸基团都是通过EI、HPr、EIIA和EIIB转运给糖。作为EII的膜内部分，EIIC结构域构成转运通道且认为可能是底物的特定结合位点。
在甘露糖PTS中发现了第三种EII。其A、B结构域二者融合为单个可溶性多肽，而两个膜内蛋白(IIC和IID)与甘露糖的跨膜运输有关。
大肠杆菌和鼠伤寒门氏菌中，已对编码EI(ptsI)的基因进行了克隆和测序(Saffen，E.W.等，J.Biol.Chem.，262，pp.16241-16253，1987；De Reuse，H.和Danchin，A.，J.Bacteriol.，170，pp.3827-3837，1988)。进而还克隆了某些糖特异性的EII基因(Saffen，E.W.等，J.Biol.Chem.，262，pp.16241-16253，1987；Erni，B.和Zanolari，B.，J.Biol.Chem.，261，pp.16398-16403，1986；Nelson，S.O.等，EMBO J.，3，pp.1587-1593，1984)。
已知某些类型的糖通过不需要PEP的非PTS系统摄入细胞。
发明公开
如上所述，已开展关于细胞如何摄取糖的许多研究，但关于工业用棒杆菌PTS的研究还没有取得太多的进展。因此，本发明的目的是提供编码棒杆菌蔗糖PTS组成蛋白的基因。
本申请的发明者分离出了包含编码棒杆菌蔗糖酶(转化酶)的基因的DNA片段并测定了其结构。他们还通过使用包含扩增蔗糖酶基因的棒杆菌建立了一种生产氨基酸或核酸的方法(日本专利公开(Japanese Patent Laid-open Publication(Kokai))第5-244958和8-196280号)。在所述DNA片段中，在约6kb的SmaI片段中存在四个可读框(ORF-F1，ORF-F2，ORF-F3和ORF-F4)。
然而，本发明的发明者在比较了其他蔗糖酶基因的基础上，认为前述ORF-F2不包含全长蔗糖酶基因。亦即根据已知蔗糖酶基因估计，蔗糖酶氨基酸残基数是466-511个(Gunaseakren，P.，J.Bacteriol.，172(12)，pp.6727-35，1990)，而ORF-F2可编码的氨基酸序列包含424个氨基酸残基，相对较短。因此，又克隆了ORF-F2下游的序列并测定了其核苷酸序列。结果揭示包含前述蔗糖酶基因的DNA片段由两个彼此连接的独立克隆片段组成，而且发现一个编码蔗糖PTS酶II的新基因位于蔗糖酶基因的下游。这样完成了本发明。
也就是说，本发明提供以下(A)或(B)定义的蛋白质：
(A)具有序列表SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质；
(B)具有包含取代、缺失、插入、添加或翻转一个或若干个氨基酸的序列表SEQ ID NO：2氨基酸序列并具有结合蔗糖活性的蛋白质。
本发明还提供编码下列(A)或(B)定义的蛋白质的DNA：
(A)具有序列表SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质；
(B)具有其中包含取代、缺失、插入、添加或翻转一个或若干个氨基酸的序列表SEQ ID NO：2氨基酸序列并具有结合蔗糖活性的蛋白质。
上述DNA包括以下(a)或(b)定义的DNA：
(a)包含序列表SEQ ID NO：1的核苷酸3779至5761的核苷酸序列的DNA；
(b)在严格条件下可与包含序列表SEQ ID NO：1核苷酸3779至5761的核苷酸序列的核苷酸序列杂交并编码具有结合蔗糖活性的蛋白质的DNA。
附图简述
图1图示蔗糖PTS酶II基因破坏的质粒的构建过程。
图2图示pBCT4的构建过程。
实施本发明最佳方式
下文将详细阐述本发明。
本发明的DNA通过PCR(聚合酶链式反应)扩增位于乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)染色体DNA蔗糖酶基因下游的区段获得，见下文的实施例。
可以如下扩增与染色体DNA已知区段相邻的区段：将序列盒(cassette)与包含所述区段的DNA片段连接，并用相当于所述已知区段的引物和相当于所述序列盒的引物进行PCR。这时，如果事先将所述序列盒的5’端去磷酸化，就会在染色体DNA片段与所述序列盒5’端的连接位点产生一个缺口。所以，从序列盒引物开始的DNA合成将在此连接位点终止，只有从合成引物开始合成的DNA可以用作模板，以便从序列盒引物开始合成，从而形成互补链。因而可进行特定的扩增(序列盒连接介导的PCR方法(Molecular and Cellular Probes，6，pp.467-475))。可通过商业渠道购得应用此方法的试剂盒(体外克隆试剂盒TAKARA LA PCRTM，Takara Shuzo)，并可用以获得本发明的DNA。
既然本发明的DNA及其相邻区段的核苷酸序列已经知道，则可用根据这些核苷酸序列合成的寡核苷酸作为引物，以及用棒杆菌染色体DNA作为模板，通过PCR对其直接进行扩增。这样的引物实例包括具有SEQ ID NO：10和21核苷酸序列的寡核苷酸。进一步还可以用根据这些核苷酸序列合成的寡核苷酸作为探针通过杂交从染色体DNA文库中分离出本发明的DNA。例如可用Saito等的方法(见Biochim.Biophys.Acta，72，pp.619-629，1963)或者K.S.Kirby的方法(Biochem.J.，64，p.405，1956)获得棒杆菌染色体DNA。
此外，还可以利用本领域技术人员熟知的传统方法来制备染色体DNA、制备染色体DNA文库、进行杂交反应、PCR、制备质粒DNA、消化和连接DNA、转化以及设计用作引物的寡核苷酸等等。这些方法见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.的《分子克隆实验手册》(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)等。
用来克隆本发明DNA以及制备染色体DNA文库等的质粒可以是能在诸如埃希氏菌属(genus Escherichia)细菌的微生物中复制的质粒，其具体实例包括pBR322、pTWV228、pMW119和pUC19等。
包含如上所述获得的本发明DNA的DNA片段核苷酸序列实例见序列表SEQ ID NO：1。包含该序列核苷酸3779至5761的核苷酸序列的区段编码本发明蛋白蔗糖PTS酶II。在SEQ ID NO：1核苷酸序列中，其核苷酸342至1505和核苷酸2338至3609分别相当于包含蔗糖酶基因的DNA片段的ORF-F1和ORF-F2，所述蔗糖酶基因见日本专利公开第8-196280号。进一步比较SEQ ID NO：1核苷酸序列和日本专利公开第8-196280号介绍的核苷酸序列，发现SEQ ID NO：1核苷酸序列中的核苷酸1至3687区段与日本专利公开第8-196280号描述的核苷酸序列相同。因此说明上述包含蔗糖酶基因的DNA片段由两个独立克隆片段组成。
本发明DNA可以是编码以下蔗糖PTS酶II的DNA：所述蔗糖PTS酶II在一个或多个位点存在一个或若干个氨基酸的取代、缺失、插入、增加或倒位，前提是所编码的蔗糖PTS酶II结合蔗糖的活性不降低。本文使用的术语“若干个”表示的数目可以根据蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置和氨基酸残基的种类而不同。这是因为氨基酸中存在高度相似的氨基酸如异亮氨酸和缬氨酸，这些氨基酸之间的差异基本上不影响蛋白质的三维结构。所以，所述蛋白质可以是与组成蔗糖PTS酶II的完整氨基酸序列具有70％至80％或者更高同源性、优选90％至95％同源性并具有结合蔗糖活性的蛋白质。具体来说，术语“若干个”是指2至180个，优选2至60个，更优选2至5个。
例如可如下获得编码与上述蔗糖PTS酶II大体相同蛋白质的DNA：通过定点诱变修饰核苷酸序列，从而使特定位点的氨基酸序列存在一个或若干个氨基酸残基的取代、缺失、插入、增加或倒位。此外，也可以通过传统的诱变处理获得上述修饰DNA。诱变处理方法的实例包括用羟胺等体外处理编码蔗糖PTS酶II的DNA，以及通过紫外线(UV)照射或者用常规诱变处理使用的诱变剂(如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸)处理诸如埃希氏菌属细菌的微生物，所述微生物包含编码蔗糖PTS酶II的DNA。
上述核苷酸的取代、缺失、插入、增加或倒位等包括自然发生的突变(突变或变异)，例如在含蔗糖PTS酶II微生物的不同菌株、菌种或菌属观察到的突变等。
例如可以通过从编码蔗糖PTS酶II的突变DNA或含有该DNA的细胞分离DNA获得编码与蔗糖PTS酶II大体相同蛋白质的DNA，所分离的DNA在严格条件下可与具有序列表SEQ ID NO：1核苷酸序列的3779至5761核苷酸序列的DNA杂交或者可与通过PCR等从具有所述核苷酸序列的DNA制备的探针杂交，而且所述分离的DNA编码含有具有结合蔗糖活性的蔗糖PTS酶II的蛋白质。这里所说的“严格条件”是指形成所谓的特异性杂交分子而不能形成非特异性杂交分子的条件。很难用数值清楚定义这一条件。但是，举例来说，所述严格条件包括这样的条件：在该条件下，2种具有高度同源性的DNA分子，如同源性超过50％的2种DNA分子，可以相互杂交；而同源性低于50％的2种DNA分子不能相互杂交。另一方面，典型的严格杂交条件为以下列盐浓度表示的杂交条件：1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS，60℃；该杂交条件是DNA杂交中常用的洗涤条件。这里所指的同源性以Lipman-Pearson(Science，227，pp.1435-1441，1985)方法计算值或者Takashi&Gotoh(J.Biochem.，92，pp.1173-1177，1984)方法计算值表示。可以根据本领域技术人员熟知的方法设计探针。
在所述条件下可杂交的基因包括具有所述基因产生的终止密码子的基因，但通过使这些基因与可市售获得的表达载体连接可以很容易去除这些基因，从而检测其表达产物的大小。
本发明的蛋白质是由本发明的DNA编码的蛋白质，它具有SEQID NO：2氨基酸序列。本发明的蛋白质可以具有包含取代、缺失、插入、增加或倒位一个或若干个氨基酸的相当于序列表SEQ ID NO：2氨基酸序列的氨基酸序列，前提是具有结合蔗糖的活性。
本发明的DNA可以用来增强棒杆菌等摄取蔗糖的能力。此外，因为PTS消耗PEP将糖摄入细胞，所以认为PTS不利于合成其生物合成系统在上游阶段包含PEP的氨基酸。因此，认为如果蔗糖PTS破坏而蔗糖可以通过不需要PEP的摄取系统摄入，则对蔗糖摄取率或氨基酸产率等方面都有利。在棒杆菌中，蔗糖特异性的非PTS系统不清楚，但是举例来说，如果蔗糖酶可以在胞外发挥作用，那么葡萄糖和果糖可以通过非PTS系统摄入细胞。
此外，如果将本发明的DNA加以修饰，使其编码的蔗糖PTS酶II作用增强或减弱，或使其与表达控制序列如来自其他基因的启动子连接并导入棒杆菌中，从而可获得蔗糖摄取能力增强或减弱的棒杆菌。具体来说，将编码作用增强的蔗糖PTS酶II的DNA分子导入自主复制载体或棒杆菌细胞染色体DNA。此外，将编码作用减弱的蔗糖PTS酶II的DNA分子利用同源重组通过基因取代导入染色体DNA中。另一方面，利用含有温度敏感型复制控制区段的质粒通过基因取代可以获得蔗糖PTS在低温时起作用而在高温时不起作用的棒杆菌(见日本专利公告第7-108228号)。
适用于本发明的棒杆菌包括迄今分类为短杆菌属(genusBrevibacterium)但目前合并至棒杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，而且包括与棒杆菌属密切相关的短杆菌属细菌。这样的棒杆菌实例如下：
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynbacterium acetoacidophilum)
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
Corynebacterium alkanolyticum
美棒杆菌(Corynebacterium callunae)
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)
百合花棒杆菌(谷氨酸棒杆菌)(Corynebacterium lilium)
Corynebacterium melassecola
嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)
力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)
谷氨酸棒杆菌(Brevibacterium divaricatum)
黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)(Brevibacterium flavum)
(Brevibacterium immariophilum)
乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)(Brevibacterium lactofermentum)
玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)
解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)
生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)
产氨短杆菌(产氨棒杆菌)(Brevibacterium ammoniagenes(Corynebacterium ammoniagenes))
Brevibacterium album
Brevibacterium cerium
嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)
可在棒杆菌细胞中自主复制的载体实例包括pAM330(参见日本专利公开第58-67699号)、pHM1519(参见日本专利公开第58-77895号)等。而且，如果从所述载体切除可使质粒在棒杆菌中自主复制的DNA片段并将其插入大肠杆菌载体中，则它们可用作在大肠杆菌和棒杆菌二者中均可自主复制的所谓穿梭载体。这样的穿梭载体实例包括以下所述的载体。同时还分别列出了含有各载体的微生物，括号内为其国际保藏处的保藏号。其中pHSC4质粒包含温度敏感型复制控制区段。
pAJ655    大肠杆菌AJ11882(FERM BP-136)
          谷氨酸棒杆菌SR8201(ATCC39135)
pAJ1844   大肠杆菌AJ11883(FERM BP-137)
          谷氨酸棒杆菌SR8202(ATCC39136)
pAJ611    大肠杆菌AJ11884(FERM BP-138)
pAJ3148   谷氨酸棒杆菌SR8203(ATCC39137)
pAJ440    枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AJ11901(FERM BP-140)
pHC4      大肠杆菌AJ12617(FERM BP-3532)
pHSC4     大肠杆菌AJ12571(FERM BP-3524)
包含本发明DNA的重组载体可以根据迄今报道的转化方法导入棒杆菌中。例如，有以氯化钙处理受体细胞以增加其对DNA通透性的方法，曾报道用这一方法处理大肠杆菌K-12(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159，1970)；以及用处于生长期的细胞制备感受态细胞、然后将所述DNA导入其中的方法，曾报道用这一方法用于枯草芽孢杆菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F.E.，Gene，1，153，1977)。除此之外，还可使用的方法有：一个方法是将DNA受体细胞制成容易吸收重组DNA的原生质体或者原生质球，然后将重组DNA导入DNA受体细胞，已知这一方法可以用于枯草芽孢杆菌、放线菌和酵母菌(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111，1979；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，Nature，274，398，1978；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，75，1929，1978)；另一个方法是电脉冲法(见日本专利公开第2-207791号)。
实施例
下文中将详细阐述本发明的实施例。
实施例1：分离编码蔗糖PTS酶II的基因
<1>应用DNA杂交分析乳发酵短杆菌AJ12036(FERM BP-734)的染色体DNA
乳发酵短杆菌AJ12036菌株于4ml M-CM2S培养基(含有5g/L蔗糖、10g/L聚胨、10g/L酵母抽提物、5g/L NaCl和0.1g/L DL-甲硫氨酸)中培养过夜，然后收集微生物细胞。利用细菌基因组DNA纯化试剂盒(Bacterial Geneomic DNA Purification Kit)(Advanced GeneticTechnologies)从所得的微生物细胞中抽提染色体DNA。用50μg TE缓冲液(成分：10mM tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA-2Na)洗提染色体DNA。
根据《分子克隆实验室手册》(第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)介绍的方法对上述抽提的染色体DNA进行DNA杂交实验。分别用BamHI和SmaI两种不会剪切ORF-F2C末端侧区段和ORF-F3N末端侧区段的内切酶消化所述染色体DNA，然后进行琼脂糖凝胶电泳。以一个约3kb的片段作为探针，该探针片段是用BamHI从克隆在pSSM30质粒(日本专利公开第8-196280号)上的6.9kb片段切除得到的，它包含的ORF-F2C末端侧和ORF-F3N末端侧的区段(日本专利公开第8-196280号，序列表SEQ ID NO：1649至4675的片段)。
结果杂交检测到两条带，说明ORF-F2和ORF-F3在染色体上并非毗邻。所以，下面再试图证实蔗糖酶基因下游存在的序列。
<2>存在于蔗糖酶基因下游区段序列的测定
为了测定蔗糖基因下游区段的核苷酸序列，首先将该下游区段通过PCR扩增。使用TAKARA LA PCRTM体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)进行PCR。具体如下进行PCR。
用10种限制性内切酶(SpeI，EcoT 14I，NheI，PstI，EcoT22I，BglII，BamHI，XhoI，SalI，AvaI)完全消化染色体DNA，产生与上述试剂盒附带序列盒(序列表SEQ ID NO：3至8)相同的切割末端。应用这些各片段作为模板、表1所示的合成引物1和序列盒引物1(SEQ ID NO：19)进行PCR。因为在所述序列盒的5’端没有加入磷酸基，所以在染色体DNA片段和所述序列盒5’端的连接位点产生一个缺口。因此从序列盒引物起始的DNA合成在该连接位点终止，而只有从合成引物合成的DNA用作由序列盒引物开始合成的模板，形成互补链。
然后，应用以上扩增产物作为模板、合成引物2和序列盒引物2(SEQ ID NO：20)进行PCR。其结果是，用EcoT14I，PstI，BglII，BamHI，XhoI或AvaI消化染色体DNA得到的DNA用作模板时，可扩增得到片段。测定了用BamHI消化的DNA片段作为模板扩增得到约1.8kb片段的核苷酸序列。
表1：合成引物的核苷酸序列和位置
  引物编码   核苷酸序列   在SEQ ID NO：1中的位置(核苷酸序号)
  12345   CGTCTTGCGAGGATTCAGCGAGCTG(SEQ ID NO：9)AGCTGGATTTCGGCCATGAATTCTA(SEQ ID NO：10)GATCTGTTCGGTCCGCAATCACT(SEQ ID NO：11)CACTGGTGGAGATGTTCCCTCAGAT(SEQ ID NO：12)CATCTTCGCAACCGCATCCATGGCC   (3159至3183)(3179至3203)(4189至4212)(4209至4233)(4801至4825)
678910   (SEQ ID NO：13)CGCGCAGGGTGCAGCATGTTTGGC(SEQ ID NO：14)GGGCCTTGCAGGTGCTTCAGGTGTC(SEQ ID NO：15)CCGCTGTTCTTGGTATTACAGAGCC(SEQ ID NO：16)GCAGCGTCAGCGATGCCATGTTTGC(SEQ ID NO：17)GCTTGGCTCAGGTGTTGCGATCGTC(SEQ ID NO：18) (4831至4854)(4888至4912)(4914至4938)(5322至5346)(5356至5380)
根据测定的序列合成合成引物3和4。按照上述相同的方法，应用合成引物3和序列盒引物1组合以及合成引物4和序列盒引物2组合通过PCR连续扩增上述片段。其结果是，用PstI或BamHI消化染色体DNA得到的DNA用作模板时，可扩增得到片段。测定了基于PstI消化的DNA片段扩增的片段的核苷酸序列。
根据测定的序列合成合成引物5和6。应用合成引物5和序列盒引物1组合以及合成引物6和序列盒引物2连续进行PCR。其结果是，用EcoT14或PstI消化的染色体DNA用作模板时，能够证实所扩增的片段。测定了前一种情况片段的核苷酸序列。
进而，合成了合成引物7和8，且进行了与上述过程同样的操作。其结果是，EcoT14消化的染色体DNA用作模板时，可以证实所扩增的片段。测定了这一扩增片段的核苷酸序列。
根据上述序列合成引物9和10，且进行了与上述过程同样的操作。其结果是，SpeI消化的染色体DNA用作模板时，可以证实所扩增的片段。测定了这一扩增片段的核苷酸序列。
关于核苷酸序列测定，可使用ABI生产的一种测序试剂盒按照其操作说明进行反应，然后通过荧光标记法测定所扩增片段的核苷酸序列。
上述结果见序列表SEQ ID NO：1。发现在该核苷酸序列的3684号核苷酸后存在一个新的ORF。推测该ORF由1983bp核苷酸序列组成，相当于核苷酸3779至5761，而且测定的核苷酸序列翻译所得的蛋白质由661个氨基酸残基组成。关于ORF，对GENBANK CDS数据库进行了同源性检索，结果见表2，所述ORF编码的蛋白质与蔗糖摄取特异性蛋白蔗糖PTS酶II具有高度同源性。在下文中这个ORF称为ptsIIsuc基因。
表2：新ORF的同源性检索结果
  细菌及基因名称   同源已知蛋白质   同源性(％)
  P.pentsaceus   scrA枯草芽孢杆菌   trePS.xylosus      scrAS.mutans       scrAS.typhimurium  scrA质粒pUR400   酶IIscr海藻糖特异性酶IIBC酶IIscr酶IIscr酶IIscr   48.843.452.245.437.6
实施例2：蔗糖PTS酶II基因破坏菌株的制备
制备ptsIIsuc基因被破坏的乳发酵短杆菌菌株。首先制备该基因破坏的质粒(见图1)。以乳发酵短杆菌AJ12036的染色体作为模板、引物2(SEQ ID NO：10)和具有下文所示的核苷酸序列的引物11(SEQID NO：21)通过PCR扩增ptsIIsuc基因片段，利用TA克隆试剂盒(Invitrogen)进行克隆，质粒称为pCRS2。
(引物11)CGCTACTGCTGAACGAACATGTCC(相当于SEQ ID NO：1的5947至5924核苷酸)
将XbaI和SpeI消化pCRS2切除的片段与pHSG399的XbaI末端连接构建成p399S2。再以HpaI和BamHI消化该质粒，得到的片段(相当于SEQ ID NO：1的4385至4798核苷酸)与SmaI和BamHI消化的pHSG299连接，以制备质粒pdSB。接着以BamHI消化pdSB，并将之与一个温度敏感型复制起点连接，以制备质粒pdSBT，所述复制起点为用Bam HI消化质粒pBCT4得到并可以在棒杆菌中复制(参见日本专利公告第7-108228号)。该质粒包含缺失5’端和3’端的ptsIIsuc基因。在约10℃至32℃下pdSBT质粒可在棒杆菌中自主复制，而在约34℃或更高的温度下不能自主复制。
如下构建pBCT4：以限制性酶BamHI和KpnI消化日本专利公告第7-108228号介绍的温度敏感型载体pHSC4，以得到一个约3kb包含所获得的温度敏感型复制起点的DNA片段。用T4DNA聚合酶使所得DNA片段的两端平端化。使该DNA片段与BamHI接头连接后再用BamHI消化。然后，将之与以BamHI消化的pHSG399连接得到pBCT4(图2)。
以pdSBT转化乳发酵短杆菌AJ12036菌株，然后用含25μg/ml卡那霉素的CM2S平板选择转化体。通过电脉冲法进行转化(参见日本专利公开第2-207791号)。所得转化体称为AJ12036/pTSBT。将AJ12036/pTSBT菌株稀释后以每板103至105cfu涂布在含25μg/ml卡那霉素的M-CM2S平板上。转化体在平板上于34℃培养过夜，获得的抗药性菌株为包含掺入其染色体的质粒的菌株。通过PCR证实所得菌株带有通过同源重组掺入宿主染色体的pTSIIsuc基因的载体质粒。该整合菌株称为YdS1。
将所述YdS1菌株在以葡萄糖或蔗糖为糖源的基本培养基(20g/L葡萄糖或蔗糖、5g/L硫酸铵、2g/L尿素、1g/L KH2PO4、0.5g/LMgSO4·7H2O、0.002g/dl FeSO4、0.002g/dl MnSO4、100μg/L生物素、2000μg/L维生素B1、10mg/dl DL-甲硫氨酸和15g/L琼脂，pH6.6)中于34℃培养。结果见表3。因为YdS1菌株可以在只以葡萄糖为碳源的基本培养基中生长，而不能在只以蔗糖为碳源的基本培养基中生长，因此可以肯定ptsIIsuc基因是编码蔗糖摄取中的蔗糖特异性蛋白酶II的基因。
表3：在基本培养基上的生长情况
菌株   碳源
  蔗糖   葡萄糖
  AJ12036YdS1   能够生长不能生长   能够生长能够生长
工业实用性
本发明提供一种编码棒杆菌蔗糖PTS酶II的基因以及一种其蔗糖PTS不起作用的棒杆菌菌株。所述基因和菌株可以用来培育蔗糖摄取率升高或者氨基酸、核酸等产率提高的菌株。
序列表
<110>Ajinomoto Co.，Inc.(味之素株式会社)
<120>编码蔗糖PTS酶II的DNA
<130>B644MSOP1027
<150>JP 11-189512
<151>1999-07-02
<160>21
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>5969
<212>DNA
<213>乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)
<220>
<221>CDS
<222>(3779)..(5761)
<400>1
agtccgtcga cgccaccatt gatgtggtgg tcaccgagct tgcggaggct ttctacatct 60
acgctcccgt cggcgtggag tggggtcatt acgggtggga tcacgccggt gaaagttgcg 120
gaacccatgg tgttccttgt gggttgaggg aacgagtgcg ggtgagaagt ttttcaagtg 180
tctgcagttt ttaagttatg catcatcagc ttggaaggct gaggtaattc agtagacctg 240
caacagcagg cctcaagtcc gaagataatt aacctagatc cgtagacata agacatcata 300
cgtcctatgc ttgctggaag gaaccaaata acctcagaaa gatggcagaa gtggtgcatt 360
atcaagaaaa tgcaggtcaa gcagttaaaa aaattgaggg aagaattgtt ccccccctcg 420
gggtgattga tggctttctc caactcgaaa acggcatcat cacggaactc tctggagaac 480
cagcacctaa aaacgcagga ttccaccccg aactccccac gattgttccc ggttttattg 540
atcttcataa tcacggtgga aacggtggcg cgtttcctac gggaacgcag gaccaggcga 600
ggaacaccgc gcagtatcac cgcgaacatg gcacgaccgt gatgttgcca agcatggttt 660
cggcgccggc tgacgcactg gcagcgcagg tggaaaacct tattcccttg tgtgaagagg 720
tcctgctgtg cggcattcac ctcgagggcc ctttcatcaa cgcatgccgt tgtggtgctc 780
aaaacccgga tttcattttt cccggcaacc caacagatct tgcccgggtg atccatgcgg 840
gaaaaggttg gatcaaatcg atcacagtag cgccggaaac tgacaatctt tctgagcttc 900
tcgatctctg cgcagcgcac cacatcattg cttccttcgg gcacactgat gcagattttg 960
ataccactac cagcgcaatt gccttggcta aagagaaaaa tgtgacggtc acggctacgc 1020
atttgttcaa tgcgatgcct ccgctgcatc atagggctcc cggcagcgtg ggcgctttgc 1080
ttgctgcggc acgtgccggg gacgcatatg ttgagttgat cgccgacggc gtgcatttgg 1140
ccgatggaac ggtcgatcta gctcgttcca acaacgcctt tttcatcacg gacgccatgg 1200
aagccgccgg aatgccagac ggtgagtaca ttttgggcgt tttgaacgtc accgtcaccg 1260
atggagtcgc ccgtctgcgc gatggcggcg ccatcgccgg gggcaccagc acactagcga 1320
gtcagttcgt gcaccacgtg cgcaggggta tgacgcttat cgacgcgacc ctccacacct 1380
caaccgtcgc cgctaaaatt ctcggtcttg gcgatcacga aatcgctaaa tccaaccctg 1440
caaattttgt ggtctttgac tcaaacggcc aggtgcaaaa ggtccattta ggtcatcaag 1500
tactttaagt acgagtaaaa ctatcctgat tttaaaggag tcccaccatg gaaatcacta 1560
tctgcaaaga cgagcaagaa gtcggcaaag cagttgcagt cctaatcgca cccttcgcca 1620
acaagggtgg aaccttgggg cttgcaacag gatcctcacc actgagtacc taccaagagc 1680
tcattcgcat gtatgaagct ggggaagtgt cattcaagaa ctgcaaggca ttcttgttgg 1740
atgaatacgt gggactaacc cgtgacgatg aaaacagcta ctttaaaacc attcgcaaag 1800
agttcactga ccacatcgac atcgttgatg aagaggtcta cagcccagat ggtgcaaacc 1860
ctgatccata cgaagcagct gcagagtatg aggcaaagat cgctgcagaa tccgttgaag 1920
ttcaaatcct tggcatcggc ggaaacggca catcgctttc attgaaccat catcttctct 1980
gtcaggactg acaaaggtcc aggcgctgca ccctaaaact gtggaggaca acgctcgatt 2040
cttcaacacc atcgaagagg tcccaaccca cgccgtcacc cagggtttgg gcactttgtc 2100
ccgcgcgcaa aacatcgtgt tggtggcaac tggtgaagga aaagccgacg ccatccgcgg 2160
aactgtggaa ggcccagtga ctgcttcttg cccaggttcc atcctgtaga tgcacaacat 2220
gccaccatca tcgttggatg aagcagcagt atccaagctg gaaaacgctg atcactaccg 2280
tctcatggag caattaaagc tgcgctagaa acaaaaagga aagtactgtg tggggctatg 2340
cacacagaac tttccagttt gcgccctgcg taccatgtga ctcctccgca gggcaggctc 2400
aatgatccca acggaatgta cgtcgatgga gataccctcc acgtctacta ccagcacgat 2460
ccaggtttcc ccttcgcacc aaagcgcacc ggctgggctc acaccaccac gccgttgacc 2520
ggaccgcagc gattgcagtg gacgcacctg cccgacgctc tttacccgga tgcatcctat 2580
gacctggatg gatgctattc cggtggagcc gtatttactg acggcacact taaacttttc 2640
tacaccggca acctaaaaat tgacggaaag cgccgcgcca cccaaaacct tgtcgaagtc 2700
gaggacccaa ctgggctgat gggcggcatt catcgccgtt cgcctaaaaa tccgcttatc 2760
gacggacccg ccagcggttt cacaccccat taccgcgatc ccatgatcag ccctgatggt 2820
gatggttgga acatggttct tggggcccaa cgcgaaaacc tcaccggtgc agcggttcta 2880
taccgctcga cagatcttga aaactgggaa ttctccggtg aaatcacctt tgacctcagt 2940
gatgcacaac ctggttctgc tcctgatctc gttcccgatg gctacatgtg ggaatgcccc 3000
aaccttttta cgcttcgcga tgaagaaact ggcgaagatc tcgacgtgct gattttctgt 3060
ccacaaggat tggaccgaat ccacgatgag gttactcact acgcaagctc tgaccagtgc 3120
ggatatgtcg tcgacaagct tgaaggaacg accttccgcg tcttgcgagg attcagcgag 3180
ctggatttcg gccatgaatt ctacgcaccg caggttgcag taaacggttc tgatgcctgg 3240
ctcgtgggct ggatggggct gcccgcgcag gatgatcacc caacagttgc acaggaagga 3300
tgggtgcact gcctgactgt gccccgcaag cttcatttgc gcaaccacgc gatctaccaa 3360
gagctccttc tcccagaggg ggagtcgggg gtaatcagat ctgtattagg ttctgaacct 3420
gtccgagtag acatccgagg caatatttcc ctcgagtggg atggtgtccg tttgtctgtg 3480
gatcgtgatg gtgatcgtcg cgtagctgag gtaaaacctg gcgaattagt gatcgcggac 3540
gataatacag ccattgagat aactgcaggt gatggacagg tttcattcgc ttttccgggc 3600
cttcaaaggt gacactattg agagataagt catataaaag ggtcttttgt ggcgaattgt 3660
acaaatactt cgcaaaatcc cttgatcgga cacaaataaa caggtttaat attgtttagc 3720
ttttgaacaa acattcatgt ctgaatattt ttgtttcttc ccggttaagg agaaattc   3778
atg gac cat aag gac ctc gcg caa cgc atc ctg cgc gac att ggc ggc   3826
Met Asp His Lys Asp Leu Ala Gln Arg Ile Leu Arg Asp Ile Gly Gly
  1               5                  10                  15
gaa gac aac att gtc gcc gcc gca cac tgt gca acg cgt tta cgc ctc   3874
Glu Asp Asn Ile Val Ala Ala Ala His Cys Ala Thr Arg Leu Arg Leu
             20                  25                  30
gtg ctc aaa gac acc aag gat gtg gat cgc caa agt ctg gat gat gat   3922
Val Leu Lys Asp Thr Lys Asp Val Asp Arg Gln Ser Leu Asp Asp Asp
         35                  40                  45
cca gat ctg aaa ggc acc ttt gaa act ggc ggc atg ttc cag atc atc   3970
Pro Asp Leu Lys Gly Thr Phe Glu Thr Gly Gly Met Phe Gln Ile Ile
     50                  55                  60
gtc ggg cca ggc gat gtg gat cat gtt ttc aaa gaa ctc gat gac gca   4018
Val Gly Pro Gly Asp Val Asp His Val Phe Lys Glu Leu Asp Asp Ala
 65                  70                  75                  80
acc tcc aaa gac atc gct gtg tcc aca gag cag ctc aaa gat gtt gtg   4066
Thr Ser Lys Asp Ile Ala Val Ser Thr Glu Gln Leu Lys Asp Val Val
                 85                  90                  95
gct aac aac gcc aac tgg ttc agc cgt gct gtg aag gta ttg gcg gac   4114
Ala Asn Asn Ala Asn Trp Phe Ser Arg Ala Val Lys Val Leu Ala Asp
            100                 105                 110
att ttc gtc ccg ctg att cca atc ttg gtt ggt ggc ggt ctg ctc atg   4162
Ile Phe Val Pro Leu Ile Pro Ile Leu Val Gly Gly Gly Leu Leu Met
        115                 120                 125
gct atc aac aat gtg ttg gtt gcg cag gat ctg ttc ggt ccg caa tca   4210
Ala Ile Asn Asn Val Leu Val Ala Gln Asp Leu Phe Gly Pro Gln Ser
    130                 135                 140
ctg gtg gag atg ttc cct cag atc agc ggt gtt gct gag atg atc aac   4258
Leu Val Glu Met Phe Pro Gln Ile Ser Gly Val Ala Glu Met Ile Asn
145                 150                 155                 160
ctg atg gca tct gcg ccg ttc gcg ttc ttg cca gtg ttg gtt ggt ttc   4306
Leu Met Ala Ser Ala Pro Phe Ala Phe Leu Pro Val Leu Val Gly Phe
                165                 170                 175
acc gca acc aag cgt ttc ggt ggc aat gag ttc ctg ggc gcc ggc att   4354
Thr Ala Thr Lys Arg Phe Gly Gly Asn Glu Phe Leu Gly Ala Gly Ile
            180                 185                 190
ggt atg gcg atg gtg ttc cca acc ctg gtt aac ggc tac gac gtg gcc   4402
Gly Met Ala Met Val Phe Pro Thr Leu Val Asn Gly Tyr Asp Val Ala
        195                 200                 205
gcc acc atg acc gcg ggc gaa atg cca atg tgg tcc ctg ttt ggt ttg   4450
Ala Thr Met Thr Ala Gly Glu Met Pro Met Trp Ser Leu Phe Gly Leu
    210                 215                 220
gat gtt gct caa gct ggt tac cag ggc acc gtg ctt cct gtg ctg gtg   4498
Asp Val Ala Gln Ala Gly Tyr Gln Gly Thr Val Leu Pro Val Leu Val
225                 230                 235                 240
gtc tct tgg att ctg gca acg atc gag aag ttc ctg cac aag cga ctc   4546
Val Ser Trp Ile Leu Ala Thr Ile Glu Lys Phe Leu His Lys Arg Leu
                245                 250                 255
atg ggc act gca gac ttc ctg atc acc cca gtg ttg act ctg ctg ctc   4594
Met Gly Thr Ala Asp Phe Leu Ile Thr Pro Val Leu Thr Leu Leu Leu
            260                 265                 270
acc ggc ttc ctt acg ttc att gct att ggt cca gca atg cgc tgg gtg   4642
Thr Gly Phe Leu Thr Phe Ile Ala Ile Gly Pro Ala Met Arg Trp Val
        275                 280                 285
ggt gac ttg ctg gca cac ggt ctg cag gga ctc tat gat ttc ggt ggt   4690
Gly Asp Leu Leu Ala His Gly Leu Gln Gly Leu Tyr Asp Phe Gly Gly
    290                 295                 300
cca gtc ggc ggt ctg ctt ttc ggt ctg gtc tac tca cca atc gtt atc   4738
Pro Val Gly Gly Leu Leu Phe Gly Leu Val Tyr Ser Pro Ile Val Ile
305                 310                 315                 320
act ggt ctg cac cag tcc ttc ccg cca att gag ctg gag ctg ttc aac   4786
Thr Gly Leu His Gln Ser Phe Pro Pro Ile Glu Leu Glu Leu Phe Asn
                325                 330                 335
cag ggt gga tcc ttc atc ttc gca acc gca tcc atg gcc aat atc gcg   4834
Gln Gly Gly Ser Phe Ile Phe Ala Thr Ala Ser Met Ala Asn Ile Ala
            340                 345                 350
cag ggt gca gca tgt ttg gca gtg ttc ttc cta gcg aag agt gaa aag   4882
Gln Gly Ala Ala Cys Leu Ala Val Phe Phe Leu Ala Lys Ser Glu Lys
        355                 360                 365
ctc aag ggc ctt gca ggt gct tca ggt gtc tcc gct gtt ctt ggt att   4930
Leu Lys Gly Leu Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser Ala Val Leu Gly Ile
    370                 375                 380
aca gag cct gcg atc ttc ggt gtg aac ctt cgc ctg cgc tgg ccg ttc   4978
Thr Glu Pro Ala Ile Phe Gly Val Asn Leu Arg Leu Arg Trp Pro Phe
385                 390                 395                 400
tac att ggt atc ggt acc gca gct atc ggt ggc gct ttg att gca ctc   5026
Tyr Ile Gly Ile Gly Thr Ala Ala Ile Gly Gly Ala Leu Ile Ala Leu
                405                 410                 415
ttt gat atc aag gca gtt gcg ttg ggc gct gca ggt ttc ttg ggt gtt   5074
Phe Asp Ile Lys Ala Val Ala Leu Gly Ala Ala Gly Phe Leu Gly Val
            420                 425                 430
gtt tct att gat gct cca gat atg gtc atg ttc ttg gtt tgc gcg gta   5122
Val Ser Ile Asp Ala Pro Asp Met Val Met Phe Leu Val Cys Ala Val
        435                 440                 445
gtt acc ttt gtc atc gca ttc ggc gca gcg att gct tat ggc ctt tac   5170
Val Thr Phe Val Ile Ala Phe Gly Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Tyr
    450                 455                 460
ttg gtt cgc cgc aac ggc agc att gat cca gat gca acc gct gct cca   5218
Leu Val Arg Arg Asn Gly Ser Ile Asp Pro Asp Ala Thr Ala Ala Pro
465                 470                 475                 480
gtg cct gca gga acg acc aaa gcc gaa gca gaa gca ccc gca gaa ttt   5266
Val Pro Ala Gly Thr Thr Lys Ala Glu Ala Glu Ala Pro Ala Glu Phe
                485                 490                 495
tca aac gat tcc acc atc atc cag gca cct ttg acc ggt gaa gct atc   5314
Ser Asn Asp Ser Thr Ile Ile Gln Ala Pro Leu Thr Gly Glu Ala Ile
            500                 505                 510
gca ctg agc agc gtc agc gat gcc atg ttt gcc agc gga aag ctt ggc   5362
Ala Leu Ser Ser Val Ser Asp Ala Met Phe Ala Ser Gly Lys Leu Gly
        515                 520                 525
tca ggt gtt gcg atc gtc ccc acc aag ggg cag ctg gtt tca cca gtg   5410
Ser Gly Val Ala Ile Val Pro Thr Lys Gly Gln Leu Val Ser Pro Val
    530                 535                 540
agc gga aag atc gtg gtg gcc ttc cca tct ggt cac gct ttc gca gtc   5458
Ser Gly Lys Ile Val Val Ala Phe Pro Ser Gly His Ala Phe Ala Val
545                 550                 555                 560
cgc act aag gct gag gat ggt tcc aat gtg gat atc ttg atg cac att   5506
Arg Thr Lys Ala Glu Asp Gly Ser Asn Val Asp Ile Leu Met His Ile
                565                 570                 575
ggt ttc gac acc gta aac ctc aac ggc acg cac ttt aac ccg ctg aag   5554
Gly Phe Asp Thr Val Asn Leu Asn Gly Thr His Phe Asn Pro Leu Lys
            580                 585                 590
aag cag ggc gat gaa gtc aaa gca ggg gag ctg ctg tgt gaa ttc gat   5602
Lys Gln Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Glu Leu Leu Cys Glu Phe Asp
        595                 600                 605
att gat gcc att aag gct gca ggt tat gag gta acc acg ccg att gtt   5650
Ile Asp Ala Ile Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Val Thr Thr Pro Ile Val
    610                 615                 620
gtt tcg aat tac aag aaa acc gga cct gta aac act tac ggt ttg ggc   5698
Val Ser Asn Tyr Lys Lys Thr Gly Pro Val Asn Thr Tyr Gly Leu Gly
625                 630                 635                 640
gaa att gaa gcg gga gcc aac ctg ctc aac gtc gca aag aaa gaa gcg   5746
Glu Ile Glu Ala Gly Ala Asn Leu Leu Asn Val Ala Lys Lys Glu Ala
                645                 650                 655
gtg cca gca aca cca taagttgaaa ccttgagtgt tcgcacacag gttagactag   5801
Val Pro Ala Thr Pro
            660
gggacgtgac tctacgcatc tttgacaccg gtacccgtac gcttcgagat tttaaacctg 5861
ttcaaccagg tcatgcctcg gtgtacctgt gtggtgccac cccgcaatct tcaccccaca 5921
ttggacatgt tcgttcagca gtagcgtttg atattttgcg ccgctgaa              5969
<210>2
<211>661
<212>PRT
<213>乳发酵短杆菌
<400>2
Met Asp His Lys Asp Leu Ala Gln Arg Ile Leu Arg Asp Ile Gly Gly
  1               5                  10                  15
Glu Asp Asn Ile Val Ala Ala Ala His Cys Ala Thr Arg Leu Arg Leu
             20                  25                  30
Val Leu Lys Asp Thr Lys Asp Val Asp Arg Gln Ser Leu Asp Asp Asp
         35                  40                  45
Pro Asp Leu Lys Gly Thr Phe Glu Thr Gly Gly Met Phe Gln Ile Ile
     50                  55                  60
Val Gly Pro Gly Asp Val Asp His Val Phe Lys Glu Leu Asp Asp Ala
 65                  70                  75                  80
Thr Ser Lys Asp Ile Ala Val Ser Thr Glu Gln Leu Lys Asp Val Val
                 85                  90                  95
Ala Asn Asn Ala Asn Trp Phe Ser Arg Ala Val Lys Val Leu Ala Asp
            100                 105                 110
Ile Phe Val Pro Leu Ile Pro Ile Leu Val Gly Gly Gly Leu Leu Met
        115                 120                 125
Ala Ile Asn Asn Val Leu Val Ala Gln Asp Leu Phe Gly Pro Gln Ser
    130                 135                 140
Leu Val Glu Met Phe Pro Gln Ile Ser Gly Val Ala Glu Met Ile Asn
145                 150                 155                 160
Leu Met Ala Ser Ala Pro Phe Ala Phe Leu Pro Val Leu Val Gly Phe
                165                 170                 175
Thr Ala Thr Lys Arg Phe Gly Gly Asn Glu Phe Leu Gly Ala Gly Ile
            180                 185                 190
Gly Met Ala Met Val Phe Pro Thr Leu Val Asn Gly Tyr Asp Val Ala
        195                 200                 205
Ala Thr Met Thr Ala Gly Glu Met Pro Met Trp Ser Leu Phe Gly Leu
    210                 215                 220
Asp Val Ala Gln Ala Gly Tyr Gln Gly Thr Val Leu Pro Val Leu Val
225                 230                 235                 240
Val Ser Trp Ile Leu Ala Thr Ile Glu Lys Phe Leu His Lys Arg Leu
                245                 250                 255
Met Gly Thr Ala Asp Phe Leu Ile Thr Pro Val Leu Thr Leu Leu Leu
            260                 265                 270
Thr Gly Phe Leu Thr Phe Ile Ala Ile Gly Pro Ala Met Arg Trp Val
        275                 280                 285
Gly Asp Leu Leu Ala His Gly Leu Gln Gly Leu Tyr Asp Phe Gly Gly
    290                 295                 300
Pro Val Gly Gly Leu Leu Phe Gly Leu Val Tyr Ser Pro Ile Val Ile
305                 310                 315                 320
Thr Gly Leu His Gln Ser Phe Pro Pro Ile Glu Leu Glu Leu Phe Asn
                325                 330                 335
Gln Gly Gly Ser Phe Ile Phe Ala Thr Ala Ser Met Ala Asn Ile Ala
            340                 345                 350
Gln Gly Ala Ala Cys Leu Ala Val Phe Phe Leu Ala Lys Ser Glu Lys
        355                 360                 365
Leu Lys Gly Leu Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser Ala Val Leu Gly Ile
    370                 375                 380
Thr Glu Pro Ala Ile Phe Gly Val Asn Leu Arg Leu Arg Trp Pro Phe
385                 390                 395                 400
Tyr Ile Gly Ile Gly Thr Ala Ala Ile Gly Gly Ala Leu Ile Ala Leu
                405                 410                 415
Phe Asp Ile Lys Ala Val Ala Leu Gly Ala Ala Gly Phe Leu Gly Val
            420                 425                 430
Val Ser Ile Asp Ala Pro Asp Met Val Met Phe Leu Val Cys Ala Val
        435                 440                 445
Val Thr Phe Val Ile Ala Phe Gly Ala Ala Ile Ala Tyr Gly Leu Tyr
    450                 455                 460
Leu Val Arg Arg Asn Gly Ser Ile Asp Pro Asp Ala Thr Ala Ala Pro
465                 470                 475                 480
Val Pro Ala Gly Thr Thr Lys Ala Glu Ala Glu Ala Pro Ala Glu Phe
                485                 490                 495
Ser Asn Asp Ser Thr Ile Ile Gln Ala Pro Leu Thr Gly Glu Ala Ile
            500                 505                 510
Ala Leu Ser Ser Val Ser Asp Ala Met Phe Ala Ser Gly Lys Leu Gly
        515                 520                 525
Ser Gly Val Ala Ile Val Pro Thr Lys Gly Gln Leu Val Ser Pro Val
    530                 535                 540
Ser Gly Lys Ile Val Val Ala Phe Pro Ser Gly His Ala Phe Ala Val
545                 550                 555                 560
Arg Thr Lys Ala Glu Asp Gly Ser Asn Val Asp Ile Leu Met His Ile
                565                 570                 575
Gly Phe Asp Thr Val Asn Leu Asn Gly Thr His Phe Asn Pro Leu Lys
            580                 585                 590
Lys Gln Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Glu Leu Leu Cys Glu Phe Asp
        595                 600                 605
Ile Asp Ala Ile Lys Ala Ala Gly Tyr Glu Val Thr Thr Pro Ile Val
    610                 615                 620
Val Ser Asn Tyr Lys Lys Thr Gly Pro Val Asn Thr Tyr Gly Leu Gly
625                 630                 635                 640
Glu Ile Glu Ala Gly Ala Asn Leu Leu Asn Val Ala Lys Lys Glu Ala
                645                 650                 655
Val Pro Ala Thr Pro
            660
<210>3
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：Sau3AI序列盒
<220>
<221>misc_feature
<222>(44)
<223>互补链在该位置沿3’至5’方向延伸具有3’-ctag-5’序列的单链
<400>3
gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata ggga                      44
<210>4
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：EcoRI序列盒
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)
<223>互补链在该位置沿3’至5’方向延伸具有3’-ttaa-5’序列的单链
<400>4
gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata gggagag                   47
<210>5
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：HindIII序列盒
<220>
<221>misc_feature
<222>(46)
<223>互补链在该位置沿3’至5’方向延伸具有3’-tcga-5’序列的单链
<400>5
gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata gggaga                     46
<210>6
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：PstI序列盒
<220>
<221>misc_feature
<222>(48)..(51)
<223>不存在互补链
<400>6
gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata gggagactgc a               51
<210>7
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：SalI序列盒
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)
<223>互补链在该位置沿3’至5’方向延伸具有3’-agct-5’序列的单链
<400>7
gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata gggagag                    47
<210>8
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：XbaI序列盒
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)
<223>互补链在该位置沿3’至5’方向延伸具有3’-gatc-5’序列的单链
<400>8
gtacatattg tcgttagaac gcgtaatacg actcactata gggagat                  47
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：用于PCR的引物
<400>9
cgtcttgcga ggattcagcg agctg                                          25
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：用于PCR的引物
<400>10
agctggattt cggccatgaa ttcta                                          25
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：用于PCR的引物
<400>11
gatctgttcg gtccgcaatc act                                            23
<210>12
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：用于PCR的引物
<400>12
cactggtgga gatgttccct cagat                                       25
<210>13
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：用于PCR的引物
<400>13
catcttcgca accgcatcca tggcc                                       25
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：用于PCR的引物
<400>14
cgcgcagggt gcagcatgtt tggc                                        24
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：用于PCR的引物
<400>15
gggccttgca ggtgcttcag gtgtc                                       25
<210>16
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：用于PCR的引物
<400>16
ccgctgttct tggtattaca gagcc                                      25
<210>17
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：用于PCR的引物
<400>17
gcagcgtcag cgatgccatg tttgc                                      25
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：用于PCR的引物
<400>18
gcttggctca ggtgttgcga tcgtc                                      25
<210>19
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：序列盒引物1
<400>19
gtacatattg tcgttagaac gcggtaatac gactca                          36
<210>20
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：序列盒引物2
<400>20
cgttagaacg cgtaatacga ctcactatag ggaga                           35
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：用于PCR的引物
<400>21
cgctactgct gaacgaacat gtcc                                      24

Claims (4)

1.一种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO：2氨基酸序列，并具有结合蔗糖活性。
2.一种DNA，该DNA编码一种蛋白质，所述蛋白质与SEQ IDNO：2氨基酸序列有95％或95％以上的同源性，并具有结合蔗糖活性，该DNA是以下(a)或(b)定义的DNA：
(a)包含序列表SEQ ID NO：1的核苷酸3779至5761的核苷酸序列的DNA；
(b)在1×SSC，0.1％SDS，60℃条件下与序列表SEQ ID NO：1的核苷酸3779至5761的核苷酸序列杂交并编码具有结合蔗糖活性的蛋白质的DNA。
3.权利要求2的DNA，其中蛋白质来源于棒杆菌。
4.权利要求2的DNA，其中蛋白质具有SEQ ID NO：2氨基酸序列。
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