PL195942B1 - Nowe izolowane czasteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowartosciowych zwiazków chemicznych i sposób diagnozowania obecnosci albo aktywnosci Corynebacterium diphteriae PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Nowe izolowane czasteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowartosciowych zwiazków chemicznych i sposób diagnozowania obecnosci albo aktywnosci Corynebacterium diphteriae PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number
PL195942B1
PL195942B1 PL00380961A PL38096100A PL195942B1 PL 195942 B1 PL195942 B1 PL 195942B1 PL 00380961 A PL00380961 A PL 00380961A PL 38096100 A PL38096100 A PL 38096100A PL 195942 B1 PL195942 B1 PL 195942B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
nucleic acid
protein
sequence
glutamicum
amino acid
Prior art date
Application number
PL00380961A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Publication of PL195942B1 publication Critical patent/PL195942B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1. Izolowana czasteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, ze obejmuje sekwencje poda- na na Liscie Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencje do niej komplementarna. 2. Izolowana czasteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, ze koduje polipeptyd obejmu- jacy sekwencje aminokwasowa podana na Liscie Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencje do niej komplementarna. 3. Izolowana czasteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, ze koduje naturalnie wystepu- jaca odmiane alleliczna polipeptydu obejmujacego sekwencje aminokwasowa podana na Liscie Se- kwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencje do niej komplementarna. 4. Izolowana czasteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, ze obejmuje sekwencje nukle- otydowa, która jest w przynajmniej 50% identyczna z cala sekwencja nukleotydowa podana na Liscie Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencje do niej komplementarna. 5. Izolowana czasteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, ze koduje polipeptyd obejmu- jacy sekwencje aminokwasowa, która jest w przynajmniej 50% identyczna z cala sekwencja nukleoty- dowa podana na Liscie Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencje do niej komplementarna. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są nowe, izolowane cząsteczki kwasu nukleinowego, wektory obejmujące te cząsteczki, nowe komórki gospodarza transfekowane tymi wektorami, izolowane polipeptydy oraz sposób ich wytwarzania, nowy sposób wytwarzania wysokowartościowych związków chemicznych oraz nowy sposób diagnozowania obecności albo aktywności Corynebacterium diphteriae.
Zgłoszenie to zastrzega pierwszeństwo względem wcześniej złożonego, wstępnego zgłoszenia patentowego USA nr 60/141031, złożonego 25 czerwca 1999. Zgłoszenie to zastrzega również pierwszeństwo z:
niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19931636.8, złożonego 8 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932125.6, złożonego 9 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932126.4, złożonego 9 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932127.2, złożonego 9 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932128.0, złożonego 9 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932129.9, złożonego 9 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932226.0, złożonego 9 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932920.6, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932922.2, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932924.9, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 15 19932928.1, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932930.3, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932933.8, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932935.4, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932973.7, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19933002.6, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19933003.4, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19933005.0, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19933006.9, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19941378.9, złożonego 31 sierpnia 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19941379.7, złożonego 31 sierpnia 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19941390.8, złożonego 31 sierpnia 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19941391.6, złożonego 31 sierpnia 1999, i niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 25 19942088.2, złożonego 3 września 1999.
Pełna zawartość wszystkich wyżej wspomnianych zastrzeżeń patentowych jest rozmyślnie włączona tu przez odniesienie literaturowe.
Niektóre produkty oraz produkty uboczne naturalnie zachodzących w komórkach procesów metabolicznych mają zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu wliczając w to żywienie, przemysł spożywczy, kosmetyczny oraz farmaceutyczny. Do cząsteczek tych, objętych wspólną nazwą „związków wysokowartościowych”, zalicza się kwasy organiczne, aminokwasy zarówno białkowe, jak i niebiałkowe, nukleotydy i nukleozydy, lipidy i kwasy tłuszczowe, diole, węglowodany, związki aromatyczne, witaminy i kofaktory oraz enzymy. Najwygodniejszym sposobem wytwarzania tych związków jest hodowla na dużą skalę bakterii zdolnych do produkcji i wydzielania dużych ilości cząsteczek pożądanego związku. Szczególnie użytecznym do tego celu organizmem jest Corynebacterium glutamicum, gram-pozytywna; niepatogenna bakteria. Stosując metodę selekcji otrzymano ogromną liczbę szczepów zmutowanych, które produkują cały wachlarz pożądanych związków. Jednakże selekcja szczepów wydajniejszych pod względem produkcji określonej cząsteczki jest procesem czasochłonnym i trudnym.
Przedmiotem wynalazku jest izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego.
Istotą wynalazku jest to, że izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencję do niej komplementarną.
Istotą wynalazku jest również to, że izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, koduje polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencję do niej komplementarną.
Istotą wynalazku jest także to, że izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, koduje naturalnie występującą odmianę alleliczną polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencję do niej komplementarną.
PL 195 942 B1
Istotą kolejnego przedmiotu wynalazku jest to, że cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję nukleotydową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencję do niej komplementarną.
Istotą jeszcze innego przedmiotu wynalazku jest to, że izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencję do niej komplementarną.
Istotą wynalazku jest także to, że izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera fragment obejmujący co najmniej 15 sąsiadujących ze sobą nukleotydów o sekwencji nukleotydowej podanej na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencję do niej komplementarną.
Istotą jeszcze innego przedmiotu wynalazku jest to, że izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną powyżej i sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd heterologiczny.
Przedmiotem wynalazku, jest także wektor.
Istotą wynalazku jest to, że wektor obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku.
Korzystnie, wektor jest wektorem ekspresyjnym.
Przedmiotem wynalazku, jest także komórka gospodarza.
Istotą wynalazku jest to, że komórka gospodarza jest transfekowana wektorem ekspresyjnym według wynalazku.
Korzystnie komórka gospodarza jest komórką mikroorganizmu.
Korzystnie, komórka gospodarza należy do rodzaju Corynebacterium albo Brevibacterium.
W innym korzystnym wariancie, ekspresja cząsteczki kwasu nukleinowego powoduje modulację wytwarzania wysokowartościowych związków chemicznych przez komórkę.
Korzystnie, wysokowartościowy związek jest wybrany z grupy obejmującej: kwasy organiczne, aminokwasy wchodzące w skład białek i nie wchodzące w skład białek, zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy, nukleotydy, lipidy, nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe, diole, węglowodany, związki aromatyczne, witaminy, kofaktory, poliketydy i enzymy.
Przedmiotem wynalazku, jest także sposób wytwarzania polipeptydu.
Istotą wynalazku jest to, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza według wynalazku w odpowiedniej pożywce w taki sposób, że wytwarza ona polipeptyd.
Przedmiotem wynalazku jest również, izolowany polipeptyd.
Istotą wynalazku jest to, że izolowany polipeptyd obejmuje sekwencją aminokwasową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400.
Istotą wynalazku jest również to,że izolowany polipeptyd obejmuje naturalnie występującą odmianę alleliczną polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400.
Istotą kolejnego przedmiotu wynalazku jest to, że izolowany polipeptyd jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id.399.
Istotą jeszcze innego przedmiotu wynalazku jest to, że izolowany polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id.400.
Istotą wynalazku jest także to, że izolowany polipeptyd obejmuje fragment polipeptydu zawierający sekwencję aminokwasową, podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400, przy czym wspomniany fragment utrzymuje aktywność biologiczną typową dla 1,2-dioksogenazy katecholowej.
Istotą wynalazku jest również to, że izolowany polipeptyd jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399.
Korzystnie, izolowany polipeptyd dodatkowo obejmuje heterologiczne sekwencje aminokwasowe.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania wysokowartościowego związku chemicznego.
Istotą wynalazku jest to, że sposób obejmuje hodowanie komórki według wynalazku w taki sposób, że wytwarzany jest wysokowartościowy związek chemiczny.
Korzystnie, sposób dodatkowo obejmuje etap odzyskiwania związku z pożywki hodowlanej.
Korzystnie, stosuje się komórkę należącą do rodzaju Corynebacterium albo Brevibacterium.
W innym korzystnym wariancie stosuje się komórkę wybraną z grupy obejmującej: Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium acetoaci4
PL 195 942 B1 dophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitrophilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium healii, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium paraffinolyticum i szczepy podane na Tablicy 3.
Korzystnie, ekspresja cząsteczki kwasu nukleinowego z wektora powoduje modulowanie wytwarzania wysokowartościowego związku chemicznego.
Korzystnie, wysokowartościowy związek chemiczny jest wybrany z grupy obejmującej: kwasy organiczne, aminokwasy wchodzące w skład białek i nie wchodzące w skład białek, zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy, nukleotydy, lipidy, nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe, diole, węglowodany, związki aromatyczne, witaminy, kofaktory, poliketydy i enzymy.
W innym korzystnym wariancie, związkiem chemicznym jest aminokwas.
Korzystnie, aminokwas jest wybrany z grupy obejmującej: lizynę, glutaminian, glutaminę, alaninę, asparaginian, glicynę, serynę, treoninę, metioninę, cysteinę, walinę, leucynę, izoleucynę, argininę, prolinę, histydynę, tyrozynę, fenyloalaninę i tryptofan.
Przedmiotem wynalazku jest także inny sposób wytwarzania wysokowartościowego związku chemicznego.
Istotą wynalazku jest to, że sposób obejmuje hodowanie komórki, której genomowy DNA zmieniono przez wprowadzenie cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku, jest także sposób diagnozowania obecności albo aktywności Corynebacterium diphteriae u osobnika.
Istotą wynalazku jest to, że sposób obejmuje wykrywanie u osobnika obecności bądź aktywności jednej z cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku lub cząsteczki polipeptydu według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza.
Istotą wynalazku jest to, że komórka gospodarza obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest uszkodzona.
Istotą kolejnego przedmiotu wynalazku jest to, że komórka gospodarza obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje jedną albo wiele modyfikacji w porównaniu do sekwencji Sekw. Nr Id. 399.
Istotą innego przedmiotu wynalazku jest to, że komórka gospodarza obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399, przy czym region regulatorowy cząsteczki kwasu nukleinowego jest zmodyfikowany względem regionu regulatorowego typu dzikiego.
Wynalazek dostarcza nowych cząsteczek bakteryjnego kwasu nukleinowego o rozmaitym zastosowaniu obejmującym identyfikację mikroorganizmów, mogących posłużyć do produkcji związków wysokowartościowych, modulowanie ich syntezy w C.glutamicum lub bakteriach spokrewnionych, rozróżnianie lub identyfikację C.glutamicum lub bakterii spokrewnionych, jako punktów odniesienia przy mapowaniu genomu C.glutamicum oraz jako znaczników do transformacji. Te nowe cząsteczki kwasu nukleinowego kodują białka zwane tu białkami homeostazy i adaptacji (HA).
C.glutamicum jest gram pozytywną, aerobową bakterią, powszechnie stosowaną w przemyśle do produkcji bardzo różnorodnych związków wysokowartościowych, a także degradacji węglowodorów (takich jak w rozlewiskach ropy naftowej) oraz do utleniania terpenoidów. Cząsteczki kwasów nukleinowych HA według wynalazku można zatem wykorzystać do identyfikacji mikroorganizmów mogących posłużyć do produkcji związków wysokowartościowych np. w procesie fermentacji. Celem modulowania produkcji jednego lub więcej związków wysokowartościowych pochodzących z danego mikroorganizmu (np. poprawianie wydajności produkcji lub produkcja jednego lub więcej związków wysokowartościowych pochodzących z gatunków należących do rodzaju Cornynebacterium lub Brevibacterium) zastosować można modulację ekspresji kwasów nukleinowych HA według wynalazku lub modyfikację ich sekwencji.
Kwasy nukleinowe HA według wynalazku mogą być również stosowane do identyfikacji organizmu takiego jak Corynebacterium glutamicum lub blisko z nim spokrewnionego, albo do stwierdzenia obecności C.glutamicum lub organizmu z nim spokrewnionego w mieszanej populacji mikroorganizmów. Wynalazek dostarcza sekwencji kwasów nukleinowych dużej liczby genów C.glutamicum;
PL 195 942 B1 poprzez testowanie ekstrahowanego DNA genomowego z hodowli pojedynczej lub mieszanej populacji mikroorganizmów, sondą łączącą się w ostrych warunkach z charakterystycznym tylko dla C.glutamicum regionem danego genu, można mieć pewność czy organizm ten jest w hodowli obecny. Choć Corynebacterium glutamicum samo w sobie nie jest patogenne, spokrewnione jest z gatunkiem u ludzi patogennym, Corynebacterium diphtheriae (powodującym dyfteryt); wykrywanie takich organizmów ma istotne znaczenie kliniczne.
Cząsteczki kwasów nukleinowych HA według wynalazku mogą także służyć jako punkty odniesienia przy mapowaniu genomu C.glutamicum lub genomów organizmów spokrewnionych. Podobnie, cząsteczki te lub ich warianty albo fragmenty, mogą być stosowane jako znaczniki genetycznie modyfikowanych gatunków Corynebacterium lub Brevibacterium.
Białka HA kodowane przez nowe cząsteczki kwasów nukleinowych według wynalazku są na przykład zdolne do realizacji funkcji związanych z utrzymaniem homeostazy w C.glutamicum lub ze zdolnością tego mikroorganizmu do adaptacji do różnych warunków środowiskowych. Przy dostępności wektorów klonujących stosowanych u Corynebacterium glutamicum, takich jak opisane przez Sinskey i wsp., patent USA nr 4,649,119, oraz technik inżynierii genetycznej stosowanych u C.glutamicum i spokrewnionych gatunków z rodzaju Brevibacterium (np. lactofermentum) (Yoshihama i wsp., J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985); Katsumata i wsp., J. Bacteriol. 15: 306-311 (1984); Santamaria i wsp., J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246 (1984)), cząsteczki kwasów nukleinowych według wynalazku można wykorzystać do celów inżynierii genetycznej u tego organizmu, aby ulepszyć lub podwyższyć wydajność produkcji jednego lub więcej związków wysokowartościowych. Taka ulepszona produkcja lub efektywność produkcji wysokowartościowego związku chemicznego może być spowodowana bezpośrednim lub pośrednim wpływem manipulacji genem według wynalazku.
Istnieje szereg mechanizmów, za pośrednictwem których zmiana białka HA według wynalazku może bezpośrednio wpływać na wydajność i/lub efektywność produkcji wysokowartościowych związków chemicznych przez posiadające takie zmienione białko szczepy C.glutamicum. Przykładowo, przez przebudowanie enzymów, modyfikujących lub degradujących związki aromatyczne lub alifatyczne, tak, że zwiększa się lub zmniejsza ich aktywność lub ilość, można będzie modulować wytwarzanie jednego lub więcej wysokowartościowych związków chemicznych będących produktami modyfikacji lub degradacji tych związków. Podobnie, enzymy uczestniczące w metabolizmie związków nieorganicznych dostarczają kluczowych cząsteczek (np. fosforu, siarki i cząsteczek azotu) dla biosyntezy takich wysokowartościowych związków chemicznych, jak aminokwasy, witaminy i kwasy nukleinowe. Przez zmianę aktywności kilku takich enzymów w C.glutamicum można zwiększyć przekształcenie tych związków nieorganicznych (lub alternatywnie użycie związków nieorganicznych) i tym samym umożliwić zwiększone wbudowanie nieorganicznych atomów do tych wysokowartościowych związków chemicznych. Przebudowa genetyczna enzymów w C.glutamicum uczestniczących w ogólnych procesach komórkowych może również bezpośrednio poprawiać produkcję wysokowartościowych związków chemicznych, bowiem wiele z tych enzymów bezpośrednio modyfikuje te wysokowartościowe związki (np. aminokwasy) lub enzymy uczestniczące w syntezie tych związków lub sekrecji. Modulowanie aktywności lub ilości proteaz komórkowych może również wywierać bezpośrednie działanie na wytwarzanie wysokowartościowych związków chemicznych, bowiem wiele proteaz może degradować te związki lub enzymy uczestniczące w ich wytwarzaniu lub degradacji.
Ponadto, wyżej wspomniane enzymy uczestniczące w modyfikacji lub degradacji aromatycznych/alifatycznych związków, w ogólnych biokatalizach, metabolizmie związku nieorganicznego lub proteolizie same w sobie są wysokowartościowymi związkami, pożądanymi z uwagi na ich aktywność w różnych zastosowaniach przemysłowych in vitro. Przez zmianę liczby kopii genu dla jednego lub większej liczby enzymów w C.glutamicum, można zwiększyć liczbę wytwarzanych przez komórkę białek, zwiększając w ten sposób potencjalną wydajność lub efektywność produkcji tych białek w hodowli C.glutamicum lub w wielkiej skali.
Zmiana białka HA według wynalazku może również bezpośrednio wpływać na wydajność produkcji i/lub efektywność wytwarzania wysokowartościowego związku chemicznego ze szczepu C.glutamicum niosącego takie zmienione białko. Przykładowo, przez modulowanie aktywności i/lub liczby tych białek uczestniczących w konstrukcji lub przebudowie ściany komórkowej może być możliwa modyfikacja struktury samej ściany komórkowej taka, że komórka jest zdolna do lepszej obrony przed mechanicznym lub innymi wstrząsami występującymi w czasie hodowli w fermentorze w wielkiej skali. Również hodowanie na dużą skalę C.glutamicum wymaga znaczącego wytwarzania ściany komórkowej. Modulacja aktywności lub ilości enzymów syntetyzujących lub degradujących ścianę
PL 195 942 B1 komórkową może przyspieszyć biosyntezę ściany komórkowej, co z kolei może umożliwić szybszy wzrost tego mikroorganizmu w hodowli i co za tym idzie zwiększenie liczby komórek wytwarzających wysokowartościowy związek chemiczny.
Przez modyfikowanie enzymów HA według wynalazku można również bezpośrednio wpływać na wydajność lub efektywność produkcji jednego lub większej liczby wysokowartościowych związków chemicznych z C.glutamicum. Przykładowo, wiele ogólnych enzymów w C.glutamicum może mieć znaczący wpływ na ogólne procesy komórkowe (np. procesy regulacyjne), które z kolei mają znaczący wpływ na metabolizm wysokowartościowych związków chemicznych. Podobnie proteazy, enzymy modyfikujące lub degradujące potencjalnie toksyczne aromatyczne lub alifatyczne związki i enzymy powodujące metabolizm związków nieorganicznych mogą służyć zwiększeniu żywotności C.glutamicum. Proteazy wspomagają selektywne usuwanie źle sfałdowanych lub błędnie regulowanych białek, takich jak te, które mogą wystąpić we względnie stresotwórczych warunkach środowiskowych jakie występują w czasie hodowli w fermentorze na dużą skalę. Przez zmianę tych białek możliwe jest dalsze zwiększenie tej aktywności i zwiększenie żywotności C.glutamicum w hodowli. Modyfikacje aromatyczno/alifatyczne lub degradacja białek nie tylko służą detoksyfikacji tych odpadowych związków (które mogą występować jako zanieczyszczenia w pożywce hodowlanej lub jako produkty odpadowe z samych komórek), lecz również pozwalają komórce wykorzystać alternatywne źródła węgla, jeśli optymalne źródło węgla jest w hodowli ograniczone. Przez zwiększenie ich liczby i/lub aktywności zwiększona może być przeżywalność komórek C.glutamicum w hodowli. Białka związane z metabolizmem związków nieorganicznych dostarczają komórce cząsteczek nieorganicznych wymaganych (między innymi) dla syntezy wszystkich białek i nukleotydów i co za tym idzie są krytyczne dla ogólnej żywotności komórki. Zwiększona liczba żywych komórek wytwarzających, w hodowli na wielką skalę jeden lub więcej pożądanych wysokowartościowych związków chemicznych, prowadzi w efekcie do towarzyszącego temu zwiększenia wydajności produkcji i/lub efektywności produkcji wysokowartościowych związków chemicznych w hodowli.
Wynalazek dostarcza nowych cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują białka określone tu jako białka HA, które są przykładowo zdolne do realizacji funkcji wymaganej dla zachowania homeostazy w C.glutamicum lub uczestniczą w zdolności mikroorganizmu do adaptacji do różnych warunków środowiskowych. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące białko HA są określone tu jako cząsteczki kwasu nukleinowego HA. W korzystnej postaci białko HA uczestniczy w biosyntezie lub przebudowie ściany komórkowej C.glutamicum lub w metabolizmie związków nieorganicznych, modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych lub posiada aktywność enzymatyczną lub proteolityczną C.glutamicum. Przykłady takich białek obejmują te, które są kodowane przez geny zestawione w Tablicy 1.
Tak więc, jeden aspekt wynalazku dotyczy wyizolowanych cząsteczek kwasów nukleinowych (np. cDNA, DNA lub RNA) zawierających sekwencję nukleotydową kodującą białko HA lub biologicznie aktywne jego fragmenty, jak również dotyczy fragmentów kwasów nukleinowych stosowanych jako startery lub sondy w hybrydyzacji do wykrywania lub amplifikacji kwasów nukleinowych kodujących HA (np. DNA lub mRNA).
W innych szczególnie korzystnych postaciach, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje z lub jest homologiczna do sekwencji nukleotydowej lub jej fragmentów, przedstawionej jako nieparzysta Nr ID. 399 na Liście Sekwencji co najmniej w około 50%, korzystnie co najmniej w około 60%, korzystniej co najmniej w około 70%, 80% lub 90%, zaś najkorzystniej co najmniej w około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i więcej. W innych korzystnych postaciach, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEKW. Nr ID. 400 w Liście Sekwencji. Korzystne białka HA według wynalazku, korzystnie mają co najmniej jedną aktywność HA spośród tu opisanych.
W innej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje białko lub jego fragment, który zawiera sekwencję aminokwasową wystarczająco homologiczną do sekwencji aminokwasowej według wynalazku np. homologiczną w takim stopniu, że dane białko lub jego część posiada aktywność HA. Korzystnie białko lub jego fragment kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zachowują zdolność uczestnictwa w utrzymaniu homeostazy w C.glutamicum lub przeprowadzenia funkcji związanej z adaptacją tego mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych. W jednej postaci, białko kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jest co najmniej w około 50%, korzystnie co najmniej w około 60%, korzystniej co najmniej w około 70%, 80% lub 90%, zaś najkorzystniej co najmniej w około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i bardziej homologiczne do sekwencji aminokwasowej
PL 195 942 B1 według wynalazku (np. całkowitej sekwencji aminokwasowej wybranej spośród sekwencji o parzystym numerze na Liście Sekwencji). Białko, w innej korzystnej postaci, stanowi całkowitej długości białko C.glutamicum, które jest zasadniczo homologiczne do całkowitej sekwencji aminokwasowej wynalazku.
W innej korzystnej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego dostarczona z C.glutamicum i kodująca białko (np. białko fuzyjne HA), zawierające biologicznie aktywną domenę homologiczną w co najmniej około 50% lub więcej do sekwencji aminokwasowej według wynalazku, jest zdolna do uczestnictwa w naprawie lub rekombinacji DNA, w transpozycji materiału genetycznego, w ekspresji genu (np. w procesach transkrypcji lub translacji), w fałdowaniu białka lub w wydalaniu białka u Corynebacterium C.glutamicum lub posiada jedną lub więcej aktywności przedstawionych w Tablicy 1 i która również zawiera heterologiczne sekwencje kwasów nukleinowych kodujące heterologiczne polipeptydy lub rejony regulatorowe.
W innej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego ma długość co najmniej 15 nukleotydów i hybrydyzuje w ostrych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową według wynalazku. Korzystnie wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego odpowiada naturalnie występującej cząsteczce kwasu nukleinowego. Bardziej korzystnie wyizolowany kwas nukleinowy koduje naturalnie występujące białko HA C.glutamicum lub biologicznie aktywną jego część.
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy genetycznie modyfikowanego mikroorganizmu, do którego wprowadzono, bądź w którym zmieniono gen HA. W jednej postaci, genom mikroorganizmu został zmieniony poprzez wprowadzenie w formie transgenu cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku kodującej dziką lub zmutowaną sekwencję HA. W innej postaci, endogenny gen HA znajdujący się w genomie mikroorganizmu został zmieniony, np. funkcjonalnie uszkodzony, metodą rekombinacji homologicznej z użyciem zmienionego genu HA. W jeszcze innej postaci, endogenny bądź wprowadzony gen HA w mikroorganizmie zmieniono poprzez jedną lub więcej mutacji punktowych, delecji lub inwersji, nie powodując jednak utraty zdolności kodowania funkcjonalnego białka HA. W kolejnej postaci, jeden lub więcej spośród rejonów regulatorowych genu HA (np. promotor, represor lub induktor) mikroorganizmu zmieniono (np. poprzez delecję, skrócenie, inwersję lub mutację punktową) w taki sposób, że ekspresja genu HA uległa modulacji. W korzystnej postaci, mikroorganizm należy do rodzaju Corynebacterium lub Brevibacterium, najkorzystniej zaś zalicza się do Corynebacterium glutamicum. W korzystnej postaci, mikroorganizm jest także wykorzystywany do produkcji pożądanego związku, takiego jak aminokwas, a w szczególności lizyny.
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy wyizolowanego białka HA lub jego części np. biologicznie aktywnej jego części. W korzystnej postaci wyizolowane białko HA lub jego część może uczestniczyć w utrzymaniu homeostazy C.glutamicum lub przeprowadzić funkcję związaną z adaptacją tego mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych. W innej korzystnej postaci, wyizolowane białko HA lub jego część jest wystarczająco homologiczna do sekwencji aminokwasowej według wynalazku w taki sposób, że białko lub jego część zachowuje zdolność do brania udziału w utrzymaniu homeostazy C.glutamicum lub przeprowadzenia funkcji związanej z adaptacją tego mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych.
Wynalazek dostarcza także wyizolowanego preparatu białka HA. W korzystnej postaci białko HA zawiera sekwencję aminokwasową według wynalazku. W innej korzystnej postaci, wynalazek dotyczy wyizolowanego białka o pełnej długości, które jest zasadniczo homologiczne do całkowitej sekwencji aminokwasowej według wynalazku (kodowanej przez otwartą ramkę odczytu zestawioną z odpowiadającą jej sekwencją o nieparzystym numerze na Liście Sekwencji). W kolejnej korzystnej postaci białko jest homologiczne do całkowitej sekwencji aminokwasowej według wynalazku co najmniej w około 50%, korzystnie co najmniej w około 60%, korzystniej co najmniej w około 70%, 80% lub 90%, zaś najkorzystniej co najmniej w około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej. W innej postaci wyizolowane białko HA zawiera sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w około 50% lub więcej homologiczna do sekwencji aminokwasowej według wynalazku i zdolne jest do brania udziału utrzymaniu homeostazy C.glutamicum lub przeprowadzenia funkcji związanej z adaptacją tego mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych posiada jedną lub więcej spośród aktywności zestawionych w Tablicy 1.
Alternatywnie, wyizolowane białko HA może zawierać sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje, na przykład w ostrych warunkach, lub jest homologiczna do całkowitej sekwencji nukleotydowej według wynalazku w około 50%, korzystnie co najmniej w około 60%, korzystniej co najmniej w około 70%, 80% lub 90%, zaś najkorzystniej co najmniej
PL 195 942 B1 w około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i bardziej. Pożądanym jest także, aby korzystne formy białek HA miały jedną lub więcej spośród opisanych tutaj bioaktywności HA.
Polipeptyd HA lub jego biologicznie aktywna część, można skutecznie połączyć z polipeptydem nie będącym HA celem wytworzenia białka fuzyjnego. W korzystnej postaci, takie fuzyjne białko posiada aktywność, która różni się od aktywności samego białka HA. W innych korzystnych postaciach, zastosowanie takiego białka fuzyjnego powoduje podwyższenie wydajności, produkcji i/lub efektywności produkcji pożądanego związku wysokowartościowego u C.glutamicum. W szczególnie korzystnej postaci, integracja białka fuzyjnego w komórce gospodarza moduluje w niej produkcję pożądanego związku.
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy metod modulacji produkcji cząsteczek przez mikroorganizmy. Metody te obejmują kontaktowanie komórek z reagentem modulującym aktywność białka HA lub ekspresję kwasu nukleinowego HA w taki sposób, że aktywność komórek podlega zmianom względem aktywności przy braku reagenta. W korzystnej postaci, komórka modulowana jest z uwagi na jeden lub więcej procesów związanych z biosyntezą lub przebudową ściany komórkowej, metabolizmem związków nieorganicznych, modyfikacją lub degradacją związków aromatycznych lub alifatycznych lub z uwagi na aktywność enzymatyczną lub proteolityczną. Reagent modulujący aktywność białka HA może być reagentem stymulującym aktywność białka HA lub ekspresję kwasu nukleinowego HA. Do reagentów stymulujących aktywność białka HA lub ekspresję kwasu nukleinowego HA zaliczają się małe cząsteczki, aktywne białka HA i kwasy nukleinowe kodujące białka HA, wprowadzone do komórek. Do reagentów hamujących aktywność HA lub ekspresję zaliczają się małe cząsteczki oraz antysensowne cząsteczki kwasów nukleinowych HA.
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy metod modulacji wydajności pożądanego związku z komórek, obejmujących wprowadzanie do komórek dzikich lub zmutowanych genów HA utrzymywanych bądź na oddzielnych plazmidach bądź zintegrowanych z genomem komórek gospodarza. Integracja z genomem zajść może losowo, bądź drogą rekombinacji uprawnionej w taki sposób, że dany gen zastępowany jest przez wprowadzoną kopię, co powoduje produkcję pożądanego związku w modulowanej komórce. W korzystnej postaci wydajności są podwyższone. W innej korzystnej postaci, związkiem chemicznym jest związek wysokowartościowy. W szczególnie korzystnej postaci, wzmiankowany związek wysoko wartościowy jest aminokwasem. W szczególnie korzystnej postaci takim aminokwasem jest L-lizyna.
Niniejszy wynalazek dostarcza kwasu nukleinowego HA i cząsteczek białka zaangażowanych u C.glutamicum w biosyntezę lub przebudowę ściany komórkowej, metabolizm związków nieorganicznych, modyfikację lub degradację związków aromatycznych lub alifatycznych lub które mają aktywność enzymatyczną lub proteolityczną C.glutamicum. Cząsteczki według wynalazku mogą być wykorzystywane do modulowania produkcji związków wysokowartościowych u mikroorganizmów, takich jak C.glutamicum albo przez bezpośrednie działanie (np. gdy nadekspresja lub optymalizacja aktywności białka uczestniczącego w produkcji wysokowartościowego związku chemicznego (np. enzymu) ma bezpośredni wpływ na wydajność, produkcję i/lub efektywność produkcji wysokowartościowego związku chemicznego w modyfikowanym C.glutamicum) albo przez pośredni wpływ, który jednak daje w efekcie wzrost wydajności, produkcji i/lub efektywności produkcji żądanego związku (np. gdy modulacja aktywności lub liczby kopii aromatycznej lub alifatycznej modyfikacji lub degradacji białka prowadzi do zwiększenia żywotności komórek C.glutamicum, dzięki czemu z kolei wzrasta produkcja w hodowli w dużej skali. Dalsze aspekty wynalazku są przedstawione poniżej.
I. Związki wysokowartościowe
Pojęcie związku wysokowartościowego znane jest w nauce i obejmuje cząsteczki produkowane przez organizm, mające zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu, jak między innymi przemysł kosmetyczny farmaceutyczny oraz rolnictwo. Do takich związków zalicza się kwasy organiczne takie, jak kwas winowy, kwas itakonowy i kwas diaminopimelinowy, zarówno białkowe jak i niebiałkowe aminokwasy, zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy i nukleotydy (jak opisane np. w Kuninaka,
A. (1996) Nucleotides and related compounds, str.561-612, w Biotechnology tom 6, Rehm i wsp. wyd. VCH: Weinheim i odnośniki do literatury tam zawarte), lipidy, zarówno nienasycone jak i nasycone kwasy tłuszczowe (np. kwas arachidonowy), diole (np. propanodiol, butanodiol), węglowodany (np. kwas hialuronowy i trehaloza), związki aromatyczne (np. aminy aromatyczne, wanilina i indygo), witaminy i kofaktory (jak opisane w Encyklopedii Ullmanna Industrial Chemistry, tom A27, „Vitamins”, str. 443-613 (1996 VCH: Weinheim i odnośniki do literatury tam zawarte; oraz Ong, A.S., Niki, E.&Packer, L. (1995) „Nutrition, Lipids, Health, and Disease” Proceedings of the UNESCO/-Confederation of Scientific
PL 195 942 B1 and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free radical Research-Asia, Sept. 1-3, 1994 w Penang, Malezja, AOCS Press, (1995)), enzymy, poliketydy (Cane i wsp. (1998) Science 282:63-68), i wszystkie inne związki chemiczne opisane w Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN; 0818805086 i odnośniki do literatury tam zawarte. Metabolizm i zastosowanie niektórych spośród powyższych związków wysokowartościowych omówiono poniżej.
A. Metabolizm i zastosowanie aminokwasów
Aminokwasy stanowią podstawowe jednostki strukturalne wszystkich białek i jako takie niezbędne są do normalnego funkcjonowania komórek wszystkich organizmów. Termin „aminokwas” jest znany w nauce. Istnieje 20 aminokwasów białkowych służących jako strukturalne jednostki białek, w których są one połączone za pomocą wiązań peptydowych, podczas gdy aminokwasy niebiałkowe (poznano ich kilkaset) normalnie nie są znajdowane w białkach (patrz Encyklopedia Ullmanna Industrial Chemistry, tom A2, str. 57-95 VCH: Weinheim (1985)). Aminokwasy mogą posiadać konfigurację optyczną D lub L, choć ogólnie rzecz biorąc jedynie aminokwasy typu L znajdują się w naturalnie występujących białkach. Szlaki biosyntezy i degradacji każdego z 20 aminokwasów białkowych są dobrze poznane zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych (patrz. Stryer, L. Biochemia, wydanie 3, strony 578-590 (1988)). Aminokwasy „niezbędne” (histydyna, izoleucyna, leucyna, lizyna, metionina, fenyloalanina, treonina, tryptofan oraz walina) noszą tę nazwą, ponieważ z uwagi na złożoność ich biosyntezy wymagane są w pożywieniu, z łatwością przekształcane są drogą prostych szlaków biosyntezy do pozostałych 11 aminokwasów endogennych (alanina, arginina, asparagina, asparaginian, cysteina, glutaminian, glutamina, glicyna, prolina, seryna oraz tyrozyna). Wyżej zorganizowane zwierzęta zachowały zdolność do syntezy niektórych spośród tych aminokwasów, lecz aminokwasy niezbędne muszą być w diecie dostarczane, aby mogła zachodzić normalna synteza białek.
Poza udziałem w biosyntezie białek, powyższe aminokwasy są interesujące również jako związki chemiczne, a wiele z nich znalazło rozmaite zastosowania w żywieniu, przemyśle spożywczym, chemicznym, kosmetycznym, rolniczym oraz farmaceutycznym. Lizyna jest istotnym aminokwasem w żywieniu nie tylko ludzi, lecz także zwierząt jednożołądkowych, takich jak drób i trzoda chlewna. Glutaminian jest najpowszechniej używany jako dodatek zapachowy (glutaminian monosodu, MSG) i szeroko stosowany w przemyśle spożywczym, tak jak i asparaginian, fenyloalanina, glicyna oraz cysteina. Glicyna, L-metionina i tryptofan są wykorzystywane w przemyśle farmaceutycznym. Glutamina, walina, leucyna, izoleucyna, histydyna, arginina, prolina, seryna oraz alanina stosowane są zarówno w przemyśle farmaceutycznym, jak i kosmetycznym. Zaś treonina, tryptofan oraz D/L-metionina są popularnymi dodatkami w żywieniu (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, p. 466-502, Rhem i wsp. (eds) Biotechnology tom 6, rozdział 14a, VCH: Weinheim). Ponadto aminokwasy te okazały się przydatne jako prekursory do produkcji syntetycznych aminokwasów i białek, takich jak N-acetylocysteina, S-karboksymetylo-L-cysteina, (S)-5-hydroksytryptofan oraz inne opisane w Encyclopedia of Industrial Chemistry autorstwa Ulmanna, tom A2, str. 57-97, VCH: Weinheim, 1985.
Biosynteza aminokwasów naturalnych przez zdolne do ich produkcji organizmy, takie jak bakterie, została dobrze scharakteryzowana (w celu zapoznania się z bakteryjną biosyntezą aminokwasów i jej regulacją patrz. Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606). Glutaminian syntezowany jest na drodze redukcyjnej animacji a-ketoglutaranu, związku pośredniego w cyklu kwasu cytrynowego. Glutamina, prolina oraz arginina są, każda z osobna, produkowane z glutaminianu. Substratem do biosyntezy seryny jest 3-fosfoglicerynian (produkt pośredni glikolizy), który w trzyetapowym procesie, w wyniku którego powstaje seryna, podlega kolejno utlenieniu, transaminacji i hydrolizie. Zarówno cysteina jak i glicyna produkowane są z seryny; pierwsza poprzez reakcję kondensacji homocysteiny z seryna, zaś druga w rezultacie przeniesienia atomu węgla z pozycji b łańcucha bocznego na tetrahydrofolian w reakcji katalizowanej przez transhydroksymetylaze serynową. Fenyloalanina i tyrozyna syntetyzowane są z erytrozo-4-fosforanu i fosfoenolopirogronianu będących prekursorami glikolizy i szlaku fosfopentozowego, w dziewięcio-etapowych procesach biosyntezy różniących się między sobą jedynie dwoma końcowymi etapami po etapie syntezy prefenolanu. Również tryptofan produkowany jest z tych dwóch prekursorowych cząsteczek, lecz jego synteza jest procesem 11 etapowym. Tyrozyna może być także syntetyzowana z fenyloalaniny w reakcji katalizowanej przez hydroksylazę fenyloalaninową. Alanina, walina oraz leucyna stanowią biosyntetyczne pochodne pirogronianu, będącego końcowym produktem glikolizy. Asparaginian powstaje ze szczawiooctanu, produktu pośredniego w cyklu kwasu cytrynowego. Asparagina, metionina, treonina oraz lizyna są produktem przekształcenia asparaginianu. Isoleucyna powstaje z treoniny. Histydyna powstaje w wyniku
PL 195 942 B1 złożonego, 9-etapowego procesu z 5-fosforybozylo-1-pirofosforanu, będącego aktywowaną formą cukru.
Aminokwasy dostarczane w nadmiarze wobec białek nie są magazynowane, lecz degradowane celem dostarczenia związków pośrednich wykorzystywanych w głównych szlakach biosyntezy w komórce (patrz. Stryer, L. Biochemia wyd. 3 rozdział 21 „Amino Acids Degradation and me Urea Cycle”, str. 495-516 (1988)). Chociaż komórka jest w stanie przekształcać niepotrzebne aminokwasy w użyteczne metabolity pośrednie, produkcja aminokwasów jest dla niej kosztowna zarówno pod względem energetycznym, jak i pod względem cząsteczek prekursorowych oraz enzymów koniecznych do ich syntezy. Nie jest zatem zaskakujące, że biosynteza aminokwasów jest regulowana poprzez inhibicję na zasadzie sprzężenia zwrotnego, gdzie obecność danego aminokwasu prowadzi do zwolnienia lub całkowitego zakończenia jego produkcji (celem zapoznania się z mechanizmami sprzężeń zwrotnych w biosyntezie aminokwasów, patrz. Stryer, L. Biochemia, wyd. 3 rozdział 24: „Biosynthesis of Amino Acids and Heme”, str. 576-600(1988)). Zatem produkcja jakiegokolwiek aminokwasu jest ograniczana przez jego ilość w komórce.
B. Metabolizm i zastosowania witamin, kofaktorów oraz związków odżywczych
Witaminy, kofaktory oraz związki odżywcze wchodzą w skład kolejnej grupy cząsteczek, których zdolność syntezy została utracona przez organizmy wyższe i które muszą być w związku z tym przyjmowane w pokarmie, choć z łatwością syntetyzowane są przez inne organizmy takie, jak bakterie. Cząsteczki te są same z siebie związkami aktywnymi biologicznie, bądź też są prekursorami związków biologicznie aktywnych, mogących stanowić nośniki elektronów lub produkty pośrednie w rozmaitych szlakach metabolicznych. Poza wartością odżywczą, związki te mają również istotne znaczenie przemysłowe, jako czynniki barwiące, antyoksydanty oraz katalizatory lub inne związki wspomagające procesy metaboliczne. (Celem zapoznania się ze strukturą, aktywnością i zastosowaniem przemysłowym tych związków, patrz np. Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry „Vitamins”, tom A27, str. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Pojęcie „witamina” jest znane w nauce i obejmuje składniki odżywcze, które konieczne są do normalnego funkcjonowania organizmu, lecz których organizm nie potrafi sam syntetyzować. Do grupy witamin można zaliczyć kofaktory i związki odżywcze („nutraceutical”). Termin „kofaktor” obejmuje niebiałkowe związki wymagane do wystąpienia normalnej aktywności enzymatycznej. Mogą to być związki organiczne lub nieorganiczne; cząsteczki kofaktorów według wynalazku są najczęściej organiczne. Pojęcie „związku odżywczego” obejmuje substancje uzupełniające w diecie, mające korzystny wpływ na zdrowie roślin i zwierząt, a szczególnie ludzi. Przykładem takich cząsteczek są witaminy, antyoksydanty, a także pewne tłuszcze (np. wielonienasycone kwasy tłuszczowe).
Biosynteza tych cząsteczek w organizmach zdolnych je syntezować, takich, jak bakterie, została szeroko opisana (Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry „Vitamins”, tom A27, str. 443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A. S., Niki, E. & Parker, L. (1995) „Nutrition, Lipids, Health, and Disease” Proceedings of the Unesco/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research - Asia, held Spet. 1-3, 1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press: Champaign, ILX, 374 S).
Tiamina (witamina B1) wytwarzana jest w procesie chemicznego połączenia pirimidyny z cząsteczkami tiazolu. Ryboflawina (witamina B2) syntetyzowana jest z guanozyno-5'-tri-fosforanu (GTP) i rybozo-5ifosforanu. Ryboflawina z kolei, wykorzystywana jest do syntezy mononukleotydu flawiny (FMN) oraz adeninowego dinukleotydu flawiny (FAD). Wszystkie substancje należące do rodziny związków objętych łączną nazwą „witamina B6” (np. pirydoksyna, pirydoksamina, pirydokso-5ifosforan oraz handlowo stosowany chlorowodorek pirydoksyny), są pochodnymi wspólnej jednostki strukturalnej, 5-hydroksy-6-metylopirydyny. Pantotenian (kwas pantotenowy, (R)-(+)-N-(2,4-dihydroksy-3,3-dimetylo-1-oksobutylo)-b-alanina) może być produkowany na drodze syntezy chemicznej bądź fermentacji. Ostatnim etapem w biosyntezie pantotenianu jest reakcja kondensacji b-alaniny i kwasu pantowego z użyciem energii pochodzącej z ATP. Poznano enzymy odpowiedzialne za etapy biosyntezy obejmujące konwersję do kwasu pantowego, b-alaniny oraz kondensację do kwasu pantotenowego. Aktywną metabolicznie formą pantotenianu jest Koenzym A, którego biosynteza przebiega w pięciu enzymatycznych etapach. Pantotenian, pirydoksalo-5MOsforan, cysteina oraz ATP są prekursorami Koenzymu A. Wspomniane enzymy nie tylko katalizują tworzenie pantotenianu, lecz także produkcję kwasu (R)-pantowego, (R)-pantolaktonu, (R)-pantenolu (prowitamina B5), pantoteiny (i jej pochodnych) oraz koenzymu A.
PL 195 942 B1
Biosynteza biotyny z cząsteczki prekursorowej pimeloilo-CoA była szczegółowo badana u mikroorganizmów, dzięki czemu zidentyfikowano kilka genów w nią zaangażowanych. Okazało się, że wiele z odpowiadających im białek bierze także udział w syntezie związków wiążących Fe, oraz że należą do białek klasy nifS. Kwas liponowy jest pochodną kwasu oktanowego i jest wykorzystywany jako koenzym w metabolizmie energetycznym, gdzie staje się częścią kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej i dehydrogenazy a-ketoglutaranowej. Foliany są grupą związków pochodnych kwasu foliowego, który z kolei jest pochodną kwasu L-glutaminowego, kwasu p-amino-benzoesowego oraz
6-metylopteryny. Biosyntezę kwasu foliowego i jego pochodnych badano szczegółowo u niektórych mikroorganizmów, poczynając od metabolicznych produktów pośrednich guanozyno-5'-trifosfo-ranu (GTP), kwasu L-glutaminowego oraz p-amino-benzoesowego.
Korynoidy (takie jak kobalaminy, a w szególności witamina B12) oraz porfiryny należą do grupy związków chemicznych charakteryzujących się tetrapirolowym układem pierścieniowym. Biosynteza witaminy B12 jest na tyle złożona, że nie została jeszcze całkowicie opisana, lecz poznano już wiele enzymów i substratów, biorących w niej udział. Kwas nikotynowy (nikotynian) i nikotynamid są pochodnymi pirydyny zwanymi również Tiacynamh Niacyna jest prekursorem ważnego koenzymu NAD (dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy) i NADP (fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego) i ich zredukowanych form.
Produkcja tych związków na dużą skalę w większości opiera się na niekomórkowej syntezie chemicznej, jednakże niektóre z tych związków chemicznych - jak ryboflawina, witamina B6, pantotenian i biotyna, są produkowane na dużą skalę w hodowlach mikroorganizmów. Jedynie witamina B12 z powodu złożoności procesu jej syntezy, produkowana jest wyłącznie poprzez fermentacją. Metody in vitro wymagają czasu i znacznego nakładu materiałów często bardzo kosztownych.
C. Metabolizm i zastosowania puryn, pirymidyn, nukleozydów i niukleotydów.
Metabolizm genów puryn, pirymidyn i odpowiadających im białek stanowi ważny cel w terapii nowotworów i infekcji wirusowych. Pojęcie „puryna” lub „pirymidyna” odnosi się do zasad azotowych będących składnikami kwasów nukleinowych, koenzymów i nukleotydów. Pojęcie „nukleotyd” odnosi się do podstawowych strukturalnych jednostek cząsteczek kwasów nukleinowych, które składają się z zasady azotowej, pentozy (w przypadku RNA cukrem jest ryboza; w przypadku DNA D-deoksyryboza) i kwasu fosforowego. Pojęcie „nukleozyd” odnosi się do cząsteczek nukleotydów, które służą jako prekursor, nie posiadających kwasu fosforowego, który występuje w nukleotydach. Poprzez hamowanie biosyntezy tych cząsteczek lub ich gotowości do tworzenia cząsteczek kwasów nukleinowych możliwe jest hamowanie syntezy RNA i DNA; dzięki hamowaniu tej aktywności w komórkach nowotworowych, można ograniczyć zdolność tych komórek do podziału i replikacji. Istnieją także nukleotydy nie wchodzące w skład cząsteczek kwasów nukleinowych, ale służące raczej jako zapas energetyczny (tj. AMP) lub jako koenzymy (tj. FAD i NAD).
Zastosowanie tych związków chemicznych do celów medycznych poprzez wpływanie ich na metabolizm puryn i/lub pirymidyn zostało opisane w kilku publikacjach (np. Christopherson, R.I. Lyons, S.D. (1990) „Potent inhibitors of de novo pyrimidine nad purine biosynthesis as chemotherapeutic agetns.” Med. Res. Reviews 10:505-548). Badania enzymów zaangażowanych w metabolizm puryn i pirymidyn skupiały się na rozwoju nowych leków, które mogą być użyte jako np. immunosupresory lub antyproliferanty (Smith, J.L., (1995) „Enzymes in nucleotide symesis” Curr. Opin. Struct. Biol. 5:752-757; (1995) Biochem Soc. Transact. 23:877-902). Jednakże zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy i nukleotydy mają inne zastosowania: jako związki pośrednie w biosyntezie kilku związków wysokowartościowych (np. tiaminy, S-adenozylometioniny, folianów lub ryboflawiny), jako nośniki energii dla komórki (np. ATP lub GTP)i dla samych związków chemicznych wykorzystywanych zwykle jako wzmacniacze smaku (np. IMP lub GMP) lub dla kilku zastosowań medycznych (patrz np. Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology tom 6, Rehm i wsp., eds. VCH: Weinheim str 561-612). Enzymy zaangażowane w metabolizm puryn, pirymidyn, nukleozydów lub nukleotydów są także często wykorzystywane jako cele dla związków chemicznych stosowanych do ochrony upraw, do których należą fungicydy, herbicydy i środki owadobójcze.
Scharakteryzowano metabolizm tych związków w bakteriach (patrz np. Zalkin, H., Dixson, J.E. (1992) „de novo purine nucleotide biosynthesis” Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, tom 42, Academic Press:, str. 259-287; Michal, G. (1999) „Nucleotides and Nucleosides” rozdział 8: Biochemical Pathway: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley: New York). Metabolizm puryn był obiektem intensywnych badań i jest kluczowy dla normalnego funkcjonowania komórki. Metabolizm wolnych puryn u zwierząt wyższych może doprowadzić do ciężkich schorzeń
PL 195 942 B1 takich jak skaza moczanowa. Nukleotydy purynowe syntetyzowane są z rybozo-5-fosforanu w kilku etapach poprzez związek pośredni inozyno-5Mcsforan (IMP) prowadząc do produkcji guanozyno-5^monofosforanu (GMP) lub adenozyno-5^monofosforanu (AMP), z których z łatwością powstają związki trifosforanowe wykorzystywane jako nukleotydy. Związki te są także wykorzystywane jako energetyczny zapas, a ich degradacja zapewnia energię dla wielu różnych komórkowych procesów biochemicznych. Biosynteza pirymidyn przebiega poprzez tworzenie urydyno-5^monofosforanu (UMP) z rybozo-5-fosforanu. UMP jest następnie przekształcany do cytydyno-5'-trifosforanu (CTP). Formy deoksy wszystkich tych nukleotydów wytwarzane są w jednoetapowej reakcji redukcji z difosforanowej formy rybozydo dwufosforanowej formy deoksyrybozy danego nukleotydu. Pod wpływem fosforylacji cząsteczki te stają się zdolne do brania udziału w syntezie DNA.
D. Metabolizm i zastosowania trehalozy
Trehaloza składa się z dwóch cząsteczek glukozy połączonych wiązaniem a,a-1,1. Jest ona powszechnie stosowana w przemyśle spożywczym jako słodzik, dodatek do suszonej lub mrożonej żywności oraz napojów. Jednakże ma również zastosowania w przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznym oraz biotechnologicznym (patrz. np. Nishmoto i wsp., (1998) patent USA nr 5,759,610; Singer, M.A. i Lindiquist, S. (1998) Trends Biotech. 16: 460-467; Paiva, C.L.A. i Panek, A.D. (1996) Biotech. Ann. Rev. 2: 293-314; oraz Shiosaka, M. (1997) J.Japan 172: 97-102). Trehaloza produkowana jest przez enzymy występujące u wielu organizmów i jest naturalnie wydzielana do pożywki, z której może być zbierana za pomocą metod dobrze znanych w technice.
II. Zachowanie homeostazy w C.glutamicum i adaptacja środowiskowa
Metaboliczne i inne procesy biochemiczne, dzięki którym komórki funkcjonują, są wrażliwe na warunki środowiskowe, takie jak temperatura, ciśnienie, stężenie substancji rozpuszczonych i dostępność tlenu. Gdy jeden lub więcej takich warunków środowiskowych jest zaburzonych lub zmienionych w sposób, który nie jest zgodny z normalnym funkcjonowaniem tych procesów komórkowych, komórka musi działać aby zachować środowisko wewnątrzkomórkowe, które umożliwi przebieg tych procesów niezależnie od wrogości środowiska zewnątrzkomórkowego. Komórki bakterii gram dodatnich, takie jak komórki C.glutamicum, posiadają szereg mechanizmów, dzięki którym zachowana może być wewnętrzna homeostaza niezależnie od niesprzyjających warunków środowiskowych. Obejmują one ścianę komórkową, białka, które są zdolne do degradacji potencjalnych toksycznych związków aromatycznych i alifatycznych, mechanizmy proteolizy, dzięki którym mogą być szybko degradowane źle sfałdowane lub błędnie regulowane białka i katalizatory pozwalające na zachodzenie reakcji wewnątrzkomórkowych, które normalnie nie zachodzą w warunkach optymalnych dla wzrostu bakterii.
Poza jedynie przeżyciem we wrogim środowisku komórki bakterii (np. komórki C.glutamicum) są również często zdolne do adaptacji, tak że są w stanie czerpać korzyści z takich warunków. Przykładowo, komórki w środowisku pozbawionym pożądanych źródeł węgla mogą przystosować się do wzrostu na mniej użytecznym źródle węgla. Również komórki mogą być w stanie wykorzystać mniej pożądane związki nieorganiczne, gdy niedostępne są powszechnie stosowane. Komórki C.glutamicum posiadają szereg genów, które pozwalają im na przystosowanie się do wykorzystywania cząsteczek nieorganicznych i organicznych, które nie byłyby normalnie wykorzystywane w optymalnych warunkach wzrostu jako substancje odżywcze i prekursory dla metabolizmu. Zagadnienia związane z wewnątrzkomórkowymi procesami uczestniczącymi w homeostazie i adaptacji są ponadto omówione poniżej.
A. Modyfikacja i degradacja związków aromatycznych i alifatycznych
Komórki bakterii są w naturze powszechnie wystawione na różne związki aromatyczne i alifatyczne. Związki aromatyczne są cząsteczkami organicznymi posiadającymi pierścień cykliczny, podczas gdy związki alifatyczne są cząsteczkami organicznymi o strukturze otwartego łańcucha a nie pierścieniowej. Takie związki mogą powstawać jako produkty uboczne procesów przemysłowych (np. benzen lub toluen) lecz mogą również być wytwarzane przez określone mikroorganizmy (np. alkohole). Wiele z tych związków jest toksycznych dla komórek, szczególnie związki aromatyczne, które są wysoce reaktywne dzięki wysokiej energii układu pierścieniowego. Co za tym idzie, pewne bakterie wykształciły mechanizmy, dzięki którym są zdolne do modyfikacji lub degradacji tych związków, tak że nie są one dłużej niebezpieczne dla komórki. W komórkach mogą znajdować się enzymy, które są zdolne do, przykładowo, hydroksylacji, izomeryzacji lub metylowania związków aromatycznych lub alifatycznych tak, że stają się one albo mniej toksyczne lub tak, że zmodyfikowana postać może podlegać obróbce przez typowe komórkowe szlaki usuwania odpadów i degradacji. Komórki mogą również posiadać enzymy, które są zdolne do specyficznej degradacji jednej lub większej liczby potencjalnie
PL 195 942 B1 niebezpiecznych substancji, a co za tym idzie ochrony komórki. Zasady i przykłady tego typów modyfikacji i procesów degradacji w bakteriach są opisane w kilku publikacjach np. H. Sahm (1999) „Procaryotes in Industrial Producion” w Lengeler, J.W. i wsp., wyd., Biology of me Procaryotes, Thieme Verlag: Stuttgart i Schlegel, H.G. (1992) Algemeine Mikrobiologie, Thieme: Sztutgart).
Poza prostą inaktywacją niebezpiecznych aromatycznych lub alifatycznych związków, wiele bakterii rozwinęło zdolność do wykorzystywania takich związków jako źródeł węgla dla podtrzymania metabolizmu, gdy korzystne dla komórki, źródło węgla jest niedostępne. Przykładowo, znane są szczepy Pseudomonas mogące wykorzystywać jako źródło węgla toluen, benzen i 1,10-dichlorodekan (Chang,
B.V. i wsp. (1997) Chemosphere 35(12): 2807-2815; Wischnak, C. i wsp., (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64(9): 3507-3511; Churchill, S.A. i wsp., (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65(2): 549-552). Istnieją podobne przykłady dla wielu innych gatunków bakterii, które są znane w stanie techniki.
Zaczęto wykorzystywać zdolność określonych bakterii do modyfikowania lub degradacji związków aromatycznych i alifatycznych. Ropa naftowa jest złożoną mieszaniną substancji chemicznych, które obejmują cząsteczki alifatyczne i aromatyczne. Stosując bakterie posiadające zdolność do degradacji lub modyfikacji tych toksycznych związków, przykładowo w przypadku rozlanego oleju, można wyeliminować większość zniszczeń środowiska z dużą wydajnością i przy niskim koszcie (patrz przykładowo Smith, M.R. (1990) „The biodegradation of aromatic hydrocarbons by bacteria” Biodegradation 1(2-3): 191-206; i Suyam, T i wsp., (1998) „Bacterial isolates degrading aliphatic polycarbonates” FEMS Microbiol. Lett. 161(2): 255-261).
B. Metabolizm związków nieorganicznych
Komórki (np. komórki bakterii) zawierają ogromne ilości różnych cząsteczek, takich jak woda, jony nieorganiczne i substancje organiczne (np. białka, cukry i inne makrocząsteczki). Ogromna masa typowej komórki zawiera jedynie cztery rodzaje atomów: węgiel, tlen, wodór i azot. Choć stanowią one procentowo niewielką część komórki, substancje nieorganiczne są równie ważne dla prawidłowego funkcjonowania komórki. Cząsteczki takie obejmują fosfor, siarkę, wapń, magnez, żelazo, cynk, mangan, miedź, molibden, wolfram i kobalt. Wiele z tych związków jest krytycznych dla tworzenia ważnych cząsteczek, takich jak nukleotydy (fosfor) i aminokwasy (azot i siarka). Inne z tych jonów nieorganicznych służą jako kofaktory w reakcjach enzymatycznych lub wspomagają ciśnienie osmotyczne. Wszystkie takie cząsteczki muszą być pobrane przez bakterie z otaczającego środowiska.
Pożądane jest aby każdy z tych związków nieorganicznych bakteria mogła pobrać w postaci najłatwiejszej do wykorzystania przez typowe mechanizmy metaboliczne komórki. Jednak, bakteria może przeciwstawić się środowiskom, w których te korzystne postaci nie są łatwo dostępne. Dla przeżycia w takich warunkach ważne jest, aby bakteria posiadała dodatkowe mechanizmy biochemiczne zdolne do przekształcenia mniej metabolicznie aktywnych, lecz łatwo dostępnych postaci tych związków nieorganicznych do postaci, które mogą być użyte w metabolizmie komórkowym. Bakteria często posiada szereg genów kodujących realizujące ten cel enzymy, które nie ulegają ekspresji, jeśli pożądany rodzaj związku nieorganicznego nie jest dostępny. Co za tym idzie geny te dla metabolizmu różnych związków nieorganicznych służą jako kolejne narzędzie, którego bakteria może użyć dla adaptacji w suboptymalnych warunkach środowiskowych .
Po węglu, najważniejszym składnikiem komórki jest azot. Typowa komórka bakteryjna zawiera 12-15% azotu. Jest on składnikiem aminokwasów i nukleotydów, jak również wielu innych, ważnych, występujących w komórce cząsteczek. Ponadto, azot może służyć jako substytut tlenu, jako końcowy akceptor elektronu w metabolizmie energii. Dobre źródła azotu obejmują wiele związków organicznych i nieorganicznych, takich jak gazowy amoniak lub sole amonowe (np. NH4Cl, (NH4)2SO4 lub NH4OH), azotany, mocznik, aminokwasy lub złożone źródła azotu jak syrop kukurydziany, mąka sojowa, białko z soi, ekstrakt z drożdży, ekstrakt z mięsa, itp. Azot z amoniaku jest przyswajany przez działanie szczególnych enzymów: dehydrogenazy glutaminianowej, syntazy glutaminianowej i aminotransferazy glutamino-2-oksyglutarowej. Przeniesienie amino-azot z jednej cząsteczki organicznej na inną jest wykonane przez aminotransferazy, klasę enzymów, przenoszących jedną grupę aminową z alfa-aminokwasu na alfa-ketokwas. Azotan może być redukowany przez reduktazę azotanową, reduktazę azotynową i dalej enzymy redoks, aż do ich przekształcenia w cząsteczkę azotu lub amoniaku, która może być łatwo wykorzystana przez komórkę w typowych szlakach metabolicznych.
Fosfor typowo znajduje się wewnątrz komórki zarówno w postaci organicznej jak i nieorganicznej i może być pobrany przez komórkę również w którejś z tych postaci, aczkolwiek większość mikroorganizmów preferencyjnie pobiera nieorganiczny fosforan. Przekształcenie organicznego fosforanu do postaci, którą może wykorzystać komórka, wymaga działania fosfataz (np. fitaz, które hydrolizują
PL 195 942 B1 fosforan dając fitan i pochodne inozytolu). Fosforan jest kluczowym elementem w syntezie kwasów nukleinowych i również pełni znaczącą rolę w komórkowym metabolizmie energii (np. w syntezie ATP, ADP i AMP).
Siarka jest wymagana dla syntezy aminokwasów (np. metioniny i cysteiny), witamin (np. tiaminy, biotyny i kwasu lipoidowego) i białek żelazowo-siarkowych. Bakterie uzyskują siarkę głównie z nieorganicznych siarczanów, chociaż powszechnie wykorzystywane są również: tiosiarczany, siarczyny i siarczki. W warunkach, w których związki te nie są łatwo dostępne, wiele bakterii wyraża geny umożliwiające wykorzystanie związków sulfonianowych takich jak 2-aminosulfonian (tauryna) (Kertesz, M. A. (1993) „Proteins Induced by Sulphate Limitation in Escherichia coli, Pseudomonas putida or Staphylococcus aureus” J. Bacteriol. 175:1187-1190).
Inne atomy nieorganiczne np. metalu lub jony wapnia są również krytyczne dla żywotności komórek. Przykładowo, żelazo odgrywa kluczową rolę w reakcjach redoks i jest kofaktorem białek żelazowo-siarkowych, białek hemu i cytochromów. Pobranie żelaza przez komórki bakterii może być spowodowane działaniem syderoforów, czynników chelatujących wiążących zewnątrzkomórkowe jony żelaza i przenoszących je do wnętrza komórki. Dla opisu metabolizmu żelaza i innych związków nieorganicznych patrz: Langeler i wsp., (1999) Biology of Prokaryotes, Thieme Verlag: Studgart; Neidhardt, F.C. i wsp., wyd. Escherichia coli and Salmonella. ASM Press: Waszyngton D.C.; Sonenshein, A. L. i wsp., wyd. (1999) Bacillus subtilis and other Gram-positive Bacteria, ASM Press: Waszyngton
D.C. Voed, D. i Voed J.G. (1992) Biochemie, VCH: Weinheim; Brock, T.D. i Madigan, M.T. (1991) Biology of Microorganisms Prentice Hall: Englewood Cliffs, str. 267-269; Rhodes, P.M. i Stanbury, P.F. Applied Microbial Physiology -A Practicał Approach, Oxford Univ. Press: Oxford.
C. Enzymy i proteoliza
Wewnątrzkomórkowe warunki, do których bakteria, taka jak C.glutamicum, jest optymalnie przystosowana, często nie są tymi warunkami, w których wiele reakcji biochemicznych zachodziłoby normalnie. Aby umożliwić przebieg takich reakcji w warunkach fizjologicznych komórki wykorzystują enzymy. Enzymy są białkowymi katalizatorami biologicznymi orientującymi przestrzennie reagujące cząsteczki lub dostarczającymi specyficznego środowiska, tak że bariera energetyczna dla reakcji biochemicznej jest obniżona. Różne enzymy katalizuj ą różne reakcje i każdy enzym może być podmiotem transkrypcyjnej, translacyjnej lub posttranslacyjnej regulacji tak, że reakcja będzie zachodziła jedynie w odpowiednich warunkach i określonym czasie. Enzymy mogą uczestniczyć w degradacji (np. proteazy), syntezie (np. syntazy) lub modyfikacji (np. transferazy lub izomerazy) związków i wszystkie te enzymy umożliwiają wytwarzanie w komórce niezbędnych związków. To z kolei zapewnia zachowanie homeostazy komórki.
Jednak, fakt że enzymy działają optymalnie w warunkach fizjologicznych, w których bakteria jest najbardziej żywotna, oznacza, że gdy warunki środowiskowe ulegną zaburzeniu, istnieje istotna możliwość, że aktywność enzymu również ulegnie zaburzeniu. Przykładowo, zmiany temperatury mogą powodować nieprawidłowe składanie się białek, i to samo dotyczy również zmian pH. Składanie białka w znacznym stopniu zależy od elektrostatycznych i hydrofobowych oddziaływań aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym tak, że jakakolwiek zmiana ładunków pojedynczych aminokwasów (która może powstać przez zmianę komórkowego pH) może mieć zaburzający wpływ na zdolność białka do poprawnego składania się. Zmiany temperatury skutecznie zmieniają ilość energii kinetycznej posiadanej przez cząsteczkę polipeptydu, która wpływa na zdolność polipeptydu do przyjmowania poprawnej postaci, konfiguracji energetycznie stabilnej. Źle złożone białka mogą być szkodliwe dla komórki z dwóch powodów. Po pierwsze, źle złożone białko może mieć podobnie zaburzoną aktywność lub nie posiadać aktywności. Po drugie, źle złożone białka mogą być pozbawione obszarów konformacyjnych niezbędnych dla prawidłowej regulacji przez inne systemy komórkowe i co za tym idzie mogą być aktywne w sposób niekontrolowany.
Komórka posiada mechanizm, dzięki któremu źle złożone enzymy i białka regulatorowe mogą być szybko zniszczone przez proteolizę, zanim dojdzie do jakiegokolwiek uszkodzenia komórki. Białka takie jak te z rodziny la/lon i należące do rodziny Clp rozpoznają specyficznie i niszczą źle złożone białka (patrz np. Sherman, M.Y., Goldberg, A.L. (1999) AXS 77: 57-78 i zawarte w niej cytowania i Porankiewicz J. (1999) Molec. Microbiol. 32(3): 449-58 i zawarte w niej cytowania, Neidhardt, F.C., i wsp., (1996) E. coli and Salmonella, ASM Press: Waszyngton, D.C. i zawarte w niej cytowania i Pri-tchard, G.G. i Coolbear, T. (1993) FEMS Microbiol. Rev. 12(1-3): 179-206 i zawarte w niej cytowania). Enzymy te wiążą się ze źle złożonymi lub nie złożonymi białkami i degradują je zależnie od ATP. Co za tym idzie, proteoliza służy jako ważny mechanizm wykorzystywany przez komórkę dla
PL 195 942 B1 zapobieżenia zniszczeniu normalnych funkcji komórkowych w wyniku zmian środowiskowych, a ponadto pozwoli komórkom przeżyć w warunkach i środowiskach, które inaczej byłyby toksyczne z powodu błędnej regulacji i/lub zaburzonej aktywności lub regulacji enzymu.
Proteoliza posiada również istotne funkcje w komórce w optymalnych warunkach środowiskowych. W normalnych procesach metabolicznych proteazy uczestniczą w hydrolizie wiązań peptydowych, w katabolizmie złożonych cząsteczek w celu dostarczenia niezbędnych produktów degradacji, i w modyfikacji białka. Wydzielane proteazy odgrywają ważną rolę w katabolizmie zewnątrzkomórkowych substancji odżywczych, nawet przed wniknięciem tych związków do komórki. Ponadto, sama aktywność proteolityczna może pełnić funkcje regulatorowe; sporulacja u B. subtilis i przechodzenie do kolejnych etapów cyklu komórkowego u Caulobacter spp., o których wiadomo, że są regulowane przez kluczowe przypadki proteolizy zachodzące u każdego z tych gatunków (Gottesman, S. (1999) Curr. Opin. Microbiol. 2(2): 142-147). Tak więc procesy proteolizy są kluczowe dla przeżycia komórki zarówno w suboptymalnych jak i optymalnych warunkach środowiskowych i uczestniczą w utrzymaniu homeostazy komórek.
D. Wytwarzanie ściany komórkowej i przebudowy
Podczas gdy biochemiczna maszyneria komórki może być zdolna do szybkiej adaptacji do różnych i przypuszczalnie niekorzystnych środowisk, komórki nadał wymagają ogólnego mechanizmu, dzięki któremu mogą być chronione przed środowiskiem. Dla wielu bakterii ściana komórki zapewnia taką ochronę i pełni również rolę w adhezji, wzroście komórki i podziale i transporcie pożądanego, rozpuszczalnego i odpadowego materiału.
Dla funkcjonowania komórki wymagają wewnątrzkomórkowych stężeń metabolitów i innych cząsteczek, które są znacząco wyższe niż występujące w otaczającej pożywce. Ponieważ metabolity te są w znacznym stopniu chronione przed opuszczeniem komórki dzięki obecności hydrofobowej błony, system wykazuje skłonność do przepuszczania do komórki ze środowiska zewnętrznego cząsteczek rozpuszczonych w wodzie tak, że wewnętrzne stężenia rozpuszczonych cząsteczek odpowiadają stężeniom na zewnątrz. Rozpuszczone w wodzie cząsteczki są zdolne do łatwego przekraczania błony komórkowej i błona ta nie jest w stanie zapobiec ich wypływaniu i ciśnieniu, które może doprowadzić do osmotycznej lizy komórki. Sztywność ściany komórkowej w znacznym stopniu zwiększa zdolność komórki do tolerowania tych ciśnień i stanowi dodatkową barierę dla niepożądanej dyfuzji tych metabolitów i pożądanych, rozpuszczonych substancji z komórki. Podobnie ściana komórkowa służy zapobieganiu wnikaniu do komórki niepożądanego materiału.
Ściana komórkowa uczestniczy również w wielu innych procesach komórkowych takich jak adhezja, wzrost komórki i podział. Dzięki temu, że ściana komórkowa całkowicie otacza komórkę, jakiekolwiek oddziaływanie komórki z otoczeniem musi zachodzić za pośrednictwem ściany komórkowej. Zatem ściana komórki musi uczestniczyć w jakimkolwiek przyleganiu komórki do innej komórki i do pożądanych powierzchni. Ponadto, komórka nie może rosnąć lub dzielić się bez towarzyszących temu zmian w ścianie komórkowej. Ponieważ ochrona, którą zapewnia ściana, wymaga jej obecności podczas wzrostu, morfogenezy i namnażania się, to jednym z kluczowych etapów w podziale komórki jest synteza ściany komórkowej tak, że nowa komórka oddziela się od starej. Tak więc często biosynteza ściany komórkowej jest regulowana równocześnie ze wzrostem komórki i podziałem komórki (patrz np. Sonenshein, A.L. i wsp., wyd. (1993) Bacillus subtilis and Other Gram-positive Bacteria, ASM: Waszyngton D.C.).
Struktura ściany komórkowej jest inna u bakterii gram dodatnich i gram ujemnych. Jednak, w obu typach funkcjonalna jednostka strukturalna ściany pozostaje taka sama: zachodząca na siebie siatka dwóch polisacharydów, N-acetyloglukozaminy (NAG) i kwasu N-acetylomuraminowego (NAM), które są usieciowane przez aminokwasy (najczęściej L-alaninę, D-glutaminian, kwas diaminopimelinowy i D-alaninę), nazwane „peptydo-glikanem”. Znane są procesy uczestniczące w syntezie ściany komórkowej (patrz np. Michał, G., wyd. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley: Nowy Jork).
U gram ujemnych bakterii wewnętrzna błona komórkowa jest opłaszczona przez pojedynczą warstwę peptydoglikanu (o grubości około 10 nM) określonej jako otoczka mureinowa. Ta struktura peptydoglikanu jest bardzo twarda i jej postać określa kształt organizmu. Zewnętrzna powierzchnia otoczki mureinowej jest pokryta zewnętrzną błoną zawierającą poryny i inne białka błonowe, fosfolipidy i lipopolisacharydy. Dla utrzymania ścisłego związku z błoną zewnętrzną ściana komórkowa bakterii gram ujemnej posiada również rozrzucone cząsteczki lipidów służące do zakotwiczenia jej w otaczającej błonie.
PL 195 942 B1
U bakterii gram dodatniej, takiej jak Corynebacterium glutamicum, błona cytoplazmatyczna jest pokryta wielowarstwowym peptydoglikanem o grubości w zakresie 20 -80 nm (patrz np. Legeler i wsp. (1999) Biology of Procaryotes, Thieme Verlag: Stutgart, str. 913-918, str. 875-899 i str. 88-109 i zawarte w niej cytowania). Ściana komórkowa bakterii gram dodatnich zawiera również kwas teichoinowy, polimer glicerolu lub rybitolu związanych za pośrednictwem grup fosforanowych. Kwas teichoinowy jest również zdolny do wiązania się z aminokwasami i tworzy wiązania kowalencyjne z kwasem muraminowym. W ścianie komórkowej mogą występować również kwasy lipoteichoinowe i teichuronowe. Jeśli występują te kwasy, struktury powierzchni komórkowej, takie jak wici lub kapsułki, będą również zakotwiczone w tej warstwie.
III. Elementy i sposoby według wynalazku
Obecny wynalazek opiera się, przynajmniej częściowo, na odkryciu nowych cząsteczek określonych tu jako kwas nukleinowy HA i cząsteczek białka, które uczestniczą w utrzymaniu homeostazy w C.glutamicum, lub które realizują funkcje związane z adaptacją mikroorganizmów do różnych warunków środowiskowych. W pewnej postaci cząsteczki HA uczestniczą w biosyntezie ściany komórkowej C.glutamicum lub w przebudowach, w metabolizmie związków nieorganicznych, w modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych, lub posiadają aktywność enzymatyczną lub proteolityczną. W korzystnej postaci aktywność cząsteczek HA według obecnego wynalazku dotyczy biosyntezy ściany komórkowej C.glutamicum lub przebudowy, metabolizmu związków nieorganicznych, modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych lub aktywność enzymatyczna lub proteolityczna ma wpływ na wytwarzanie przez ten organizm pożądanych wysoko wartościowych związków chemicznych. W szczególnie korzystnej postaci, cząsteczki HA według wynalazku mają aktywność modulującą, tak, że procesy komórkowe C.glutamicum w których uczestniczą cząsteczki HA (np. biosynteza lub przebudowy ściany komórkowej C.glutamicum, metabolizm związków nieorganicznych, modyfikacja lub degradacja związków aromatycznych lub alifatycznych lub aktywność enzymatyczna lub proteolityczna) mają również zmienioną aktywność, powodując zarówno bezpośrednio lub pośrednio modulację wydajności, produkcji i/lub efektywności produkcji pożądanego wysokowartościowego związku chemicznego w C.glutamicum.
Określenie „białko HA” lub „polipeptyd HA” obejmuje białka uczestniczące w wielu procesach komórkowych związanych z homeostazą C.glutamicum lub zdolnością komórek C.glutamicum do przystosowania się do niekorzystnych warunków środowiskowych. Przykładowo białko HA może uczestniczyć w biosyntezie lub przebudowie ściany komórkowej C.glutamicum, metabolizmie związków nieorganicznych w C.glutamicum, w modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych w C.glutamicum, lub może posiadać enzymatyczną lub proteolityczną aktywność C.glutamicum. Przykłady białek HA obejmują białka kodowane przez geny HA podane w Tablicy 1 i w Id. Sekw. Nr o numerach nieparzystych.
Pojęcia „gen HA” lub „sekwencja kwasu nukleinowego HA” obejmują sekwencje kwasów nukleinowych kodujące białko HA, składające się z regionu kodującego oraz położonych w kierunku 5' i 3' od niego regionów nie podlegających translacji. W Tablicy1zestawiono przykłady genów HA. Pojęcia „produkcja” czy „produktywność” są znane wnauce i dotyczą stężenia produktu fermentacji (na przykład pożądanego związku wysokowartościowego) wytworzonego w danym czasie i danej objętości fermentacyjnej (np. kg produktu na godzinę na litr). Pojęcie „efektywności produkcji” dotyczy czasu koniecznego do osiągnięcia danego poziomu produkcji (na przykład, jak dużo czasu zajmuje komórce osiągnięcie danego tempa produkcji związku wysokowartościowego). Pojęcie „wydajności” lub „wydajności produkt/węgiel” jest w znane w nauce i dotyczy efektywności przekształcania substratu (źródło węgla) w produkt (tj. związek wysokowartościowy). Zapisywane jest to ogólnie jako, na przykład, kilogram produktu na kilogram źródła węgla. Poprzez zwiększanie wydajności lub produkcji związku, zwiększa się liczba uzyskiwanych cząsteczek czy też uzyskiwanych przydatnych cząsteczek tego związku w hodowli o danej wielkości na dany czas. Określenia „biosynteza” lub „szlak biosyntezy” są znane w nauce i obejmują przebiegającą w komórce syntezę związków, w szczególności związków organicznych, ze związków pośrednich, w ściśle regulowanym i wieloetapowym procesie. Określenie „degradacja” lub „szlak degradacji” są znane w nauce i obejmują przebiegający w komórce rozkład związków, w szczególności związków organicznych, do produktów ich degradacji (czyli ogólnie rzecz biorąc, mniejszych lub mniej złożonych cząsteczek) w ściśle regulowanym i wieloetapowym procesie. Termin „metabolizm” jest znany w nauce i obejmuje całokształt biochemicznych reakcji zachodzących w organizmie. Zatem na metabolizm danego związku (np. metabolizm aminokwasu takiego jak glicyna) składa się całość biosyntezy, modyfikacji i degradacji tego związku w komórce. Określenie
PL 195 942 B1 „homeostaza” obejmuje wszystkie mechanizmy wykorzystywane przez komórkę w celu utrzymania stałego środowiska wewnątrzkomórkowego mimo niekorzystnych warunków zewnątrzkomórkowych. Nie ograniczającym przykładem takich procesów jest wykorzystanie ściany komórkowej dla zapobiegania lizie osmotycznej spowodowanej wysokimi stężeniami rozpuszczalnych substancji wewnątrzkomórkowych. Termin „adaptacja” lub „adaptacja do warunków środowiskowych” jest znany w nauce i obejmuje mechanizmy wykorzystywane przez komórkę dla zachowania zdolności komórki do przeżycia w niesprzyjających warunkach środowiskowych (ogólnie mówiąc takich warunkach środowiskowych, w których nie występuje ani jedna ani więcej korzystnych substancji odżywczych, lub takich warunkach środowiskowych, w których temperatura, pH, osmolarność, procentowa zawartość tlenu i im podobne, odbiegają od optymalnych warunków życia komórki). Wiele komórek, w tym komórki
C.glutamicum, posiada geny kodujące białka, które są wyrażane w takich warunkach środowiskowych i które umożliwiają dalszy wzrost w takich suboptymalnych warunkach.
W kolejnej postaci cząsteczki HA według wynalazku są zdolne do modulowania produkcji pożądanej cząsteczki takiej jak wysokowartościowy związek chemiczny w mikroorganizmie, takim jak C.glutamicum. Istnieje szereg mechanizmów, dzięki którym zmiana białka HA według wynalazku może bezpośrednio wpływać na wydajność, produkcję i/lub efektywność produkcji wysokowartościowych związków chemicznych w szczepie C.glutamicum zawierającym takie zmienione białko. Przykładowo, przez przebudowę enzymów modyfikujących lub degradujących związki aromatyczne lub alifatyczne, polegającą na zwiększeniu lub zmniejszeniu aktywności lub ilości enzymów będzie możliwe modulowanie produkcji jednego lub więcej wysokowartościowych związków chemicznych będących produktami modyfikacji lub degradacji tych związków. Podobnie, enzymy uczestniczące w metabolizmie związków nieorganicznych dostarczają kluczowych cząsteczek (np. fosforu, siarki lub cząsteczek azotu) dla biosyntezy takich wysokowartościowych związków chemicznych jak aminokwasy, witaminy i kwasy nukleinowe. Przez zmianę aktywności lub ilości tych enzymów w C.glutamicum będzie możliwe zwiększenie konwersji tych związków nieorganicznych (lub użycie alternatywnych związków nieorganicznych), co pozwala na zwiększenie poziomu wbudowywania związków nieorganicznych do tych wysokowartościowych związków chemicznych. Przebudowa genetyczna enzymów C.glutamicum biorących na ogół udział w procesach komórkowych może również zwiększać produkcję wysokowartościowych związków chemicznych, bowiem wiele takich enzymów bezpośrednio modyfikuje wysokowartościowe związki chemiczne (np. aminokwasy) lub enzymy uczestniczące w syntezie lub sekrecji tych związków. Modulacja aktywności lub liczby proteaz komórkowych może również mieć bezpośredni wpływ na produkcję wysokowartościowych związków chemicznych, bowiem wiele proteaz może degradować te związki lub enzymy uczestniczące w wytwarzaniu lub degradacji związków.
Ponadto wyżej wspomniane enzymy uczestniczące w modyfikacji lub degradacji związku aromatycznego/alifatycznego w biokatalizie, w metabolizmie związku nieorganicznego lub proteolizie, same w sobie są cennymi związkami chemicznymi pożądanymi z uwagi na ich aktywność w różnych, przemysłowych zastosowaniach in vitro. Przez zmianę, liczby kopii genu dla jednego lub większej liczby takich enzymów w C.glutamicum możliwe będzie zwiększenie ilości tych białek wytwarzanych przez komórkę, co za tym idzie zwiększenie potencjalnej wydajności lub efektywności produkcji tych białek w hodowlach C.glutamicum lub pokrewnych bakterii w wielkiej skali.
Zmiana białka HA według wynalazku może również bezpośrednio wpłynąć na wydajność, produkcję i/lub efektywność produkcji wysokowartościowych związków chemicznych w szczepie C.glutamicum, który zawiera tak zmienione białko. Przykładowo, przez modulowanie aktywności i/lub liczby tych białek uczestniczących w konstruowaniu lub przebudowie ściany komórkowej możliwa będzie modyfikacja struktury samej ściany komórkowej tak, że komórka będzie zdolna do lepszego przetrzymania mechanicznego lub innych wstrząsów występujących podczas fermentacji w wielkiej skali. Również, hodowla C.glutamicum w wielkiej skali wymaga znacznego wytwarzania ściany komórkowej. Modulacja aktywności lub ilości enzymów dla biosyntezy lub degradacji ściany komórkowej może zwiększyć szybkość biosyntezy ściany komórkowej, co z kolei może umożliwić szybszy wzrost tych mikroorganizmów w hodowli i co za tym idzie większą liczbę komórek wytwarzających żądany wysoko wartościowy związek chemiczny.
Modyfikując enzymy HA według wynalazku można również pośrednio wpływać na wydajność, produkcję lub efektywność produkcji jednego lub więcej wysokowartościowych związków chemicznych w C.glutamicum. Przykładowo, wiele enzymów w C.glutamicummoże mieć znaczący wpływ na ogólne procesy komórkowe (np. procesy regulujące), co z kolei ma znaczący wpływ na metabolizm wysokowartościowych związków chemicznych. Podobnie, proteazy, enzymy, które modyfikują lub degradują
PL 195 942 B1 potencjalnie toksyczne związki aromatyczne lub alifatyczne i enzymy promujące metabolizm związków nieorganicznych, uczestniczą w zwiększeniu żywotności C.glutamicum. Proteazy pomagają w selektywnym usuwaniu źle złożonych lub źle regulowanych białek, takich jak te, które mogą wystąpić przy stosunkowo wstrząsowych warunkach środowiskowych podczas fermentacji w wielkiej skali. Zmieniając te białka można będzie dalej zwiększyć tę aktywność i poprawić żywotność C.glutamicum w hodowli. Modyfikacja związku aromatycznego/alifatycznego lub degradacja białek służy nie tylko do detoksyfikacji tych związków odpadowych (które mogą być traktowane jako zanieczyszczenia w pożywce hodowlanej lub jako produkty odpadowe samych komórek) lecz również umożliwia wykorzystywanie przez komórki alternatywnych źródeł węgla, jeśli optymalne źródło węgla występuje w hodowli w ilościach ograniczonych. Zwiększając ich ilość i/lub aktywność, można zwiększyć przeżywalność komórek C.glutamicum w hodowli. Białka według wynalazku związane z metabolizmem związków nieorganicznych zaopatrują komórkę w cząsteczki nieorganiczne wymagane dla syntezy wszystkich białek i nukleotydów (między innymi) i co za tym idzie są krytyczne dla ogólnej żywotności komórki. Zwiększona ilość żywotnych komórek wytwarzających jeden lub więcej pożądanych wysokowartościowych związków chemicznych w hodowli w wielkiej skali, powinna równocześnie spowodować zwiększenie wydajności, produkcji i/lub efektywności produkcji wysokowartościowych związków chemicznych w hodowli.
Wyizolowane sekwencje kwasu nukleinowego według wynalazku zawarte są w genomie szczepu Corynobacterium glutamicum, dostępnego w American Type Culture Collection, oznaczonego jako ATCC 13032. Sekwencje nukleotydowe izolowanych DNA dla HA C.glutamicum oraz domniemane sekwencje aminokwasowe białek HA C.glutamicum przedstawione są na Liście Sekwencji, jako odpowiednio - SEKW. Nr ID. o numeracji nieparzystej oraz SEKW. Nr ID. o numeracji parzystej.
Przeprowadzono analizy obliczeniowe, które pozwoliły sklasyfikować i/lub zidentyfikować wspomniane sekwencje nukleotydowe, jako sekwencje kodujące białka, które uczestniczą w biosyntezie lub przebudowie ściany komórkowej C.glutamicum, w metabolizmie związków nieorganicznych, modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych lub które mają enzymatyczną lub proteolityczną aktywność C.glutamicum.
Niniejszy wynalazek dotyczy także białek posiadających sekwencję aminokwasową zasadniczo homologiczną do sekwencji aminokwasowych według wynalazku. Przyjęto, że białko, którego sekwencja aminokwasową jest zasadniczo homologiczna do wybranej sekwencji aminokwasowej, musi być przynajmniej homologiczne w 50% do wybranej sekwencji aminokwasowej, np. do całkowitej wybranej sekwencji aminokwasowej. Białko posiadające sekwencję aminokwasową zasadniczo homologiczną do wybranej sekwencji aminokwasowej, może posiadać sekwencję do niej homologiczną także co najmniej w około 50%, korzystnie co najmniej w około 60-70%, korzystniej co najmniej w około 70-80%, 80-90% lub 80-95%, zaś najkorzystniej co najmniej w około 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną.
Białko HA lub aktywna biologicznie jego część lub fragment według wynalazku mogą brać udział w transporcie do wnętrza C.glutamicum wysokoenergetycznych cząsteczek węglowych takich, jak glukoza, bądź też uczestniczyć w wewnątrzkomórkowym przekaźnictwie sygnału u tego mikroorganizmu czy wreszcie, posiadać jedną lub więcej funkcji zestawionych w Tablicy 1.
Rozmaite aspekty wynalazku opisano dalej szczegółowo w następujących podsekcjach:
A. Izolowane cząsteczki kwasu nukleinowego
Jeden z aspektów wynalazku dotyczy izolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących polipeptydy HA lub jego biologicznie aktywne części, jak również fragmentów kwasu nukleinowego wystarczających do zastosowania w charakterze sond do hybrydyzacji czy też starterów do identyfikacji lub amplifikacji kwasu nukleinowego kodującego HA (np. DNA dla HA). Przyjęto, że pojęcie „cząsteczka kwasu nukleinowego” ma obejmować cząsteczki DNA (np. cDNA lub DNA genomowe) i RNA (np. mRNA), a także analogiczne DNA lub RNA utworzone za pomocą analogów nukleotydowych.
Pojęcie to dotyczy również nie podlegających translacji sekwencji umiejscowionych zarówno na końcu
3' jak i 5' regionu kodującego genu: co najmniej około 100 nukleotydów sekwencji położonej w kierunku 5' rejonu kodującego i co najmniej około 20 nukleotydów sekwencji położonej w kierunku 3' rejonu kodującego genu. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jedno- lub dwuniciowa, lecz korzystna jest forma dwuniciowa. „Wyizolowana” cząsteczka kwasu nukleinowego to taka cząsteczka, która została oddzielona od innych cząsteczek kwasu nukleinowego obecnych w miejscu stanowiącym naturalne źródło kwasu nukleinowego. „Wyizolowana” cząsteczka kwasu nukleinowego w korzystnej formie nie zawiera sekwencji naturalnie flankujących ją w genomowym DNA organizmu, z którego
PL 195 942 B1 została uzyskana (tj. sekwencji położonych na końcach 5' i 3' kwasu nukleinowego). Na przykład w rozmaitych postaciach, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego HA może zawierać mniej niż około 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0,5kb lub 0,1kb sekwencji nukleinowych naturalnie flankujących cząsteczkę kwasu nukleinowego w genomowym DNA komórki, z której ten kwas nukleinowy uzyskano (np. komórki C.glutamicum). Co więcej, jeśli „wyizolowana” cząsteczka kwasu nukleinowego, taka jak cząsteczka DNA, została uzyskana za pomocą technik rekombinacji, może być w znacznym stopniu pozbawiona pozostałego materiału komórkowego lub pożywki hodowlanej, a w przypadku syntezy chemicznej - chemicznych prekursorów lub innychzwiązków chemicznych.
Cząsteczkę kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, np. cząsteczkę kwasu nukleinowego posiadającą sekwencję nukleotydową o nieparzystym numerze na Liście Sekwencji lub jej fragment, można wyizolować za pomocą standardowych technik biologii molekularnej oraz zawartej tu informacji o sekwencji. Na przykład, DNA dla HA C.glutamicum można wyizolować z biblioteki C.glutamicum przy użyciu całości lub części jednej z sekwencji o nieparzystym numerze SEKW. Nr ID. na Liście Sekwencji stanowiącej sondę do hybrydyzacji, a także standardowych technik hybrydyzacji (np. jak opisane w Sambrook, J., Fritsh, E.F., i Maniatis,T. Molecular Cloning: A Labolatory Manual. 2nd. Ed., Cold Spring Harbor Labolatory, Cold Sprong Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca całość lub część jednej z sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku może zostać wyizolowana przy zastosowaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z użyciem starterów oligonukleotydowych zaprojektowanych na podstawie tej sekwencji (np. cząteczki kwasu nukleinowego zawierającej całość lub część jednej z sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku może być wyizolowana przy zastosowaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z użyciem starterów zaprojektowanych na podstawie tej samej sekwencji). Na przykład, mRNA może zostać wyizolowany z normalnych komórek śródbłonka (np. z zastosowaniem procedury ekstrakcji tiocyjanianem guanidyny według Chirwing i wsp. (1979) Biochemistry18:5294-5299), zaś DNA można uzyskać za pomocą odwrotnej transkryptazy (np. Moloney odwrotna transkryptaza MLV dostępna w Gibco/BRL, Bethesda, MD; lub odwrotna transkryptaza AMV dostępna w Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Syntetyczne startery oligonukleotydowe do amplifikacji metodą łańcuchowej reakcji polimerazy mogą być zaprojektowane na podstawie jednej z sekwencji nukleotydowych przedstawionych na Liście Sekwencji. Kwas nukleinowy według wynalazku może zostać zamplifikowany za pomocą cDNA lub wymiennie, genomowego DNA, jako matrycy oraz odpowiednich starterów oligonukleotydowych, zgodnie ze standardowymi technikami amplifikacji PCR. Tak powielony kwas nukleinowy może zostać wklonowany do odpowiedniego wektora i scharakteryzowany poprzez analizę sekwencji. Ponadto oligonukleotydy odpowiadające sekwencji nkleotydowej HA mogą być uzyskane przy zastosowaniu standardowych technik syntezy np. przy użyciu automatycznego syntezatora DNA.
W korzystnej postaci, wyizolowana cząteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera jedną z sekwencji nukleotydowych przedstawionych na Liście Sekwencji. Sekwencje kwasów nukleinowych według wynalazku, jak zostało to przedstawione na Liście Sekwencji, odpowiadają cząsteczkom DNA dla HA Corynobacterium glutamicum według wynalazku. Powyższe DNA zawiera sekwencje kodujące białka HA (tj. „region kodujący” wskazany w każdej nieparzyście numerowanej sekwencji SEKW. Nr ID.: na Liście Sekwencji), jak również niepodlegające translacji sekwencje 5' i 3' wskazane w każdej nieparzystej SEKW. Nr ID.: na Liście Sekwencji. Alternatywnie, cząsteczka kwasu nuleinowego może także zawierać wyłącznie kodujący rejon którejkolwiek z sekwencji kwasów nukleinowych umieszczonych na Liście Sekwencji.
Dla celów niniejszego zgłoszenia stosownym wydaje się, że każda z sekwencji kwasów nukleinowych lub aminokwasów zestawiona na Liście Sekwencji posiada numer identyfikacyjny RXA, RXN, RXS lub RXC oznaczony jako „RXA”, „RXN”, „RXS” lub „RXC”, po którym następuje 5 cyfr (tj. RXA02458, RXN00249, RXS00153 lub RXC00963). Każda z sekwencji kwasu nukleinowego składa się z co najwyżej trzech części: rejonu położonego powyżej końca 5' rejonu kodującego, rejonu kodującego i rejonu położonego poniżej końca 3' rejonu kodującego. Celem uniknięcia nieładu w nomenklaturze, każdemu z tych trzech rejonów przypisano to samo oznaczenie RXA, RXN, RXS lub RXC. Zatem określenie „jedna z sekwencjio nieparzystym numerze na Liście Sekwencji”odnosi się do jakiejkolwiek spośród sekwencji kwasu nukleinowego na Liście Sekwencji, które można także rozpoznać dzięki różnym oznaczeniom RXA, RXN, RXS czy RXC. Rejon kodujący każdej z tych sekwencji ulega translacji do odpowiedniej sekwencji aminokwasowej, także umieszczonej na Liście Sekwencji, jako parzysty numer SEKW. Nr ID.: następujący zaraz po odpowiadającej mu sekwencji kwasu nukleino20
PL 195 942 B1 wego. Na przykład, region kodujący dla RXA02458 zestawiono jako SEKW. Nr ID.:1, podczas gdy sekwencję aminokwasową przezeń kodowaną zestawiono jako SEKW. Nr ED.:2. Sekwencje cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku identyfikowane są za pomocą tych samych oznaczeń, co sekwencje aminokwasowe przez nie kodowane - RXA, RXN, RXS oraz RXC, tak, aby z łatwością można je było powiązać. Na przykład, sekwencje aminokwasowe oznaczone jako RXA02458, RXN00249, RXS00153 oraz RXC00963 powstały w wyniku translacji regionów kodujących sekwencji nukleotydowych cząsteczek kwasu nukleinowego oznaczonych odpowiednio, jako RXA02458, RXN00249, RXS00153oraz RXC00963. Zgodność pomiędzy sekwencjami nukleotydowymi a aminokwasowymi RXA, RXN, RXS i RXC według wynalazku oraz przypisane im numery SEKW. Nr ID. zestawiono w Tablicy1.
Kilka spośród genów według wynalazku to „geny oznaczone literą F”. Geny F obejmują te geny zestawione w Tablicy 1, które mają literę „F” przed oznaczeniem RXA, RXN, RXS i RXC. Na przykład, SEKW. Nr ID.:5, oznaczona, jak wskazano w Tablicy 1, jako „F RXA00249”, jest genem oznaczonym literą F, tak samo jak numery SEKW. Nr ID.: 11,15 oraz 33 (oznaczone w Tablicy 1, jako odpowiednio „F RXA02264”, „F RXA02247” oraz „F RXA00675”).
W jednej postaci, cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego według wynalazku nie obejmują cząsteczek kwasu nukleinowego C.glutamicum zebranych w Tablicy 2. W przypadku genu dapD, jego sekwencja została opublikowana przez Wehrmann, A. i wsp. (1998) J. Bacteriol. 180(12): 3159-3165. Jednakże, sekwencja otrzymana przez wynalazców niniejszego zgłoszenia jest istotnie dłuższa niż wersja opublikowana. Należy przypuszczać, iż wersja opublikowana opiera się na błędnym kodonie start, przedstawia zatem jedynie fragment właściwego regionu kodującego.
W innej korzystnej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego, komplementarną do jednej z sekwencji nukleotydowych według wynalazku lub jej fragmentu. Cząsteczka kwasu nukleinowego komplementarna do jednej z sekwencji nukleotydowych według wynalazku to taka, która jest dostatecznie komplementarna do jednej spośród sekwencji nukleotydowych przedstawionych na Liście Sekwencji (np. sekwencji o nieparzystym numerze SEKW. Nr ID.:), by hybrydyzować do jednej z sekwencji nukleotydowych według wynalazku tworząc stabilny dupleks.
W jeszcze innej korzystnej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową homologiczną do sekwencji nukleotydowej według wynalazku lub jej fragmentu (np. sekwencji o nieparzystym numerze SEKW. Nr ID.: na Liście Sekwencji) co najmniej w około 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% lub 60%, korzystnie co najmniej w około 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% lub 70%, bardziej korzystnie co najmniej w około 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% lub 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% lub 90%, albo 91%, 92%, 93%, 94%, zaś jeszcze bardziej korzystnie co najmniej w około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej. Zakresy i wartości identyczności pośrednie w stosunku do wyżej wymienionych zakresów (np. 70-90% identyczności lub 80-95% identyczności) są również objęte niniejszym według wynalazkiem. Na przykład, zakresy wartości identyczności wykorzystujące połączenie jakichkolwiek spośród wyżej wymienionych wartości jako górnych i/lub dolnych granic zakresu objęte są wynalazkiem. W dodatkowej korzystnej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje, np. w ostrych warunkach, do jednej z sekwencji nukleotydowych według wynalazku lub jej fragmentu.
Ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku może zawierać jedynie fragment rejonu kodującego sekwencji o jednym z nieparzystych numerów SEKW. Nr ID.s na Liście Sekwencji, na przykład fragment, który może stanowić sondę bądź starter czy też fragment kodujący biologicznie aktywną część białka HA. Określone dzięki klonowaniu genów HA C.glutamicum sekwencje nukleotydowe umożliwiają tworzenie sond lub starterów zaprojektowanych do identyfikacji i/lub klonowania homologów HA w innych typach komórek i organizmów, jak również identyfikacji i/lub klonowania homologów HA z innych gatunków Corynebacteria czy gatunków spokrewnionych. Sonda/starter zawiera przeważnie zasadniczo oczyszczone oligonukleotydy. Oligonukleotyd przeważnie zawiera rejon sekwencji nukleotydowej, który hybrydyzuje w ostrych warunkach do co najmniej około 12, korzystniej około 25, zaś jeszcze korzystniej do około 40, 50 lub 75 kolejnych nukleotydów w nici sensownej jednej z sekwencji nukleotydowych według wynalazku (sekwencji antysensownej dla jednej z tych sekwencji lub naturalnie występujących jej mutantów). W celu klonowania homologów HA za pomocą reakcji PCR zastosowane mogą być startery zaprojektowane na podstawie sekwencji nukleotydowej według wynalazku. Zaprojektowane na podstawie sekwencji nukleotydowych HA sondy mogą być
PL 195 942 B1 zastosowane do wykrywania transkryptów lub sekwencji genomowych kodujących te same lub homologiczne białka. Sondy, w korzystnych postaciach, dodatkowo zawierają doczepioną do nich wyznakowaną grupę, którą może być np. radioizotop, związek fluorescencyjny, enzym lub kofaktor dla enzymu. Sondy takie można stosować w zestawie do testu diagnostycznego w celu identyfikacji komórek, w których zachodzi niewłaściwa ekspresja białka HA, poprzez pomiar w próbce komórek poziomu kwasu nukleinowego kodującego HA, np. za pomocą oznaczenia poziomów mRNA dla HA lub określenia czy genomowy gen dla HA uległ mutacji lub delecji. W jednej postaci, cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje białko lub jego część obejmującą sekwencję aminokwasową wystarczająco homologiczną do sekwencji aminokwasowej według wynalazku tak, że białko lub jego część zachowuje zdolność do brania udziału w utrzymaniu homeostazy u C.glutamicum lub do przeprowadzenia funkcji uczestniczącej w adaptacji mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych. Użyte tu pojęcie „dostatecznie homologiczny” odnosi się do białek lub ich części, których sekwencje aminokwasowe zawierają minimalną liczbę identycznych lub równoważnych reszt aminokwasowych (np. reszt aminokwasowych o łańcuchu bocznym podobnym do łańcucha reszty aminokwasowej występującej w sekwencji jednego z parzyście numerowanych SEKW. Nr ID.s na Liście Sekwencji) względem sekwencji aminokwasowej według wynalazku, dzięki czemu białko lub jego część zdolne jest do brania udziału w utrzymaniu homeostazy u C.glutamicum lub do przeprowadzenia funkcji uczestniczącej w adaptacji mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych. Białka biorące udział w biosyntezie lub przebudowie ściany komórkowej C.glutamicum, w metabolizmie związków nieroganicznych, modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych lub te które mają enzymatyczną lub proteolityczną aktywność C.glutamicum, jak tu opisane, mogą odgrywać rolę w produkcji i wydzielaniu jednego lub więcej wysokowartościowych związków chemicznych. Przykłady takiego działania są również tu opisane. Zatem „funkcja białka HA” bezpośrednio bądź pośrednio wpływa na wydajność, produkcję i/albo efektywność produkcji jednego lub więcej związków wysokowartościowych. Przykłady działania białka HA zestawiono w Tablicy1.
W innej postaci, białko jest homologiczne względem całkowitej sekwencji aminokwasowej według wynalazku co najmniej w około 50-60%, korzystnie co najmniej w około 60-70%, korzystniej co najmniej w około 70-80%, 80-90%, 90-95%, zaś najkorzystniej co najmniej w około 96%, 97%, 98%, 99% i bardziej homologiczne.
Korzystnie części białek kodowanych przez cząsteczki kwasu nukleinowego HA według wynalazku, są biologicznie aktywnymi częściami jednego z białek HA. Przyjęte tutaj pojęcie „aktywna biologicznie część białka HA” ma w założeniu obejmować część, np. domenę/motyw, białka HA, która może brać udział w utrzymaniu homeostazy u C.glutamicum lub która może przeprowadzić funkcję uczestniczącą w adaptacji mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych, bądź też wykazującą taką aktywność, jak wymieniona w Tablicy 1. W celu określenia czy białko HA lub jego biologicznie aktywna część może brać udział w biosyntezie lub przebudowie ściany komórkowej C.glutamicum, w mebabolizmie związków nieorganicznych, modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych lub czy ma enzymatyczną lub proteolityczną aktywność C.glutamicum, można wykonać oznaczenie aktywności enzymatycznej. Metody takich oznaczeń, wyszczególnione w Przykładzie 8, są dobrze znane osobom o podstawowej znajomości metod badań naukowych.
Dodatkowe fragmenty kwasu nukleinowego kodujące aktywne biologicznie części białka HA można uzyskać przez izolację części jednej z sekwencji aminokwasowych według wynalazku, i ekspresję kodowanej części białka lub peptydu HA (np. przez ekspresję rekombinacyjną in vitro) i oznaczanie aktywności kodowanej części białka lub peptydu HA.
Wynalazek obejmuje też cząsteczki kwasu nukleinowego różniące się od jednej z sekwencji nukleotydowych według wynalazku (i jej części) z powodu zjawiska degeneracji kodu genetycznego i kodujące to samo białko HA, co białko kodowane przez sekwencje nukleotydowe według wynalazku. W innej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku posiada sekwencję nukleotydową kodującą białko o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Liście Sekwencji (np. o parzystym numerze). W kolejnej postaci, cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje pełnej długości białko C.glutamicum zasadniczo homologiczne do sekwencji aminokwasowej według wynalazku.
Dla specjalisty zrozumiałe jest, że w jednej postaci przez sekwencje według wynalazku nie rozumie się sekwencji według stanu techniki, takich jak sekwencje zawarte w Genbanku zestawione w Tablicy 2 lub 4 dostępne przed dokonaniem niniejszego wynalazku. W jednej postaci, wynalazek obejmuje sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe posiadające taki procent identyczności względem
PL 195 942 B1 sekwencji nukleotydowej lub aminokwasowej według wynalazku, który jest większy niż w przypadku sekwencji według stanu techniki (np. sekwencji pochodzącej z Genbanku (lub białka kodowanego przez taką sekwencję) umieszczonej w Tablicy2 lub 4). Na przykład, wynalazek obejmuje sekwencję nukleotydową, która jest więcej niż i/lub co najmniej w 44% identyczna z sekwencją nukleotydową oznaczoną jako RXA00471 (SEKW. Nr ID.:293), sekwencją nukleotydową, która jest więcej niż i/lub co najmniej w 39% identyczna z sekwencją nukleotydową oznaczoną jako RXA00500 (SEKW. Nr ID.:143) oraz sekwencję nukleotydową, która jest więcej niż i/lub co najmniej w 35% identyczna z sekwencją nukleotydową oznaczoną jako RXA00502 (SEKW . Nr ID.:147). Specjalista jest w stanie obliczyć niższy próg procentu identyczności dla każdej sekwencji według wynalazku poprzez badanie wyników wyliczenia GAP procentu identyczności, zestawionych w Tablicy4 dla każdego z trzech najwyższych trafień dla danej sekwencji i poprzez odejmowanie najwyższych obliczeń GAP procentu identyczności od 100%. Dla specjalisty jest też zrozumiałe, iż wynalazek obejmuje również sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe mające większy procent identyczności od w ten sposób wyliczonego, niższego progu (np. mające co najmniej 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% lub 60%, korzystnie co najmniej około 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% lub 70%, bardziej korzystniej co najmniej około 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% lub 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% lub 90%, lub 91%, 92%, 93%, 94%, zaś najkorzystniej co najmniej około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub więcej identyczności).
Dla specjalisty zrozumiałe jest, że oprócz zestawionych na Liście Sekwencji jako nieparzyste SEKW. Nr ID. sekwencji nukleotydowych HA C.glutamicum, w populacji mogą występować (np. w populacji C.glutamicum) polimorfizmy sekwencji DNA prowadzące do zmian w sekwencjach aminokwasowych białek HA. Taki genetyczny polimorfizm w genie HA może występować pośród osobników populacji z powodu naturalnej zmienności. Przyjęte tutaj pojęcia „gen” oraz „gen zrekombinowany” odnoszą się do cząsteczek kwasu nukleinowego zawierających otwartą ramkę odczytu kodującą białko HA, szczególnie białka HA C.glutamicum. Wynikem takiej naturalnej zmienności jest zazwyczaj 1-5% zmienność w sekwencji nukleotydowej genu HA. Jakakolwiek oraz wszystkie spośród takich zmienności w sekwencji nukleotydowej i będące ich następstwem polimorfizmy sekwencji aminokwasowej HA wynikające z naturalnej zmienności, lecz nie mające wpływu na funkcjonalną aktywność białek HA wchodzą w zakres według wynalazku.
Cząsteczki kwasu nukleinowego odpowiadające naturalnym wariantom oraz nie występującym u C.glutamicum homologom DNA dla HA według wynalazku można wyizolować opierając się na ich homologii do, przedstawionego tu, kwasu nukleinowego HA C.glutamicum, za pomocą DNA C.glutamicum lub jego fragmentów użytych jako sondy do hybrydyzacji zgodnie ze standardowymi technikami hybrydyzacji w ostrych warunkach. Zatem w innej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku ma co najmniej 15 nukleotydów długości i hybrydyzuje w ostrych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową o nieparzystym numerze SEKW. Nr ID. na Liście Sekwencji. W pozostałych postaciach, kwas nukleinowy ma co najmniej 30, 50, 100, 250 lub więcej nukleotydów długości. Przyjęte tu określenie „hybrydyzacja w ostrych warunkach” opisywać ma warunki hybrydyzacji i płukania, w których sekwencje nukleotydowe homologiczne co najmniej w 60% w stosunku do siebie zwykle pozostają ze sobą zhybrydyzowane. Warunki hybrydyzacji są tak dobrane, by sekwencje co najmniej w około 65%, bardziej korzystnie co najmniej w około 70%, zaś najkorzystniej co najmniej w około 75% i bardziej homologiczne do siebie zwykle pozostawały ze sobą zhybrydyzowane. Takie ostre warunki znane są specjalistom, a informacje o nich znaleźć można w Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Korzystny, lecz nie jedyny przykład ostrych warunków hybrydyzacji to hybrydyzacja w układzie 6X chlorek sodu/cytrynian sodu (SSC) w około 45°C, po której następuje jedno lub więcej płukań w 0.2X SSC, 0.1% SDS w 50-65°C. Korzystnie wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku, która hybrydyzuje w ostrych warunkach do sekwencjinukleotydowej według wynalazku, odpowiada naturalnie występującej cząsteczce kwasu nukleinowego. Użyte tu określenie „naturalnie występująca” cząsteczka kwasu nukleinowego odnosi się do cząsteczki RNA lub DNA posiadającej sekwencję nukleotydową występującą w naturze (np. kodującą naturalne białko). W jednej postaci, kwas nukleinowy koduje naturalne białko HA C.glutamicum.
Specjalista rozumie, że dodatkowo oprócz naturalnie występujących w populacji odmian sekwencji HA, do sekwencji nukleotydowej według wynalazku mogą być wprowadzane zmiany poprzez mutacje, prowadzące tym samym do zmian w sekwencji aminokwasowej kodowanego białka HA, bez zmieniania jego aktywności funkcjonalnej. Na przykład do sekwencji nukleotydowej według wynalazku
PL 195 942 B1 może zostać wprowadzona zamiana nukleotydową prowadząca do zmiany „nieistotnych” aminokwasów. „Nieistotny” aminokwas to taki, który może być zmieniony w dzikiej sekwencji jednego z białek HA bez zmiany aktywności wymienionego białka, podczas gdy „istotny” aminokwas wymagany jest do utrzymania aktywności białka HA. Jednakże inne aminokwasy (np. te, które nie są konserwowane lub są jedynie semikonserwowane w domenie posiadającej aktywność HA) mogą nie być istotne dla aktywności, a tym samym zamiany ich nie naruszają aktywności HA.
Zatem kolejny aspekt wynalazku odnosi się do cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących białka HA zawierające zmiany w aminokwasach nieistotnych dla aktywności HA. Takie białka HA różnią się sekwencją aminokwasową od sekwencji o parzystym numerze SEKW. Nr ID. na Liście Sekwencji, nadal zachowując co najmniej jedną z aktywności HA tu opisanych. W jednej postaci wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową kodującą białko zawierające sekwencję aminokwasową homologiczną co najmniej w około 50% do sekwencji aminokwasowej według wynalazku i zdolne do udziału w utrzymaniu homeostarzy w C.glutamicum lub do realizacji funkcji wymaganej dla adaptacji tego mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych, albo posiada jedną lub więcej aktywności zestawionych w Tablicy 1. Korzystnie, białko kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jest homologiczne do jednej z sekwencji aminokwasowych według wynalazku o nieparzystym numerze SEKW. Nr ID. na Liście Sekwencji co najmniej w około 50-60%, korzystniej co najmniej w około 60-70%, bardziej korzystnie co najmniej w około 70-80%, 80-90%, 90-95% i najkorzystniej co najmniej w około 96%, 97%, 98% lub 99%. W celu ustalenia procentu homologii między dwoma sekwencjami aminokwasowymi (np. jednej z sekwencji aminokwasowych według wynalazku i zmutowanej jego formy) lub dwoma kwasami nukleinowymi, sekwencje są przyrównane pod kątem optymalnego porównania (np. mogą być wprowadzone przerwy w sekwencji białka lub kwasu nukleinowego w celu optymalnego przyrównania do innego białka lub kwasu nukleinowego). Porównywane są wtedy aminokwasy lub nukleotydy na odpowiadających sobie pozycjach. Gdy pozycja w jednej sekwencji (np. jednej z sekwencji aminokwasowych według wynalazku) zajmowana jest przez taki sam aminokwas lub nukleotyd jak w odpowiadającej jej pozycji w innej sekwencji (np. zmutowanej formie sekwencji aminokwasowej), wtedy cząsteczki w tej pozycji są homologiczne (tj. użyte tutaj sformuowanie „homologii” jest równoznaczne z „identycznością” aminokwasu lub nukleotydu). Procent homologii pomiędzy dwoma sekwencjami jest funkcją liczby identycznych pozycji w danych sekwencjach (tj. % homologii = # identycznych pozycji/ całkowita # pozycji x 100).
Wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą białko HA homologiczne do sekwencji białka według wynalazku można otrzymać poprzez wprowadzenie jednej lub więcej nukleotydowych substytucji, addycji lub delecji w sekwencji nukleotydowej według wynalazku w wyniku czego, że do kodowanego białka zostaje wprowadzona jedna lub więcej aminokwasowa substytucja, addycja lub delecja. W jednej z sekwencji nukleotydowych według wynalazku można dokonywać mutacji za pomocą standardowych technik takich, jak ukierunkowana mutageneza oraz mutageneza za pomocą PCR. Korzystnie substytucje aminokwasów konserwowanych są dokonywane w jednej lub więcej pozycji przypuszczalnie nieistotnych resztach aminokwasowych. „Substytucja konserwowanego aminokwasu” to taka substytucja, w której dana reszta aminokwasowa jest zastąpiona przez aminokwas posiadający podobny łańcuch boczny, W stanie techniki określono rodziny reszt aminokwasowych posiadających podobne łańcuchy boczne. Rodziny te obejmują aminokwasy z zasadowymi łańcuchami bocznymi (np. lizyna, arginina, histydyna), kwasowymi łańcuchami bocznymi (np. kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), polarnymi łańcuchami bocznymi nie posiadającymi ładunku (np. glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina), łańcuchami bocznymi niepolarnymi (np. alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan), łańcuchami bocznymi o odgałęzieniu b (np. treonina, walina, izoleucyna) oraz aromatycznymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Zatem przypuszczalnie nieistotna reszta aminokwasowa w białku HA zastępowana jest przez inną resztę aminokwasowa należącą do tej samej rodziny łańcuchów bocznych. Alternatywnie w innej postaci, mutacje mogą być wprowadzane losowo wzdłuż całej sekwencji kodującej HA lub jej części, np. poprzez mutagenezę wysyceniową, zaś uzyskane mutanty można przeszukiwać pod kątem tych, które posiadają aktywność HA w celu ich identyfikacji. Po wykonaniu mutagenezy jednej z sekwencji nukleotydowych o nieparzystym numerze SEKW. Nr ID. na Liście Sekwencji, kodowane białko można poddać rekombinowanej ekspresji, a jego aktywność określić na przykład za pomocą oznaczeń tu opisanych (patrz Przykład 8).
Dodatkowo, oprócz cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących opisane powyżej białka HA, kolejny aspekt według wynalazku dotyczy wyizolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego, które są
PL 195 942 B1 względem powyższych antysensowne. „Antysensowna” cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję nukleotydową komplementarną do „sensownej” cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej białko, np. komplementarną do kodującej nici dwuniciowej cząsteczki DNA lub do sekwencji mRNA. Stąd, antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego może wiązać się za pomocą wiązań wodorowych do cząsteczki sensownej. Antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego może być komplementarna do całej nici kodującej HA, bądź jedynie do jej części. W jednej postaci antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego jest antysensowna względem „rejonu kodującego” kodującej nici sekwencji nukleotydowej dla białka HA. Pojęcie „rejon kodujący” odnosi się do odcinka sekwencji nukleotydowej zawierającego kodony przepisywane na reszty aminokwasowe (np. cały rejon kodujący SEKW. Nr ID. 3 (RXN00249) zawiera nukleotydy od 1do 957). W innej postaci, antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego jest antysensowna względem „rejonu niekodującego” w kodującej nici sekwencji nukleotydowej dla HA. Pojęcie „rejon niekodujący” odnosi się do sekwencji 5' i 3', które flankują rejon kodujący i nie są przepisywane na aminokwasy (tj. dotyczy rejonów 5' i 3' niepodlegających translacji).
Mając do dyspozycji przedstawiane tutaj sekwencje nici kodującej dla HA (np. sekwencje o nieparzystych numerach SEKW. Nr ID, zestawione na Liście Sekwencji), można określić antysensowne cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku zgodnie z prawami parowania zasad opisanymi przez Watsona i Cricka. Antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego może być komplementarna do całego rejonu kodującego mRNA dla HA, ale korzystniej stanowi ona oligonukleotyd antysensowny tylko do części rejonu kodującego bądź niekodującego mRNA dla HA. Na przykład, oligonukleotyd antysensowny może być komplementarny do odcinka otaczającego miejsce początku translacji w mRNA dla HA. Oligonukleotyd antysensowny może mieć na przykład, długość około 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 lub 50 nukleotydów. Antysensowny kwas nukleinowy według wynalazku można uzyskać przy zastosowaniu syntezy chemicznej i enzymatycznych reakcji ligacji używając znanych w nauce procedur. Na przykład antysensowny kwas nukleinowy (np. antysensowny oligonukleotyd) może być chemicznie syntetyzowany z użyciem naturalnie występujących nukleotydów lub rozmaicie zmodyfikowanych nukleotydów zaprojektowanych tak, aby zwiększyć biologiczną stabilność cząsteczek,lub aby zwiększyć fizyczną stabilość formy dwuniciowej składającej się z cząsteczek antysensownych i sensownych nici kwasów nukleinowych np. mogą być zastosowane pochodne fosforotionianowe i nukleotydy podstawione akrydyną. Przykłady zmodyfikowanych nukleotydów, które mogą być zastosowane do wytworzenia antysensownego kwasu nukleinowego obejmują: 5-fluorouracyl, 5-bromouracyl, 5-chlorouracyl, 5-jodouracyl, hypoksantyna, ksantyna, 4-acetylocytozyna, 5-(karboksyhydroksymetylo)uracyl, 5-karboksymetyloaminometylo-2-tiourydyna, 5-karboksymetyloaminometylouracyl, dihydrouracyl, beta-D-galaktozylokweozyna, inozyna, N6-isopentenylo-adenina, 1-metyloguanina,
1- metyloinozyna, 2,2-dimetyloguanina, 2-metyloadenina, 2-metyloguanina, 3-metylocytozyna, 5-metylocytozyna, N6-adenina, 7-metyloguanina, 5-metylo-amino-metylouracyl, 5-metoksyaminometylo-2-tiouracyl, beta-D-mannozylokweozyna, 5'-metoksy-karboksymetylouracyl, 5-metoksyuracyl, 2-metylotio-N6-izopentenyloadenina, kwas uracylo-5-oksy-octowy (v), wybutoksozyna, pseudouracyl, kweozyna,
2- tiocytozyna, 5-metylo-2-tiouracyl, 2-tio-uracyl, 4-tio-uracyl, 5-metylouracyl, ester metylowy kwasu uracylo-5-oksyoctowego, kwas uracylo-5-oksyoctowy (v), 5-metylo-2-tiouracyl, 3-(3-amino-3-N-2-karboksypropylo)uracyl, (acp3)w oraz 2,6-diaminopuryna. Cząsteczkę antysensownego kwasu nukleinowego można wytworzyć alternatywnie sposobem biologicznym, stosując wektor ekspresyjny, w którym subklonowano kwas nukleinowy w położeniu antysensownym (tj. RNA przepisane z wstawionej cząsteczki kwasu nukleinowego będzie w położeniu antysensownym względem interesującej nas, docelowej cząsteczki kwasu nukleinowego, opisanej dalej w następnym rozdziale).
Antysensowne cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku są zazwyczaj wprowadzane do komórki lub wytworzenia in situ tak, by hybrydyzowały bądź wiązały się z komórkowymmRNA i/lub genomowym DNA kodującym białko HA celem zahamowania jego ekspresji, np. poprzez inhibicję transkrypcji i/lub translacji. Hybrydyzację można uzyskać na zasadzie konwencjonalnej komplementarności z wytworzeniem stabilnego dupleksu, lub też, w przypadku antysensownej cząsteczki kwasu nukleinowego wiążącej się do dupleksów DNA, może ona zachodzić poprzez specyficzną interakcję z większym rowkiem podwójnej helisy.
Cząsteczkę antysensowną można tak modyfikować, aby wiązała się specyficznie z receptorem lub antygenem prezentowanym na powierzchni wybranej komórki, np. poprzez połączenie antysensownej cząsteczki kwasu nukleinowego z peptydem lub przeciwciałem, wiążącym się do receptora bądź antygenu na powierzchni komórki. Antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego może być
PL 195 942 B1 również dostarczona do komórek za pomocą opisanych tu wektorów. Do tego, by osiągnąć dostateczne wewnątrzkomórkowe stężenie cząsteczek antysensownych, korzystne są konstrukty wektorowe, w których antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego regulowana jest przez silne prokariotyczne, wirusowe bądź eukariotyczne promotory.
W jeszcze innej postaci, antysensownacząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku jest a-anomeryczną cząsteczką kwasu nukleinowego, a-anomeryczne cząsteczki kwasu nukleinowego tworzą specyficzne dwuniciowe hybrydy z komplementarnym RNA, w których w odróżnieniu od formy typu b, nici biegną równolegle do siebie (Gaultier i wsp. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). Antysensowną cząsteczka kwasu nukleinowego może także składać się z 2'-o-metylorybonukleotydu (Inoue i wsp. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6131-6148) lub obejmować chimeryczne analogi RNA-DNA (Inoue i wsp. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).
W kolejnej postaci, antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku jest rybozymem. Rybozymy są katalitycznymi cząsteczkami RNA wykazującymi aktywność rybonukleazy, zdolnymi do cięcia kwasów nukleinowych o pojedynczej nici, takich jak mRNA, do których posiadają odcinek komplementarny. Zatem, rybozymy (np. rybozymy typu hammeread (opisane przez Haselhoff i Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) mogą posłużyć do katalicznego cięcia transkryptów mRNA dla HA w celu zahamowania translacji mRNA dla HA. Rybozym specyficzny względem kwasu nukleinowego kodującego HA można zaprojektować opierając się na opisanej tutaj sekwencji nukleotydowej DNA dla HA (t.j. SEKW. Nr ID.:3(RXN00249)). Na przykład, można skonstruować pochodną RNA Tetrachymeny L-19 IVS, w której sekwencja nukleotydowa miejsca aktywnego jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej przeznaczonej do cięcia w mRNA kodującym HA. Patrz. np. Cech i wsp. patent USA nr 4,987,071 oraz Cech i wsp. patent USA nr 5,116,742. Z kolei mRNA dla HA może być wykorzystane do selekcji katalitycznego RNA o specyficznej aktywności rybonukleazy z mieszaniny cząsteczek RNA. Patrz. np. Bartel, D. i Szostak,J.W. (1993) Science 261:1411-1418.
W sposób alternatywny, ekspresję genu HA można hamować za pomocą docelowych sekwencji nukleotydów komplementarnych do regionu regulatorowego sekwencji nukleotydowej HA (np. promotora i/lub wzmacniacza genu HA), z którym tworzą potrójne struktury helikalne, co zapobiega transkrypcji genu HA w komórkach docelowych. Patrz. Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. i wsp. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36 oraz Maher, L.J. (1992) Bioassays14(12):807-15.
B. Zrekombinowane Wektory Ekspresyjne i Komórki Gospodarza
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy wektorów, a szczególnie wektorów ekspresyjnych, zawierających cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego białko HA (lub jego część). Przyjęty tutaj termin „wektor” odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do transportu połączonej z nią innej cząsteczki kwasu nukleinowego. Jednym z rodzajów wektora jest „plazmid”, który składa się z podwójnej nici DNA tworzącej kolistą pętlę, do której można ligować dodatkowe fragmenty DNA. Innym rodzajem wektora jest wektor wirusowy, charakteryzujący się tym, że dodatkowe fragmenty DNA ligowane są do genomu wirusa. Niektóre wektory mają zdolność autonomicznej replikacji w komórce gospodarza, do której zostały wprowadzone (np. wektory bakteryjne posiadające bakteryjne miejsce rozpoczęcia replikacji oraz ssacze wektory episomalne). Pozostałe wektory (np. nieepisomalne wektory ssacze) po wprowadzeniu do komórki są integrowane z genomem gospodarza i wrazznim ulegają replikacji. Co więcej, pewne wektory zdolne są do kierowania ekspresją genów, z którymi są funkcjonalnie połączone. Wektory takie objęte są tutaj nazwą „wektorów ekspresyjnych”. Wektory ekspresyjne wykorzystywane w technikach rekombinacji DNA często mają postać plazmidów. W niniejszym opisie terminy „plazmid” oraz „wektor mogą być używane zamiennie, ponieważ plazmid jest najbardziej powszechnie stosowaną formą wektora. Jednakże, wynalazek obejmuje w założeniu również takie spośród innych postaci wektorów ekspresyjnych, jak wektory wirusowe (np. niezdolne do replikacji retrowirusy, adenowirusy oraz wirusy towarzyszące adenowirusom), które pełnią funkcje równoznaczne z wyżej opisanymi. Rekombinacyjne wektory ekspresyjne według wynalazku zawierają cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku w formie dogodnej do uzyskania ekspresji w komórce gospodarza, co oznacza, że rekombinacyjne wektory ekspresyjne zawierają jedną lub więcej sekwencji regulatorowych, połączonych z mającą podlegać ekspresji sekwencją nukleotydową i wyselekcjonowanych pod kątem wykorzystywanych komórek gospodarza. Pojęcie „funkcjonalnie połączona” dotyczące rekombinacyjnego wektora ekspresyjnego ma oznaczać, że interesująca nas sekwencja nukleotydowa jest związana z sekwencją(-ami) regulatorawą(-ymi) w sposób umożliwiający ekspresję sekwencji nukleotydowej (np. in vitro w układzie transkrypcja/translacja lub w komórce gospodarza,
PL 195 942 B1 jeśli wektor jest do niej wprowadzony). Pojęcie „sekwencja regulatorowa” ma obejmować promotory, wzmacniacze oraz inne elementy kontrolujące ekspresję (np. sygnały poliadenylacji). Takie sekwencje regulatorowe opisane są, na przykład, w Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Do sekwencji regulatorowych zaliczają się zarówno takie, które potrafią kierować ekspresją konstytutywną sekwencji nukleotydowej w wielu rodzajach komórek gospodarza, jak i te, które zdolne są kierować ekspresją sekwencji nukleotydowej tylko w niektórych komórkach gospodarza. Korzystnymi sekwencjami regulatorowymi są, na przykład, promotory takie, jak cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SPO2, lPRlub lPL, które korzystnie są wykorzystywane u bakterii. Dodatkowymi sekwencjami regulatorowymi są na przykład promotory pochodzące z drożdży i grzybów takie, jak ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GADPH, TEF, rp28, ADH, promotory pochodzenia roślinnego, takie jak CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos lub promotory ubikwitynowy bądź fazeolinowy. Możliwe jest także stosowanie promotorów sztucznych. Dla specjalisty jest oczywiste, że projekt wektora ekspresyjnego zależeć może od takich czynników, jak wybór komórki gospodarza do transformacji, poziom ekspresji żądanego białka itd. Wektory ekspresyjne według wynalazku mogą być wprowadzane do komórek gospodarza w celu wytwarzania w nich białek lub peptydów, włączając w to białka lub peptydy fuzyjne, kodowanych przez cząsteczki kwasu nukleinowego, jak to opisano (np. białka HA, zmutowane formy białek HA, białka fuzyjne itd.).
Rekombinacyjne wektory ekspresyjne według wynalazku mogą być projektowane do uzyskiwania ekspresji białek HA w komórkach prokariotycznych bądź eukariotycznych. Na przykład, geny HA mogą podlegać ekspresji w komórkach bakteryjnych takich, jak C.glutamicum, komórkach owadzich (z zastosowaniem bakulowirusowych wektorów ekspresyjnych), drożdży lub w komórkach innych grzybów (patrz. Romanos, M.A. i wsp. (1992) „Foreign gene expression in yeast: a review”, Yeast 8:423-488;, van den Hondel, C.A.M.JJ. i wsp. (1991) „Heterologous gene expression in filamentous fungi” w: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, wyd., str. 396-428: Academic Press: San Diego; oraz van den Hondel, C.A.M.JJ. & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi” w: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. i wsp., wyd, str. 1-28, Cambridge Unversity Press: Cambridge), w komórkach glonów oraz roślinnych komórczakach (patrz Schmidt, R. I Willmitzer, L. (1988) „High efficiency Agrobacterium tumefactiens - mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants” Plant Cell Rep.: 583-586), bądź w komórkach ssaczych. Dogodne komórki omawiane są dokładniej w Goeddel, Gene Exspression Technology: Methods in Enzymology 186, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternatywnie zrekombinowany wektor ekspresyjny może ulec transkrypcji i translacji in vitro, na przykład z użyciem sekwencji regulatorowych promotora T7 i polimerazy T7.
Ekspresja białek w organizmach prokariotycznych często zachodzi z wektorami zawierającymi konstytutywne lub indukcyjne promotory kierujące ekspresją fuzyjnych bądź niefuzyjnych białek. Wektory fuzyjne powodują dodanie pewnej liczby aminokwasów do białka w nich kodowanego, zwykle do końcowego aminokwasu zrekombinowanego białka. Takie wektory fuzyjne zwykle mają trzy zastosowania: 1) zwiększenie ekspresji zrekombinowanego białka; 2) zwiększenie rozpuszczalności zrekombinowannego białka; i 3) pomoc w oczyszczeniu zrekombinowanego białka, służąc jako ligand w oczyszczaniu uwzględniającym powinowactwo. Do fuzyjnych wektorów ekspresyjnych często wprowadzane jest miejsce cięcia proteolitycznego w pozycji złączenia fuzyjnej części i zrekombinowanego białka, w celu umożliwienia rozdzielenia zrekombinowanego białka od części fuzyjnej po jego oczyszczeniu. Takie enzymy i miejsca przez nie rozpoznawane, obejmują Czynnik Xa, trombinę, enterokinazę.
Typowe fuzyjne wektory ekspresyjne obejmują pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith,D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) i pRITS (Pharmacia, Piscataway, NJ), które łączą odpowiednio S-transferazę glutationu (GST), białko E łączące się z maltozą, białko A, z docelowym zrekombinowanym białkiem. W jednej postaci sekwencja kodująca białka HA jest klonowana do wektora ekspresyjnego pGEX w celu utworzenia wektora kodującego białko fuzyjne zawierające od końca N do końca C białko X z miejscem cięcia trombiny-GST. Białko fuzyjne może być oczyszczone za pomocą chromatografii powinowactwa z użyciem złoża glutation-agaroza. Zrekombinowane białko HA odcięte zostaje od GTS poprzez trawienie białka przy pomocy trombiny.
Przykłady odpowiednich, indukcyjnych niefuzyjnych wektorów ekspresyjnych E.coli obejmują pTrc (Amann i wsp., (1988) Gene 69:301-315) pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pINIII113-B1, lgt11, pBdCl i pET11d
PL 195 942 B1 (Studier i wsp., Gene Ekspression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89: i Pouwels i wsp., wyd. (1985) Cloning Vectors, Elsevier. New York IBSN 0444 904018). Ekspresja docelowego genu z wektora pTrc opiera się na transkrypcji przez polimerazę RNA gospodarza z zastosowaniem hybrydowego fuzyjnego promotora trp-lac. Ekspresja docelowego genu z wektora pET 11d opiera się na transkrypcji z fuzyjnego promotora T7 gn10-lac obsługiwanego przez ulegającą koekspresji wirusową polimerazę RNA (T7 gn1). Taka wirusowa polimeraza dostarczana jest przez szczepy gospodarza BL21 (DE3) lub HMS174(DE3) z wbudowanego profaga l posiadającego gen gn1T7 pod transkrypcyjną kontrolą promotora lacUV 5. Odpowiednie wektory mogą zostać wybrane w celu transformacji innych rodzajów bakterii. Na przykład plazmidy pIJ101, pIJ364, pIJ702 i pIJ361 są znane z wykorzystania do transformacji Streptomyces, podczas gdy plazmidy pUB110, pC194 lub pBD214 są wykorzystywane do transformacji gatunków Bacillus. Wśród plazmidów stosowanych do transferu informacji genetycznej w Corynobacterium znajdują się pHM1519, pBL1, pSA77 lub pAJ667 (Pouwels i wsp., wyd. (1985) Cloning Vectors, Elsevier. New York IBSN 0444 904018).
Jedna ze strategii maksymalizacji ekspesji zrekombinowanego białka polega na ekspresji tego białka w bakteriach z osłabioną zdolnością do trawień proteolitycznych zrekombinowanego białka (Gottesman, S., Gene Ekspression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San
Diego, California (1990) 119-128). Odmienna strategia polega na takim dopasowaniu sekwencji kwasu nukleinowego wstawianego do wektora ekspresyjnego, że poszczególne kodony dla każdego aminokwasu są preferencyjnie wykorzystywanymi kodonami w wybranej do przeprowadzenia ekspresji bakterii takiej jak C.glutamicum (Wada i wsp., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Takie dopasowanie sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku można uzyskać przy zastosowaniu standardowych technik syntezy DNA.
W innej postaci wektor ekspresyjny białka HA jest wektorem drożdżowym. Przykłady wektorów do ekspresji w drożdżach S.cerevisiae obejmują pYepSec1 (Baldari i wsp., (1987) Embo J. 6:229-234),2m, pAG-1, Yep6, Yep13, pEMBLYe23, pMFa (Kurjan i Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz i wsp., (1987) Gene54:113-123) i pYES2 (Invitrogen Corportation, San Diego, CA). Wektory i metody do konstrukcji wektorów odpowiednich do użyciaw innych grzybach takich jak grzyby nitkowate, obejmują te wyszczególnione w van den Hondel, C.A.M.JJ. & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi”Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy i wsp., wyd.,str. 1-28, Cambrige UnivesityPress: Cambridge, Pouwels i wsp., wyd. (1985) Cloning Vectors, Elsevier: New York (IBSN 0444 904018).
Alternatywnie białka HA według wynalazku mogą ulegać ekspresji w komórkach owadzich przy zastosowaniu bakulowirusowych wektorów ekspresyjnych. Wektory bakulowirusowe służące do uzyskania ekspresji białek w hodowanych komórkach owadzich (np. komórkach Sf9) obejmują serię pAc (Smith i wsp., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) iserię pVL(Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39).
W innej postaci białka HA według wynalazku mogą ulegać ekspresji w jednokomórkowych roślinach (takich jak glony) lub w komórkach roślinnych z roślin wyższych (np. nasiennych takich jak rośliny zbożowe). Przykłady roślinnych wektorów ekspresyjnych obejmują wektory wyszczególnione w Becker, D., Kemper, E., Schell, J., Masterson, R. (1992) „New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; Bevan, M.W. (1984) „Binary Agrobacteriumvectors for plant transformation”, Nucl Acid. Res. 12:8711-8721 i zaliczają się do nich: pLGV23, pGHlac+ pBIN19, pAK2004 i pDH51 (Pouwels i wsp., wyd. (1985) Cloning Vectors, Elsevier: New York IBSN 0444 904018).
W kolejnej postaci kwas nukleinowy według wynalazku ulega ekspresji w ssaczych komórkach z zastosowaniem ssaczych wektorów ekspresyjnych Przykłady ssaczych wektorów ekspresyjnych obejmują pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) i pMT2PC (Kaufman i wsp. (1987) EMBO J. 6:187-195). W przypadku wykorzystania komórek ssaczych kontrolne funkcje wektora ekspresyjnego często zapewniane są przez wirusowe elementy regulatorowe. Na przykład powszechnie stosowane promotory pochodzą z wirusa poliomy, Adenovirusa 2, cytomegalowirusa i Wirusa Siminan 40. Inne przydatne systemy ekspresji dla komórek prokariotycznych i eukariotycznych przedstawione są w rozdziale 16 i 17 w Sambrook, J., Fritsh, E.F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Labolatory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Labolatory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
PL 195 942 B1
W innej postaci zrekombinowany ssaczy wektor ekspresyjny jest zdolny do kontrolowania ekspresji kwasu nukleinowego szczególnie w określonym rodzaju komórek (np. do ekspresji kwasu nukleinowego używane są elementy regulatorowe tkankowo specyficzne). Elementy regulatorowe tkankowo specyficzne są znane w nauce. Przykłady odpowiednich tkankowo specyficznych promotorów obejmują, ale nie ograniczają się do, promotora albuminy (specyficznego wątrobowo; Pinker i wsp. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotorów specyficznych dla limfocytów (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:234-257) w szczególności promotorów receptorów limfocytów T (Winoto i Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) oraz immunoglobulin (Banerji i wsp. (1983) Cell 33:729-740; Queen i Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotorów specyficznych dla komórek nerwowych (np. promotor neurofilamentów; Byrne i Ruddle (1989) PNAS 86:5473-5477), promotorów specyficznych dla komórek trzustki (Edlund i wsp. (1985) Science 230:912-916) oraz promotorów specyficznych dla gruczołu mlekowego (np. promotor genu serwatki mleka; U.S. Patent No. 4,873,316 oraz European Application Publication NO. 264,166). Zalicza się do nich również promotory regulowane w okresie rozwoju, na przykład promotory hox u gryzoni (Kessel i Gruss (1990) Science 249:374-379) oraz promotor a-fetoproteiny (Campes i Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).
W dalszej kolejności wynalazek dostarcza rekombinacyjnego wektora ekspresyjnego zawierającego cząsteczkę DNA według wynalazku wklonowaną do tego wektora w położeniu antysensownym. Oznacza to, że cząsteczka DNA jest funkcjonalnie połączona z sekwencją regulatorową w sposób umożliwiający ekspresję cząsteczki RNA (poprzez transkrypcję cząsteczki DNA), która jest antysensowna względem mRNA dla HA. Dzięki możliwości wyboru danej sekwencji regulatorowej funkcjonalnie połączonej z cząsteczką kwasu nukleinowego sklonowaną w położeniu antysensownym, można pokierować konstytutywną ekspresją cząsteczki antysensownego RNA w różnego rodzaju komórkach, na przykład -wirusowe promotory i/lub wzmacniacze, bądź sekwencje regulatorowe można wybrać tak, by pokierować konstytutywną, tkankowo specyficzną czy też specyficzną względem rodzaju komórki ekspresją antysensownego RNA. Antysensowne wektory ekspresyjne mogą mieć formę zrekombinowanego plazmidu, fagmidu lub osłabionego wirusa, w którym antysensowne cząsteczki kwasu nukleinowego produkowane są pod kontrolą regionów regulatorowych o wysokiej wydajności, których aktywność można określić na podstawie typu komórki, do której wprowadzono wektor. Dyskusja na temat regulacji ekspresji genu za pomocą genów antysnesownych patrz. Weintraub, H. i wsp., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews -Trends in Genetics, Tom 1(1) 1986.
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy komórek gospodarza, do których został wprowadzony rekombinacyjny wektor ekspresyjny według wynalazku. Pojęcie „komórka gospodarza” oraz „rekombinowana komórka gospodarza” używane są tutaj zamiennie. Jest zrozumiałe, że pojęcie takie odnosi się nie tylko do danej komórki stanowiącej przedmiot działań, lecz także do komórek potomnych lub potencjalnie potomnych tej komórki. Ponieważ mogą pojawić się pewne zmiany w powstających komórkach potomnych z powodu mutacji bądź wpływu środowiska, komórki potomne mogą nie być w rzeczywistości identyczne z komórką rodzicielską, lecz nadal wchodzą w zakres pojęcia użytego powyżej.
Komórką gospodarza może być komórka prokariotyczna lub eukariotyczna. Na przykład białko HA może ulegać ekspresji w bakteryjnych komórkach takich jak C.glutamicum, komórkach owadzich, drożdżowych lub ssaczych (takich jak komórki jajnikowe chomików chińskich (CHO) lub komórki COS). Inne odpowiednie komórki gospodarza są znane specjalistom. Mikroorganizmy pokrewne Corynabacterium glutamicum, które mogą być dogodnie użyte jako komórki gospodarza dla cząsteczek kwasu nukleinowego i białka według wynalazku, zestawione są w Tablicy 3.
Wektorowe DNA może zostać wprowadzone do komórek prokariotycznych lub eukariotycznych na drodze konwencjonalnych technik transforamcji lub transfekcji. Użyte tu określenia „transforamcja” i „transfekcja” odnoszą się do rozmaitych znanych w nauce technik służących do wprowadzania obcego kwasu nukleinowego (np. liniowego DNA lub RNA (np. zlinearyzowanego wektora lub samego konstruktu genowego bez wektora) lub kwasu nukleinowego w formie wektora (np. plazmidu, faga, fazmidu, fagmidu, transpozonu lub innego DNA) do komórek gospodarza, i obejmują koprecypitację fosforanem wapnia lub chlorkiem wapnia, transfekcję z użyciem dekstranu-DEAE, lipofekcję lub elektroporację. Odpowiednie metody transformacji lub transfekcji komórek gospodarza można znaleźć w Sambrook i wsp. (Molecular Cloning: A Labolatory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harob Labolatory, Cold Spring Harob Labolatory Press, Cold Spring Harobor, NY, 1989) i innych podręcznikach laboratoryjnych.
PL 195 942 B1
Zależnie od użytego wektora ekspresyjnego i zastosowanej techniki transfekcyjnej, tylko w niewielkiej frakcji komórek może dojść do integracji obcego DNA do genomu, co, jak wiadomo, daje stabilną transfekcję komórek ssaczych. W celu identyfikacji i selekcji komórek, w których doszło do integracji, do komórek gospodarza przeważnie wprowadzony zostaje razem z danym genem gen kodujący marker selekcyjny (np. oporności na antybiotyk). Korzystne markery selekcyjne obejmują markery nadające oporność na leki takie jak G418, higromycyna i metotreksat. Kwas nukleinowy kodujący marker selekcyjny może zostać wprowadzony do komórki gospodarza na tym samym wektorze, który koduje białko HA lub może być wprowadzony na oddzielnym wektorze. Komórki stabilnie stransfekowane wprowadzonym kwasem nukleinowym mogą być zidentyfikowane poprzez selekcję na lek (np. komórki posiadające włączony do genomu gen markera selekcyjnego przeżyją, podczas gdy pozostałe zginą).
Aby stworzyć homologiczny rekombinowany mikroorganizm, należy przygotować wektor zawierający przynajmniej część genu HA, w którym dokonano delecji, addycji lub substytucji, powodującej zmianę genu HA, np. zaburzenie jego funkcjonowania.
Korzystnie genem jest gen HA należący do Corynebacterium glutamicum, lecz może to również być jego homolog u pokrewnej bakterii czy nawet ssaka, drożdży lub owada. W korzystnej postaci, wektor jest tak zaprojektowany, że w wyniku rekombinacji homologicznej, wewnątrzpochodny gen HA jest funkcjonalnie zaburzony (tj. nie koduje już funkcjonalnego białka; wektorom takim nadano nazwę wektorów „knock out”). Alternatywnie, wektor można zaprojektować tak, że choć w wyniku rekombinacji homologicznej, wewnątrzpochodny gen HA jest zmutowany lub w inny sposób zmieniony, nadal koduje funkcjonalne białko (np. zmieniony może być regulatorowy rejon położony w kierunku 5', co powoduje zmianę ekspresji endogennego białka HA). W wektorze stosowanym do rekombinacji homolgicznej, zmieniona część genu HA flankowana jest na swych końcach 5' i 3' przez dodatkowy fragment DNA genu HA, aby zajść mogła rekombinacja homologiczna pomiędzy zewnątrzpochodnym genem HA znajdującym się na wektorze, a wewnątrzpochodnym genem HA mikroorganizmu. Ów dodatkowy flankujący fragment DNA genu HA ma dostateczną długość dla zajścia prawidłowej rekombinacji homologicznej z genem endogennym. Zazwyczaj, flankujące DNA na wektorze zawiera kilka tysięcy nukleotydów (zarówno na końcu 5', jak i 3') (patrz. np. Thomas, K.R. i Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503, opis wektorów do rekombinacji homologicznej). Wektor wprowadzany jest do mikroorganizmu (np. drogą elektroporacji), a komórki, w których zaszła rekombinacja homologiczna z udziałem wprowadzonego genu HA i wewnątrzpochodnego genu HA, poddane są selekcji za pomocą znanych w nauce technik.
W innej postaci, można wyprodukować rekombinowane mikroorganizmy zawierające swoiste układy, które umożliwiają regulację ekspresji wprowadzonego genu. Na przykład, wprowadzenie genu HA do wektora, który umieszcza ten gen pod kontrolą operonu laktozowego, pozwala na ekspresję genu HA jedynie w obecności IPTG. Takie układy regulacji są w nauce dobrze znane.
W jeszcze innej postaci, wewnątrzpochodny gen HA w komórce gospodarza jest zaburzony (np. poprzez rekombinację homologiczną lub inne znane w nauce metody molekularne) w taki sposób, że ekspresja kodowanego przezeń białka w ogóle nie zachodzi. W kolejnej postaci, wewnątrzpochodny bądź wprowadzony do komórki gospodarza gen HA zmieniono poprzez poddanie go jednej lub więcej mutacji punktowych, delecji lub inwersji, lecz w dalszym ciągu koduje on funkcjonalne białko HA. W jeszcze innej postaci, zmieniono jeden lub więcej rejonów regulatorowych genu HA (np. poprzez delecję, skrócenie, inwersję lub mutację punktową) w taki sposób, że ekspresja całego genu uległa modulacji. Dla specjalisty jest zrozumiałe, że komórki gospodarza zawierające jedną lub więcej spośród opisanych modyfikacji genu i białka HA, mogą być z łatwością uzyskiwane za pomocą metod według wynalazku i objęte są zakresem niniejszego wynalazku.
Komórka gospodarza według wynalazku, taka jak pochodząca z hodowli komórka prokariotyczna bądź eukariotyczna, może być wykorzystana do produkcji (tj. ekspresji) białek HA. Zatem w dalszej swej części, wynalazek przedstawia sposoby produkcji białek HA z wykorzystaniem komórek gospodarza według wynalazku. W jednej postaci, sposób obejmuje hodowlę komórki gospodarza według wynalazku (do której wprowadzono rekombinacyjny wektor ekspresyjny kodujący białko HA, lub do genomu której wprowadzono gen kodujący białko HA typu dzikiego bądź białko zmienione) w odpowiedniej pożywce do czasu, aż zostanie wyprodukowane białko HA. W innej postaci, sposób obejmuje jeszcze izolację białek HA z pożywki lub komórki gospodarza.
PL 195 942 B1
C. Wyizolowane białka HA
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy wyizolowanych białek HA oraz ich aktywnych biologicznie części. „Wyizolowane” lub „oczyszczone” białko bądź jego biologicznie aktywna część jest zasadniczo wolne od materiału komórkowego, jeśli zostało wyprodukowane technikami rekombinacji DNA, bądź prekursorów pochodzenia chemicznego czy też innych związków chemicznych, jeśli zostało zsyntetyzowane chemicznie. Określenie „zasadniczo wolne od materiału komórkowego” dotyczy preparatów białka HA, w których białko jest oddzielone od pozostałych komponentów komórki, w której zachodzi jego naturalna lub uzyskiwana metodą rekombinacji produkcja. W jednej postaci, określenie „zasadniczo wolne od materiału komórkowego” dotyczy preparatów białka HA, które mają mniej niż około 30% (suchej masy) białka nie-HA (zwanego tu też „białkiem zanieczyszczającym”), korzystnie - mniej niż około 20% białka nie-HA, bardziej korzystnie - mniej niż około 10% białka nie-HA, natomiast najkorzystniej mniej niż około 5% białka nie-HA. Jeśli białko HA lub jego biologicznie aktywna część jest produkowane metodą rekombinacji, korzystnie jest również zasadniczo wolne od pożywki hodowlanej, tj. pożywka hodowlana stanowi mniej niż około 20%, korzystnie mniej niż około 10%, a najkorzystniej mniej niż około 5% objętości preparatu białkowego. Określenie „zasadniczo wolne od chemicznych prekursorów lub innych związków chemicznych” obejmuje preparaty białka HA, w których białko oddzielone od chemicznych prekursorów lub innych związków chemicznych użytych do syntezy białka. W jednej postaci, pojęcie „zasadniczo wolne od prekursorów chemicznych lub innych związków chemicznych” odnosi się do preparatów białka HA zawierających mniej niż około 30% (suchej masy) prekursorów chemicznych lub związków chemicznych nie będących HA, korzystnie - mniej niż około 20% prekursorów chemicznych lub związków chemicznych nie będących HA, korzystniej - mniej niż około 10% prekursorów chemicznych lub związków chemicznych nie będących HA, zaś najkorzystniej - mniej niż około 5% prekursorów chemicznych lub związków chemicznych nie będących HA. W korzystnych postaciach, wyizolowane białka lub ich biologicznie aktywne części w zupełności pozbawione są zanieczyszczających białek pochodzących z tego samego organizmu, z którego uzyskano białko HA. Zazwyczaj białka takie produkowane są w wyniku ekspresji rekombinacyjnej, na przykład, ekspresji białka HA C.glutamicum u tego mikroorganizmu.
Wyizolowane białko HA według wynalazku lub jego część może brać udział w naprawie lub rekombinacji DNA, w transpozycji materiału genetycznego, w ekspresji genu (tj. w procesie transkrypcji lub translacji), w składaniu białek lub sekrecji białek w Corynebacterium glutamicum, lub też wykazuje jedną lub więcej z aktywności zestawionych w Tablicy 1. W korzystnych postaciach, białko lub jego część zawiera sekwencję aminokwasową wykazującą dostateczną homologię do sekwencji aminokwasowej według wynalazku, tak, iż białko lub jego część zachowuje zdolność do uczestniczenia w utrzymaniu homeostazy w C.glutamicum lub do realizacji funkcji biorącej udział w adaptacji tego mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych. Korzystnie część białka stanowi część biologicznie aktywna, jak to zostało niniejszym opisane. W innej korzystnej postaci, białko HA według wynalazku posiada sekwencję aminokwasową o parzystym numerze SEKW. Nr ID.: na Liście Sekwencji. W kolejnej korzystnej postaci, białko HA ma sekwencję aminokwasową kodowaną przez DNA o sekwencji nukleotydowej, zdolnej do hybrydyzacji, np. w ostrych warunkach, do sekwencji nukleotydowej według wynalazku. W jeszcze innej korzystnej postaci, białko HA posiada sekwencję aminokwasową kodowaną przez DNA o sekwencji nukleotydowej homologicznej do jednej z sekwencji kwasów nukleinowych według wynalazku lub jej części co najmniej w około 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% lub 60%, korzystnie co najmniej w około 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% lub 70%, korzystniej co najmniej w około 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% lub 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% lub 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, zaś najkorzystniej co najmniej w około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej.
Zakresy oraz wartości identyczności są pośrednie względem wartości wymienionych powyżej (np. identyczność w zakresie 70-90% lub 80-95%), a niniejszy wynalazek także je obejmuje. Na przykład, wynalazek obejmuje zakresy wartości dla identyczności wyrażone za pomocą kombinacji którychkolwiek z powyższych wartości wymienionych jako dolne i/lub górne granice zakresu. Korzystnie, korzystne białka HA według niniejszego wynalazku również posiadają przynajmniej jedną z opisanych tu aktywności HA. Na przykład, korzystne białko HA według niniejszego wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową, zdolną do hybrydyzacji, np. w ostrych warunkach, do sekwencji nukleotydowej według wynalazku, i uczestniczyć może w transporcie wysokoenergetycznych cząsteczek węglowych, takich jak glukoza, do wnętrza C.glutamicum, a także
PL 195 942 B1 w wewnątrzkomórkowym przekaźnictwie sygnału u tego mikroorganimu, lub wykazuje jedną lub więcej z zestawionych w Tablicy1aktywności.
W innych postaciach, białko HA jest zasadniczo homologiczne do sekwencji aminokwasowej według wynalazku i zachowuje funkcjonalną aktywność białka posiadającego jedną z sekwencji według wynalazku, różniąc się jednak od niego w swej sekwencji aminokwasowej z racji naturalnej zmienności bądź mutagenezy, jak to szczegółowo opisano powyżej w podrozdziale I. Zatem, w innej postaci, białkiem HA jest białko składające się z sekwencji aminokwasowej homologicznej co najmniej w około 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% lub 60%, korzystnie -co najmniej w około 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% lub 70%, korzystniej -co najmniej w około 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% lub 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% lub 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, zaś najkorzystniej -co najmniej w około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologicznej do całkowitej sekwencji aminokwasowej według wynalazku i posiadające przynajmniej jedną spośród tutaj opisanych aktywności HA. Zakresy oraz wartości identyczności są pośrednie względem wartości wymienionych powyżej (np. identyczność w zakresie 70-90% lub 80-95%), a niniejszy wynalazek także je obejmuje. Na przykład, wynalazek obejmuje zakresy wartości dla identyczności wyrażone za pomocą kombinacji którychkolwiek z powyższych wartości wymienionych jako dolne i/lub górne granice zakresu. W innej postaci, wynalazek dotyczy białka o całkowitej długości pochodzącego z C.glutamicum, i wykazującego znaczną homologię do całkowitej sekwencji aminokwasowej według wynalazku.
Do fragmentów białka HA wykazujących aktywność biologiczną zaliczają się peptydy zawierające sekwencje aminokwasowe uzyskane z sekwencji aminokwasowej białka HA, np. sekwencji aminokwasowej o parzystym numerze SEKW. Nr ID. na Liście Sekwencji lub sekwencji aminokwasowej białka homologicznego do białka HA, i składające się z niniejszej liczby aminokwasów niż samo białko HA o pełnej długości lub pełnej długości białko homologiczne do białka HA oraz wykazujące przynajmniej jedną spośród aktywności białka HA. Zazwyczaj biologicznie aktywne fragmenty białka (peptydy, np. peptydy złożone z 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 i więcej aminokwasów) zawierają domenę lub motyw wykazujący przynajmniej jedną spośród aktywności białka HA. Co więcej, za pomocą technik rekombinacyjnych można uzyskać kolejne aktywne biologicznie części (białka HA), pozbawione innych regionów białka, i ocenić pod względem jednej lub więcej spośród opisanych tu aktywności. Korzystnie biologicznie aktywne części białka HA zawierają jedną lub więcej wybranych domen/motywów lub ich części, posiadających aktywność biologiczną.
Korzystnie, białka HA są wytwarzane za pomocą technik rekombinacji DNA. Na przykład, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko klonowana jest (jak opisano powyżej) do wektora ekspresyjnego, który wprowadzany jest (jak opisano powyżej) do komórki gospodarza, gdzie następuje ekspresja białka HA. Białko HA można następnie wyizolować z komórek za pomocą odpowiedniej procedury oczyszczania z wykorzystaniem standardowych technik oczyszczania białka. W sposób alternatywny względem ekspresji rekombinacyjnej białko, polipeptyd lub peptyd HA można syntetyzować chemicznie za pomocą standardowych technik syntezy białek. Co więcej, natywne białko HA można wyizolować z komórek (np. komórek nabłonka), na przykład za pomocą przeciwciał anty-HA, wyprodukowanych standardowymi technikami z wykorzystaniem białka HA według wynalazku lub jego fragmentu.
Wynalazek dostarcza także chimerowych lub fuzyjnych białek HA. „Białko chimerowe”lub „białko fuzyjne”HA zawiera polipeptyd HA połączony funkcjonalnie z polipeptydem nie-HA. Pojęcie „polipeptyd HA”odnosi się do polipeptydu posiadającego sekwencję aminokwasową odpowiadającą HA, podczas gdy pojęcie „polipeptyd nie-HA” odnosi się do polipeptydu o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej białku, które nie jest zasadniczo homologiczne do białka HA np. białku różniącemu się od HA i pochodzącemu z tego samego lub innego organizmu. Jeśli chodzi o białko fuzyjne, określenie „połączony funkcjonalnie”mawskazywać, że polipeptyd HA i polipeptyd nie-HA połączone są ze sobą w ramce („in frame”). Polipeptyd nie-HA może być dołączony do C lub N końca polipeptydu HA. Na przykład w jednej postaci, białko fuzyjne jest białkiem GST-HA, w którym sekwencje HA dołączone są do C końca sekwencji GST. Takie białka fuzyjne ułatwiają oczyszczanie zrekombinowanych białek HA. W innej postaci, białko fuzyjne jest białkiem HA zawierającym heterologiczną sekwencję sygnałową na swoim N końcu. Dzięki zastosowaniu heterologicznej sekwencji sygnałowej, w niektórych komórkach gospodarza (np. ssaczych) ekspresja i/lub sekrecja białka HA może ulec podwyższeniu.
Chimerowe lub fuzyjne białko HA wynalazku korzystnie wytwarzane jest z zastosowaniem standardowych technik rekombinacji DNA. Na przykład fragmenty DNA kodujące różne sekwencje polipep32
PL 195 942 B1 tydowe są ligowane razem w ramce zgodnie z konwencjonalnymi technikami, na przykład poprzez stosowanie do ligacji tępych lub lepkich końców, trawienie enzymami restrykcyjnymi w celu uzyskania końców odpowiednich, należyte uzupełnianie lepkich końców, traktowanie fosfatazą alkaliczną w celu wykluczenia niepożądanego łączenia oraz ligację enzymatyczną. W innej postaci, gen fuzyjny może być zsyntetyzowany przy użyciu konwencjonalnych technik wliczając w to automatyczne syntezery DNA. Wsposób alternatywny, amplifikacja fragmentów genu za pomocą PCR może zostać przeprowadzona z użyciem kotwiczących starterów, dających początek komplementarnym sekwencjom zachodzącym pomiędzy dwoma kolejnymi fragmentami genu, które następnie mogą być połączone i reamplifikowane w celu utworzenia sekwencji genu chimerowego (patrz np. Current Protocols in Molecular Biology, eds., Ausubel i wsp., John Wiley&Sons; 1992). Co więcej, wiele wektorów ekspresyjnych jest dostępnych komercyjnie i koduje od razu część fuzyjną (np. polipeptyd GST). Kwas nukleinowy kodujący HA może być klonowany do takiego wektora ekspresyjnego w sposób sprawiający, że część fuzyjną połączona jest w ramce z białkiem HA.
Homologi białka HA mogą być tworzone poprzez mutagenezę np. określoną mutację punktową, lub też cięcie białka HA. Użyty tutaj termin „homologi” odnosi się do różnych form białka HA działających agonistycznie lub antagonistycznie względem aktywności białka HA. Agonista białka HA zasadniczo zachowuje tę samą lub częściową aktywność biologiczną białka HA. Antagonista białka HA może hamować jedną lub więcej spośród aktywności naturalnie występujących form białka HA poprzez, np. konkurencyjne wiązanie się do elementu układu HA znajdującego się w części dolnej bądź górnej tego układu i obejmującego białko HA. Białko HA C.glutamicum oraz jego homologi według niniejszego wynalazku modulować mogą zatem u tego mikroorganizmu działanie jednego lub więcej spośród szlaków transportu cukru lub wewnątrzkomórkowych szlaków transdukcji sygnału, w których same uczestniczą.
W alternatywnej postaci, homologi białka HA można identyfikować poprzez przeszukiwanie kombinatorycznych bibliotek mutantów białka HA np. mutantów powstałych w wyniku skracania, pod względem aktywności agonistycznej lub antagonistycznej wobec białka HA. Wjednej postaci, metodą mutagenezy kombinatorycznej na poziomie kwasu nukleinowego tworzy się zróżnicowaną bibliotekę odmian HA kodowanych przez zróżnicowaną bibliotekę genową. Zróżnicowaną bibliotekę odmian HA można stworzyć naprzykład za pomocą enzymatycznej ligacji mieszaniny syntetycznych oligonukleotydów z sekwencjami genowymi w taki sposób, że zdegenerowany zbiór potencjalnych sekwencji HA może ulec ekspresji w formie pojedynczych polipeptydów lub, alternatywnie, jako zbiór większych białek fuzyjnych (np. w obrazie fagowym) zawierający zbiór sekwencji HA. Istnieje wiele metod wykorzystywanych do tworzenia bibliotek potencjalnych homologów HA ze zdegenerowanej sekwencji oligonukleotydowej. Chemiczną syntezę zdegenerowanej sekwencji genowej można przeprowadzić w automatycznym syntezatorze DNA, a syntetyczny gen następnie zligować do odpowiedniego wektora ekspresyjnego. Wykorzystanie zbioru zdegenerowanych genów pozwala zgromadzić w jednej mieszaninie wszystkie sekwencje kodujące pożądany zbiór potencjalnych sekwencji HA. Metody syntezy zdegenerowanych oligonukleotydów są znane w nauce (patrz np. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura i wsp. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura i wsp. (1984) Science 198:1056; Ike i wsp. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Poza tym biblioteki fragmentów sekwencji kodujących białka HA można wykorzystać do tworzenia zróżnicowanej populacji fragmentów HA służących do przeszukiwania i następnie selekcji homologów białka HA. W jednej postaci, bibliotekę fragmentów sekwencji kodujących można stworzyć poprzez traktowanie dwuniciowego fragmentu PCR sekwencji kodującej HA nukleazami w warunkach, w których każda cząsteczka nacinana jest tylko w jednym miejscu, po czym następuje denaturacja dwuniciowego DNA, renaturacja DNA do postaci dwuniciowej mogącej zawierać sensowne/antysensowne pary z różnych produktów trawienia, usuwanie części jednoniciowych z uformowanych fragmentów dwuniciowych za pomocą nukleazy S1i w końcu ligacja otrzymanej biblioteki fragmentów do wektora ekspresyjnego. Dzięki zastosowaniu tej metody można otrzymać bibliotekę ekspresyjną kodującą fragmenty N i C końcowe oraz wewnętrzne fragmety białka HA o różnych rozmiarach.
Znanych jest kilka technik poszukiwania produktów genowych z kombinatoryjnych bibliotek utworzonych poprzez mutacje punktowe lub skracanie i przeszukiwania bibliotek cDNA w celu wykrycia produktów genowych posiadających wybrane właściwości. Techniki te są przystosowane do szybkiego przeszukiwania bibliotek genowych wytworzonych metodą kombinatorycznej mutagenezy homo logów HA. Najczęściej stosowane, mogące podlegać analizie o wysokiej przepustowości, techniki do przeszukiwania dużych bibliotek genowych zazwyczaj obejmują klonowanie biblioteki genowej do
PL 195 942 B1 zdolnych do replikacji wektorów ekspresyjnych, transformację odpowiednich komórek otrzymaną biblioteką wektorową, wreszcie ekspresję kombinatorowych genów w warunkach, w których izolacja wektora kodującego dany gen ułatwiona jest poprzez wykrywanie pożądanej aktywności jego produktu (lub: w których wykrywanie pożądanej aktywności ułatwia izolację wektora kodującego gen, którego produkt był wykrywany). W celu identyfikacji homologów HA wykorzystać można kombinację metody przeszukiwania bibliotek i rekursywnej mutagenezy zespołowej („recursive ensemble mutagenesis”) (REM), nowej technologii zwiększającej częstość występowania funkcjonalnych mutantów w bibliotekach (Arkin i Yourvan (1992) PNAS 89:7911-7815; Delgrave i wsp. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).
W innej postaci, do analizy zróżnicowanej biblioteki HA można zastosować testy komórkowe posługując się w tym celu metodami znanymi w nauce.
D. Zastosowanie i sposoby według wynalazku
Cząsteczki kwasu nukleinowego, białka, homologi białek, białka fuzyjne, startery, wektory i komórki gospodarza tu opisane mogą być zastosowane w jednej lub więcej spośród następujących metod: identyfikacji C.glutamicum i spokrewnionych organizmów; mapowania genomów organizmów spokrewnionych z C.glutamicum; identyfikacji i lokalizacji danych sekwencji C.glutamicum; w badaniach ewolucyjnych; ustalaniu rejonów białka HA niezbędnych do jego działania; modulacji działania białka HA; modulacji działania szlaku HA; wreszcie, modulacji komórkowego wytwarzania pożądanych związków, takich jak związki wysoko wartościowe.
Cząsteczki kwasu nukleinowego HA według wynalazku mają różnorakie zastosowanie. Po pierwsze, mogą być wykorzystane do identyfikacji organizmu będącego Corynebacterium glutamicum lub z nim spokrewnionego. Mogą one być także wykorzystane do ustalenia obecności C.glutamicum lub organizmów spokrewnionych w mieszaninie populacyjnej mikroorganizmów. Wynalazek dostarcza sekwencji kwasu nukleinowego wielu genów C.glutamicum; poprzez badanie w ostrych warunkach wyekstrahowanego, genomowego DNA pochodzącego z hodowli pojedynczych lub mieszanych populacji mikroorganizmów, stosując sondę wiążącą się do unikalnego dla C.glutamicum rejonu danego genu, można stwierdzić czy ten organizm jest w hodowli obecny.
Chociaż samo Corynebacterium glutamicum nie jest gatunkiem patogennym, spokrewnione jest z gatunkami patogennymi, takimi we jest przyczyną zachorowań na błonicę (dyfteryt), szybko postępującą, ostrą i powodującą gorączkę infekcję, wywołującą zarówno miejscowe, jak układowe patologie. W chorobie tej tworzą się miejscowe uszkodzenia wyższych dróg oddechowych obejmujące niszczenie komórek nabłonka; toksyna, którą wydzielają zarazki rozprzestrzenia się poprzez to uszkodzenie do obwodowych, podatnych tkanek ciała. Zmiany degeneracyjne wywołane zahamowaniem syntezy białka w tkankach takich jak serce, mięśnie, nerwy obwodowe, nadnercza, nerki, wątrobę i śledzionę powodują układową patologię choroby. Nadal odnotowuje się wysoką zachorowalność na dyfteryt w wielu częściach świata wliczając w to Afrykę, Azję, wschodnią Europę i niezależne republiki byłego Związku Radzieckiego. Występowanie epidemii błonicy w dwóch ostatnich rejonach spowodowało co najmniej 5000 zgonów od 1990 roku.
W jednej postaci, wynalazek dostarcza metody wykrywania obecności lub aktywności Corynebacterium diphteriae u badanego osobnika. Metoda ta obejmuje wykrywanie jednej lub więcej spośród sekwencji kwasu nukleinowego lub sekwencji aminokwasowych według wynalazku u badanego osobnika, co umożliwia wykrycie u niego obecności bądź aktywności Corynebacterium diphteriae. C.glutamicum i C.diphteriae są gatunkami spokrewnionymi i wiele cząsteczek kwasu nukleinowego oraz białek u C.glutamicum jest homologicznych do cząsteczek kwasu nukleinowego i białek C.Diphteriae, mogą być one zatem wykorzystane do wykrywania C.diphteriae u badanego osobnika.
Cząsteczki kwasu nukleinowego i białka według wynalazku mogą także służyć jako znaczniki specyficznych rejonów genomu. Ma to zastosowanie nie tylko przy mapowaniu genomu, lecz również w badaniach czynnościowych białek C.glutamicum. Na przykład, w celu identyfikacji obszaru genomu, do którego przyłącza się konkretne białko łączące się z DNA u C.glutamicum, genom C.glutamicum może zostać strawiony, a jego fragmenty inkubowane z białkiem wiążącym się z DNA. Te, które wiążą się z białkiem można dodatkowo traktować sondami cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku, najlepiej sprzężonymi z łatwo wykrywalnym znacznikiem; wiązanie się takiej cząsteczki kwasu nukleinowego do danego odcinka genomu umożliwia jego lokalizację na mapie genomowej C.glutamicum, a jeśli przeprowadzane jest wielokrotnie z użyciem rozmaitych enzymów, ułatwia szybkie określenie sekwencji aminokwasowej, do której wiąże się białko. Ponadto, cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku mogą być na tyle homologiczne do (odpowiednich) sekwencji DNA bakterii
PL 195 942 B1 gatunków pokrewnych, że mogą posłużyć jako znaczniki do konstruowania mapy genomowej takich bakterii pokrewnych, jak choćby Brevibcterium lactofermentum.
Cząsteczki kwasu nukleinowego HA według wynalazku są także przydatne do badań struktury białek oraz badań ewolucyjnych. Układ pobierania cukrów, w którym biorą udział cząsteczki według wynalazku, wykorzystywany jest przez bardzo wiele różnych bakterii; poprzez porównywanie sekwencji cząsteczek kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku z sekwencjami kodującymi podobne enzymy u innych organizmów, można oszacować pokrewieństwo pomiędzy nimi. Podobnie, takie porównanie pozwala na ocenę, które spośród regionów tej sekwencji są konserwowane, a które nie, co może pomóc przy określaniu tych rejonów białka, które istotne są dla działania enzymu. Jest to przydatne do badań nad inżynierią białek i wskazywać może, jakie zmiany, w warunkach mutagenezy, niewpływają na utratę funkcji białka.
Wynikiem manipulacji dokonywanych na cząsteczkach kwasu nukleinowego HA według wynalazku, może być tworzenie białek HA wykazujących funkcjonalne różnice względem białek HA typu dzikiego. Białka te mogą charakteryzować się podwyższoną lub obniżoną wydajnością bądź aktywnością lub mogą występować w komórce w większej niż zazwyczaj liczbie.
Wynalazek dostarcza metod przesiewania cząsteczek, które modulują aktywność białka HA, bądź poprzez oddziaływanie z samym białkiem lub z jego substratem czy cząsteczką wiążącą się z nim, bądź poprzez modulowanie procesu transkrypcji lub translacji cząsteczki kwasu nukleinowego HA według wynalazku. Wmetodach takich mikroorganizm, w którym ekspresji ulega jedno lub więcej białek HA według wynalazku, poddawany jest oddziaływaniu jednego lub więcej związków testowych, po czym oceniany jest wpływ każdego związku testowego na poziom aktywności lub ekspresji białka HA.
Cząsteczki HA według wynalazku można modyfikować w taki sposób, że wydajność, produkcja i/lub efektywność produkcji jednego lubwięcej związków wysokowartościowych ulega poprawie. Przykładowo, zmieniając aktywność tych białek można modulować strukturę lub grubość ściany komórkowej. Ściana komórkowa w znacznej mierze służy jako element chroniący przed liżą osmotyczną i wywołanym przez czynniki zewnętrzne uszkodzeniem; modyfikując ścianę komórkową można zwiększyć zdolność C.glutamicum do wytrzymywania wstrząsu mechanicznego i siły ścinania, którym poddane są mikroorganizmy podczas hodowli w fermentorze w wielkiej skali. Ponadto, każda komórka C.glutamicum jest otoczona grubą ścianą komórkową i co za tym idzie znacząca część biomasy w wielkoskalowej hodowli stanowi ściana komórkowa. Zwiększając tempo syntezy ściany komórkowej lub aktywując syntezę ściany komórkowej (przez genetyczną przebudowę białek ściany komórkowej HA według wynalazku) możliwa jest poprawa szybkości wzrostu mikroorganizmu. Podobnie, zmniejszając aktywność lub ilość białek uczestniczących wdegradacji ściany komórkowej lub zmniejszając hamowanie biosyntezy ściany komórkowej można uzyskać ogólne zwiększenie wytwarzania ściany komórkowej. Zwiększenie ilości żywych komórek C.glutamicum (które może być osiągnięte przez jakiekolwiek opisane zmiany białek) powinno doprowadzić do zwiększenia liczby komórek wytwarzających żądany wysokowartościowy związek chemiczny w hodowli w fermentorze w wielkiej skali, co powinno pozwolić na zwiększenie wydajności lub skuteczności wytwarzania tych związków w hodowli.
Modulowanie aktywności lub liczby białek HA z C.glutamicum uczestniczących w modyfikowaniu lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych może mieć również bezpośredni lub pośredni wpływ na wytwarzanie jednego lub więcej wysokowartościowych związków chemicznych w tych komórkach. Określone produkty modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych są pożądane jako wysoko wartościowe związki chemiczne (np. kwasy organiczne lub zmodyfikowane związki aromatyczne lub alifatyczne) tak więc przez modyfikację enzymów przeprowadzających te modyfikacje związków (np. hydroksylację, metylację lub izomeryzację) lub reakcje degradacji można zwiększyć ilość wytwarzanych, pożądanych związków. Podobnie, zmniejszając aktywność lub liczbę białek uczestniczących w szlakach, które dalej degradują produkty modyfikacji lub rozpadu wyżej wspomnianych reakcji można zwiększyć wydajność tych wysokowartościowych związków chemicznych uzyskiwanych z hodowli komórek C.glutamicum.
Enzymy modyfikujące i degradujące związki aromatyczne i alifatyczne same są wysokowartościowymi związkami chemicznymi. W oczyszczonej postaci enzymy te mogą być użyte do degradacji związków aromatycznych i alifatycznych (np. toksycznych substancji chemicznych, takich jak produkty ropopochodne) zarówno dla odtwarzania biologicznego skażonych miejsc, dla przeprowadzenia rozkładu odpadów, lub do ekonomicznie opłacalnej i prowadzonej w wielkiej skali produkcji pożądanych zmodyfikowanych związków aromatycznych lub alifatycznych lub ich produktów rozpadu, z których niektóre mogą być tradycyjnie użyte jako źródła węglalub energii dla wytwarzania w hodowli innych
PL 195 942 B1 cennych związków (patrz np. Faber, K. (1995) Biotransformation in Organie Chemistry, Springer: Berlin i zawarte w niej cytowania i Roberts, S.M. wyd. (1992-1996) Preparative Biotransformation, Wiley: Chichester i zawarte w niej cytowania). Zmieniając genetycznie te białka tak, że ich regulacja przez inne mechanizmy komórkowe jest zmniejszona lub zniesiona, można będzie zwiększyć ogólną ilość lub aktywność tych białek i co za tym idzie poprawić nie tylko wydajność wytwarzanych wysokowartościowych związków chemicznych, lecz również aktywność tych zbieranych białek.
Modyfikacja enzymów biorących udział w modyfikacji i degradacji związków aromatycznych i alifatycznych może mieć również pośredni wpływ na wytwarzanie jednego lub większej liczby wysokowartościowych związków chemicznych. Wiele związków aromatycznych i alifatycznych (takich jak te, które mogą być traktowane jako zanieczyszczenia w pożywce hodowlanej lub jako produkty odpadowe metabolizmu komórki) jest toksycznych dla komórek; przez modyfikowanie i/lub degradowanie tych związków, które umożliwia łatwe ich usunięcie lub zniszczenie powinna być zwiększona żywotność komórki. Ponadto, enzymy te mogą modyfikować lub degradować te związki w taki sposób, że otrzymane produkty mogą być włączone do normalnych szlaków komórkowych metabolizmu węgla, czyniąc komórkę zdolną do wykorzystania tych związków jako alternatywnych źródeł węgla lub energii. W przypadku hodowli w wielkiej skali, gdzie może być ograniczona ilość optymalnych źródeł węgla, enzymy te dostarczają sposobu w jaki komórki mogą kontynuować wzrost i podział wykorzystując związki aromatyczne lub alifatyczne jako substancje pokarmowe. W każdym z tych przypadków zwiększona w hodowli ilość komórek C.glutamicum wytwarzających pożądane wysokowartościowe związki powinna z kolei prowadzić do zwiększonej wydajności lub efektywności produkcji wysokowartościowych związków chemicznych.
Modyfikacje aktywności lub liczby białek HA uczestniczących w metabolizmie związków nieorganicznych mogą również bezpośrednio lub pośrednio wpływać na wytwarzanie jednego lub większej liczby wysokowartościowych związków chemicznych w C.glutamicum lub hodowli pokrewnych bakterii. Przykładowo, wiele pożądanych wysokowartościowych związków chemicznych, takich jak kwasy nukleinowe, aminokwasy, kofaktory i witaminy (np. tiamina, biotyna i kwas lipoilowy) nie może być syntetyzowych bez cząsteczek nieorganicznych takich jak fosfor, azotan, siarczan i żelazo. Białka według wynalazku związane z metabolizmemzwiązków nieorganicznych pozwalaj ą komórce uzyskać te cząsteczki z różnorodnych związków nieorganicznych i przekształcić je w szlakach biosyntezy w różne cenne związki. Zatem zwiększając aktywność lub liczbę enzymów uczestniczących w metabolizmie tych związków nieorganicznych można zwiększyć ilość dostarczanych limitujących substancji nieorganicznych i w ten sposób bezpośrednio zwiększyć produkcję lub efektywność produkcji różnych wartościowych związków chemicznych w komórkach C.glutamicum zawierających takie zmienione białka. Modyfikacja aktywności lub liczby enzymów metabolizmu związków nieorganicznych według wynalazku może również uczynić C.glutamicum zdolną do lepszego wykorzystania ograniczonych zasobów związków nieorganicznych lub wykorzystania nieoptymalnych związków nieorganicznych dla syntezy aminokwasów, witamin, kofaktorów lub kwasów nukleinowych, z których wszystkie są niezbędne dla kontynuacji wzrostu i replikacji komórki. Zwiększając żywotność tych komórek w hodowli w wielkiej skali zwiększy się również ilość komórek C.glutamicum wytwarzających jeden lub więcej wartościowych związków chemicznych w hodowli, co z kolei zwiększa wydajność lub efektywność produkcji jednego lub więcej wartościowych związków chemicznych.
Enzymy C.glutamicum dla procesów ogólnych są same w sobie pożądanymi cennymi związkami chemicznymi. Specyficzne właściwości enzymów (tj. między innymi regiospecyficzność i stereospecyficzność) czynią je użytecznymi katalizatorami dla reakcji chemicznych in vitro. Z odpowiednim substratem mogą być inkubowane całe komórki C.glutamicum, tak że pożądany produkt jest wytwarzany w komórce przez enzymy lub pożądane enzymy mogą być nadprodukowane i oczyszczone z hodowli C.glutamicum (lub pokrewnej jej bakterii) i następnie wykorzystane w reakcjach in vitro o zastosowaniach przemysłowych (zarówno w roztworze lub unieruchomione na odpowiednim złożu dla immobilizującym). W każdej sytuacji enzym może być zarówno naturalnym białkiem z C.glutamicum jak i może być wynikiem mutagenezy przeprowadzanej w celu zmiany jego aktywności; typowe zastosowania przemysłowe takich enzymów obejmują stosowanie ich jako katalizatorów w przemyśle chemicznym (np. do chemicznej syntezy organicznej), jako dodatków do pokarmu, jako składników pasz, do obróbki owoców, do obróbki skóry, w detergentach, w analizach i medycynie i w przemyśle tekstylnym (patrz np. Yamada, H. (1993) „Microbial reactions for the production of useful organie compounds” Chimica 47:5-10; Roberts, S.M. (1998) Preparative Biotransformations: The employment of enzymes and whole cells in synthetic chemistry J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:157-169; Zaks, A.
PL 195 942 B1 i Dodds, D.R. (1997) „Application of biocatalysis and biotransformations to the synthesis of farmaceuticals”DDT 2: 513-531; Roberts , S.N. i Williamson, N.M. (1997) „The use of enzymes for the preparation of biologically active natural products and analogues in optically active form” Curr. Organ. Chemistry 1: 1-20; Faber. K. (1995) Biotransformation in Organie Chemistry, Springer: Berlin; Roberts S.M. wyd. 1992-96) Preparative Biotransformations, Willey: Chichester, Cheetham, P.S J. (1995) „The applications of enzymes in industry” w: Handbook of Enzymes Biotechnology wyd. 3, Wiessman, A. wyd. Elis: Horwood, str. 419-552; i Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987), tom A9, Enzymes str. 390-457). Tak więc przez zwiększenie aktywności lub liczby tych enzymów można zwiększyć zdolność komórki do przekształcenia dostarczonych substratów do pożądanych produktów lub wywołać nadprodukcję tych enzymów i zwiększyć ilość produktu końcowego w wielkoskalowych hodowlach. Ponadto, przez mutagenezę tych białek może być możliwe usunięcie hamowania zwrotnego lub innych hamujących, komórkowych mechanizmów kontrolnych tak, że może być wytworzona i aktywowana przez komórkę większa ilość tych enzymów, co prowadzi do zwiększenia wydajności, produkcji lub efektywności produkcji tych cennych białek z wielkoskalowych hodowli. Ponadto, manipulowanie tymi enzymami może zmienić aktywność jednego lub większej liczby szlaków metabolicznych C.glutamicum, takich jak szlaki dla biosyntezy lub wydzielania jednego lub większej liczby cennych związków chemicznych.
Mutageneza enzymów proteolitycznych według wynalazku, w wyniku której jest zmieniona ich aktywność lub ilość może również bezpośrednio lub pośrednio wpływać na wydajność, produkcję, i/lub efektywność produkcji jednego lub więcej cennych związków chemicznych w C.glutamicum. Przykładowo, zwiększając aktywność lub ilość tych białek można zwiększyć zdolność bakterii do przeżycia w wielkoskalowej hodowli, dzięki zwiększonej zdolności komórki do szybkiego degradowania błędnie złożonych białek w odpowiedzi na wysokie temperatury, nieoptymalne pH i inne czynniki wstrząsowe, którym poddana jest bakteria podczas hodowli w fermentorze. Zwiększona ilość komórek w tych hodowlach może prowadzić do zwiększonej wydajności lub efektywności produkcji jednego lub większej liczby cennych związków chemicznych, dzięki stosunkowo dużej ilości komórek, które w hodowli wytwarzają te związki. Również komórki C.glutamicum posiadają wielofunkcyjne proteazy powierzchniowe służące do degradacji zewnątrzkomórkowych substancji odżywczych do cząsteczek, które mogą być łatwiej pobierane przez komórki jako źródła węgla/energii lub substancji odżywczych innego rodzaju. Zwiększona aktywność lub ilość takich enzymów może zwiększyć to przekształcenie i zwiększyć ilość dostępnych substancji odżywczych poprawiając w ten sposób wzrost komórki lub produktywność. Zatem proteazy według wynalazku mają pośredni wpływ na wytwarzanie cennych produktów przez C.glutamicum.
Bardziej bezpośredni wpływ na wytwarzanie wysokowartościowych związków chemicznych w odpowiedzi na modyfikację jednej lub więcej proteaz według wynalazku może wystąpić, gdy proteazy te uczestniczą w wytwarzaniu lub degradacji pożądanego cennego związku chemicznego. Przez zmniejszenie aktywności proteazy degradującej cenny związek chemiczny lub białko uczestniczące w syntezie cennego związku chemicznego może być możliwe zwiększenie poziomów cennego związku (dzięki zmniejszonej degradacji lub zwiększonej syntezie związku). Podobnie, zwiększając aktywność proteazy, która degraduje związek, aby uzyskać cenny związek chemiczny lub białko uczestniczące w degradacji cennego związku, powinno się uzyskać podobny wynik: zwiększone poziomy pożądanego cennego związku chemicznego z komórek C.glutamicum zawierających te przebudowane białka.
Wyżej wspomniane strategie mutagenezy dla białek HA prowadzące do zwiększonej wydajności wysokowartościowego związku chemicznego z C.glutamicum nie są jedyne; warianty tych strategii będą oczywiste dla specjalistów. Stosując takie strategie i włączając ujawnione tu mechanizmy kwasy nukleinowe i cząsteczki białka według wynalazku mogą być wykorzystane do wytwarzania C.glutamicum lub pokrewnych szczepów bakterii wyrażających zmienione przez mutacje kwasy nukleinowe HA i cząsteczki białka, tak że poprawia się wydajność, produkcja i/lub efektywność produkcji pożądanego związku. Ten pożądany związek może być jakimkolwiek produktem wytworzonym przez C.glutamicum, który obejmuje końcowe produkty szlaków biosyntezy i produkty pośrednie występujących w naturze szlaków metabolicznych, jak również cząsteczki, które w naturze nie występują w metabolizmie C.glutamicum, lecz które są produkowane przez szczep C.glutamicum według wynalazku.
Niniejszy wynalazek jest w dalszej części zilustrowany przykładami, które nie powinny być interpretowane jako wyczerpujące wszystkie możliwości w tym zakresie. Treść wszystkich cytowanych w tym zgłoszeniu, zgłoszeń patentowych, patentów, opublikowanych zgłoszeń patentowych, Tablicy oraz Listy Sekwencji włączono tu jako odnośniki.
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
Kwas Aminokwas Kod identyfikacji Konta, NT· Start NT Stop Funkcja nukleinowy Sekw. Nr id,. .
Sekw. Nr.
PL 195 942 B1 i2
ιη iq to tg tg co co co co tó O COCO <<<<<
ggggg w co co ω o <<<<·<
oooo _i _j _j -i >- 5- >- >o o o o '2 X Z. Z o o o o tt. Cć CĆ Cć p Q O Q >· >- >- >X X X X o o o o □ ΩΩΟ
O O O BBB < < < ggg sgs •st
CO to CM CO CO F
CO CD F O CM O -<- F ί- N K> CC co xt cd cc co
O O CM CM 07
CO. V- -«- 'M- F tD
CO ·*— CO v- t“, ro v- v—
F F V- co ΓΜ 'sT^CO^fOCOco0
N N ω in S O
OOO^OOoO o o o o A Q o t: XX££>C£i£>X ooo$oo>o
CM T- CM σ>
xj- to cn ca; co f
O CO CM ID CM
LO V- x+ 5t ΧΓ Tf v-Mn to co co ir> ir> cm
CO CD xf- W LO &> CO CT) CO CO CO F
CM CO O CO CM M x£ x— co cn tn co cm i UJ®
CM £- O CO O u f% α X et o o >
to co tn m co en o o tn to CM CD CO 'tf Xj- ^C<5 zrx σι ci « η -i °> °> + a S co co p
O O o S fi· <c <c Ι2«χ i SgZBgS
00522 9S§§§ 00^-¾ XC2TgsS uj lj O < P te te θ 4 o
9ρ<<«; 23£xgg S -- S: 5 Ś S
IU 'JJ j < < O O ΓΥ Q y X o o o cćtz&gSte ee&ŁSiS x x 3 9 2 2 LUUJiTiSSS£?QKS§S A A G_ < F <
co
N
F to
CDCOFlOr-kOFF cococct-cdcmt—^+co cocob-ł-omcoŁom
CMr-^-FtOtOcO-ę-tD s<
F F CO O CD CR ΙΛ _ O CM .
P* — ° θ CD o tJ- co CM T-O ω r- C\I O? O CO
OSDC7>Ot-S F CO tD CD V- CO-r-OtOmtOCOtO F ’φ CO ro-M-cob-cMN-cOfOcOT-roiOT—encGcotocjio-M-CJio F F
CM<?3tDC0'r--i-T-F0>CDx}'*~Fv-CM'v-tDFFF<O'r--»~ v— CO co oj o> . cd po f co u? σι coco cmco^co.
O CD O co CÓ 0 ID +· Lf) Pj v- N F rO N ·Ό (O ci -to tO h- tn r\j Oj b~. fsJ O cM
O O O cjOO O O O O Oj O O A. o O O O
O O O o O ° OOOOoOOoOOOOooooSoOOCOCOrŚ ϋϋϋ$ϋΰοοϋϋ>ϋϋ>θϋϋϋ <O F .νO O O CO 05 t—
O O CM W $ & & ω
CDCOOCMrtCDCOO cncoooooo-rv- t—CMCMCMCMCMCM
LO F 03 X— CO to F σ> T-rencbcnooooo £ v- v- CM CM CM CM CM co cm ? 52 cn ęO to fo
m. F tf) r? m “i η m ^iiiiiiliii ii . . ,,, . ,n CO V *“ co CO to. CD π- V> CD UD CO CM CO
COFCOi^CO^-iilOrMFF^iniDO^i-tD^OOŁOTV-CM Οσ^Ο CM yOr-v-CMO V~- T-CMCO-i-1— COCMO oooooooooooooo <.< <£ZZZZZZZZZZZ
.........
. CM O O CM o o oft o o z
Z.Z, Z. &%&
cm f LO CO x- F v- O gg
CM X?·' CD CO O CM ^CDCOOCM^iCDCÓDCMM-tDCOOCMTt-CDCOOCM^htDCO· O CM CM gj £j CM CM CO CO CO CO CO +Γ ’Φ «7 Φ tp tp 10 CO. CD tp CD CD C- 1>
CM CM CM CM CM
CMCMCMCMCMCMCMCMCMCMrMCMCMCMCMCMCMCMCMCMtNCM
V- C7 m s OT -Γ- COLOFCr>T-COlOFCJ>T-COLOFCOv-COlOFCO-«“tOLOF CRv~ t- X- T~ t- V- CM CM CM CM CM fO CO COCO CO ν M M ŁO LO LO LO LO CO CO CD CD tO S CM CM CM CM CM CM CMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCM.CMCM CM CM
PL 195 942 B1
333 334 RXS00153 W0167 41S5 4620 BIAŁKO GUZOWATOŚCI
Ureaza ...
Kwas Aminokwas Kod identyfikacji Kontig, NT Start NT Stop Funkcja nukleinowy Sekw. Nr Id.
Sekw. Nr.
PL 195 942 B1
Metabolizm fosforanu i fosfonianu
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
Tablica 2: Geny nie objęte wynalazKiem
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
15(9):3917(1987)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
Tablica 3: Szczepy Corynebacterium and Breyibacterium,, które mogą być zastosowane w praktyce wynalazku
Rodzaj Gatunek ATCC FERM NRRL CECT NCMIB CBS NCTC DSMZ
Breyibacterium ammoniagenes 21054
Breyibacterium ammoniagenes 19350’
Breyibacterium · ammoniagenes 19351'
Breyibacterium ammoniagenes 19352
Breyibacterium ammoniagenes . .' 19353
Breyibacterium ammoniagenes 19354
Breyibacterium ammoniagenes 19355
Breyibacterium ammoniagenes - 19356
Breyibacterium ammoniagenes 21055
Breyibacterium ammoniagenes. 21077
Breyibacterium ammoniagenes 21553
Breyibactermm ammoniagenes 21580
Breyibacterium ammoniagenes 39101
Breyibacterium. butenicum 21196
Breyibacterium diyarfcatan. 21792 P928
Breyibacterima flarom . ... 21474
Breyibacterium flarom ·, 21129
Breyibacterium fimim ' 21518 .
Breyibacterium flayiStn BI 1474
Breyibacterium flarom BI 1472
Brevibacterium flarom 21127
Breyibacterium flarom 21.128
Breyibacterium flarom . . 21427 .
Breyibacterium flayttoa 21475 .
Breyibacterium' flarom ' 21517 ’
Breyibacterium flayiim , 21528
Breyibacterium flarom 21529
Breyibacterium · flarom B11477
Breyibacterium flarom BI1478
Breyibacterium flayiim 21127
Brevibacterińm flarom BI1474
Breyibacterium healil . 15527
Breyibacterium ketoglntamicum . 21004
Breyibacterium ketogiutamicum. 21089
Breyibacterium kefosoreduettim 21914
Breyibacterium . iactofermentum 70
Breyibacterium Iactofermentum - 74
Breyibacterium Iactofermentum . 77
Breyibacterium ' Iactofermentum . 21798
Breyibacterium Iactofermentum ’ 21799
Breyibacterium iactofermentum 21800-
Breyibacterium iactofonnenfhtn. 21801
Breyibacterium lactofennentutn .BI 1470
Breyibacterium ' Iactofermentum B11471
Breyibacterium Iactofermentum 21086
Breyibacterium laćtoźsrinęntuni 21420
PL 195 942 B1
Tablica 3 (cd.)
Breyibacienum łactofermentum 21086
BTevibacterium łactofermentum ' 31269
Brevibaćterium linens ' 9174
Breńbacterium linens 19391 .
Breyibacterium ,, linens 8377
Breyibacterium paraffinolyticum .11160 .
Brsvibacterium - spec. ł 717.73
Breyibacterium spec.- 717.73
Breyibacterium . Sp«C. 14604
Breribacteriusn . spec. . 21860
Brevibacteriinn spec. 21864
Breyibacieriuia · spec. 21265 1
BreYibacteriuci, spec. - 21866
Breyibacterium ' spec. 19240
Corynebacterium acetoacidophilutn ·. 21476
Corynebacterium acetoacidophilum 13870 —---
Corynebacterium aceto glutamicum Β11473
Corynebacterium' aeetogjutamicom BI 1475
Corynebacterium acetoglutamicum 15806
Corynebacterium, . acetoglutarhifcnm 21491 .
Corynebacterium · aceioglutamicute 31270
Corynebacterium acetóphihun . B3671
Corynebacterium antaoniagenes 6872 2399
Coryaebaeterinm ·, amanomagenes 15511
Corynefeacteriiffii firjiókense 21496
Corynebacterium . glutamicum . 14067 '
Corynebacterium glutamicum . . 39137
Corynebacterium. gluiHmićtuiL . 21254
Corynebacterium giutamicum . 21255.
Corynebacterium glutamicum .31830 .
Corynebacterium glutamicum 13032
Corynebacterium. ghrtamictim 14305
Corynebacterium glutamicum Ϊ 5455
Corynebacterium gliitfanicum . 13058
Cotynebacteriam glutamicum 13059
Corynebacterium ghitamicum 13060
Corynebacterium glutamicum. 21492
Corynebacterium glutamicum 21513
Corynebacterium glutemicuni . 21526
Corynebacterium ghitamicum 21543
Corynebacterium gl ut and cum 13287
Corynebacterium glutamicum . 21851
Corynebacterium gjutaitiicutn 21253.
Coiyhebacierium glutamicum 21514
Corynebacterium ghitamicum 21516
Corynebacterium glutamicum 21299
Corynebacterium . glutamicum 21300
Corynebacterium glutamicum 39684
Corynebacterium glutamicum 21488
Corynebacterium glutamicum 21649
Corynebacterium glutamicum 21650
PL 195 942 B1
Tablica 3 (cd.)
Corynebacteriuni glutamicuoL . ' 19223 '
Coiynebacterium glutamicum 13869
Coiynebacterium glutamicum - 21157
Corynebacterium glutamicum 21158
Corynebacterium glutamicum 21159
Corynebacterium glutamicnm . 21355
Coiynebacteriura glutamicum 31808
Corynebacterium glutamicum ’ ' 21674
Corynebacferiita ghitamicum 21562 ..
Corynebacterium glutamicum . 21563
Corynebacterium glutamicum 21564 ! !
Corynebacterium glutamicum . 21565
Coiynebacterium ghitajłiićum 21566
Corynebacterium ghitartiiemn 21567
Corynebacterium glutamicum 21568
Coiynebacterium glutamicum 21569
Corynebacterium glutamicum 21570'
Corynebacterium glutaiaicum . 21571
Corynebacterium glutamicum 21572
Corynebacterium glutamicum 21573 -
Coiynebacterium glutamicum ' 21579
Corynebacterium glutamicum : 19049
Corynebacteriuni glutamicum . 19050
Corynebacterium glutamicum . 19051
Corynebacterium glutamicum 19052
Corynebacterium glutamicum 19053
Coryncbacterium glutamicum 19054
Corynebacteriuni glutamicum 19055 .
Corynebacterium . glutamicum 19056
Coiynebacterium glutarmcufli 19057
Coiyneb acterium glutamicum ' 19058
Coiynebacterium glutamicum . 19059
Corynebacteriuni glutamicum 19060
Coiynebacterium glutamicum 19185
Corynebacteriuni glutamicum 13286.
Coiynebacterium glutamicum 21515
Corynebacterium glutamicum 21527
Corynebacteriuni glutamicum 21544
Corynebacteriuni glutamicum 21492
Corynebacteriuni glutamicum B8183
Corynebacterium glutamicum Β8182
Corynebacteriuni , glutamicum BJ2416
Corynebacterium glutamictuii B12417
Ccaynebacterium glutsmtcuhi ' B12418
Coiynebacterium . glutamicum BI1476
Corynebacteriuni ' glutamicum 21608 .
Corynebacteriuni liliuin . PS73
Corynebacteriuni nitrilophiius 21419 11594
Coiynebacterium spec. P4445
Corynebacteriiun · spec. P4446
Coiynebacterium spec. . 31058
PL 195 942 B1
Tablica 3 (cd.)
CorynEbacterfen spec. 31089
Corynsbacterium spec. 31090
Corynebactefium spec. 31990
Corynebacterium spec. 31090
Ceryiłebacteriua. spec. - 15954 20145
Corynebacterium spec. 21857
Corynebacterium spec. 21852
Corynebacterium . spec. 21863
ATCC: AthericanType Cuiturc Coilcctioa, Rockvilk, MD, USA
FERM: Fermentation Research Iastłtute, Chiba, Japonia
NRRL: ARS Cultee Collection, Northern Regional Research Laboratay, Feeria, EL, USA
CECT: Coleceicn Espanold de Cultivos Tipo, Walencja, Hiszpania
NCfMB: National ColtectJorr of Industriał and Marinę Bacteria Ltd., Aberdeen, UK
CBS: CeatniaSbureau voor Schinraelcnltures, Baam, NL
NCTC: National CoEection of Type Culftsres, London, UK
DSMZ: Deutsche SanMnlung von Miktoorganisinen und Żellkulturęn, Braunsćhweig, Niemcy
Piśmiennictwo patrz. Sugawara; H. et al. (1993) World directory of collections of cultures of nticioorgarusnjs: Bacteria, fungi and yeasis (4* ώη), World federation for culture cbllectiosis world data center on microdrganisffls, Sarmatą, Japen. .
PL 195 942 B1
Tablica 4; Wygilrf przyrównania
DłagoSć Dostęp Mazwa trsfieah w GessBsuk % homaishii
PL 195 942 B1
Tablica 4 (cd.) rxa00152 1419 GB_BA1:?JiTCY277 38300 279701 Mycobacterium tuberculosis H37Rv complate genorne; segment Mycobacierjum 58,500 rxa00470 1392 GB_PL2:DCPCNAM 865 Χ62977 D.carola mRNAfor prolferating celi nucisar antigan (PCMA). Daucus carota 37,914 30-wrz-9&
PL 195 942 B1
Tablica 4 (c.<ł>
GB_PL2AC00B267 101644 ACOOS267 Arabidopsis Ihaiiana BAC F9M13from chromosomu IV near21,5 cM, Arabidopsis thaliana 36,153 27-kwi-99 proiease ATP-binding subuni! Clpx (clpX) gene, partial cds.
GB_BA2:AF013216 1.5742 AFO13216 WlyxOcoccus xanthus Dog (dog), isocitrate lyase (fcl), Mis (mis), Ufo Myxococcus ranihus 54,683 28-sty-98 (ufo), fumarate hydratasa (fhy), snd proteosoms major subunit (cipP) κ t
g.erses, complete cds;.and acyl-CoA oitidase (sco) gene, partial cds, .
PL 195 942 B1
Tablica. 4 (c.d.) rxaOO5S7 714 GB_BA1;M7V003 Θ3033 AL021246 Mycobacterium tuberculosis H37Rv complete genome; segment Mycobacferlum 42,090 17-cze-98
108/1S2. tuberculosis .
GB_BA1:CGBPHI16 962 Y12472 C.glulamicum DWA attachment siie bacteriophage Phi-16. Corynebacterium 40,000 OS-MAR-1993 rxaOO715 913 GB_EST30:AI547104 218 AIS47104 Vii15c01.y.1Slratagenemoussheart(#937316}MusmtKCuluscDNA Musmusculus 58,511 2&-kwi-99 ' clone !MAGE:102124&5', mRMA sequehce.
GB_EST17:AA636159 447 AA636159 vn15c01.r1 Strafagene mouse heart ;#93731S) Mus muscuius cDNA Mus musoulus 41,195 22-pa2-97 clone IMAGE:1021248 5', roRKA sequer.ce.
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
rxaO112O 1401 GBJ3A1:MTV00& 63(533 AL021245 Mycobacteriumtubsrcuiosis H37Rv complete genoms; segment Mycobactsriura 35,715 17-cze-S8
103/132. (uberculosis
GB_BA1:CAJ10321 S710 AJ010321 Caiilobacter-crescentuapartial tig gene and dpP, cicA, dpX, lon' Allobactercrescenius 53,31-1 O1-paź-93
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
124/162. tuberculosis
GET£ST21:C89252 587 G6S252 CB9252 Mouse early blastocyst cDHA Mus musculus.cDNA clone Musmusculus 37,219 28-maj-98
01B00061JC08, mRNAsequence. .
GB_EST14:AA423349 457 AA423340 ve39d04.ri Soares mouse mammary giand NbMMG Mus muscuius Mttó muscuius 38,377 l6-paź-97 cDNA clone IMAGE:820519 5, mRNA seguence.
PL 195 942 B1
Tablica 4fa<Ł) rxa01849 1224 GB_BA1:MTCY24A1 20270 Z95207 Myeobacierium tuberculosis H37Rv complete genoms; segment Mycobacterium 39,950 1 7-cz.e-98
124/162. tuberculosis '
GB_J3A2:RCPHSYNG 45859' Z11165 .R.capsulatus cwnpteta photosynthesls gene cluster. Rhodobaetar capsulatus 37,344 O2-'ivrz-39
! s
8
T-' Vo o
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
MmcY (mmcY) gsnes, comptete cds; and unknown gi ' Tablica 4 (c-d.) rxs02477 744 GB_HTG4AC010054 130191 AC010054 Drosophila melanagaslerchroiriasofne 3L/74E2 clone RPCI98- Drosophila melanogaster' 37,463 16-paź-99
15E10,SEOUENCiNG IN PROGRESS ***, 70 unordered piecas.
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
P r z y k ł a d 1: Przygotowanie całkowitego genomowego DNA Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Hodowla Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) wzrastała przez noc w 30°C w warunkach wytrząsania w pożywce BHI (Difco). Komórki zbierano poprzez wirowanie, supernatant usuwano, komórki zawieszono w 5 ml buforu I (5% pierwotnej objętości hodowli wszystkie przedstawione objętości przeliczono na 100 ml objętości hodowlanej). Skład buforu I: sacharoza w stężeniu 140,4 g/l, 2,6 g/l MgSO4 x 7H2O, roztwór KH2PO4 10 ml/l (100 g/l o pH 6,7 ustawionym za pomocą KOH), zagęszczone M12 50ml/l (10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l NaCl, 2 g/l MgSO4 x 7H2O, 0,2 g/l CaCl2, 0,5 g/l ekstraktu drożdżowego (Difco), 10 ml/l mieszaniny mikroelementów (200 mg/l FeSO4, x H2O, 10 mg/l ZnSO4 x 7H2O, 3 mg/l MnCl2 x 4H2O, 30 mg/l H3BO3, 20 mg/l CoCl2 x 6H20, 1 mg/l NiCl2 x 6H2O, 3 mg/l Na2MoO4 x 2H2O, 500 mg/l czynnika kompleksotwórczego (EDTA lub kwas cytrynianowy), 100 ml/l mieszaniny witamin (0,2 mg/l biotyny, 0,2 mg/l kwasu foliowego, 20 mg/l kwasu p-amino-benzoesowego, 20 mg/l ryboflawiny, 40 mg/l pantotenianu wapnia, 140 mg/l kwasu nikotynowego, 40 mg/l chlorowodoru pirydoksolu, 200 mg/l mioinozytolu). Do zawiesiny dodano lizozymu o końcowym stężeniu 2,5 mg/ml. Po około 4 godzinach inkubacji w 37°C trawiono ściany komórkowe, a otrzymane protoplasty zbierano przez wirowanie. Osad protoplastów przemywano jeden raz 5 ml buforu I i jeden raz 5 ml buforu TE (10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 8). Osad zawieszano w 4ml buforu TE i dodawano 0,5 ml roztworu SDS (10%) i 0,5 ml roztworu NaCl (5M). Po dodaniu proteinazy K o końcowym stężeniu 200 mg/ml zawiesinę inkubowano około 18 godz. w 37°C. DNA oczyszczano poprzez ekstrakcję fenolem, mieszaniną fenol:chloroform:alkohol izoamylowy i chloroform-alkohol izoamylowy stosując standardowe procedury. Następnie DNA wytrącano poprzez dodanie 1/50 objętości octanu sodu 3M i 2 objętości etanolu, a następnie 30 min. inkubację w -20°C oraz wirowanie przez 30 min przy 12000 obr./min w wysokoobrotowej wirówce przy użyciu rotora SS34 (Sorvall). DNA zawieszano w 1 ml buforu TE zawierającego 20 mg/ml RNAzy A i dializowano w 4°C względem 1000 ml buforu TE przez co najmniej 3 godz. Podczas tego czasu trzykrotnie wymieniano bufor. Do objętości 0,4 ml zdializowanego roztworu DNA dodano 0,4 ml 2M LiCl i 0,8 ml etanolu. Po 30 min inkubacji w -20°C DNA zbierano poprzez wirowanie (13000 obr./min, Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau, Germany). Osad DNA zawieszano w buforze TE. DNA przygotowane z zastosowaniem tej procedury można wykorzystać do wszystkich celów, włączając hybrydyzację Southern lub tworzenie bibliotek genomowych.
P r z y k ł a d 2: Konstruowanie bibliotek genomowych Corynebacterium glutamicum ATCC13032 w Escherichia coli.
Za pomocą DNA przygotowanego wg opisu w Przykładzie 1 konstruowano plazmidowe oraz kosmidowe biblioteki zgodnie ze znanymi i ustalonymi metodami (patrz np. Sambrook, J. i wsp. (1989) „Molecular Cloning: A Labolatory Manual”, Cold Spring Harbor Labolatory Press, lub Ausubel, F.M. i wsp. (1994) „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley &Sons.) Wykorzystany mógł być jakikolwiek plazmid lub kosmid. Szczególnie przydatny był plazmid pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol 134:1141-1156), plazmidy serii pBS (pBSSK+, pBSSK- i inne; Stratagene, LaJolla, USA) lub kosmidy takie jak SuperCos1 (Stratagene, LaJolla, USA) czy Lorist6 (Gibson, T.J. Rosenthal, A. Waterson, R.H. (1987) Gene 53: 283-286). Biblioteki genowe szczególnie przydatne u C.glutamicum można skonstruować za pomocą plazmidu pSL109 (Lee, H.-S. i Sinskey, A.J. (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4:256-263).
P r z y k ł a d 3: Sekwencjonowanie i rachunkowa analiza funkcjonalna
Do sekwencjonowania DNA wykorzystano biblioteki genomowe opisane w Przykładzie 2 z zastosowaniem standardowych metod, szczególnie metody terminacji łańcucha przy użyciu maszyny sekwencyjnej ABI377 (patrz np. Fleischman, R.D. i wsp. (1995) „Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd.”, Science, 269:496-512). Użyto starterów sekwencyjnych o następującej sekwencji nukleotydowej:
5'-GGAAACAGTATGACCATG-3' lub 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'.
P r z y k ł a d 4: Mutageneza in vivo
Mutagenezę in vivo Corynebacterium glutamicum przeprowadzić można poprzez pasażowanie DNA plazmidów (lub innych wektorów) w E.coli bądź innym mikroorganizmie (np. Bacillus ssp. lub w drożdżach takich jak Saccharomyces cerevisiae), który ma osłabione zdolności utrzymania integralności swojej informacji genetycznej. Typowe szczepy mutatorowe posiadają mutacje w genach układu naprawy DNA (np. mutHLS, mutD, mutT i in.; piśmiennictwo patrz. Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, p2277-2294, ASM; Washington). Szczepy te są dobrze znane specjalistom. Wykorzystanie takich szczepów zobrazowano na przykład w Greener, A. i Callahan, M. (1994) Strategies 7:32-34.
PL 195 942 B1
P r zyk ł a d 5: Transfer DNA pomiędzy Escherichia coli i Corynebacterum glutamicum
Kilka gatunków Corynebacterium i Brevibacterum zawiera plazmidy endogenne (jak np. pHM1519 czy pBL1), które ulegają autonomicznej replikacji (patrz. Martin, J.F. i wsp. (1987) Biotechnology, 5:137-146). Wektory wahadłowe dla Escherichia coli i Corynebacterium glutamicum można z łatwością skonstruować za pomocą standardowych wektorów dla E.coli (Sambrook, J. i wsp. (1989) „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Labolatory Press, lub Ausubel, F.M. i wsp. (1994) „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley &Sons), do których dodano miejsce początku replikacji oraz odpowiedni marker pochodzący z Corynebacterium glutamicum. Takie miejsca początku replikacji pochodzą w szczególności z endogennych plazmidów wyizolowanych z gatunków Corynebacterium i Brevibacterum. Jako markery transformacyjne dla tych gatunków w szczególności przydatne są geny oporności na kanamycynę (takie, jak dostarczane z transpozonów Tn5 lub Tn903) lub na chloramfenikol (Winnacker, E.L. (1987) „From Genes to Clones - Introduction to Gene Technoloogy”, VCH, Weinheim). W literaturze istnieje wiele przykładów na konstruowanie rozmaitych wektorów wahadłowych ulegających replikacji zarówno w E.coli jak i w C.glutamicum i które mogą być zastosowane do wielu celów włącznie z nadekspresją genów (patrz np. Yoshihama, M. i wsp. (1985) J.Bacteriol. 162:591-597, Matrin, J.F. i wsp. (1987) Biotechnology, 5:137-146 i Eikmanns, B.J. i wsp. (1991) Gene, 102:93-98).
Wykorzystując standardowe metody, można klonować dane geny do jednego z opisanych wyżej wektorów wahadłowych i wprowadzić takie hybrydowe wektorydo szczepów Corynebacteium glutamicum. Tranformację C.glutamicum można osiągnąć poprzez transformację protoplastów (Kastsumata, R. i wsp. (1984) J.Bacteriol. 159:306-311), elektroporację, (Liebl, E. i wsp. (1989) FEMS Microbiol. Letters,
53:299-303), a w przypadku zastosowania specjalnych wektorów także poprzez koniugację (jak opisano np. w Schafer, A. i wsp. (1990) J.Bacteriol. 172:1663-1666). Możliwe jest także przeniesienie wektora wahadłowego dla C.glutamicum do E.coli poprzez uzyskanie plazmidowego DNA z C.glutamicum (z zastosowaniem dobrze znanych w nauce standardowych metod) i transformację do E.coli. Etap transformacji można przeprowadzić za pomocą metod standardowych, wskazanym jest jednak wykorzystanie szczepu E.coli z uszkodzonym Mcr, takiego jak NM522 (Gough & Murray (1983) J.Mol. Biol 166:1-19).
Nadekspresję genów mogą uzyskać w szczepach C.glutamicum za pomocą plazmidów zawierających pCG1 (patent USA nr 4,617,267) lub jego fragmenty oraz ewentualnie genu oporności na kanamycynę pochodzącego z TN903 (Grindley, N.D. i Joyce, C.M. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(12):7176-7180). Dodatkowo, nadekspresję genów można uzyskać w szczepach C.glutamicum za pomocą plazmidu pSL109 (Lee, H.-S. i Sinskey, A.J. (1994) J.Microbiol. Biotechnol. 4:256-263).
Oprócz wykorzystania plazmidów replikatywnych, nadekspresją genów może także zostać osiągnięta na drodze integracji do genomu. Integrację do genomu u C.glutamicum lub innych gatunków Corynebacterium bądź Brevibacterium można osiągnąć znanymi metodami, takimi jak rekombinacja homologiczna z rejonami (rejonem) genomowymi, integracja z użyciem endonukleaz restrykcyjnych (REMI) (patrz np. DE Patent 19823834) lub poprzez zastosowanie transpozonów. Możliwa jest także modulacja aktywności danego genu na drodze modyfikacji rejonów regulatorowych (np. promotora, represora i/lub wzmacniacza) poprzez modyfikację sekwencji, insercję lub delecję z zastosowaniem metod typu site-directed (np. rekombinacji homologicznej) lub metod opartych na zdarzeniach losowych (takich jak mutageneza transpozonowa lub REMI). Sekwencje kwasu nukleinowego będące terminatorami transkrypcji mogą zostać także wprowadzone na koniec 3' rejonu kodującego jednego lub więcej genów według wynalazku; terminatory takie są dobrze znane w nauce i zostały opisane np. w Winnacker, E.L. (1987) From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology. VCH: Weinheim.
P r zyk ł a d 6: Ocena ekspresji zmutowanego białka
Obserwacje aktywności zmutowanego białka w stransformowanych komórkach gospodarza opierają się na fakcie, że zmutowane białko ulega ekspresji w podobny sposób i w podobnej ilości do białka typu dzikiego. Użyteczną metodą określania poziomu transkrypcji zmutowanego genu (wskaźnik ilości mRNA dostępnego dla translacji) jest hybrydyzacja typu Northern (referencje patrz np. Ausubel i wsp.(1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York), w której po ekstrakcji całkowitego RNA z hodowli organizmu, rozdziale na żelu, przeniesieniu na filtr i inkubacji z sondą, wyznakowaną znacznikiem (przeważnie radioaktywnym lub chemiluminescencyjnym), łączącą się do danego genu, przyłączanie sondy i jakość tego łączenia określa obecność, a także ilość mRNA danego genu. Taka informacja określa stopień transkrypcji zmutowanego genu. Całkowite komórkowe RNA można otrzymać z Corynobacterium glutamicum kilkoma metodami, znanymi w technice, np. metoda opisana w Bormann, E.R. i wsp. (1992) Mol. Microbiol. 6:317-326.
PL 195 942 B1
Do określania obecności lub względnej ilości białka uzyskanego po translacji tego mRNA, można zastosować standardowe techniki, takie jak hybrydyzacja typu Western (patrz np. Ausubel i wsp.(1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). W tej procedurze wszystkie wyekstrahowane białka komórkowe rozdziela się poprzez elektroforezę w żelu, przenosi na filtr taki jak nitroceluloza i inkubuje z sondą taką jak przeciwciało, które specyficznie łączy się z danym białkiem. Sonda jest przeważnie wyznakowana znacznikiem chemiluminescencyjnym lub kolorymetrycznym, który można z łatwością wykryć. Obecność i ilość obserwowanego znacznika wskazuje na obecność i ilość pożądanego zmutowanego białka znajdującego się w komórce.
P r z y k ł a d 7: Hodowla genetycznie zmodyfikowanego Corynobacterium glutamicum - pożywki i warunki hodowli
Genetycznie zmodyfikowane komórki Corynobacteria hodowane są w syntetycznych lub naturalnych pożywkach. Wiele różnych pożywek hodowlanych dla Corynobacteria jest dobrze znanych i łatwo dostępnych (Lieb i wsp. (1989) Appl. Miocrobiol. Biotechnol., 32:205-210; von der Osten i wsp. (1998) Biotechnology Letters, 11:11-16; Patent DE 4,120,867; Lieb (1992) „The Genus Corynobacterium, The Procariotes tom II, Balows, A. i wsp. wyd. Springer- Verlag). Pożywki te zawierają jedno lub więcej źródeł węgla, źródło azotu, sole nieorganiczne, witaminy i mikroelementy. Korzystnym źródłem węgla są cukry takie jak modo-, di- i polisacharydy. Na przykład dobrymi źródłami węgla są glukoza, fruktoza, mannoza, galaktoza, ryboza, sorboza, rybuloza, laktoza, maltoza, sacharoza, rafmoza, skrobia lub celuloza. Można także dostarczać cukier do pożywki poprzez związki złożone takie jak melasa i inne produkty uboczne rafinacji cukru. Dostarczanie mieszaniny różnych źródeł węgla może także być korzystne. Innymi możliwymi źródłami węgla są alkohole, kwasy organiczne takie jak metanol, etanol, kwas octowy czy kwas mlekowy. Źródłami azotu są zazwyczaj organiczne i nieorganiczne związki azotu lub surowce zawierające takie związki. Przykładowe źródła azotu obejmują amoniak lub sole amonowe takie jak NH4Cl lub (NH4)2SO4 NK4 OH, azotany, mocznik, aminokwasy lub złożone związki azotowe takie jak roztwór z maceracji zboża, mąka sojowa, białko sojowe, ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny i inne. Związki soli nieorganicznych mogące wchodzić w skład pożywki obejmują chlorki, fosforany lub siarczany wapnia, magnezu, sodu, kobaltu, molibdenu, potasu, manganu, cynku, miedzi lub żelaza. W celu utrzymania jonów metali w roztworze do pożywki mogą być dodane związki chelatujące. Szczególnie użyteczne związki chelatujące obejmują dihydroksyfenole, takie jak katechol, protokatechuaniany lub kwasy organiczne, takie jak kwas cytrynowy. Pożywki zawierają także inne czynniki wzrostowe takie jak witaminy lub promotory wzrostu, na przykłady biotyna, ryboflawina, tiamina, kwas foliowy, kwas nikotynowy, pantotenian i pirydoksyna. Czynniki wzrostowe i sole często pochodzą ze złożonych związków pożywki takich jak ekstrakt drożdżowy, melasa, roztwór z maceracji zboża i inne. Właściwy skład pożywki zależy w dużym stopniu od eksperymentu i jest indywidualnie dobierany w każdym przypadku. Informacje o optymalizacji pożywek są dostępne w książce :Applied Microbiol Physiology, Apractical Approach (wyd. P,M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) 53-73, ISBN 019 963577 3). Można także wybrać pożywkę proponowaną przez hanglowych dostawców np. standard 1 (Merck) lub BHI (wyciąg z serca, Difco) i inne.
Wszystkie składniki pożywki są sterylizowane bądź w wysokiej temperaturze (20 min., 1.5bar, 121°C) bądź poprzez filtrację. Związki mogą być sterylizowane razem lub jeżeli jest to konieczne oddzielnie. Pożywka może zawierać wszystkie składniki od momentu rozpoczęcia hodowli lub mogą być one, stosownie do potrzeb, dodawane w sposób ciągły bądź partiami już w trakcie trwania hodowli.
Warunki hodowli są określane oddzielnie dla każdego eksperymentu. Temperatura powinna mieścić się w przedziale 15-45°C. Może być ona utrzymywana stale na tym samym poziomie lub zmieniana w trakcie eksperymentu. pH pożywki powinno znajdować się w przedziale 5-8,5, najlepiej jeśli wynosi około 7,0, a utrzymywane może być poprzez dodawanie do pożywki buforów. Przykładowy bufor przydatny do tego celu, to bufor fosforanowy. Zamiennie bądź równocześnie mogą być używane syntetyczne bufory takie jak MOPS, HEPES, ACES i inne. Utrzymywanie stałego pH hodowli możliwe jest także poprzez dodawanie NaOH lub NT4OH podczas jej wzrostu. Jeśli wykorzystywane są składniki pożywek złożonych, takie jak ekstrakt drożdżowy, zmniejsza to konieczność stosowania dodatkowych buforów, a wynika to z faktu, że wiele związków złożonych ma wysokie zdolności buforowe. W przypadku, gdy do hodowli mikroorganizmów stosowane są fermentory, pH można kontrolować za pomocą gazowego amoniaku.
Czas inkubacji zazwyczaj zawiera się. w przedziale od kilku godzin do kilku dni. Jest on dobierany tak, aby umożliwić uzyskanie maksymalnej ilości produktu w pożywce. Do przedstawionych doświadczeń hodowlanych można stosować rozmaite naczynia, takie jak płytki do mikromianowania, szklane probówki, szklane kolby oraz szklane lub metalowe fermentory o różnych rozmiarach. Aby
PL 195 942 B1 umożliwić przegląd dużej liczby kolonii, mikroorganizmy powinny być hodowane na płytkach do mikromianowania, w szklanych probówkach bądź w kolbach do wytrząsania zawierających lub nie, przegrody. Korzystnie stosowane są 100 ml kolby do wytrząsania, wypełnione żądaną pożywką hodowlaną o stężeniu 10% (objętości). Kolby powinny być wytrząsane w rotacyjnej wytrząsarce (amplituda 25 mm) z zastosowaniem prędkości w granicach 100-300 obr./min. Straty powstałe w wyniku parowania można obniżyć poprzez utrzymywanie odpowiedniej wilgotności, w przeciwnym razie powinno się stosować matematyczną korekcję strat powstałych w wyniku parowania.
W przypadku testowania genetycznie zmodyfikowanych klonów, powinno się także testować niezmodyfikowany klon kontrolny lub klon kontrolny zawierający pierwotny plazmid bez wstawki. Hodowla prowadzona jest do uzyskania OD w granicach 0,5-1,5 z użyciem inkubowanych w 30°C komórek rosnących na szalkach takich jak szalki CM (10 g/l glukozy, 2,5 g/l NaCl, 2g/lmocznika, 10g/l polipeptonu, 5g/l ekstraktu drożdżowego, 5g/lekstraktu mięsnego, 22g/l agaru, pH 6,8 doprowadzone za pomocą 2M NaOH). Pożywki szczepiona jest zawieszonymi w roztworze fizjologicznym komórkami C.glutamicum z szalek CM lub poprzez dodanie płynnej pre-hodowli tej bakterii.
Przykład 8: Analiza in vitro funkcji zmutowanych białek Metody oznaczania aktywności i parametrów kinetycznych enzymów są ustalone i wystandaryzowanie. Eksperymenty mające na celu określenie aktywności jakiegokolwiek zmodyfikowanego enzymu muszą być dopasowane do specyficznej aktywności enzymu niezmutowanego, co jest dobrze znane w nauce. Przeglądy ogólnych wiadomości o enzymach jak również o specyficznych detalach dotyczących ich struktury, kinetyki, zasad działania, metod, aplikacji i przykładów ustalania wielu aktywności enzymatycznych, można znaleźć np. w następujących referencjach: Dixson, M., Webb, E.C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersth, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanism. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D. wyd., (1983) The Enzymes, wyd. III. Academic Press: New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, wyd. II. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Graal, M., wyd. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, wyd. III., tom I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; Ullmann, Encyklopedia of Industrial Chemistry (1987) tom. A9, „Enzymes. VCH: Weinheim, str. 352-363.
Aktywność białek łączących się z DNA można mierzyć za pomocą kilku ustalonych metod, takich jak test spowolnienia migracji w żelu (zwany także retardacją żelową). Wpływ takich białek na ekspresję innych cząsteczek mierzyć można przy zastosowaniu testów genu reporterowego (takich, jak opisane w Kolmar, H. i wsp. (1995) EMBO J. 14:3895-3904 i cytowane tam piśmiennictwo). Układy oznaczeń genu reporterowego są dobrze znane i ustalone dla zastosowań zarówno w komórkach pro-, jak i eukariotycznych, a wykorzystuje się do nich takie enzymy, jak beta-galaktozydaza, białko o zielonej fluorescencji (GFP) i kilka innych.
Określenie aktywności białek transportu błonowego można przeprowadzić według takich technik, jak opisane w Gennis, R.B. (1989) „Pores, Channels and Transporters” w Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidlberg, 85-137; 199-234 i270-322.
Przykład 9: Analiza wpływu zmutowanego białka na produkcję żądanego produktu
Wpływ modyfikacji genetycznej na produkcję pożądanego składnika (takiego jak aminokwas) u C.glutamicum można ocenić hodując zmodyfikowany mikroorganizm w odpowiednich warunkach (takich jak opisane powyżej) i analizując pożywkę i/lub elementy komórkowe pod względem zwiększonej produkcji pożądanego składnika (tj. aminokwasu). Takie techniki analizy są dobrze znane specjalistom, a obejmują spektroskopię, chromatografię cienkowarstwową, rozmaite metody znakowania, metody enzymatyczne i mikrobiologiczne czy chromatografię analityczną, jak wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) (patrz np. Ullman, Encyklopedia of Industrial Chemistry (1985) tom A2, str. 89-90 i 443-613, VCH: Weinheim; Fallon, A. i wsp. (1987) „Applications of HPLC in Biochemistry” Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, tom 17; Rehm i wsp. (1993) Biotechnology, tom 3, rozdział III: „Product recovery and purification” 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. i wsp. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley & Sons; Kennedy, J.F. Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological matrials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. i Henry, J.D. (1988) Biochemical separations, Ullman^s Encyklopedia of Industrial Chemistry (1987) tom B3, rozdział 11, str. 1-27, VCH: Weinheim; oraz Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Oprócz pomiaru końcowego produktu fermentacji, możliwa jest także analiza innych składników szlaków metabolicznych wykorzystywanych przy produkcji żądanego składnika, takich jak składniki pośrednie i produkty uboczne w celu określenia całkowitej wydajności organizmu, wydajności i/lub efektywności produkcji danego składnika. Metody analizy obejmują pomiar poziomu składników od88
PL 195 942 B1 żywczych w pożywce (np. cukrów, węglowodanów, źródeł azotu, fosforanów i innych jonów), pomiar składników biomasy i jej wzrostu, analizę produkcji pospolitych metabolitów szlaków biosyntetycznych oraz pomiar gazów produkowanych podczas fermentacji. Standardowe metody pomiarów wyszczególnione są w Applied Microbial Physiology, A Practical Approach, Rhodes, P.M. i Stanbury, P.F. wyd., IRL Press, str. 103-129; 131-163 i 165-192 (ISBN 0199635773 ) i piśmiennictwie tam cytowanym.
P r z y k ł a d 10: Oczyszczanie pożądanego produktu z hodowli C.glutamicum
Pozyskiwanie żądanego produktu z komórek C.glutamicum lub z supernatantu opisanej powyżej hodowli przeprowadzić można stosując rozmaite, dobrze znane w nauce, metody. Jeżeli pożądany produkt nie jest wydzielany z komórek, mogą być one zebrane z hodowli poprzez wirowanie o niskiej prędkości, a komórki mogą być poddane lizie za pomocą standardowych technik takich, jak oddziaływanie mechaniczne lub sonikacja. Osad komórkowy usuwany jest przez wirowanie, a supernatant zawierający rozpuszczone białka odzyskuje się do dalszego oczyszczania żądanego składnika. Jeżeli produkt jest z komórek C.glutamicum wydzielany, komórki poddaje się wirowaniu, a frakcja supernatantu jest przeznaczana do dalszego oczyszczania.
Niezależnie od metody oczyszczania, supernatant poddawany jest chromatografii na odpowiednim złożu, na którym pożądana cząsteczka zostaje związana, zaś wiele spośród zanieczyszczeń znajdujących się w próbce - nie, bądź na którym wiązane są zanieczyszczenia, zaś pożądane cząsteczki - nie. Etapy chromatografii mogą być w razie konieczności powtórzone z wykorzystaniem tego samego lub innego złoża. Specjaliści będą zorientowani w wyborze odpowiednich złóż chromatograficznych i ich skutecznych zastosowaniach przy oczyszczaniu danej cząsteczki. Oczyszczony produkt może być zagęszczony poprzez filtrację lub ultrafiltrację, i przechowywany w temperaturze zapewniającej jego maksymalną stabilność.
Jest wiele metod oczyszczania znanych w nauce i nie należy ograniczać się do metody przedstawionej powyżej. Takie techniki oczyszczania są na przykład opisane w Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw- Hill: New York (1986).
Identyfikacja i czystość wyizolowanych związków może zostać oszacowana za pomocą standardowych technik. Obejmują one wysokociśnieniową chromatografię cieczową (HPLC), metody spektroskopowe, metody znakowania, chromatografię cienkowarstwową, NIRS, oznaczenie enzymatyczne bądź mikrobiologiczne. Przegląd wymienionych metody analitycznych zamieszczony jest w Patek i wsp. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova i wsp. (1996) Biotekhnologiya 11:27-32; oraz Schmidt i wsp. (1988) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullman^s Encyklopedia of Industrial Chemistry (1996) tom A27, VCH: Weinheim, str. 89-90, 521-540, 540-547, 559-566, 575-581 i 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Patchways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Fallon, A. i wsp. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry w: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, tom 17.
Przykład 11: Analiza sekwencji genów według wynalazku
Porównywanie sekwencji i określanie procentowej homologii pomiędzy dwiema sekwencjami są technikami powszechnie znanymi i można je przeprowadzić za pomocą takich algorytmów matematycznych, jak algorytm Karlina i Altschula (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, zmodyfikowanych jak u Karlina i Altschula (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Taki algorytm jest załączony do programów NBLAST i XBLAST (wersja 2.0) Altschul i wsp. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. W celu ustalenia sekwencji homologicznych do cząsteczek kwasu nukleinowego HA według wynalazku poszukiwania nukleotydów w programie BLAST można przeprowadzić za pomocą programu NBLAST, wynik=100, długość słowa=12. W celu uzyskania sekwencji aminokwasowych homologicznych do cząsteczek białka HA według wynalazku poszukiwania białek w programie BLAST można przeprowadzić za pomocą programu XBLAST, wynik=50, długość słowa=3. W celu uzyskania przyrównań nieciągłych (gapped alignments) do celów porównawczych, użyć można programu Gapped BLAST według opisu Altschul i wsp. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. W wypadku stosowania programów BLAST i Gapped BLAST, wiadomym będzie jak optymalizować parametry programu(np. XBLAST i NBLAST) dla podlegającej analizie, specyficznej sekwencji.
Kolejnym przykładem matematycznego algorytmu stosowanego do porównywania sekwencji jest algorytm Meyersa i Millera ((1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17). Algorytm taki znajduje się w programie ALIGN (wersja 2,0), będącym częścią oprogramowania GCG do dopasowywania sekwencji. Przy wykorzystywaniu programu ALIGN do porównywania sekwencji aminokwasowych, można użyć Tablicy wagowej reszt PAM120, glp12, gp4. Dodatkowe algorytmy do analizy sekwencji są
PL 195 942 B1 znane w nauce i obejmują ADVANCE oraz ADAM opisane w Torelli i Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:3-5, a także FASTA opisany w Pearson i Lipman (1988) P.N.A.S. 85:2444-8.
Procent homologii pomiędzy dwiema sekwencjami aminokwasowymi można uzyskać za pomocą programu GAP w oprogramowaniu GCG (dostępnego na http:/www.gsg.com) stosując macierz Blosum 62 lub PAM250 oraz parametry gap weight 12, 10, 8, 6 lub 4 i lenght weight 2, 3,lub 4. Procent homologii pomiędzy dwiema sekwencjami nukleotydowymi można uzyskać przy użyciu programu GAP w oprogramowaniu GCG stosując standardowe parametry, takie jak gap weight 50 i lenght weight 3.
Analizę porównawczą sekwencji genowych według wynalazku z sekwencjami obecnymi w Genbank'u przeprowadzono z zastosowaniem technik dobrze znanych w nauce (patrz Bexevanis i Ouellette wyd. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. John Wiley and Sons: New York). Sekwencje genowe według wynalazku porównywano z sekwencjami obecnymi w Genbanku w trzy etapowym procesie. Na pierwszym etapie przeprowadzono analizę BLASTN (np. lokalną analizę przyrównań) dla każdej z sekwencji według wynalazku względem sekwencji nukleotydowych zawartych w Genbanku, a pierwszych 500 wyników poddano dalszej analizie. Następnie, wykorzystując tych 500 wyników przeprowadzono poszukiwanie FASTA (np. łączona lokalna i globalna analiza przyrównań, w której przyrównywane są określone rejony sekwencji). Każda sekwencja genowa według wynalazku była następnie globalnie przyrównywana do każdej z trzech pierwszych wyników FASTA za pomocą programu GAP z pakietu oprogramowania GCG (z zastosowaniem standardowych parametrów). W celu uzyskania właściwych wyników, długości sekwencji uzyskanych z Genbanku dostosowywano do długości badanych sekwencji za pomocą metod znanych w nauce. Wyniki tej analizy zostały zestawione w Tablicy 4. Otrzymane dane są identyczne z tymi, które uzyskano by dzięki samej globalnej analizie GAP przeprowadzonej na każdym spośród genów według wynalazku w porównaniu z każdym z odnośników w Genbanku, lecz wymagało znacznie mniej czasu obliczeniowego w porównaniu z analizą GAP o szerokiej bazie danych (analiza globalna). Sekwencje według wynalazku, dla których nie uzyskano przyrównań powyżej wartości granicznych wskazano wTablicy 4 nie umieszczając informacji o przyrównaniu. Dla specjalisty zrozumiałe jest, że procentowa homologia przyrównania GAP zestawiona w Tablicy 4 pod nagłówkiem „% homologii (GAP)” jest umieszczone w europejskim formacie numerycznym, gdzie „'” oznacza kropkę dziesiętną. Na przykład wartość „40,345” w tej kolumnie odpowiada 40,345%.
P r zyk ł a d 12: Budowa i działanie mikropaneli DNA
Sekwencje według wynalazku mogą dodatkowo posłużyć przy konstruowaniu i stosowaniu mikropaneli DNA (projekt, metodologia i wykorzystanie mikropaneli DNA są znane i opisane np. w Schena, M. i wsp. (1995) Science 270:467-470; Wodicka, L. (1997) Nature Biotechnology 15:1359-1367; DeSaizieu, A. i wsp. (1998) Naturę Biotechnology 16:45-48; DeRisi, J.L. i wsp. (1997) Science 278:680-686).
Mikropanele DNA są stałymi lub elastycznymi podstawkami, składającymi się z nitrocelulozy, nylonu, szkła, silikonu czy innych materiałów. Cząsteczki kwasu nukleinowego mogą w sposób pożądany przyczepiać się do ich powierzchni. Inne kwasy nukleinowe lub mieszaniny kwasów nukleinowych, po odpowiednim ich wyznakowaniu, mogą być poddane procesowi hybrydyzacji do unieruchomionych cząsteczek kwasu nukleinowego, przy czym wyznakowanie umożliwia monitorowanie i pomiar intensywności poszczególnych sygnałów zhybrydyzowanych cząsteczek w określonym rejonie. Ta metodologia pozwala na jednoczesne oznaczenie względnej lub całkowitej ilości wszystkich bądź wybranych kwasów nukleinowych w danej próbce kwasu nukleinowego lub mieszaninie. Mikropanele DNA umożliwiają więc analizę ekspresji bardzo wielu (nawet 6800 lub więcej) kwasów nukleinowych równocześnie (patrz np. Schena, M. (1996) BioEssays 18(5):427-431).
Sekwencje według wynalazku mogą być zastosowane do projektowania oligonukleotydowych starterów zdolnych do amplifikacji określonych rejonów jednego lub więcej genów C.glutamicum w reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego, takiej jak reakcja łańcuchowa polimerazy. Wybór i projekt starterów oligonukleotydowych 5' lub 3' czy też odpowiednich łączników umożliwia kowalencyjne wiązanie się uzyskanych produktów PGR do powierzchni pożywki wspomagającej, opisanej powyżej (opisanej także np. w Schena, M. i wsp. (1995) Science 270:467-470).
Mikropanele kwasu nukleinowego mogą być także tworzone na drodze syntezy oligonukleotydówą in situ, jak to zostało opisane w Wodicka, L i wsp. (1997) Nature Biotechnology 15:1359-1367. Za pomocą metod fotolitograficznych precyzyjnie określone rejony matrycy poddawane są działaniu światła. Dochodzi do aktywacji fotolabimych grup ochronnych, które ulegają addycji nukleotydowej, podczas gdy rejony zakryte przed światłem nie podlegają żadnym modyfikacjom. Kolejne cykle ochrony i aktywacji światłem umożliwiają syntezę różnych oligonukleotydów w określonych pozycjach. Małe, określone rejony genów według wynalazku syntetyzować można na mikropanelach za pomocą syntezy oligonukleoty90
PL 195 942 B1 dów na stałym podłożu. Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, obecne w próbce lub mieszaninie nukleotydów, mogą hybrydyzować do mikro szeregów. Takie cząsteczki kwasu nukleinowego można wyznakować z zastosowaniem standardowych metod. W skrócie, cząsteczki kwasu nukleinowego (np. cząsteczki mRNA lub DNA) znakowane są poprzez inkorporację izotopowo lub fluorescencyjnie wyznakowanych nukleotydów, np. w trakcie odwrotnej transkrypcji lub syzntezy DNA. Hybrydyzacja wyznakowanych kwasów nukleinowych do mikropaneli jest opisana (np. Schena, M. i wsp. (1995) j.w.; Wodicka, L. i wsp. (1997), j.w.; DeSaizieu, A. i wsp. (1998), j.w.). Wykrywanie i ilościowe oznaczanie zhybrydyzowanych cząsteczek jest dostosowane do specyficznego wyznakowania. Znakowanie radioaktywne może być wykryte, na przykład w sposób opisany w Schena, M. i wsp. (1995) j.w.), zaś znakowanie fluorescencyjne, na przykład za pomocą metody Shalon i wsp. (1996) Genome Research 6:639-645). Zastosowanie sekwencji według wynalazku w opisanej powyżej technologii mikropaneli DNA umożliwia analizę porównawczą różnych szczepów C.glutamicum lub innych Corynebacteria. Metody oparte na mikropanelach kwasu nukleinowego stanowią duże ułatwienie na przykład w badaniach wewnątrzszczepowej zmienności, wykorzystujących indywidualne profile transkrypcyjne oraz przy identyfikacji genów istotnych dla specyficznych i/lub pożądanych właściwości szczepu, takich jak patogenność, wydajność oraz odporność na stres. Wykorzystanie technologii paneli kwasu nukleinowego jest także możliwe do celów porównania profili ekspresji genów według wynalazku podczas przebiegu reakcji fermentacji.
Przykład 13: Analiza dynamiki populacji białek występujących w komórce (proteomika)
Geny, składniki oraz metody według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie w badaniach dotyczących interakcji i dynamiki populacji białek, określanych mianem proteomiki. Badane populacje białkowe obejmują (lecz nie ograniczają się do) całkowitą populację białek C.glutamicum (np. w porównaniu z populacją białek innego organizmu), białka aktywne w specyficznych warunkach środowiska lub metabolizmu (np. podczas fermentacji, wysokiej bądź niskiej temperatury, w warunkach wysokiego lub niskiego pH) czy też białka aktywne podczas specyficznych faz wzrostu i rozwoju.
Populacje białek mogą być analizowane z zastosowaniem rozmaitych dobrze znanych technik, jak np. elektroforeza żelowa. Białka komórkowe można uzyskać np. poprzez liżę lub ekstrakcję, a rozdzielić za pomocą różnorodnych technik elektroforetycznych. Metoda elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w obecności dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) rozdziela białka wykorzystując głównie różnice ich ciężaru cząsteczkowego. Metoda elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z ogniskowaniem izoelektrycznym (IEF-PAGE) do rozdziału białek wykorzystuje ich punkt izoelektryczny, (który odzwierciedla nie tylko sekwencję aminokwasową, ale także posttranslacyjne modyfikacje białka). Inna korzystna metoda analizy białkowej jest połączeniem IEF-PAGE z SDS-PAGE i jest znana jako elektroforeza żelowa dwuwymiarowa (opisana np. w Hermann i wsp. (1998) Electrophoresis 19:3217-3221; Fountoulakis i wsp. (1998) Elektrophoresis 19:1193-1202; Langen i wsp. (1997) Elektrophoresis 18:1184-1192; Antelmann i wsp. (1997) Elektrophoresis 18:1451-1463). Stosować można również inne dobrze znane techniki rozdziału białek, takie jak elektoroforeza w żelu kapilarnym.
Białka rozdzielone za pomocą tych metodologii mogą zostać uwidocznione za pomocą standardowych technik takich jak barwienie lub znakowanie. Do odpowiednich, wykorzystywanych w nauce barwników zalicza się Coomassie Brilliant Blue, barwienie srebrem lub barwnikami fluorescencyjnymi takim jak Sypro Ruby (Molecular Probes). Dodanie do pożywki z C.glutamicum radioaktywnie wyzna35 35 kowanych aminokwasów lub innych prekursorów białkowych (np. 35S-metioniny, 35S-cysteiny, amino14 15 15 15 + kwasów z wyznakowanym węglem 14C, 15N-aminokwasów, 15NO3 lub 15NH4+ lub aminokwasów z wyznakowanym węglem 13C) umożliwia w tych komórkach znakowanie białek poprzedzające ich wyodrębnienie. Podobnie wykorzystane mogą być znaczniki fluorescencyjne. Wyznakowane w ten sposób białka mogą być ekstrahowane, izolowane i rozdzielane według wcześniej opisanych metod.
Białka uwidocznione za pomocą tych technik mogą być dalej analizowane poprzez pomiar ilości użytego barwnika lub znacznika. Za pomocą metod optycznych można ustalić ilość danego białka i porównać ją z ilością innych białek w tym samym żelu lub w innych żelach. Porównywanie białek w żelach można przeprowadzić na zasadzie optycznego porównania, z zastosowaniem spektroskopii, punktowania obrazu i analizy żelu lub poprzez użycie klisz fotograficznych i ekranów. Takie techniki są dobrze znane w nauce.
Aby zidentyfikować dane białko można zastosować techniki bezpośredniego sekwencjonowania i inne na przykład sekwencjonowanie C- i/lub N- końcowych aminokwasów (takie jak degradacja
Edma^a), spektrometria mas (w szczególności techniki MALDI lub ESI (patrz Langen i wsp. (1997)
Elekrophoresis 18:1184-1192)) .
Sekwencje białkowe według wynalazku można wykorzystać do identyfikacji, za pomocą tych technik, białek C.glutamicum.
PL 195 942 B1
Informacja uzyskana z zastosowaniem tych metod może być wykorzystana do porównania wzorów obecności białek, aktywności, modyfikacji pomiędzy różnymi próbami pobranymi w różnorodnych biologicznie warunkach (np. różne organizmy, punkty czasowe fermentacji, składniki pożywki, biotopy). Dane uzyskane z takich eksperymentów, same lub w połączeniu z innymi technikami, mogą mieć różne zastosowania, np. do porównywania zachowań różnych organizmów w danej (np. metabolicznej) sytuacji, do wzrostu produktywności szczepów wytwarzających związki wysokowartościowe lub do wzrostu wydajności produkcji związków wysokowartościowych.
Specjaliści będą w stanie rozpoznać lub stwierdzić z użyciem jedynie rutynowych doświadczeń istnienie wielu odpowiedników opisanych tu specyficznych postaci wynalazku. Takie odpowiedniki są objęte następującymi zastrzeżeniami.

Claims (40)

1. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że obejmuje sekwencję podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencję do niej komplementarną.
2. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencję do niej komplementarną.
3.Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje naturalnie występującą odmianę alleliczną polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencję do niej komplementarną.
4. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencję do niej komplementarną.
5. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencję do niej komplementarną.
6. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że zawiera fragment obejmującyco najmniej 15 sąsiadujących ze sobą nukleotydów o sekwencji nukleotydowej podanej na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencję do niej komplementarną.
7. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 1albo 2,albo 3,albo 4,albo 5,albo 6 i sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd heterologiczny.
8. Wektor znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 1 albo 2,albo 3,albo 4,albo 5,albo 6,albo 7.
9. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że jest wektorem ekspresyjnym.
10. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest transfekowana wektorem ekspresyjnym określonym w zastrz. 9.
11. Komórka gospodarza według zastrz. 10, znamienna tym, że jest komórką mikroorganizmu.
12. Komórka gospodarza według zastrz. 11, znamienna tym, że należy do rodzaju Corynebacteriumalbo Brevibacterium.
13. Komórka gospodarza według zastrz. 10, znamienna tym, że ekspresja cząsteczki kwasu nukleinowego powoduje modulację wytwarzania wysokowartościowych związków chemicznych przez komórkę.
14. Komórka gospodarza według zastrz. 13, znamienna tym, że wysoko wartościowy związek jest wybrany z grupy obejmującej: kwasy organiczne, aminokwasy wchodzące w skład białek i nie wchodzące w skład białek, zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy, nukleotydy, lipidy, nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe, diole, węglowodany, związki aromatyczne, witaminy, kofaktory, poliketydy i enzymy.
15.Sposób wytwarzania polipeptydu, znamienny tym,że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 10 w odpowiedniej pożywce w taki sposób, że wytwarza ona polipeptyd.
16. Izolowany połłpeptyd znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasowi podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400.
17.Izolowany polipeptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje heterologiczne sekwencje aminokwasowe.
18. Izolowany polipeptyd, znamienny tym, że obejmuje naturalnie występującą odmianę alleliczną polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400.
19.Izolowany polipeptyd według zastrz. 18, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje heterologiczne sekwencje aminokwasowe.
20. Izolowany połipeptyd, znamienny tym, że jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id.399.
21.Izolowany polipeptyd według zastrz. 20, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje heterologiczne sekwencje aminokwasowe.
PL 195 942 B1
22. Izolowany polipeptyd, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id.400.
23. Izolowany polipeptyd według zastrz. 22, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje heterologiczne sekwencje aminokwasowe.
24. Izolowany polipeptyd, znamienny tym, że obejmuje fragment polipeptydu zawierający sekwencję aminokwasową, podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400, przy czym wspomniany fragment utrzymuje aktywność biologiczną typową dla 1,2-dioksogenazy katecholowej.
25. Izolowany polipeptyd według zastrz. 24, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje heterologiczne sekwencje aminokwasowe.
26. Izolowany polipeptyd, znamienny tym, że jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399.
27. Izolowany polipeptyd według zastrz. 26, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje heterologiczne sekwencje aminokwasowe.
28. Sposób wytwarzania wysoko wartościowego związku chemicznego, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki określonej w zastrz. 10, w taki sposób, że wytwarzany jest wysokowartościowy związek chemiczny.
29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap odzyskiwania związku z pożywki hodowlanej.
30. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że komórka należy do rodzaju Corynebacterium albo Brevibacterium.
31. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że komórka jest wybrana z grupy obejmującej: Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitrophilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium healii, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium parafflnolyticum i szczepy podane na Tablicy 3.
32. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że ekspresja cząsteczki kwasu nukleinowego z wektora powoduje modulowanie wytwarzania wysokowartościowego związku chemicznego.
33. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że wysokowartościowy związek chemiczny jest wybrany z grupy obejmującej: kwasy organiczne, aminokwasy wchodzące w skład białek i nie wchodzące w skład białek, zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy, nukleotydy, lipidy, nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe, diole, węglowodany, związki aromatyczne, witaminy, kofaktory, poliketydy i enzymy.
34. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że związkiem chemicznym jest aminokwas.
35. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że aminokwas jest wybrany z grupy obejmującej: lizynę, glutaminian, glutaminę, alaninę, asparaginian, glicynę, serynę, treoninę, metioninę, cysteinę, walinę, leucynę, izoleucynę, argininę, prolinę, histydynę, tyrozynę, fenyloalaninę i tryptofan.
36. Sposób wytwarzania wysokowartościowego związku chemicznego, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki, której genomowy DNA zmieniono przez wprowadzenie cząsteczki kwasu nukleinowego określonej w zastrz. 1 albo 2,albo 3,albo 4,albo 5,albo 6,albo 7.
37. Sposób diagnozowania obecności albo aktywności Corynebacterium diphteriae u osobnika, znamienny tym, że obejmuje wykrywanie u osobnika obecności bądź aktywności jednej z cząsteczek kwasu nukleinowego określonych w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6 lub cząsteczki polipeptydu określonej w zastrz. 16 albo 18, albo 20, albo 22, albo 24, albo 26.
38. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest uszkodzona.
39. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje jedną albo wiele modyfikacji w porównaniu do sekwencji Sekw. Nr Id. 399.
PL 195 942 B1
40. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399, przy czym region regulatorowy cząsteczki kwasu nukleinowego jest zmodyfikowany względem regionu regulatorowego typu dzikiego.
PL00380961A 1999-06-25 2000-06-23 Nowe izolowane czasteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowartosciowych zwiazków chemicznych i sposób diagnozowania obecnosci albo aktywnosci Corynebacterium diphteriae PL PL PL PL PL PL PL PL195942B1 (pl)

Applications Claiming Priority (26)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14103199P 1999-06-25 1999-06-25
DE19931636 1999-07-08
DE19932129 1999-07-09
DE19932127 1999-07-09
DE19932126 1999-07-09
DE19932226 1999-07-09
DE19932125 1999-07-09
DE19932128 1999-07-09
DE19932933 1999-07-14
DE19933005 1999-07-14
DE19933002 1999-07-14
DE19932930 1999-07-14
DE19932922 1999-07-14
DE19933006 1999-07-14
DE19932920 1999-07-14
DE19932928 1999-07-14
DE19932973 1999-07-14
DE19933003 1999-07-14
DE19932924 1999-07-14
DE19932935 1999-07-14
DE19941390 1999-08-31
DE19941378 1999-08-31
DE19941391 1999-08-31
DE19941379 1999-08-31
DE19942088 1999-09-03
PCT/IB2000/000911 WO2001000842A2 (en) 1999-06-25 2000-06-23 Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in homeostasis and adaptation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL195942B1 true PL195942B1 (pl) 2007-11-30

Family

ID=27586753

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL00380961A PL195942B1 (pl) 1999-06-25 2000-06-23 Nowe izolowane czasteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowartosciowych zwiazków chemicznych i sposób diagnozowania obecnosci albo aktywnosci Corynebacterium diphteriae PL PL PL PL PL PL PL
PL00359892A PL195215B1 (pl) 1999-06-25 2000-06-23 Nowe izolowane cz asteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowarto sciowych zwi azków chemicznych i sposób diagnozowania obecno sci albo aktywno sci Corynebacterium diphteriae PL PL PL PL PL PL PL
PL380959A PL201534B1 (pl) 1999-06-25 2000-06-23 Nowe izolowane cząsteczki kwasu nukleionoweg, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowartościowych związków chemicznych i sposób diagnozowania obecności albo aktywności Corynebacterium diphteriae

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL00359892A PL195215B1 (pl) 1999-06-25 2000-06-23 Nowe izolowane cz asteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowarto sciowych zwi azków chemicznych i sposób diagnozowania obecno sci albo aktywno sci Corynebacterium diphteriae PL PL PL PL PL PL PL
PL380959A PL201534B1 (pl) 1999-06-25 2000-06-23 Nowe izolowane cząsteczki kwasu nukleionoweg, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowartościowych związków chemicznych i sposób diagnozowania obecności albo aktywności Corynebacterium diphteriae

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20070161091A1 (pl)
EP (2) EP2302058A1 (pl)
JP (2) JP2004512808A (pl)
KR (3) KR100834985B1 (pl)
AU (1) AU783706B2 (pl)
CA (1) CA2380871A1 (pl)
ES (1) ES2176128T1 (pl)
HU (1) HUP0203647A2 (pl)
MX (1) MXPA01012841A (pl)
PL (3) PL195942B1 (pl)
SK (1) SK18902001A3 (pl)
TR (1) TR200103711T2 (pl)
WO (1) WO2001000842A2 (pl)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1298854C (zh) 1999-07-02 2007-02-07 味之素株式会社 编码蔗糖pts酶ⅱ的dna
US6395528B1 (en) * 2000-01-27 2002-05-28 Ajinomoto Co., Inc. Phosphoserine phosphatase gene of coryneform bacteria
DE10039049A1 (de) 2000-08-10 2002-02-21 Degussa Neue für das IysR3-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
DE10039043A1 (de) 2000-08-10 2002-02-21 Degussa Neue für das luxR-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
EP1307562B1 (en) * 2000-08-10 2004-12-15 Degussa AG Nucleotide sequences which code for the lysr3 gene
US6825030B2 (en) * 2000-08-31 2004-11-30 Degussa Ag Nucleotide sequences encoding a sensor kinase, citA, from corynebacterium glutamicum
WO2002018430A2 (en) * 2000-09-02 2002-03-07 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the metr and metz genes
US6815196B2 (en) 2000-09-02 2004-11-09 Degussa Ag Nucleotide sequences encoding o-succinylhomoserine sulfhydrylase
DE10136986A1 (de) * 2000-09-03 2002-03-21 Degussa Für Gene cysD, cysN, cysK, cysE und cysH kodierende Nukleotidsequenzen
US6822085B2 (en) 2000-09-03 2004-11-23 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the cysD, cysN, cysK, cysE and cysH genes
EP1315744A1 (en) * 2000-09-09 2003-06-04 Degussa AG Nucleotide sequences which code for the clpc gene
DE10045486A1 (de) * 2000-09-14 2002-04-11 Degussa Neue für das pstC2-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
US20020098554A1 (en) * 2000-09-19 2002-07-25 Mike Farwick Nucleotide sequences coding for the pepC gene
RU2280077C2 (ru) * 2001-07-26 2006-07-20 Адзиномото Ко., Инк. Ген пептидообразующего фермента, пептидообразующий фермент и способ получения дипептида
US7468262B2 (en) 2003-05-16 2008-12-23 Ajinomoto Co., Inc. Polynucleotides encoding useful polypeptides in corynebacterium glutamicum ssp. lactofermentum
DE10359594A1 (de) 2003-12-18 2005-07-28 Basf Ag PEF-TU-Expressionseinheiten
US8728795B2 (en) 2003-12-18 2014-05-20 Basf Se Pgro expression units
DE102004035065A1 (de) 2004-07-20 2006-02-16 Basf Ag P-ET-TS-Expressionseinheiten
EP2434015B1 (en) 2004-09-09 2013-11-20 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth DNA fragment having promoter function
WO2006032102A1 (en) * 2004-09-22 2006-03-30 Grain Foods Crc Ltd. Method of producing fragrance by inactivation or reduction of a functional protein with betaine aldehyde dehydrogenase (badh) activity
WO2010017526A1 (en) * 2008-08-08 2010-02-11 The Scripps Research Institute Purine nucleotides isotopically labeled in the purine base, methods of making thereof and uses thereof
WO2019094608A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Denali Therapeutics Inc. Anti-bace1 antibodies and methods of use thereof
WO2020085511A1 (ja) * 2018-10-25 2020-04-30 味の素株式会社 タンパク質の分泌生産法
CN110964090B (zh) * 2019-12-26 2021-02-19 江南大学 一种促进n-乙酰氨基葡萄糖生产的蛋白质起始因子if3突变体及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6649379B1 (en) * 1987-06-12 2003-11-18 Massachusetts Institute Of Technology Method and deregulated enzyme for threonine production
JP2967996B2 (ja) * 1989-06-06 1999-10-25 協和醗酵工業株式会社 Ｌ―トリプトファンの製造法

Also Published As

Publication number Publication date
KR100834985B1 (ko) 2008-06-03
AU783706B2 (en) 2005-11-24
JP2004512808A (ja) 2004-04-30
JP2007259859A (ja) 2007-10-11
EP2302058A1 (en) 2011-03-30
AU5420500A (en) 2001-01-31
KR20030002293A (ko) 2003-01-08
KR20060115928A (ko) 2006-11-10
WO2001000842A2 (en) 2001-01-04
PL195215B1 (pl) 2007-08-31
SK18902001A3 (sk) 2002-09-10
TR200103711T2 (tr) 2002-07-22
KR100878333B1 (ko) 2009-01-14
HUP0203647A2 (hu) 2003-01-28
CA2380871A1 (en) 2001-01-04
ES2176128T1 (es) 2002-12-01
US20070161091A1 (en) 2007-07-12
MXPA01012841A (es) 2002-07-09
PL359892A1 (pl) 2004-09-06
EP1254232A2 (en) 2002-11-06
KR20070087031A (ko) 2007-08-27
PL201534B1 (pl) 2009-04-30
WO2001000842A3 (en) 2001-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1257649B1 (en) Corynebacterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins
KR100834986B1 (ko) 스트레스 저항성 및 내성 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자
PL195942B1 (pl) Nowe izolowane czasteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowartosciowych zwiazków chemicznych i sposób diagnozowania obecnosci albo aktywnosci Corynebacterium diphteriae PL PL PL PL PL PL PL
KR100834989B1 (ko) 막 합성 및 막 운반 관련 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자
EP2290062A1 (en) Corynebacterium glutamicum gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase
JP2007267744A (ja) ホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系タンパク質をコードするコリネバクテリウム−グルタミカム遺伝子
US7393675B2 (en) Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production
KR20020086616A (ko) 대사 경로 단백질을 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰유전자
US20040043953A1 (en) Genes of corynebacterium
RU2321634C2 (ru) Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии
RU2304616C2 (ru) Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в гомеостазе и адаптации
RU2312145C2 (ru) Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте
EP1661987A1 (en) Corynebacterium glutamicum gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20120623