PL195942B1 - Nowe izolowane czasteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowartosciowych zwiazków chemicznych i sposób diagnozowania obecnosci albo aktywnosci Corynebacterium diphteriae PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents
Nowe izolowane czasteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowartosciowych zwiazków chemicznych i sposób diagnozowania obecnosci albo aktywnosci Corynebacterium diphteriae PL PL PL PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL195942B1 PL195942B1 PL00380961A PL38096100A PL195942B1 PL 195942 B1 PL195942 B1 PL 195942B1 PL 00380961 A PL00380961 A PL 00380961A PL 38096100 A PL38096100 A PL 38096100A PL 195942 B1 PL195942 B1 PL 195942B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- nucleic acid
- protein
- sequence
- glutamicum
- amino acid
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 247
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 229
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 229
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 150
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 95
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 67
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 115
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 74
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 61
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 title claims description 57
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 title claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 443
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 348
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims abstract description 207
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 112
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 44
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 339
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 125
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 122
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 100
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 100
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 91
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 80
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 78
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 53
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 51
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 40
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 35
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 35
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 34
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 24
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 22
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 22
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 22
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 19
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- -1 cofactors Natural products 0.000 claims description 17
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 claims description 16
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 11
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 10
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 claims description 10
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 9
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000002585 base Substances 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 claims description 9
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 9
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 claims description 9
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 9
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 8
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 8
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 8
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 7
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 7
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 7
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 7
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 6
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 claims description 6
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 claims description 6
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 claims description 6
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 6
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 5
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 claims description 5
- 125000000830 polyketide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 claims description 5
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 claims description 5
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 claims description 4
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 claims description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 3
- 235000012539 Bacterium linens Nutrition 0.000 claims description 2
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 claims description 2
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 claims description 2
- 241000186310 Brevibacterium linens Species 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 abstract description 37
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 23
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 23
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract description 13
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 233
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 98
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 81
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 67
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 66
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 48
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 47
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 46
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 43
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 38
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 38
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 31
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 31
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 description 31
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 30
- 150000007824 aliphatic compounds Chemical class 0.000 description 30
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 30
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 30
- 230000006870 function Effects 0.000 description 28
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 27
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 27
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 20
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 20
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 18
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 17
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 17
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 16
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 16
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 16
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 16
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 16
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 16
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 16
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 14
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 14
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 13
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 13
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 12
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 12
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 12
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 12
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 11
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 11
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 10
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 10
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 10
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 9
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 239000012707 chemical precursor Substances 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 8
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 8
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 8
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 8
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 7
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 7
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 7
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 7
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 7
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 7
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 6
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 6
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 6
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 6
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 6
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 6
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 6
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 5
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 5
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 5
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 5
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 5
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 5
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 5
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 5
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 5
- XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N rGTP Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XKMLYUALXHKNFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 5
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 5
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 5
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 5
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 4
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 4
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 4
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 4
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 4
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 4
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 4
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 4
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TXXYYOUBDOAQDT-UHFFFAOYSA-N 4-nitro-1-(phenylmethoxymethyl)imidazole Chemical compound C1=NC([N+](=O)[O-])=CN1COCC1=CC=CC=C1 TXXYYOUBDOAQDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical group O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 3
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose 5-phosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 3
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 3
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 3
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 3
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N flavin adenine dinucleotide Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1[C@@H]([C@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C2=NC(=O)NC(=O)C2=NC2=C1C=C(C)C(C)=C2 VWWQXMAJTJZDQX-UYBVJOGSSA-N 0.000 description 3
- 235000019162 flavin adenine dinucleotide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011714 flavin adenine dinucleotide Substances 0.000 description 3
- 229940093632 flavin-adenine dinucleotide Drugs 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000002093 isoelectric focusing polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 3
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 3
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 3
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 3
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 3
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 3
- LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N (-)-phaseollin Chemical compound C1OC2=CC(O)=CC=C2[C@H]2[C@@H]1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-KXBFYZLASA-N 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RFLVMTUMFYRZCB-UHFFFAOYSA-N 1-methylguanine Chemical compound O=C1N(C)C(N)=NC2=C1N=CN2 RFLVMTUMFYRZCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YSAJFXWTVFGPAX-UHFFFAOYSA-N 2-[(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)oxy]acetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CNC(=O)NC1=O YSAJFXWTVFGPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydrouracil Chemical compound O=C1CCNC(=O)N1 OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000819038 Chichester Species 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- PCDQPRRSZKQHHS-UHFFFAOYSA-N Cytidine 5'-triphosphate Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SNPLKNRPJHDVJA-ZETCQYMHSA-N D-panthenol Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCCO SNPLKNRPJHDVJA-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000005298 Iron-Sulfur Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010081409 Iron-Sulfur Proteins Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001646725 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Species 0.000 description 2
- 108700035964 Mycobacterium tuberculosis HsaD Proteins 0.000 description 2
- HYVABZIGRDEKCD-UHFFFAOYSA-N N(6)-dimethylallyladenine Chemical compound CC(C)=CCNC1=NC=NC2=C1N=CN2 HYVABZIGRDEKCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MNLRQHMNZILYPY-MDMHTWEWSA-N N-acetyl-alpha-D-muramic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@@H]1NC(C)=O MNLRQHMNZILYPY-MDMHTWEWSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N NADP zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 2
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 2
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 2
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 2
- 101150096566 clpX gene Proteins 0.000 description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002742 combinatorial mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- PCDQPRRSZKQHHS-ZAKLUEHWSA-N cytidine-5'-triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical group OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940013640 flavin mononucleotide Drugs 0.000 description 2
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 239000011768 flavin mononucleotide Substances 0.000 description 2
- FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N flavin mononucleotide Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical class O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 2
- 238000002803 maceration Methods 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 2
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 2
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 230000004260 plant-type cell wall biogenesis Effects 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 229940076376 protein agonist Drugs 0.000 description 2
- 229940076372 protein antagonist Drugs 0.000 description 2
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 2
- NHZMQXZHNVQTQA-UHFFFAOYSA-N pyridoxamine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CN)=C1O NHZMQXZHNVQTQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 2
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 2
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000007363 regulatory process Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 235000019231 riboflavin-5'-phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- RBCOYOYDYNXAFA-UHFFFAOYSA-L (5-hydroxy-4,6-dimethylpyridin-3-yl)methyl phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP([O-])([O-])=O)C(C)=C1O RBCOYOYDYNXAFA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- RBBNTRDPSVZESY-UHFFFAOYSA-N 1,10-dichlorodecane Chemical compound ClCCCCCCCCCCCl RBBNTRDPSVZESY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 1-methylinosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)N(C)C=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O WJNGQIYEQLPJMN-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- HLYBTPMYFWWNJN-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)-2-hydroxyacetic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C1=CNC(=O)NC1=O HLYBTPMYFWWNJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1h-imidazole Chemical compound FC1=CC=CC(C=2NC=CN=2)=C1 JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGAKLDIYNFXTCK-UHFFFAOYSA-N 2-[(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)methylamino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC1=CNC(=O)NC1=O SGAKLDIYNFXTCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-PGYHGBPZSA-N 2-amino-3-O-[(R)-1-carboxyethyl]-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound OC(=O)[C@@H](C)O[C@@H]1[C@@H](N)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O MSFSPUZXLOGKHJ-PGYHGBPZSA-N 0.000 description 1
- UDOGNMDURIJYQC-UHFFFAOYSA-N 2-amino-6-methyl-1h-pteridin-4-one Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=NC(C)=CN=C21 UDOGNMDURIJYQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- XMSMHKMPBNTBOD-UHFFFAOYSA-N 2-dimethylamino-6-hydroxypurine Chemical compound N1C(N(C)C)=NC(=O)C2=C1N=CN2 XMSMHKMPBNTBOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AQSRRZGQRFFFGS-UHFFFAOYSA-N 2-methylpyridin-3-ol Chemical compound CC1=NC=CC=C1O AQSRRZGQRFFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 3-methylcytosine Chemical compound CN1C(N)=CC=NC1=O KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- GJAKJCICANKRFD-UHFFFAOYSA-N 4-acetyl-4-amino-1,3-dihydropyrimidin-2-one Chemical compound CC(=O)C1(N)NC(=O)NC=C1 GJAKJCICANKRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 5-O-phosphono-alpha-D-ribofuranosyl diphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 0.000 description 1
- WPYRHVXCOQLYLY-UHFFFAOYSA-N 5-[(methoxyamino)methyl]-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CONCC1=CNC(=S)NC1=O WPYRHVXCOQLYLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZFTBZKVVGZNMJR-UHFFFAOYSA-N 5-chlorouracil Chemical compound ClC1=CNC(=O)NC1=O ZFTBZKVVGZNMJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDCYZAJDBXYCGN-VIFPVBQESA-N 5-hydroxy-L-tryptophan Chemical compound C1=C(O)C=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 LDCYZAJDBXYCGN-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KSNXJLQDQOIRIP-UHFFFAOYSA-N 5-iodouracil Chemical compound IC1=CNC(=O)NC1=O KSNXJLQDQOIRIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KELXHQACBIUYSE-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound COC1=CNC(=O)NC1=O KELXHQACBIUYSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 1
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZRCZVZMOAAFDC-UHFFFAOYSA-N 6-methyl-5-(methylamino)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CNC1=C(C)NC(=O)NC1=O LZRCZVZMOAAFDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007991 ACES buffer Substances 0.000 description 1
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102000006589 Alpha-ketoglutarate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004306 Alpha-ketoglutarate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 description 1
- 244000177578 Bacterium linens Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 1
- RZFWPMCQSJBJFL-UGKPPGOTSA-N C(=O)(O)CNCNCC=1C(NC(N([C@H]2[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)C1)=S)=O Chemical compound C(=O)(O)CNCNCC=1C(NC(N([C@H]2[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)C1)=S)=O RZFWPMCQSJBJFL-UGKPPGOTSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000001432 Calendula officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005881 Calendula officinalis Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-OUBTZVSYSA-N Carbon-13 Chemical compound [13C] OKTJSMMVPCPJKN-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-NJFSPNSNSA-N Carbon-14 Chemical compound [14C] OKTJSMMVPCPJKN-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000863012 Caulobacter Species 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 229910021580 Cobalt(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000289527 Cordyline terminalis Species 0.000 description 1
- 235000009091 Cordyline terminalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 229930195713 D-glutamate Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 229930182818 D-methionine Natural products 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 239000011703 D-panthenol Substances 0.000 description 1
- 235000004866 D-panthenol Nutrition 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N D-ribulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N D-threo-2-Pentulose Natural products OCC(O)C(O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008265 DNA repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 239000004097 EU approved flavor enhancer Substances 0.000 description 1
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 206010051998 Febrile infection Diseases 0.000 description 1
- 241000703243 Feeria Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 238000012357 Gap analysis Methods 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 108020000311 Glutamate Synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002667 Glycine hydroxymethyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010043428 Glycine hydroxymethyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 241000288105 Grus Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241001235200 Haemophilus influenzae Rd KW20 Species 0.000 description 1
- 108010089792 Hemeproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008015 Hemeproteins Human genes 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Chemical class CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000599573 Homo sapiens InaD-like protein Proteins 0.000 description 1
- 206010020400 Hostility Diseases 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100037978 InaD-like protein Human genes 0.000 description 1
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical class OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 108020003285 Isocitrate lyase Proteins 0.000 description 1
- ZSBXGIUJOOQZMP-UHFFFAOYSA-N Isomatrine Natural products C1CCC2CN3C(=O)CCCC3C3C2N1CCC3 ZSBXGIUJOOQZMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 150000008539 L-glutamic acids Chemical class 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 101710173438 Late L2 mu core protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 description 1
- 108090000855 Matrilysin Proteins 0.000 description 1
- NLSTZAFFNDSJGQ-UHFFFAOYSA-N Matrin Natural products O=C1CCCN2CC3CCNC4CCCC(C34)C12 NLSTZAFFNDSJGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000863420 Myxococcus Species 0.000 description 1
- SGSSKEDGVONRGC-UHFFFAOYSA-N N(2)-methylguanine Chemical compound O=C1NC(NC)=NC2=C1N=CN2 SGSSKEDGVONRGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910004619 Na2MoO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 1
- 108010025915 Nitrite Reductases Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101710163504 Phaseolin Proteins 0.000 description 1
- 108010069013 Phenylalanine Hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100038223 Phenylalanine-4-hydroxylase Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 1
- 102000017033 Porins Human genes 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 241000191023 Rhodobacter capsulatus Species 0.000 description 1
- JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N Ribitol Natural products OCC(C)C(O)C(O)CO JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 1
- GBFLZEXEOZUWRN-VKHMYHEASA-M S-carboxylatomethyl-L-cysteine(1-) Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSCC([O-])=O GBFLZEXEOZUWRN-VKHMYHEASA-M 0.000 description 1
- 229910003798 SPO2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100434411 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ADH1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100478210 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) spo2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 239000000589 Siderophore Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical class OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 101100187081 Trichormus variabilis (strain ATCC 29413 / PCC 7937) nifS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- ZVNYJIZDIRKMBF-UHFFFAOYSA-N Vesnarinone Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C(=O)N1CCN(C=2C=C3CCC(=O)NC3=CC=2)CC1 ZVNYJIZDIRKMBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000440386 Vibrio phage phi16 Species 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000000641 acridinyl group Chemical group C1(=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 101150102866 adc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- XKMRRTOUMJRJIA-UHFFFAOYSA-N ammonia nh3 Chemical compound N.N XKMRRTOUMJRJIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N bakuchiol Chemical compound CC(C)=CCC[C@@](C)(C=C)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 LFYJSSARVMHQJB-QIXNEVBVSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Chemical group C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000001486 biosynthesis of amino acids Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- CDQSJQSWAWPGKG-UHFFFAOYSA-N butane-1,1-diol Chemical compound CCCC(O)O CDQSJQSWAWPGKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L calcium;3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 230000006860 carbon metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000008618 cell wall macromolecule catabolic process Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000006790 cellular biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000006567 cellular energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N chloroform;3-methylbutan-1-ol Chemical compound ClC(Cl)Cl.CC(C)CCO BKHZIBWEHPHYAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CRQQGFGUEAVUIL-UHFFFAOYSA-N chlorothalonil Chemical compound ClC1=C(Cl)C(C#N)=C(Cl)C(C#N)=C1Cl CRQQGFGUEAVUIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 101150036868 cicA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940010007 cobalamins Drugs 0.000 description 1
- 150000001867 cobalamins Chemical class 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150064923 dapD gene Proteins 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005786 degenerative changes Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 101150036185 dnaQ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- UJKWLAZYSLJTKA-UHFFFAOYSA-N edma Chemical compound O1CCOC2=CC(CC(C)NC)=CC=C21 UJKWLAZYSLJTKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 235000019264 food flavour enhancer Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 235000013611 frozen food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000000640 hydroxylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 1
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052920 inorganic sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960005431 ipriflavone Drugs 0.000 description 1
- FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M iron chloride Chemical compound [Cl-].[Fe] FBAFATDZDUQKNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150021879 iscS gene Proteins 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- IZAGSTRIDUNNOY-UHFFFAOYSA-N methyl 2-[(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)oxy]acetate Chemical compound COC(=O)COC1=CNC(=O)NC1=O IZAGSTRIDUNNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N methylenebutanedioic acid Natural products OC(=O)CC(=C)C(O)=O LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- XJVXMWNLQRTRGH-UHFFFAOYSA-N n-(3-methylbut-3-enyl)-2-methylsulfanyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CSC1=NC(NCCC(C)=C)=C2NC=NC2=N1 XJVXMWNLQRTRGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 238000001320 near-infrared absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 101150082753 nifS gene Proteins 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000005257 nucleotidylation Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical class CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- LDCYZAJDBXYCGN-UHFFFAOYSA-N oxitriptan Natural products C1=C(O)C=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 LDCYZAJDBXYCGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000003209 petroleum derivative Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N phaseollin Natural products C1OC2=CC(O)=CC=C2C2C1C1=CC=C3OC(C)(C)C=CC3=C1O2 LWTDZKXXJRRKDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 1
- LYCRXMTYUZDUGA-UYRKPTJQSA-N pimeloyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LYCRXMTYUZDUGA-UYRKPTJQSA-N 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920002776 polycyclohexyl methacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013324 preserved food Nutrition 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N propane-1,1-diol Chemical compound CCC(O)O ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000004144 purine metabolism Effects 0.000 description 1
- OYSBZLVHMPNJMR-UHFFFAOYSA-N pyridine-3-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1.OC(=O)C1=CC=CN=C1 OYSBZLVHMPNJMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003222 pyridines Chemical class 0.000 description 1
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008151 pyridoxamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011699 pyridoxamine Substances 0.000 description 1
- WHOMFKWHIQZTHY-UHFFFAOYSA-L pyridoxine 5'-phosphate(2-) Chemical compound CC1=NC=C(COP([O-])([O-])=O)C(CO)=C1O WHOMFKWHIQZTHY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 229960004172 pyridoxine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019170 pyridoxine-5-phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011763 pyridoxine-5-phosphate Substances 0.000 description 1
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical class OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004728 pyruvic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 description 1
- 150000008223 ribosides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000010979 ruby Substances 0.000 description 1
- 229910001750 ruby Inorganic materials 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Chemical class OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 1
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000012409 standard PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 150000003871 sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 229920002997 teichuronic acid Polymers 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 150000004764 thiosulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N thiouracil Chemical compound O=C1C=CNC(=S)N1 ZEMGGZBWXRYJHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150095421 tig gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005891 transamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical class OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000004143 urea cycle Effects 0.000 description 1
- MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N vanillin Chemical compound COC1=CC(C=O)=CC=C1O MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N vanillin Natural products COC1=CC(O)=CC(C=O)=C1 FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012141 vanillin Nutrition 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 1
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Izolowana czasteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, ze obejmuje sekwencje poda- na na Liscie Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencje do niej komplementarna. 2. Izolowana czasteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, ze koduje polipeptyd obejmu- jacy sekwencje aminokwasowa podana na Liscie Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencje do niej komplementarna. 3. Izolowana czasteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, ze koduje naturalnie wystepu- jaca odmiane alleliczna polipeptydu obejmujacego sekwencje aminokwasowa podana na Liscie Se- kwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencje do niej komplementarna. 4. Izolowana czasteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, ze obejmuje sekwencje nukle- otydowa, która jest w przynajmniej 50% identyczna z cala sekwencja nukleotydowa podana na Liscie Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencje do niej komplementarna. 5. Izolowana czasteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, ze koduje polipeptyd obejmu- jacy sekwencje aminokwasowa, która jest w przynajmniej 50% identyczna z cala sekwencja nukleoty- dowa podana na Liscie Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencje do niej komplementarna. PL PL PL PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są nowe, izolowane cząsteczki kwasu nukleinowego, wektory obejmujące te cząsteczki, nowe komórki gospodarza transfekowane tymi wektorami, izolowane polipeptydy oraz sposób ich wytwarzania, nowy sposób wytwarzania wysokowartościowych związków chemicznych oraz nowy sposób diagnozowania obecności albo aktywności Corynebacterium diphteriae.
Zgłoszenie to zastrzega pierwszeństwo względem wcześniej złożonego, wstępnego zgłoszenia patentowego USA nr 60/141031, złożonego 25 czerwca 1999. Zgłoszenie to zastrzega również pierwszeństwo z:
niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19931636.8, złożonego 8 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932125.6, złożonego 9 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932126.4, złożonego 9 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932127.2, złożonego 9 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932128.0, złożonego 9 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932129.9, złożonego 9 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932226.0, złożonego 9 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932920.6, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932922.2, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932924.9, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 15 19932928.1, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932930.3, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932933.8, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932935.4, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19932973.7, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19933002.6, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19933003.4, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19933005.0, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19933006.9, złożonego 14 lipca 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19941378.9, złożonego 31 sierpnia 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19941379.7, złożonego 31 sierpnia 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19941390.8, złożonego 31 sierpnia 1999, niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 19941391.6, złożonego 31 sierpnia 1999, i niemieckiego zgłoszenia patentowego nr 25 19942088.2, złożonego 3 września 1999.
Pełna zawartość wszystkich wyżej wspomnianych zastrzeżeń patentowych jest rozmyślnie włączona tu przez odniesienie literaturowe.
Niektóre produkty oraz produkty uboczne naturalnie zachodzących w komórkach procesów metabolicznych mają zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu wliczając w to żywienie, przemysł spożywczy, kosmetyczny oraz farmaceutyczny. Do cząsteczek tych, objętych wspólną nazwą „związków wysokowartościowych”, zalicza się kwasy organiczne, aminokwasy zarówno białkowe, jak i niebiałkowe, nukleotydy i nukleozydy, lipidy i kwasy tłuszczowe, diole, węglowodany, związki aromatyczne, witaminy i kofaktory oraz enzymy. Najwygodniejszym sposobem wytwarzania tych związków jest hodowla na dużą skalę bakterii zdolnych do produkcji i wydzielania dużych ilości cząsteczek pożądanego związku. Szczególnie użytecznym do tego celu organizmem jest Corynebacterium glutamicum, gram-pozytywna; niepatogenna bakteria. Stosując metodę selekcji otrzymano ogromną liczbę szczepów zmutowanych, które produkują cały wachlarz pożądanych związków. Jednakże selekcja szczepów wydajniejszych pod względem produkcji określonej cząsteczki jest procesem czasochłonnym i trudnym.
Przedmiotem wynalazku jest izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego.
Istotą wynalazku jest to, że izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencję do niej komplementarną.
Istotą wynalazku jest również to, że izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, koduje polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencję do niej komplementarną.
Istotą wynalazku jest także to, że izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, koduje naturalnie występującą odmianę alleliczną polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencję do niej komplementarną.
PL 195 942 B1
Istotą kolejnego przedmiotu wynalazku jest to, że cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję nukleotydową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencję do niej komplementarną.
Istotą jeszcze innego przedmiotu wynalazku jest to, że izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencję do niej komplementarną.
Istotą wynalazku jest także to, że izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera fragment obejmujący co najmniej 15 sąsiadujących ze sobą nukleotydów o sekwencji nukleotydowej podanej na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencję do niej komplementarną.
Istotą jeszcze innego przedmiotu wynalazku jest to, że izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną powyżej i sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd heterologiczny.
Przedmiotem wynalazku, jest także wektor.
Istotą wynalazku jest to, że wektor obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku.
Korzystnie, wektor jest wektorem ekspresyjnym.
Przedmiotem wynalazku, jest także komórka gospodarza.
Istotą wynalazku jest to, że komórka gospodarza jest transfekowana wektorem ekspresyjnym według wynalazku.
Korzystnie komórka gospodarza jest komórką mikroorganizmu.
Korzystnie, komórka gospodarza należy do rodzaju Corynebacterium albo Brevibacterium.
W innym korzystnym wariancie, ekspresja cząsteczki kwasu nukleinowego powoduje modulację wytwarzania wysokowartościowych związków chemicznych przez komórkę.
Korzystnie, wysokowartościowy związek jest wybrany z grupy obejmującej: kwasy organiczne, aminokwasy wchodzące w skład białek i nie wchodzące w skład białek, zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy, nukleotydy, lipidy, nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe, diole, węglowodany, związki aromatyczne, witaminy, kofaktory, poliketydy i enzymy.
Przedmiotem wynalazku, jest także sposób wytwarzania polipeptydu.
Istotą wynalazku jest to, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza według wynalazku w odpowiedniej pożywce w taki sposób, że wytwarza ona polipeptyd.
Przedmiotem wynalazku jest również, izolowany polipeptyd.
Istotą wynalazku jest to, że izolowany polipeptyd obejmuje sekwencją aminokwasową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400.
Istotą wynalazku jest również to,że izolowany polipeptyd obejmuje naturalnie występującą odmianę alleliczną polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400.
Istotą kolejnego przedmiotu wynalazku jest to, że izolowany polipeptyd jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id.399.
Istotą jeszcze innego przedmiotu wynalazku jest to, że izolowany polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id.400.
Istotą wynalazku jest także to, że izolowany polipeptyd obejmuje fragment polipeptydu zawierający sekwencję aminokwasową, podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400, przy czym wspomniany fragment utrzymuje aktywność biologiczną typową dla 1,2-dioksogenazy katecholowej.
Istotą wynalazku jest również to, że izolowany polipeptyd jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399.
Korzystnie, izolowany polipeptyd dodatkowo obejmuje heterologiczne sekwencje aminokwasowe.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania wysokowartościowego związku chemicznego.
Istotą wynalazku jest to, że sposób obejmuje hodowanie komórki według wynalazku w taki sposób, że wytwarzany jest wysokowartościowy związek chemiczny.
Korzystnie, sposób dodatkowo obejmuje etap odzyskiwania związku z pożywki hodowlanej.
Korzystnie, stosuje się komórkę należącą do rodzaju Corynebacterium albo Brevibacterium.
W innym korzystnym wariancie stosuje się komórkę wybraną z grupy obejmującej: Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium acetoaci4
PL 195 942 B1 dophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitrophilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium healii, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium paraffinolyticum i szczepy podane na Tablicy 3.
Korzystnie, ekspresja cząsteczki kwasu nukleinowego z wektora powoduje modulowanie wytwarzania wysokowartościowego związku chemicznego.
Korzystnie, wysokowartościowy związek chemiczny jest wybrany z grupy obejmującej: kwasy organiczne, aminokwasy wchodzące w skład białek i nie wchodzące w skład białek, zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy, nukleotydy, lipidy, nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe, diole, węglowodany, związki aromatyczne, witaminy, kofaktory, poliketydy i enzymy.
W innym korzystnym wariancie, związkiem chemicznym jest aminokwas.
Korzystnie, aminokwas jest wybrany z grupy obejmującej: lizynę, glutaminian, glutaminę, alaninę, asparaginian, glicynę, serynę, treoninę, metioninę, cysteinę, walinę, leucynę, izoleucynę, argininę, prolinę, histydynę, tyrozynę, fenyloalaninę i tryptofan.
Przedmiotem wynalazku jest także inny sposób wytwarzania wysokowartościowego związku chemicznego.
Istotą wynalazku jest to, że sposób obejmuje hodowanie komórki, której genomowy DNA zmieniono przez wprowadzenie cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku, jest także sposób diagnozowania obecności albo aktywności Corynebacterium diphteriae u osobnika.
Istotą wynalazku jest to, że sposób obejmuje wykrywanie u osobnika obecności bądź aktywności jednej z cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku lub cząsteczki polipeptydu według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka gospodarza.
Istotą wynalazku jest to, że komórka gospodarza obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest uszkodzona.
Istotą kolejnego przedmiotu wynalazku jest to, że komórka gospodarza obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje jedną albo wiele modyfikacji w porównaniu do sekwencji Sekw. Nr Id. 399.
Istotą innego przedmiotu wynalazku jest to, że komórka gospodarza obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399, przy czym region regulatorowy cząsteczki kwasu nukleinowego jest zmodyfikowany względem regionu regulatorowego typu dzikiego.
Wynalazek dostarcza nowych cząsteczek bakteryjnego kwasu nukleinowego o rozmaitym zastosowaniu obejmującym identyfikację mikroorganizmów, mogących posłużyć do produkcji związków wysokowartościowych, modulowanie ich syntezy w C.glutamicum lub bakteriach spokrewnionych, rozróżnianie lub identyfikację C.glutamicum lub bakterii spokrewnionych, jako punktów odniesienia przy mapowaniu genomu C.glutamicum oraz jako znaczników do transformacji. Te nowe cząsteczki kwasu nukleinowego kodują białka zwane tu białkami homeostazy i adaptacji (HA).
C.glutamicum jest gram pozytywną, aerobową bakterią, powszechnie stosowaną w przemyśle do produkcji bardzo różnorodnych związków wysokowartościowych, a także degradacji węglowodorów (takich jak w rozlewiskach ropy naftowej) oraz do utleniania terpenoidów. Cząsteczki kwasów nukleinowych HA według wynalazku można zatem wykorzystać do identyfikacji mikroorganizmów mogących posłużyć do produkcji związków wysokowartościowych np. w procesie fermentacji. Celem modulowania produkcji jednego lub więcej związków wysokowartościowych pochodzących z danego mikroorganizmu (np. poprawianie wydajności produkcji lub produkcja jednego lub więcej związków wysokowartościowych pochodzących z gatunków należących do rodzaju Cornynebacterium lub Brevibacterium) zastosować można modulację ekspresji kwasów nukleinowych HA według wynalazku lub modyfikację ich sekwencji.
Kwasy nukleinowe HA według wynalazku mogą być również stosowane do identyfikacji organizmu takiego jak Corynebacterium glutamicum lub blisko z nim spokrewnionego, albo do stwierdzenia obecności C.glutamicum lub organizmu z nim spokrewnionego w mieszanej populacji mikroorganizmów. Wynalazek dostarcza sekwencji kwasów nukleinowych dużej liczby genów C.glutamicum;
PL 195 942 B1 poprzez testowanie ekstrahowanego DNA genomowego z hodowli pojedynczej lub mieszanej populacji mikroorganizmów, sondą łączącą się w ostrych warunkach z charakterystycznym tylko dla C.glutamicum regionem danego genu, można mieć pewność czy organizm ten jest w hodowli obecny. Choć Corynebacterium glutamicum samo w sobie nie jest patogenne, spokrewnione jest z gatunkiem u ludzi patogennym, Corynebacterium diphtheriae (powodującym dyfteryt); wykrywanie takich organizmów ma istotne znaczenie kliniczne.
Cząsteczki kwasów nukleinowych HA według wynalazku mogą także służyć jako punkty odniesienia przy mapowaniu genomu C.glutamicum lub genomów organizmów spokrewnionych. Podobnie, cząsteczki te lub ich warianty albo fragmenty, mogą być stosowane jako znaczniki genetycznie modyfikowanych gatunków Corynebacterium lub Brevibacterium.
Białka HA kodowane przez nowe cząsteczki kwasów nukleinowych według wynalazku są na przykład zdolne do realizacji funkcji związanych z utrzymaniem homeostazy w C.glutamicum lub ze zdolnością tego mikroorganizmu do adaptacji do różnych warunków środowiskowych. Przy dostępności wektorów klonujących stosowanych u Corynebacterium glutamicum, takich jak opisane przez Sinskey i wsp., patent USA nr 4,649,119, oraz technik inżynierii genetycznej stosowanych u C.glutamicum i spokrewnionych gatunków z rodzaju Brevibacterium (np. lactofermentum) (Yoshihama i wsp., J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985); Katsumata i wsp., J. Bacteriol. 15: 306-311 (1984); Santamaria i wsp., J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246 (1984)), cząsteczki kwasów nukleinowych według wynalazku można wykorzystać do celów inżynierii genetycznej u tego organizmu, aby ulepszyć lub podwyższyć wydajność produkcji jednego lub więcej związków wysokowartościowych. Taka ulepszona produkcja lub efektywność produkcji wysokowartościowego związku chemicznego może być spowodowana bezpośrednim lub pośrednim wpływem manipulacji genem według wynalazku.
Istnieje szereg mechanizmów, za pośrednictwem których zmiana białka HA według wynalazku może bezpośrednio wpływać na wydajność i/lub efektywność produkcji wysokowartościowych związków chemicznych przez posiadające takie zmienione białko szczepy C.glutamicum. Przykładowo, przez przebudowanie enzymów, modyfikujących lub degradujących związki aromatyczne lub alifatyczne, tak, że zwiększa się lub zmniejsza ich aktywność lub ilość, można będzie modulować wytwarzanie jednego lub więcej wysokowartościowych związków chemicznych będących produktami modyfikacji lub degradacji tych związków. Podobnie, enzymy uczestniczące w metabolizmie związków nieorganicznych dostarczają kluczowych cząsteczek (np. fosforu, siarki i cząsteczek azotu) dla biosyntezy takich wysokowartościowych związków chemicznych, jak aminokwasy, witaminy i kwasy nukleinowe. Przez zmianę aktywności kilku takich enzymów w C.glutamicum można zwiększyć przekształcenie tych związków nieorganicznych (lub alternatywnie użycie związków nieorganicznych) i tym samym umożliwić zwiększone wbudowanie nieorganicznych atomów do tych wysokowartościowych związków chemicznych. Przebudowa genetyczna enzymów w C.glutamicum uczestniczących w ogólnych procesach komórkowych może również bezpośrednio poprawiać produkcję wysokowartościowych związków chemicznych, bowiem wiele z tych enzymów bezpośrednio modyfikuje te wysokowartościowe związki (np. aminokwasy) lub enzymy uczestniczące w syntezie tych związków lub sekrecji. Modulowanie aktywności lub ilości proteaz komórkowych może również wywierać bezpośrednie działanie na wytwarzanie wysokowartościowych związków chemicznych, bowiem wiele proteaz może degradować te związki lub enzymy uczestniczące w ich wytwarzaniu lub degradacji.
Ponadto, wyżej wspomniane enzymy uczestniczące w modyfikacji lub degradacji aromatycznych/alifatycznych związków, w ogólnych biokatalizach, metabolizmie związku nieorganicznego lub proteolizie same w sobie są wysokowartościowymi związkami, pożądanymi z uwagi na ich aktywność w różnych zastosowaniach przemysłowych in vitro. Przez zmianę liczby kopii genu dla jednego lub większej liczby enzymów w C.glutamicum, można zwiększyć liczbę wytwarzanych przez komórkę białek, zwiększając w ten sposób potencjalną wydajność lub efektywność produkcji tych białek w hodowli C.glutamicum lub w wielkiej skali.
Zmiana białka HA według wynalazku może również bezpośrednio wpływać na wydajność produkcji i/lub efektywność wytwarzania wysokowartościowego związku chemicznego ze szczepu C.glutamicum niosącego takie zmienione białko. Przykładowo, przez modulowanie aktywności i/lub liczby tych białek uczestniczących w konstrukcji lub przebudowie ściany komórkowej może być możliwa modyfikacja struktury samej ściany komórkowej taka, że komórka jest zdolna do lepszej obrony przed mechanicznym lub innymi wstrząsami występującymi w czasie hodowli w fermentorze w wielkiej skali. Również hodowanie na dużą skalę C.glutamicum wymaga znaczącego wytwarzania ściany komórkowej. Modulacja aktywności lub ilości enzymów syntetyzujących lub degradujących ścianę
PL 195 942 B1 komórkową może przyspieszyć biosyntezę ściany komórkowej, co z kolei może umożliwić szybszy wzrost tego mikroorganizmu w hodowli i co za tym idzie zwiększenie liczby komórek wytwarzających wysokowartościowy związek chemiczny.
Przez modyfikowanie enzymów HA według wynalazku można również bezpośrednio wpływać na wydajność lub efektywność produkcji jednego lub większej liczby wysokowartościowych związków chemicznych z C.glutamicum. Przykładowo, wiele ogólnych enzymów w C.glutamicum może mieć znaczący wpływ na ogólne procesy komórkowe (np. procesy regulacyjne), które z kolei mają znaczący wpływ na metabolizm wysokowartościowych związków chemicznych. Podobnie proteazy, enzymy modyfikujące lub degradujące potencjalnie toksyczne aromatyczne lub alifatyczne związki i enzymy powodujące metabolizm związków nieorganicznych mogą służyć zwiększeniu żywotności C.glutamicum. Proteazy wspomagają selektywne usuwanie źle sfałdowanych lub błędnie regulowanych białek, takich jak te, które mogą wystąpić we względnie stresotwórczych warunkach środowiskowych jakie występują w czasie hodowli w fermentorze na dużą skalę. Przez zmianę tych białek możliwe jest dalsze zwiększenie tej aktywności i zwiększenie żywotności C.glutamicum w hodowli. Modyfikacje aromatyczno/alifatyczne lub degradacja białek nie tylko służą detoksyfikacji tych odpadowych związków (które mogą występować jako zanieczyszczenia w pożywce hodowlanej lub jako produkty odpadowe z samych komórek), lecz również pozwalają komórce wykorzystać alternatywne źródła węgla, jeśli optymalne źródło węgla jest w hodowli ograniczone. Przez zwiększenie ich liczby i/lub aktywności zwiększona może być przeżywalność komórek C.glutamicum w hodowli. Białka związane z metabolizmem związków nieorganicznych dostarczają komórce cząsteczek nieorganicznych wymaganych (między innymi) dla syntezy wszystkich białek i nukleotydów i co za tym idzie są krytyczne dla ogólnej żywotności komórki. Zwiększona liczba żywych komórek wytwarzających, w hodowli na wielką skalę jeden lub więcej pożądanych wysokowartościowych związków chemicznych, prowadzi w efekcie do towarzyszącego temu zwiększenia wydajności produkcji i/lub efektywności produkcji wysokowartościowych związków chemicznych w hodowli.
Wynalazek dostarcza nowych cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują białka określone tu jako białka HA, które są przykładowo zdolne do realizacji funkcji wymaganej dla zachowania homeostazy w C.glutamicum lub uczestniczą w zdolności mikroorganizmu do adaptacji do różnych warunków środowiskowych. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące białko HA są określone tu jako cząsteczki kwasu nukleinowego HA. W korzystnej postaci białko HA uczestniczy w biosyntezie lub przebudowie ściany komórkowej C.glutamicum lub w metabolizmie związków nieorganicznych, modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych lub posiada aktywność enzymatyczną lub proteolityczną C.glutamicum. Przykłady takich białek obejmują te, które są kodowane przez geny zestawione w Tablicy 1.
Tak więc, jeden aspekt wynalazku dotyczy wyizolowanych cząsteczek kwasów nukleinowych (np. cDNA, DNA lub RNA) zawierających sekwencję nukleotydową kodującą białko HA lub biologicznie aktywne jego fragmenty, jak również dotyczy fragmentów kwasów nukleinowych stosowanych jako startery lub sondy w hybrydyzacji do wykrywania lub amplifikacji kwasów nukleinowych kodujących HA (np. DNA lub mRNA).
W innych szczególnie korzystnych postaciach, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje z lub jest homologiczna do sekwencji nukleotydowej lub jej fragmentów, przedstawionej jako nieparzysta Nr ID. 399 na Liście Sekwencji co najmniej w około 50%, korzystnie co najmniej w około 60%, korzystniej co najmniej w około 70%, 80% lub 90%, zaś najkorzystniej co najmniej w około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i więcej. W innych korzystnych postaciach, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEKW. Nr ID. 400 w Liście Sekwencji. Korzystne białka HA według wynalazku, korzystnie mają co najmniej jedną aktywność HA spośród tu opisanych.
W innej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje białko lub jego fragment, który zawiera sekwencję aminokwasową wystarczająco homologiczną do sekwencji aminokwasowej według wynalazku np. homologiczną w takim stopniu, że dane białko lub jego część posiada aktywność HA. Korzystnie białko lub jego fragment kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego zachowują zdolność uczestnictwa w utrzymaniu homeostazy w C.glutamicum lub przeprowadzenia funkcji związanej z adaptacją tego mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych. W jednej postaci, białko kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jest co najmniej w około 50%, korzystnie co najmniej w około 60%, korzystniej co najmniej w około 70%, 80% lub 90%, zaś najkorzystniej co najmniej w około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i bardziej homologiczne do sekwencji aminokwasowej
PL 195 942 B1 według wynalazku (np. całkowitej sekwencji aminokwasowej wybranej spośród sekwencji o parzystym numerze na Liście Sekwencji). Białko, w innej korzystnej postaci, stanowi całkowitej długości białko C.glutamicum, które jest zasadniczo homologiczne do całkowitej sekwencji aminokwasowej wynalazku.
W innej korzystnej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego dostarczona z C.glutamicum i kodująca białko (np. białko fuzyjne HA), zawierające biologicznie aktywną domenę homologiczną w co najmniej około 50% lub więcej do sekwencji aminokwasowej według wynalazku, jest zdolna do uczestnictwa w naprawie lub rekombinacji DNA, w transpozycji materiału genetycznego, w ekspresji genu (np. w procesach transkrypcji lub translacji), w fałdowaniu białka lub w wydalaniu białka u Corynebacterium C.glutamicum lub posiada jedną lub więcej aktywności przedstawionych w Tablicy 1 i która również zawiera heterologiczne sekwencje kwasów nukleinowych kodujące heterologiczne polipeptydy lub rejony regulatorowe.
W innej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego ma długość co najmniej 15 nukleotydów i hybrydyzuje w ostrych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową według wynalazku. Korzystnie wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego odpowiada naturalnie występującej cząsteczce kwasu nukleinowego. Bardziej korzystnie wyizolowany kwas nukleinowy koduje naturalnie występujące białko HA C.glutamicum lub biologicznie aktywną jego część.
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy genetycznie modyfikowanego mikroorganizmu, do którego wprowadzono, bądź w którym zmieniono gen HA. W jednej postaci, genom mikroorganizmu został zmieniony poprzez wprowadzenie w formie transgenu cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku kodującej dziką lub zmutowaną sekwencję HA. W innej postaci, endogenny gen HA znajdujący się w genomie mikroorganizmu został zmieniony, np. funkcjonalnie uszkodzony, metodą rekombinacji homologicznej z użyciem zmienionego genu HA. W jeszcze innej postaci, endogenny bądź wprowadzony gen HA w mikroorganizmie zmieniono poprzez jedną lub więcej mutacji punktowych, delecji lub inwersji, nie powodując jednak utraty zdolności kodowania funkcjonalnego białka HA. W kolejnej postaci, jeden lub więcej spośród rejonów regulatorowych genu HA (np. promotor, represor lub induktor) mikroorganizmu zmieniono (np. poprzez delecję, skrócenie, inwersję lub mutację punktową) w taki sposób, że ekspresja genu HA uległa modulacji. W korzystnej postaci, mikroorganizm należy do rodzaju Corynebacterium lub Brevibacterium, najkorzystniej zaś zalicza się do Corynebacterium glutamicum. W korzystnej postaci, mikroorganizm jest także wykorzystywany do produkcji pożądanego związku, takiego jak aminokwas, a w szczególności lizyny.
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy wyizolowanego białka HA lub jego części np. biologicznie aktywnej jego części. W korzystnej postaci wyizolowane białko HA lub jego część może uczestniczyć w utrzymaniu homeostazy C.glutamicum lub przeprowadzić funkcję związaną z adaptacją tego mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych. W innej korzystnej postaci, wyizolowane białko HA lub jego część jest wystarczająco homologiczna do sekwencji aminokwasowej według wynalazku w taki sposób, że białko lub jego część zachowuje zdolność do brania udziału w utrzymaniu homeostazy C.glutamicum lub przeprowadzenia funkcji związanej z adaptacją tego mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych.
Wynalazek dostarcza także wyizolowanego preparatu białka HA. W korzystnej postaci białko HA zawiera sekwencję aminokwasową według wynalazku. W innej korzystnej postaci, wynalazek dotyczy wyizolowanego białka o pełnej długości, które jest zasadniczo homologiczne do całkowitej sekwencji aminokwasowej według wynalazku (kodowanej przez otwartą ramkę odczytu zestawioną z odpowiadającą jej sekwencją o nieparzystym numerze na Liście Sekwencji). W kolejnej korzystnej postaci białko jest homologiczne do całkowitej sekwencji aminokwasowej według wynalazku co najmniej w około 50%, korzystnie co najmniej w około 60%, korzystniej co najmniej w około 70%, 80% lub 90%, zaś najkorzystniej co najmniej w około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej. W innej postaci wyizolowane białko HA zawiera sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w około 50% lub więcej homologiczna do sekwencji aminokwasowej według wynalazku i zdolne jest do brania udziału utrzymaniu homeostazy C.glutamicum lub przeprowadzenia funkcji związanej z adaptacją tego mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych posiada jedną lub więcej spośród aktywności zestawionych w Tablicy 1.
Alternatywnie, wyizolowane białko HA może zawierać sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje, na przykład w ostrych warunkach, lub jest homologiczna do całkowitej sekwencji nukleotydowej według wynalazku w około 50%, korzystnie co najmniej w około 60%, korzystniej co najmniej w około 70%, 80% lub 90%, zaś najkorzystniej co najmniej
PL 195 942 B1 w około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i bardziej. Pożądanym jest także, aby korzystne formy białek HA miały jedną lub więcej spośród opisanych tutaj bioaktywności HA.
Polipeptyd HA lub jego biologicznie aktywna część, można skutecznie połączyć z polipeptydem nie będącym HA celem wytworzenia białka fuzyjnego. W korzystnej postaci, takie fuzyjne białko posiada aktywność, która różni się od aktywności samego białka HA. W innych korzystnych postaciach, zastosowanie takiego białka fuzyjnego powoduje podwyższenie wydajności, produkcji i/lub efektywności produkcji pożądanego związku wysokowartościowego u C.glutamicum. W szczególnie korzystnej postaci, integracja białka fuzyjnego w komórce gospodarza moduluje w niej produkcję pożądanego związku.
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy metod modulacji produkcji cząsteczek przez mikroorganizmy. Metody te obejmują kontaktowanie komórek z reagentem modulującym aktywność białka HA lub ekspresję kwasu nukleinowego HA w taki sposób, że aktywność komórek podlega zmianom względem aktywności przy braku reagenta. W korzystnej postaci, komórka modulowana jest z uwagi na jeden lub więcej procesów związanych z biosyntezą lub przebudową ściany komórkowej, metabolizmem związków nieorganicznych, modyfikacją lub degradacją związków aromatycznych lub alifatycznych lub z uwagi na aktywność enzymatyczną lub proteolityczną. Reagent modulujący aktywność białka HA może być reagentem stymulującym aktywność białka HA lub ekspresję kwasu nukleinowego HA. Do reagentów stymulujących aktywność białka HA lub ekspresję kwasu nukleinowego HA zaliczają się małe cząsteczki, aktywne białka HA i kwasy nukleinowe kodujące białka HA, wprowadzone do komórek. Do reagentów hamujących aktywność HA lub ekspresję zaliczają się małe cząsteczki oraz antysensowne cząsteczki kwasów nukleinowych HA.
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy metod modulacji wydajności pożądanego związku z komórek, obejmujących wprowadzanie do komórek dzikich lub zmutowanych genów HA utrzymywanych bądź na oddzielnych plazmidach bądź zintegrowanych z genomem komórek gospodarza. Integracja z genomem zajść może losowo, bądź drogą rekombinacji uprawnionej w taki sposób, że dany gen zastępowany jest przez wprowadzoną kopię, co powoduje produkcję pożądanego związku w modulowanej komórce. W korzystnej postaci wydajności są podwyższone. W innej korzystnej postaci, związkiem chemicznym jest związek wysokowartościowy. W szczególnie korzystnej postaci, wzmiankowany związek wysoko wartościowy jest aminokwasem. W szczególnie korzystnej postaci takim aminokwasem jest L-lizyna.
Niniejszy wynalazek dostarcza kwasu nukleinowego HA i cząsteczek białka zaangażowanych u C.glutamicum w biosyntezę lub przebudowę ściany komórkowej, metabolizm związków nieorganicznych, modyfikację lub degradację związków aromatycznych lub alifatycznych lub które mają aktywność enzymatyczną lub proteolityczną C.glutamicum. Cząsteczki według wynalazku mogą być wykorzystywane do modulowania produkcji związków wysokowartościowych u mikroorganizmów, takich jak C.glutamicum albo przez bezpośrednie działanie (np. gdy nadekspresja lub optymalizacja aktywności białka uczestniczącego w produkcji wysokowartościowego związku chemicznego (np. enzymu) ma bezpośredni wpływ na wydajność, produkcję i/lub efektywność produkcji wysokowartościowego związku chemicznego w modyfikowanym C.glutamicum) albo przez pośredni wpływ, który jednak daje w efekcie wzrost wydajności, produkcji i/lub efektywności produkcji żądanego związku (np. gdy modulacja aktywności lub liczby kopii aromatycznej lub alifatycznej modyfikacji lub degradacji białka prowadzi do zwiększenia żywotności komórek C.glutamicum, dzięki czemu z kolei wzrasta produkcja w hodowli w dużej skali. Dalsze aspekty wynalazku są przedstawione poniżej.
I. Związki wysokowartościowe
Pojęcie związku wysokowartościowego znane jest w nauce i obejmuje cząsteczki produkowane przez organizm, mające zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu, jak między innymi przemysł kosmetyczny farmaceutyczny oraz rolnictwo. Do takich związków zalicza się kwasy organiczne takie, jak kwas winowy, kwas itakonowy i kwas diaminopimelinowy, zarówno białkowe jak i niebiałkowe aminokwasy, zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy i nukleotydy (jak opisane np. w Kuninaka,
A. (1996) Nucleotides and related compounds, str.561-612, w Biotechnology tom 6, Rehm i wsp. wyd. VCH: Weinheim i odnośniki do literatury tam zawarte), lipidy, zarówno nienasycone jak i nasycone kwasy tłuszczowe (np. kwas arachidonowy), diole (np. propanodiol, butanodiol), węglowodany (np. kwas hialuronowy i trehaloza), związki aromatyczne (np. aminy aromatyczne, wanilina i indygo), witaminy i kofaktory (jak opisane w Encyklopedii Ullmanna Industrial Chemistry, tom A27, „Vitamins”, str. 443-613 (1996 VCH: Weinheim i odnośniki do literatury tam zawarte; oraz Ong, A.S., Niki, E.&Packer, L. (1995) „Nutrition, Lipids, Health, and Disease” Proceedings of the UNESCO/-Confederation of Scientific
PL 195 942 B1 and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free radical Research-Asia, Sept. 1-3, 1994 w Penang, Malezja, AOCS Press, (1995)), enzymy, poliketydy (Cane i wsp. (1998) Science 282:63-68), i wszystkie inne związki chemiczne opisane w Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN; 0818805086 i odnośniki do literatury tam zawarte. Metabolizm i zastosowanie niektórych spośród powyższych związków wysokowartościowych omówiono poniżej.
A. Metabolizm i zastosowanie aminokwasów
Aminokwasy stanowią podstawowe jednostki strukturalne wszystkich białek i jako takie niezbędne są do normalnego funkcjonowania komórek wszystkich organizmów. Termin „aminokwas” jest znany w nauce. Istnieje 20 aminokwasów białkowych służących jako strukturalne jednostki białek, w których są one połączone za pomocą wiązań peptydowych, podczas gdy aminokwasy niebiałkowe (poznano ich kilkaset) normalnie nie są znajdowane w białkach (patrz Encyklopedia Ullmanna Industrial Chemistry, tom A2, str. 57-95 VCH: Weinheim (1985)). Aminokwasy mogą posiadać konfigurację optyczną D lub L, choć ogólnie rzecz biorąc jedynie aminokwasy typu L znajdują się w naturalnie występujących białkach. Szlaki biosyntezy i degradacji każdego z 20 aminokwasów białkowych są dobrze poznane zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych (patrz. Stryer, L. Biochemia, wydanie 3, strony 578-590 (1988)). Aminokwasy „niezbędne” (histydyna, izoleucyna, leucyna, lizyna, metionina, fenyloalanina, treonina, tryptofan oraz walina) noszą tę nazwą, ponieważ z uwagi na złożoność ich biosyntezy wymagane są w pożywieniu, z łatwością przekształcane są drogą prostych szlaków biosyntezy do pozostałych 11 aminokwasów endogennych (alanina, arginina, asparagina, asparaginian, cysteina, glutaminian, glutamina, glicyna, prolina, seryna oraz tyrozyna). Wyżej zorganizowane zwierzęta zachowały zdolność do syntezy niektórych spośród tych aminokwasów, lecz aminokwasy niezbędne muszą być w diecie dostarczane, aby mogła zachodzić normalna synteza białek.
Poza udziałem w biosyntezie białek, powyższe aminokwasy są interesujące również jako związki chemiczne, a wiele z nich znalazło rozmaite zastosowania w żywieniu, przemyśle spożywczym, chemicznym, kosmetycznym, rolniczym oraz farmaceutycznym. Lizyna jest istotnym aminokwasem w żywieniu nie tylko ludzi, lecz także zwierząt jednożołądkowych, takich jak drób i trzoda chlewna. Glutaminian jest najpowszechniej używany jako dodatek zapachowy (glutaminian monosodu, MSG) i szeroko stosowany w przemyśle spożywczym, tak jak i asparaginian, fenyloalanina, glicyna oraz cysteina. Glicyna, L-metionina i tryptofan są wykorzystywane w przemyśle farmaceutycznym. Glutamina, walina, leucyna, izoleucyna, histydyna, arginina, prolina, seryna oraz alanina stosowane są zarówno w przemyśle farmaceutycznym, jak i kosmetycznym. Zaś treonina, tryptofan oraz D/L-metionina są popularnymi dodatkami w żywieniu (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, p. 466-502, Rhem i wsp. (eds) Biotechnology tom 6, rozdział 14a, VCH: Weinheim). Ponadto aminokwasy te okazały się przydatne jako prekursory do produkcji syntetycznych aminokwasów i białek, takich jak N-acetylocysteina, S-karboksymetylo-L-cysteina, (S)-5-hydroksytryptofan oraz inne opisane w Encyclopedia of Industrial Chemistry autorstwa Ulmanna, tom A2, str. 57-97, VCH: Weinheim, 1985.
Biosynteza aminokwasów naturalnych przez zdolne do ich produkcji organizmy, takie jak bakterie, została dobrze scharakteryzowana (w celu zapoznania się z bakteryjną biosyntezą aminokwasów i jej regulacją patrz. Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606). Glutaminian syntezowany jest na drodze redukcyjnej animacji a-ketoglutaranu, związku pośredniego w cyklu kwasu cytrynowego. Glutamina, prolina oraz arginina są, każda z osobna, produkowane z glutaminianu. Substratem do biosyntezy seryny jest 3-fosfoglicerynian (produkt pośredni glikolizy), który w trzyetapowym procesie, w wyniku którego powstaje seryna, podlega kolejno utlenieniu, transaminacji i hydrolizie. Zarówno cysteina jak i glicyna produkowane są z seryny; pierwsza poprzez reakcję kondensacji homocysteiny z seryna, zaś druga w rezultacie przeniesienia atomu węgla z pozycji b łańcucha bocznego na tetrahydrofolian w reakcji katalizowanej przez transhydroksymetylaze serynową. Fenyloalanina i tyrozyna syntetyzowane są z erytrozo-4-fosforanu i fosfoenolopirogronianu będących prekursorami glikolizy i szlaku fosfopentozowego, w dziewięcio-etapowych procesach biosyntezy różniących się między sobą jedynie dwoma końcowymi etapami po etapie syntezy prefenolanu. Również tryptofan produkowany jest z tych dwóch prekursorowych cząsteczek, lecz jego synteza jest procesem 11 etapowym. Tyrozyna może być także syntetyzowana z fenyloalaniny w reakcji katalizowanej przez hydroksylazę fenyloalaninową. Alanina, walina oraz leucyna stanowią biosyntetyczne pochodne pirogronianu, będącego końcowym produktem glikolizy. Asparaginian powstaje ze szczawiooctanu, produktu pośredniego w cyklu kwasu cytrynowego. Asparagina, metionina, treonina oraz lizyna są produktem przekształcenia asparaginianu. Isoleucyna powstaje z treoniny. Histydyna powstaje w wyniku
PL 195 942 B1 złożonego, 9-etapowego procesu z 5-fosforybozylo-1-pirofosforanu, będącego aktywowaną formą cukru.
Aminokwasy dostarczane w nadmiarze wobec białek nie są magazynowane, lecz degradowane celem dostarczenia związków pośrednich wykorzystywanych w głównych szlakach biosyntezy w komórce (patrz. Stryer, L. Biochemia wyd. 3 rozdział 21 „Amino Acids Degradation and me Urea Cycle”, str. 495-516 (1988)). Chociaż komórka jest w stanie przekształcać niepotrzebne aminokwasy w użyteczne metabolity pośrednie, produkcja aminokwasów jest dla niej kosztowna zarówno pod względem energetycznym, jak i pod względem cząsteczek prekursorowych oraz enzymów koniecznych do ich syntezy. Nie jest zatem zaskakujące, że biosynteza aminokwasów jest regulowana poprzez inhibicję na zasadzie sprzężenia zwrotnego, gdzie obecność danego aminokwasu prowadzi do zwolnienia lub całkowitego zakończenia jego produkcji (celem zapoznania się z mechanizmami sprzężeń zwrotnych w biosyntezie aminokwasów, patrz. Stryer, L. Biochemia, wyd. 3 rozdział 24: „Biosynthesis of Amino Acids and Heme”, str. 576-600(1988)). Zatem produkcja jakiegokolwiek aminokwasu jest ograniczana przez jego ilość w komórce.
B. Metabolizm i zastosowania witamin, kofaktorów oraz związków odżywczych
Witaminy, kofaktory oraz związki odżywcze wchodzą w skład kolejnej grupy cząsteczek, których zdolność syntezy została utracona przez organizmy wyższe i które muszą być w związku z tym przyjmowane w pokarmie, choć z łatwością syntetyzowane są przez inne organizmy takie, jak bakterie. Cząsteczki te są same z siebie związkami aktywnymi biologicznie, bądź też są prekursorami związków biologicznie aktywnych, mogących stanowić nośniki elektronów lub produkty pośrednie w rozmaitych szlakach metabolicznych. Poza wartością odżywczą, związki te mają również istotne znaczenie przemysłowe, jako czynniki barwiące, antyoksydanty oraz katalizatory lub inne związki wspomagające procesy metaboliczne. (Celem zapoznania się ze strukturą, aktywnością i zastosowaniem przemysłowym tych związków, patrz np. Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry „Vitamins”, tom A27, str. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Pojęcie „witamina” jest znane w nauce i obejmuje składniki odżywcze, które konieczne są do normalnego funkcjonowania organizmu, lecz których organizm nie potrafi sam syntetyzować. Do grupy witamin można zaliczyć kofaktory i związki odżywcze („nutraceutical”). Termin „kofaktor” obejmuje niebiałkowe związki wymagane do wystąpienia normalnej aktywności enzymatycznej. Mogą to być związki organiczne lub nieorganiczne; cząsteczki kofaktorów według wynalazku są najczęściej organiczne. Pojęcie „związku odżywczego” obejmuje substancje uzupełniające w diecie, mające korzystny wpływ na zdrowie roślin i zwierząt, a szczególnie ludzi. Przykładem takich cząsteczek są witaminy, antyoksydanty, a także pewne tłuszcze (np. wielonienasycone kwasy tłuszczowe).
Biosynteza tych cząsteczek w organizmach zdolnych je syntezować, takich, jak bakterie, została szeroko opisana (Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry „Vitamins”, tom A27, str. 443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A. S., Niki, E. & Parker, L. (1995) „Nutrition, Lipids, Health, and Disease” Proceedings of the Unesco/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research - Asia, held Spet. 1-3, 1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press: Champaign, ILX, 374 S).
Tiamina (witamina B1) wytwarzana jest w procesie chemicznego połączenia pirimidyny z cząsteczkami tiazolu. Ryboflawina (witamina B2) syntetyzowana jest z guanozyno-5'-tri-fosforanu (GTP) i rybozo-5ifosforanu. Ryboflawina z kolei, wykorzystywana jest do syntezy mononukleotydu flawiny (FMN) oraz adeninowego dinukleotydu flawiny (FAD). Wszystkie substancje należące do rodziny związków objętych łączną nazwą „witamina B6” (np. pirydoksyna, pirydoksamina, pirydokso-5ifosforan oraz handlowo stosowany chlorowodorek pirydoksyny), są pochodnymi wspólnej jednostki strukturalnej, 5-hydroksy-6-metylopirydyny. Pantotenian (kwas pantotenowy, (R)-(+)-N-(2,4-dihydroksy-3,3-dimetylo-1-oksobutylo)-b-alanina) może być produkowany na drodze syntezy chemicznej bądź fermentacji. Ostatnim etapem w biosyntezie pantotenianu jest reakcja kondensacji b-alaniny i kwasu pantowego z użyciem energii pochodzącej z ATP. Poznano enzymy odpowiedzialne za etapy biosyntezy obejmujące konwersję do kwasu pantowego, b-alaniny oraz kondensację do kwasu pantotenowego. Aktywną metabolicznie formą pantotenianu jest Koenzym A, którego biosynteza przebiega w pięciu enzymatycznych etapach. Pantotenian, pirydoksalo-5MOsforan, cysteina oraz ATP są prekursorami Koenzymu A. Wspomniane enzymy nie tylko katalizują tworzenie pantotenianu, lecz także produkcję kwasu (R)-pantowego, (R)-pantolaktonu, (R)-pantenolu (prowitamina B5), pantoteiny (i jej pochodnych) oraz koenzymu A.
PL 195 942 B1
Biosynteza biotyny z cząsteczki prekursorowej pimeloilo-CoA była szczegółowo badana u mikroorganizmów, dzięki czemu zidentyfikowano kilka genów w nią zaangażowanych. Okazało się, że wiele z odpowiadających im białek bierze także udział w syntezie związków wiążących Fe, oraz że należą do białek klasy nifS. Kwas liponowy jest pochodną kwasu oktanowego i jest wykorzystywany jako koenzym w metabolizmie energetycznym, gdzie staje się częścią kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej i dehydrogenazy a-ketoglutaranowej. Foliany są grupą związków pochodnych kwasu foliowego, który z kolei jest pochodną kwasu L-glutaminowego, kwasu p-amino-benzoesowego oraz
6-metylopteryny. Biosyntezę kwasu foliowego i jego pochodnych badano szczegółowo u niektórych mikroorganizmów, poczynając od metabolicznych produktów pośrednich guanozyno-5'-trifosfo-ranu (GTP), kwasu L-glutaminowego oraz p-amino-benzoesowego.
Korynoidy (takie jak kobalaminy, a w szególności witamina B12) oraz porfiryny należą do grupy związków chemicznych charakteryzujących się tetrapirolowym układem pierścieniowym. Biosynteza witaminy B12 jest na tyle złożona, że nie została jeszcze całkowicie opisana, lecz poznano już wiele enzymów i substratów, biorących w niej udział. Kwas nikotynowy (nikotynian) i nikotynamid są pochodnymi pirydyny zwanymi również Tiacynamh Niacyna jest prekursorem ważnego koenzymu NAD (dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy) i NADP (fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego) i ich zredukowanych form.
Produkcja tych związków na dużą skalę w większości opiera się na niekomórkowej syntezie chemicznej, jednakże niektóre z tych związków chemicznych - jak ryboflawina, witamina B6, pantotenian i biotyna, są produkowane na dużą skalę w hodowlach mikroorganizmów. Jedynie witamina B12 z powodu złożoności procesu jej syntezy, produkowana jest wyłącznie poprzez fermentacją. Metody in vitro wymagają czasu i znacznego nakładu materiałów często bardzo kosztownych.
C. Metabolizm i zastosowania puryn, pirymidyn, nukleozydów i niukleotydów.
Metabolizm genów puryn, pirymidyn i odpowiadających im białek stanowi ważny cel w terapii nowotworów i infekcji wirusowych. Pojęcie „puryna” lub „pirymidyna” odnosi się do zasad azotowych będących składnikami kwasów nukleinowych, koenzymów i nukleotydów. Pojęcie „nukleotyd” odnosi się do podstawowych strukturalnych jednostek cząsteczek kwasów nukleinowych, które składają się z zasady azotowej, pentozy (w przypadku RNA cukrem jest ryboza; w przypadku DNA D-deoksyryboza) i kwasu fosforowego. Pojęcie „nukleozyd” odnosi się do cząsteczek nukleotydów, które służą jako prekursor, nie posiadających kwasu fosforowego, który występuje w nukleotydach. Poprzez hamowanie biosyntezy tych cząsteczek lub ich gotowości do tworzenia cząsteczek kwasów nukleinowych możliwe jest hamowanie syntezy RNA i DNA; dzięki hamowaniu tej aktywności w komórkach nowotworowych, można ograniczyć zdolność tych komórek do podziału i replikacji. Istnieją także nukleotydy nie wchodzące w skład cząsteczek kwasów nukleinowych, ale służące raczej jako zapas energetyczny (tj. AMP) lub jako koenzymy (tj. FAD i NAD).
Zastosowanie tych związków chemicznych do celów medycznych poprzez wpływanie ich na metabolizm puryn i/lub pirymidyn zostało opisane w kilku publikacjach (np. Christopherson, R.I. Lyons, S.D. (1990) „Potent inhibitors of de novo pyrimidine nad purine biosynthesis as chemotherapeutic agetns.” Med. Res. Reviews 10:505-548). Badania enzymów zaangażowanych w metabolizm puryn i pirymidyn skupiały się na rozwoju nowych leków, które mogą być użyte jako np. immunosupresory lub antyproliferanty (Smith, J.L., (1995) „Enzymes in nucleotide symesis” Curr. Opin. Struct. Biol. 5:752-757; (1995) Biochem Soc. Transact. 23:877-902). Jednakże zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy i nukleotydy mają inne zastosowania: jako związki pośrednie w biosyntezie kilku związków wysokowartościowych (np. tiaminy, S-adenozylometioniny, folianów lub ryboflawiny), jako nośniki energii dla komórki (np. ATP lub GTP)i dla samych związków chemicznych wykorzystywanych zwykle jako wzmacniacze smaku (np. IMP lub GMP) lub dla kilku zastosowań medycznych (patrz np. Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology tom 6, Rehm i wsp., eds. VCH: Weinheim str 561-612). Enzymy zaangażowane w metabolizm puryn, pirymidyn, nukleozydów lub nukleotydów są także często wykorzystywane jako cele dla związków chemicznych stosowanych do ochrony upraw, do których należą fungicydy, herbicydy i środki owadobójcze.
Scharakteryzowano metabolizm tych związków w bakteriach (patrz np. Zalkin, H., Dixson, J.E. (1992) „de novo purine nucleotide biosynthesis” Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, tom 42, Academic Press:, str. 259-287; Michal, G. (1999) „Nucleotides and Nucleosides” rozdział 8: Biochemical Pathway: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley: New York). Metabolizm puryn był obiektem intensywnych badań i jest kluczowy dla normalnego funkcjonowania komórki. Metabolizm wolnych puryn u zwierząt wyższych może doprowadzić do ciężkich schorzeń
PL 195 942 B1 takich jak skaza moczanowa. Nukleotydy purynowe syntetyzowane są z rybozo-5-fosforanu w kilku etapach poprzez związek pośredni inozyno-5Mcsforan (IMP) prowadząc do produkcji guanozyno-5^monofosforanu (GMP) lub adenozyno-5^monofosforanu (AMP), z których z łatwością powstają związki trifosforanowe wykorzystywane jako nukleotydy. Związki te są także wykorzystywane jako energetyczny zapas, a ich degradacja zapewnia energię dla wielu różnych komórkowych procesów biochemicznych. Biosynteza pirymidyn przebiega poprzez tworzenie urydyno-5^monofosforanu (UMP) z rybozo-5-fosforanu. UMP jest następnie przekształcany do cytydyno-5'-trifosforanu (CTP). Formy deoksy wszystkich tych nukleotydów wytwarzane są w jednoetapowej reakcji redukcji z difosforanowej formy rybozydo dwufosforanowej formy deoksyrybozy danego nukleotydu. Pod wpływem fosforylacji cząsteczki te stają się zdolne do brania udziału w syntezie DNA.
D. Metabolizm i zastosowania trehalozy
Trehaloza składa się z dwóch cząsteczek glukozy połączonych wiązaniem a,a-1,1. Jest ona powszechnie stosowana w przemyśle spożywczym jako słodzik, dodatek do suszonej lub mrożonej żywności oraz napojów. Jednakże ma również zastosowania w przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznym oraz biotechnologicznym (patrz. np. Nishmoto i wsp., (1998) patent USA nr 5,759,610; Singer, M.A. i Lindiquist, S. (1998) Trends Biotech. 16: 460-467; Paiva, C.L.A. i Panek, A.D. (1996) Biotech. Ann. Rev. 2: 293-314; oraz Shiosaka, M. (1997) J.Japan 172: 97-102). Trehaloza produkowana jest przez enzymy występujące u wielu organizmów i jest naturalnie wydzielana do pożywki, z której może być zbierana za pomocą metod dobrze znanych w technice.
II. Zachowanie homeostazy w C.glutamicum i adaptacja środowiskowa
Metaboliczne i inne procesy biochemiczne, dzięki którym komórki funkcjonują, są wrażliwe na warunki środowiskowe, takie jak temperatura, ciśnienie, stężenie substancji rozpuszczonych i dostępność tlenu. Gdy jeden lub więcej takich warunków środowiskowych jest zaburzonych lub zmienionych w sposób, który nie jest zgodny z normalnym funkcjonowaniem tych procesów komórkowych, komórka musi działać aby zachować środowisko wewnątrzkomórkowe, które umożliwi przebieg tych procesów niezależnie od wrogości środowiska zewnątrzkomórkowego. Komórki bakterii gram dodatnich, takie jak komórki C.glutamicum, posiadają szereg mechanizmów, dzięki którym zachowana może być wewnętrzna homeostaza niezależnie od niesprzyjających warunków środowiskowych. Obejmują one ścianę komórkową, białka, które są zdolne do degradacji potencjalnych toksycznych związków aromatycznych i alifatycznych, mechanizmy proteolizy, dzięki którym mogą być szybko degradowane źle sfałdowane lub błędnie regulowane białka i katalizatory pozwalające na zachodzenie reakcji wewnątrzkomórkowych, które normalnie nie zachodzą w warunkach optymalnych dla wzrostu bakterii.
Poza jedynie przeżyciem we wrogim środowisku komórki bakterii (np. komórki C.glutamicum) są również często zdolne do adaptacji, tak że są w stanie czerpać korzyści z takich warunków. Przykładowo, komórki w środowisku pozbawionym pożądanych źródeł węgla mogą przystosować się do wzrostu na mniej użytecznym źródle węgla. Również komórki mogą być w stanie wykorzystać mniej pożądane związki nieorganiczne, gdy niedostępne są powszechnie stosowane. Komórki C.glutamicum posiadają szereg genów, które pozwalają im na przystosowanie się do wykorzystywania cząsteczek nieorganicznych i organicznych, które nie byłyby normalnie wykorzystywane w optymalnych warunkach wzrostu jako substancje odżywcze i prekursory dla metabolizmu. Zagadnienia związane z wewnątrzkomórkowymi procesami uczestniczącymi w homeostazie i adaptacji są ponadto omówione poniżej.
A. Modyfikacja i degradacja związków aromatycznych i alifatycznych
Komórki bakterii są w naturze powszechnie wystawione na różne związki aromatyczne i alifatyczne. Związki aromatyczne są cząsteczkami organicznymi posiadającymi pierścień cykliczny, podczas gdy związki alifatyczne są cząsteczkami organicznymi o strukturze otwartego łańcucha a nie pierścieniowej. Takie związki mogą powstawać jako produkty uboczne procesów przemysłowych (np. benzen lub toluen) lecz mogą również być wytwarzane przez określone mikroorganizmy (np. alkohole). Wiele z tych związków jest toksycznych dla komórek, szczególnie związki aromatyczne, które są wysoce reaktywne dzięki wysokiej energii układu pierścieniowego. Co za tym idzie, pewne bakterie wykształciły mechanizmy, dzięki którym są zdolne do modyfikacji lub degradacji tych związków, tak że nie są one dłużej niebezpieczne dla komórki. W komórkach mogą znajdować się enzymy, które są zdolne do, przykładowo, hydroksylacji, izomeryzacji lub metylowania związków aromatycznych lub alifatycznych tak, że stają się one albo mniej toksyczne lub tak, że zmodyfikowana postać może podlegać obróbce przez typowe komórkowe szlaki usuwania odpadów i degradacji. Komórki mogą również posiadać enzymy, które są zdolne do specyficznej degradacji jednej lub większej liczby potencjalnie
PL 195 942 B1 niebezpiecznych substancji, a co za tym idzie ochrony komórki. Zasady i przykłady tego typów modyfikacji i procesów degradacji w bakteriach są opisane w kilku publikacjach np. H. Sahm (1999) „Procaryotes in Industrial Producion” w Lengeler, J.W. i wsp., wyd., Biology of me Procaryotes, Thieme Verlag: Stuttgart i Schlegel, H.G. (1992) Algemeine Mikrobiologie, Thieme: Sztutgart).
Poza prostą inaktywacją niebezpiecznych aromatycznych lub alifatycznych związków, wiele bakterii rozwinęło zdolność do wykorzystywania takich związków jako źródeł węgla dla podtrzymania metabolizmu, gdy korzystne dla komórki, źródło węgla jest niedostępne. Przykładowo, znane są szczepy Pseudomonas mogące wykorzystywać jako źródło węgla toluen, benzen i 1,10-dichlorodekan (Chang,
B.V. i wsp. (1997) Chemosphere 35(12): 2807-2815; Wischnak, C. i wsp., (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64(9): 3507-3511; Churchill, S.A. i wsp., (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65(2): 549-552). Istnieją podobne przykłady dla wielu innych gatunków bakterii, które są znane w stanie techniki.
Zaczęto wykorzystywać zdolność określonych bakterii do modyfikowania lub degradacji związków aromatycznych i alifatycznych. Ropa naftowa jest złożoną mieszaniną substancji chemicznych, które obejmują cząsteczki alifatyczne i aromatyczne. Stosując bakterie posiadające zdolność do degradacji lub modyfikacji tych toksycznych związków, przykładowo w przypadku rozlanego oleju, można wyeliminować większość zniszczeń środowiska z dużą wydajnością i przy niskim koszcie (patrz przykładowo Smith, M.R. (1990) „The biodegradation of aromatic hydrocarbons by bacteria” Biodegradation 1(2-3): 191-206; i Suyam, T i wsp., (1998) „Bacterial isolates degrading aliphatic polycarbonates” FEMS Microbiol. Lett. 161(2): 255-261).
B. Metabolizm związków nieorganicznych
Komórki (np. komórki bakterii) zawierają ogromne ilości różnych cząsteczek, takich jak woda, jony nieorganiczne i substancje organiczne (np. białka, cukry i inne makrocząsteczki). Ogromna masa typowej komórki zawiera jedynie cztery rodzaje atomów: węgiel, tlen, wodór i azot. Choć stanowią one procentowo niewielką część komórki, substancje nieorganiczne są równie ważne dla prawidłowego funkcjonowania komórki. Cząsteczki takie obejmują fosfor, siarkę, wapń, magnez, żelazo, cynk, mangan, miedź, molibden, wolfram i kobalt. Wiele z tych związków jest krytycznych dla tworzenia ważnych cząsteczek, takich jak nukleotydy (fosfor) i aminokwasy (azot i siarka). Inne z tych jonów nieorganicznych służą jako kofaktory w reakcjach enzymatycznych lub wspomagają ciśnienie osmotyczne. Wszystkie takie cząsteczki muszą być pobrane przez bakterie z otaczającego środowiska.
Pożądane jest aby każdy z tych związków nieorganicznych bakteria mogła pobrać w postaci najłatwiejszej do wykorzystania przez typowe mechanizmy metaboliczne komórki. Jednak, bakteria może przeciwstawić się środowiskom, w których te korzystne postaci nie są łatwo dostępne. Dla przeżycia w takich warunkach ważne jest, aby bakteria posiadała dodatkowe mechanizmy biochemiczne zdolne do przekształcenia mniej metabolicznie aktywnych, lecz łatwo dostępnych postaci tych związków nieorganicznych do postaci, które mogą być użyte w metabolizmie komórkowym. Bakteria często posiada szereg genów kodujących realizujące ten cel enzymy, które nie ulegają ekspresji, jeśli pożądany rodzaj związku nieorganicznego nie jest dostępny. Co za tym idzie geny te dla metabolizmu różnych związków nieorganicznych służą jako kolejne narzędzie, którego bakteria może użyć dla adaptacji w suboptymalnych warunkach środowiskowych .
Po węglu, najważniejszym składnikiem komórki jest azot. Typowa komórka bakteryjna zawiera 12-15% azotu. Jest on składnikiem aminokwasów i nukleotydów, jak również wielu innych, ważnych, występujących w komórce cząsteczek. Ponadto, azot może służyć jako substytut tlenu, jako końcowy akceptor elektronu w metabolizmie energii. Dobre źródła azotu obejmują wiele związków organicznych i nieorganicznych, takich jak gazowy amoniak lub sole amonowe (np. NH4Cl, (NH4)2SO4 lub NH4OH), azotany, mocznik, aminokwasy lub złożone źródła azotu jak syrop kukurydziany, mąka sojowa, białko z soi, ekstrakt z drożdży, ekstrakt z mięsa, itp. Azot z amoniaku jest przyswajany przez działanie szczególnych enzymów: dehydrogenazy glutaminianowej, syntazy glutaminianowej i aminotransferazy glutamino-2-oksyglutarowej. Przeniesienie amino-azot z jednej cząsteczki organicznej na inną jest wykonane przez aminotransferazy, klasę enzymów, przenoszących jedną grupę aminową z alfa-aminokwasu na alfa-ketokwas. Azotan może być redukowany przez reduktazę azotanową, reduktazę azotynową i dalej enzymy redoks, aż do ich przekształcenia w cząsteczkę azotu lub amoniaku, która może być łatwo wykorzystana przez komórkę w typowych szlakach metabolicznych.
Fosfor typowo znajduje się wewnątrz komórki zarówno w postaci organicznej jak i nieorganicznej i może być pobrany przez komórkę również w którejś z tych postaci, aczkolwiek większość mikroorganizmów preferencyjnie pobiera nieorganiczny fosforan. Przekształcenie organicznego fosforanu do postaci, którą może wykorzystać komórka, wymaga działania fosfataz (np. fitaz, które hydrolizują
PL 195 942 B1 fosforan dając fitan i pochodne inozytolu). Fosforan jest kluczowym elementem w syntezie kwasów nukleinowych i również pełni znaczącą rolę w komórkowym metabolizmie energii (np. w syntezie ATP, ADP i AMP).
Siarka jest wymagana dla syntezy aminokwasów (np. metioniny i cysteiny), witamin (np. tiaminy, biotyny i kwasu lipoidowego) i białek żelazowo-siarkowych. Bakterie uzyskują siarkę głównie z nieorganicznych siarczanów, chociaż powszechnie wykorzystywane są również: tiosiarczany, siarczyny i siarczki. W warunkach, w których związki te nie są łatwo dostępne, wiele bakterii wyraża geny umożliwiające wykorzystanie związków sulfonianowych takich jak 2-aminosulfonian (tauryna) (Kertesz, M. A. (1993) „Proteins Induced by Sulphate Limitation in Escherichia coli, Pseudomonas putida or Staphylococcus aureus” J. Bacteriol. 175:1187-1190).
Inne atomy nieorganiczne np. metalu lub jony wapnia są również krytyczne dla żywotności komórek. Przykładowo, żelazo odgrywa kluczową rolę w reakcjach redoks i jest kofaktorem białek żelazowo-siarkowych, białek hemu i cytochromów. Pobranie żelaza przez komórki bakterii może być spowodowane działaniem syderoforów, czynników chelatujących wiążących zewnątrzkomórkowe jony żelaza i przenoszących je do wnętrza komórki. Dla opisu metabolizmu żelaza i innych związków nieorganicznych patrz: Langeler i wsp., (1999) Biology of Prokaryotes, Thieme Verlag: Studgart; Neidhardt, F.C. i wsp., wyd. Escherichia coli and Salmonella. ASM Press: Waszyngton D.C.; Sonenshein, A. L. i wsp., wyd. (1999) Bacillus subtilis and other Gram-positive Bacteria, ASM Press: Waszyngton
D.C. Voed, D. i Voed J.G. (1992) Biochemie, VCH: Weinheim; Brock, T.D. i Madigan, M.T. (1991) Biology of Microorganisms Prentice Hall: Englewood Cliffs, str. 267-269; Rhodes, P.M. i Stanbury, P.F. Applied Microbial Physiology -A Practicał Approach, Oxford Univ. Press: Oxford.
C. Enzymy i proteoliza
Wewnątrzkomórkowe warunki, do których bakteria, taka jak C.glutamicum, jest optymalnie przystosowana, często nie są tymi warunkami, w których wiele reakcji biochemicznych zachodziłoby normalnie. Aby umożliwić przebieg takich reakcji w warunkach fizjologicznych komórki wykorzystują enzymy. Enzymy są białkowymi katalizatorami biologicznymi orientującymi przestrzennie reagujące cząsteczki lub dostarczającymi specyficznego środowiska, tak że bariera energetyczna dla reakcji biochemicznej jest obniżona. Różne enzymy katalizuj ą różne reakcje i każdy enzym może być podmiotem transkrypcyjnej, translacyjnej lub posttranslacyjnej regulacji tak, że reakcja będzie zachodziła jedynie w odpowiednich warunkach i określonym czasie. Enzymy mogą uczestniczyć w degradacji (np. proteazy), syntezie (np. syntazy) lub modyfikacji (np. transferazy lub izomerazy) związków i wszystkie te enzymy umożliwiają wytwarzanie w komórce niezbędnych związków. To z kolei zapewnia zachowanie homeostazy komórki.
Jednak, fakt że enzymy działają optymalnie w warunkach fizjologicznych, w których bakteria jest najbardziej żywotna, oznacza, że gdy warunki środowiskowe ulegną zaburzeniu, istnieje istotna możliwość, że aktywność enzymu również ulegnie zaburzeniu. Przykładowo, zmiany temperatury mogą powodować nieprawidłowe składanie się białek, i to samo dotyczy również zmian pH. Składanie białka w znacznym stopniu zależy od elektrostatycznych i hydrofobowych oddziaływań aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym tak, że jakakolwiek zmiana ładunków pojedynczych aminokwasów (która może powstać przez zmianę komórkowego pH) może mieć zaburzający wpływ na zdolność białka do poprawnego składania się. Zmiany temperatury skutecznie zmieniają ilość energii kinetycznej posiadanej przez cząsteczkę polipeptydu, która wpływa na zdolność polipeptydu do przyjmowania poprawnej postaci, konfiguracji energetycznie stabilnej. Źle złożone białka mogą być szkodliwe dla komórki z dwóch powodów. Po pierwsze, źle złożone białko może mieć podobnie zaburzoną aktywność lub nie posiadać aktywności. Po drugie, źle złożone białka mogą być pozbawione obszarów konformacyjnych niezbędnych dla prawidłowej regulacji przez inne systemy komórkowe i co za tym idzie mogą być aktywne w sposób niekontrolowany.
Komórka posiada mechanizm, dzięki któremu źle złożone enzymy i białka regulatorowe mogą być szybko zniszczone przez proteolizę, zanim dojdzie do jakiegokolwiek uszkodzenia komórki. Białka takie jak te z rodziny la/lon i należące do rodziny Clp rozpoznają specyficznie i niszczą źle złożone białka (patrz np. Sherman, M.Y., Goldberg, A.L. (1999) AXS 77: 57-78 i zawarte w niej cytowania i Porankiewicz J. (1999) Molec. Microbiol. 32(3): 449-58 i zawarte w niej cytowania, Neidhardt, F.C., i wsp., (1996) E. coli and Salmonella, ASM Press: Waszyngton, D.C. i zawarte w niej cytowania i Pri-tchard, G.G. i Coolbear, T. (1993) FEMS Microbiol. Rev. 12(1-3): 179-206 i zawarte w niej cytowania). Enzymy te wiążą się ze źle złożonymi lub nie złożonymi białkami i degradują je zależnie od ATP. Co za tym idzie, proteoliza służy jako ważny mechanizm wykorzystywany przez komórkę dla
PL 195 942 B1 zapobieżenia zniszczeniu normalnych funkcji komórkowych w wyniku zmian środowiskowych, a ponadto pozwoli komórkom przeżyć w warunkach i środowiskach, które inaczej byłyby toksyczne z powodu błędnej regulacji i/lub zaburzonej aktywności lub regulacji enzymu.
Proteoliza posiada również istotne funkcje w komórce w optymalnych warunkach środowiskowych. W normalnych procesach metabolicznych proteazy uczestniczą w hydrolizie wiązań peptydowych, w katabolizmie złożonych cząsteczek w celu dostarczenia niezbędnych produktów degradacji, i w modyfikacji białka. Wydzielane proteazy odgrywają ważną rolę w katabolizmie zewnątrzkomórkowych substancji odżywczych, nawet przed wniknięciem tych związków do komórki. Ponadto, sama aktywność proteolityczna może pełnić funkcje regulatorowe; sporulacja u B. subtilis i przechodzenie do kolejnych etapów cyklu komórkowego u Caulobacter spp., o których wiadomo, że są regulowane przez kluczowe przypadki proteolizy zachodzące u każdego z tych gatunków (Gottesman, S. (1999) Curr. Opin. Microbiol. 2(2): 142-147). Tak więc procesy proteolizy są kluczowe dla przeżycia komórki zarówno w suboptymalnych jak i optymalnych warunkach środowiskowych i uczestniczą w utrzymaniu homeostazy komórek.
D. Wytwarzanie ściany komórkowej i przebudowy
Podczas gdy biochemiczna maszyneria komórki może być zdolna do szybkiej adaptacji do różnych i przypuszczalnie niekorzystnych środowisk, komórki nadał wymagają ogólnego mechanizmu, dzięki któremu mogą być chronione przed środowiskiem. Dla wielu bakterii ściana komórki zapewnia taką ochronę i pełni również rolę w adhezji, wzroście komórki i podziale i transporcie pożądanego, rozpuszczalnego i odpadowego materiału.
Dla funkcjonowania komórki wymagają wewnątrzkomórkowych stężeń metabolitów i innych cząsteczek, które są znacząco wyższe niż występujące w otaczającej pożywce. Ponieważ metabolity te są w znacznym stopniu chronione przed opuszczeniem komórki dzięki obecności hydrofobowej błony, system wykazuje skłonność do przepuszczania do komórki ze środowiska zewnętrznego cząsteczek rozpuszczonych w wodzie tak, że wewnętrzne stężenia rozpuszczonych cząsteczek odpowiadają stężeniom na zewnątrz. Rozpuszczone w wodzie cząsteczki są zdolne do łatwego przekraczania błony komórkowej i błona ta nie jest w stanie zapobiec ich wypływaniu i ciśnieniu, które może doprowadzić do osmotycznej lizy komórki. Sztywność ściany komórkowej w znacznym stopniu zwiększa zdolność komórki do tolerowania tych ciśnień i stanowi dodatkową barierę dla niepożądanej dyfuzji tych metabolitów i pożądanych, rozpuszczonych substancji z komórki. Podobnie ściana komórkowa służy zapobieganiu wnikaniu do komórki niepożądanego materiału.
Ściana komórkowa uczestniczy również w wielu innych procesach komórkowych takich jak adhezja, wzrost komórki i podział. Dzięki temu, że ściana komórkowa całkowicie otacza komórkę, jakiekolwiek oddziaływanie komórki z otoczeniem musi zachodzić za pośrednictwem ściany komórkowej. Zatem ściana komórki musi uczestniczyć w jakimkolwiek przyleganiu komórki do innej komórki i do pożądanych powierzchni. Ponadto, komórka nie może rosnąć lub dzielić się bez towarzyszących temu zmian w ścianie komórkowej. Ponieważ ochrona, którą zapewnia ściana, wymaga jej obecności podczas wzrostu, morfogenezy i namnażania się, to jednym z kluczowych etapów w podziale komórki jest synteza ściany komórkowej tak, że nowa komórka oddziela się od starej. Tak więc często biosynteza ściany komórkowej jest regulowana równocześnie ze wzrostem komórki i podziałem komórki (patrz np. Sonenshein, A.L. i wsp., wyd. (1993) Bacillus subtilis and Other Gram-positive Bacteria, ASM: Waszyngton D.C.).
Struktura ściany komórkowej jest inna u bakterii gram dodatnich i gram ujemnych. Jednak, w obu typach funkcjonalna jednostka strukturalna ściany pozostaje taka sama: zachodząca na siebie siatka dwóch polisacharydów, N-acetyloglukozaminy (NAG) i kwasu N-acetylomuraminowego (NAM), które są usieciowane przez aminokwasy (najczęściej L-alaninę, D-glutaminian, kwas diaminopimelinowy i D-alaninę), nazwane „peptydo-glikanem”. Znane są procesy uczestniczące w syntezie ściany komórkowej (patrz np. Michał, G., wyd. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley: Nowy Jork).
U gram ujemnych bakterii wewnętrzna błona komórkowa jest opłaszczona przez pojedynczą warstwę peptydoglikanu (o grubości około 10 nM) określonej jako otoczka mureinowa. Ta struktura peptydoglikanu jest bardzo twarda i jej postać określa kształt organizmu. Zewnętrzna powierzchnia otoczki mureinowej jest pokryta zewnętrzną błoną zawierającą poryny i inne białka błonowe, fosfolipidy i lipopolisacharydy. Dla utrzymania ścisłego związku z błoną zewnętrzną ściana komórkowa bakterii gram ujemnej posiada również rozrzucone cząsteczki lipidów służące do zakotwiczenia jej w otaczającej błonie.
PL 195 942 B1
U bakterii gram dodatniej, takiej jak Corynebacterium glutamicum, błona cytoplazmatyczna jest pokryta wielowarstwowym peptydoglikanem o grubości w zakresie 20 -80 nm (patrz np. Legeler i wsp. (1999) Biology of Procaryotes, Thieme Verlag: Stutgart, str. 913-918, str. 875-899 i str. 88-109 i zawarte w niej cytowania). Ściana komórkowa bakterii gram dodatnich zawiera również kwas teichoinowy, polimer glicerolu lub rybitolu związanych za pośrednictwem grup fosforanowych. Kwas teichoinowy jest również zdolny do wiązania się z aminokwasami i tworzy wiązania kowalencyjne z kwasem muraminowym. W ścianie komórkowej mogą występować również kwasy lipoteichoinowe i teichuronowe. Jeśli występują te kwasy, struktury powierzchni komórkowej, takie jak wici lub kapsułki, będą również zakotwiczone w tej warstwie.
III. Elementy i sposoby według wynalazku
Obecny wynalazek opiera się, przynajmniej częściowo, na odkryciu nowych cząsteczek określonych tu jako kwas nukleinowy HA i cząsteczek białka, które uczestniczą w utrzymaniu homeostazy w C.glutamicum, lub które realizują funkcje związane z adaptacją mikroorganizmów do różnych warunków środowiskowych. W pewnej postaci cząsteczki HA uczestniczą w biosyntezie ściany komórkowej C.glutamicum lub w przebudowach, w metabolizmie związków nieorganicznych, w modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych, lub posiadają aktywność enzymatyczną lub proteolityczną. W korzystnej postaci aktywność cząsteczek HA według obecnego wynalazku dotyczy biosyntezy ściany komórkowej C.glutamicum lub przebudowy, metabolizmu związków nieorganicznych, modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych lub aktywność enzymatyczna lub proteolityczna ma wpływ na wytwarzanie przez ten organizm pożądanych wysoko wartościowych związków chemicznych. W szczególnie korzystnej postaci, cząsteczki HA według wynalazku mają aktywność modulującą, tak, że procesy komórkowe C.glutamicum w których uczestniczą cząsteczki HA (np. biosynteza lub przebudowy ściany komórkowej C.glutamicum, metabolizm związków nieorganicznych, modyfikacja lub degradacja związków aromatycznych lub alifatycznych lub aktywność enzymatyczna lub proteolityczna) mają również zmienioną aktywność, powodując zarówno bezpośrednio lub pośrednio modulację wydajności, produkcji i/lub efektywności produkcji pożądanego wysokowartościowego związku chemicznego w C.glutamicum.
Określenie „białko HA” lub „polipeptyd HA” obejmuje białka uczestniczące w wielu procesach komórkowych związanych z homeostazą C.glutamicum lub zdolnością komórek C.glutamicum do przystosowania się do niekorzystnych warunków środowiskowych. Przykładowo białko HA może uczestniczyć w biosyntezie lub przebudowie ściany komórkowej C.glutamicum, metabolizmie związków nieorganicznych w C.glutamicum, w modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych w C.glutamicum, lub może posiadać enzymatyczną lub proteolityczną aktywność C.glutamicum. Przykłady białek HA obejmują białka kodowane przez geny HA podane w Tablicy 1 i w Id. Sekw. Nr o numerach nieparzystych.
Pojęcia „gen HA” lub „sekwencja kwasu nukleinowego HA” obejmują sekwencje kwasów nukleinowych kodujące białko HA, składające się z regionu kodującego oraz położonych w kierunku 5' i 3' od niego regionów nie podlegających translacji. W Tablicy1zestawiono przykłady genów HA. Pojęcia „produkcja” czy „produktywność” są znane wnauce i dotyczą stężenia produktu fermentacji (na przykład pożądanego związku wysokowartościowego) wytworzonego w danym czasie i danej objętości fermentacyjnej (np. kg produktu na godzinę na litr). Pojęcie „efektywności produkcji” dotyczy czasu koniecznego do osiągnięcia danego poziomu produkcji (na przykład, jak dużo czasu zajmuje komórce osiągnięcie danego tempa produkcji związku wysokowartościowego). Pojęcie „wydajności” lub „wydajności produkt/węgiel” jest w znane w nauce i dotyczy efektywności przekształcania substratu (źródło węgla) w produkt (tj. związek wysokowartościowy). Zapisywane jest to ogólnie jako, na przykład, kilogram produktu na kilogram źródła węgla. Poprzez zwiększanie wydajności lub produkcji związku, zwiększa się liczba uzyskiwanych cząsteczek czy też uzyskiwanych przydatnych cząsteczek tego związku w hodowli o danej wielkości na dany czas. Określenia „biosynteza” lub „szlak biosyntezy” są znane w nauce i obejmują przebiegającą w komórce syntezę związków, w szczególności związków organicznych, ze związków pośrednich, w ściśle regulowanym i wieloetapowym procesie. Określenie „degradacja” lub „szlak degradacji” są znane w nauce i obejmują przebiegający w komórce rozkład związków, w szczególności związków organicznych, do produktów ich degradacji (czyli ogólnie rzecz biorąc, mniejszych lub mniej złożonych cząsteczek) w ściśle regulowanym i wieloetapowym procesie. Termin „metabolizm” jest znany w nauce i obejmuje całokształt biochemicznych reakcji zachodzących w organizmie. Zatem na metabolizm danego związku (np. metabolizm aminokwasu takiego jak glicyna) składa się całość biosyntezy, modyfikacji i degradacji tego związku w komórce. Określenie
PL 195 942 B1 „homeostaza” obejmuje wszystkie mechanizmy wykorzystywane przez komórkę w celu utrzymania stałego środowiska wewnątrzkomórkowego mimo niekorzystnych warunków zewnątrzkomórkowych. Nie ograniczającym przykładem takich procesów jest wykorzystanie ściany komórkowej dla zapobiegania lizie osmotycznej spowodowanej wysokimi stężeniami rozpuszczalnych substancji wewnątrzkomórkowych. Termin „adaptacja” lub „adaptacja do warunków środowiskowych” jest znany w nauce i obejmuje mechanizmy wykorzystywane przez komórkę dla zachowania zdolności komórki do przeżycia w niesprzyjających warunkach środowiskowych (ogólnie mówiąc takich warunkach środowiskowych, w których nie występuje ani jedna ani więcej korzystnych substancji odżywczych, lub takich warunkach środowiskowych, w których temperatura, pH, osmolarność, procentowa zawartość tlenu i im podobne, odbiegają od optymalnych warunków życia komórki). Wiele komórek, w tym komórki
C.glutamicum, posiada geny kodujące białka, które są wyrażane w takich warunkach środowiskowych i które umożliwiają dalszy wzrost w takich suboptymalnych warunkach.
W kolejnej postaci cząsteczki HA według wynalazku są zdolne do modulowania produkcji pożądanej cząsteczki takiej jak wysokowartościowy związek chemiczny w mikroorganizmie, takim jak C.glutamicum. Istnieje szereg mechanizmów, dzięki którym zmiana białka HA według wynalazku może bezpośrednio wpływać na wydajność, produkcję i/lub efektywność produkcji wysokowartościowych związków chemicznych w szczepie C.glutamicum zawierającym takie zmienione białko. Przykładowo, przez przebudowę enzymów modyfikujących lub degradujących związki aromatyczne lub alifatyczne, polegającą na zwiększeniu lub zmniejszeniu aktywności lub ilości enzymów będzie możliwe modulowanie produkcji jednego lub więcej wysokowartościowych związków chemicznych będących produktami modyfikacji lub degradacji tych związków. Podobnie, enzymy uczestniczące w metabolizmie związków nieorganicznych dostarczają kluczowych cząsteczek (np. fosforu, siarki lub cząsteczek azotu) dla biosyntezy takich wysokowartościowych związków chemicznych jak aminokwasy, witaminy i kwasy nukleinowe. Przez zmianę aktywności lub ilości tych enzymów w C.glutamicum będzie możliwe zwiększenie konwersji tych związków nieorganicznych (lub użycie alternatywnych związków nieorganicznych), co pozwala na zwiększenie poziomu wbudowywania związków nieorganicznych do tych wysokowartościowych związków chemicznych. Przebudowa genetyczna enzymów C.glutamicum biorących na ogół udział w procesach komórkowych może również zwiększać produkcję wysokowartościowych związków chemicznych, bowiem wiele takich enzymów bezpośrednio modyfikuje wysokowartościowe związki chemiczne (np. aminokwasy) lub enzymy uczestniczące w syntezie lub sekrecji tych związków. Modulacja aktywności lub liczby proteaz komórkowych może również mieć bezpośredni wpływ na produkcję wysokowartościowych związków chemicznych, bowiem wiele proteaz może degradować te związki lub enzymy uczestniczące w wytwarzaniu lub degradacji związków.
Ponadto wyżej wspomniane enzymy uczestniczące w modyfikacji lub degradacji związku aromatycznego/alifatycznego w biokatalizie, w metabolizmie związku nieorganicznego lub proteolizie, same w sobie są cennymi związkami chemicznymi pożądanymi z uwagi na ich aktywność w różnych, przemysłowych zastosowaniach in vitro. Przez zmianę, liczby kopii genu dla jednego lub większej liczby takich enzymów w C.glutamicum możliwe będzie zwiększenie ilości tych białek wytwarzanych przez komórkę, co za tym idzie zwiększenie potencjalnej wydajności lub efektywności produkcji tych białek w hodowlach C.glutamicum lub pokrewnych bakterii w wielkiej skali.
Zmiana białka HA według wynalazku może również bezpośrednio wpłynąć na wydajność, produkcję i/lub efektywność produkcji wysokowartościowych związków chemicznych w szczepie C.glutamicum, który zawiera tak zmienione białko. Przykładowo, przez modulowanie aktywności i/lub liczby tych białek uczestniczących w konstruowaniu lub przebudowie ściany komórkowej możliwa będzie modyfikacja struktury samej ściany komórkowej tak, że komórka będzie zdolna do lepszego przetrzymania mechanicznego lub innych wstrząsów występujących podczas fermentacji w wielkiej skali. Również, hodowla C.glutamicum w wielkiej skali wymaga znacznego wytwarzania ściany komórkowej. Modulacja aktywności lub ilości enzymów dla biosyntezy lub degradacji ściany komórkowej może zwiększyć szybkość biosyntezy ściany komórkowej, co z kolei może umożliwić szybszy wzrost tych mikroorganizmów w hodowli i co za tym idzie większą liczbę komórek wytwarzających żądany wysoko wartościowy związek chemiczny.
Modyfikując enzymy HA według wynalazku można również pośrednio wpływać na wydajność, produkcję lub efektywność produkcji jednego lub więcej wysokowartościowych związków chemicznych w C.glutamicum. Przykładowo, wiele enzymów w C.glutamicummoże mieć znaczący wpływ na ogólne procesy komórkowe (np. procesy regulujące), co z kolei ma znaczący wpływ na metabolizm wysokowartościowych związków chemicznych. Podobnie, proteazy, enzymy, które modyfikują lub degradują
PL 195 942 B1 potencjalnie toksyczne związki aromatyczne lub alifatyczne i enzymy promujące metabolizm związków nieorganicznych, uczestniczą w zwiększeniu żywotności C.glutamicum. Proteazy pomagają w selektywnym usuwaniu źle złożonych lub źle regulowanych białek, takich jak te, które mogą wystąpić przy stosunkowo wstrząsowych warunkach środowiskowych podczas fermentacji w wielkiej skali. Zmieniając te białka można będzie dalej zwiększyć tę aktywność i poprawić żywotność C.glutamicum w hodowli. Modyfikacja związku aromatycznego/alifatycznego lub degradacja białek służy nie tylko do detoksyfikacji tych związków odpadowych (które mogą być traktowane jako zanieczyszczenia w pożywce hodowlanej lub jako produkty odpadowe samych komórek) lecz również umożliwia wykorzystywanie przez komórki alternatywnych źródeł węgla, jeśli optymalne źródło węgla występuje w hodowli w ilościach ograniczonych. Zwiększając ich ilość i/lub aktywność, można zwiększyć przeżywalność komórek C.glutamicum w hodowli. Białka według wynalazku związane z metabolizmem związków nieorganicznych zaopatrują komórkę w cząsteczki nieorganiczne wymagane dla syntezy wszystkich białek i nukleotydów (między innymi) i co za tym idzie są krytyczne dla ogólnej żywotności komórki. Zwiększona ilość żywotnych komórek wytwarzających jeden lub więcej pożądanych wysokowartościowych związków chemicznych w hodowli w wielkiej skali, powinna równocześnie spowodować zwiększenie wydajności, produkcji i/lub efektywności produkcji wysokowartościowych związków chemicznych w hodowli.
Wyizolowane sekwencje kwasu nukleinowego według wynalazku zawarte są w genomie szczepu Corynobacterium glutamicum, dostępnego w American Type Culture Collection, oznaczonego jako ATCC 13032. Sekwencje nukleotydowe izolowanych DNA dla HA C.glutamicum oraz domniemane sekwencje aminokwasowe białek HA C.glutamicum przedstawione są na Liście Sekwencji, jako odpowiednio - SEKW. Nr ID. o numeracji nieparzystej oraz SEKW. Nr ID. o numeracji parzystej.
Przeprowadzono analizy obliczeniowe, które pozwoliły sklasyfikować i/lub zidentyfikować wspomniane sekwencje nukleotydowe, jako sekwencje kodujące białka, które uczestniczą w biosyntezie lub przebudowie ściany komórkowej C.glutamicum, w metabolizmie związków nieorganicznych, modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych lub które mają enzymatyczną lub proteolityczną aktywność C.glutamicum.
Niniejszy wynalazek dotyczy także białek posiadających sekwencję aminokwasową zasadniczo homologiczną do sekwencji aminokwasowych według wynalazku. Przyjęto, że białko, którego sekwencja aminokwasową jest zasadniczo homologiczna do wybranej sekwencji aminokwasowej, musi być przynajmniej homologiczne w 50% do wybranej sekwencji aminokwasowej, np. do całkowitej wybranej sekwencji aminokwasowej. Białko posiadające sekwencję aminokwasową zasadniczo homologiczną do wybranej sekwencji aminokwasowej, może posiadać sekwencję do niej homologiczną także co najmniej w około 50%, korzystnie co najmniej w około 60-70%, korzystniej co najmniej w około 70-80%, 80-90% lub 80-95%, zaś najkorzystniej co najmniej w około 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologiczną.
Białko HA lub aktywna biologicznie jego część lub fragment według wynalazku mogą brać udział w transporcie do wnętrza C.glutamicum wysokoenergetycznych cząsteczek węglowych takich, jak glukoza, bądź też uczestniczyć w wewnątrzkomórkowym przekaźnictwie sygnału u tego mikroorganizmu czy wreszcie, posiadać jedną lub więcej funkcji zestawionych w Tablicy 1.
Rozmaite aspekty wynalazku opisano dalej szczegółowo w następujących podsekcjach:
A. Izolowane cząsteczki kwasu nukleinowego
Jeden z aspektów wynalazku dotyczy izolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących polipeptydy HA lub jego biologicznie aktywne części, jak również fragmentów kwasu nukleinowego wystarczających do zastosowania w charakterze sond do hybrydyzacji czy też starterów do identyfikacji lub amplifikacji kwasu nukleinowego kodującego HA (np. DNA dla HA). Przyjęto, że pojęcie „cząsteczka kwasu nukleinowego” ma obejmować cząsteczki DNA (np. cDNA lub DNA genomowe) i RNA (np. mRNA), a także analogiczne DNA lub RNA utworzone za pomocą analogów nukleotydowych.
Pojęcie to dotyczy również nie podlegających translacji sekwencji umiejscowionych zarówno na końcu
3' jak i 5' regionu kodującego genu: co najmniej około 100 nukleotydów sekwencji położonej w kierunku 5' rejonu kodującego i co najmniej około 20 nukleotydów sekwencji położonej w kierunku 3' rejonu kodującego genu. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jedno- lub dwuniciowa, lecz korzystna jest forma dwuniciowa. „Wyizolowana” cząsteczka kwasu nukleinowego to taka cząsteczka, która została oddzielona od innych cząsteczek kwasu nukleinowego obecnych w miejscu stanowiącym naturalne źródło kwasu nukleinowego. „Wyizolowana” cząsteczka kwasu nukleinowego w korzystnej formie nie zawiera sekwencji naturalnie flankujących ją w genomowym DNA organizmu, z którego
PL 195 942 B1 została uzyskana (tj. sekwencji położonych na końcach 5' i 3' kwasu nukleinowego). Na przykład w rozmaitych postaciach, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego HA może zawierać mniej niż około 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0,5kb lub 0,1kb sekwencji nukleinowych naturalnie flankujących cząsteczkę kwasu nukleinowego w genomowym DNA komórki, z której ten kwas nukleinowy uzyskano (np. komórki C.glutamicum). Co więcej, jeśli „wyizolowana” cząsteczka kwasu nukleinowego, taka jak cząsteczka DNA, została uzyskana za pomocą technik rekombinacji, może być w znacznym stopniu pozbawiona pozostałego materiału komórkowego lub pożywki hodowlanej, a w przypadku syntezy chemicznej - chemicznych prekursorów lub innychzwiązków chemicznych.
Cząsteczkę kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, np. cząsteczkę kwasu nukleinowego posiadającą sekwencję nukleotydową o nieparzystym numerze na Liście Sekwencji lub jej fragment, można wyizolować za pomocą standardowych technik biologii molekularnej oraz zawartej tu informacji o sekwencji. Na przykład, DNA dla HA C.glutamicum można wyizolować z biblioteki C.glutamicum przy użyciu całości lub części jednej z sekwencji o nieparzystym numerze SEKW. Nr ID. na Liście Sekwencji stanowiącej sondę do hybrydyzacji, a także standardowych technik hybrydyzacji (np. jak opisane w Sambrook, J., Fritsh, E.F., i Maniatis,T. Molecular Cloning: A Labolatory Manual. 2nd. Ed., Cold Spring Harbor Labolatory, Cold Sprong Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca całość lub część jednej z sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku może zostać wyizolowana przy zastosowaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z użyciem starterów oligonukleotydowych zaprojektowanych na podstawie tej sekwencji (np. cząteczki kwasu nukleinowego zawierającej całość lub część jednej z sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku może być wyizolowana przy zastosowaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z użyciem starterów zaprojektowanych na podstawie tej samej sekwencji). Na przykład, mRNA może zostać wyizolowany z normalnych komórek śródbłonka (np. z zastosowaniem procedury ekstrakcji tiocyjanianem guanidyny według Chirwing i wsp. (1979) Biochemistry18:5294-5299), zaś DNA można uzyskać za pomocą odwrotnej transkryptazy (np. Moloney odwrotna transkryptaza MLV dostępna w Gibco/BRL, Bethesda, MD; lub odwrotna transkryptaza AMV dostępna w Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Syntetyczne startery oligonukleotydowe do amplifikacji metodą łańcuchowej reakcji polimerazy mogą być zaprojektowane na podstawie jednej z sekwencji nukleotydowych przedstawionych na Liście Sekwencji. Kwas nukleinowy według wynalazku może zostać zamplifikowany za pomocą cDNA lub wymiennie, genomowego DNA, jako matrycy oraz odpowiednich starterów oligonukleotydowych, zgodnie ze standardowymi technikami amplifikacji PCR. Tak powielony kwas nukleinowy może zostać wklonowany do odpowiedniego wektora i scharakteryzowany poprzez analizę sekwencji. Ponadto oligonukleotydy odpowiadające sekwencji nkleotydowej HA mogą być uzyskane przy zastosowaniu standardowych technik syntezy np. przy użyciu automatycznego syntezatora DNA.
W korzystnej postaci, wyizolowana cząteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera jedną z sekwencji nukleotydowych przedstawionych na Liście Sekwencji. Sekwencje kwasów nukleinowych według wynalazku, jak zostało to przedstawione na Liście Sekwencji, odpowiadają cząsteczkom DNA dla HA Corynobacterium glutamicum według wynalazku. Powyższe DNA zawiera sekwencje kodujące białka HA (tj. „region kodujący” wskazany w każdej nieparzyście numerowanej sekwencji SEKW. Nr ID.: na Liście Sekwencji), jak również niepodlegające translacji sekwencje 5' i 3' wskazane w każdej nieparzystej SEKW. Nr ID.: na Liście Sekwencji. Alternatywnie, cząsteczka kwasu nuleinowego może także zawierać wyłącznie kodujący rejon którejkolwiek z sekwencji kwasów nukleinowych umieszczonych na Liście Sekwencji.
Dla celów niniejszego zgłoszenia stosownym wydaje się, że każda z sekwencji kwasów nukleinowych lub aminokwasów zestawiona na Liście Sekwencji posiada numer identyfikacyjny RXA, RXN, RXS lub RXC oznaczony jako „RXA”, „RXN”, „RXS” lub „RXC”, po którym następuje 5 cyfr (tj. RXA02458, RXN00249, RXS00153 lub RXC00963). Każda z sekwencji kwasu nukleinowego składa się z co najwyżej trzech części: rejonu położonego powyżej końca 5' rejonu kodującego, rejonu kodującego i rejonu położonego poniżej końca 3' rejonu kodującego. Celem uniknięcia nieładu w nomenklaturze, każdemu z tych trzech rejonów przypisano to samo oznaczenie RXA, RXN, RXS lub RXC. Zatem określenie „jedna z sekwencjio nieparzystym numerze na Liście Sekwencji”odnosi się do jakiejkolwiek spośród sekwencji kwasu nukleinowego na Liście Sekwencji, które można także rozpoznać dzięki różnym oznaczeniom RXA, RXN, RXS czy RXC. Rejon kodujący każdej z tych sekwencji ulega translacji do odpowiedniej sekwencji aminokwasowej, także umieszczonej na Liście Sekwencji, jako parzysty numer SEKW. Nr ID.: następujący zaraz po odpowiadającej mu sekwencji kwasu nukleino20
PL 195 942 B1 wego. Na przykład, region kodujący dla RXA02458 zestawiono jako SEKW. Nr ID.:1, podczas gdy sekwencję aminokwasową przezeń kodowaną zestawiono jako SEKW. Nr ED.:2. Sekwencje cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku identyfikowane są za pomocą tych samych oznaczeń, co sekwencje aminokwasowe przez nie kodowane - RXA, RXN, RXS oraz RXC, tak, aby z łatwością można je było powiązać. Na przykład, sekwencje aminokwasowe oznaczone jako RXA02458, RXN00249, RXS00153 oraz RXC00963 powstały w wyniku translacji regionów kodujących sekwencji nukleotydowych cząsteczek kwasu nukleinowego oznaczonych odpowiednio, jako RXA02458, RXN00249, RXS00153oraz RXC00963. Zgodność pomiędzy sekwencjami nukleotydowymi a aminokwasowymi RXA, RXN, RXS i RXC według wynalazku oraz przypisane im numery SEKW. Nr ID. zestawiono w Tablicy1.
Kilka spośród genów według wynalazku to „geny oznaczone literą F”. Geny F obejmują te geny zestawione w Tablicy 1, które mają literę „F” przed oznaczeniem RXA, RXN, RXS i RXC. Na przykład, SEKW. Nr ID.:5, oznaczona, jak wskazano w Tablicy 1, jako „F RXA00249”, jest genem oznaczonym literą F, tak samo jak numery SEKW. Nr ID.: 11,15 oraz 33 (oznaczone w Tablicy 1, jako odpowiednio „F RXA02264”, „F RXA02247” oraz „F RXA00675”).
W jednej postaci, cząsteczki kwasu nukleinowego według niniejszego według wynalazku nie obejmują cząsteczek kwasu nukleinowego C.glutamicum zebranych w Tablicy 2. W przypadku genu dapD, jego sekwencja została opublikowana przez Wehrmann, A. i wsp. (1998) J. Bacteriol. 180(12): 3159-3165. Jednakże, sekwencja otrzymana przez wynalazców niniejszego zgłoszenia jest istotnie dłuższa niż wersja opublikowana. Należy przypuszczać, iż wersja opublikowana opiera się na błędnym kodonie start, przedstawia zatem jedynie fragment właściwego regionu kodującego.
W innej korzystnej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego, komplementarną do jednej z sekwencji nukleotydowych według wynalazku lub jej fragmentu. Cząsteczka kwasu nukleinowego komplementarna do jednej z sekwencji nukleotydowych według wynalazku to taka, która jest dostatecznie komplementarna do jednej spośród sekwencji nukleotydowych przedstawionych na Liście Sekwencji (np. sekwencji o nieparzystym numerze SEKW. Nr ID.:), by hybrydyzować do jednej z sekwencji nukleotydowych według wynalazku tworząc stabilny dupleks.
W jeszcze innej korzystnej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową homologiczną do sekwencji nukleotydowej według wynalazku lub jej fragmentu (np. sekwencji o nieparzystym numerze SEKW. Nr ID.: na Liście Sekwencji) co najmniej w około 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% lub 60%, korzystnie co najmniej w około 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% lub 70%, bardziej korzystnie co najmniej w około 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% lub 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% lub 90%, albo 91%, 92%, 93%, 94%, zaś jeszcze bardziej korzystnie co najmniej w około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej. Zakresy i wartości identyczności pośrednie w stosunku do wyżej wymienionych zakresów (np. 70-90% identyczności lub 80-95% identyczności) są również objęte niniejszym według wynalazkiem. Na przykład, zakresy wartości identyczności wykorzystujące połączenie jakichkolwiek spośród wyżej wymienionych wartości jako górnych i/lub dolnych granic zakresu objęte są wynalazkiem. W dodatkowej korzystnej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje, np. w ostrych warunkach, do jednej z sekwencji nukleotydowych według wynalazku lub jej fragmentu.
Ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku może zawierać jedynie fragment rejonu kodującego sekwencji o jednym z nieparzystych numerów SEKW. Nr ID.s na Liście Sekwencji, na przykład fragment, który może stanowić sondę bądź starter czy też fragment kodujący biologicznie aktywną część białka HA. Określone dzięki klonowaniu genów HA C.glutamicum sekwencje nukleotydowe umożliwiają tworzenie sond lub starterów zaprojektowanych do identyfikacji i/lub klonowania homologów HA w innych typach komórek i organizmów, jak również identyfikacji i/lub klonowania homologów HA z innych gatunków Corynebacteria czy gatunków spokrewnionych. Sonda/starter zawiera przeważnie zasadniczo oczyszczone oligonukleotydy. Oligonukleotyd przeważnie zawiera rejon sekwencji nukleotydowej, który hybrydyzuje w ostrych warunkach do co najmniej około 12, korzystniej około 25, zaś jeszcze korzystniej do około 40, 50 lub 75 kolejnych nukleotydów w nici sensownej jednej z sekwencji nukleotydowych według wynalazku (sekwencji antysensownej dla jednej z tych sekwencji lub naturalnie występujących jej mutantów). W celu klonowania homologów HA za pomocą reakcji PCR zastosowane mogą być startery zaprojektowane na podstawie sekwencji nukleotydowej według wynalazku. Zaprojektowane na podstawie sekwencji nukleotydowych HA sondy mogą być
PL 195 942 B1 zastosowane do wykrywania transkryptów lub sekwencji genomowych kodujących te same lub homologiczne białka. Sondy, w korzystnych postaciach, dodatkowo zawierają doczepioną do nich wyznakowaną grupę, którą może być np. radioizotop, związek fluorescencyjny, enzym lub kofaktor dla enzymu. Sondy takie można stosować w zestawie do testu diagnostycznego w celu identyfikacji komórek, w których zachodzi niewłaściwa ekspresja białka HA, poprzez pomiar w próbce komórek poziomu kwasu nukleinowego kodującego HA, np. za pomocą oznaczenia poziomów mRNA dla HA lub określenia czy genomowy gen dla HA uległ mutacji lub delecji. W jednej postaci, cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje białko lub jego część obejmującą sekwencję aminokwasową wystarczająco homologiczną do sekwencji aminokwasowej według wynalazku tak, że białko lub jego część zachowuje zdolność do brania udziału w utrzymaniu homeostazy u C.glutamicum lub do przeprowadzenia funkcji uczestniczącej w adaptacji mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych. Użyte tu pojęcie „dostatecznie homologiczny” odnosi się do białek lub ich części, których sekwencje aminokwasowe zawierają minimalną liczbę identycznych lub równoważnych reszt aminokwasowych (np. reszt aminokwasowych o łańcuchu bocznym podobnym do łańcucha reszty aminokwasowej występującej w sekwencji jednego z parzyście numerowanych SEKW. Nr ID.s na Liście Sekwencji) względem sekwencji aminokwasowej według wynalazku, dzięki czemu białko lub jego część zdolne jest do brania udziału w utrzymaniu homeostazy u C.glutamicum lub do przeprowadzenia funkcji uczestniczącej w adaptacji mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych. Białka biorące udział w biosyntezie lub przebudowie ściany komórkowej C.glutamicum, w metabolizmie związków nieroganicznych, modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych lub te które mają enzymatyczną lub proteolityczną aktywność C.glutamicum, jak tu opisane, mogą odgrywać rolę w produkcji i wydzielaniu jednego lub więcej wysokowartościowych związków chemicznych. Przykłady takiego działania są również tu opisane. Zatem „funkcja białka HA” bezpośrednio bądź pośrednio wpływa na wydajność, produkcję i/albo efektywność produkcji jednego lub więcej związków wysokowartościowych. Przykłady działania białka HA zestawiono w Tablicy1.
W innej postaci, białko jest homologiczne względem całkowitej sekwencji aminokwasowej według wynalazku co najmniej w około 50-60%, korzystnie co najmniej w około 60-70%, korzystniej co najmniej w około 70-80%, 80-90%, 90-95%, zaś najkorzystniej co najmniej w około 96%, 97%, 98%, 99% i bardziej homologiczne.
Korzystnie części białek kodowanych przez cząsteczki kwasu nukleinowego HA według wynalazku, są biologicznie aktywnymi częściami jednego z białek HA. Przyjęte tutaj pojęcie „aktywna biologicznie część białka HA” ma w założeniu obejmować część, np. domenę/motyw, białka HA, która może brać udział w utrzymaniu homeostazy u C.glutamicum lub która może przeprowadzić funkcję uczestniczącą w adaptacji mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych, bądź też wykazującą taką aktywność, jak wymieniona w Tablicy 1. W celu określenia czy białko HA lub jego biologicznie aktywna część może brać udział w biosyntezie lub przebudowie ściany komórkowej C.glutamicum, w mebabolizmie związków nieorganicznych, modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych lub czy ma enzymatyczną lub proteolityczną aktywność C.glutamicum, można wykonać oznaczenie aktywności enzymatycznej. Metody takich oznaczeń, wyszczególnione w Przykładzie 8, są dobrze znane osobom o podstawowej znajomości metod badań naukowych.
Dodatkowe fragmenty kwasu nukleinowego kodujące aktywne biologicznie części białka HA można uzyskać przez izolację części jednej z sekwencji aminokwasowych według wynalazku, i ekspresję kodowanej części białka lub peptydu HA (np. przez ekspresję rekombinacyjną in vitro) i oznaczanie aktywności kodowanej części białka lub peptydu HA.
Wynalazek obejmuje też cząsteczki kwasu nukleinowego różniące się od jednej z sekwencji nukleotydowych według wynalazku (i jej części) z powodu zjawiska degeneracji kodu genetycznego i kodujące to samo białko HA, co białko kodowane przez sekwencje nukleotydowe według wynalazku. W innej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku posiada sekwencję nukleotydową kodującą białko o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Liście Sekwencji (np. o parzystym numerze). W kolejnej postaci, cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje pełnej długości białko C.glutamicum zasadniczo homologiczne do sekwencji aminokwasowej według wynalazku.
Dla specjalisty zrozumiałe jest, że w jednej postaci przez sekwencje według wynalazku nie rozumie się sekwencji według stanu techniki, takich jak sekwencje zawarte w Genbanku zestawione w Tablicy 2 lub 4 dostępne przed dokonaniem niniejszego wynalazku. W jednej postaci, wynalazek obejmuje sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe posiadające taki procent identyczności względem
PL 195 942 B1 sekwencji nukleotydowej lub aminokwasowej według wynalazku, który jest większy niż w przypadku sekwencji według stanu techniki (np. sekwencji pochodzącej z Genbanku (lub białka kodowanego przez taką sekwencję) umieszczonej w Tablicy2 lub 4). Na przykład, wynalazek obejmuje sekwencję nukleotydową, która jest więcej niż i/lub co najmniej w 44% identyczna z sekwencją nukleotydową oznaczoną jako RXA00471 (SEKW. Nr ID.:293), sekwencją nukleotydową, która jest więcej niż i/lub co najmniej w 39% identyczna z sekwencją nukleotydową oznaczoną jako RXA00500 (SEKW. Nr ID.:143) oraz sekwencję nukleotydową, która jest więcej niż i/lub co najmniej w 35% identyczna z sekwencją nukleotydową oznaczoną jako RXA00502 (SEKW . Nr ID.:147). Specjalista jest w stanie obliczyć niższy próg procentu identyczności dla każdej sekwencji według wynalazku poprzez badanie wyników wyliczenia GAP procentu identyczności, zestawionych w Tablicy4 dla każdego z trzech najwyższych trafień dla danej sekwencji i poprzez odejmowanie najwyższych obliczeń GAP procentu identyczności od 100%. Dla specjalisty jest też zrozumiałe, iż wynalazek obejmuje również sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe mające większy procent identyczności od w ten sposób wyliczonego, niższego progu (np. mające co najmniej 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% lub 60%, korzystnie co najmniej około 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% lub 70%, bardziej korzystniej co najmniej około 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% lub 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% lub 90%, lub 91%, 92%, 93%, 94%, zaś najkorzystniej co najmniej około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub więcej identyczności).
Dla specjalisty zrozumiałe jest, że oprócz zestawionych na Liście Sekwencji jako nieparzyste SEKW. Nr ID. sekwencji nukleotydowych HA C.glutamicum, w populacji mogą występować (np. w populacji C.glutamicum) polimorfizmy sekwencji DNA prowadzące do zmian w sekwencjach aminokwasowych białek HA. Taki genetyczny polimorfizm w genie HA może występować pośród osobników populacji z powodu naturalnej zmienności. Przyjęte tutaj pojęcia „gen” oraz „gen zrekombinowany” odnoszą się do cząsteczek kwasu nukleinowego zawierających otwartą ramkę odczytu kodującą białko HA, szczególnie białka HA C.glutamicum. Wynikem takiej naturalnej zmienności jest zazwyczaj 1-5% zmienność w sekwencji nukleotydowej genu HA. Jakakolwiek oraz wszystkie spośród takich zmienności w sekwencji nukleotydowej i będące ich następstwem polimorfizmy sekwencji aminokwasowej HA wynikające z naturalnej zmienności, lecz nie mające wpływu na funkcjonalną aktywność białek HA wchodzą w zakres według wynalazku.
Cząsteczki kwasu nukleinowego odpowiadające naturalnym wariantom oraz nie występującym u C.glutamicum homologom DNA dla HA według wynalazku można wyizolować opierając się na ich homologii do, przedstawionego tu, kwasu nukleinowego HA C.glutamicum, za pomocą DNA C.glutamicum lub jego fragmentów użytych jako sondy do hybrydyzacji zgodnie ze standardowymi technikami hybrydyzacji w ostrych warunkach. Zatem w innej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku ma co najmniej 15 nukleotydów długości i hybrydyzuje w ostrych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową o nieparzystym numerze SEKW. Nr ID. na Liście Sekwencji. W pozostałych postaciach, kwas nukleinowy ma co najmniej 30, 50, 100, 250 lub więcej nukleotydów długości. Przyjęte tu określenie „hybrydyzacja w ostrych warunkach” opisywać ma warunki hybrydyzacji i płukania, w których sekwencje nukleotydowe homologiczne co najmniej w 60% w stosunku do siebie zwykle pozostają ze sobą zhybrydyzowane. Warunki hybrydyzacji są tak dobrane, by sekwencje co najmniej w około 65%, bardziej korzystnie co najmniej w około 70%, zaś najkorzystniej co najmniej w około 75% i bardziej homologiczne do siebie zwykle pozostawały ze sobą zhybrydyzowane. Takie ostre warunki znane są specjalistom, a informacje o nich znaleźć można w Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Korzystny, lecz nie jedyny przykład ostrych warunków hybrydyzacji to hybrydyzacja w układzie 6X chlorek sodu/cytrynian sodu (SSC) w około 45°C, po której następuje jedno lub więcej płukań w 0.2X SSC, 0.1% SDS w 50-65°C. Korzystnie wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku, która hybrydyzuje w ostrych warunkach do sekwencjinukleotydowej według wynalazku, odpowiada naturalnie występującej cząsteczce kwasu nukleinowego. Użyte tu określenie „naturalnie występująca” cząsteczka kwasu nukleinowego odnosi się do cząsteczki RNA lub DNA posiadającej sekwencję nukleotydową występującą w naturze (np. kodującą naturalne białko). W jednej postaci, kwas nukleinowy koduje naturalne białko HA C.glutamicum.
Specjalista rozumie, że dodatkowo oprócz naturalnie występujących w populacji odmian sekwencji HA, do sekwencji nukleotydowej według wynalazku mogą być wprowadzane zmiany poprzez mutacje, prowadzące tym samym do zmian w sekwencji aminokwasowej kodowanego białka HA, bez zmieniania jego aktywności funkcjonalnej. Na przykład do sekwencji nukleotydowej według wynalazku
PL 195 942 B1 może zostać wprowadzona zamiana nukleotydową prowadząca do zmiany „nieistotnych” aminokwasów. „Nieistotny” aminokwas to taki, który może być zmieniony w dzikiej sekwencji jednego z białek HA bez zmiany aktywności wymienionego białka, podczas gdy „istotny” aminokwas wymagany jest do utrzymania aktywności białka HA. Jednakże inne aminokwasy (np. te, które nie są konserwowane lub są jedynie semikonserwowane w domenie posiadającej aktywność HA) mogą nie być istotne dla aktywności, a tym samym zamiany ich nie naruszają aktywności HA.
Zatem kolejny aspekt wynalazku odnosi się do cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących białka HA zawierające zmiany w aminokwasach nieistotnych dla aktywności HA. Takie białka HA różnią się sekwencją aminokwasową od sekwencji o parzystym numerze SEKW. Nr ID. na Liście Sekwencji, nadal zachowując co najmniej jedną z aktywności HA tu opisanych. W jednej postaci wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową kodującą białko zawierające sekwencję aminokwasową homologiczną co najmniej w około 50% do sekwencji aminokwasowej według wynalazku i zdolne do udziału w utrzymaniu homeostarzy w C.glutamicum lub do realizacji funkcji wymaganej dla adaptacji tego mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych, albo posiada jedną lub więcej aktywności zestawionych w Tablicy 1. Korzystnie, białko kodowane przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jest homologiczne do jednej z sekwencji aminokwasowych według wynalazku o nieparzystym numerze SEKW. Nr ID. na Liście Sekwencji co najmniej w około 50-60%, korzystniej co najmniej w około 60-70%, bardziej korzystnie co najmniej w około 70-80%, 80-90%, 90-95% i najkorzystniej co najmniej w około 96%, 97%, 98% lub 99%. W celu ustalenia procentu homologii między dwoma sekwencjami aminokwasowymi (np. jednej z sekwencji aminokwasowych według wynalazku i zmutowanej jego formy) lub dwoma kwasami nukleinowymi, sekwencje są przyrównane pod kątem optymalnego porównania (np. mogą być wprowadzone przerwy w sekwencji białka lub kwasu nukleinowego w celu optymalnego przyrównania do innego białka lub kwasu nukleinowego). Porównywane są wtedy aminokwasy lub nukleotydy na odpowiadających sobie pozycjach. Gdy pozycja w jednej sekwencji (np. jednej z sekwencji aminokwasowych według wynalazku) zajmowana jest przez taki sam aminokwas lub nukleotyd jak w odpowiadającej jej pozycji w innej sekwencji (np. zmutowanej formie sekwencji aminokwasowej), wtedy cząsteczki w tej pozycji są homologiczne (tj. użyte tutaj sformuowanie „homologii” jest równoznaczne z „identycznością” aminokwasu lub nukleotydu). Procent homologii pomiędzy dwoma sekwencjami jest funkcją liczby identycznych pozycji w danych sekwencjach (tj. % homologii = # identycznych pozycji/ całkowita # pozycji x 100).
Wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą białko HA homologiczne do sekwencji białka według wynalazku można otrzymać poprzez wprowadzenie jednej lub więcej nukleotydowych substytucji, addycji lub delecji w sekwencji nukleotydowej według wynalazku w wyniku czego, że do kodowanego białka zostaje wprowadzona jedna lub więcej aminokwasowa substytucja, addycja lub delecja. W jednej z sekwencji nukleotydowych według wynalazku można dokonywać mutacji za pomocą standardowych technik takich, jak ukierunkowana mutageneza oraz mutageneza za pomocą PCR. Korzystnie substytucje aminokwasów konserwowanych są dokonywane w jednej lub więcej pozycji przypuszczalnie nieistotnych resztach aminokwasowych. „Substytucja konserwowanego aminokwasu” to taka substytucja, w której dana reszta aminokwasowa jest zastąpiona przez aminokwas posiadający podobny łańcuch boczny, W stanie techniki określono rodziny reszt aminokwasowych posiadających podobne łańcuchy boczne. Rodziny te obejmują aminokwasy z zasadowymi łańcuchami bocznymi (np. lizyna, arginina, histydyna), kwasowymi łańcuchami bocznymi (np. kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), polarnymi łańcuchami bocznymi nie posiadającymi ładunku (np. glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina), łańcuchami bocznymi niepolarnymi (np. alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan), łańcuchami bocznymi o odgałęzieniu b (np. treonina, walina, izoleucyna) oraz aromatycznymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Zatem przypuszczalnie nieistotna reszta aminokwasowa w białku HA zastępowana jest przez inną resztę aminokwasowa należącą do tej samej rodziny łańcuchów bocznych. Alternatywnie w innej postaci, mutacje mogą być wprowadzane losowo wzdłuż całej sekwencji kodującej HA lub jej części, np. poprzez mutagenezę wysyceniową, zaś uzyskane mutanty można przeszukiwać pod kątem tych, które posiadają aktywność HA w celu ich identyfikacji. Po wykonaniu mutagenezy jednej z sekwencji nukleotydowych o nieparzystym numerze SEKW. Nr ID. na Liście Sekwencji, kodowane białko można poddać rekombinowanej ekspresji, a jego aktywność określić na przykład za pomocą oznaczeń tu opisanych (patrz Przykład 8).
Dodatkowo, oprócz cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących opisane powyżej białka HA, kolejny aspekt według wynalazku dotyczy wyizolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego, które są
PL 195 942 B1 względem powyższych antysensowne. „Antysensowna” cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję nukleotydową komplementarną do „sensownej” cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej białko, np. komplementarną do kodującej nici dwuniciowej cząsteczki DNA lub do sekwencji mRNA. Stąd, antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego może wiązać się za pomocą wiązań wodorowych do cząsteczki sensownej. Antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego może być komplementarna do całej nici kodującej HA, bądź jedynie do jej części. W jednej postaci antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego jest antysensowna względem „rejonu kodującego” kodującej nici sekwencji nukleotydowej dla białka HA. Pojęcie „rejon kodujący” odnosi się do odcinka sekwencji nukleotydowej zawierającego kodony przepisywane na reszty aminokwasowe (np. cały rejon kodujący SEKW. Nr ID. 3 (RXN00249) zawiera nukleotydy od 1do 957). W innej postaci, antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego jest antysensowna względem „rejonu niekodującego” w kodującej nici sekwencji nukleotydowej dla HA. Pojęcie „rejon niekodujący” odnosi się do sekwencji 5' i 3', które flankują rejon kodujący i nie są przepisywane na aminokwasy (tj. dotyczy rejonów 5' i 3' niepodlegających translacji).
Mając do dyspozycji przedstawiane tutaj sekwencje nici kodującej dla HA (np. sekwencje o nieparzystych numerach SEKW. Nr ID, zestawione na Liście Sekwencji), można określić antysensowne cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku zgodnie z prawami parowania zasad opisanymi przez Watsona i Cricka. Antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego może być komplementarna do całego rejonu kodującego mRNA dla HA, ale korzystniej stanowi ona oligonukleotyd antysensowny tylko do części rejonu kodującego bądź niekodującego mRNA dla HA. Na przykład, oligonukleotyd antysensowny może być komplementarny do odcinka otaczającego miejsce początku translacji w mRNA dla HA. Oligonukleotyd antysensowny może mieć na przykład, długość około 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 lub 50 nukleotydów. Antysensowny kwas nukleinowy według wynalazku można uzyskać przy zastosowaniu syntezy chemicznej i enzymatycznych reakcji ligacji używając znanych w nauce procedur. Na przykład antysensowny kwas nukleinowy (np. antysensowny oligonukleotyd) może być chemicznie syntetyzowany z użyciem naturalnie występujących nukleotydów lub rozmaicie zmodyfikowanych nukleotydów zaprojektowanych tak, aby zwiększyć biologiczną stabilność cząsteczek,lub aby zwiększyć fizyczną stabilość formy dwuniciowej składającej się z cząsteczek antysensownych i sensownych nici kwasów nukleinowych np. mogą być zastosowane pochodne fosforotionianowe i nukleotydy podstawione akrydyną. Przykłady zmodyfikowanych nukleotydów, które mogą być zastosowane do wytworzenia antysensownego kwasu nukleinowego obejmują: 5-fluorouracyl, 5-bromouracyl, 5-chlorouracyl, 5-jodouracyl, hypoksantyna, ksantyna, 4-acetylocytozyna, 5-(karboksyhydroksymetylo)uracyl, 5-karboksymetyloaminometylo-2-tiourydyna, 5-karboksymetyloaminometylouracyl, dihydrouracyl, beta-D-galaktozylokweozyna, inozyna, N6-isopentenylo-adenina, 1-metyloguanina,
1- metyloinozyna, 2,2-dimetyloguanina, 2-metyloadenina, 2-metyloguanina, 3-metylocytozyna, 5-metylocytozyna, N6-adenina, 7-metyloguanina, 5-metylo-amino-metylouracyl, 5-metoksyaminometylo-2-tiouracyl, beta-D-mannozylokweozyna, 5'-metoksy-karboksymetylouracyl, 5-metoksyuracyl, 2-metylotio-N6-izopentenyloadenina, kwas uracylo-5-oksy-octowy (v), wybutoksozyna, pseudouracyl, kweozyna,
2- tiocytozyna, 5-metylo-2-tiouracyl, 2-tio-uracyl, 4-tio-uracyl, 5-metylouracyl, ester metylowy kwasu uracylo-5-oksyoctowego, kwas uracylo-5-oksyoctowy (v), 5-metylo-2-tiouracyl, 3-(3-amino-3-N-2-karboksypropylo)uracyl, (acp3)w oraz 2,6-diaminopuryna. Cząsteczkę antysensownego kwasu nukleinowego można wytworzyć alternatywnie sposobem biologicznym, stosując wektor ekspresyjny, w którym subklonowano kwas nukleinowy w położeniu antysensownym (tj. RNA przepisane z wstawionej cząsteczki kwasu nukleinowego będzie w położeniu antysensownym względem interesującej nas, docelowej cząsteczki kwasu nukleinowego, opisanej dalej w następnym rozdziale).
Antysensowne cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku są zazwyczaj wprowadzane do komórki lub wytworzenia in situ tak, by hybrydyzowały bądź wiązały się z komórkowymmRNA i/lub genomowym DNA kodującym białko HA celem zahamowania jego ekspresji, np. poprzez inhibicję transkrypcji i/lub translacji. Hybrydyzację można uzyskać na zasadzie konwencjonalnej komplementarności z wytworzeniem stabilnego dupleksu, lub też, w przypadku antysensownej cząsteczki kwasu nukleinowego wiążącej się do dupleksów DNA, może ona zachodzić poprzez specyficzną interakcję z większym rowkiem podwójnej helisy.
Cząsteczkę antysensowną można tak modyfikować, aby wiązała się specyficznie z receptorem lub antygenem prezentowanym na powierzchni wybranej komórki, np. poprzez połączenie antysensownej cząsteczki kwasu nukleinowego z peptydem lub przeciwciałem, wiążącym się do receptora bądź antygenu na powierzchni komórki. Antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego może być
PL 195 942 B1 również dostarczona do komórek za pomocą opisanych tu wektorów. Do tego, by osiągnąć dostateczne wewnątrzkomórkowe stężenie cząsteczek antysensownych, korzystne są konstrukty wektorowe, w których antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego regulowana jest przez silne prokariotyczne, wirusowe bądź eukariotyczne promotory.
W jeszcze innej postaci, antysensownacząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku jest a-anomeryczną cząsteczką kwasu nukleinowego, a-anomeryczne cząsteczki kwasu nukleinowego tworzą specyficzne dwuniciowe hybrydy z komplementarnym RNA, w których w odróżnieniu od formy typu b, nici biegną równolegle do siebie (Gaultier i wsp. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). Antysensowną cząsteczka kwasu nukleinowego może także składać się z 2'-o-metylorybonukleotydu (Inoue i wsp. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6131-6148) lub obejmować chimeryczne analogi RNA-DNA (Inoue i wsp. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).
W kolejnej postaci, antysensowna cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku jest rybozymem. Rybozymy są katalitycznymi cząsteczkami RNA wykazującymi aktywność rybonukleazy, zdolnymi do cięcia kwasów nukleinowych o pojedynczej nici, takich jak mRNA, do których posiadają odcinek komplementarny. Zatem, rybozymy (np. rybozymy typu hammeread (opisane przez Haselhoff i Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) mogą posłużyć do katalicznego cięcia transkryptów mRNA dla HA w celu zahamowania translacji mRNA dla HA. Rybozym specyficzny względem kwasu nukleinowego kodującego HA można zaprojektować opierając się na opisanej tutaj sekwencji nukleotydowej DNA dla HA (t.j. SEKW. Nr ID.:3(RXN00249)). Na przykład, można skonstruować pochodną RNA Tetrachymeny L-19 IVS, w której sekwencja nukleotydowa miejsca aktywnego jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej przeznaczonej do cięcia w mRNA kodującym HA. Patrz. np. Cech i wsp. patent USA nr 4,987,071 oraz Cech i wsp. patent USA nr 5,116,742. Z kolei mRNA dla HA może być wykorzystane do selekcji katalitycznego RNA o specyficznej aktywności rybonukleazy z mieszaniny cząsteczek RNA. Patrz. np. Bartel, D. i Szostak,J.W. (1993) Science 261:1411-1418.
W sposób alternatywny, ekspresję genu HA można hamować za pomocą docelowych sekwencji nukleotydów komplementarnych do regionu regulatorowego sekwencji nukleotydowej HA (np. promotora i/lub wzmacniacza genu HA), z którym tworzą potrójne struktury helikalne, co zapobiega transkrypcji genu HA w komórkach docelowych. Patrz. Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. i wsp. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36 oraz Maher, L.J. (1992) Bioassays14(12):807-15.
B. Zrekombinowane Wektory Ekspresyjne i Komórki Gospodarza
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy wektorów, a szczególnie wektorów ekspresyjnych, zawierających cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego białko HA (lub jego część). Przyjęty tutaj termin „wektor” odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do transportu połączonej z nią innej cząsteczki kwasu nukleinowego. Jednym z rodzajów wektora jest „plazmid”, który składa się z podwójnej nici DNA tworzącej kolistą pętlę, do której można ligować dodatkowe fragmenty DNA. Innym rodzajem wektora jest wektor wirusowy, charakteryzujący się tym, że dodatkowe fragmenty DNA ligowane są do genomu wirusa. Niektóre wektory mają zdolność autonomicznej replikacji w komórce gospodarza, do której zostały wprowadzone (np. wektory bakteryjne posiadające bakteryjne miejsce rozpoczęcia replikacji oraz ssacze wektory episomalne). Pozostałe wektory (np. nieepisomalne wektory ssacze) po wprowadzeniu do komórki są integrowane z genomem gospodarza i wrazznim ulegają replikacji. Co więcej, pewne wektory zdolne są do kierowania ekspresją genów, z którymi są funkcjonalnie połączone. Wektory takie objęte są tutaj nazwą „wektorów ekspresyjnych”. Wektory ekspresyjne wykorzystywane w technikach rekombinacji DNA często mają postać plazmidów. W niniejszym opisie terminy „plazmid” oraz „wektor mogą być używane zamiennie, ponieważ plazmid jest najbardziej powszechnie stosowaną formą wektora. Jednakże, wynalazek obejmuje w założeniu również takie spośród innych postaci wektorów ekspresyjnych, jak wektory wirusowe (np. niezdolne do replikacji retrowirusy, adenowirusy oraz wirusy towarzyszące adenowirusom), które pełnią funkcje równoznaczne z wyżej opisanymi. Rekombinacyjne wektory ekspresyjne według wynalazku zawierają cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku w formie dogodnej do uzyskania ekspresji w komórce gospodarza, co oznacza, że rekombinacyjne wektory ekspresyjne zawierają jedną lub więcej sekwencji regulatorowych, połączonych z mającą podlegać ekspresji sekwencją nukleotydową i wyselekcjonowanych pod kątem wykorzystywanych komórek gospodarza. Pojęcie „funkcjonalnie połączona” dotyczące rekombinacyjnego wektora ekspresyjnego ma oznaczać, że interesująca nas sekwencja nukleotydowa jest związana z sekwencją(-ami) regulatorawą(-ymi) w sposób umożliwiający ekspresję sekwencji nukleotydowej (np. in vitro w układzie transkrypcja/translacja lub w komórce gospodarza,
PL 195 942 B1 jeśli wektor jest do niej wprowadzony). Pojęcie „sekwencja regulatorowa” ma obejmować promotory, wzmacniacze oraz inne elementy kontrolujące ekspresję (np. sygnały poliadenylacji). Takie sekwencje regulatorowe opisane są, na przykład, w Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Do sekwencji regulatorowych zaliczają się zarówno takie, które potrafią kierować ekspresją konstytutywną sekwencji nukleotydowej w wielu rodzajach komórek gospodarza, jak i te, które zdolne są kierować ekspresją sekwencji nukleotydowej tylko w niektórych komórkach gospodarza. Korzystnymi sekwencjami regulatorowymi są, na przykład, promotory takie, jak cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SPO2, lPRlub lPL, które korzystnie są wykorzystywane u bakterii. Dodatkowymi sekwencjami regulatorowymi są na przykład promotory pochodzące z drożdży i grzybów takie, jak ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GADPH, TEF, rp28, ADH, promotory pochodzenia roślinnego, takie jak CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos lub promotory ubikwitynowy bądź fazeolinowy. Możliwe jest także stosowanie promotorów sztucznych. Dla specjalisty jest oczywiste, że projekt wektora ekspresyjnego zależeć może od takich czynników, jak wybór komórki gospodarza do transformacji, poziom ekspresji żądanego białka itd. Wektory ekspresyjne według wynalazku mogą być wprowadzane do komórek gospodarza w celu wytwarzania w nich białek lub peptydów, włączając w to białka lub peptydy fuzyjne, kodowanych przez cząsteczki kwasu nukleinowego, jak to opisano (np. białka HA, zmutowane formy białek HA, białka fuzyjne itd.).
Rekombinacyjne wektory ekspresyjne według wynalazku mogą być projektowane do uzyskiwania ekspresji białek HA w komórkach prokariotycznych bądź eukariotycznych. Na przykład, geny HA mogą podlegać ekspresji w komórkach bakteryjnych takich, jak C.glutamicum, komórkach owadzich (z zastosowaniem bakulowirusowych wektorów ekspresyjnych), drożdży lub w komórkach innych grzybów (patrz. Romanos, M.A. i wsp. (1992) „Foreign gene expression in yeast: a review”, Yeast 8:423-488;, van den Hondel, C.A.M.JJ. i wsp. (1991) „Heterologous gene expression in filamentous fungi” w: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, wyd., str. 396-428: Academic Press: San Diego; oraz van den Hondel, C.A.M.JJ. & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi” w: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. i wsp., wyd, str. 1-28, Cambridge Unversity Press: Cambridge), w komórkach glonów oraz roślinnych komórczakach (patrz Schmidt, R. I Willmitzer, L. (1988) „High efficiency Agrobacterium tumefactiens - mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants” Plant Cell Rep.: 583-586), bądź w komórkach ssaczych. Dogodne komórki omawiane są dokładniej w Goeddel, Gene Exspression Technology: Methods in Enzymology 186, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternatywnie zrekombinowany wektor ekspresyjny może ulec transkrypcji i translacji in vitro, na przykład z użyciem sekwencji regulatorowych promotora T7 i polimerazy T7.
Ekspresja białek w organizmach prokariotycznych często zachodzi z wektorami zawierającymi konstytutywne lub indukcyjne promotory kierujące ekspresją fuzyjnych bądź niefuzyjnych białek. Wektory fuzyjne powodują dodanie pewnej liczby aminokwasów do białka w nich kodowanego, zwykle do końcowego aminokwasu zrekombinowanego białka. Takie wektory fuzyjne zwykle mają trzy zastosowania: 1) zwiększenie ekspresji zrekombinowanego białka; 2) zwiększenie rozpuszczalności zrekombinowannego białka; i 3) pomoc w oczyszczeniu zrekombinowanego białka, służąc jako ligand w oczyszczaniu uwzględniającym powinowactwo. Do fuzyjnych wektorów ekspresyjnych często wprowadzane jest miejsce cięcia proteolitycznego w pozycji złączenia fuzyjnej części i zrekombinowanego białka, w celu umożliwienia rozdzielenia zrekombinowanego białka od części fuzyjnej po jego oczyszczeniu. Takie enzymy i miejsca przez nie rozpoznawane, obejmują Czynnik Xa, trombinę, enterokinazę.
Typowe fuzyjne wektory ekspresyjne obejmują pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith,D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) i pRITS (Pharmacia, Piscataway, NJ), które łączą odpowiednio S-transferazę glutationu (GST), białko E łączące się z maltozą, białko A, z docelowym zrekombinowanym białkiem. W jednej postaci sekwencja kodująca białka HA jest klonowana do wektora ekspresyjnego pGEX w celu utworzenia wektora kodującego białko fuzyjne zawierające od końca N do końca C białko X z miejscem cięcia trombiny-GST. Białko fuzyjne może być oczyszczone za pomocą chromatografii powinowactwa z użyciem złoża glutation-agaroza. Zrekombinowane białko HA odcięte zostaje od GTS poprzez trawienie białka przy pomocy trombiny.
Przykłady odpowiednich, indukcyjnych niefuzyjnych wektorów ekspresyjnych E.coli obejmują pTrc (Amann i wsp., (1988) Gene 69:301-315) pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pINIII113-B1, lgt11, pBdCl i pET11d
PL 195 942 B1 (Studier i wsp., Gene Ekspression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89: i Pouwels i wsp., wyd. (1985) Cloning Vectors, Elsevier. New York IBSN 0444 904018). Ekspresja docelowego genu z wektora pTrc opiera się na transkrypcji przez polimerazę RNA gospodarza z zastosowaniem hybrydowego fuzyjnego promotora trp-lac. Ekspresja docelowego genu z wektora pET 11d opiera się na transkrypcji z fuzyjnego promotora T7 gn10-lac obsługiwanego przez ulegającą koekspresji wirusową polimerazę RNA (T7 gn1). Taka wirusowa polimeraza dostarczana jest przez szczepy gospodarza BL21 (DE3) lub HMS174(DE3) z wbudowanego profaga l posiadającego gen gn1T7 pod transkrypcyjną kontrolą promotora lacUV 5. Odpowiednie wektory mogą zostać wybrane w celu transformacji innych rodzajów bakterii. Na przykład plazmidy pIJ101, pIJ364, pIJ702 i pIJ361 są znane z wykorzystania do transformacji Streptomyces, podczas gdy plazmidy pUB110, pC194 lub pBD214 są wykorzystywane do transformacji gatunków Bacillus. Wśród plazmidów stosowanych do transferu informacji genetycznej w Corynobacterium znajdują się pHM1519, pBL1, pSA77 lub pAJ667 (Pouwels i wsp., wyd. (1985) Cloning Vectors, Elsevier. New York IBSN 0444 904018).
Jedna ze strategii maksymalizacji ekspesji zrekombinowanego białka polega na ekspresji tego białka w bakteriach z osłabioną zdolnością do trawień proteolitycznych zrekombinowanego białka (Gottesman, S., Gene Ekspression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San
Diego, California (1990) 119-128). Odmienna strategia polega na takim dopasowaniu sekwencji kwasu nukleinowego wstawianego do wektora ekspresyjnego, że poszczególne kodony dla każdego aminokwasu są preferencyjnie wykorzystywanymi kodonami w wybranej do przeprowadzenia ekspresji bakterii takiej jak C.glutamicum (Wada i wsp., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Takie dopasowanie sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku można uzyskać przy zastosowaniu standardowych technik syntezy DNA.
W innej postaci wektor ekspresyjny białka HA jest wektorem drożdżowym. Przykłady wektorów do ekspresji w drożdżach S.cerevisiae obejmują pYepSec1 (Baldari i wsp., (1987) Embo J. 6:229-234),2m, pAG-1, Yep6, Yep13, pEMBLYe23, pMFa (Kurjan i Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz i wsp., (1987) Gene54:113-123) i pYES2 (Invitrogen Corportation, San Diego, CA). Wektory i metody do konstrukcji wektorów odpowiednich do użyciaw innych grzybach takich jak grzyby nitkowate, obejmują te wyszczególnione w van den Hondel, C.A.M.JJ. & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi”Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy i wsp., wyd.,str. 1-28, Cambrige UnivesityPress: Cambridge, Pouwels i wsp., wyd. (1985) Cloning Vectors, Elsevier: New York (IBSN 0444 904018).
Alternatywnie białka HA według wynalazku mogą ulegać ekspresji w komórkach owadzich przy zastosowaniu bakulowirusowych wektorów ekspresyjnych. Wektory bakulowirusowe służące do uzyskania ekspresji białek w hodowanych komórkach owadzich (np. komórkach Sf9) obejmują serię pAc (Smith i wsp., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) iserię pVL(Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39).
W innej postaci białka HA według wynalazku mogą ulegać ekspresji w jednokomórkowych roślinach (takich jak glony) lub w komórkach roślinnych z roślin wyższych (np. nasiennych takich jak rośliny zbożowe). Przykłady roślinnych wektorów ekspresyjnych obejmują wektory wyszczególnione w Becker, D., Kemper, E., Schell, J., Masterson, R. (1992) „New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; Bevan, M.W. (1984) „Binary Agrobacteriumvectors for plant transformation”, Nucl Acid. Res. 12:8711-8721 i zaliczają się do nich: pLGV23, pGHlac+ pBIN19, pAK2004 i pDH51 (Pouwels i wsp., wyd. (1985) Cloning Vectors, Elsevier: New York IBSN 0444 904018).
W kolejnej postaci kwas nukleinowy według wynalazku ulega ekspresji w ssaczych komórkach z zastosowaniem ssaczych wektorów ekspresyjnych Przykłady ssaczych wektorów ekspresyjnych obejmują pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) i pMT2PC (Kaufman i wsp. (1987) EMBO J. 6:187-195). W przypadku wykorzystania komórek ssaczych kontrolne funkcje wektora ekspresyjnego często zapewniane są przez wirusowe elementy regulatorowe. Na przykład powszechnie stosowane promotory pochodzą z wirusa poliomy, Adenovirusa 2, cytomegalowirusa i Wirusa Siminan 40. Inne przydatne systemy ekspresji dla komórek prokariotycznych i eukariotycznych przedstawione są w rozdziale 16 i 17 w Sambrook, J., Fritsh, E.F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Labolatory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Labolatory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
PL 195 942 B1
W innej postaci zrekombinowany ssaczy wektor ekspresyjny jest zdolny do kontrolowania ekspresji kwasu nukleinowego szczególnie w określonym rodzaju komórek (np. do ekspresji kwasu nukleinowego używane są elementy regulatorowe tkankowo specyficzne). Elementy regulatorowe tkankowo specyficzne są znane w nauce. Przykłady odpowiednich tkankowo specyficznych promotorów obejmują, ale nie ograniczają się do, promotora albuminy (specyficznego wątrobowo; Pinker i wsp. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotorów specyficznych dla limfocytów (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:234-257) w szczególności promotorów receptorów limfocytów T (Winoto i Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) oraz immunoglobulin (Banerji i wsp. (1983) Cell 33:729-740; Queen i Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotorów specyficznych dla komórek nerwowych (np. promotor neurofilamentów; Byrne i Ruddle (1989) PNAS 86:5473-5477), promotorów specyficznych dla komórek trzustki (Edlund i wsp. (1985) Science 230:912-916) oraz promotorów specyficznych dla gruczołu mlekowego (np. promotor genu serwatki mleka; U.S. Patent No. 4,873,316 oraz European Application Publication NO. 264,166). Zalicza się do nich również promotory regulowane w okresie rozwoju, na przykład promotory hox u gryzoni (Kessel i Gruss (1990) Science 249:374-379) oraz promotor a-fetoproteiny (Campes i Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).
W dalszej kolejności wynalazek dostarcza rekombinacyjnego wektora ekspresyjnego zawierającego cząsteczkę DNA według wynalazku wklonowaną do tego wektora w położeniu antysensownym. Oznacza to, że cząsteczka DNA jest funkcjonalnie połączona z sekwencją regulatorową w sposób umożliwiający ekspresję cząsteczki RNA (poprzez transkrypcję cząsteczki DNA), która jest antysensowna względem mRNA dla HA. Dzięki możliwości wyboru danej sekwencji regulatorowej funkcjonalnie połączonej z cząsteczką kwasu nukleinowego sklonowaną w położeniu antysensownym, można pokierować konstytutywną ekspresją cząsteczki antysensownego RNA w różnego rodzaju komórkach, na przykład -wirusowe promotory i/lub wzmacniacze, bądź sekwencje regulatorowe można wybrać tak, by pokierować konstytutywną, tkankowo specyficzną czy też specyficzną względem rodzaju komórki ekspresją antysensownego RNA. Antysensowne wektory ekspresyjne mogą mieć formę zrekombinowanego plazmidu, fagmidu lub osłabionego wirusa, w którym antysensowne cząsteczki kwasu nukleinowego produkowane są pod kontrolą regionów regulatorowych o wysokiej wydajności, których aktywność można określić na podstawie typu komórki, do której wprowadzono wektor. Dyskusja na temat regulacji ekspresji genu za pomocą genów antysnesownych patrz. Weintraub, H. i wsp., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews -Trends in Genetics, Tom 1(1) 1986.
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy komórek gospodarza, do których został wprowadzony rekombinacyjny wektor ekspresyjny według wynalazku. Pojęcie „komórka gospodarza” oraz „rekombinowana komórka gospodarza” używane są tutaj zamiennie. Jest zrozumiałe, że pojęcie takie odnosi się nie tylko do danej komórki stanowiącej przedmiot działań, lecz także do komórek potomnych lub potencjalnie potomnych tej komórki. Ponieważ mogą pojawić się pewne zmiany w powstających komórkach potomnych z powodu mutacji bądź wpływu środowiska, komórki potomne mogą nie być w rzeczywistości identyczne z komórką rodzicielską, lecz nadal wchodzą w zakres pojęcia użytego powyżej.
Komórką gospodarza może być komórka prokariotyczna lub eukariotyczna. Na przykład białko HA może ulegać ekspresji w bakteryjnych komórkach takich jak C.glutamicum, komórkach owadzich, drożdżowych lub ssaczych (takich jak komórki jajnikowe chomików chińskich (CHO) lub komórki COS). Inne odpowiednie komórki gospodarza są znane specjalistom. Mikroorganizmy pokrewne Corynabacterium glutamicum, które mogą być dogodnie użyte jako komórki gospodarza dla cząsteczek kwasu nukleinowego i białka według wynalazku, zestawione są w Tablicy 3.
Wektorowe DNA może zostać wprowadzone do komórek prokariotycznych lub eukariotycznych na drodze konwencjonalnych technik transforamcji lub transfekcji. Użyte tu określenia „transforamcja” i „transfekcja” odnoszą się do rozmaitych znanych w nauce technik służących do wprowadzania obcego kwasu nukleinowego (np. liniowego DNA lub RNA (np. zlinearyzowanego wektora lub samego konstruktu genowego bez wektora) lub kwasu nukleinowego w formie wektora (np. plazmidu, faga, fazmidu, fagmidu, transpozonu lub innego DNA) do komórek gospodarza, i obejmują koprecypitację fosforanem wapnia lub chlorkiem wapnia, transfekcję z użyciem dekstranu-DEAE, lipofekcję lub elektroporację. Odpowiednie metody transformacji lub transfekcji komórek gospodarza można znaleźć w Sambrook i wsp. (Molecular Cloning: A Labolatory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harob Labolatory, Cold Spring Harob Labolatory Press, Cold Spring Harobor, NY, 1989) i innych podręcznikach laboratoryjnych.
PL 195 942 B1
Zależnie od użytego wektora ekspresyjnego i zastosowanej techniki transfekcyjnej, tylko w niewielkiej frakcji komórek może dojść do integracji obcego DNA do genomu, co, jak wiadomo, daje stabilną transfekcję komórek ssaczych. W celu identyfikacji i selekcji komórek, w których doszło do integracji, do komórek gospodarza przeważnie wprowadzony zostaje razem z danym genem gen kodujący marker selekcyjny (np. oporności na antybiotyk). Korzystne markery selekcyjne obejmują markery nadające oporność na leki takie jak G418, higromycyna i metotreksat. Kwas nukleinowy kodujący marker selekcyjny może zostać wprowadzony do komórki gospodarza na tym samym wektorze, który koduje białko HA lub może być wprowadzony na oddzielnym wektorze. Komórki stabilnie stransfekowane wprowadzonym kwasem nukleinowym mogą być zidentyfikowane poprzez selekcję na lek (np. komórki posiadające włączony do genomu gen markera selekcyjnego przeżyją, podczas gdy pozostałe zginą).
Aby stworzyć homologiczny rekombinowany mikroorganizm, należy przygotować wektor zawierający przynajmniej część genu HA, w którym dokonano delecji, addycji lub substytucji, powodującej zmianę genu HA, np. zaburzenie jego funkcjonowania.
Korzystnie genem jest gen HA należący do Corynebacterium glutamicum, lecz może to również być jego homolog u pokrewnej bakterii czy nawet ssaka, drożdży lub owada. W korzystnej postaci, wektor jest tak zaprojektowany, że w wyniku rekombinacji homologicznej, wewnątrzpochodny gen HA jest funkcjonalnie zaburzony (tj. nie koduje już funkcjonalnego białka; wektorom takim nadano nazwę wektorów „knock out”). Alternatywnie, wektor można zaprojektować tak, że choć w wyniku rekombinacji homologicznej, wewnątrzpochodny gen HA jest zmutowany lub w inny sposób zmieniony, nadal koduje funkcjonalne białko (np. zmieniony może być regulatorowy rejon położony w kierunku 5', co powoduje zmianę ekspresji endogennego białka HA). W wektorze stosowanym do rekombinacji homolgicznej, zmieniona część genu HA flankowana jest na swych końcach 5' i 3' przez dodatkowy fragment DNA genu HA, aby zajść mogła rekombinacja homologiczna pomiędzy zewnątrzpochodnym genem HA znajdującym się na wektorze, a wewnątrzpochodnym genem HA mikroorganizmu. Ów dodatkowy flankujący fragment DNA genu HA ma dostateczną długość dla zajścia prawidłowej rekombinacji homologicznej z genem endogennym. Zazwyczaj, flankujące DNA na wektorze zawiera kilka tysięcy nukleotydów (zarówno na końcu 5', jak i 3') (patrz. np. Thomas, K.R. i Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503, opis wektorów do rekombinacji homologicznej). Wektor wprowadzany jest do mikroorganizmu (np. drogą elektroporacji), a komórki, w których zaszła rekombinacja homologiczna z udziałem wprowadzonego genu HA i wewnątrzpochodnego genu HA, poddane są selekcji za pomocą znanych w nauce technik.
W innej postaci, można wyprodukować rekombinowane mikroorganizmy zawierające swoiste układy, które umożliwiają regulację ekspresji wprowadzonego genu. Na przykład, wprowadzenie genu HA do wektora, który umieszcza ten gen pod kontrolą operonu laktozowego, pozwala na ekspresję genu HA jedynie w obecności IPTG. Takie układy regulacji są w nauce dobrze znane.
W jeszcze innej postaci, wewnątrzpochodny gen HA w komórce gospodarza jest zaburzony (np. poprzez rekombinację homologiczną lub inne znane w nauce metody molekularne) w taki sposób, że ekspresja kodowanego przezeń białka w ogóle nie zachodzi. W kolejnej postaci, wewnątrzpochodny bądź wprowadzony do komórki gospodarza gen HA zmieniono poprzez poddanie go jednej lub więcej mutacji punktowych, delecji lub inwersji, lecz w dalszym ciągu koduje on funkcjonalne białko HA. W jeszcze innej postaci, zmieniono jeden lub więcej rejonów regulatorowych genu HA (np. poprzez delecję, skrócenie, inwersję lub mutację punktową) w taki sposób, że ekspresja całego genu uległa modulacji. Dla specjalisty jest zrozumiałe, że komórki gospodarza zawierające jedną lub więcej spośród opisanych modyfikacji genu i białka HA, mogą być z łatwością uzyskiwane za pomocą metod według wynalazku i objęte są zakresem niniejszego wynalazku.
Komórka gospodarza według wynalazku, taka jak pochodząca z hodowli komórka prokariotyczna bądź eukariotyczna, może być wykorzystana do produkcji (tj. ekspresji) białek HA. Zatem w dalszej swej części, wynalazek przedstawia sposoby produkcji białek HA z wykorzystaniem komórek gospodarza według wynalazku. W jednej postaci, sposób obejmuje hodowlę komórki gospodarza według wynalazku (do której wprowadzono rekombinacyjny wektor ekspresyjny kodujący białko HA, lub do genomu której wprowadzono gen kodujący białko HA typu dzikiego bądź białko zmienione) w odpowiedniej pożywce do czasu, aż zostanie wyprodukowane białko HA. W innej postaci, sposób obejmuje jeszcze izolację białek HA z pożywki lub komórki gospodarza.
PL 195 942 B1
C. Wyizolowane białka HA
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy wyizolowanych białek HA oraz ich aktywnych biologicznie części. „Wyizolowane” lub „oczyszczone” białko bądź jego biologicznie aktywna część jest zasadniczo wolne od materiału komórkowego, jeśli zostało wyprodukowane technikami rekombinacji DNA, bądź prekursorów pochodzenia chemicznego czy też innych związków chemicznych, jeśli zostało zsyntetyzowane chemicznie. Określenie „zasadniczo wolne od materiału komórkowego” dotyczy preparatów białka HA, w których białko jest oddzielone od pozostałych komponentów komórki, w której zachodzi jego naturalna lub uzyskiwana metodą rekombinacji produkcja. W jednej postaci, określenie „zasadniczo wolne od materiału komórkowego” dotyczy preparatów białka HA, które mają mniej niż około 30% (suchej masy) białka nie-HA (zwanego tu też „białkiem zanieczyszczającym”), korzystnie - mniej niż około 20% białka nie-HA, bardziej korzystnie - mniej niż około 10% białka nie-HA, natomiast najkorzystniej mniej niż około 5% białka nie-HA. Jeśli białko HA lub jego biologicznie aktywna część jest produkowane metodą rekombinacji, korzystnie jest również zasadniczo wolne od pożywki hodowlanej, tj. pożywka hodowlana stanowi mniej niż około 20%, korzystnie mniej niż około 10%, a najkorzystniej mniej niż około 5% objętości preparatu białkowego. Określenie „zasadniczo wolne od chemicznych prekursorów lub innych związków chemicznych” obejmuje preparaty białka HA, w których białko oddzielone od chemicznych prekursorów lub innych związków chemicznych użytych do syntezy białka. W jednej postaci, pojęcie „zasadniczo wolne od prekursorów chemicznych lub innych związków chemicznych” odnosi się do preparatów białka HA zawierających mniej niż około 30% (suchej masy) prekursorów chemicznych lub związków chemicznych nie będących HA, korzystnie - mniej niż około 20% prekursorów chemicznych lub związków chemicznych nie będących HA, korzystniej - mniej niż około 10% prekursorów chemicznych lub związków chemicznych nie będących HA, zaś najkorzystniej - mniej niż około 5% prekursorów chemicznych lub związków chemicznych nie będących HA. W korzystnych postaciach, wyizolowane białka lub ich biologicznie aktywne części w zupełności pozbawione są zanieczyszczających białek pochodzących z tego samego organizmu, z którego uzyskano białko HA. Zazwyczaj białka takie produkowane są w wyniku ekspresji rekombinacyjnej, na przykład, ekspresji białka HA C.glutamicum u tego mikroorganizmu.
Wyizolowane białko HA według wynalazku lub jego część może brać udział w naprawie lub rekombinacji DNA, w transpozycji materiału genetycznego, w ekspresji genu (tj. w procesie transkrypcji lub translacji), w składaniu białek lub sekrecji białek w Corynebacterium glutamicum, lub też wykazuje jedną lub więcej z aktywności zestawionych w Tablicy 1. W korzystnych postaciach, białko lub jego część zawiera sekwencję aminokwasową wykazującą dostateczną homologię do sekwencji aminokwasowej według wynalazku, tak, iż białko lub jego część zachowuje zdolność do uczestniczenia w utrzymaniu homeostazy w C.glutamicum lub do realizacji funkcji biorącej udział w adaptacji tego mikroorganizmu do różnych warunków środowiskowych. Korzystnie część białka stanowi część biologicznie aktywna, jak to zostało niniejszym opisane. W innej korzystnej postaci, białko HA według wynalazku posiada sekwencję aminokwasową o parzystym numerze SEKW. Nr ID.: na Liście Sekwencji. W kolejnej korzystnej postaci, białko HA ma sekwencję aminokwasową kodowaną przez DNA o sekwencji nukleotydowej, zdolnej do hybrydyzacji, np. w ostrych warunkach, do sekwencji nukleotydowej według wynalazku. W jeszcze innej korzystnej postaci, białko HA posiada sekwencję aminokwasową kodowaną przez DNA o sekwencji nukleotydowej homologicznej do jednej z sekwencji kwasów nukleinowych według wynalazku lub jej części co najmniej w około 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% lub 60%, korzystnie co najmniej w około 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% lub 70%, korzystniej co najmniej w około 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% lub 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% lub 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, zaś najkorzystniej co najmniej w około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej.
Zakresy oraz wartości identyczności są pośrednie względem wartości wymienionych powyżej (np. identyczność w zakresie 70-90% lub 80-95%), a niniejszy wynalazek także je obejmuje. Na przykład, wynalazek obejmuje zakresy wartości dla identyczności wyrażone za pomocą kombinacji którychkolwiek z powyższych wartości wymienionych jako dolne i/lub górne granice zakresu. Korzystnie, korzystne białka HA według niniejszego wynalazku również posiadają przynajmniej jedną z opisanych tu aktywności HA. Na przykład, korzystne białko HA według niniejszego wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową, zdolną do hybrydyzacji, np. w ostrych warunkach, do sekwencji nukleotydowej według wynalazku, i uczestniczyć może w transporcie wysokoenergetycznych cząsteczek węglowych, takich jak glukoza, do wnętrza C.glutamicum, a także
PL 195 942 B1 w wewnątrzkomórkowym przekaźnictwie sygnału u tego mikroorganimu, lub wykazuje jedną lub więcej z zestawionych w Tablicy1aktywności.
W innych postaciach, białko HA jest zasadniczo homologiczne do sekwencji aminokwasowej według wynalazku i zachowuje funkcjonalną aktywność białka posiadającego jedną z sekwencji według wynalazku, różniąc się jednak od niego w swej sekwencji aminokwasowej z racji naturalnej zmienności bądź mutagenezy, jak to szczegółowo opisano powyżej w podrozdziale I. Zatem, w innej postaci, białkiem HA jest białko składające się z sekwencji aminokwasowej homologicznej co najmniej w około 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% lub 60%, korzystnie -co najmniej w około 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% lub 70%, korzystniej -co najmniej w około 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% lub 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% lub 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, zaś najkorzystniej -co najmniej w około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub bardziej homologicznej do całkowitej sekwencji aminokwasowej według wynalazku i posiadające przynajmniej jedną spośród tutaj opisanych aktywności HA. Zakresy oraz wartości identyczności są pośrednie względem wartości wymienionych powyżej (np. identyczność w zakresie 70-90% lub 80-95%), a niniejszy wynalazek także je obejmuje. Na przykład, wynalazek obejmuje zakresy wartości dla identyczności wyrażone za pomocą kombinacji którychkolwiek z powyższych wartości wymienionych jako dolne i/lub górne granice zakresu. W innej postaci, wynalazek dotyczy białka o całkowitej długości pochodzącego z C.glutamicum, i wykazującego znaczną homologię do całkowitej sekwencji aminokwasowej według wynalazku.
Do fragmentów białka HA wykazujących aktywność biologiczną zaliczają się peptydy zawierające sekwencje aminokwasowe uzyskane z sekwencji aminokwasowej białka HA, np. sekwencji aminokwasowej o parzystym numerze SEKW. Nr ID. na Liście Sekwencji lub sekwencji aminokwasowej białka homologicznego do białka HA, i składające się z niniejszej liczby aminokwasów niż samo białko HA o pełnej długości lub pełnej długości białko homologiczne do białka HA oraz wykazujące przynajmniej jedną spośród aktywności białka HA. Zazwyczaj biologicznie aktywne fragmenty białka (peptydy, np. peptydy złożone z 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 i więcej aminokwasów) zawierają domenę lub motyw wykazujący przynajmniej jedną spośród aktywności białka HA. Co więcej, za pomocą technik rekombinacyjnych można uzyskać kolejne aktywne biologicznie części (białka HA), pozbawione innych regionów białka, i ocenić pod względem jednej lub więcej spośród opisanych tu aktywności. Korzystnie biologicznie aktywne części białka HA zawierają jedną lub więcej wybranych domen/motywów lub ich części, posiadających aktywność biologiczną.
Korzystnie, białka HA są wytwarzane za pomocą technik rekombinacji DNA. Na przykład, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko klonowana jest (jak opisano powyżej) do wektora ekspresyjnego, który wprowadzany jest (jak opisano powyżej) do komórki gospodarza, gdzie następuje ekspresja białka HA. Białko HA można następnie wyizolować z komórek za pomocą odpowiedniej procedury oczyszczania z wykorzystaniem standardowych technik oczyszczania białka. W sposób alternatywny względem ekspresji rekombinacyjnej białko, polipeptyd lub peptyd HA można syntetyzować chemicznie za pomocą standardowych technik syntezy białek. Co więcej, natywne białko HA można wyizolować z komórek (np. komórek nabłonka), na przykład za pomocą przeciwciał anty-HA, wyprodukowanych standardowymi technikami z wykorzystaniem białka HA według wynalazku lub jego fragmentu.
Wynalazek dostarcza także chimerowych lub fuzyjnych białek HA. „Białko chimerowe”lub „białko fuzyjne”HA zawiera polipeptyd HA połączony funkcjonalnie z polipeptydem nie-HA. Pojęcie „polipeptyd HA”odnosi się do polipeptydu posiadającego sekwencję aminokwasową odpowiadającą HA, podczas gdy pojęcie „polipeptyd nie-HA” odnosi się do polipeptydu o sekwencji aminokwasowej odpowiadającej białku, które nie jest zasadniczo homologiczne do białka HA np. białku różniącemu się od HA i pochodzącemu z tego samego lub innego organizmu. Jeśli chodzi o białko fuzyjne, określenie „połączony funkcjonalnie”mawskazywać, że polipeptyd HA i polipeptyd nie-HA połączone są ze sobą w ramce („in frame”). Polipeptyd nie-HA może być dołączony do C lub N końca polipeptydu HA. Na przykład w jednej postaci, białko fuzyjne jest białkiem GST-HA, w którym sekwencje HA dołączone są do C końca sekwencji GST. Takie białka fuzyjne ułatwiają oczyszczanie zrekombinowanych białek HA. W innej postaci, białko fuzyjne jest białkiem HA zawierającym heterologiczną sekwencję sygnałową na swoim N końcu. Dzięki zastosowaniu heterologicznej sekwencji sygnałowej, w niektórych komórkach gospodarza (np. ssaczych) ekspresja i/lub sekrecja białka HA może ulec podwyższeniu.
Chimerowe lub fuzyjne białko HA wynalazku korzystnie wytwarzane jest z zastosowaniem standardowych technik rekombinacji DNA. Na przykład fragmenty DNA kodujące różne sekwencje polipep32
PL 195 942 B1 tydowe są ligowane razem w ramce zgodnie z konwencjonalnymi technikami, na przykład poprzez stosowanie do ligacji tępych lub lepkich końców, trawienie enzymami restrykcyjnymi w celu uzyskania końców odpowiednich, należyte uzupełnianie lepkich końców, traktowanie fosfatazą alkaliczną w celu wykluczenia niepożądanego łączenia oraz ligację enzymatyczną. W innej postaci, gen fuzyjny może być zsyntetyzowany przy użyciu konwencjonalnych technik wliczając w to automatyczne syntezery DNA. Wsposób alternatywny, amplifikacja fragmentów genu za pomocą PCR może zostać przeprowadzona z użyciem kotwiczących starterów, dających początek komplementarnym sekwencjom zachodzącym pomiędzy dwoma kolejnymi fragmentami genu, które następnie mogą być połączone i reamplifikowane w celu utworzenia sekwencji genu chimerowego (patrz np. Current Protocols in Molecular Biology, eds., Ausubel i wsp., John Wiley&Sons; 1992). Co więcej, wiele wektorów ekspresyjnych jest dostępnych komercyjnie i koduje od razu część fuzyjną (np. polipeptyd GST). Kwas nukleinowy kodujący HA może być klonowany do takiego wektora ekspresyjnego w sposób sprawiający, że część fuzyjną połączona jest w ramce z białkiem HA.
Homologi białka HA mogą być tworzone poprzez mutagenezę np. określoną mutację punktową, lub też cięcie białka HA. Użyty tutaj termin „homologi” odnosi się do różnych form białka HA działających agonistycznie lub antagonistycznie względem aktywności białka HA. Agonista białka HA zasadniczo zachowuje tę samą lub częściową aktywność biologiczną białka HA. Antagonista białka HA może hamować jedną lub więcej spośród aktywności naturalnie występujących form białka HA poprzez, np. konkurencyjne wiązanie się do elementu układu HA znajdującego się w części dolnej bądź górnej tego układu i obejmującego białko HA. Białko HA C.glutamicum oraz jego homologi według niniejszego wynalazku modulować mogą zatem u tego mikroorganizmu działanie jednego lub więcej spośród szlaków transportu cukru lub wewnątrzkomórkowych szlaków transdukcji sygnału, w których same uczestniczą.
W alternatywnej postaci, homologi białka HA można identyfikować poprzez przeszukiwanie kombinatorycznych bibliotek mutantów białka HA np. mutantów powstałych w wyniku skracania, pod względem aktywności agonistycznej lub antagonistycznej wobec białka HA. Wjednej postaci, metodą mutagenezy kombinatorycznej na poziomie kwasu nukleinowego tworzy się zróżnicowaną bibliotekę odmian HA kodowanych przez zróżnicowaną bibliotekę genową. Zróżnicowaną bibliotekę odmian HA można stworzyć naprzykład za pomocą enzymatycznej ligacji mieszaniny syntetycznych oligonukleotydów z sekwencjami genowymi w taki sposób, że zdegenerowany zbiór potencjalnych sekwencji HA może ulec ekspresji w formie pojedynczych polipeptydów lub, alternatywnie, jako zbiór większych białek fuzyjnych (np. w obrazie fagowym) zawierający zbiór sekwencji HA. Istnieje wiele metod wykorzystywanych do tworzenia bibliotek potencjalnych homologów HA ze zdegenerowanej sekwencji oligonukleotydowej. Chemiczną syntezę zdegenerowanej sekwencji genowej można przeprowadzić w automatycznym syntezatorze DNA, a syntetyczny gen następnie zligować do odpowiedniego wektora ekspresyjnego. Wykorzystanie zbioru zdegenerowanych genów pozwala zgromadzić w jednej mieszaninie wszystkie sekwencje kodujące pożądany zbiór potencjalnych sekwencji HA. Metody syntezy zdegenerowanych oligonukleotydów są znane w nauce (patrz np. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura i wsp. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura i wsp. (1984) Science 198:1056; Ike i wsp. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Poza tym biblioteki fragmentów sekwencji kodujących białka HA można wykorzystać do tworzenia zróżnicowanej populacji fragmentów HA służących do przeszukiwania i następnie selekcji homologów białka HA. W jednej postaci, bibliotekę fragmentów sekwencji kodujących można stworzyć poprzez traktowanie dwuniciowego fragmentu PCR sekwencji kodującej HA nukleazami w warunkach, w których każda cząsteczka nacinana jest tylko w jednym miejscu, po czym następuje denaturacja dwuniciowego DNA, renaturacja DNA do postaci dwuniciowej mogącej zawierać sensowne/antysensowne pary z różnych produktów trawienia, usuwanie części jednoniciowych z uformowanych fragmentów dwuniciowych za pomocą nukleazy S1i w końcu ligacja otrzymanej biblioteki fragmentów do wektora ekspresyjnego. Dzięki zastosowaniu tej metody można otrzymać bibliotekę ekspresyjną kodującą fragmenty N i C końcowe oraz wewnętrzne fragmety białka HA o różnych rozmiarach.
Znanych jest kilka technik poszukiwania produktów genowych z kombinatoryjnych bibliotek utworzonych poprzez mutacje punktowe lub skracanie i przeszukiwania bibliotek cDNA w celu wykrycia produktów genowych posiadających wybrane właściwości. Techniki te są przystosowane do szybkiego przeszukiwania bibliotek genowych wytworzonych metodą kombinatorycznej mutagenezy homo logów HA. Najczęściej stosowane, mogące podlegać analizie o wysokiej przepustowości, techniki do przeszukiwania dużych bibliotek genowych zazwyczaj obejmują klonowanie biblioteki genowej do
PL 195 942 B1 zdolnych do replikacji wektorów ekspresyjnych, transformację odpowiednich komórek otrzymaną biblioteką wektorową, wreszcie ekspresję kombinatorowych genów w warunkach, w których izolacja wektora kodującego dany gen ułatwiona jest poprzez wykrywanie pożądanej aktywności jego produktu (lub: w których wykrywanie pożądanej aktywności ułatwia izolację wektora kodującego gen, którego produkt był wykrywany). W celu identyfikacji homologów HA wykorzystać można kombinację metody przeszukiwania bibliotek i rekursywnej mutagenezy zespołowej („recursive ensemble mutagenesis”) (REM), nowej technologii zwiększającej częstość występowania funkcjonalnych mutantów w bibliotekach (Arkin i Yourvan (1992) PNAS 89:7911-7815; Delgrave i wsp. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).
W innej postaci, do analizy zróżnicowanej biblioteki HA można zastosować testy komórkowe posługując się w tym celu metodami znanymi w nauce.
D. Zastosowanie i sposoby według wynalazku
Cząsteczki kwasu nukleinowego, białka, homologi białek, białka fuzyjne, startery, wektory i komórki gospodarza tu opisane mogą być zastosowane w jednej lub więcej spośród następujących metod: identyfikacji C.glutamicum i spokrewnionych organizmów; mapowania genomów organizmów spokrewnionych z C.glutamicum; identyfikacji i lokalizacji danych sekwencji C.glutamicum; w badaniach ewolucyjnych; ustalaniu rejonów białka HA niezbędnych do jego działania; modulacji działania białka HA; modulacji działania szlaku HA; wreszcie, modulacji komórkowego wytwarzania pożądanych związków, takich jak związki wysoko wartościowe.
Cząsteczki kwasu nukleinowego HA według wynalazku mają różnorakie zastosowanie. Po pierwsze, mogą być wykorzystane do identyfikacji organizmu będącego Corynebacterium glutamicum lub z nim spokrewnionego. Mogą one być także wykorzystane do ustalenia obecności C.glutamicum lub organizmów spokrewnionych w mieszaninie populacyjnej mikroorganizmów. Wynalazek dostarcza sekwencji kwasu nukleinowego wielu genów C.glutamicum; poprzez badanie w ostrych warunkach wyekstrahowanego, genomowego DNA pochodzącego z hodowli pojedynczych lub mieszanych populacji mikroorganizmów, stosując sondę wiążącą się do unikalnego dla C.glutamicum rejonu danego genu, można stwierdzić czy ten organizm jest w hodowli obecny.
Chociaż samo Corynebacterium glutamicum nie jest gatunkiem patogennym, spokrewnione jest z gatunkami patogennymi, takimi we jest przyczyną zachorowań na błonicę (dyfteryt), szybko postępującą, ostrą i powodującą gorączkę infekcję, wywołującą zarówno miejscowe, jak układowe patologie. W chorobie tej tworzą się miejscowe uszkodzenia wyższych dróg oddechowych obejmujące niszczenie komórek nabłonka; toksyna, którą wydzielają zarazki rozprzestrzenia się poprzez to uszkodzenie do obwodowych, podatnych tkanek ciała. Zmiany degeneracyjne wywołane zahamowaniem syntezy białka w tkankach takich jak serce, mięśnie, nerwy obwodowe, nadnercza, nerki, wątrobę i śledzionę powodują układową patologię choroby. Nadal odnotowuje się wysoką zachorowalność na dyfteryt w wielu częściach świata wliczając w to Afrykę, Azję, wschodnią Europę i niezależne republiki byłego Związku Radzieckiego. Występowanie epidemii błonicy w dwóch ostatnich rejonach spowodowało co najmniej 5000 zgonów od 1990 roku.
W jednej postaci, wynalazek dostarcza metody wykrywania obecności lub aktywności Corynebacterium diphteriae u badanego osobnika. Metoda ta obejmuje wykrywanie jednej lub więcej spośród sekwencji kwasu nukleinowego lub sekwencji aminokwasowych według wynalazku u badanego osobnika, co umożliwia wykrycie u niego obecności bądź aktywności Corynebacterium diphteriae. C.glutamicum i C.diphteriae są gatunkami spokrewnionymi i wiele cząsteczek kwasu nukleinowego oraz białek u C.glutamicum jest homologicznych do cząsteczek kwasu nukleinowego i białek C.Diphteriae, mogą być one zatem wykorzystane do wykrywania C.diphteriae u badanego osobnika.
Cząsteczki kwasu nukleinowego i białka według wynalazku mogą także służyć jako znaczniki specyficznych rejonów genomu. Ma to zastosowanie nie tylko przy mapowaniu genomu, lecz również w badaniach czynnościowych białek C.glutamicum. Na przykład, w celu identyfikacji obszaru genomu, do którego przyłącza się konkretne białko łączące się z DNA u C.glutamicum, genom C.glutamicum może zostać strawiony, a jego fragmenty inkubowane z białkiem wiążącym się z DNA. Te, które wiążą się z białkiem można dodatkowo traktować sondami cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku, najlepiej sprzężonymi z łatwo wykrywalnym znacznikiem; wiązanie się takiej cząsteczki kwasu nukleinowego do danego odcinka genomu umożliwia jego lokalizację na mapie genomowej C.glutamicum, a jeśli przeprowadzane jest wielokrotnie z użyciem rozmaitych enzymów, ułatwia szybkie określenie sekwencji aminokwasowej, do której wiąże się białko. Ponadto, cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku mogą być na tyle homologiczne do (odpowiednich) sekwencji DNA bakterii
PL 195 942 B1 gatunków pokrewnych, że mogą posłużyć jako znaczniki do konstruowania mapy genomowej takich bakterii pokrewnych, jak choćby Brevibcterium lactofermentum.
Cząsteczki kwasu nukleinowego HA według wynalazku są także przydatne do badań struktury białek oraz badań ewolucyjnych. Układ pobierania cukrów, w którym biorą udział cząsteczki według wynalazku, wykorzystywany jest przez bardzo wiele różnych bakterii; poprzez porównywanie sekwencji cząsteczek kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku z sekwencjami kodującymi podobne enzymy u innych organizmów, można oszacować pokrewieństwo pomiędzy nimi. Podobnie, takie porównanie pozwala na ocenę, które spośród regionów tej sekwencji są konserwowane, a które nie, co może pomóc przy określaniu tych rejonów białka, które istotne są dla działania enzymu. Jest to przydatne do badań nad inżynierią białek i wskazywać może, jakie zmiany, w warunkach mutagenezy, niewpływają na utratę funkcji białka.
Wynikiem manipulacji dokonywanych na cząsteczkach kwasu nukleinowego HA według wynalazku, może być tworzenie białek HA wykazujących funkcjonalne różnice względem białek HA typu dzikiego. Białka te mogą charakteryzować się podwyższoną lub obniżoną wydajnością bądź aktywnością lub mogą występować w komórce w większej niż zazwyczaj liczbie.
Wynalazek dostarcza metod przesiewania cząsteczek, które modulują aktywność białka HA, bądź poprzez oddziaływanie z samym białkiem lub z jego substratem czy cząsteczką wiążącą się z nim, bądź poprzez modulowanie procesu transkrypcji lub translacji cząsteczki kwasu nukleinowego HA według wynalazku. Wmetodach takich mikroorganizm, w którym ekspresji ulega jedno lub więcej białek HA według wynalazku, poddawany jest oddziaływaniu jednego lub więcej związków testowych, po czym oceniany jest wpływ każdego związku testowego na poziom aktywności lub ekspresji białka HA.
Cząsteczki HA według wynalazku można modyfikować w taki sposób, że wydajność, produkcja i/lub efektywność produkcji jednego lubwięcej związków wysokowartościowych ulega poprawie. Przykładowo, zmieniając aktywność tych białek można modulować strukturę lub grubość ściany komórkowej. Ściana komórkowa w znacznej mierze służy jako element chroniący przed liżą osmotyczną i wywołanym przez czynniki zewnętrzne uszkodzeniem; modyfikując ścianę komórkową można zwiększyć zdolność C.glutamicum do wytrzymywania wstrząsu mechanicznego i siły ścinania, którym poddane są mikroorganizmy podczas hodowli w fermentorze w wielkiej skali. Ponadto, każda komórka C.glutamicum jest otoczona grubą ścianą komórkową i co za tym idzie znacząca część biomasy w wielkoskalowej hodowli stanowi ściana komórkowa. Zwiększając tempo syntezy ściany komórkowej lub aktywując syntezę ściany komórkowej (przez genetyczną przebudowę białek ściany komórkowej HA według wynalazku) możliwa jest poprawa szybkości wzrostu mikroorganizmu. Podobnie, zmniejszając aktywność lub ilość białek uczestniczących wdegradacji ściany komórkowej lub zmniejszając hamowanie biosyntezy ściany komórkowej można uzyskać ogólne zwiększenie wytwarzania ściany komórkowej. Zwiększenie ilości żywych komórek C.glutamicum (które może być osiągnięte przez jakiekolwiek opisane zmiany białek) powinno doprowadzić do zwiększenia liczby komórek wytwarzających żądany wysokowartościowy związek chemiczny w hodowli w fermentorze w wielkiej skali, co powinno pozwolić na zwiększenie wydajności lub skuteczności wytwarzania tych związków w hodowli.
Modulowanie aktywności lub liczby białek HA z C.glutamicum uczestniczących w modyfikowaniu lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych może mieć również bezpośredni lub pośredni wpływ na wytwarzanie jednego lub więcej wysokowartościowych związków chemicznych w tych komórkach. Określone produkty modyfikacji lub degradacji związków aromatycznych lub alifatycznych są pożądane jako wysoko wartościowe związki chemiczne (np. kwasy organiczne lub zmodyfikowane związki aromatyczne lub alifatyczne) tak więc przez modyfikację enzymów przeprowadzających te modyfikacje związków (np. hydroksylację, metylację lub izomeryzację) lub reakcje degradacji można zwiększyć ilość wytwarzanych, pożądanych związków. Podobnie, zmniejszając aktywność lub liczbę białek uczestniczących w szlakach, które dalej degradują produkty modyfikacji lub rozpadu wyżej wspomnianych reakcji można zwiększyć wydajność tych wysokowartościowych związków chemicznych uzyskiwanych z hodowli komórek C.glutamicum.
Enzymy modyfikujące i degradujące związki aromatyczne i alifatyczne same są wysokowartościowymi związkami chemicznymi. W oczyszczonej postaci enzymy te mogą być użyte do degradacji związków aromatycznych i alifatycznych (np. toksycznych substancji chemicznych, takich jak produkty ropopochodne) zarówno dla odtwarzania biologicznego skażonych miejsc, dla przeprowadzenia rozkładu odpadów, lub do ekonomicznie opłacalnej i prowadzonej w wielkiej skali produkcji pożądanych zmodyfikowanych związków aromatycznych lub alifatycznych lub ich produktów rozpadu, z których niektóre mogą być tradycyjnie użyte jako źródła węglalub energii dla wytwarzania w hodowli innych
PL 195 942 B1 cennych związków (patrz np. Faber, K. (1995) Biotransformation in Organie Chemistry, Springer: Berlin i zawarte w niej cytowania i Roberts, S.M. wyd. (1992-1996) Preparative Biotransformation, Wiley: Chichester i zawarte w niej cytowania). Zmieniając genetycznie te białka tak, że ich regulacja przez inne mechanizmy komórkowe jest zmniejszona lub zniesiona, można będzie zwiększyć ogólną ilość lub aktywność tych białek i co za tym idzie poprawić nie tylko wydajność wytwarzanych wysokowartościowych związków chemicznych, lecz również aktywność tych zbieranych białek.
Modyfikacja enzymów biorących udział w modyfikacji i degradacji związków aromatycznych i alifatycznych może mieć również pośredni wpływ na wytwarzanie jednego lub większej liczby wysokowartościowych związków chemicznych. Wiele związków aromatycznych i alifatycznych (takich jak te, które mogą być traktowane jako zanieczyszczenia w pożywce hodowlanej lub jako produkty odpadowe metabolizmu komórki) jest toksycznych dla komórek; przez modyfikowanie i/lub degradowanie tych związków, które umożliwia łatwe ich usunięcie lub zniszczenie powinna być zwiększona żywotność komórki. Ponadto, enzymy te mogą modyfikować lub degradować te związki w taki sposób, że otrzymane produkty mogą być włączone do normalnych szlaków komórkowych metabolizmu węgla, czyniąc komórkę zdolną do wykorzystania tych związków jako alternatywnych źródeł węgla lub energii. W przypadku hodowli w wielkiej skali, gdzie może być ograniczona ilość optymalnych źródeł węgla, enzymy te dostarczają sposobu w jaki komórki mogą kontynuować wzrost i podział wykorzystując związki aromatyczne lub alifatyczne jako substancje pokarmowe. W każdym z tych przypadków zwiększona w hodowli ilość komórek C.glutamicum wytwarzających pożądane wysokowartościowe związki powinna z kolei prowadzić do zwiększonej wydajności lub efektywności produkcji wysokowartościowych związków chemicznych.
Modyfikacje aktywności lub liczby białek HA uczestniczących w metabolizmie związków nieorganicznych mogą również bezpośrednio lub pośrednio wpływać na wytwarzanie jednego lub większej liczby wysokowartościowych związków chemicznych w C.glutamicum lub hodowli pokrewnych bakterii. Przykładowo, wiele pożądanych wysokowartościowych związków chemicznych, takich jak kwasy nukleinowe, aminokwasy, kofaktory i witaminy (np. tiamina, biotyna i kwas lipoilowy) nie może być syntetyzowych bez cząsteczek nieorganicznych takich jak fosfor, azotan, siarczan i żelazo. Białka według wynalazku związane z metabolizmemzwiązków nieorganicznych pozwalaj ą komórce uzyskać te cząsteczki z różnorodnych związków nieorganicznych i przekształcić je w szlakach biosyntezy w różne cenne związki. Zatem zwiększając aktywność lub liczbę enzymów uczestniczących w metabolizmie tych związków nieorganicznych można zwiększyć ilość dostarczanych limitujących substancji nieorganicznych i w ten sposób bezpośrednio zwiększyć produkcję lub efektywność produkcji różnych wartościowych związków chemicznych w komórkach C.glutamicum zawierających takie zmienione białka. Modyfikacja aktywności lub liczby enzymów metabolizmu związków nieorganicznych według wynalazku może również uczynić C.glutamicum zdolną do lepszego wykorzystania ograniczonych zasobów związków nieorganicznych lub wykorzystania nieoptymalnych związków nieorganicznych dla syntezy aminokwasów, witamin, kofaktorów lub kwasów nukleinowych, z których wszystkie są niezbędne dla kontynuacji wzrostu i replikacji komórki. Zwiększając żywotność tych komórek w hodowli w wielkiej skali zwiększy się również ilość komórek C.glutamicum wytwarzających jeden lub więcej wartościowych związków chemicznych w hodowli, co z kolei zwiększa wydajność lub efektywność produkcji jednego lub więcej wartościowych związków chemicznych.
Enzymy C.glutamicum dla procesów ogólnych są same w sobie pożądanymi cennymi związkami chemicznymi. Specyficzne właściwości enzymów (tj. między innymi regiospecyficzność i stereospecyficzność) czynią je użytecznymi katalizatorami dla reakcji chemicznych in vitro. Z odpowiednim substratem mogą być inkubowane całe komórki C.glutamicum, tak że pożądany produkt jest wytwarzany w komórce przez enzymy lub pożądane enzymy mogą być nadprodukowane i oczyszczone z hodowli C.glutamicum (lub pokrewnej jej bakterii) i następnie wykorzystane w reakcjach in vitro o zastosowaniach przemysłowych (zarówno w roztworze lub unieruchomione na odpowiednim złożu dla immobilizującym). W każdej sytuacji enzym może być zarówno naturalnym białkiem z C.glutamicum jak i może być wynikiem mutagenezy przeprowadzanej w celu zmiany jego aktywności; typowe zastosowania przemysłowe takich enzymów obejmują stosowanie ich jako katalizatorów w przemyśle chemicznym (np. do chemicznej syntezy organicznej), jako dodatków do pokarmu, jako składników pasz, do obróbki owoców, do obróbki skóry, w detergentach, w analizach i medycynie i w przemyśle tekstylnym (patrz np. Yamada, H. (1993) „Microbial reactions for the production of useful organie compounds” Chimica 47:5-10; Roberts, S.M. (1998) Preparative Biotransformations: The employment of enzymes and whole cells in synthetic chemistry J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:157-169; Zaks, A.
PL 195 942 B1 i Dodds, D.R. (1997) „Application of biocatalysis and biotransformations to the synthesis of farmaceuticals”DDT 2: 513-531; Roberts , S.N. i Williamson, N.M. (1997) „The use of enzymes for the preparation of biologically active natural products and analogues in optically active form” Curr. Organ. Chemistry 1: 1-20; Faber. K. (1995) Biotransformation in Organie Chemistry, Springer: Berlin; Roberts S.M. wyd. 1992-96) Preparative Biotransformations, Willey: Chichester, Cheetham, P.S J. (1995) „The applications of enzymes in industry” w: Handbook of Enzymes Biotechnology wyd. 3, Wiessman, A. wyd. Elis: Horwood, str. 419-552; i Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987), tom A9, Enzymes str. 390-457). Tak więc przez zwiększenie aktywności lub liczby tych enzymów można zwiększyć zdolność komórki do przekształcenia dostarczonych substratów do pożądanych produktów lub wywołać nadprodukcję tych enzymów i zwiększyć ilość produktu końcowego w wielkoskalowych hodowlach. Ponadto, przez mutagenezę tych białek może być możliwe usunięcie hamowania zwrotnego lub innych hamujących, komórkowych mechanizmów kontrolnych tak, że może być wytworzona i aktywowana przez komórkę większa ilość tych enzymów, co prowadzi do zwiększenia wydajności, produkcji lub efektywności produkcji tych cennych białek z wielkoskalowych hodowli. Ponadto, manipulowanie tymi enzymami może zmienić aktywność jednego lub większej liczby szlaków metabolicznych C.glutamicum, takich jak szlaki dla biosyntezy lub wydzielania jednego lub większej liczby cennych związków chemicznych.
Mutageneza enzymów proteolitycznych według wynalazku, w wyniku której jest zmieniona ich aktywność lub ilość może również bezpośrednio lub pośrednio wpływać na wydajność, produkcję, i/lub efektywność produkcji jednego lub więcej cennych związków chemicznych w C.glutamicum. Przykładowo, zwiększając aktywność lub ilość tych białek można zwiększyć zdolność bakterii do przeżycia w wielkoskalowej hodowli, dzięki zwiększonej zdolności komórki do szybkiego degradowania błędnie złożonych białek w odpowiedzi na wysokie temperatury, nieoptymalne pH i inne czynniki wstrząsowe, którym poddana jest bakteria podczas hodowli w fermentorze. Zwiększona ilość komórek w tych hodowlach może prowadzić do zwiększonej wydajności lub efektywności produkcji jednego lub większej liczby cennych związków chemicznych, dzięki stosunkowo dużej ilości komórek, które w hodowli wytwarzają te związki. Również komórki C.glutamicum posiadają wielofunkcyjne proteazy powierzchniowe służące do degradacji zewnątrzkomórkowych substancji odżywczych do cząsteczek, które mogą być łatwiej pobierane przez komórki jako źródła węgla/energii lub substancji odżywczych innego rodzaju. Zwiększona aktywność lub ilość takich enzymów może zwiększyć to przekształcenie i zwiększyć ilość dostępnych substancji odżywczych poprawiając w ten sposób wzrost komórki lub produktywność. Zatem proteazy według wynalazku mają pośredni wpływ na wytwarzanie cennych produktów przez C.glutamicum.
Bardziej bezpośredni wpływ na wytwarzanie wysokowartościowych związków chemicznych w odpowiedzi na modyfikację jednej lub więcej proteaz według wynalazku może wystąpić, gdy proteazy te uczestniczą w wytwarzaniu lub degradacji pożądanego cennego związku chemicznego. Przez zmniejszenie aktywności proteazy degradującej cenny związek chemiczny lub białko uczestniczące w syntezie cennego związku chemicznego może być możliwe zwiększenie poziomów cennego związku (dzięki zmniejszonej degradacji lub zwiększonej syntezie związku). Podobnie, zwiększając aktywność proteazy, która degraduje związek, aby uzyskać cenny związek chemiczny lub białko uczestniczące w degradacji cennego związku, powinno się uzyskać podobny wynik: zwiększone poziomy pożądanego cennego związku chemicznego z komórek C.glutamicum zawierających te przebudowane białka.
Wyżej wspomniane strategie mutagenezy dla białek HA prowadzące do zwiększonej wydajności wysokowartościowego związku chemicznego z C.glutamicum nie są jedyne; warianty tych strategii będą oczywiste dla specjalistów. Stosując takie strategie i włączając ujawnione tu mechanizmy kwasy nukleinowe i cząsteczki białka według wynalazku mogą być wykorzystane do wytwarzania C.glutamicum lub pokrewnych szczepów bakterii wyrażających zmienione przez mutacje kwasy nukleinowe HA i cząsteczki białka, tak że poprawia się wydajność, produkcja i/lub efektywność produkcji pożądanego związku. Ten pożądany związek może być jakimkolwiek produktem wytworzonym przez C.glutamicum, który obejmuje końcowe produkty szlaków biosyntezy i produkty pośrednie występujących w naturze szlaków metabolicznych, jak również cząsteczki, które w naturze nie występują w metabolizmie C.glutamicum, lecz które są produkowane przez szczep C.glutamicum według wynalazku.
Niniejszy wynalazek jest w dalszej części zilustrowany przykładami, które nie powinny być interpretowane jako wyczerpujące wszystkie możliwości w tym zakresie. Treść wszystkich cytowanych w tym zgłoszeniu, zgłoszeń patentowych, patentów, opublikowanych zgłoszeń patentowych, Tablicy oraz Listy Sekwencji włączono tu jako odnośniki.
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
Kwas Aminokwas Kod identyfikacji Konta, NT· Start NT Stop Funkcja nukleinowy Sekw. Nr id,. .
Sekw. Nr.
PL 195 942 B1 i2
ιη iq to tg tg co co co co tó O COCO <<<<<
ggggg w co co ω o <<<<·<
oooo _i _j _j -i >- 5- >- >o o o o '2 X Z. Z o o o o tt. Cć CĆ Cć p Q O Q >· >- >- >X X X X o o o o □ ΩΩΟ
O O O BBB < < < ggg sgs •st
CO to CM CO CO F
CO CD F O CM O -<- F ί- N K> CC co xt cd cc co
O O CM CM 07
CO. V- -«- 'M- F tD
CO ·*— CO v- t“, ro v- v—
F F V- co ΓΜ 'sT^CO^fOCOco0
N N ω in S O
OOO^OOoO o o o o A Q o t: XX££>C£i£>X ooo$oo>o
CM T- CM σ>
xj- to cn ca; co f
O CO CM ID CM
LO V- x+ 5t ΧΓ Tf v-Mn to co co ir> ir> cm
CO CD xf- W LO &> CO CT) CO CO CO F
CM CO O CO CM M x£ x— co cn tn co cm i UJ®
CM £- O CO O u f% α X et o o >
to co tn m co en o o tn to CM CD CO 'tf Xj- ^C<5 zrx σι ci « η -i °> °> + a S co co p
O O o S fi· <c <c Ι2«χ i SgZBgS
00522 9S§§§ 00^-¾ XC2TgsS uj lj O < P te te θ 4 o
9ρ<<«; 23£xgg S -- S: 5 Ś S
IU 'JJ j < < O O ΓΥ Q y X o o o cćtz&gSte ee&ŁSiS x x 3 9 2 2 LUUJiTiSSS£?QKS§S A A G_ < F <
co
N
F to
CDCOFlOr-kOFF cococct-cdcmt—^+co cocob-ł-omcoŁom
CMr-^-FtOtOcO-ę-tD s<
F F CO O CD CR ΙΛ _ O CM .
P* — ° θ CD o tJ- co CM T-O ω r- C\I O? O CO
OSDC7>Ot-S F CO tD CD V- CO-r-OtOmtOCOtO F ’φ CO ro-M-cob-cMN-cOfOcOT-roiOT—encGcotocjio-M-CJio F F
CM<?3tDC0'r--i-T-F0>CDx}'*~Fv-CM'v-tDFFF<O'r--»~ v— CO co oj o> . cd po f co u? σι coco cmco^co.
O CD O co CÓ 0 ID +· Lf) Pj v- N F rO N ·Ό (O ci -to tO h- tn r\j Oj b~. fsJ O cM
O O O cjOO O O O O Oj O O A. o O O O
O O O o O ° OOOOoOOoOOOOooooSoOOCOCOrŚ ϋϋϋ$ϋΰοοϋϋ>ϋϋ>θϋϋϋ <O F .νO O O CO 05 t—
O O CM W $ & & ω
CDCOOCMrtCDCOO cncoooooo-rv- t—CMCMCMCMCMCM
LO F 03 X— CO to F σ> T-rencbcnooooo £ v- v- CM CM CM CM CM co cm ? 52 cn ęO to fo
m. F tf) r? m “i η m ^iiiiiiliii ii . . ,,, . ,n CO V *“ co CO to. CD π- V> CD UD CO CM CO
COFCOi^CO^-iilOrMFF^iniDO^i-tD^OOŁOTV-CM Οσ^Ο CM yOr-v-CMO V~- T-CMCO-i-1— COCMO oooooooooooooo <.< <£ZZZZZZZZZZZ
.........
. CM O O CM o o oft o o z
Z.Z, Z. &%&
cm f LO CO x- F v- O gg
CM X?·' CD CO O CM ^CDCOOCM^iCDCÓDCMM-tDCOOCMTt-CDCOOCM^htDCO· O CM CM gj £j CM CM CO CO CO CO CO +Γ ’Φ «7 Φ tp tp 10 CO. CD tp CD CD C- 1>
CM CM CM CM CM
CMCMCMCMCMCMCMCMCMCMrMCMCMCMCMCMCMCMCMCMtNCM
V- C7 m s OT -Γ- COLOFCr>T-COlOFCJ>T-COLOFCOv-COlOFCO-«“tOLOF CRv~ t- X- T~ t- V- CM CM CM CM CM fO CO COCO CO ν M M ŁO LO LO LO LO CO CO CD CD tO S CM CM CM CM CM CM CMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCM.CMCM CM CM
PL 195 942 B1
333 334 RXS00153 W0167 41S5 4620 BIAŁKO GUZOWATOŚCI
Ureaza ...
Kwas Aminokwas Kod identyfikacji Kontig, NT Start NT Stop Funkcja nukleinowy Sekw. Nr Id.
Sekw. Nr.
PL 195 942 B1
Metabolizm fosforanu i fosfonianu
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
Tablica 2: Geny nie objęte wynalazKiem
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
15(9):3917(1987)
PL 195 942 B1
Tablica 2 (cd.)
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
Tablica 3: Szczepy Corynebacterium and Breyibacterium,, które mogą być zastosowane w praktyce wynalazku
Rodzaj | Gatunek | ATCC | FERM | NRRL | CECT | NCMIB | CBS | NCTC | DSMZ |
Breyibacterium | ammoniagenes | 21054 | |||||||
Breyibacterium | ammoniagenes | 19350’ | |||||||
Breyibacterium · | ammoniagenes | 19351' | |||||||
Breyibacterium | ammoniagenes | 19352 | |||||||
Breyibacterium | ammoniagenes . .' | 19353 | |||||||
Breyibacterium | ammoniagenes | 19354 | |||||||
Breyibacterium | ammoniagenes | 19355 | |||||||
Breyibacterium | ammoniagenes - | 19356 | |||||||
Breyibacterium | ammoniagenes | 21055 | |||||||
Breyibacterium | ammoniagenes. | 21077 | |||||||
Breyibacterium | ammoniagenes | 21553 | |||||||
Breyibactermm | ammoniagenes | 21580 | |||||||
Breyibacterium | ammoniagenes | 39101 | |||||||
Breyibacterium. | butenicum | 21196 | |||||||
Breyibacterium | diyarfcatan. | 21792 | P928 | ||||||
Breyibacterima | flarom . ... | 21474 | |||||||
Breyibacterium | flarom | ·, 21129 | |||||||
Breyibacterium | fimim ' | 21518 . | |||||||
Breyibacterium | flayiStn | BI 1474 | |||||||
Breyibacterium | flarom | BI 1472 | |||||||
Brevibacterium | flarom | 21127 | |||||||
Breyibacterium | flarom | 21.128 | |||||||
Breyibacterium | flarom . . | 21427 . | |||||||
Breyibacterium | flayttoa | 21475 . | |||||||
Breyibacterium' | flarom ' | 21517 ’ | |||||||
Breyibacterium | flayiim , | 21528 | |||||||
Breyibacterium | flarom | 21529 | |||||||
Breyibacterium · | flarom | B11477 | |||||||
Breyibacterium | flarom | BI1478 | |||||||
Breyibacterium | flayiim | 21127 | |||||||
Brevibacterińm | flarom | BI1474 | |||||||
Breyibacterium | healil . | 15527 | |||||||
Breyibacterium | ketoglntamicum | . 21004 | |||||||
Breyibacterium | ketogiutamicum. | 21089 | |||||||
Breyibacterium | kefosoreduettim | 21914 | |||||||
Breyibacterium . | iactofermentum | 70 | |||||||
Breyibacterium | Iactofermentum - | 74 | |||||||
Breyibacterium | Iactofermentum . | 77 | |||||||
Breyibacterium ' | Iactofermentum | . 21798 | |||||||
Breyibacterium | Iactofermentum | ’ 21799 | |||||||
Breyibacterium | iactofermentum | 21800- | |||||||
Breyibacterium | iactofonnenfhtn. | 21801 | |||||||
Breyibacterium | lactofennentutn | .BI 1470 | |||||||
Breyibacterium ' | Iactofermentum | B11471 | |||||||
Breyibacterium | Iactofermentum | 21086 | |||||||
Breyibacterium | laćtoźsrinęntuni | 21420 |
PL 195 942 B1
Tablica 3 (cd.)
Breyibacienum | łactofermentum | 21086 | |||||||
BTevibacterium | łactofermentum ' | 31269 | |||||||
Brevibaćterium | linens ' | 9174 | |||||||
Breńbacterium | linens | 19391 . | |||||||
Breyibacterium ,, | linens | 8377 | |||||||
Breyibacterium | paraffinolyticum | .11160 . | |||||||
Brsvibacterium - | spec. ł | 717.73 | |||||||
Breyibacterium | spec.- | 717.73 | |||||||
Breyibacterium . | Sp«C. | 14604 | |||||||
Breribacteriusn . | spec. . | 21860 | |||||||
Brevibacteriinn | spec. | 21864 | |||||||
Breyibacieriuia · | spec. | 21265 | 1 | ||||||
BreYibacteriuci, | spec. - | 21866 | |||||||
Breyibacterium ' | spec. | 19240 | |||||||
Corynebacterium | acetoacidophilutn ·. | 21476 | |||||||
Corynebacterium | acetoacidophilum | 13870 | —--- | ||||||
Corynebacterium | aceto glutamicum | Β11473 | |||||||
Corynebacterium' | aeetogjutamicom | BI 1475 | |||||||
Corynebacterium | acetoglutamicum | 15806 | |||||||
Corynebacterium, . | acetoglutarhifcnm | 21491 . | |||||||
Corynebacterium · | aceioglutamicute | 31270 | |||||||
Corynebacterium | acetóphihun . | B3671 | |||||||
Corynebacterium | antaoniagenes | 6872 | 2399 | ||||||
Coryaebaeterinm ·, | amanomagenes | 15511 | |||||||
Corynefeacteriiffii | firjiókense | 21496 | |||||||
Corynebacterium . | glutamicum . | 14067 ' | |||||||
Corynebacterium | glutamicum . . | 39137 | |||||||
Corynebacterium. | gluiHmićtuiL | . 21254 | |||||||
Corynebacterium | giutamicum . | 21255. | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | .31830 . | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 13032 | |||||||
Corynebacterium. | ghrtamictim | 14305 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | Ϊ 5455 | |||||||
Corynebacterium | gliitfanicum | . 13058 | |||||||
Cotynebacteriam | glutamicum | 13059 | |||||||
Corynebacterium | ghitamicum | 13060 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum. | 21492 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 21513 | |||||||
Corynebacterium | glutemicuni . | 21526 | |||||||
Corynebacterium | ghitamicum | 21543 | |||||||
Corynebacterium | gl ut and cum | 13287 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum . | 21851 | |||||||
Corynebacterium | gjutaitiicutn | 21253. | |||||||
Coiyhebacierium | glutamicum | 21514 | |||||||
Corynebacterium | ghitamicum | 21516 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 21299 | |||||||
Corynebacterium . | glutamicum | 21300 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 39684 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 21488 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 21649 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 21650 |
PL 195 942 B1
Tablica 3 (cd.)
Corynebacteriuni | glutamicuoL . ' | 19223 ' | |||||||
Coiynebacterium | glutamicum | 13869 | |||||||
Coiynebacterium | glutamicum - | 21157 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 21158 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 21159 | |||||||
Corynebacterium | glutamicnm | . 21355 | |||||||
Coiynebacteriura | glutamicum | 31808 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum ’ | ' 21674 | |||||||
Corynebacferiita | ghitamicum | 21562 .. | |||||||
Corynebacterium | glutamicum . | 21563 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 21564 | ! ! | ||||||
Corynebacterium | glutamicum . | 21565 | |||||||
Coiynebacterium | ghitajłiićum | 21566 | |||||||
Corynebacterium | ghitartiiemn | 21567 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 21568 | |||||||
Coiynebacterium | glutamicum | 21569 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 21570' | |||||||
Corynebacterium | glutaiaicum . | 21571 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 21572 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 21573 | - | ||||||
Coiynebacterium | glutamicum ' | 21579 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum : | 19049 | |||||||
Corynebacteriuni | glutamicum . | 19050 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum . | 19051 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 19052 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 19053 | |||||||
Coryncbacterium | glutamicum | 19054 | |||||||
Corynebacteriuni | glutamicum | 19055 . | |||||||
Corynebacterium . | glutamicum | 19056 | |||||||
Coiynebacterium | glutarmcufli | 19057 | |||||||
Coiyneb acterium | glutamicum ' | 19058 | |||||||
Coiynebacterium | glutamicum . | 19059 | |||||||
Corynebacteriuni | glutamicum | 19060 | |||||||
Coiynebacterium | glutamicum | 19185 | |||||||
Corynebacteriuni | glutamicum | 13286. | |||||||
Coiynebacterium | glutamicum | 21515 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | 21527 | |||||||
Corynebacteriuni | glutamicum | 21544 | |||||||
Corynebacteriuni | glutamicum | 21492 | |||||||
Corynebacteriuni | glutamicum | B8183 | |||||||
Corynebacterium | glutamicum | Β8182 | |||||||
Corynebacteriuni , | glutamicum | BJ2416 | |||||||
Corynebacterium | glutamictuii | B12417 | |||||||
Ccaynebacterium | glutsmtcuhi ' | B12418 | |||||||
Coiynebacterium . | glutamicum | BI1476 | |||||||
Corynebacteriuni ' | glutamicum | 21608 . | |||||||
Corynebacteriuni | liliuin . | PS73 | |||||||
Corynebacteriuni | nitrilophiius | 21419 | 11594 | ||||||
Coiynebacterium | spec. | P4445 | |||||||
Corynebacteriiun · | spec. | P4446 | |||||||
Coiynebacterium | spec. . | 31058 |
PL 195 942 B1
Tablica 3 (cd.)
CorynEbacterfen | spec. | 31089 | |||||||
Corynsbacterium | spec. | 31090 | |||||||
Corynebactefium | spec. | 31990 | |||||||
Corynebacterium | spec. | 31090 | |||||||
Ceryiłebacteriua. | spec. - | 15954 | 20145 | ||||||
Corynebacterium | spec. | 21857 | |||||||
Corynebacterium | spec. | 21852 | |||||||
Corynebacterium . | spec. | 21863 |
ATCC: AthericanType Cuiturc Coilcctioa, Rockvilk, MD, USA
FERM: Fermentation Research Iastłtute, Chiba, Japonia
NRRL: ARS Cultee Collection, Northern Regional Research Laboratay, Feeria, EL, USA
CECT: Coleceicn Espanold de Cultivos Tipo, Walencja, Hiszpania
NCfMB: National ColtectJorr of Industriał and Marinę Bacteria Ltd., Aberdeen, UK
CBS: CeatniaSbureau voor Schinraelcnltures, Baam, NL
NCTC: National CoEection of Type Culftsres, London, UK
DSMZ: Deutsche SanMnlung von Miktoorganisinen und Żellkulturęn, Braunsćhweig, Niemcy
Piśmiennictwo patrz. Sugawara; H. et al. (1993) World directory of collections of cultures of nticioorgarusnjs: Bacteria, fungi and yeasis (4* ώη), World federation for culture cbllectiosis world data center on microdrganisffls, Sarmatą, Japen. .
PL 195 942 B1
Tablica 4; Wygilrf przyrównania
DłagoSć Dostęp Mazwa trsfieah w GessBsuk % homaishii
PL 195 942 B1
Tablica 4 (cd.) rxa00152 1419 GB_BA1:?JiTCY277 38300 279701 Mycobacterium tuberculosis H37Rv complate genorne; segment Mycobacierjum 58,500 rxa00470 1392 GB_PL2:DCPCNAM 865 Χ62977 D.carola mRNAfor prolferating celi nucisar antigan (PCMA). Daucus carota 37,914 30-wrz-9&
PL 195 942 B1
Tablica 4 (c.<ł>
GB_PL2AC00B267 101644 ACOOS267 Arabidopsis Ihaiiana BAC F9M13from chromosomu IV near21,5 cM, Arabidopsis thaliana 36,153 27-kwi-99 proiease ATP-binding subuni! Clpx (clpX) gene, partial cds.
GB_BA2:AF013216 1.5742 AFO13216 WlyxOcoccus xanthus Dog (dog), isocitrate lyase (fcl), Mis (mis), Ufo Myxococcus ranihus 54,683 28-sty-98 (ufo), fumarate hydratasa (fhy), snd proteosoms major subunit (cipP) κ t
g.erses, complete cds;.and acyl-CoA oitidase (sco) gene, partial cds, .
PL 195 942 B1
Tablica. 4 (c.d.) rxaOO5S7 714 GB_BA1;M7V003 Θ3033 AL021246 Mycobacterium tuberculosis H37Rv complete genome; segment Mycobacferlum 42,090 17-cze-98
108/1S2. tuberculosis .
GB_BA1:CGBPHI16 962 Y12472 C.glulamicum DWA attachment siie bacteriophage Phi-16. Corynebacterium 40,000 OS-MAR-1993 rxaOO715 913 GB_EST30:AI547104 218 AIS47104 Vii15c01.y.1Slratagenemoussheart(#937316}MusmtKCuluscDNA Musmusculus 58,511 2&-kwi-99 ' clone !MAGE:102124&5', mRMA sequehce.
GB_EST17:AA636159 447 AA636159 vn15c01.r1 Strafagene mouse heart ;#93731S) Mus muscuius cDNA Mus musoulus 41,195 22-pa2-97 clone IMAGE:1021248 5', roRKA sequer.ce.
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
rxaO112O 1401 GBJ3A1:MTV00& 63(533 AL021245 Mycobacteriumtubsrcuiosis H37Rv complete genoms; segment Mycobactsriura 35,715 17-cze-S8
103/132. (uberculosis
GB_BA1:CAJ10321 S710 AJ010321 Caiilobacter-crescentuapartial tig gene and dpP, cicA, dpX, lon' Allobactercrescenius 53,31-1 O1-paź-93
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
124/162. tuberculosis
GET£ST21:C89252 587 G6S252 CB9252 Mouse early blastocyst cDHA Mus musculus.cDNA clone Musmusculus 37,219 28-maj-98
01B00061JC08, mRNAsequence. .
GB_EST14:AA423349 457 AA423340 ve39d04.ri Soares mouse mammary giand NbMMG Mus muscuius Mttó muscuius 38,377 l6-paź-97 cDNA clone IMAGE:820519 5, mRNA seguence.
PL 195 942 B1
Tablica 4fa<Ł) rxa01849 1224 GB_BA1:MTCY24A1 20270 Z95207 Myeobacierium tuberculosis H37Rv complete genoms; segment Mycobacterium 39,950 1 7-cz.e-98
124/162. tuberculosis '
GB_J3A2:RCPHSYNG 45859' Z11165 .R.capsulatus cwnpteta photosynthesls gene cluster. Rhodobaetar capsulatus 37,344 O2-'ivrz-39
! s
8
T-' Vo o
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
MmcY (mmcY) gsnes, comptete cds; and unknown gi ' Tablica 4 (c-d.) rxs02477 744 GB_HTG4AC010054 130191 AC010054 Drosophila melanagaslerchroiriasofne 3L/74E2 clone RPCI98- Drosophila melanogaster' 37,463 16-paź-99
15E10,SEOUENCiNG IN PROGRESS ***, 70 unordered piecas.
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
PL 195 942 B1
P r z y k ł a d 1: Przygotowanie całkowitego genomowego DNA Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Hodowla Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) wzrastała przez noc w 30°C w warunkach wytrząsania w pożywce BHI (Difco). Komórki zbierano poprzez wirowanie, supernatant usuwano, komórki zawieszono w 5 ml buforu I (5% pierwotnej objętości hodowli wszystkie przedstawione objętości przeliczono na 100 ml objętości hodowlanej). Skład buforu I: sacharoza w stężeniu 140,4 g/l, 2,6 g/l MgSO4 x 7H2O, roztwór KH2PO4 10 ml/l (100 g/l o pH 6,7 ustawionym za pomocą KOH), zagęszczone M12 50ml/l (10 g/l (NH4)2SO4, 1 g/l NaCl, 2 g/l MgSO4 x 7H2O, 0,2 g/l CaCl2, 0,5 g/l ekstraktu drożdżowego (Difco), 10 ml/l mieszaniny mikroelementów (200 mg/l FeSO4, x H2O, 10 mg/l ZnSO4 x 7H2O, 3 mg/l MnCl2 x 4H2O, 30 mg/l H3BO3, 20 mg/l CoCl2 x 6H20, 1 mg/l NiCl2 x 6H2O, 3 mg/l Na2MoO4 x 2H2O, 500 mg/l czynnika kompleksotwórczego (EDTA lub kwas cytrynianowy), 100 ml/l mieszaniny witamin (0,2 mg/l biotyny, 0,2 mg/l kwasu foliowego, 20 mg/l kwasu p-amino-benzoesowego, 20 mg/l ryboflawiny, 40 mg/l pantotenianu wapnia, 140 mg/l kwasu nikotynowego, 40 mg/l chlorowodoru pirydoksolu, 200 mg/l mioinozytolu). Do zawiesiny dodano lizozymu o końcowym stężeniu 2,5 mg/ml. Po około 4 godzinach inkubacji w 37°C trawiono ściany komórkowe, a otrzymane protoplasty zbierano przez wirowanie. Osad protoplastów przemywano jeden raz 5 ml buforu I i jeden raz 5 ml buforu TE (10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 8). Osad zawieszano w 4ml buforu TE i dodawano 0,5 ml roztworu SDS (10%) i 0,5 ml roztworu NaCl (5M). Po dodaniu proteinazy K o końcowym stężeniu 200 mg/ml zawiesinę inkubowano około 18 godz. w 37°C. DNA oczyszczano poprzez ekstrakcję fenolem, mieszaniną fenol:chloroform:alkohol izoamylowy i chloroform-alkohol izoamylowy stosując standardowe procedury. Następnie DNA wytrącano poprzez dodanie 1/50 objętości octanu sodu 3M i 2 objętości etanolu, a następnie 30 min. inkubację w -20°C oraz wirowanie przez 30 min przy 12000 obr./min w wysokoobrotowej wirówce przy użyciu rotora SS34 (Sorvall). DNA zawieszano w 1 ml buforu TE zawierającego 20 mg/ml RNAzy A i dializowano w 4°C względem 1000 ml buforu TE przez co najmniej 3 godz. Podczas tego czasu trzykrotnie wymieniano bufor. Do objętości 0,4 ml zdializowanego roztworu DNA dodano 0,4 ml 2M LiCl i 0,8 ml etanolu. Po 30 min inkubacji w -20°C DNA zbierano poprzez wirowanie (13000 obr./min, Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau, Germany). Osad DNA zawieszano w buforze TE. DNA przygotowane z zastosowaniem tej procedury można wykorzystać do wszystkich celów, włączając hybrydyzację Southern lub tworzenie bibliotek genomowych.
P r z y k ł a d 2: Konstruowanie bibliotek genomowych Corynebacterium glutamicum ATCC13032 w Escherichia coli.
Za pomocą DNA przygotowanego wg opisu w Przykładzie 1 konstruowano plazmidowe oraz kosmidowe biblioteki zgodnie ze znanymi i ustalonymi metodami (patrz np. Sambrook, J. i wsp. (1989) „Molecular Cloning: A Labolatory Manual”, Cold Spring Harbor Labolatory Press, lub Ausubel, F.M. i wsp. (1994) „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley &Sons.) Wykorzystany mógł być jakikolwiek plazmid lub kosmid. Szczególnie przydatny był plazmid pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol 134:1141-1156), plazmidy serii pBS (pBSSK+, pBSSK- i inne; Stratagene, LaJolla, USA) lub kosmidy takie jak SuperCos1 (Stratagene, LaJolla, USA) czy Lorist6 (Gibson, T.J. Rosenthal, A. Waterson, R.H. (1987) Gene 53: 283-286). Biblioteki genowe szczególnie przydatne u C.glutamicum można skonstruować za pomocą plazmidu pSL109 (Lee, H.-S. i Sinskey, A.J. (1994) J. Microbiol. Biotechnol. 4:256-263).
P r z y k ł a d 3: Sekwencjonowanie i rachunkowa analiza funkcjonalna
Do sekwencjonowania DNA wykorzystano biblioteki genomowe opisane w Przykładzie 2 z zastosowaniem standardowych metod, szczególnie metody terminacji łańcucha przy użyciu maszyny sekwencyjnej ABI377 (patrz np. Fleischman, R.D. i wsp. (1995) „Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd.”, Science, 269:496-512). Użyto starterów sekwencyjnych o następującej sekwencji nukleotydowej:
5'-GGAAACAGTATGACCATG-3' lub 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'.
P r z y k ł a d 4: Mutageneza in vivo
Mutagenezę in vivo Corynebacterium glutamicum przeprowadzić można poprzez pasażowanie DNA plazmidów (lub innych wektorów) w E.coli bądź innym mikroorganizmie (np. Bacillus ssp. lub w drożdżach takich jak Saccharomyces cerevisiae), który ma osłabione zdolności utrzymania integralności swojej informacji genetycznej. Typowe szczepy mutatorowe posiadają mutacje w genach układu naprawy DNA (np. mutHLS, mutD, mutT i in.; piśmiennictwo patrz. Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, p2277-2294, ASM; Washington). Szczepy te są dobrze znane specjalistom. Wykorzystanie takich szczepów zobrazowano na przykład w Greener, A. i Callahan, M. (1994) Strategies 7:32-34.
PL 195 942 B1
P r zyk ł a d 5: Transfer DNA pomiędzy Escherichia coli i Corynebacterum glutamicum
Kilka gatunków Corynebacterium i Brevibacterum zawiera plazmidy endogenne (jak np. pHM1519 czy pBL1), które ulegają autonomicznej replikacji (patrz. Martin, J.F. i wsp. (1987) Biotechnology, 5:137-146). Wektory wahadłowe dla Escherichia coli i Corynebacterium glutamicum można z łatwością skonstruować za pomocą standardowych wektorów dla E.coli (Sambrook, J. i wsp. (1989) „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Labolatory Press, lub Ausubel, F.M. i wsp. (1994) „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley &Sons), do których dodano miejsce początku replikacji oraz odpowiedni marker pochodzący z Corynebacterium glutamicum. Takie miejsca początku replikacji pochodzą w szczególności z endogennych plazmidów wyizolowanych z gatunków Corynebacterium i Brevibacterum. Jako markery transformacyjne dla tych gatunków w szczególności przydatne są geny oporności na kanamycynę (takie, jak dostarczane z transpozonów Tn5 lub Tn903) lub na chloramfenikol (Winnacker, E.L. (1987) „From Genes to Clones - Introduction to Gene Technoloogy”, VCH, Weinheim). W literaturze istnieje wiele przykładów na konstruowanie rozmaitych wektorów wahadłowych ulegających replikacji zarówno w E.coli jak i w C.glutamicum i które mogą być zastosowane do wielu celów włącznie z nadekspresją genów (patrz np. Yoshihama, M. i wsp. (1985) J.Bacteriol. 162:591-597, Matrin, J.F. i wsp. (1987) Biotechnology, 5:137-146 i Eikmanns, B.J. i wsp. (1991) Gene, 102:93-98).
Wykorzystując standardowe metody, można klonować dane geny do jednego z opisanych wyżej wektorów wahadłowych i wprowadzić takie hybrydowe wektorydo szczepów Corynebacteium glutamicum. Tranformację C.glutamicum można osiągnąć poprzez transformację protoplastów (Kastsumata, R. i wsp. (1984) J.Bacteriol. 159:306-311), elektroporację, (Liebl, E. i wsp. (1989) FEMS Microbiol. Letters,
53:299-303), a w przypadku zastosowania specjalnych wektorów także poprzez koniugację (jak opisano np. w Schafer, A. i wsp. (1990) J.Bacteriol. 172:1663-1666). Możliwe jest także przeniesienie wektora wahadłowego dla C.glutamicum do E.coli poprzez uzyskanie plazmidowego DNA z C.glutamicum (z zastosowaniem dobrze znanych w nauce standardowych metod) i transformację do E.coli. Etap transformacji można przeprowadzić za pomocą metod standardowych, wskazanym jest jednak wykorzystanie szczepu E.coli z uszkodzonym Mcr, takiego jak NM522 (Gough & Murray (1983) J.Mol. Biol 166:1-19).
Nadekspresję genów mogą uzyskać w szczepach C.glutamicum za pomocą plazmidów zawierających pCG1 (patent USA nr 4,617,267) lub jego fragmenty oraz ewentualnie genu oporności na kanamycynę pochodzącego z TN903 (Grindley, N.D. i Joyce, C.M. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(12):7176-7180). Dodatkowo, nadekspresję genów można uzyskać w szczepach C.glutamicum za pomocą plazmidu pSL109 (Lee, H.-S. i Sinskey, A.J. (1994) J.Microbiol. Biotechnol. 4:256-263).
Oprócz wykorzystania plazmidów replikatywnych, nadekspresją genów może także zostać osiągnięta na drodze integracji do genomu. Integrację do genomu u C.glutamicum lub innych gatunków Corynebacterium bądź Brevibacterium można osiągnąć znanymi metodami, takimi jak rekombinacja homologiczna z rejonami (rejonem) genomowymi, integracja z użyciem endonukleaz restrykcyjnych (REMI) (patrz np. DE Patent 19823834) lub poprzez zastosowanie transpozonów. Możliwa jest także modulacja aktywności danego genu na drodze modyfikacji rejonów regulatorowych (np. promotora, represora i/lub wzmacniacza) poprzez modyfikację sekwencji, insercję lub delecję z zastosowaniem metod typu site-directed (np. rekombinacji homologicznej) lub metod opartych na zdarzeniach losowych (takich jak mutageneza transpozonowa lub REMI). Sekwencje kwasu nukleinowego będące terminatorami transkrypcji mogą zostać także wprowadzone na koniec 3' rejonu kodującego jednego lub więcej genów według wynalazku; terminatory takie są dobrze znane w nauce i zostały opisane np. w Winnacker, E.L. (1987) From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology. VCH: Weinheim.
P r zyk ł a d 6: Ocena ekspresji zmutowanego białka
Obserwacje aktywności zmutowanego białka w stransformowanych komórkach gospodarza opierają się na fakcie, że zmutowane białko ulega ekspresji w podobny sposób i w podobnej ilości do białka typu dzikiego. Użyteczną metodą określania poziomu transkrypcji zmutowanego genu (wskaźnik ilości mRNA dostępnego dla translacji) jest hybrydyzacja typu Northern (referencje patrz np. Ausubel i wsp.(1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York), w której po ekstrakcji całkowitego RNA z hodowli organizmu, rozdziale na żelu, przeniesieniu na filtr i inkubacji z sondą, wyznakowaną znacznikiem (przeważnie radioaktywnym lub chemiluminescencyjnym), łączącą się do danego genu, przyłączanie sondy i jakość tego łączenia określa obecność, a także ilość mRNA danego genu. Taka informacja określa stopień transkrypcji zmutowanego genu. Całkowite komórkowe RNA można otrzymać z Corynobacterium glutamicum kilkoma metodami, znanymi w technice, np. metoda opisana w Bormann, E.R. i wsp. (1992) Mol. Microbiol. 6:317-326.
PL 195 942 B1
Do określania obecności lub względnej ilości białka uzyskanego po translacji tego mRNA, można zastosować standardowe techniki, takie jak hybrydyzacja typu Western (patrz np. Ausubel i wsp.(1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). W tej procedurze wszystkie wyekstrahowane białka komórkowe rozdziela się poprzez elektroforezę w żelu, przenosi na filtr taki jak nitroceluloza i inkubuje z sondą taką jak przeciwciało, które specyficznie łączy się z danym białkiem. Sonda jest przeważnie wyznakowana znacznikiem chemiluminescencyjnym lub kolorymetrycznym, który można z łatwością wykryć. Obecność i ilość obserwowanego znacznika wskazuje na obecność i ilość pożądanego zmutowanego białka znajdującego się w komórce.
P r z y k ł a d 7: Hodowla genetycznie zmodyfikowanego Corynobacterium glutamicum - pożywki i warunki hodowli
Genetycznie zmodyfikowane komórki Corynobacteria hodowane są w syntetycznych lub naturalnych pożywkach. Wiele różnych pożywek hodowlanych dla Corynobacteria jest dobrze znanych i łatwo dostępnych (Lieb i wsp. (1989) Appl. Miocrobiol. Biotechnol., 32:205-210; von der Osten i wsp. (1998) Biotechnology Letters, 11:11-16; Patent DE 4,120,867; Lieb (1992) „The Genus Corynobacterium, The Procariotes tom II, Balows, A. i wsp. wyd. Springer- Verlag). Pożywki te zawierają jedno lub więcej źródeł węgla, źródło azotu, sole nieorganiczne, witaminy i mikroelementy. Korzystnym źródłem węgla są cukry takie jak modo-, di- i polisacharydy. Na przykład dobrymi źródłami węgla są glukoza, fruktoza, mannoza, galaktoza, ryboza, sorboza, rybuloza, laktoza, maltoza, sacharoza, rafmoza, skrobia lub celuloza. Można także dostarczać cukier do pożywki poprzez związki złożone takie jak melasa i inne produkty uboczne rafinacji cukru. Dostarczanie mieszaniny różnych źródeł węgla może także być korzystne. Innymi możliwymi źródłami węgla są alkohole, kwasy organiczne takie jak metanol, etanol, kwas octowy czy kwas mlekowy. Źródłami azotu są zazwyczaj organiczne i nieorganiczne związki azotu lub surowce zawierające takie związki. Przykładowe źródła azotu obejmują amoniak lub sole amonowe takie jak NH4Cl lub (NH4)2SO4 NK4 OH, azotany, mocznik, aminokwasy lub złożone związki azotowe takie jak roztwór z maceracji zboża, mąka sojowa, białko sojowe, ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny i inne. Związki soli nieorganicznych mogące wchodzić w skład pożywki obejmują chlorki, fosforany lub siarczany wapnia, magnezu, sodu, kobaltu, molibdenu, potasu, manganu, cynku, miedzi lub żelaza. W celu utrzymania jonów metali w roztworze do pożywki mogą być dodane związki chelatujące. Szczególnie użyteczne związki chelatujące obejmują dihydroksyfenole, takie jak katechol, protokatechuaniany lub kwasy organiczne, takie jak kwas cytrynowy. Pożywki zawierają także inne czynniki wzrostowe takie jak witaminy lub promotory wzrostu, na przykłady biotyna, ryboflawina, tiamina, kwas foliowy, kwas nikotynowy, pantotenian i pirydoksyna. Czynniki wzrostowe i sole często pochodzą ze złożonych związków pożywki takich jak ekstrakt drożdżowy, melasa, roztwór z maceracji zboża i inne. Właściwy skład pożywki zależy w dużym stopniu od eksperymentu i jest indywidualnie dobierany w każdym przypadku. Informacje o optymalizacji pożywek są dostępne w książce :Applied Microbiol Physiology, Apractical Approach (wyd. P,M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) 53-73, ISBN 019 963577 3). Można także wybrać pożywkę proponowaną przez hanglowych dostawców np. standard 1 (Merck) lub BHI (wyciąg z serca, Difco) i inne.
Wszystkie składniki pożywki są sterylizowane bądź w wysokiej temperaturze (20 min., 1.5bar, 121°C) bądź poprzez filtrację. Związki mogą być sterylizowane razem lub jeżeli jest to konieczne oddzielnie. Pożywka może zawierać wszystkie składniki od momentu rozpoczęcia hodowli lub mogą być one, stosownie do potrzeb, dodawane w sposób ciągły bądź partiami już w trakcie trwania hodowli.
Warunki hodowli są określane oddzielnie dla każdego eksperymentu. Temperatura powinna mieścić się w przedziale 15-45°C. Może być ona utrzymywana stale na tym samym poziomie lub zmieniana w trakcie eksperymentu. pH pożywki powinno znajdować się w przedziale 5-8,5, najlepiej jeśli wynosi około 7,0, a utrzymywane może być poprzez dodawanie do pożywki buforów. Przykładowy bufor przydatny do tego celu, to bufor fosforanowy. Zamiennie bądź równocześnie mogą być używane syntetyczne bufory takie jak MOPS, HEPES, ACES i inne. Utrzymywanie stałego pH hodowli możliwe jest także poprzez dodawanie NaOH lub NT4OH podczas jej wzrostu. Jeśli wykorzystywane są składniki pożywek złożonych, takie jak ekstrakt drożdżowy, zmniejsza to konieczność stosowania dodatkowych buforów, a wynika to z faktu, że wiele związków złożonych ma wysokie zdolności buforowe. W przypadku, gdy do hodowli mikroorganizmów stosowane są fermentory, pH można kontrolować za pomocą gazowego amoniaku.
Czas inkubacji zazwyczaj zawiera się. w przedziale od kilku godzin do kilku dni. Jest on dobierany tak, aby umożliwić uzyskanie maksymalnej ilości produktu w pożywce. Do przedstawionych doświadczeń hodowlanych można stosować rozmaite naczynia, takie jak płytki do mikromianowania, szklane probówki, szklane kolby oraz szklane lub metalowe fermentory o różnych rozmiarach. Aby
PL 195 942 B1 umożliwić przegląd dużej liczby kolonii, mikroorganizmy powinny być hodowane na płytkach do mikromianowania, w szklanych probówkach bądź w kolbach do wytrząsania zawierających lub nie, przegrody. Korzystnie stosowane są 100 ml kolby do wytrząsania, wypełnione żądaną pożywką hodowlaną o stężeniu 10% (objętości). Kolby powinny być wytrząsane w rotacyjnej wytrząsarce (amplituda 25 mm) z zastosowaniem prędkości w granicach 100-300 obr./min. Straty powstałe w wyniku parowania można obniżyć poprzez utrzymywanie odpowiedniej wilgotności, w przeciwnym razie powinno się stosować matematyczną korekcję strat powstałych w wyniku parowania.
W przypadku testowania genetycznie zmodyfikowanych klonów, powinno się także testować niezmodyfikowany klon kontrolny lub klon kontrolny zawierający pierwotny plazmid bez wstawki. Hodowla prowadzona jest do uzyskania OD w granicach 0,5-1,5 z użyciem inkubowanych w 30°C komórek rosnących na szalkach takich jak szalki CM (10 g/l glukozy, 2,5 g/l NaCl, 2g/lmocznika, 10g/l polipeptonu, 5g/l ekstraktu drożdżowego, 5g/lekstraktu mięsnego, 22g/l agaru, pH 6,8 doprowadzone za pomocą 2M NaOH). Pożywki szczepiona jest zawieszonymi w roztworze fizjologicznym komórkami C.glutamicum z szalek CM lub poprzez dodanie płynnej pre-hodowli tej bakterii.
Przykład 8: Analiza in vitro funkcji zmutowanych białek Metody oznaczania aktywności i parametrów kinetycznych enzymów są ustalone i wystandaryzowanie. Eksperymenty mające na celu określenie aktywności jakiegokolwiek zmodyfikowanego enzymu muszą być dopasowane do specyficznej aktywności enzymu niezmutowanego, co jest dobrze znane w nauce. Przeglądy ogólnych wiadomości o enzymach jak również o specyficznych detalach dotyczących ich struktury, kinetyki, zasad działania, metod, aplikacji i przykładów ustalania wielu aktywności enzymatycznych, można znaleźć np. w następujących referencjach: Dixson, M., Webb, E.C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersth, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanism. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D. wyd., (1983) The Enzymes, wyd. III. Academic Press: New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, wyd. II. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Graal, M., wyd. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, wyd. III., tom I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; Ullmann, Encyklopedia of Industrial Chemistry (1987) tom. A9, „Enzymes. VCH: Weinheim, str. 352-363.
Aktywność białek łączących się z DNA można mierzyć za pomocą kilku ustalonych metod, takich jak test spowolnienia migracji w żelu (zwany także retardacją żelową). Wpływ takich białek na ekspresję innych cząsteczek mierzyć można przy zastosowaniu testów genu reporterowego (takich, jak opisane w Kolmar, H. i wsp. (1995) EMBO J. 14:3895-3904 i cytowane tam piśmiennictwo). Układy oznaczeń genu reporterowego są dobrze znane i ustalone dla zastosowań zarówno w komórkach pro-, jak i eukariotycznych, a wykorzystuje się do nich takie enzymy, jak beta-galaktozydaza, białko o zielonej fluorescencji (GFP) i kilka innych.
Określenie aktywności białek transportu błonowego można przeprowadzić według takich technik, jak opisane w Gennis, R.B. (1989) „Pores, Channels and Transporters” w Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidlberg, 85-137; 199-234 i270-322.
Przykład 9: Analiza wpływu zmutowanego białka na produkcję żądanego produktu
Wpływ modyfikacji genetycznej na produkcję pożądanego składnika (takiego jak aminokwas) u C.glutamicum można ocenić hodując zmodyfikowany mikroorganizm w odpowiednich warunkach (takich jak opisane powyżej) i analizując pożywkę i/lub elementy komórkowe pod względem zwiększonej produkcji pożądanego składnika (tj. aminokwasu). Takie techniki analizy są dobrze znane specjalistom, a obejmują spektroskopię, chromatografię cienkowarstwową, rozmaite metody znakowania, metody enzymatyczne i mikrobiologiczne czy chromatografię analityczną, jak wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) (patrz np. Ullman, Encyklopedia of Industrial Chemistry (1985) tom A2, str. 89-90 i 443-613, VCH: Weinheim; Fallon, A. i wsp. (1987) „Applications of HPLC in Biochemistry” Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, tom 17; Rehm i wsp. (1993) Biotechnology, tom 3, rozdział III: „Product recovery and purification” 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. i wsp. (1988) Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley & Sons; Kennedy, J.F. Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological matrials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. i Henry, J.D. (1988) Biochemical separations, Ullman^s Encyklopedia of Industrial Chemistry (1987) tom B3, rozdział 11, str. 1-27, VCH: Weinheim; oraz Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Oprócz pomiaru końcowego produktu fermentacji, możliwa jest także analiza innych składników szlaków metabolicznych wykorzystywanych przy produkcji żądanego składnika, takich jak składniki pośrednie i produkty uboczne w celu określenia całkowitej wydajności organizmu, wydajności i/lub efektywności produkcji danego składnika. Metody analizy obejmują pomiar poziomu składników od88
PL 195 942 B1 żywczych w pożywce (np. cukrów, węglowodanów, źródeł azotu, fosforanów i innych jonów), pomiar składników biomasy i jej wzrostu, analizę produkcji pospolitych metabolitów szlaków biosyntetycznych oraz pomiar gazów produkowanych podczas fermentacji. Standardowe metody pomiarów wyszczególnione są w Applied Microbial Physiology, A Practical Approach, Rhodes, P.M. i Stanbury, P.F. wyd., IRL Press, str. 103-129; 131-163 i 165-192 (ISBN 0199635773 ) i piśmiennictwie tam cytowanym.
P r z y k ł a d 10: Oczyszczanie pożądanego produktu z hodowli C.glutamicum
Pozyskiwanie żądanego produktu z komórek C.glutamicum lub z supernatantu opisanej powyżej hodowli przeprowadzić można stosując rozmaite, dobrze znane w nauce, metody. Jeżeli pożądany produkt nie jest wydzielany z komórek, mogą być one zebrane z hodowli poprzez wirowanie o niskiej prędkości, a komórki mogą być poddane lizie za pomocą standardowych technik takich, jak oddziaływanie mechaniczne lub sonikacja. Osad komórkowy usuwany jest przez wirowanie, a supernatant zawierający rozpuszczone białka odzyskuje się do dalszego oczyszczania żądanego składnika. Jeżeli produkt jest z komórek C.glutamicum wydzielany, komórki poddaje się wirowaniu, a frakcja supernatantu jest przeznaczana do dalszego oczyszczania.
Niezależnie od metody oczyszczania, supernatant poddawany jest chromatografii na odpowiednim złożu, na którym pożądana cząsteczka zostaje związana, zaś wiele spośród zanieczyszczeń znajdujących się w próbce - nie, bądź na którym wiązane są zanieczyszczenia, zaś pożądane cząsteczki - nie. Etapy chromatografii mogą być w razie konieczności powtórzone z wykorzystaniem tego samego lub innego złoża. Specjaliści będą zorientowani w wyborze odpowiednich złóż chromatograficznych i ich skutecznych zastosowaniach przy oczyszczaniu danej cząsteczki. Oczyszczony produkt może być zagęszczony poprzez filtrację lub ultrafiltrację, i przechowywany w temperaturze zapewniającej jego maksymalną stabilność.
Jest wiele metod oczyszczania znanych w nauce i nie należy ograniczać się do metody przedstawionej powyżej. Takie techniki oczyszczania są na przykład opisane w Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw- Hill: New York (1986).
Identyfikacja i czystość wyizolowanych związków może zostać oszacowana za pomocą standardowych technik. Obejmują one wysokociśnieniową chromatografię cieczową (HPLC), metody spektroskopowe, metody znakowania, chromatografię cienkowarstwową, NIRS, oznaczenie enzymatyczne bądź mikrobiologiczne. Przegląd wymienionych metody analitycznych zamieszczony jest w Patek i wsp. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova i wsp. (1996) Biotekhnologiya 11:27-32; oraz Schmidt i wsp. (1988) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullman^s Encyklopedia of Industrial Chemistry (1996) tom A27, VCH: Weinheim, str. 89-90, 521-540, 540-547, 559-566, 575-581 i 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Patchways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Fallon, A. i wsp. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry w: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, tom 17.
Przykład 11: Analiza sekwencji genów według wynalazku
Porównywanie sekwencji i określanie procentowej homologii pomiędzy dwiema sekwencjami są technikami powszechnie znanymi i można je przeprowadzić za pomocą takich algorytmów matematycznych, jak algorytm Karlina i Altschula (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, zmodyfikowanych jak u Karlina i Altschula (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Taki algorytm jest załączony do programów NBLAST i XBLAST (wersja 2.0) Altschul i wsp. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. W celu ustalenia sekwencji homologicznych do cząsteczek kwasu nukleinowego HA według wynalazku poszukiwania nukleotydów w programie BLAST można przeprowadzić za pomocą programu NBLAST, wynik=100, długość słowa=12. W celu uzyskania sekwencji aminokwasowych homologicznych do cząsteczek białka HA według wynalazku poszukiwania białek w programie BLAST można przeprowadzić za pomocą programu XBLAST, wynik=50, długość słowa=3. W celu uzyskania przyrównań nieciągłych (gapped alignments) do celów porównawczych, użyć można programu Gapped BLAST według opisu Altschul i wsp. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. W wypadku stosowania programów BLAST i Gapped BLAST, wiadomym będzie jak optymalizować parametry programu(np. XBLAST i NBLAST) dla podlegającej analizie, specyficznej sekwencji.
Kolejnym przykładem matematycznego algorytmu stosowanego do porównywania sekwencji jest algorytm Meyersa i Millera ((1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17). Algorytm taki znajduje się w programie ALIGN (wersja 2,0), będącym częścią oprogramowania GCG do dopasowywania sekwencji. Przy wykorzystywaniu programu ALIGN do porównywania sekwencji aminokwasowych, można użyć Tablicy wagowej reszt PAM120, glp12, gp4. Dodatkowe algorytmy do analizy sekwencji są
PL 195 942 B1 znane w nauce i obejmują ADVANCE oraz ADAM opisane w Torelli i Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:3-5, a także FASTA opisany w Pearson i Lipman (1988) P.N.A.S. 85:2444-8.
Procent homologii pomiędzy dwiema sekwencjami aminokwasowymi można uzyskać za pomocą programu GAP w oprogramowaniu GCG (dostępnego na http:/www.gsg.com) stosując macierz Blosum 62 lub PAM250 oraz parametry gap weight 12, 10, 8, 6 lub 4 i lenght weight 2, 3,lub 4. Procent homologii pomiędzy dwiema sekwencjami nukleotydowymi można uzyskać przy użyciu programu GAP w oprogramowaniu GCG stosując standardowe parametry, takie jak gap weight 50 i lenght weight 3.
Analizę porównawczą sekwencji genowych według wynalazku z sekwencjami obecnymi w Genbank'u przeprowadzono z zastosowaniem technik dobrze znanych w nauce (patrz Bexevanis i Ouellette wyd. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. John Wiley and Sons: New York). Sekwencje genowe według wynalazku porównywano z sekwencjami obecnymi w Genbanku w trzy etapowym procesie. Na pierwszym etapie przeprowadzono analizę BLASTN (np. lokalną analizę przyrównań) dla każdej z sekwencji według wynalazku względem sekwencji nukleotydowych zawartych w Genbanku, a pierwszych 500 wyników poddano dalszej analizie. Następnie, wykorzystując tych 500 wyników przeprowadzono poszukiwanie FASTA (np. łączona lokalna i globalna analiza przyrównań, w której przyrównywane są określone rejony sekwencji). Każda sekwencja genowa według wynalazku była następnie globalnie przyrównywana do każdej z trzech pierwszych wyników FASTA za pomocą programu GAP z pakietu oprogramowania GCG (z zastosowaniem standardowych parametrów). W celu uzyskania właściwych wyników, długości sekwencji uzyskanych z Genbanku dostosowywano do długości badanych sekwencji za pomocą metod znanych w nauce. Wyniki tej analizy zostały zestawione w Tablicy 4. Otrzymane dane są identyczne z tymi, które uzyskano by dzięki samej globalnej analizie GAP przeprowadzonej na każdym spośród genów według wynalazku w porównaniu z każdym z odnośników w Genbanku, lecz wymagało znacznie mniej czasu obliczeniowego w porównaniu z analizą GAP o szerokiej bazie danych (analiza globalna). Sekwencje według wynalazku, dla których nie uzyskano przyrównań powyżej wartości granicznych wskazano wTablicy 4 nie umieszczając informacji o przyrównaniu. Dla specjalisty zrozumiałe jest, że procentowa homologia przyrównania GAP zestawiona w Tablicy 4 pod nagłówkiem „% homologii (GAP)” jest umieszczone w europejskim formacie numerycznym, gdzie „'” oznacza kropkę dziesiętną. Na przykład wartość „40,345” w tej kolumnie odpowiada 40,345%.
P r zyk ł a d 12: Budowa i działanie mikropaneli DNA
Sekwencje według wynalazku mogą dodatkowo posłużyć przy konstruowaniu i stosowaniu mikropaneli DNA (projekt, metodologia i wykorzystanie mikropaneli DNA są znane i opisane np. w Schena, M. i wsp. (1995) Science 270:467-470; Wodicka, L. (1997) Nature Biotechnology 15:1359-1367; DeSaizieu, A. i wsp. (1998) Naturę Biotechnology 16:45-48; DeRisi, J.L. i wsp. (1997) Science 278:680-686).
Mikropanele DNA są stałymi lub elastycznymi podstawkami, składającymi się z nitrocelulozy, nylonu, szkła, silikonu czy innych materiałów. Cząsteczki kwasu nukleinowego mogą w sposób pożądany przyczepiać się do ich powierzchni. Inne kwasy nukleinowe lub mieszaniny kwasów nukleinowych, po odpowiednim ich wyznakowaniu, mogą być poddane procesowi hybrydyzacji do unieruchomionych cząsteczek kwasu nukleinowego, przy czym wyznakowanie umożliwia monitorowanie i pomiar intensywności poszczególnych sygnałów zhybrydyzowanych cząsteczek w określonym rejonie. Ta metodologia pozwala na jednoczesne oznaczenie względnej lub całkowitej ilości wszystkich bądź wybranych kwasów nukleinowych w danej próbce kwasu nukleinowego lub mieszaninie. Mikropanele DNA umożliwiają więc analizę ekspresji bardzo wielu (nawet 6800 lub więcej) kwasów nukleinowych równocześnie (patrz np. Schena, M. (1996) BioEssays 18(5):427-431).
Sekwencje według wynalazku mogą być zastosowane do projektowania oligonukleotydowych starterów zdolnych do amplifikacji określonych rejonów jednego lub więcej genów C.glutamicum w reakcji amplifikacji kwasu nukleinowego, takiej jak reakcja łańcuchowa polimerazy. Wybór i projekt starterów oligonukleotydowych 5' lub 3' czy też odpowiednich łączników umożliwia kowalencyjne wiązanie się uzyskanych produktów PGR do powierzchni pożywki wspomagającej, opisanej powyżej (opisanej także np. w Schena, M. i wsp. (1995) Science 270:467-470).
Mikropanele kwasu nukleinowego mogą być także tworzone na drodze syntezy oligonukleotydówą in situ, jak to zostało opisane w Wodicka, L i wsp. (1997) Nature Biotechnology 15:1359-1367. Za pomocą metod fotolitograficznych precyzyjnie określone rejony matrycy poddawane są działaniu światła. Dochodzi do aktywacji fotolabimych grup ochronnych, które ulegają addycji nukleotydowej, podczas gdy rejony zakryte przed światłem nie podlegają żadnym modyfikacjom. Kolejne cykle ochrony i aktywacji światłem umożliwiają syntezę różnych oligonukleotydów w określonych pozycjach. Małe, określone rejony genów według wynalazku syntetyzować można na mikropanelach za pomocą syntezy oligonukleoty90
PL 195 942 B1 dów na stałym podłożu. Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku, obecne w próbce lub mieszaninie nukleotydów, mogą hybrydyzować do mikro szeregów. Takie cząsteczki kwasu nukleinowego można wyznakować z zastosowaniem standardowych metod. W skrócie, cząsteczki kwasu nukleinowego (np. cząsteczki mRNA lub DNA) znakowane są poprzez inkorporację izotopowo lub fluorescencyjnie wyznakowanych nukleotydów, np. w trakcie odwrotnej transkrypcji lub syzntezy DNA. Hybrydyzacja wyznakowanych kwasów nukleinowych do mikropaneli jest opisana (np. Schena, M. i wsp. (1995) j.w.; Wodicka, L. i wsp. (1997), j.w.; DeSaizieu, A. i wsp. (1998), j.w.). Wykrywanie i ilościowe oznaczanie zhybrydyzowanych cząsteczek jest dostosowane do specyficznego wyznakowania. Znakowanie radioaktywne może być wykryte, na przykład w sposób opisany w Schena, M. i wsp. (1995) j.w.), zaś znakowanie fluorescencyjne, na przykład za pomocą metody Shalon i wsp. (1996) Genome Research 6:639-645). Zastosowanie sekwencji według wynalazku w opisanej powyżej technologii mikropaneli DNA umożliwia analizę porównawczą różnych szczepów C.glutamicum lub innych Corynebacteria. Metody oparte na mikropanelach kwasu nukleinowego stanowią duże ułatwienie na przykład w badaniach wewnątrzszczepowej zmienności, wykorzystujących indywidualne profile transkrypcyjne oraz przy identyfikacji genów istotnych dla specyficznych i/lub pożądanych właściwości szczepu, takich jak patogenność, wydajność oraz odporność na stres. Wykorzystanie technologii paneli kwasu nukleinowego jest także możliwe do celów porównania profili ekspresji genów według wynalazku podczas przebiegu reakcji fermentacji.
Przykład 13: Analiza dynamiki populacji białek występujących w komórce (proteomika)
Geny, składniki oraz metody według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie w badaniach dotyczących interakcji i dynamiki populacji białek, określanych mianem proteomiki. Badane populacje białkowe obejmują (lecz nie ograniczają się do) całkowitą populację białek C.glutamicum (np. w porównaniu z populacją białek innego organizmu), białka aktywne w specyficznych warunkach środowiska lub metabolizmu (np. podczas fermentacji, wysokiej bądź niskiej temperatury, w warunkach wysokiego lub niskiego pH) czy też białka aktywne podczas specyficznych faz wzrostu i rozwoju.
Populacje białek mogą być analizowane z zastosowaniem rozmaitych dobrze znanych technik, jak np. elektroforeza żelowa. Białka komórkowe można uzyskać np. poprzez liżę lub ekstrakcję, a rozdzielić za pomocą różnorodnych technik elektroforetycznych. Metoda elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w obecności dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) rozdziela białka wykorzystując głównie różnice ich ciężaru cząsteczkowego. Metoda elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z ogniskowaniem izoelektrycznym (IEF-PAGE) do rozdziału białek wykorzystuje ich punkt izoelektryczny, (który odzwierciedla nie tylko sekwencję aminokwasową, ale także posttranslacyjne modyfikacje białka). Inna korzystna metoda analizy białkowej jest połączeniem IEF-PAGE z SDS-PAGE i jest znana jako elektroforeza żelowa dwuwymiarowa (opisana np. w Hermann i wsp. (1998) Electrophoresis 19:3217-3221; Fountoulakis i wsp. (1998) Elektrophoresis 19:1193-1202; Langen i wsp. (1997) Elektrophoresis 18:1184-1192; Antelmann i wsp. (1997) Elektrophoresis 18:1451-1463). Stosować można również inne dobrze znane techniki rozdziału białek, takie jak elektoroforeza w żelu kapilarnym.
Białka rozdzielone za pomocą tych metodologii mogą zostać uwidocznione za pomocą standardowych technik takich jak barwienie lub znakowanie. Do odpowiednich, wykorzystywanych w nauce barwników zalicza się Coomassie Brilliant Blue, barwienie srebrem lub barwnikami fluorescencyjnymi takim jak Sypro Ruby (Molecular Probes). Dodanie do pożywki z C.glutamicum radioaktywnie wyzna35 35 kowanych aminokwasów lub innych prekursorów białkowych (np. 35S-metioniny, 35S-cysteiny, amino14 15 15 15 + kwasów z wyznakowanym węglem 14C, 15N-aminokwasów, 15NO3 lub 15NH4+ lub aminokwasów z wyznakowanym węglem 13C) umożliwia w tych komórkach znakowanie białek poprzedzające ich wyodrębnienie. Podobnie wykorzystane mogą być znaczniki fluorescencyjne. Wyznakowane w ten sposób białka mogą być ekstrahowane, izolowane i rozdzielane według wcześniej opisanych metod.
Białka uwidocznione za pomocą tych technik mogą być dalej analizowane poprzez pomiar ilości użytego barwnika lub znacznika. Za pomocą metod optycznych można ustalić ilość danego białka i porównać ją z ilością innych białek w tym samym żelu lub w innych żelach. Porównywanie białek w żelach można przeprowadzić na zasadzie optycznego porównania, z zastosowaniem spektroskopii, punktowania obrazu i analizy żelu lub poprzez użycie klisz fotograficznych i ekranów. Takie techniki są dobrze znane w nauce.
Aby zidentyfikować dane białko można zastosować techniki bezpośredniego sekwencjonowania i inne na przykład sekwencjonowanie C- i/lub N- końcowych aminokwasów (takie jak degradacja
Edma^a), spektrometria mas (w szczególności techniki MALDI lub ESI (patrz Langen i wsp. (1997)
Elekrophoresis 18:1184-1192)) .
Sekwencje białkowe według wynalazku można wykorzystać do identyfikacji, za pomocą tych technik, białek C.glutamicum.
PL 195 942 B1
Informacja uzyskana z zastosowaniem tych metod może być wykorzystana do porównania wzorów obecności białek, aktywności, modyfikacji pomiędzy różnymi próbami pobranymi w różnorodnych biologicznie warunkach (np. różne organizmy, punkty czasowe fermentacji, składniki pożywki, biotopy). Dane uzyskane z takich eksperymentów, same lub w połączeniu z innymi technikami, mogą mieć różne zastosowania, np. do porównywania zachowań różnych organizmów w danej (np. metabolicznej) sytuacji, do wzrostu produktywności szczepów wytwarzających związki wysokowartościowe lub do wzrostu wydajności produkcji związków wysokowartościowych.
Specjaliści będą w stanie rozpoznać lub stwierdzić z użyciem jedynie rutynowych doświadczeń istnienie wielu odpowiedników opisanych tu specyficznych postaci wynalazku. Takie odpowiedniki są objęte następującymi zastrzeżeniami.
Claims (40)
1. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że obejmuje sekwencję podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencję do niej komplementarną.
2. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencję do niej komplementarną.
3.Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje naturalnie występującą odmianę alleliczną polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencję do niej komplementarną.
4. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencję do niej komplementarną.
5. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że koduje polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400 albo sekwencję do niej komplementarną.
6. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że zawiera fragment obejmującyco najmniej 15 sąsiadujących ze sobą nukleotydów o sekwencji nukleotydowej podanej na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399 albo sekwencję do niej komplementarną.
7. Izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, znamienna tym, że obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 1albo 2,albo 3,albo 4,albo 5,albo 6 i sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd heterologiczny.
8. Wektor znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 1 albo 2,albo 3,albo 4,albo 5,albo 6,albo 7.
9. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że jest wektorem ekspresyjnym.
10. Komórka gospodarza, znamienna tym, że jest transfekowana wektorem ekspresyjnym określonym w zastrz. 9.
11. Komórka gospodarza według zastrz. 10, znamienna tym, że jest komórką mikroorganizmu.
12. Komórka gospodarza według zastrz. 11, znamienna tym, że należy do rodzaju Corynebacteriumalbo Brevibacterium.
13. Komórka gospodarza według zastrz. 10, znamienna tym, że ekspresja cząsteczki kwasu nukleinowego powoduje modulację wytwarzania wysokowartościowych związków chemicznych przez komórkę.
14. Komórka gospodarza według zastrz. 13, znamienna tym, że wysoko wartościowy związek jest wybrany z grupy obejmującej: kwasy organiczne, aminokwasy wchodzące w skład białek i nie wchodzące w skład białek, zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy, nukleotydy, lipidy, nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe, diole, węglowodany, związki aromatyczne, witaminy, kofaktory, poliketydy i enzymy.
15.Sposób wytwarzania polipeptydu, znamienny tym,że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 10 w odpowiedniej pożywce w taki sposób, że wytwarza ona polipeptyd.
16. Izolowany połłpeptyd znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasowi podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400.
17.Izolowany polipeptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje heterologiczne sekwencje aminokwasowe.
18. Izolowany polipeptyd, znamienny tym, że obejmuje naturalnie występującą odmianę alleliczną polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400.
19.Izolowany polipeptyd według zastrz. 18, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje heterologiczne sekwencje aminokwasowe.
20. Izolowany połipeptyd, znamienny tym, że jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id.399.
21.Izolowany polipeptyd według zastrz. 20, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje heterologiczne sekwencje aminokwasowe.
PL 195 942 B1
22. Izolowany polipeptyd, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową, która jest w przynajmniej 50% identyczna z całą sekwencją nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id.400.
23. Izolowany polipeptyd według zastrz. 22, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje heterologiczne sekwencje aminokwasowe.
24. Izolowany polipeptyd, znamienny tym, że obejmuje fragment polipeptydu zawierający sekwencję aminokwasową, podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 400, przy czym wspomniany fragment utrzymuje aktywność biologiczną typową dla 1,2-dioksogenazy katecholowej.
25. Izolowany polipeptyd według zastrz. 24, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje heterologiczne sekwencje aminokwasowe.
26. Izolowany polipeptyd, znamienny tym, że jest kodowany przez cząsteczkę kwasu nukleinowego obejmującą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399.
27. Izolowany polipeptyd według zastrz. 26, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje heterologiczne sekwencje aminokwasowe.
28. Sposób wytwarzania wysoko wartościowego związku chemicznego, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki określonej w zastrz. 10, w taki sposób, że wytwarzany jest wysokowartościowy związek chemiczny.
29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap odzyskiwania związku z pożywki hodowlanej.
30. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że komórka należy do rodzaju Corynebacterium albo Brevibacterium.
31. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że komórka jest wybrana z grupy obejmującej: Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitrophilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium healii, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium parafflnolyticum i szczepy podane na Tablicy 3.
32. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że ekspresja cząsteczki kwasu nukleinowego z wektora powoduje modulowanie wytwarzania wysokowartościowego związku chemicznego.
33. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że wysokowartościowy związek chemiczny jest wybrany z grupy obejmującej: kwasy organiczne, aminokwasy wchodzące w skład białek i nie wchodzące w skład białek, zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy, nukleotydy, lipidy, nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe, diole, węglowodany, związki aromatyczne, witaminy, kofaktory, poliketydy i enzymy.
34. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że związkiem chemicznym jest aminokwas.
35. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że aminokwas jest wybrany z grupy obejmującej: lizynę, glutaminian, glutaminę, alaninę, asparaginian, glicynę, serynę, treoninę, metioninę, cysteinę, walinę, leucynę, izoleucynę, argininę, prolinę, histydynę, tyrozynę, fenyloalaninę i tryptofan.
36. Sposób wytwarzania wysokowartościowego związku chemicznego, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki, której genomowy DNA zmieniono przez wprowadzenie cząsteczki kwasu nukleinowego określonej w zastrz. 1 albo 2,albo 3,albo 4,albo 5,albo 6,albo 7.
37. Sposób diagnozowania obecności albo aktywności Corynebacterium diphteriae u osobnika, znamienny tym, że obejmuje wykrywanie u osobnika obecności bądź aktywności jednej z cząsteczek kwasu nukleinowego określonych w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6 lub cząsteczki polipeptydu określonej w zastrz. 16 albo 18, albo 20, albo 22, albo 24, albo 26.
38. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest uszkodzona.
39. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje jedną albo wiele modyfikacji w porównaniu do sekwencji Sekw. Nr Id. 399.
PL 195 942 B1
40. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową podaną na Liście Sekwencji jako Sekw. Nr Id. 399, przy czym region regulatorowy cząsteczki kwasu nukleinowego jest zmodyfikowany względem regionu regulatorowego typu dzikiego.
Applications Claiming Priority (26)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US14103199P | 1999-06-25 | 1999-06-25 | |
DE19931636 | 1999-07-08 | ||
DE19932129 | 1999-07-09 | ||
DE19932128 | 1999-07-09 | ||
DE19932226 | 1999-07-09 | ||
DE19932126 | 1999-07-09 | ||
DE19932127 | 1999-07-09 | ||
DE19932125 | 1999-07-09 | ||
DE19932930 | 1999-07-14 | ||
DE19933002 | 1999-07-14 | ||
DE19932922 | 1999-07-14 | ||
DE19933003 | 1999-07-14 | ||
DE19932928 | 1999-07-14 | ||
DE19932935 | 1999-07-14 | ||
DE19933005 | 1999-07-14 | ||
DE19933006 | 1999-07-14 | ||
DE19932924 | 1999-07-14 | ||
DE19932920 | 1999-07-14 | ||
DE19932973 | 1999-07-14 | ||
DE19932933 | 1999-07-14 | ||
DE19941391 | 1999-08-31 | ||
DE19941378 | 1999-08-31 | ||
DE19941390 | 1999-08-31 | ||
DE19941379 | 1999-08-31 | ||
DE19942088 | 1999-09-03 | ||
PCT/IB2000/000911 WO2001000842A2 (en) | 1999-06-25 | 2000-06-23 | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in homeostasis and adaptation |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL195942B1 true PL195942B1 (pl) | 2007-11-30 |
Family
ID=27586753
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL00359892A PL195215B1 (pl) | 1999-06-25 | 2000-06-23 | Nowe izolowane cz asteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowarto sciowych zwi azków chemicznych i sposób diagnozowania obecno sci albo aktywno sci Corynebacterium diphteriae PL PL PL PL PL PL PL |
PL00380961A PL195942B1 (pl) | 1999-06-25 | 2000-06-23 | Nowe izolowane czasteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowartosciowych zwiazków chemicznych i sposób diagnozowania obecnosci albo aktywnosci Corynebacterium diphteriae PL PL PL PL PL PL PL |
PL380959A PL201534B1 (pl) | 1999-06-25 | 2000-06-23 | Nowe izolowane cząsteczki kwasu nukleionoweg, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowartościowych związków chemicznych i sposób diagnozowania obecności albo aktywności Corynebacterium diphteriae |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL00359892A PL195215B1 (pl) | 1999-06-25 | 2000-06-23 | Nowe izolowane cz asteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowarto sciowych zwi azków chemicznych i sposób diagnozowania obecno sci albo aktywno sci Corynebacterium diphteriae PL PL PL PL PL PL PL |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL380959A PL201534B1 (pl) | 1999-06-25 | 2000-06-23 | Nowe izolowane cząsteczki kwasu nukleionoweg, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowartościowych związków chemicznych i sposób diagnozowania obecności albo aktywności Corynebacterium diphteriae |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070161091A1 (pl) |
EP (2) | EP2302058A1 (pl) |
JP (2) | JP2004512808A (pl) |
KR (3) | KR20070087031A (pl) |
AU (1) | AU783706B2 (pl) |
CA (1) | CA2380871A1 (pl) |
ES (1) | ES2176128T1 (pl) |
HU (1) | HUP0203647A2 (pl) |
MX (1) | MXPA01012841A (pl) |
PL (3) | PL195215B1 (pl) |
SK (1) | SK18902001A3 (pl) |
TR (1) | TR200103711T2 (pl) |
WO (1) | WO2001000842A2 (pl) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4254103B2 (ja) | 1999-07-02 | 2009-04-15 | 味の素株式会社 | シュークロースptsエンザイムiiをコードするdna |
US6395528B1 (en) * | 2000-01-27 | 2002-05-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Phosphoserine phosphatase gene of coryneform bacteria |
DE10039049A1 (de) | 2000-08-10 | 2002-02-21 | Degussa | Neue für das IysR3-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
DE10039043A1 (de) | 2000-08-10 | 2002-02-21 | Degussa | Neue für das luxR-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
ES2233665T3 (es) * | 2000-08-10 | 2005-06-16 | Degussa Ag | Secuencias de nucleotidos que codifican el gen iysr3. |
US6825030B2 (en) | 2000-08-31 | 2004-11-30 | Degussa Ag | Nucleotide sequences encoding a sensor kinase, citA, from corynebacterium glutamicum |
AU8198401A (en) * | 2000-09-02 | 2002-03-13 | Degussa | Nucleotide sequences which code for the metr and metz genes |
US6815196B2 (en) | 2000-09-02 | 2004-11-09 | Degussa Ag | Nucleotide sequences encoding o-succinylhomoserine sulfhydrylase |
US6822085B2 (en) | 2000-09-03 | 2004-11-23 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the cysD, cysN, cysK, cysE and cysH genes |
DE10136986A1 (de) * | 2000-09-03 | 2002-03-21 | Degussa | Für Gene cysD, cysN, cysK, cysE und cysH kodierende Nukleotidsequenzen |
AU2001285916A1 (en) * | 2000-09-09 | 2002-03-22 | Degussa A.G. | Nucleotide sequences which code for the clpc gene |
DE10045486A1 (de) * | 2000-09-14 | 2002-04-11 | Degussa | Neue für das pstC2-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
US20020098554A1 (en) * | 2000-09-19 | 2002-07-25 | Mike Farwick | Nucleotide sequences coding for the pepC gene |
CN1529712A (zh) * | 2001-07-26 | 2004-09-15 | ֮����ʽ���� | 二肽的制备方法、其中所用的肽生成酶及肽生成酶的制备方法 |
US7468262B2 (en) | 2003-05-16 | 2008-12-23 | Ajinomoto Co., Inc. | Polynucleotides encoding useful polypeptides in corynebacterium glutamicum ssp. lactofermentum |
DE10359594A1 (de) | 2003-12-18 | 2005-07-28 | Basf Ag | PEF-TU-Expressionseinheiten |
US8728795B2 (en) | 2003-12-18 | 2014-05-20 | Basf Se | Pgro expression units |
DE102004035065A1 (de) | 2004-07-20 | 2006-02-16 | Basf Ag | P-ET-TS-Expressionseinheiten |
US8604180B2 (en) | 2004-09-09 | 2013-12-10 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | DNA fragment having promoter function |
WO2006032102A1 (en) * | 2004-09-22 | 2006-03-30 | Grain Foods Crc Ltd. | Method of producing fragrance by inactivation or reduction of a functional protein with betaine aldehyde dehydrogenase (badh) activity |
WO2010017526A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-02-11 | The Scripps Research Institute | Purine nucleotides isotopically labeled in the purine base, methods of making thereof and uses thereof |
WO2019094608A1 (en) | 2017-11-08 | 2019-05-16 | Denali Therapeutics Inc. | Anti-bace1 antibodies and methods of use thereof |
CN112930359A (zh) * | 2018-10-25 | 2021-06-08 | 味之素株式会社 | 蛋白质的分泌生产方法 |
CN110964090B (zh) * | 2019-12-26 | 2021-02-19 | 江南大学 | 一种促进n-乙酰氨基葡萄糖生产的蛋白质起始因子if3突变体及其应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6649379B1 (en) * | 1987-06-12 | 2003-11-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Method and deregulated enzyme for threonine production |
JP2967996B2 (ja) * | 1989-06-06 | 1999-10-25 | 協和醗酵工業株式会社 | L―トリプトファンの製造法 |
-
2000
- 2000-06-23 ES ES00938991T patent/ES2176128T1/es active Pending
- 2000-06-23 MX MXPA01012841A patent/MXPA01012841A/es not_active Application Discontinuation
- 2000-06-23 PL PL00359892A patent/PL195215B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-06-23 KR KR1020077015870A patent/KR20070087031A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-06-23 KR KR1020017016584A patent/KR100834985B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-06-23 JP JP2001506834A patent/JP2004512808A/ja active Pending
- 2000-06-23 SK SK1890-2001A patent/SK18902001A3/sk not_active Application Discontinuation
- 2000-06-23 EP EP10182496A patent/EP2302058A1/en not_active Withdrawn
- 2000-06-23 CA CA002380871A patent/CA2380871A1/en not_active Abandoned
- 2000-06-23 PL PL00380961A patent/PL195942B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-06-23 AU AU54205/00A patent/AU783706B2/en not_active Ceased
- 2000-06-23 WO PCT/IB2000/000911 patent/WO2001000842A2/en active Application Filing
- 2000-06-23 HU HU0203647A patent/HUP0203647A2/hu unknown
- 2000-06-23 TR TR2001/03711T patent/TR200103711T2/xx unknown
- 2000-06-23 EP EP00938991A patent/EP1254232A2/en not_active Withdrawn
- 2000-06-23 KR KR1020067022695A patent/KR100878333B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-06-23 PL PL380959A patent/PL201534B1/pl not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-01-21 US US11/041,504 patent/US20070161091A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-04-24 JP JP2007113881A patent/JP2007259859A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2176128T1 (es) | 2002-12-01 |
PL359892A1 (pl) | 2004-09-06 |
JP2004512808A (ja) | 2004-04-30 |
CA2380871A1 (en) | 2001-01-04 |
HUP0203647A2 (hu) | 2003-01-28 |
WO2001000842A2 (en) | 2001-01-04 |
US20070161091A1 (en) | 2007-07-12 |
JP2007259859A (ja) | 2007-10-11 |
TR200103711T2 (tr) | 2002-07-22 |
KR20060115928A (ko) | 2006-11-10 |
KR20030002293A (ko) | 2003-01-08 |
SK18902001A3 (sk) | 2002-09-10 |
EP1254232A2 (en) | 2002-11-06 |
AU5420500A (en) | 2001-01-31 |
PL201534B1 (pl) | 2009-04-30 |
EP2302058A1 (en) | 2011-03-30 |
PL195215B1 (pl) | 2007-08-31 |
KR100878333B1 (ko) | 2009-01-14 |
AU783706B2 (en) | 2005-11-24 |
KR100834985B1 (ko) | 2008-06-03 |
WO2001000842A3 (en) | 2001-08-23 |
MXPA01012841A (es) | 2002-07-09 |
KR20070087031A (ko) | 2007-08-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1257649B1 (en) | Corynebacterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins | |
KR100834986B1 (ko) | 스트레스 저항성 및 내성 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자 | |
PL195942B1 (pl) | Nowe izolowane czasteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza, izolowane polipeptydy i sposoby ich wytwarzania, sposób wytwarzania wysokowartosciowych zwiazków chemicznych i sposób diagnozowania obecnosci albo aktywnosci Corynebacterium diphteriae PL PL PL PL PL PL PL | |
KR100834989B1 (ko) | 막 합성 및 막 운반 관련 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자 | |
EP2290062A1 (en) | Corynebacterium glutamicum gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase | |
JP2007267744A (ja) | ホスホエノールピルビン酸:糖ホスホトランスフェラーゼ系タンパク質をコードするコリネバクテリウム−グルタミカム遺伝子 | |
US7393675B2 (en) | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production | |
KR20020086616A (ko) | 대사 경로 단백질을 코딩하는 코리네박테리움 글루타미쿰유전자 | |
US20040043953A1 (en) | Genes of corynebacterium | |
RU2321634C2 (ru) | Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в метаболизме углерода и продуцировании энергии | |
RU2304616C2 (ru) | Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в гомеостазе и адаптации | |
RU2312145C2 (ru) | Гены corynebacterium glutamicum, кодирующие белки, участвующие в синтезе мембран и мембранном транспорте | |
EP1661987A1 (en) | Corynebacterium glutamicum gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20120623 |