JPH04278088A - ビオチンシンセターゼをコードする遺伝子を含むｄｎａ断片およびその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ビオチンシンタ−ゼ（
すなわちデスチオビオチンからビオチンの生合成反応に
関与する酵素）をコ−ドする遺伝子を含むコリネ型細菌
由来のＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミ
ド、該組換えプラスミドで形質転換されたコリネ型細菌
及び該コリネ型細菌を用いるビオチンシンセタ−ゼの製
造法に関する。

【０００２】ビオチンシンセタ−ゼは、ビオチン生合成
に関与する酵素の一つであり、ビオチン製造における産
業上有用な酵素である。

【０００３】またビオチンは、ヒト、動物、植物及びあ
る種の微生物の生育に必要とされるビタミンの１種であ
り、特に皮膚代謝の調整剤として、あるいはヒトの脱毛
防止養毛剤として、あるいは、家畜飼料への添加剤とし
て用いられる有用な物質である。

【０００４】従来、微生物を用いたビオチンの製造法と
しては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エシエリヒ
ア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アグロバクテリウム
（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クロモバクテリウ
ム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シユ−ドモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ア−スロバクタ−
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属等の微生物を用いる方
法が知られている（特開昭５６−１６０９９８号公報）
。またこれら野生株に人工的に突然変異を生起させてビ
オチン生産能を付与する方法も提案されている（例えば
　Ｈ．Ｙａｍａｇａｔａｅｔ　ａｌ，Ａｇｒｉ．Ｂｉａ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，４７、１６１１、１９８３）。

【０００５】しかしながら、微生物を用いてビオチンを
製造しようとする場合、野生株はビオチンによる強力な
フイ−ドバツク抑制機構のため（Ｙ．Ｉｚｕｍｉ，Ｋ．
Ｏｇａｔａ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．
２２、１５５−１５７、１９７７）、ビオチンは極少量
しか生成されない。また変異株を用いる方法でも生成量
は必ずしも満足し得るものではなかつた。

【０００６】また、工業的利用上多くの利点を有するブ
レビバクテリウム属およびコリネバクテリウム属細菌を
含むコリネ型細菌のある種の菌株、例えばブレビバクテ
リウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆ
ｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３、ブレビバクテリウム・ラク
トフア−メンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌ
ａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コ
リネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８
３１、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）
ＡＴＣＣ１３７４５等はビオチン要求性を有しており、
ビオチンを全く生産しないことが知られている。

【０００７】ビオチンの生合成に関与する遺伝子として
は、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ）由来の遺伝子がよく研究されており、ｂｉｏＡ
、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＨ
遺伝子が存在することが知られている。このうち、ｂｉ
ｏＡは７，８−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフ
エラ−ゼ、ｂｉｏＢはビオチンシンセタ−ゼ、ｂｉｏＣ
はピメリルＣｏＡシンテタ−ゼ、ｂｉｏＤはデスチオビ
オチンシンテタ−ゼ、ｂｉｏＦは７−ケト−８−アミノ
ペラルゴン酸シンテタ−ゼをそれぞれコ−ドすることが
知られ、ｂｉｏＨについては、その働きは、まだ明らか
でない（Ａ．Ｊ．Ｏｔｓｕｋａ　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、１９５７７−１９５８
５、１９８８）。また、ｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ
、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ遺伝子はｂｉｏＡＢＦＣＤなるオ
ペロンを形成しており、その発現は、ｂｉｏＡとｂｉｏ
Ｂ遺伝子の間に存在するオペレ−タ−により制御される
ことがわかつている。また、そのオペレ−タ−の制御は
、ｂｉｏＡ遺伝子にコ−ドされたビオチンリプレツサ−
が、ビオチンにより活性化されることによりオペレ−タ
−に結合し、ビオチン生合成オペロンの発現を抑制する
ことが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３
、１０１３−１０１６、１９８８）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】この発明は、コリネ型
細菌のビオチン生合成に関与する遺伝子を解析・単離し
、該遺伝子を同種であるコリネ型細菌に導入し、該遺伝
子産物を効率的にコリネ型細菌から取得することを目的
としてなされたものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた。その結果、ビオチン要
求性の大腸菌変異株を用いる交差相補性試験により、ビ
オチン要求性のコリネ型細菌は少くともｂｉｏＢ、ｂｉ
ｏＡ、ｂｉｏＤの３種のビオチン生合成に関与する遺伝
子を保有していることが明らかとなり、該遺伝子を適当
なベクタ−プラスミドに導入して、コリネ型細菌を形質
転換し、該コリネ型細菌を培養することにより、培養物
中に効率的にビオチン生合成に関与する酵素が生成する
ことを見い出し本発明を完成するに至つた。かくして本
発明によれば、（１）　コリネ型細菌由来のビオチンシ
ンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子（ｂｉｏＢ）を含むＤＮ
Ａ断片、（２）　該ＤＮＡ断片が導入された組換えプラ
スミド、（３）　該組換えプラスミドで形質転換された
コリネ型細菌、（４）　該コリネ型細菌を培養し、培養
物中にビオチンシンセタ−ゼを生成せしめることを特徴
とするビオチンシンセタ−ゼの製造法、が提供される。

【００１０】以下本発明についてさらに詳細に説明する
。本発明の「ビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子
を含むＤＮＡ断片」（以下これを「ｂｉｏＢ断片」と略
称することがある）は、デスチオビオチンからビオチン
への変換反応を触媒する酵素、すなわちビオチンシンセ
タ−ゼをコ−ドする遺伝子（ｂｉｏＢ）を含むＤＮＡ断
片である。

【００１１】上記ｂｉｏＢ断片の供給源となる微生物は
、コリネ型細菌であれば特に限定されるものではないが
、一般的には、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４９７）およびその由来株、
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣ
Ｃ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７
４６、ブレビバクテリウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣ
Ｃ１４０２０、ブレビバクテリウム・ラクトフア−メン
タム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏｆｅ
ｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリ
ウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１等が有利
に使用される。

【００１２】これらの供給源微生物からｂｉｏＢ断片を
調製するための基本的操作の一例を述べれば次のとおり
である。

【００１３】すなわち、ｂｉｏＢ断片の調製は、上記コ
リネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２
３３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４９７）株の染色体上に存在
し、この染色体を適当な制限酵素で切断することにより
生ずる切断断片の中から以下に述べる方法で分離、取得
することができる。先ず、ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する
。この染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３
ＡＩを用いて、ＤＮＡ断片の大きさが約２０〜３０ｋｂ
になるように部分分解する。

【００１４】得られたＤＮＡ断片をコスミドベクタ−、
例えばｐＷＥ１５に挿入し、このコスミドをλＤＮＡ　
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｋｉｔを用い
る形質導入により、ｂｉｏＢの欠損した大腸菌変異株（
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖ
ｏｌ　９４、ｐ２０６５−２０６６、１９６７及びＪｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ
　１１２、ｐ８３０−８３９、１９７２参照）に導入す
る。この大腸菌変異株を、ビオチンを含まない選択培地
に塗沫する。

【００１５】得られる形質転換株よりコスミドＤＮＡを
抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来の
ｂｉｏＢ断片を確認・取得することができる。かくして
得られるｂｉｏＢ断片は、大きさが約２０〜３０ｋｂと
大きく、実用的でないので、さらに短かい断片に特定化
する必要がある。

【００１６】次に、上記で得られたｂｉｏＡ、ｂｉｏＤ
断片を含むコスミドを適当な制限酵素を用いて切断し、
得られるＤＮＡ断片を、大腸菌で複製可能なベクタ−プ
ラスミドに挿入しこのベクタ−プラスミドを通常用いら
れる形質転換法、例えば、塩化カルシウム法、電気パル
ス法による形質転換により、前記ｂｉｏＢの欠損した大
腸菌変異株に導入し、この大腸菌変異株をビオチンを含
まない選択培地に塗沫する。

【００１７】得られる形質転換株よりプラスミドＤＮＡ
を抽出し、制限酵素で解析することにより挿入されたブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株染色体由来
のｂｉｏＢ断片を確認・取得することができる。

【００１８】このようにして得られるｂｉｏＢ断片の一
つは、上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩの部分分解に
より切り出し、さらにそれを制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ
で切り出すことによつて得られる大きさが約５．５ｋｂ
のＤＮＡ断片を挙げることができる。

【００１９】この約５．５ｋｂのビオチンシンセタ−ゼ
をコ−ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片を、各種の制限酵
素で切断したときの認識部位数及び切断断片の大きさを
下記表１に示す。

【００２０】なお、本明細書において、制限酵素による
「認識部位数」は、ＤＮＡ断片又はプラスミドを、過剰
の制限酵素の存在下で完全分解し、それらの分解物をそ
れ自体既知の方法に従い１％アガロ−スゲル電気泳動お
よびポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離可能
な断片の数から決定した値を採用した。

【００２１】また、「切断断片の大きさ」及びプラスミ
ドの大きさは、アガロ−スゲル電気泳動を用いる場合に
は、エシエリヒア・コリのラムダフア−ジ（λｐｈａｇ
ｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで切断して得
られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一アガロ−スゲル上
での泳動距離で描かれる標準線に基づき、また、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を用いる場合には、エシエリ
ヒア・コリのフアイ・エツクス１７４フア−ジ（φｘ１
７４ｐｈａｇｅ）のＤＮＡを制限酵素Ｈａｅ　ＩＩＩで
切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同一ポリア
クリルアミドゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基
づき、切断ＤＮＡ断片又はプラスミドの各ＤＮＡ断片の
大きさを算出する。プラスミドの大きさは、切断断片そ
れぞれの大きさを加算して求める。なお、各ＤＮＡ断片
の大きさの決定において、１ｋｂ以上の断片の大きさに
ついては、１％アガロ−スゲル電気泳動によつて得られ
る結果を採用し、約０．１ｋｂから１ｋｂ未満の断片の
大きさについては４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によつて得られる結果を採用した。

【００２２】

【表１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　表　　１　　　　　　　　制限酵素　　　　認
識部位数　　　　切断断片の大きさ（ｋｂ）　　　　　
　　　ＫｐｎＩ　　　　　　　　　　　１　　　　　　
　　　　　　　３．０　、　２．５　　　　　　　　Ｓ
ａｃＩ　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　
　　　１．７　、　３．８　　　　　　　　ＥｃｏＲＩ
　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　０
．６　、　４．９ 　　上記表１中、３．０ｋｂのＫｐｎＩ切断断片、１．
７ｋｂのＳａｃＩ切断断片もまたビオチンシンセタ−ゼ
をコ−ドすることが確認されており、従つてこれらの切
断断片もまた、本発明のビオチンシンセタ−ゼをコ−ド
する遺伝子を含むＤＮＡ断片に包含されるものである。

【００２３】かくして、ビオチンシンセタ−ゼをコ−ド
する遺伝子は、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩおよび
ＫｐｎＩで切り出すことにより得られる大きさが約３．
０ｋｂのＤＮＡ断片、および同染色体ＤＮＡを制限酵素
Ｈｉｎｄ　ＩＩＩおよびＳａｃＩで切り出すことにより
得られる大きさが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片中に含まれ
ているものと考えられる。

【００２４】上記約３．０ｋｂのＤＮＡ断片および約１
．７ｋｂのＤＮＡ断片を、さらに各種の制限酵素で切断
したときの認識部位数および切断断片の大きさを、各々
下記表２および表３に示す。

【００２５】

【表２】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　表　　２　　　　　　　　制限酵素　　　　認
識部位数　　　　切断断片の大きさ（ｋｂ）　　　　　
　　　ＳａｃＩ　　　　　　　　　　　１　　　　　　
　　　　　　　１．７　、　１．３　　　　　　　　Ｅ
ｃｏＲＩ　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　
　　　０．６　、　２．４

【００２６】

【表３】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　表　　３　　　　　　　　制限酵素　　　　認
識部位数　　　　切断断片の大きさ（ｋｂ）　　　　　
　　　ＳｐｈＩ　　　　　　　　　　　１　　　　　　
　　　　　　　０．２　、　１．５　　　　　　　　Ｅ
ｃｏＲＩ　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　
　　　０．６　、　１．１　　　　　　　　ＳｍａＩ　
　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　１
．０　、　０．７　　　　　　　　Ｈｉｎｃ　ＩＩ　　
　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　１．５　、
　０．２ 　　一方、上記したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩお
よびＳａｃＩで切り出すことにより得られる大きさが約
１．７ｋｂのＤＮＡ断片については、その塩基配列をプ
ラスミドｐＵＣ１８またはｐＵＣ１９を用いるジデオキ
シヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　法）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅ
ｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ　７４、５４６３、１９７７）により決定すること
ができる。このようにして決定した上記約１．７ｋｂの
ＤＮＡ断片の塩基配列中のオ−プンリ−デイングフレ−
ムの存在から決定したビオチンシンセタ−ゼをコ−ドす
る遺伝子（ｂｉｏＢ）は、次の配列を有しており、３３
４のアミノ酸をコ−ドする１００２の塩基対から構成さ
れる：

【００２７】

【化４】

【００２８】

【化５】

【００２９】

【化６】

【００３０】上記の塩基配列を包含して成る本発明のビ
オチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子を含むＤＮＡ断
片は、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮＡから分離された
もののみならず、通常用いられるＤＮＡ合成装置、例え
ばベツクマン社製　Ｓｙｓｔｅｍ−１Ｐｌｕｓ　を用い
て合成されたものであつてもよい。

【００３１】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明のＤＮＡ断片は、ビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする
機能を実質的に損なうことがない限り、塩基配列の一部
の塩基が他の塩基と置換されていてもよく又は削除され
ていてもよく、或いは新たに塩基が挿入されていてもよ
く、さらに塩基配列の一部が転位されているものであつ
てもよく、これらの誘導体のいずれもが、本発明のビオ
チンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片
に包含されるものである。

【００３２】以上に詳述した大きさが約５．５ｋｂ、約
３．０ｋｂ、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素によ
る切断点地図を図１に示す。

【００３３】本発明のビオチンシンセタ−ゼをコ−ドす
る遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｂｉｏＢ断片）は、コリネ
型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少
くとも含むプラスミドベクタ−に導入することにより、
コリネ型細菌内でビオチンシンセタ−ゼの高発現可能な
組換えプラスミドを得ることができる。

【００３４】本発明のｂｉｏＢ断片を導入することがで
きる、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を
少くとも含むプラスミドベクタ−としては、特願平２−
４２１２号明細書に開示されているプラスミドｐＣＲＹ
３０；特開平２−２７６５７５号公報に記載されている
プラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２
ＫＸ、ｐＣＲＹ３Ｋ７、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣＲＹ３Ｋ
Ｘ；特開平１−１９１６８６号公報に記載されているプ
ラスミドｐＣＲＹ２及びｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７
６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７
８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１
９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１
及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号に記
載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載の
ｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐ
ＣＧ４及びｐＣＧ１１等を挙げることができる。

【００３５】中でもコリネ型細菌の宿主ベクタ−系で用
いられるプラスミドベクタ−としては、コリネ型細菌内
でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細
菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とをもつも
のが好ましく、例えばプラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲ
Ｙ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２
ＫＸ、ｐＣＲＹ３Ｋ７、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣＲＹ３Ｋ
Ｘが好適に使用される。

【００３６】上記プラスミドベクタ−ｐＣＲＹ３０を調
製する方法としては、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｔａｔｉｏｎｉ
ｓ）ＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２５１５）か
らプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを抽出（このプラスミ
ドの詳細は特開平１−９５７８５号公報参照）し、制限
酵素ＸｈｏＩで大きさが約４．０ｋｂのプラスミドの複
製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、
制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで大きさが約２．１
ｋｂのプラスミドの安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を切り出す。これらの両断片をプラスミドｐＨＳ
Ｇ２９８（宝酒造製）のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ部位及び
ＳａｌＩ部位に組み込むことにより、プラスミドベクタ
−ｐＣＲＹ３０を調製することができる。

【００３７】次に、上記プラスミドベクタ−への本発明
のｂｉｏＢ断片の導入は、例えばプラスミドベクタ−中
に１個所だけ存在する制限酵素部位を、該制限酵素で開
裂し、そこに前記ｂｉｏＢ断片を必要に応じてＳ１ヌク
レア−ゼで処理して平滑末端とするか、または適当なア
ダプタ−ＤＮＡの存在下にＤＮＡリガ−ゼ処理で連絡さ
せることにより行うことができる。

【００３８】プラスミドｐＣＲＹ３０への本発明のｂｉ
ｏＢ断片の導入は、プラスミドｐＣＲＹ３０を制限酵素
ＥｃｏＲＩで開裂させ、そこに前記ビオチンシンセタ−
ゼをコ−ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｂｉｏＢ断片
）をＳｌヌクレア−ゼで処理することにより平滑末端と
した後、ＤＮＡリガ−ゼで連結させることにより行うこ
とができる。

【００３９】このようにして造成されるプラスミドｐＣ
ＲＹ３０に本発明のｂｉｏＢ断片を導入した組換えプラ
スミドは、ビオチンシンセタ−ゼの製造に好適に用いる
ことができる組換えプラスミドの一つであり、本発明者
らはこれをプラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ２と命名し
た。プラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ２の作成方法の詳
細については、後記実施例４及び５で説明する。

【００４０】このプラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ２の
制限酵素切断点地図を図２に示す。このようにして造成
されるビオチンシンセタ−ゼ遺伝子を含むコリネ型細菌
内で複製増殖可能なプラスミドを、宿主微生物に導入し
培養することにより、ビオチンシンセタ−ゼを安定に効
率よく生産することが可能となる。

【００４１】本発明によるプラスミドで形質転換しうる
宿主微生物としては、コリネ型細菌、例えばブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１
４９７）、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４９８）、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ＡＢＴ−１１（Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−１５００）、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３−ＡＢＤ−２１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１
４９９）等が挙げられる。

【００４２】なお、上記のＦＥＲＭ　ＢＰ−１４９８の
菌株は、ＦＥＲＭＢＰ−１４９７号の菌株を親株として
ＤＬ−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付与されたエタノ
−ル資化性微生物である（特公昭５９−２８３９８号公
報第３〜４欄参照）。また、ＦＥＲＭ　ＢＰ−１５００
号の菌株は、ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４９７の菌株を親株と
したＬ−α−アミノ酪酸トランスアミナ−ゼ高活性変異
株である（特開昭６２−５１９９８号公報参照）。さら
に、ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４９９の菌株はＦＥＲＭＢＰ−
１４９７の菌株を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミ
ナ−ゼ高活性変異株である（特開昭６１−１７７９９３
号公報参照）。

【００４３】これらの微生物の他に、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、同Ａ
ＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ１３７４６、ブレビバク
テリウム・デバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）ＡＴＣＣ１４０２０、ブ
レビバクテリウム・ラクトフア−メンタム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）
ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカ
ム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉ
ｃｕｍ）ＡＴＣＣ３１８３１等を宿主微生物として用い
ることもできる。

【００４４】なお宿主としてブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３由来の菌株を用いる場合、本菌株が保
有するプラスミドｐＢＹ５０２（特開昭６３−３６７８
７号公報参照）のため、形質転換が困難である場合があ
るので、そのような場合には、本菌株よりプラスミドｐ
ＢＹ５０２を除去することが望ましい。そのようなプラ
スミドｐＢＹ５０２を除去する方法としては、例えば、
継代培養を繰り返すことにより、自然に欠失させること
も可能であるし、人為的に除去することも可能である［
Ｂａｃｔ．Ｒｅｖ．３６　ｐ．３６１〜４０５（１９７
２）参照］。上記プラスミドｐＢＹ５０２を人為的に除
去する方法の一例を示せば次のとおりである。

【００４５】宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３の生育を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレ
ンジ（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）もしくはエチジ
ウムブロミド（濃度：０．２〜５０μｇ／ｍｌ）等を含
む培地に、１ｍｌ当り約１０細胞になるように植菌し、
生育を不完全に阻害しながら、約２４時間約３５℃で培
養する。 培養液を希釈後寒天培地に塗布し、約３５℃で約２日培
養する。出現したコロニ−から各々独立にプラスミド抽
出操作を行い、プラスミドｐＢＹ５０２が除去されてい
る株を選択する。この操作によりプラスミドｐＢＹ５０
２が除去されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３由来菌株が得られる。

【００４６】このようにして得られるブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株への前記プラスミド
の形質転換法としては、エシエリヒア・コリ及びエルビ
ニア・カロトボラについて知られているように［Ｃａｌ
ｖｉｎ，Ｎ．Ｍ．ａｎｄ　Ｈａｎａｗａｌｔ，Ｐ．Ｃ．
，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｌｉｏｌｏｇｙ，
１７０，２７９６（１９８８）；Ｉｔｏ，Ｋ．，Ｎｉｓ
ｈｉｄａ，Ｔ．ａｎｄ　Ｉｚａｋｉ．Ｋ．，Ａｇｒｉｃ
ｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，５２，２９３（１９８８）参照］、Ｄ
ＮＡ受容菌にパルス波を通電することによりプラスミド
を導入することが可能である。

【００４７】上記の方法で形質転換して得られるビオチ
ンシンセタ−ゼ産生能を有するコリネ型細菌、例えばブ
レビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来株の培養
方法を以下に述べる。

【００４８】培養は炭素源、窒素源、無機塩等を含む通
常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例え
ばグルコ−ス、エタノ−ル、メタノ−ル、廃糖蜜等が、
そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等
がそれぞれ単独もしくは混合して用いられる。また無機
塩としては、例えばリン酸−水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ−ンステイ−プ
リカ−、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加することができる。

【００４９】培養は、通常、通気撹拌、振盪等の好気的
条件下に、約２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃の
温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜１０、
好ましくは７〜８付近で行い、培養中のｐＨの調整は酸
又はアルカリを添加して行うことができる。

【００５０】培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１
〜５容量％、更に好ましくは２〜３容量％である。また
、培養期間は通常１〜７日間とすることができ、最適期
間は３日間である。

【００５１】このようにして得られる培養物から遠心分
離等により菌体を取得することができる。

【００５２】かくして培養された菌体は、野生株を培養
した場合に比べて、ビオチンシンセタ−ゼをその菌体内
に多量含有している。菌体内に産生された、ビオチンシ
ンセタ−ゼの含量を調べる方法としては、例えば超音波
処理、酵素処理、ホモジナイズ等の通常用いられる手段
にて破砕し得られる無細胞抽出液を、ＳＤＳゲル電気泳
動法［例えば、「蛋白質・酵素の基礎実験法」南江堂刊
、３１４〜３３３頁等参照］に付することにより、菌体
内の蛋白質を分離した後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒｉ
ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ−２５０による染色法ある
いは、銀染色法により染色した後、例えばフアルマシア
社製　Ｕｌｔｒｏ　Ｓｃａｎ　ＸＬ　レ−ザ−デンシト
メ−タ−を用いることにより、菌体中の各種タンパク質
量を測定することができる。かくして、菌体内に産生さ
れた、ビオチンシンセタ−ゼ含量の増加を測定すること
が可能である。

【００５３】上記の如くビオチンシンセタ−ゼを高含量
含む菌体を用いることにより、少なくともデスチオビオ
チンを含有する前記通常の栄養培地で培養することによ
り、高効率でビオチンを製造することができる。

【００５４】本明細書では、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３からビオチンシンセタ−ゼをコ−ドす
る遺伝子（ｂｉｏＢ）を含むＤＮＡ断片を単離し、該Ｄ
ＮＡ断片を導入した組換えプラスミドを同じくブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来株へ導入し、該
微生物によるビオチンシンセタ−ゼの生産能の向上につ
いて主として詳述したが、ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３由来株の代りに前記した他のコリネ型細
菌を用いても本発明の目的は達成される。

【００５５】いわゆるコリネ型細菌は、コリネバクテリ
ウム属やブレビバクテリウム属等の種々の属名、種々の
菌名が付されているが主な菌学的性質を同じくしている
。これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やＤＮＡの塩
基組成が画一的であり、菌種間には７０〜８０％のＤＮ
Ａの相同性があり、非常に近縁な微生物であることは明
らかである（Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｅｒｍｅ
ｎｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅｓ　Ｎｏ．５５、ｐ１−５、１９８０、Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍ
ａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ３１、ｐ
１３１−１３８、１９８１参照）。

【００５６】また、ビオチン要求性のコリネ型細菌、例
えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−１４９７）、ブレビバクテリウム・ラクト
フア−メンタムＡＴＣＣ１３８６９およびコリネバクテ
リウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１８３１について、ビ
オチン生合成に関与する各ステツプの遺伝子が欠損した
ビオチン要求性大腸菌変異株（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ　１１２、ｐ８３０
−８３９、１９７２および　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ　９４、ｐ２０６５−
２０６６、１９６７参照）との交差相補性試験（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ　９６、
ｐ５１５−５２４、１９６８参照）により、そのビオチ
ン生合成系路について検討した結果、これら３種の菌株
は同様にピメリルＣｏＡシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝
子（ｂｉｏＣ）および７−ケト−８−アミノペラルゴン
酸シンテタ−ゼをコ−ドする遺伝子（ｂｉｏＦ）が欠損
しており、また少くとも７，８−ジアミノペラルゴン酸
アミノトランスフエラ−ゼをコ−ドする遺伝子（ｂｉｏ
Ａ）、デスチオビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝
子（ｂｉｏＤ）およびビオチンシンセタ−ゼをコ−ドす
る遺伝子を保有していることが明らかとなつた。これら
の事実を踏まえれば、ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ−２３３のみならず、コリネ型細菌全般から単離され
たビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子（ｂｉｏＢ
）を含むＤＮＡ断片も本発明の範囲に含まれ、また、本
発明のプラスミドで形質転換し得る宿主微生物は、ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３に限らず、コリ
ネ型細菌が全て含まれることは明らかである。

【００５７】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、実施
例は本発明の具体的に認識を得る一助とみなすべきもの
であり、本発明の範囲を限定するためのものでないこと
を理解しなければならない。

【００５８】

【実施例１】コリネ型細菌とビオチン要求性大腸菌変異
株との相補性試験 （Ａ）コリネ型細菌を含有するビオチン欠乏最少培地プ
レ−トの作製 半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ
４　７ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４　０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　０
．５ｇ、ＭｇＳＯ４　０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
　６ｍｇ、ＭｎＳＯ４　４〜６Ｈ２Ｏ　６ｍｇ、酵母エ
キス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、
塩酸チアミン２００μｇ、グルコ−ス２０ｇ、純水１ｌ
］１ｌに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４９７）を植菌して、Ｏ．Ｄ．が
約２．９になるまで培養し、菌体を集めた。得られた菌
体をＢＭ緩衝液［組成：尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４
　７ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４　０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　０．
５ｇ、ＭｇＳＯ４　０．５ｇ］で２回洗浄した。この菌
体を１０ｍｌのＢＭ緩衝液に懸濁し、その内１ｍｌを、
滅菌後、５０℃に放置しておいたビオチン検定用Ｃ培地
（尿素０．２％、硫酸アンモニウム０．７％、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４　０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４　０．０５％、ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ　０．０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　
６ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ　６ｐｐｍ、チア
ミン・ＨＣｌ　１００μｇ／ｌ、ビタミン・アツセイ用
カザミノ酸０．１％、グルコ−ス０．２％、寒天１．０
％）に添加し、撹拌後、プレ−トに流し、固化した。

【００５９】同様にして、ブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４９７）の代わり
に、ブレビバクテリウム・ラクトフア−メンタムＡＴＣ
Ｃ１３８６９、あるいは、コリネバクテリウム・グルタ
ミカムＡＴＣＣ３１８３１を用いて各種のコリネ型細菌
を含んだビオチン欠乏最少培地プレ−トを作製した。 （Ｂ）ビオチン要求性大腸菌変異株との相補性試験ビオ
チン生合成系路の各ステツプの欠損したビオチン要求性
大腸菌変異株と各種コリネ型細菌との相補性試験により
、各種コリネ型細菌のビオチン生合成系路を推定するこ
とができる。

【００６０】上記（Ａ）で作製した、３種のコリネ型細
菌含有ビオチン欠乏最少培地のプレ−トに、各種ビオチ
ン要求性大腸菌変異株を線状に植菌した。用いたビオチ
ン要求性大腸菌変異株は、エシエリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｒ８７３（ｂｉｏＡ４）
、同Ｒ８７４（ｂｉｏＦ１２）、同Ｒ８７５（ｂｉｏＢ
１７）、同Ｒ８７６（ｂｉｏＣ１８）、同Ｒ８７７（ｂ
ｉｏＣ１９）である［（　　）内は各菌株の遺伝子型（
Ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を示す、またこれらの菌株の詳細お
よび取得方法については、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ　９４、ｐ２０６５−２
０６６（１９６７）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ　１１２、ｐ８３０−８３９
（１９７２）参照）。

【００６１】これらのビオチン要求性大腸菌変異株とコ
リネ型細菌が相補した場合は、コリネ型細菌がビオチン
欠乏最小培地のプレ−ト中に生育し、黄色いコロニ−を
形成する。各種ビオチン要求性大腸菌変異株に対応する
コリネ型細菌のコロニ−形成の有無により、コリネ型細
菌がビオチン生合成に関与する遺伝子のどの部分を欠損
し、その部分を保有しているか容易に判別することがで
きる。

【００６２】本相補試験の結果、ブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）、ブ
レビバクテリウム・ラクトフア−メンタムＡＴＣＣ１３
８６９、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３
１８３１は、各菌株共、エシエリヒア・コリＲ８７３（
ｂｉｏＡ４）、同Ｒ８７５（ｂｉｏＢ１７）、同Ｒ８７
７（ｂｉｏＤ１９）を相補したが、同Ｒ８７４（ｂｉｏ
Ｆ１２）、同Ｒ８７６（ｂｉｏＣ１８）を相補しなかつ
た。即ち、各々のコリネ型細菌は、少なくとも、同様に
７，８−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフエラ−
ゼをコ−ドする遺伝子（ｂｉｏＡ）、デスチオビオチン
シンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子（ｂｉｏＤ）およびビ
オチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子（ｂｉｏＢ）を
有していることが明らかとなつた。

【００６３】

【実施例２】ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３由来のビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子（ｂ
ｉｏＢ）を含むＤＮＡ断片のクロ−ン化（Ａ）ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全ＤＮＡの抽出 半合成培地Ａ培地［組成：尿素２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ
４　７ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４　０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　０
．５ｇ、ＭｇＳＯ４　０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
　６ｍｇ、ＭｎＳＯ４　４〜６Ｈ２Ｏ　６ｍｇ、酵母エ
キス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、
塩酸チアミン２００μｇ、グルコ−ス２０ｇ、純水１ｌ
］１ｌに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４９７）を対数増殖期後期まで培
養し、菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの
濃度にリゾチ−ムを含む１０ｍＭ　ＮａＣｌ−２０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ　ＥＤＴＡ−２Ｎ
ａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次にプロテナ−ゼＫを、最
終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃
で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最
終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間
保温して容菌した。この溶菌液に、等量のフエノ−ル／
クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに
振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分
間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリ
ウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタ
ノ−ルをゆつくりと加えた。水層とエタノ−ル層の間に
存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノ−
ルで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に
用いた。

【００６４】（Ｂ）組換え体の創製 上記（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３の全ＤＮＡ９０μｌを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ　
１ｕｎｉｔを用い、３７℃で２０分間反応させ部分分解
した。 この部分分解ＤＮＡにコスミドｐＷＥ１５（ストラダジ
−ン社製）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断した後、脱リン
酸化処理したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）、１０ｍＭジチオスレイト−ル、１ｍＭ　Ａ
ＴＰ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２及びＴ４ＤＮＡリガ−ゼ１
ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度で
ある）、４℃で１５時間反応させ、結合させた。

【００６５】（Ｃ）ビオチン生合成に関与する酵素をコ
−ドする遺伝子を含むコスミドの選抜 上記（Ｂ）項で得たコスミド混液を用い、前記エシエリ
ヒア・コリＲ８７５（ｂｉｏＢ１７）株を形質導入し、
アンピリシン５０ｍｇを含む選択培地［Ｋ２ＨＰＯ４　
７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４　１ｇ
、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ
、グルコ−ス２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解］
に塗沫した。なお形質導入には、宝酒造より販売されて
いるλＤＮＡ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ
　Ｋｉｔ　を用いて行つた。培地上の生育株を常法によ
り、液体培養し、培養液よりコスミドＤＮＡを抽出し、
該コスミドを制限酵素により切断し、アガロ−スゲル電
気泳動を用いて調べたところ、コスミドｐＷＥ１５の長
さ８．８ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約３０ｋｂのＤ
ＮＡ断片が認められた。本コスミドをｐＷＥ１５−ｂｉ
ｏ２と命名した。

【００６６】（Ｄ）ビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする
遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｂｉｏＢ断片）のプラスミド
ｐＨＳＧ３９９へのサブクロ−ニング 上記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−ｂｉｏ２に含
まれるＤＮＡ挿入断片は約３０ｋｂと大きく、実用的で
ないので、得られた断片のうち必要な部分だけに小型化
するために、プラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造より市
販）へビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を下記のとおりサブクロ−ニングした。

【００６７】上記（Ｃ）項で得たコスミドｐＷＥ１５−
ｂｉｏ２を制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで切断したものと
、プラスミドｐＨＳＧ３９９を制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩ
Ｉで切断したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）、１０ｍＭジチオスレイト−ル、１ｍＭ　Ａ
ＴＰ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２及びＴ４ＤＮＡリガ−ゼ１
ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度で
ある）、１２℃で１５時間反応させ、結合させた。

【００６８】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｂｉｏｌｏｇｙ、５３、１５９、１９７０）によりエ
シエリヒア・コリＲ８７５（ｂｉｏＢ１７）株を形質転
換し、クロラムフエニコ−ル５０ｍｇを含む選択培地［
Ｋ２ＨＰＯ４　７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　２ｇ、（ＮＨ４）
２ＳＯ４　１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．１ｇ、カ
ザミノ酸１０ｇ、グルコ−ス２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留
水１ｌに溶解］に塗沫した。

【００６９】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロ−スゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＨＳＧ３９９の長さ
２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約５．５ｋｂの挿
入ＤＮＡ断片が認められた。各種の制限で切断したとき
の、長さ約５．５ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素認識部位
数および切断断片の大きさは前記表１に示したとおりで
あつた。 このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に示す。

【００７０】また上記で得たプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の表４に示す。

【００７１】

【表４】 　　表４　　　　プラスミドｐＨＳＧ３９９−ｂｉｏＢ
５．５　　　　　　　　　　　　　　制限酵素　　　　
認識部位数　　　　切断断片の大きさ（ｋｂ）　　　　
　　　　ＨｉｎｄＩＩＩ　　　　　　　２　　　　　　
　　　　　５．５　、　　２．２　　　　　　　　　　
ＳａｃＩ　　　　　　　　　　　２　　　　　　　　　
　　６．０　、　　１．７　　　　　　　　ＫｐｎＩ　
　　　　　　　　　　２　　　　　　　　　　　４．７
　、　　３．０ 　　上記の制限酵素により特徴づけられるプラスミドを
ｐＨＳＧ３９９−ｂｉｏＢ５．５と命名した。

【００７２】以上により、ビオチンシンセタ−ゼをコ−
ドする遺伝子（ｂｉｏＢ）を含む大きさが約５．５ｋｂ
のＤＮＡ断片（Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片）を得ることがで
きた。

【００７３】（Ｅ）ビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする
遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｂｉｏＢ断片）のプラスミド
　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　へのサブクロ−ニン
グ上記（Ｄ）項で得たプラミドｐＨＳＧ３９９−ｂｉｏ
Ｂ５．５は、ｂｉｏＢを含む長さが約５．５ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片を有しているがさらに得られた断片のうち必
要な部分だけに小型化するために、プラスミド　ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（ストラタジ−ン社より市販）
へビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を下記のとおりサブクロ−ニングした。

【００７４】上記（Ｄ）項で得たプラスミドｐＨＳＧ３
９９−ｂｉｏ５．５を制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩおよび
ＳａｃＩで切断したものと、プラスミド　ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ　ＩＩを制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩおよびＳ
ａｃＩで切断したものを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．６）、１０ｍＭジチオスレイト−ル、１ｍＭ
　ＡＴＰ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２及びＴ４ＤＮＡリガ−
ゼ１ｕｎｉｔ　の各成分を添加し（各成分の濃度は最終
濃度である）、１２℃で１５時間反応させ、結合させた
。

【００７５】得られたプラスミド混液を用い、前記の方
法に従い前記エシエリヒア・コリＲ８７５（ｂｉｏＢ１
７）株を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含む選択
培地［Ｋ２ＨＰＯ４　７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　２ｇ、（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４　１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１ｇ
、カザミノ酸１０ｇ、グルコ−ス２ｇ及び寒天１６ｇを
蒸留水１ｌに溶解］に塗沫した。

【００７６】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロ−スゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミド　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ　ＩＩの長さ２．９５ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長
さ約１．７ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。各種の
制限酵素で切断したときの、長さ約１．７ｋｂのＤＮＡ
断片の制限酵素認識部位数および切断断片の大きさは前
記表３に示したとおりであつた。このＤＮＡ断片の制限
酵素切断点地図を図１に示す。

【００７７】また上記で得たプラスミドを各種制限酵素
で切断して、切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の表５に示す。

【００７８】

【表５】 　　表５　　　　　プラスミドｐＢＳ−ｂｉｏＢ−ＨＳ
１．７　　　　　　　　　　　　　　　　制限酵素　　
　　認識部位数　　　　切断断片の大きさ（ｋｂ）　　
　　　　　　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　　　　　　１　　　　
　　　　　　　　　　　４．６５　　　　　　　　Ｓａ
ｃＩ　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　
　　　　４．６５　　　　　　　　ＨｉｎｃＩＩ　　　
　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　　　４．６
５ 　　上記の制限酵素により特徴づけられるプラスミドを
ｐＢＳ−ｂｉｏＢ−ＨＳ１．７とと命名した。

【００７９】以上により、ビオチンシンセタ−ゼをコ−
ドする遺伝子（ｂｉｏＢ）を含む大きさが約１．７ｋｂ
のＤＮＡ断片（Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ−ＳａｃＩ断片）を得
ることができた。

【００８０】

【実施例３】ビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子
（ｂｉｏＢ）の塩基配列の決定実施例２の（Ｅ）項で得
られたビオチンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子（ｂｉ
ｏＢ）を含む長さが約１．７ｋｂのＤＮＡ断片について
、その塩基配列をプラスミドｐＵＣ１８またはｐＵＣ１
９を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法（ｄｉｄｅｏ
ｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　法）（Ｓ
ａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４、５４６３、１９７７）に
より図２に示した戦略図に従つて決定した。その塩基配
列中のオプンリ−デングフレ−ムの存在から、ビオチン
シンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子（ｂｉｏＢ）は、下記
の配列を有する３３４のアミノ酸をコ−ドする１００２
の塩基対より構成されていることが判明した。

【００８１】

【化７】

【００８２】

【化８】

【００８３】

【化９】

【００８４】

【実施例４】コリネ型細菌内で複製し安定なプラスミド
ベクタ−ｐＣＲＹ３０の作成 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２５１５
）から分離された分子量約１０メガダルトンのプラスミ
ドであり、特開平１−９５７８５号公報に記載のように
して調製した。半合成培地Ａ培地［尿素２ｇ、（ＮＨ４
）２ＳＯ４　７ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４　０．５ｇ、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４　０．５ｇ、ＭｇＳＯ４　０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ　６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ　６ｍｇ
、酵母エキス２．５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビチオン２０
０μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、グルコ−ス２０ｇ及
び純水１ｌ］１ｌに、ブレビバクテリウム・スタチオニ
ス１ＦＯ１２１４４を対数増殖期後期まで培養し、菌体
を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾ
チ−ムを含む緩衝液［２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭグル
コ−ス］２０ｍｌに懸濁し、３７℃で１時間反応させた
。反応液にアルカリ−ＳＤＳ液［０．２Ｎ　ＮａＯＨ、
１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ］４０ｍｌを添加し、緩やかに混
和して室温にて１５分間静置した。次に、この反応液に
酢酸カリウム溶液［５Ｍ酢酸カリウム溶液６０ｍｌ、酢
酸１１．５ｍｌ、純水２８．５ｍｌの混合液］３０ｍｌ
を添加し、充分混和してから氷水中に１５分間静置した
。

【００８５】溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で１０分
間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得た
。

【００８６】これに等量のフエノ−ル−クロロホルム液
（フエノ−ル：クロロホルム＝１：１混和液）を加え懸
濁した後、遠心管に移し、室温下で５分間、１５，００
０×ｇの遠心分離にかけ、水層を回収した。水層に２倍
量のエタノ−ルを加え、−２０℃で１時間静置後、４℃
で１０分間、１５，０００×ｇの遠心分離にかけ、沈澱
を回収した。

【００８７】沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液［トリス１
０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ；ＨＣｌにてｐＨ８．０に調整
］２ｍｌに溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍
濃度のＴＥ緩衝液１００ｍｌに塩化セシウム１７０ｇを
溶解させた液］１５ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌエチジウムブ
ロマイド溶液１ｍｌを加えて、密度を１．３９２ｇ／ｍ
ｌに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１６，
０００×ｇの遠心分離を行つた。

【００８８】プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射によ
り遠心管内で下方のバンドとして見い出される。このバ
ンドを注射器で遠心管の側面から抜きとることにより、
プラスミドｐＢＹ５０３を含む分画液を得た。

【００８９】次いでこの分画液を等量のイソアミルアル
コ−ルで４回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去
し、その後にＴＥ緩衝液に対して透析を行つた。このよ
うにして得られたプラスミドｐＢＹ５０３を含む透析液
に３Ｍ　酢酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに添加
した後、２倍量エタノ−ルを加え、−２０℃１時間静置
した。この溶液を１５，０００×ｇの遠心分離にかけて
ＤＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢＹ５０３を５０μｇ
得た。

【００９０】（Ｂ）プラスミドベクタ−ｐＣＲＹ３０の
作成 プラスミドｐＨＳＧ２９８（宝酒造製）０．５μｇに制
限酵素ＳａｌＩ（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃１時間反応さ
せ、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。

【００９１】前記（Ａ）項で調製したプラスミドｐＢＹ
５０３の２μｇに制限酵素ＸｈｏＩ（１ｕｎｉｔ）を３
７℃で３０分間反応させ、プラスミドＤＮＡを部分分解
した。

【００９２】両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、
制限酵素を不活性化するために６５℃で１０分間加熱処
理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５
０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
、１０ｍＭジチオスレイト−ル、１ｍＭ　ＡＴＰ及びＴ
４ＤＮＡリガ−ゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化
し、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いてエシ
エリヒア・コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製
）を形質転換した。

【００９３】形質転換株は３０μｇ／ｍｌ（最終濃度）
のカナマイシン、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
）１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）のＸ−ｇａｌ（５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド）を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エ
キス５ｇ、ＮａＣｌ　５ｇ及び純水１ｌ、ｐＨ７．２）
で３７℃にて２４時間培養し、生育株として得られた。 これらの生育株のうち、白いコロニ−で生育してきたも
のを選択し、各々プラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法［Ｔ
．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎ
ｇ”（１９８２）ｐ９０〜９１参照］により抽出した。

【００９４】その結果、プラスミドｐＨＳＧ２９８のＳ
ａｌＩ部位にプラスミドｐＢＹ５０３由来の約４．０ｋ
ｂの断片が挿入されたプラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒ
ｉが得られた。

【００９５】次に同様の方法を用い、前記（Ａ）項で得
られたプラスミドｐＢＹ５０３ＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ
Ｉ及びＥｃｏＲＩにて処理して得られる約２．１ｋｂの
ＤＮＡ断片を上記プラスミドｐＨＳＧ２９８−ｏｒｉの
ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクロ−ニングし、プラス
ミドベクタ−ｐＣＲＹ３０を調製した。

【００９６】

【実施例５】プラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ２の作成
及びコリネ型細菌への導入 実施例２の（Ｅ）項で得られたプラスミドｐＢＳ−ｂｉ
ｏＢ−ＨＳ１．７５μｇを制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ及
びＳａｃＩを各々５ｕｎｉｔづつ用い、３７℃で１時間
反応させ分解したものと、実施例４の（Ｂ）項で得られ
たプラスミドｐＣＲＹ３０　１μｇを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ　１ｕｎｉｔを用い、３７℃で１時間反応させ分解し
たものを混合し、Ｓ１ヌクレア−ゼで処理することによ
り平滑末端とした後、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．
６）、１０ｍＭジチオスレイト−ル、１ｍＭ　ＡＴＰ、
１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２およびＴ４　ＤＮＡリガ−ゼ１ｕ
ｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度であ
る）、１２℃で１５時間反応させ結合させた。このプラ
スミドを用いて、前記方法に従いエシエリヒア・コリＲ
８７５（ｂｉｏＢ１７）株を形質転換し、カナマイシン
５０μｇ／ｍｌを含む選択培地［Ｋ２ＨＰＯ４　７ｇ、
ＫＨ２ＰＯ４　２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４　１ｇ、Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．１ｇ、カザミノ酸１０ｇ、グル
コ−ス２ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１ｌに溶解］に塗抹
した。

【００９７】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドを制限酵素により切断し、アガロ−スゲル電気泳動を
用いて調べたところ、プラスミドｐＣＲＹ３０の長さ８
．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、大きさ１．７ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。

【００９８】上記の如く調製されたプラスミドＤＮＡを
、コリネ型細菌へ形質転換した。

【００９９】形質転換は、電気パルス法を用いて行つた
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
　ＢＰ−１４９７）プラスミドｐＢＹ５０２除去株を１
００ｍｌの前記Ａ培地で対数増殖初期まで培養し、ペニ
シリンＧを１ユニツト／ｍｌになるように添加して、さ
らに２時間振盪培養し、遠心分離により菌体を集め、菌
体を２０ｍｌのパルス用溶液（２７２ｍＭ　Ｓｕｃｒｏ
ｓｅ、７ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２：ｐ
Ｈ７．４）にて洗浄した。さらに菌体を遠心分離して集
め、５ｍｌのパルス用溶液に懸濁し、０．７５ｍｌの細
胞と、前記で得られたプラスミドＤＮＡ溶液５０μｌと
を混合し、水中にて２０分間静置した。ジ−ンパルサ−
（バイオラド社製）を用いて、２５００ボルト、２５μ
ＦＤに設定し、パルスを印加後氷中に２０分間静置した
。全量を３ｍｌの前記Ａ培地に移し３０℃にて１時間培
養後、カナマイシン１５μｇ／ｍｌ（最終濃度）を含む
前記Ａ寒天培地に植菌し３０℃で２〜３日間培養した。 出現したカナマイシン耐性株より、前記実施例４（Ａ）
項に記載の方法を用いてプラスミドを得た。このプラス
ミドを各種制限酵素で切断して、切断断片の大きさを測
定した。その結果を下記の表６に示す。

【０１００】

【表６】 　　表６　　　　　　　プラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉ
ｏ２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　制限酵素
　　　　認識部位数　　　　切断断片の大きさ（ｋｂ）
　　　　　　　　ＸｈｏＩ　　　　　　　　　　　１　
　　　　　　　　　　　　　１０．３　　　　　　　　
ＢａｍＨ１　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　
　　　　　１０．３　　　　　　　　ＫｐｎＩ　　　　
　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　　１０．
３　　　　　　　　ＳａｃＩ　　　　　　　　　　　１
　　　　　　　　　　　　　　１０．３　　　　　　　
　Ｓｐｈ　Ｉ　　　　　　　　　　　２　　　　　　　
　　　　　　　　８．６　、　１．７ 　　上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐ
ＣＲＹ３０−ｂｉｏ２と命名した。このプラスミドｐＣ
ＲＹ３０−ｂｉｏ２の制限酵素地図を図３に示す。なお
、プラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ２により形質転換さ
れたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３−ｂｉ
ｏ２は、茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院
微生物工業技術研究所に、平成３年２月２６日付で：微
工研菌寄第１２０４０号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１２０４０）
として寄託されている。

【０１０１】

【実施例６】プラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ２の安定
性 前記のＡ培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実施
例５で得た形質転換株ＭＪ−２３３−ｂｉｏ２を植菌し
、３０℃にて２４時間振盪培養を行つた後、同様にして
調製したＡ培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ
に分注し、１２０℃で１５分間滅菌したものに、１ｍｌ
当たり５０ｃｅｌｌｓ　の割合になるように植継し、同
じく３０℃にて２４時間振盪培養を行つた。次に遠心分
離して集菌し、菌体を洗浄後、カナマイシンを１５μｇ
／ｍｌの割合で添加したＡ培地及び無添加のＡ培地を用
いて調製した平板培地に一定量塗抹し、３０℃にて１日
培養後生育コロニ−をカウントした。

【０１０２】この結果、カナマイシン添加および無添加
培地に生育したコロニ−は同数であること、さらにＡ培
地生育コロニ−は全てカナマイシン添加培地に生育する
こと、すなわち該プラスミドの高度の安定性を確認した
。

【０１０３】

【実施例７】ビオチンシンセタ−ゼの製造培地（尿素０
．２％、硫酸アンモニウム０．７％、ＫＨ２ＰＯ４　０
．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４　０．０５％、ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２Ｏ　０．０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　６ｐｐｍ
、ＭｎＳＯ４・４〜６Ｈ２Ｏ　６ｐｐｍ、チアミン・Ｈ
Ｃｌ　１００μｇ／ｌ、及びビオチン２００μｇ／ｌ）
１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注、滅菌（
滅菌後ｐＨ７．０）した後、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３−ｂｉｏ２株を植菌し、無菌的にグル
コ−スを最終濃度２％（Ｗ／Ｖ）なるように加え、３０
℃にて３日間振とう培養を行つた。

【０１０４】対照としてプラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉ
ｏ２を保持しないブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３株を植菌し、同様に培養を行つた。

【０１０５】培養液をベツクマン遠心機　Ｍｏｄｅｌ　
Ｊ２−２１を用いて、８０００ｒｐｍで１０分間、遠心
し、菌体を集菌する。本試量菌体約５ｍｇに、０．５Ｍ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）を０．１２５ｍｌ、
１０％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを０．２００ｍｌ、β−メルカ
プトエタノ−ルを０．０５０ｍｌを添加し、水で全量を
１．０ｍｌに合わせる。この試料液を沸騰水中で約３分
間処理する。上記の試料液１ｍｌに対して、０．０５％
（Ｗ／Ｖ）ＢＰＢと７０％（Ｖ／Ｖ）グリセロ−ルを含
む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の０
．１ｍｌを加えたものを泳動用試料液とする。

【０１０６】試料液を「第一化学薬品（株）」製ＳＤＳ
−ＰＡＧプレ−ト１０／２０−１０１０を用い、試料を
５μｌアプライした後、６０ｍＡの定電流で、約６０分
間泳動する。

【０１０７】Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ
　Ｂｌｕｅ　Ｒ−２５０の０．２５％（Ｗ／Ｖ）（正味
の濃度）を含むエタノ−ル−酢酸−水（９：２：９、Ｖ
／Ｖ）混液にゲルプレ−トを浸して分離ゲル中の試料蛋
白質の染色を行う。室温で約６時間染色した後、エタノ
−ル、酢酸、水（２５：８：６５、Ｖ／Ｖ）混液（脱色
液）に浸し、軽く振盪し、直ちに、新しい脱色液と交換
する。以後は、約１時間ごとに新しい脱色液と交換する
。この脱色操作を分離ゲル中の蛋白質のバンドがかなり
明瞭に見えるようになるまで繰り返す（３〜５時間）。 つぎに、分離ゲルをメタノ−ル−酢酸−水（１０：１５
：１７５、Ｖ／Ｖ）混液（保存液）に浸して、蛋白質の
存在していない部分（バツクグランド）を完全に脱色す
る。かくして、ゲル上に分子量約３万のタンパク質のバ
ンドとして染色されていることにより、ビオチンシンセ
タ−ゼが菌体内で産生されていることを確認することが
できる。このバンドの濃度を、フアルマシア社製「Ｕｌ
ｔｒｏ　Ｓｃａｎ　ＸＬレ−ザ−デンシトメ−タ−」を
用いて、測定した結果、ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３−ｂｉｏ２株中に含まれるビオチンシンセ
タ−ゼの含量は、ｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ２を保持しない
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株に比べて
、約５倍に上昇していることが明らかとなつた。

【０１０８】

【発明の効果】本発明の新規なＤＮＡ断片は、コリネ型
細菌のビオチン生合成に関与する酵素にうち、ビオチン
シンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子（ｂｉｏＢ）を含むＤ
ＮＡ断片であり、該ＤＮＡ断片を含む本発明のプラスミ
ドを用いることにより、コリネ型細菌に属する微生物の
遺伝子操作による改良が可能となる。

【０１０９】また、このようにして改良された本発明の
コリネ型細菌に属する微生物を培養することにより、微
生物菌体内でビオチンシンセタ−ゼの産生が増加し、該
酵素の菌体内への高度蓄積が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　本発明のビオチンシンセタ−ゼをコ−ドす
る遺伝子（ｂｉｏＢ）を含むＤＮＡ断片の制限酵素によ
る切断点地図。

【図２】　　大きさが約１．７ｋｂの本発明ＤＮＡ断片
の塩基配列決定のための戦略図。

【図３】　　本発明のプラスミドｐＣＲＹ３０−ｂｉｏ
２の制限酵素切断点地図。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　コリネ型細菌由来のビオチンシンセタ
   −ゼをコ−ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】　　コリネ型細菌がビオチン要求性の菌株
   である請求項１記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】　　ビオチン要求性のコリネ型細菌がブレ
   ビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
   ｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３である請求項２記載
   のＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】　　大きさが約５．５ｋｂ、約３．０ｋｂ
   または約１．７ｋｂである請求項２記載のＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】　　次のＤＮＡ塩基配列で表されるビオチ
   ンシンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子ＤＮＡ断片。 【化１】
6. 【請求項６】　　次のアミノ酸配列に表されるビオチン
   シンセタ−ゼをコ−ドする遺伝子ＤＮＡ断片。 【化２】 【化３】
7. 【請求項７】　　請求項１〜６のいずれかに記載された
   ＤＮＡ断片が導入された組換えプラスミド。
8. 【請求項８】　　請求項１〜６のいずれかに記載された
   ＤＮＡ断片と、プラスミドｐＢＹ５０３に由来するコリ
   ネ型細菌内で複製増殖機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断
   片及び安定化機能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を保有
   する組換えプラスミド。
9. 【請求項９】　　請求項７〜８のいずれかに記載の組換
   えプラスミドで形質転換されたコリネ型細菌。
10. 【請求項１０】　　請求項９記載のコリネ型細菌を培養
    し、培養物中にビオチンシンセタ−ゼを生成せしめるこ
    とを特徴とするビオチンシンセタ−ゼの製造法。