JPH037591A - Ｌ―トリプトファンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノーヘブツロソネ
ート−７−ホスフェートシンターゼ（以下ＤＳと略す）
、アンスラニル酸シンターゼ（以下ＡＳと略す）、アン
スラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下Ｐ
ＲＴと略す）、Ｎ−５１−ホスホリボシルアランスラニ
ル酸イソメラーゼ（以下ＰＲＡＩと略す）、インドール
−３−グリセロールリン酸シンターゼ（以下１ｎＧＰＳ
と略す）、トリプトファンシンターゼ（以下ＴＳと略す
）および３−ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ（以
下ＰＧＤＨと略す）の合成に関与する遺伝子（以下それ
ぞれＤＳ遺伝子、ＡＳ遺伝子。

ＰＲＴ遺伝子、ＰＲＡＩ遺伝子、ＩｎＧＰＳ遺伝子、Ｔ
Ｓ遺伝子、ＰＧＤＨ遺伝子と称すこともある）の全てを
含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する微生物に保有させ、該微生物を培地に培養し、培養
物中にＬ　−）　＋Ｊブトファンを生成蓄積させ、該培
養物からＬ　−）　ＩＪブトファンを採取することを特
徴とするＬ−トリプトファンの製造法に関する。従って
、本発明はバイオインダストリーの産業分野に関し、特
に医薬、飼料工業において有用なＬ　−）　Ｕブトファ
ンの製造分野に関する。

従来の技術 組換えＤＮＡ技術により、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属し、Ｌ−）リブトファン生産
能を有する菌株が種々作成されている。たとえば、ＡＳ
遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（特開昭５９−１５６２９
２）　、　ＰＲＴ遺伝子、ＰＲＡＩ遺伝子、ＩｎＧＰＳ
遺伝子およびＴＳ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ　（特開
昭６ｌ−１４９０８２）　、　ＤＳ遺伝子を含む組換え
体ＤＮＡ　（特開昭６２−５１９８０＞。

ＰＲＡＩ−１ｎＧＰＳ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ（特
開昭６２−７９７７５）、　Ｄ　Ｓ遺伝子およびＡＳ−
ＴＳ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ　ＣＢ本農菫化学会誌
６３　　、（３）　ｐ、７０１（１９８９）］をそれぞ
れ導入したＬ−トリプトファン生産菌などが知られてい
る。

さらに、バチルス属に属し、セリン生合成系遺伝子を含
む組換え体ＤＮＡを導入したＬ　−）　ＩＩブトファン
生産菌（特開昭６４−６７１７８．　　特開昭６４−６
７１７９）を用いたＬ−）！Ｊブトファンの製造法も知
られている。

発明が解決しようとする課題および解決のための手段 近年、Ｌ　−）　ＩＪブトファンの需要が増大するにつ
れてその製造法の改善が強く望まれている。本発明者は
、このような状況を考慮し、組換えＤＮＡ技術を有効に
活用し、すぐれたＬ−）！Ｊブトファン生産菌を造成す
るため鋭意研究を重ねた。その結果、微生物のＤＳ、Ａ
Ｓ、ＰＲＴ、ＰＲＡＩ。

ＩｎＧＰＳ、ＴＳおよびＰＧＤＨの合成に関与する遺伝
情報の全てを含むＤＮＡ断片を組み込んだ組換え体ＤＮ
Ａをコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
菌種に導入することにより、該菌株のＬ−）ＩＪブトフ
ァン生産能が改良されることを見出し、本発明を完成す
るに至った。ＤＳ。

ＡＳ、ＰＲＴ、ＰＲＡＩ、ＩｎＧＰＳ、ＴＳおよびＰＣ
ＤＨの全ての遺伝子を併用した例゛は知られておらず、
これらすべての遺伝子の同時増幅により、Ｌ−）！Ｉブ
トファンの生産性が一役と向上することは本発明により
初めて見出されたものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明は、微生物のＤＳ、ＡＳ、ＰＲＴ、ＰＲＡＩ。

ＩｎＧＰＳ、ＴＳおよびＰＧＤＨの合成に関与する遺伝
情報の全てを含むＤＮＡ断片とベクターとの組換え体Ｄ
ＮＡを保有するコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物中に
Ｌ−トリプトファンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−
）ＩＪブトファンを採取することを特徴とするＬ−トリ
プトファンの製造法を提供する。

ｌＤＮＡ断片としては、コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物に由来するものがあ
げられる。

上ｌ２各遺伝子の供給源となる微生物としては、芳香族
アミノ酸の生合成において自己栄養性の微生物であれば
いかなる微生物でもよい。とりわけ、原核生物である細
菌、たとえばニジエリシア属。

コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属
する菌株の遺伝子が望ましく、とくにこれらの細菌から
誘導された芳香族アミノ酸生産性変異株由来の遺伝子が
好適である。

宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物としては、コリネ型
グルタミン酸生産菌として知られている微生物は全て用
いることができるが、好適には下詑の菌株が用いられる
。

コリネバクテリウム・グルタミクム　ＡＴＣＣ１３０３
２コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム＾ＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・ハーキュリス　ＡＴＣＣ１３８６
８コリネバクテリウム・リリウム　　　　ＡＴＣＣ１５
９９０コリネバクテリウム・メラセコーラ　　ＡＴＣＣ
ｌ’！９６５ブレビバクテリウム・デイバリカラム＾Ｔ
ＣＣ１４０２０ブレビバクテリウム・フラブム　　　　
ＡＴＣＣ１４０６７ブレビバクテリウム・イマリオフィ
ラムＡＴＣＣ１４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム＾ＴＣＣ１
３８６９ ブレビバクテリウム・チオゲニタリスへＴこ［：　１９
２４０これらの細菌から変異誘導された芳香族アミノ酸
生産性菌株はさらに好ましい宿主として用いることがで
きる。これら生産性変異株はアミノ酸要求性、アミノ酸
アナログ耐性あるいはこれを併存する菌株として取得す
ることができる〔日本農芸化学会誌、　５０．　（１）
ρ、Ｒ，７９（１９７６）　’］。

ｌＤＮＡを組み込むためのベクターとしては、コリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種中で自律
Ｉ！Ｊｔ！ｌｌＩできるものであれば特に限定されない
が、例えばｐＣＧＩ（特開昭５７−１３４５００）　。

ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７）、　　ｐＣＧ４．
　　ｐｃＧｌｌくいずれも特開昭５７−１８３７９９）
、ｐＣＥ５４．　　ｐＣＢｌｏｌ（いずれも特開昭５８
−１０５９９９）、　ｐ　ＣＥ　５１ｐＣＥ５２．ｐＣ
Ｅ５３（いずれもモレキュラー・アンド・ジェネラル・
ジエネティクス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、）　１９６，１７５　（１９８４）　：］
などのプラスミドを使用することができる。

ＤＳをコードする遺伝子を含む供与体ＤＮＡとベクター
ＤＮＡとの組換え体ＤＮＡは、試験管内で両ＤＮＡを制
限酵素で切断した後、ＤＮＡ’Ｊガーゼで処理するか、
またはその切断末端をターミナルトランスフェラーゼや
ＤＮＡポリメラーゼなどで処理した後、ＤＮＡＩＪガー
ゼを作用させて結合する常法〔メソッヅ・イン・エンチ
モロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）　６８　（１９７９）　〕により種々の組換え体混
成物とともに生成させることができる。この混成物を用
いて、ＤＳをコードする遺伝子の欠失したコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属の変異株を形質転
換し、欠損形質が相補された形質転換株を選択し、この
形質転換株の有するプラスミドを単離することによって
ＤＳをコードする遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを取得で
きる。コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属微生物の形質転換法としては、プロトプラストを用い
る方法（特開昭５７−１３６４９２および特開昭５７−
１８６４８９）により実施することができる。

同様にして、トリプトファン生合成系遺伝子を含む供与
体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡを得るこ
とができる。すなわち、染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡ
との組換え体混成物を用いて、コリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属のトリプトファン生合成系遺
伝子のいずれかが欠損したトリプトファン要求性変異株
を形質転換し、トリプトファン非要求性となった形質転
換株からトリプトファン生合成系遺伝子を含む組換え体
ＤＮＡを取得できる。トリプトファン生合成系遺伝子の
同定は、コリネバクテリウム属。

ブレビバクテリウム属またはエシェリシγ属に属する微
生物から変異誘導され、遺伝子の欠損部位が既に同定さ
れているトリプトファン要求性変異株を用いた相補試験
により行うことができる。

実施例１（３）に示すように、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムの染色体ＤＮＡを供与源とした場合には、ト
リプトファン生合成に係わるＡＳ、ＰＲＴ、ＰＲＡＩ、
ＩｎＧＰＳおよびＴＳの合成に関与する全ての遺伝情報
は１１．０キロベース（ｋｂ）のＢａｍＨＩ　　ＤＮＡ
断片として単離される。

ＰＧＤＨ遺伝子を含む供与体ＤＮＡとベクターＤＮＡと
の組換え体ＤＮＡも、染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡと
の組換え体混成物を用いて、コリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属のＰＧＤＨ遺伝子が欠損したセ
リン要求性変異株を形質転換し、セリン非要求性となっ
た形質転換株を選択することによって同様に取得できる
。

以上のようにして取得したＤＳ遺伝子を含む組換え体Ｄ
ＮＡ、ト’Ｊブトファン生合成系遺伝子を含むＤＮＡお
よびＰＧＤＨ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡから各遺伝子
を含むＤＮＡ断片を切り出し順次組み換えて、全遺伝子
を同時に含む組換え体ＤＮＡを作製することができる。

この組換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入することにより
、上記遺伝子を同時に増幅することができる。細胞内で
共存できる別個のベクターＤＮＡに各々の遺伝子を組み
換え、それらの組換え体ＤＮＡと宿主微生物に共有させ
ても同様な同時増幅が可能である。

上記の組換え体ＤＮＡが、コリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属菌種由来の野生型のＤＳ遺伝子、
トリプトファン生合成系遺伝子およびＰＧＤＨ遺伝子を
含む場合、増幅効果によって各酵素の合成量は高まり、
それによって宿主微生物のトリプトファン合成能を強化
することができる。しかしながら、コリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属菌種において、ＤＳはフ
ェニルアラニンおよびチロシンでフィードバック阻害を
受け、またＡＳおよびＰＲＴはトリプトファンでフィー
ドバック阻害を受けることが知られている〔アグリ力ル
チニラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａ
ｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　３９゜３５１　（
１９７５）、同書　４７．２２９５　（１９８３）　］
。従って、これらのフィードバック阻害から解除された
変異型のＤＳ、ＡＳおよびＰＲＴをコードする遺伝子を
有する組換え体ＤＮＡを用いる方が、コリネバクテリウ
ム属またはブレビバクテリウム属微生物に高いＬ　−）
　ＩＪブトファン生産能を付与できるので好ましい。変
異型のＤＳ、ＡＳおよびＰＲＴ遺伝子は、フィードバッ
ク阻害から解除された変異型のＤＳ、ＡＳまたはＰＲＴ
をコードする遺伝子を有するコリネバクテリウム属また
はブレビバクテリウム属の変異株の染色体ＤＮＡを供与
源として、前記のようにＤＳ遺伝子またはトリプトファ
ン生合成系遺伝子の欠損変異の相補により得ることがで
きる。あるいは、野生型のＤＳまたはＡＳおよびＰＲＴ
を有するコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌種を受容菌として、各々、フェニルアラニンのア
ナログ、例えばパラフルオロフェニルアラニン（以下、
ＰＰＰと略す）、トリプトファンのアナログ、例えば５
−フルオロトリプトファン（以下、５ＦＴと略す）に耐
性となった形質転換株を選択することによっても、クロ
ーニングすることができる。変異型のＤＳ。

ＡＳおよびＰＲＴをコードする遺伝子を有する組換え体
ＤＮＡの作製は、野生型の両遺伝子を有する組換え体Ｄ
ＮＡを６作製するのと同様な方法で実施可能である。変
異型のＤＳ、ＡＳおよびＰＲＴをコードする遺伝子を有
する組換え体Ｉ）ＮＡは、野生型の両遺伝子を有する組
換え体ＤＮＡを１ｎｖｉｔｒｏで変異処理〔モレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏ１．Ｇ
ｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）　１４５゜１０１　（１９７８）
］するか、あるいは、その組換え体ＤＮＡを保有する微
生物を常法通り変異処理することによっても得ることが
できる。野生型または変異型のＤＳ遺伝子、トリプトフ
ァン生合成系遺伝子およびＰＧＤＨ遺伝子を同時に含む
組換え体ＤＮＡは、前記のようなプロトプラストを用い
る形質転換法によりコリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属徹生物に導入できる。

これらの組換え体ＤＮＡ保有株によるＬ−）ＩＪブトフ
ァンの生産は、発酵法によるアミノ酸の製造に用いられ
る培養方法により行うことができる。

すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無機物、ア
ミノ酸、ビタミンなどを含有する培地中、好気的条件下
、温度、ｐＨなどを調節しつつ培養を行えば、培養物中
にＬ　−）　Ｕブトファンが生成蓄積するのでこれを採
取する。

炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス　シ二一りロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物、ポリアルコール
、ピルビン酸１　フマール酸。

乳酸、酢酸などの各種有機酸が使用できる。さらに微生
物の資化性によって、炭化水素、アルコール類なども用
いられる。特に廃ａ蜜は好適に用いられる。

窒素源としてはアンモニアまたは塩化アンモニウム、硫
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
などの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは尿
素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、ＮＺ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチーブ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィツシュミールまたはその
消化物桶加水分解物などの窒素含有有機物など種々のも
のが使用可能である。

さらに無機物としては、リン酸第−水素カリウム１　リ
ン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム塩化アンモニ
ウム、硫酸マグネシウム１塩化ナトリウム３硫酸第一鉄
、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用する。

ビタミン１　アミノ酸としては、使用する培地の炭素源
、窒素源などによって異なるが、必要に応じ、ビオチン
、サイアミンなどを添加する。また使用する菌株が、要
求性を示す場合は、その要求物質を添加する。

培養は振盪培養または通気撹拌培養などの好気的条件下
に行う。培養温度は一般に２０〜４０℃が好適である。

培地のｐＨは中性付近に維持することが望ましい。培養
期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−）　ＩＪブトファ
ンが蓄積する。培養終了後、菌体を除去して活性炭処理
、イオン交換樹脂処理などの公知の方法で培養液からＬ
　−１−Ｕブトファンを回収する。

このようにして、ＤＳ遺伝子、トリプトファン生合成系
遺伝子およびＰＣＤＨ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを保
有させたコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属菌株を用いることにより、高い収率でり、−）ＩＪ
ブトファンを生産することができる。

本胡細書では、コリネバクテリウム・グルタミクムに、
ＤＳ、ＡＳ、ＰＲＴ、ＰＲＡ　Ｉ、Ｉ　ｎＧＰＳＴＳお
よびＰＧＤＨの合成に関与する遺伝情報の全てを含む組
換え体ＤＮＡを導入し、Ｌ　−）　ＩＪブトファンの生
産性の向上について例示したが、代わりに他のコリネ型
グルタミン酸生産菌を用いても目的は達成される。

グルタミン酸高生産能を有するいわゆるコリネ型グルタ
ミン酸生産菌は、主な菌学的性質を同じくしているにも
かかわらず、産業上の重要性から、各研究者により、種
々の囲包が付されており、属名までも、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属など種々である。し
かしながら、これらの菌群は、細胞壁のアミノ酸構成や
ＤＮＡの塩基組成が画一的であることから、同一の菌種
であることが指摘されていた。さらに、これらの菌種間
には、７０〜８０％以上のＤＮＡの相同性があることが
明らかにされ、非常に近縁な微生物であることが明白で
ある〔コマッ　ヮイ（ＫｏｍａｔｓｕＹ、）：＋７ポー
ト　オブ　ザ　ファーメンテイティブ　リサーチ　イン
スティチュート（Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆｔｈｅ　Ｆｅｒｍ
ｅｎｔａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ
ｔｅ）、　Ｎｎ５５゜１、　　＜１９８０）およびスズ
キ　ケイ１．カネコ　ティコマガタ　ケイ　（Ｓｕｚｕ
ｋｉ、　Ｋ、、Ｋａｎｅｋｏ、　Ｔ、、　ａｎｄＫｏｍ
ａｇａｔａ、　Ｋ、）　　：インターナショナル　ジャ
ーナル　オブ　システマティック　バタテリオロジイ（
Ｉｎｔ、Ｊ、５ｙｓｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、　　
　３１．　１３１　　（１９８１，）参照〕　。

上記の事実を踏まえればコリネ型グルタミン酸生産菌全
般での効果が容易に類推される。その効果の有無は組換
え体ＤＮＡがコリネ型グルタミン酸生産菌全般で自律的
に複製し、ＤＳ遺伝子、トリプトファン生合成系遺伝子
およびＰＣＤＨ遺伝子が形質発現できるか否かに係わり
、コリネ型グルタミン酸生産菌間のＤＮＡ相同性などに
おける若干の相違は何ら関係ない。しかるにこれらの菌
種がプラスミドの複製と遺伝子発現に係わる機能を等し
く保持していることは、特開昭５７−１８３７９９に開
示したコリネバクテリウム・グルタミクム２２５−２５
０株から分離され、スペクチノマイシンおよび／または
ストレプトマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＣ
Ｇ４がコリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム
属菌種などコリネ型グルタミン酸生産菌内で同じく複製
でき、またその耐性遺伝子が発現される（特開昭５７−
１８６４９２）ことから明らかである。従って、本発明
のＤＳ、　ＡＳ、ＰＲＴ、ＰＲＡＩ、ＩｎＧＰＳＳＴＳ
およびＰＧＤＨの合成に関与する遺伝情報の全てを含む
組換え体ＤＮＡを導入することによるＬ−）リプトファ
ン生産菌の作製法を適用し得る菌株は、コリネバクテリ
ウム・グルタミクムに限らすコリネバクテリウム属およ
びブレビバクテリウム属菌種を含むコリネ型グルタミン
酸生産菌全てが含まれる。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１゜ コリネバクテリウム・グルタミクムに３８のＤＳ遺伝子
、コリネバクテリウム・グルタミクムに５５のＡＳ、Ｐ
ＲＴ、ＰＲＡＩ、ＩｎＧＰＳおよびＴＳの合成に関与す
る全ての遺伝子およびコリネバクテリウム・グルタミク
ムＡＴＣＣ３１８３３のＰＧＤＨ遺伝子を同時に含む組
換え体プラスミドを保有する菌株によるトリプトファン
の生産（１）コリネバクテリウム・グルタミクムに３８
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−４５４）、　　コリネバクテリウ
ム・グルタミクムに５５　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８６４
）およびコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３
１８３３の染色体ＤＮＡおよびベクターｐＣＥ５３とｐ
ｃｃ　ｌ　ｌ　６の調製ＮＢ培地（粉末ブイヨン２０ｇ
、酵母エキス５ｇを水ＩＩｌに含み、ｐＨ７，２に調整
した培地）でそれぞれ増殖したコリネバクテリウム・グ
ルタミクムに３８　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−４５４）（Ｐ
ＰＰおよびパラ−アミノフェニルアラニンの耐性形質を
有している）、コリネバクテリウム・グルタミクムに５
５　（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８６４）　　（フェニルアラ
ニンおよびチロシン要求性で、５−メチルトリプトファ
ン、トリプトファンハイドロキサメート、６−フルオロ
トリプトファン、４−メチルトリプトファン、ＰＰＰ、
パラ−アミノフェニルアラニン、チロシンハイドロキサ
メートおよびフェニルアラニンハイドロキサメートの耐
性形質を有している）およびコリネバクテリウム・グル
タミクムＡＴＣＣ３１８３３０種培養２０ｍ１を、それ
ぞれフェニルアラニンふよびチロシン各１００ｇｇ／ｍ
＋を含む半合成培地ＳＳＭ（グルコース２０ｇ１（ＮＨ
，）２３０．１０　ｇ＋尿素３ｇ、酵母エキスＩｇ、Ｋ
ＨｉＰＯ１Ｉｇ、ＭｇＣＬ・６Ｈ３００，４ｇ、ＦｅＳ
○４４　ＨａＯ１０ｍｇ、　Ｍｎ　ＳＯ４・４〜６Ｈ２
００，２ｆｆ１ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ７○０．９ｍｇ、
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４ｍｇ。

ＮａａＢｎＯｔ’１ＯＨｓＯＯ，０９ｍｇ、（ＮＨ＜）
ｓＭｏｔｏ２４・４−ＨａＯ０，０４ｍｇ、ビオチン３
０尾およびサイアミン塩酸塩１　ｍｇを水ｌｌに含み、
ｐＨ７゜２に調整した培地〕４００ｍ１に接種して３０
℃で振盪培養した。東京光電比色計で６６０ｎｍにおけ
る吸光度（ＯＤ）を測定（以下特記しないかぎり吸光度
は６６０ｎｍで測定）し、ＯＤが０゜２になった時点で
培養液へ０．５単位／ｍ＋の濃度となるようにペニシリ
ンＧを添加した。さらに培養を継続し、ＯＤが０．６に
なるまで生育させた。

培養液から菌体をそれぞれ集菌し、ＴＢＳ緩衝液［：０
．０３Ｍ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以
下トリスと略す）、０．００５Ｍエチレンジアミン四酢
酸二ナトリウム（以下、ＥＤＴＡと略す）、０．０５Ｍ
　　ＮａＣｊｉ、ｐＨ８，０〕で洗浄後、リゾチーム溶
液（２５％ショ糖、０．ＩＭ　　ＮａＣ１，０，０５Ｍ
）リス、０．８ｍｇ　／　ｍ　Ｉリゾチーム、ｐＨ８，
０）１０ｍｌに懸濁し、３７℃で２時間反応を行った。

集菌した菌体から斎藤−三浦の方法Ｃ３ａｉｔｏ、　Ｈ
，ａｎｄ　Ｍｉｕｒａ、　Ｋ＝バイオキミ力・工・バイ
オフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、＾ｃｔａ）、７２．６１９（１９６３）　］に従っ
て高分子染色体ＤＮＡを単離した。

ベクターとして用いるｐＣＥ５３は、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムのプラスミドｒ＋ｃＧｌ　　（特開昭
５７−１３４５００）とニジエリシア・コリのプラスミ
ドｐＧＡ２２ＣＧ、八ｎ、　ｅｔ　ａｔ：ジャーナル・
オブ・バタテリオロジイ　（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１４０．４００　＜１９７９
）参照〕を和合連結させたプラスミドである。詳しくは
ｐｃｃ　ｌ上のＢｇｉＵ切断部位とｐＧＡ２２上に２カ
所あるＢａｍＨＩ切断部位のうちテトラサイタリン耐性
遺伝子内でないＢａｍ）（Ｉ切断部位とで、両制限酵素
の同一接着末端を利用して連結したものである。ｐＣＥ
５３はｒ＋ＧＡ２２由来のカナマイシン耐性遺伝子など
の選択マーカーを有し、制限酵素ＢａｍＨ１に対する切
断部位は１カ所である。

同じく、ベクターとして用いるｐｃｃ　１１６は、コリ
ネバクテリウム・グルタミクムのプラスミドｐｃＧ１１
（特開昭５７−１３４５００）上の５ｔｕｌおよびＰｓ
ｔｌ切断部位に、Ｍ１３ｒｎｐ１８　　ＲＦ　　ＤＮＡ
　（宝酒造社製）をＥｃｏＲＩで切断後、りｌ／ノー断
片（宝酒造社製）で平滑末端に修復し、さらにｐｓｔｉ
で切断して得たリンカ−を両者の各々、平滑末端、接着
末端を利用して結合させたプラスミドである。ｐｃＧ１
１６は分子長駒６．５　Ｋ　ｂのプラスミドで、単一の
制限酵素切断部位と（−てＢｇβ■。

Ｐｓ　ｔ　Ｉ、Ｓａｉ’　１．Ｘｂａ　Ｉ、ＢａｍＨＩ
。

Ｓｍａ　１．Ｋｐｎ　ＩおよびＳａｃ　Ｉを有し、スト
レプトマイシンおよび／またはスベクチノマイシン耐性
の表現型を与える（第１図参照）。

ｐＣＥ５３およびｐｃＧ１１６は各々を保有するコリネ
バクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２または
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
の培養菌体から次の方法でそれぞれ単離した。

ｐＣＥ５３またはｐｃＧ１１６を保有するコリネバクテ
リウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ｔたはコリネ
バクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３を、４
００ｍｌＳＳＭ培地で、３０℃にて振盪培養し、上記と
同様にしてペニシリンＧ処理後、ＯＤが約０．６になる
まで生育させた。菌体を集菌しＴＥＳ緩衡液で洗浄後、
リゾチーム溶液１０ｍ１に懸濁し、３７℃で２時間反応
させた。反応液に５Ｍ　ＮａＣβ２．４ｍｌ、０．５Ｍ
ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，５）０．６ｍｌ、４％ラウリル硫
酸ナトリウムと０．７Ｍ　　ＮａＣｊ！からなる溶液４
．４ｍｌを順次添加し、緩やかに混和してから氷水上に
１５時間装いた。溶菌物を遠心管に移し、４℃で６０分
間６９．４００　Ｘ　ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収
した。これに重量百分率１０％相当のポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）　６，０００　　（半井化学薬品社製
）を加え、静かに混和して溶解後、氷水上に置いた。１
０時間後、１５００Ｘｇで１０分間遠心分離してペレッ
トを回収した。ＴＥＳ緩衝緩衝液５奢ｌえてペレットを
静かに再溶解してから１．５ｍｇ／ｍｌエチジウムブロ
マイド２．０ｍｌを添加し、これに塩化セシウムを加え
て静かに溶解し、密度を１、５８０に合わせた。

この溶液を１０５，０００Ｘｇ、１８℃で４８時間超遠
心分離にかけ、紫外線照射下に検知される遠心チューブ
下方の密度の高い位置のバンドを遠心チューブの側面か
ら注射器で抜きとることによって、ｐＣＥ５３およびｐ
ｃＧ１１６ブラスミドＤＮＡをそれぞれ分離した。この
分画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容量百分
率９０％イソプロピルアルコール、１０％ＴＢＳ緩衝液
（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウムを含む）〕で
５回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、しか
る後にＴＢＳ緩衝液に対して透析した。

（２）ＤＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニング上記
で、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０
３２から調製したｐｃＧ１１６プラスミドＤＮＡ３■を
含む反応液Ｙ−１００（トリスｌ　ＯｍＭ、ＭｇＣｊ！
２　６ｍＭ、ＮａＣｊ！１００ｍＭ、ｐＨ７，５＞６０
ｍに６単位のＳａｊ！■　（宝酒造社製、以下特記しな
いかぎり制限酵素は宝酒造社製）および１３ｇＩＵを添
加し、３７℃で６０分間反応させた。一方、コリネバク
テリウム・グルタミクムに３８　（ＦＥＲＭＢＰ−４５
４）の染色体ＤＮＡ　　３■を含むＹ−１００反応液１
４０ｍに６単位のＳａｊ！　ＩおよびＢｇβ■を添加し
、３７℃で６０分間反応させた。いずれもフェノール処
理により反応を停止させた。両反応液を混合し、２容の
エタノールを加えてＤＮＡを沈澱回収後、水２００ｍに
溶解した。

このＤＮＡ溶液２００誠に１０倍濃度のＴ４リガーゼ用
緩衝液（トリス６６０　ｍＭ、　Ｍ　ｇ　Ｃ１２６６ｍ
Ｍ、　　ジチオスレイトールｌ　ＯＯｍＭ。

ｐＨ７，６）４０ｇ１２．５ｍＭ　　ＡＴＰ　　４０Ｊ
ＪＪ！。

Ｔ４１Ｊガーゼ（宝酒造社製）３００単位および水１２
０頭を加え、１２℃で１６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＡＴＣＣｌ　３０３２の形質転換に供した。コリ
ネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の種
培養４ｍｌをＳＳＭ培地４０ｍ１に植菌し、３０℃で振
盪培養した。

ＯＤが０．２になった時点で上記（１〕と同様な方法で
ペニシリンＧ処理後、ＯＤが０．６になるまで生育させ
た。菌体を集菌し、該細胞をＲＣＧＰ培地〔グルコース
５ｇ１カザミノ酸５ｇ１酵母エキス２．５ｇ、に２ＨＰ
Ｏ４３，５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ、ＭｇＣｊ！２・
６ＨａＯＯ，４ＬｇＳＦｅＳＯ＜・７　Ｈ２Ｏ１０ｍｇ
、　Ｍｎ　Ｓ　０４　・４〜６　Ｈ２Ｏ２ｍｇ、Ｚｎ５
Ｏａ・７Ｈ２００，９ｍｇ、（ＮＨ，＞６Ｍ０ｖＯ２，
＊’　４Ｈ２００，０４ｍｇ、ビオチン３０■、サイア
ミン塩酸塩２ｍｇ、コハク酸二ナトリウム１３５ｇ、ポ
リビニルピロリドン（分子量１０．０００）３０ｇを水
１１に含む培地〕に１ｍｇ　／　ｍ　Ｉのリゾチームを
含む溶液（ｐＨ７，６）１０■１に約１０″細胞／ｍ＋
となるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して３０℃で１６
時時間巾かに振盪反応してプロトプラスト化した。

このプロトプラスト菌液０．５ｍｌを小試験管にとり、
２，５００Ｘｇで５分間遠心分離し、ＴＳＭＣ緩衝液（
ＭｇＣｊ！２１０ｍＭ、ＣａＣＬ３０ｍＭ、）、リス５
０ｍＭ、　　シＢＩ４００ｍＭ。

ｐＨ７，５＞１ｍｌに再懸濁して遠心洗浄後、ＴＳＭＣ
１ｌ衝液Ｑ、１ｍｌに再懸濁した。この菌液に２倍高濃
度のＴＳＭＣｉｌ衝液と上記リガーゼ反応液の１対１混
合液１００頭を加えて混和し、次いでＴＳＭＣ緩衝液中
に２０％ＰＥＧ６，０００を含む液０．８ｍｌを添加し
て混合した。３分後、ＲＣＧＰ培地（ｐＨ７，２）２ｍ
ｌを添加し、２，５００×ｇで５分間遠心分離にかけて
上澄液を除去し、沈降したプロトプラストを１ｍｌのＲ
ＣＧＰ培地に懸濁してから、この菌液０．２ｍｌをスペ
クチノマイシ：／　４００　ｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒
天培地（ＲＣＧＰ培地に１．４％寒天を含む培地、ｐＨ
７，２）に塗布し、３０℃で７日間培養した。

寒天培地上に生育したコロニーをかき集め、生理食塩水
で２回遠心洗浄後、生理食塩水１ｍｌに懸濁した。この
菌液をＰ　Ｆ　Ｐ　３　Ｌｌ１ｇ／ｍｌおよびスベクチ
ノマイシン１００■／ｍｌを含有する最少寒天培地Ｍ１
［グルコースＩＱｇ、　　（ＮＨ，）ＨａＰＯｌＩｇ、
ＫＣｉ！　０．２ｇ、ＭｇＳＯ４・７ＨｉＯ０，２ｇ、
Ｆｅ５ｏ４・？Ｈ２０１０ｍｇ。

Ｍｎ５Ｏｓ・４〜６Ｈ２００，２ｍｇ、ＺｎＳＯ４’７
　Ｈ２Ｏ０，９ｍｇ、　Ｃｕ　Ｓ○ｓ・５Ｈ２００，４
ｍｇ。

Ｎａ２Ｂ＜Ｏｔ”１ＯＨ２００，０９Ｌｌ１ｇ、（ＮＨ
ｓ）ｓＭＯｔ０２４”　４）４２００．０４ｍｇ、ビオ
チン５０ｇｇ、ｐ−アミノ安息香酸２．５ｍｇ、サイア
ミン塩酸塩ｌｆｆ１ｇおよび寒天１６ｇを水ｌｌ中に含
み、ｐＨ７，２に調整した培地〕上に再塗布して３０℃
で５日間培養し、ＰＰＰおよびスペクチノマイシンに耐
性となった形質転換株を選択した。

これらの形質転換株から、上記（１）でｐＣＧ１１６を
単離したのと同様な方法でプラスミドＤＮＡを単離した
。形質転換株の一株から得られ、ｐＣＧＤＳｌと命名し
たプラスミドは、各種制限酵素による切断産物をアガロ
ースゲル電気泳動法で解析した結果、ｐｃＧ１１６のＳ
ａｌ１−ＢｇｆｌＩ切断部位に５．　ＯＫ　ｂの３ａｆ
Ｉ−Ｂｇ１ｎＤＮＡ断片が挿入された構造を有している
ことがわかった（第１図参照）。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
およびｐＣＧＤＳ　１を保有する形質転換株について、
ＤＳ活性をＰ、　Ｒ，５ｐｒｉｎａｖａｓａｎとり、　
Ｂ、　Ｓｐｒ　ｉ　ｎ５ｏｎらの方法〔ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ
。

Ｃｈｅｍ、）　　２３４．７１６　（１９５９）　〕に
従って測定した。ＡＴＣＣ１３０３２株のＤＳ活性を１
としたときのｐＣＧＤＳ　ｌを保有する形質転換株のＤ
Ｓ活性は８〜１０倍に増加しており、また、フェニルア
ラニンおよびチロシンによる阻害を受けないことから、
ｐＣＧＤＳ　１に挿入されている５、　ＯＫ　ｂのＤＮ
Ａ断片上には、コリネバクテリウム・グルタミクムに３
８株由来のＤＳ遺伝子が存在することが判明した。

（３）ＡＳ、ＰＲＴ、ＰＲＡＩ、ＩｎＧＰＳおよびＴＳ
の合成に関与する遺伝情報の全てを含むＤＮＡ断片のク
ローニング 上８己（１）で、コリネバクテリウム・グルタミクムＡ
ＴＣＣ１３０３２から調製したｐＣＥ５３プラスミドＤ
ＮＡ３■を含むＹ−１００反応液６０頭に６単位のＢａ
ｍＨＩを添加し、３７℃で６０分間反応させた。一方、
コリネバクテリウム・グルタミクムに５５　（ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−８６４）の染色体ＤＮＡ３■を含むＹ−１０
０反応液１４０μＱに６単位のＢａｍＨＩを添加し、３
７℃で６０分間反応させた。いずれも６５℃で１０分間
加温して反応を停止させた。

両反応液を混合し、１０倍濃度のＴ４１Ｊガーゼ用緩衝
液４０ｍ、５ｍＭ　　ＡＴＰ４０ｍ。

Ｔ４１Ｊガーゼ（宝酒造社製）３００単位および水１２
０４を加え、１２℃で１６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＴＡ、１０８（ＴＳの２つのサブユニット、αお
よびβのうち、βサブユニツト遺伝子を欠損しており、
トリプトファンの要求性を有している）（昭和６３年４
月９日付で微工研にＦＥＲＭ　ＢＰ−１８４６として寄
託）の形質転換に供した。ＴＡ１０８０種培養４ｍｌを
、トリプトファン５［］ｑ／ｍｌを含む３３Ｍ培地４０
１Ｔｌｌに植菌して３０℃で振盪培養した。

ＯＤが０．２になった時点で上記（１］と同様な方法で
ペニシリンＧ処理後、ＯＤが０．６になるまで生育させ
た。菌体を集菌し、該細胞を上記（２）と同様な方法に
よりリゾチーム処理してプロトプラスト化した。このプ
ロトプラストを上記リガーゼ反応混合物を用いて上言と
２）と同様な方法により形質転換した。カナマイシン２
００■／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地上に生育したカナ
マイシン耐性コロニーをかき集め、生理食塩水で２回遠
心洗浄後、生理食塩水１ｍｌに懸濁した。二の菌液をカ
ナマイシン１０■／ｍｌを含有する最少寒天培地Ｍ１上
に再塗布して３０℃で３日間培養し、カナマイシン耐性
で、トリプトファン非要求性となった形質転換株を選択
した。これらの形質転換株から上記（１）でｐＣＥ５３
を単離したのと同様な方法でプラスミドＤＮＡを単離し
た。形質転換株の一株から得られ、ｐＣｔｒｐＬと命名
したプラスミドは、各種制限酵素による切断産物をアガ
ロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐＣＥ５３のＢａ
ｍＨＩ切断部位に１１．ＯＫｂのＢａｍＨＩＤＮＡ断片
が挿入された構造を有していることがわかった（第１図
参照）。

この１１．ＯＫｂのＢａｍＨＩＤＮＡ断片に含まれる他
のトリプトファン生合成系遺伝子の同定を行った。ｐｃ
ｔｒｐｌを用い、コリネバクテリウム・グルタミクムＴ
Δ１０５（ＡＳ遺伝子を欠損している）、ＴＡ１０６　
（ＰＲＴ遺伝子を欠損している）およびＴＡ１０７（Ｔ
Ｓαサブユニット遺伝子を欠損している）を上記（３）
と同様な方法により形質転換した。カナマイシン２００
■／ｍ＋を含むＲＣＧＰ寒天培地上に生育したカナマイ
シン耐性コロニーはいずれもトリプトファン非要求性で
あることから、ｐｃｔｒｐｌに挿入されている１　１．
　ＯＫ　ｂのＤＮＡ断片上には、少なくともＡＳ、ＰＲ
ＴＴＳ−αおよびＴＳ−βの各遺伝子が存在することが
判明した。

次に、ｐｃｔｒｐｌを用い、ニジエリシア・コリＡＴＣ
Ｃ２３７１９（Ｋ−１２，ｔ　ｒ　ｐＣ−）を東口ａｇ
ｅｒｔらの方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）　６．２３（１９
７９））に従って形質転換した。カナマイシン２０ｇ／
ｍｌを含むＬＢ寒天培地（バタトトリプトン１０ｇ、酵
母エキス５ｇ、グルコースＩｇ。

ＮａＣ１５ｇおよび寒天１６ｇを水ｌｉ中に含み、ｐ　
Ｈ７，２に調整した培地）上に生育したカナマイシン耐
性コロニーはいずれもトリプトファン非要求性であるこ
とから、ｐｃｔｒｐｌに挿入されている１１．ＯＫｂの
ＤＮＡ断片上には、ＰＲＡＩおよびＩｎＧＰＳの合成に
関与する遺伝情報も存在することが判明した。

（４）トリプトファンアナログ耐性プラスミドｐｃｔｒ
ｐ５７の取得 ｐｃｔｒｐｌを保有するＴＡ１０８株をカナマイシン１
０ｕｇ／＋ｎｌを含むＮＢ培地で対数増殖の後期まで増
殖させた。菌体を５０ｍＭ）ＩＪス・マレイン酸緩衝液
（ｐＨ６，０＞で１回遠心洗浄後、Ｎ−メチル−Ｎ′−
二トローＮ−二トロソグアニジン４００■／ｍｌを含む
５０ｍＭ）リス・マレイン酸緩衝液中で室温で２０分間
処理した。処理菌体を５０ｍＭ）！Ｊス・マレイン酸緩
衝液で２回遠心洗浄後、洗浄菌体をカナマイシン１０ｇ
ｇ／ｍｌを含むＮＢ培地中、３０℃で１６時間培養し、
上記（１）と同様な方法でプラスミドＤＮＡを単離した
。単離したプラスミドＤＮＡを用い、ＴＡ　１０８株を
上記（３）と同様な方法で形質転換した。カナマイシン
２００・ｇ／ｍ１を含むＲＣＧＰ寒天培地上に生育した
カナマイシン耐性コロニーをかき集め、生理食塩水を用
いて２回遠心洗浄後、５　Ｆ　７　３　ｍｇ／ｍｌを含
む最少寒天培地Ｍｌに塗布して、３０℃で３日間培季し
た。出現したコロニーから５ＦＴ　　３■／ｍｌを含む
Ｍ１寒天培地およびカナマイシン１０ｇ／ｍｌを含むＮ
Ｂ寒天培地上で生育できるコロニーを選択した。その−
株から分離したプラスミドをｐｃｔｒｐ５７と命名した
。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２
およびｐｃｔｒｐｌまたはｐＣｔｒｐ５７を保有するＴ
ＡＩＧ８株について、Ａｓ活性をＨ，Ｈａｇｉｎｏらの
方法〔アグリカルチユラル・アンド・バイオロジカル・
ケミストリー（Ａｇｒｉｃ。

Ｒｉｏｔ、Ｃｈｅｍ、）　　３９．３２３　（１９７５
）：ｌに従って、またＰＲＴ活性をＪ、　［ｔｏとＣ０
Ｙａｎｏｆｓｋｙの方法〔ジャーナル・オブ・バタテリ
オロジイ（Ｊ、　Ｒｉｏｔ。

Ｃｈｅｍ、）　　９７．７３４　（１９６９））に従っ
てそれぞれ測定した。ＡＴＣＣ１３０３２株のＡｓおよ
びＰＲＴ活性を各々１としたときのｐｃｔｒｐｌまたは
ｐｃｔｒｐ５７を保有するＴＡ１０８株のＡｓおよびＰ
ＲＴ活性はいずれも１０倍以上に増加していた。また、
ＡＴＣＣ３９０１９株。

ｐｃｔｒｐｌを保有するＴＡ１’０８株およびｐｃｔｒ
ｐ５７を保有するＴＡ１０８株のＡＳの５０％阻害トリ
プトファン濃度は、各々、０．００２ｍＭ、　０．００
８ｍＭ、　４．０ｍＭであり、ＰＲＴの５０％阻害トリ
プトファン濃度は、各々、０．１９ｍＭ、０．１９ｍＭ
、４．８ｍＭであった。このことから、ｐｃｔｒｐ５７
のコードするＡＳおよびＰＲＴは、ｐｃｔｒｐｌのコー
ドするＡＳおよびＰＲＴに比べ、各々約５００倍。

約２５倍トリプトファンに対して非感受性になっている
ことがわかった。

（５）ＡＳ、ＰＲＴ、ＰＲＡｌ、Ｉ　ｎＧＰｓおよびＴ
Ｓの合成に関与する遺伝情報の全てを含むＤＮＡ断片の
ｐＣＧＤＳ　１へのサブクローニング ｐｃｔｒｐ５７プラスミドＤＮＡ　　５．を含むＹ−１
００反応液１００頭に０．５単位のＢｇｌ■を加え、３
７℃で１０分間部分消化後、アガロースゲルから７．５
　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片を分画〔モレキュラー　クローニ
ング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、　１６４
　（１９８２）］　した。また、ｐＣＧＤＳ　１プラス
ミドＤＮＡ　　３ｇを含むＹ−１００反応液１０（ｌｄ
に５単位のＢｇｊ！Ｉ［を加え３７℃で６０分間反応後
、フェノール処理により反応を停止させた。両反応液を
混合し、２容のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱回収後
、水２００ｍに溶解した。

このＤＮＡ溶液２００頭に１０倍濃度のＴ４リガーゼ用
緩衝液４０ｕＬ　　５ｍＭ　ＡＴＰ　　４０ｄ、Ｔ４１
Ｊガーゼ（宝酒造社製）３００単位および水１２０μｇ
を加え、１２℃で１６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物を用いて、ＴＡ１０８株を上記
（３）と同様な方法により形質転換した。

スベクチノマイシン４００■／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天
培地上に生育したスベクチノマイシン耐性コロニーをか
き集め、生理食塩水で２回遠心洗浄後、生理食塩水１ｍ
ｌに懸濁した。この菌液をＰ　Ｐ　Ｐ　３　ｍｇ／ｍｌ
およびスベクチノマイシン１００■／１１１１を含有す
る最少寒天培地Ｍｌ上に再塗布して３０℃で３日間培養
し、ＰＰＰおよびスベクチノマイシン耐性で、トリプト
ファン非要求性となった形質転換株を選択した。これら
の形質転換株から上記（１）と同様な方法でプラスミド
ＤＮＡを単離した。形質転換株の一株から得られ、ｐｃ
Ｄｔｒｐ１５７と命名したプラスミドは各種制限酵素に
よる切断産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果
、ｐＣＧＤＳ　１のＢｇｌｎ切断部位に４．５　Ｋ　ｂ
および３．　ＯＫ　ｂの２つのＢｇβＩ［ＤＮＡ断片が
挿入された構造を有していることがわかった（第１図参
照）。

このようにして得たｐｃＤｔｒｐ１５７に、ＡＳ、ＰＲ
Ｔ、ＰＲＡＩ、ＩｎＧＰＳおよびＴＳの合成に関与する
全ての遺伝情報が存在するかどうかを調べるため、ｐｃ
Ｄｔｒｐ１５７ブラスミドＤＮＡを上記と同様にして８
ｇ１！ｌＩで部分消化後、アガロースゲルから７．５Ｋ
ｂ□）ＤＮＡ断片を分画し、ＢａｍＨＩで切断したｐＣ
Ｅ５３（コリネバクテリウム−大腸菌シャトルベクター
）に連結した。この連結物を用いて上記と同様にしてＴ
Ａ１０８株を形質転換し、カナマイシン耐性でトリプト
ファン非要求性となった形質転換株を選択した。形質転
換株の一株から得たプラスミドｐＣｔｒｐ５７７は、各
種制限酵素による切断産物をアガロースゲル電気泳動で
解析した結果、ｐＣＥ５３のＢａｍＨＩ切断部位に４．
５　Ｋ　ｂおよび３．　ＯＫ　ｂの２つのＢｇｆｌｌＤ
ＮＡ断片が挿入された構造を有していることがわかった
。このｐｃｔｒｐ５７７を用い、上記（３）と同様な方
法でトリプトファン生合成系遺伝子の同定を行った結果
、ｐＣＥ５３のＢａｍＨＩ切断部位に挿入された？、　
５　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片上には、Ａｓ、ＰＲＴ、ＰＲＡ
Ｉ、ＩｎＧＰＳおよびＴＳの合成に関与する全ての遺伝
情報が存在することが証明された。この結果から、これ
らの遺伝情報がｐｃＤｔｒｐ１５７に含まれていること
が確認された。

（６）　　ＰＧＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニ
ング 上８己（１）で、コリネバクテリウム・グルタミクムＡ
ＴＣＣ３１８３３から調製したｐｃＧ１１６ブラスミド
ＤＮＡ３Ａｇを含むＹ−１００反応液６０ｍに６ＩＬ位
の５ａｆｌＩを添加し、３７℃で６０分間反応させた。

一方、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１
８３３の染色体ＤＮＡ３屑を含むＹ−１００反応液１４
０戚に６単位のＳａｌ　ｌを添加し、３７℃で６０分間
反応させた。いずれも６５℃で１０分間加温して反応を
停止させた。

両反応液を混合し、１０倍濃度のＴ４１Ｊガーゼ用緩衝
液４０４．５ｍＭ　　ＡＴＰ４０ｍ、Ｔ４１Ｊ４１Ｊガ
ーゼ３００単び水１２０威を加え、１２℃で１６時間反
応させた。

このリガーゼ反応混合物をコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＲ５５７（コリネバクテリウム・グルタミクムＡ
ＴＣＣ３１８３３よりセリン要求性変異株として誘導さ
れたＰ　Ｇ　Ｄ　Ｈ遺伝子欠損株）の形質転換に供した
。Ｒ３５７の種培養４−を、セリン１００■／−を含む
３３Ｍ培地４０−に植菌して３０℃で振盪培養した。

ＯＤが０．２になった時点で上記（１）と同様な方法で
ペニシリンＧ処理後、ＯＤが０．６になるまで生育させ
た。菌体を集菌し、該細胞を上記（２）と同様な方法に
より形質転換した。スベクチノマイシン４００■／曜を
含むＲＣＧＰ寒天培地上に生育したスペクチノマイシン
耐性コロニーをかき集め、生理食塩水で２回遠心洗浄後
、生理食塩水１ｍ１２に懸濁した。この菌液をスペクチ
ノマイシン１００ｇ／ｒｒＩＩｌを含有する最少寒天培
地Ｍｌ上に再塗布して３０℃で３日間培養し、スベクチ
ノマイシン耐性で、セリン非要求性となった形質転換株
を選択した。これらの形質転換株から上記（１）と同様
な方法によりプラスミドＤＮＡを単離した。形質転換株
の一株から得られ、ｐｃｓｅｒ５７１と命名したプラス
ミドは、各種制限酵素による切断産物をアガロースゲル
電気泳動で解析した結果、ｐｃＧ１１６のＳａβ■切断
部位に２．７　ｋｂのＳａｉ！Ｉ　　ＤＮＡ断片が挿入
された構造を有していることがわかった（第２図参照）
。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ３１８３３
およびｐｃｓｅｒ５７１を保有する形質転換株について
、ＰＧＤＨ活性をＢ、　Ｓｕｇｉｍｏｔ。

とり、　１．　Ｐｉｚｅｒの方法〔ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、　）２４３　　、２０８１（１９６８）　］に
従って測定した。ＡＴＣＣ３１８３３株のＰＧＤＨ活性
を１としたときのｐｃｓｅｒ５７１を保有する形質転換
株のＰＧＤＨ活性は約１３倍に増加していたことから、
ｐｃｓｅｒ５７１に挿入されている２、　７　ｋｂのＤ
ＮＡ断片上に、ＰＧＤＨ遺伝子が存在することをｍｙ忍
した。

（７）　　Ｐ　Ｇ　Ｄ　Ｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片のＩ
）ＣＤｔｒｐ１５７への連結 ｐｃｓｅｒ５７１プラスミドＤＮＡ３ｇを含むＹ−１０
０反応液１００μｇに６単位のＢａｍＨｌを添加し、３
７℃で６０分間反応後、アガロースゲルから１．４　ｋ
ｂのＤＮＡ断片を分画した。

また、ｐｃＤｔｒｐ１５７プラスミドＤＮＡ３■を含む
Ｙ−１００反応液１００頭に６単位のＢａｍ１（Ｉを加
え、３７℃で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温し
て反応を停止させた。

両反応液を混合し、２容のエタノールを加えてＤＮＡを
沈澱回収後、水２００μＱに溶解した。

このＤＮＡ溶液２００ｐに１０倍濃度のＴ４リガーゼ用
緩衝液４０ＪｄＩ、５ｍＭ　　ＡＴＰ４０戚、Ｔ４＋Ｊ
ガーゼ３００単位および水１２０頭を加え、１２℃で１
６時間反応させた。

このリガーゼ反応混合物を用いて、Ｒ３５７株を上記（
６）と同様の方法により形質転換した。

スペクチノマイシン４０Ｌｃｇ／−を含むＲＣＧＰ寒天
培地上に生育したスペクチノマイシン耐性コロニーをか
き集め、生理食塩水で２回遠心洗浄後、生理食塩水１ｍ
ｌに懸濁した。この菌液をスペクチノマイシン１００．
／−を含有する最少寒天培地Ｍｌ上に再塗布して３０℃
で３日間培養し、スペクチノマイシン耐性で、セリン非
要求性となった形質転換株を選択した。これらの形質転
換株から上記（１）と同様な方法によりプラスミドＤＮ
Ａを単離した。形質転換株の一株から得られ、ｐＤＴｓ
９９０１と命名したプラスミドは、各種制限酵素による
切断産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、ｐ
ＣＤ　ｔｒｐ１５７のＢａｍ）１１切断部位に１．４　
ｋｂのＢａｍＨＩ断片が挿入された構造を有しているこ
とがわかった（第２図参照）。

このようにして作製したｐＤＴｓ９９０１を用いて、コ
リネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ２１８５４（
ＡＴＣＣ１３０３２から誘導されたフェニルアラニンお
よびチロシン要求株）を上記（２）と同様な方法により
形質転換し、スペクチノマイシンに耐性となった形質転
換株を選択した。

このｐＤＴｓ’１９０１を保有するコリネバクテリウム
・グルタミクムＡＴＣＣ２１８５４歯株は、平成元年６
月２日付でコリネバクテリウム・グルタミクムに８２　
　（ＦＥＲＭ　　ＢＦ２４４４）として工業技術院微生
物工業技術研究所（微工研）にブダペスト条約に基づい
て寄託されている。

（８）　　ｐｃＤｔｒｐ１５７またはｐＤＴＳ９９０１
を保有する菌株によるトリプトファンの生産Ｌ−トリプ
トファン生産性菌株コリネバクテリウム・グルタミクム
ＢＰＳ−１３（ＦＥＲＭＢＰ−１７７？）　　（ＡＴＣ
Ｃ２１８５１から誘導した３−ブロモピルビン酸感受性
変異を有する菌株）の種培養４ｍｌをフェニルアラニン
およびチロシン各５０ｕｇ／ｍｒを含むＳＳＭ培地４０
ｍ１に植菌して３０℃で振盪培養した。ＯＤが０．２に
なった時点で上記（１）と同様な方法でペニシリンＧ処
理後、ＯＤが０．６になるまで生育させた。菌体を集菌
し、核細胞を上記（２）と同様な方法によりリゾチーム
処理してプロトプラスト化した。このプロトプラストを
ｐＣＤｔｒｐ１５７およびｐＤＴｓ９９０１を用いて上
記（２）と同様な方法により形質転換した。スベクチノ
マイシンに耐性となった形質転換株から上記（１）と同
様な方法によりプラスミドＤＮＡを単離した。これらの
プラスミドの各種制限酵素での切断解析により、形質転
換株がｐｃＤｔｒｐ１５７またはｐＤＴｓ９９０１を保
有することを確認した。

形質転換株と親株のＬ−）　ＩＪブトファン生産試験を
大型試験管培養により次のように行った。

種培地ＳＩＣグルコース２０ｇ、ポリペプトン１５ｇ、
酵母エキス１５ｇ、ＮａＣｊ！２．５ｇ尿素１ｇ、Ｌ−
チロシン２００■、Ｌ−フェニルアラニン２００ｍｇを
水１ｉ、に含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地３３ｍｌ
中で３０℃、２４時間振盪培養した種培養０゜５ｍｌを
５ｍｌの生産培地Ｐ１〔グルコース６０　ｇ、ＫＨ２Ｐ
○＋１ｇ。

Ｋ２ＨＰＯ４１ｇ、Ｍｇ５Ｏ＜・７１−１２０　１ｇ（
ＮＨ＝）２ＳＯ−２０ｇ、　コーン・スチープ・リカー
１０ｇ、ＭｎＳＯ＋１０ｍｇ、　　ビオチン３０μｇ、
ＣａＣＯ３２０ｇを水１βに含み、ｐＨ７，２に調整し
た培地〕の入った大型試験管にそれぞれ接種し、３０℃
で７２時間振盪培養した。なお、形質転換株の種培養お
よびＰ１生産培地での培養は、ストレプトマイシン１０
μｇ／ｍＲ存在下で行った。培養後、培養Ｐ液を高速液
体クロマトグラフィーを用いたＯＰΔポストカラム誘導
体化法により定量して、Ｌ−トリプトファンの生成量を
測定した。結果を第１表に示す。

第　　　　１　　　　表 （９）２βジャーファーメンタ−による培養試験ＢＰＳ
−１３株と該菌株のｐｃＤｔｒｐ１５７またはｐＤＴｓ
９９０１の保有株について、２βジャーファーメンタ−
による培養試験を次のように行った。

２０ｍ１の第１種培地Ｓ１中で３０℃、２４時間振盪培
養した第１種培養１０ｍ１を、１２０ｍ１の第２！ｆｌ
培地Ｓ２〔シュクロース５０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４２ｇ、Ｍ
ｇＳＯ４・７Ｈ，ＯＯ，５ｇ（ＮＨ４）２３０４５ｇ、
尿素１　ｇ、　　Ｆ　ｅ　Ｓ　０４　・７　Ｈ２Ｏ１０
ｍｇ、　Ｍｎ　ＳＯ−・４〜６８２０　１０ｍｇ、Ｃｕ
５Ｏ＋・５Ｈ２０４ｍｇ、ｍｌ−ン・スチープ・リカー
４０ｇ、Ｌ−チロシン２２２　ｍｇ。

Ｌ−フェニルアラニン３６２ｍｇ、　ビオチン５０メ■
、サイアミン塩酸塩１００　ｕｇ、　Ｃａ　ＣＯ３２０
ｇを水１１に含み、ｐ　Ｈ７，２に調整した培地〕の入
った１２容三角フラスコにそれぞれ接種し、３０℃で２
４時間振盪培養した。この第２種培養１２０ｍ１を、５
５０ｍ１の生産培地Ｊ１〔シュークロース６３　ｇ、　
　ＫＨ２Ｐ　Ｏ＜　２　ｇＫ２８　Ｐ　０４１．２　ｇ
、　Ｍｇ　ＳＯ，・７Ｈ２Ｏ１□７ｇ、　　（ＮＨ４）
２５０４１７　ｇ、　　Ｆ　ｅ　ＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ１
３ｍｇ、　Ｍｎ５Ｏｉ・４〜６８２０　１３ｍｇＣｕ５
Ｏｎ・５Ｈ２０６ｍｇ、ｍｌ−ン・スチープ・リカー６
６ｇ、Ｌ−チロシン３１０ｍｇ、Ｌフェニルアラニン６
５０ｍｇ、　　ビオチン２３０μｇサイアミン塩酸塩４
５０μｇを水１ｊ２に含み、ｐ　Ｈ６，８に調整した培
地〕の入った２１ジャーファーメンタ−に接種し、３０
℃、ｌｖｖｍ８００　ｒｐｍ条件下で、ｐ　Ｈ６，１に
アンモニア水にて調整しながら、菌体を増殖させた。途
中、２０５ｍ１のフィード液〔シュークロース３７４ｇ
、ＫＨ２ＰＯ４０，７ｇ、に２ＨＰＯＩ　０．５ｇ。

Ｌ−チロシン６００ｍｇを水１．！２に含む培地〕を２
回添加し、糖を消費した時点で培養を終了した。なお、
形質転換株のＳｌ、Ｓ２およびＪ１培地での培養は、ス
トレプトマイシン１０ｕｇ／ｍｌ！存在下で行った。培
養液を水で１００倍に希釈し６０℃で５分加熱後、培養
ｐ液を高速液体クロマトグラフィーを用いたＯＰＡポス
トカラム誘導体化法により定量してＬ　−）　ＩＪブト
ファンの生成量を測定した。

結果を第２表に示す。

第　　　　２　　　　表 ＢＰＳ−１３ ２０，１ ＢＰＳ−１３／ｐｃＤｔｒｐＬ５７　　　３２．６レピ
バクテリウム属菌種におけるＬ−）リプトファンの生産
性を向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、それぞれｐＣＤｔｒｐ１５７お
よびｐＤＴｓ９９０１の制限酵素切断地図とその作製工
程を示す。太い実線部分の染色体ＤＮＡ断片上にはＤＳ
遺伝子が、斜線部分の染色体ＤＮＡ断片上にはトリプト
ファン生合成系遺伝子が、破″ａ８分の染色体ＤＮＡ断
片上にはＰＧＤＨ遺伝子がそれぞれ含まれている。プラ
スミドの大きさはキロベース（ｋｂ）で表示されている
。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロ
   ソネート−７−ホスフェートシンターゼ、アンスラニル
   酸シンターゼ、アンスラニル酸ホスホリボシルトランス
   フェラーゼ、Ｎ−５′−ホスホリボシルアンスラニル酸
   イソメラーゼ、インドール−３−グリセロールリン酸シ
   ンターゼ、トリプトファンシンターゼおよび３−ホスホ
   グリセレートデヒドロゲナーゼの合成に関与する遺伝情
   報の全てを含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え
   体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属またはブレビ
   バクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物
   中にＬ−トリプトファンを生成蓄積させ、該培養物から
   Ｌ−トリプトファンを採取することを特徴とするＬ−ト
   リプトファンの製造法。
2. （２）該ＤＮＡ断片がコリネバクテリウム属またはブレ
   ビバクテリウム属に属する微生物に由来することを特徴
   とする請求項１記載の方法。
3. （３）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
   属に属する微生物由来の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
   ヘプツロソネート−７−ホスフェートシンターゼ、アン
   スラニル酸シンターゼ、アンスラニル酸ホスホリボシル
   トランスフェラーゼ、Ｎ−５′−ホスホリボシルアンス
   ラニル酸イソメラーゼ、インドール−３−グリセロール
   リン酸シンターゼ、トリプトファンシンターゼおよび３
   −ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼの合成に関与す
   る遺伝情報の全てを含み、コリネバクテリウム属または
   ブレビバクテリウム属に属する微生物にトリプトファン
   のアナログに対する耐性を付与することができるＤＮＡ
   断片とベクターＤＮＡとが結合した組換え体ＤＮＡ。
4. （４）コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
   属に属する微生物由来の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
   ヘプツロソネート−７−ホスフェートシンターゼ、アン
   スラニル酸シンターゼ、アンスラニル酸ホスホリボシル
   トランスフェラーゼ、Ｎ−５′−ホスホリボシルアンス
   ラニル酸イソメラーゼ、インドール−３−グリセロール
   リン酸シンターゼ、トリプトファンシンターゼおよび３
   −ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼの合成に関与す
   る遺伝情報の全てを含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡと
   の組換え体ＤＮＡを保有するコリネバクテリウム属また
   はブレビバクテリウム属に属する微生物。