JPS61289887A - 新規組換え体プラスミド - Google Patents
新規組換え体プラスミドInfo
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- JPS61289887A JPS61289887A JP60129508A JP12950885A JPS61289887A JP S61289887 A JPS61289887 A JP S61289887A JP 60129508 A JP60129508 A JP 60129508A JP 12950885 A JP12950885 A JP 12950885A JP S61289887 A JPS61289887 A JP S61289887A
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- Japan
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- ddh
- plasmid
- strain
- coli
- recombinant plasmid
- Prior art date
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- Granted
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、メソ−α、ε−ジアミノピメリン酸の定量測
定、リジン生合成酵素としてリジンの発酵生産などに有
用なメソ−α、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素（Ｅ
Ｃ１，４，１，１６以下ＤＤＨと略す）をコードする遺
伝子（以下ＤＤＨ遺伝子という）を含む組換え体プラス
ミドおよび数組換え体プラスミドを含む微生物によるＤ
ＤＨの製造法に関する。該プラスミドは、ＤＤＨ活性の
増強されたＬ−リジン生産菌の育種などにも利用される
。
定、リジン生合成酵素としてリジンの発酵生産などに有
用なメソ−α、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素（Ｅ
Ｃ１，４，１，１６以下ＤＤＨと略す）をコードする遺
伝子（以下ＤＤＨ遺伝子という）を含む組換え体プラス
ミドおよび数組換え体プラスミドを含む微生物によるＤ
ＤＨの製造法に関する。該プラスミドは、ＤＤＨ活性の
増強されたＬ−リジン生産菌の育種などにも利用される
。
従来の技術
ＤＤＨは、コリネ型グルタミン酸生産菌類およびバチル
ス属細菌に存在することが知られている酵素であり、次
の反応を触媒する〔アグリカルチュラル・バイオロジカ
ル・ケミストリイ（Ａｇｒｉｃｕｌ−ｔｕｒａｌ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、 ４８巻
、 ２５５７頁。
ス属細菌に存在することが知られている酵素であり、次
の反応を触媒する〔アグリカルチュラル・バイオロジカ
ル・ケミストリイ（Ａｇｒｉｃｕｌ−ｔｕｒａｌ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、 ４８巻
、 ２５５７頁。
１９８４年参照〕。
メソ−α、 ε−ジアミノピメリン酸 ＋ ＮＡＤＰ
” ＋ ８２０；：ｔ α−アミノ−ε−ケトピメ
リン酸 十 Ｎへ〇ＰＩＩ ＋ＮＩ（４”従来、ＤＤ
Ｈ遺伝子を組み込んだ組換え体プラスミドならびに数組
換え体プラスミドを組み込んだ微生物によるＤＤＨの製
造については知られていない。
” ＋ ８２０；：ｔ α−アミノ−ε−ケトピメ
リン酸 十 Ｎへ〇ＰＩＩ ＋ＮＩ（４”従来、ＤＤ
Ｈ遺伝子を組み込んだ組換え体プラスミドならびに数組
換え体プラスミドを組み込んだ微生物によるＤＤＨの製
造については知られていない。
発明が解決しようとする問題点
本ＤＤＨは、メソ−α、ε−ジアミノピメリン酸に特異
的に作用し、ジアミノピメリン酸の他の構造異性体には
作用しないのでメソ−α、ε−ジアミノピメリン酸の酵
素的定量測定に利用されるが、従来知られている微生物
による酵素の生成量は微量であるので非常に高価となっ
ていた。
的に作用し、ジアミノピメリン酸の他の構造異性体には
作用しないのでメソ−α、ε−ジアミノピメリン酸の酵
素的定量測定に利用されるが、従来知られている微生物
による酵素の生成量は微量であるので非常に高価となっ
ていた。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、コリネ型グルタミン酸生産菌またはバチ
ルス属細菌からＤ Ｄ Ｈ遺伝子を取り出し、これをプ
ラスミドに組み込んで組換え体プラスミドを作製し、該
プラスミドを微生物に導入して得られる形質転換体を培
養することにより著量のＤＤＨを製造することができる
ことを見出し本発明を完成した。
ルス属細菌からＤ Ｄ Ｈ遺伝子を取り出し、これをプ
ラスミドに組み込んで組換え体プラスミドを作製し、該
プラスミドを微生物に導入して得られる形質転換体を培
養することにより著量のＤＤＨを製造することができる
ことを見出し本発明を完成した。
発明の構成
本発明は、ＤＤＨ遺伝子を含む組換え体プラスミドおよ
び数組換え体プラスミドを組み込んだ微生物によるＤＤ
Ｈの製造法を提供する。
び数組換え体プラスミドを組み込んだ微生物によるＤＤ
Ｈの製造法を提供する。
コリネ型グルタミン酸生産菌において、Ｄ Ｄ ＨはＬ
−リジン生合成経路（第１表）」二重要な酵素と考えら
れている。
−リジン生合成経路（第１表）」二重要な酵素と考えら
れている。
第１表 コリネ型グルタミン酸生産菌におけるＬ −Ｉ
Ｊリジン生合成経路アグリカルチュラル・バイオロジカ
ル・ケミストリイ （八ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔ：ｒｙ）４８巻、 ２５５７頁、
１９８４年参照〕■、−アスパラギン酸 ↓ 鳴 メソ−α、 ε −ジアミノピメリン酸−Ｌ、Ｌ−α
、 ε−ジアミノピメリン酸↓ Ｌ−リジン ＤＤＨ遺伝子は、コリネ型グルタミン酸生産菌類もしく
はバチルス属細菌の染色体ＤＮＡから得ることができる
。これらの、ＤＮＡの供与菌は野性株であっても変異株
であってもよい。
Ｊリジン生合成経路アグリカルチュラル・バイオロジカ
ル・ケミストリイ （八ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔ：ｒｙ）４８巻、 ２５５７頁、
１９８４年参照〕■、−アスパラギン酸 ↓ 鳴 メソ−α、 ε −ジアミノピメリン酸−Ｌ、Ｌ−α
、 ε−ジアミノピメリン酸↓ Ｌ−リジン ＤＤＨ遺伝子は、コリネ型グルタミン酸生産菌類もしく
はバチルス属細菌の染色体ＤＮＡから得ることができる
。これらの、ＤＮＡの供与菌は野性株であっても変異株
であってもよい。
ＤＤＨ遺伝子は、供与菌からの染色体ＤＮＡの抽出、該
ＤＮＡの部分切断、特定プラスミドへの遺伝子ＤＮＡ断
片の導入、数組換えプラスミドを用いるし一α−アミノ
ーε−ケトピメリン酸からメソ−α、ε−ジアミノピメ
リン酸に至るリジン生合成酵素類（第１表の酵素Δ、Ｂ
、Ｃ，ＤまたはＤＤＨのいずれか）またはそれらの組合
せの欠損に由来するメンーα、ε−ジアミノピメリン酸
要求性微生物変異株の形質転換、該要求性が相補された
形質転換株の選択による工程でクローン化される。
ＤＮＡの部分切断、特定プラスミドへの遺伝子ＤＮＡ断
片の導入、数組換えプラスミドを用いるし一α−アミノ
ーε−ケトピメリン酸からメソ−α、ε−ジアミノピメ
リン酸に至るリジン生合成酵素類（第１表の酵素Δ、Ｂ
、Ｃ，ＤまたはＤＤＨのいずれか）またはそれらの組合
せの欠損に由来するメンーα、ε−ジアミノピメリン酸
要求性微生物変異株の形質転換、該要求性が相補された
形質転換株の選択による工程でクローン化される。
本明細書において、コリネ型グルタミン酸生産菌とは、
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロ
バクテリウム属などに属する一群のグルタミン酸生産菌
をいう（［発酵と工業−１第４０巻、１０２頁、 １９
８２年参照）。例えば、コリネバクテリウム・グルタミ
クムＡＴＣＣ１３０３２，コリネバクテリウム・アセト
アシドフィラムＡＴＣＣ１３８７０゜ブレビバクテリウ
ム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム
・ラクトフェルメンクムへＴＣＣ１３８６９゜ミクロバ
クテリウム・アンモニアフィルムＡＴＣＣ１５３５４お
よびそれらの誘導株をあげることができる。バチルス属
細菌としては、バチルス・スフエリカスＡＴＣＣ１０２
０８が代表株としてあげられる。
コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ミクロ
バクテリウム属などに属する一群のグルタミン酸生産菌
をいう（［発酵と工業−１第４０巻、１０２頁、 １９
８２年参照）。例えば、コリネバクテリウム・グルタミ
クムＡＴＣＣ１３０３２，コリネバクテリウム・アセト
アシドフィラムＡＴＣＣ１３８７０゜ブレビバクテリウ
ム・フラブムＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム
・ラクトフェルメンクムへＴＣＣ１３８６９゜ミクロバ
クテリウム・アンモニアフィルムＡＴＣＣ１５３５４お
よびそれらの誘導株をあげることができる。バチルス属
細菌としては、バチルス・スフエリカスＡＴＣＣ１０２
０８が代表株としてあげられる。
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ２１５４３
〔本菌はコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１
３０３２（野性株）から誘導されたホモセリン要求性、
ロイシン要求性、ペニシリン耐性、チアリジン耐性のリ
ジン生産菌である〕から得られるＤ Ｄ Ｈ遺伝子ＤＮ
Ａは約５．３キロベース（以下Ｋｂという）、および２
．７Ｋｂの制限酵素ＢｃｏＲＩ Ｄ ＮΔ断片の連結物
である（第１図参照）。
〔本菌はコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１
３０３２（野性株）から誘導されたホモセリン要求性、
ロイシン要求性、ペニシリン耐性、チアリジン耐性のリ
ジン生産菌である〕から得られるＤ Ｄ Ｈ遺伝子ＤＮ
Ａは約５．３キロベース（以下Ｋｂという）、および２
．７Ｋｂの制限酵素ＢｃｏＲＩ Ｄ ＮΔ断片の連結物
である（第１図参照）。
バチルス・スフエリカスＡＴＣＣ１０２０８から得られ
るＤＤＨ遺伝子ＤＮＡは、約１０．４ Ｋ ｂの制限酵
素旧ｎｄｌＩＩＤＮΔ断片である。該ＤＮＡは、制限酵
素Ｐｓｔ Ｉにより３，９Ｋｂと６．５Ｋｂとに切断さ
れる（第２図参照）。
るＤＤＨ遺伝子ＤＮＡは、約１０．４ Ｋ ｂの制限酵
素旧ｎｄｌＩＩＤＮΔ断片である。該ＤＮＡは、制限酵
素Ｐｓｔ Ｉにより３，９Ｋｂと６．５Ｋｂとに切断さ
れる（第２図参照）。
上述のＤ Ｄ Ｈ遺伝子ＤＮＡを得るための形質転換に
用いる受容菌は、上述のし一リジン生合成酵素類の欠損
に起因するメソ−α、ε−ジアミノピメリン酸要求変異
株でありかつ用いたベクターの複製に好適なものであれ
ばいずれの微生物であってもよい。本願発明においては
、大腸菌由来のベクターを用いているので、受容菌とし
てはそれが複製可能な大腸菌に一１２由来のメソ−α１
ε−ジアミノピメリン酸要求変異株ＡＴ９８２［：本
菌は、Ｎ−サクシニル−α、ε−ジアミノピメリン酸ア
ミノトランスフェラーゼ（以下５ＤＡＴと略す）欠損変
異株である〕が用いられる。これらの受容菌は、使用す
る前に実施例１に示した方法で制限酵素活性を低下せし
める変異を施して用いれば好ましい結果が得られる。
用いる受容菌は、上述のし一リジン生合成酵素類の欠損
に起因するメソ−α、ε−ジアミノピメリン酸要求変異
株でありかつ用いたベクターの複製に好適なものであれ
ばいずれの微生物であってもよい。本願発明においては
、大腸菌由来のベクターを用いているので、受容菌とし
てはそれが複製可能な大腸菌に一１２由来のメソ−α１
ε−ジアミノピメリン酸要求変異株ＡＴ９８２［：本
菌は、Ｎ−サクシニル−α、ε−ジアミノピメリン酸ア
ミノトランスフェラーゼ（以下５ＤＡＴと略す）欠損変
異株である〕が用いられる。これらの受容菌は、使用す
る前に実施例１に示した方法で制限酵素活性を低下せし
める変異を施して用いれば好ましい結果が得られる。
これらの受容菌はＤ Ｄ Ｈ遺伝子ＤＮＡを有するベク
ターを用いて形質転換された際にベクター」二のＤ Ｄ
Ｈ遺伝子ＤＮＡの有する情報を発現する。
ターを用いて形質転換された際にベクター」二のＤ Ｄ
Ｈ遺伝子ＤＮＡの有する情報を発現する。
特に、ベクターとしてマルチコピープラスミドを用いて
Ｄ Ｄ Ｈ遺伝子ＤＮＡを挿入する際には、該ＤＮＡが
著しく増加し菌体中のＤＤＨ活性が著しく増加する。こ
のようにして得た形質転換株の保有するＤ Ｄ Ｉ−１
遺伝子ＤＮＡは、他の適当なベクターに再度絹み換えて
、例えばコリネ型グルタミン酸生産菌に属ずろ受容菌に
導入することもできる。
Ｄ Ｄ Ｈ遺伝子ＤＮＡを挿入する際には、該ＤＮＡが
著しく増加し菌体中のＤＤＨ活性が著しく増加する。こ
のようにして得た形質転換株の保有するＤ Ｄ Ｉ−１
遺伝子ＤＮＡは、他の適当なベクターに再度絹み換えて
、例えばコリネ型グルタミン酸生産菌に属ずろ受容菌に
導入することもできる。
再度の組換えに用いるベクターとしては、コリネ型グル
タミン酸生産菌において複製でき、ＤＤＨ遺伝子ＤＮＡ
を受容菌へ持ぢ込みその形質を転換することができるも
のであれば、いずれも用いられる。
タミン酸生産菌において複製でき、ＤＤＨ遺伝子ＤＮＡ
を受容菌へ持ぢ込みその形質を転換することができるも
のであれば、いずれも用いられる。
例えば本発明者らの開発にかかるｐｃＧｌ。
ｐｃＧ２．ｐＣＧ４．ｐｃＧｌｌ、ｐＣＥ５４゜あるい
はｐｃＢｌｏｌが好ましい。これらのベクターの調製法
は特開昭５７−１３４５００．特開昭５７−１８３７７
９゜特開昭５８−３５１９７および特開昭５８−１０５
９９９に記載されている。
はｐｃＢｌｏｌが好ましい。これらのベクターの調製法
は特開昭５７−１３４５００．特開昭５７−１８３７７
９゜特開昭５８−３５１９７および特開昭５８−１０５
９９９に記載されている。
これらのプラスミドは、これを保有するコリネ型グルタ
ミン酸生産菌（ブレビバクテリウム属あるいはコリネバ
クテリウム属）に属する微生物の細胞から、特開昭５７
−１３４５００に記載した方法に従って単離することが
できる。
ミン酸生産菌（ブレビバクテリウム属あるいはコリネバ
クテリウム属）に属する微生物の細胞から、特開昭５７
−１３４５００に記載した方法に従って単離することが
できる。
ベクタープラスミドにＤＤＩ（遺伝子ＤＮＡを挿入する
には、適当な制限酵素によりプラスミドを切断し、常法
によりその中へ適当な遺伝子ＤＮＡを連結することによ
って行うことができる。
には、適当な制限酵素によりプラスミドを切断し、常法
によりその中へ適当な遺伝子ＤＮＡを連結することによ
って行うことができる。
ＤＤＨ遺伝子ＤＮＡを有する組換えプラスミドをコリネ
型グルタミン酸生産菌に属する受容菌に取り込ませるに
は、特開昭５７−１８６４９２および特開昭５７−１８
６４８９に記載の方法すなわち、受容菌株のプロトプラ
スト化細抱を形質転換する方法が利用される。
型グルタミン酸生産菌に属する受容菌に取り込ませるに
は、特開昭５７−１８６４９２および特開昭５７−１８
６４８９に記載の方法すなわち、受容菌株のプロトプラ
スト化細抱を形質転換する方法が利用される。
組換えプラスミドは、コリネ型グルタミン酸生産菌をス
ペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン
あるいはクロラムフェニコールなどの薬剤の耐性菌に形
質転換するので、ＤＤＨ遺伝子ＤＮＡを挿入したプラス
ミドを含む形質転換株は、その薬剤耐性を試験すること
によって容易に同定することができる。
ペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン
あるいはクロラムフェニコールなどの薬剤の耐性菌に形
質転換するので、ＤＤＨ遺伝子ＤＮＡを挿入したプラス
ミドを含む形質転換株は、その薬剤耐性を試験すること
によって容易に同定することができる。
このようにして得たＤＤＨ遺伝子ＤＮＡを含む組換え体
プラスミドを導入した微生物は通常の培地に培養して、
ＤＤＨを培養物中にＭ積させることができる。
プラスミドを導入した微生物は通常の培地に培養して、
ＤＤＨを培養物中にＭ積させることができる。
培地は炭素源、窒素源および無機イオン類さらに必要に
応じてビタミン類、アミノ酸類、有機酸類などの有機栄
養源の少量を含有する通常の培地が使用できる。
応じてビタミン類、アミノ酸類、有機酸類などの有機栄
養源の少量を含有する通常の培地が使用できる。
炭素源としてはグルコース、シニークロース、ラクトー
ス、でんぷん、でんぷん加水分解物、廃糖蜜などが利用
される。窒素源としてはガス状アンモニア、液状アンモ
ニア、アンモニウム化合物、尿素その他の含窒素化合物
を用いることができる。
ス、でんぷん、でんぷん加水分解物、廃糖蜜などが利用
される。窒素源としてはガス状アンモニア、液状アンモ
ニア、アンモニウム化合物、尿素その他の含窒素化合物
を用いることができる。
微生物細胞中のＤ Ｄ Ｈ活性の検出は、アグリカルチ
ユラル・バイオロジカル・ケミストリイ（Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ） 、 ４３巻。
ユラル・バイオロジカル・ケミストリイ（Ａｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ） 、 ４３巻。
２５５７〜２５６０頁、 １９８４年に記載の方法によ
って、メソ−α、ε−ジアミノピメリン酸を基質とし、
ＮΔＤＰを補酵素とする反応系を用いて、３４０ｎｍの
波長の変化を追跡する方法、あるいは菌体抽出物をゲル
電気泳動にかけた後、活性染色する方法によって行うこ
とができる。
って、メソ−α、ε−ジアミノピメリン酸を基質とし、
ＮΔＤＰを補酵素とする反応系を用いて、３４０ｎｍの
波長の変化を追跡する方法、あるいは菌体抽出物をゲル
電気泳動にかけた後、活性染色する方法によって行うこ
とができる。
培養は、ｐ Ｈ５〜９、温度２０〜４０℃で１〜４０時
間通気攪拌培養することによって行う。
間通気攪拌培養することによって行う。
培養物からのＤＤＨの採取は、菌体破砕液を遠心分Ｌ
透析Ｌ Ｄ Ｅ Ａ Ｅ−セファセル、セファデックス
ｃ−ｉ５ｏなどのカラムクロマトグラフィーを用いる常
法によって行うことができる。
透析Ｌ Ｄ Ｅ Ａ Ｅ−セファセル、セファデックス
ｃ−ｉ５ｏなどのカラムクロマトグラフィーを用いる常
法によって行うことができる。
以下本発明の実施例を述べる。
実施例１゜
５ＤＡＴ欠損変異と宿主特異的制限欠損変異をあわせて
持つ大腸菌に１２亜株ＴＭ１３５の造成：大腸菌の宿主
・ベクター系を用いてコリネバクテリウム・グルタミク
ムおよびバチルス・スフエリカスのＤＤＨ遺伝子ＤＮＡ
を容易にクローン化するために、宿主特異的制限欠損変
異（以下ｈｓｄＲ２と略す）と５ＤＡＴ欠損変異（以下
ｄａｐ Ｄ４と略す）とをあわせ持つクローニング用宿
主菌の造成を次のように行った。
持つ大腸菌に１２亜株ＴＭ１３５の造成：大腸菌の宿主
・ベクター系を用いてコリネバクテリウム・グルタミク
ムおよびバチルス・スフエリカスのＤＤＨ遺伝子ＤＮＡ
を容易にクローン化するために、宿主特異的制限欠損変
異（以下ｈｓｄＲ２と略す）と５ＤＡＴ欠損変異（以下
ｄａｐ Ｄ４と略す）とをあわせ持つクローニング用宿
主菌の造成を次のように行った。
制限欠損変異を有する大腸菌に１２株Ｗ八へ０２〔昭和
６０年２月２５日付で工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）にＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１
２ ＷＡ８０２ ＰＢＲＭ ＢＰ−７１８として寄託；
Ｆ−ｍｅｔＢｌ ｈｓｄ Ｒ２；ジャーナル・オフ・モ
レキュラー・バイオロジー （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、 １６巻、
１１８頁、 １９６６年〕から２５μｇ／ｍｌのりファ
ンピシンに耐性となった自然突然変異株ＲＦ８２を誘導
した。
６０年２月２５日付で工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）にＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１
２ ＷＡ８０２ ＰＢＲＭ ＢＰ−７１８として寄託；
Ｆ−ｍｅｔＢｌ ｈｓｄ Ｒ２；ジャーナル・オフ・モ
レキュラー・バイオロジー （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、 １６巻、
１１８頁、 １９６６年〕から２５μｇ／ｍｌのりファ
ンピシンに耐性となった自然突然変異株ＲＦ８２を誘導
した。
次に、ＲＦ８２株と５ＤＡＴ欠損変異株に１２ ＡＴ９
８２〔昭和６０年４月１９日付で微工研にＢｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫ１２ ＡＴ９８２ ＦＢＲＭ
ＢＰ−７７’Ｏとして寄託；Ｈｆｒ ｄａｐ Ｄ４；ジ
ャーナル・オフ・バタテリオロジイ（Ｊｏｕｒｎａｌｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、 １０５巻、８４
４頁、 １９７１年〕とをジアミノピメリン酸５０．
ｑ／ｍｌを含むし培地〔バタトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ
社製）１％、酵母エキス〈大仏栄養社製）０．５％、食
塩０．５％、ｐ Ｈ７にＮａＯＨで中和〕中で１３７℃
の温度条件下で３時間静置培養した。
８２〔昭和６０年４月１９日付で微工研にＢｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＫ１２ ＡＴ９８２ ＦＢＲＭ
ＢＰ−７７’Ｏとして寄託；Ｈｆｒ ｄａｐ Ｄ４；ジ
ャーナル・オフ・バタテリオロジイ（Ｊｏｕｒｎａｌｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、 １０５巻、８４
４頁、 １９７１年〕とをジアミノピメリン酸５０．
ｑ／ｍｌを含むし培地〔バタトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ
社製）１％、酵母エキス〈大仏栄養社製）０．５％、食
塩０．５％、ｐ Ｈ７にＮａＯＨで中和〕中で１３７℃
の温度条件下で３時間静置培養した。
生理食塩水で２回遠心洗滌後、リファンピシン２５μｇ
／ｍｌ、ジアミノピメリン酸５０μｇ ／ｍｌを含む
Ｍ９最少寒天培地（グルコース２ｇ、ＮＨ４ＣＡ１ ｇ
、Ｎａ２ＨＰＯａ ６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４３ｇ５ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２００，１ｇ、ＣａＣＡ２・２Ｈ２Ｈ２Ｏ１
５，チアミン・ＨＣＪ’ ４ｍｇおよび寒天１５ｇ１
水１１．、ｐＨ７，２）に塗布し、３７℃で５日間培養
後生育してくるコロニーの中からりファンピシン耐性で
メチオニン非要求性となった接合体を選択した。
／ｍｌ、ジアミノピメリン酸５０μｇ ／ｍｌを含む
Ｍ９最少寒天培地（グルコース２ｇ、ＮＨ４ＣＡ１ ｇ
、Ｎａ２ＨＰＯａ ６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４３ｇ５ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２００，１ｇ、ＣａＣＡ２・２Ｈ２Ｈ２Ｏ１
５，チアミン・ＨＣＪ’ ４ｍｇおよび寒天１５ｇ１
水１１．、ｐＨ７，２）に塗布し、３７℃で５日間培養
後生育してくるコロニーの中からりファンピシン耐性で
メチオニン非要求性となった接合体を選択した。
このような接合体の中からジアミノピメリン酸要求性を
示しかつ制限欠損変異を有している株を選んだ。
示しかつ制限欠損変異を有している株を選んだ。
制限欠損変異の有無は修飾機能の欠損した大腸菌ＡＴＣ
Ｃ３３５２５（ｒ−、ｍ−）上で増殖したλ７７−ジ〔
大腸菌ＡＴＣＣ１０７９８（λファージ溶原菌）から調
製〕の平板効率をもって判定した。すなわち、ＷΔ８０
２株と同等の平板効率を示した株を制限欠損変異を有す
る接合体であるとした。
Ｃ３３５２５（ｒ−、ｍ−）上で増殖したλ７７−ジ〔
大腸菌ＡＴＣＣ１０７９８（λファージ溶原菌）から調
製〕の平板効率をもって判定した。すなわち、ＷΔ８０
２株と同等の平板効率を示した株を制限欠損変異を有す
る接合体であるとした。
このようにして得られたジアミノピメリン酸要求性でか
つ制限欠損変異型の接合体の代表株がＴＭ１３５（昭和
６０年６月）３日付で微工研に［ｉ ｓ ＣＩＴ ｅ
−ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＭ１３５ ＰＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２／４として寄託）である。
つ制限欠損変異型の接合体の代表株がＴＭ１３５（昭和
６０年６月）３日付で微工研に［ｉ ｓ ＣＩＴ ｅ
−ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＭ１３５ ＰＥＲＭ Ｂ
Ｐ−２／４として寄託）である。
実施例２゜
コリネバクテリウム・グルタミクムのＤ Ｄ ＋−（遺
伝子のクローン化 クローニングは大腸菌の宿主・ベクター系にて実施する
。ベクターとして使用したｐＢＲ，３２２プラスミドは
市販品（全酒造社製）を用いた。供与体ＤＮＡたる染色
体ＤＮＡはコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
２１５４３から特開昭５８−１２６７８９実施例第１項
に記載の方法に従って単離した。
伝子のクローン化 クローニングは大腸菌の宿主・ベクター系にて実施する
。ベクターとして使用したｐＢＲ，３２２プラスミドは
市販品（全酒造社製）を用いた。供与体ＤＮＡたる染色
体ＤＮＡはコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ
２１５４３から特開昭５８−１２６７８９実施例第１項
に記載の方法に従って単離した。
Ｔ）ＢＲ３２２ＤＮＡ ４μｇおよびコリネバクテリ
ウム・グルタミクムＡＴＣＣ２１５４３の染色体ＤＮＡ
８μｇを含む制限酵素ＥＣ０ＲＴ用反応液（ＩＱｍＭト
リス塩酸緩衝液、７ｍｎＭ ＭｇＣＪ’２．１００ｍ
ＭＮａＣ１、ｐＨ７，５） １２０ｔｔＱに１２単位の
ＥｃｏＲＩ（全酒造社製）を添加し、３７℃の温度条件
下で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を
停止した。該反応消化物にＴ４’Ｊガーゼ用反応液（６
６０ｍＭ）リス塩酸緩衝液、６６ｍＭＭｇＣＬ 、１０
０ｍＭジチオスレイトーノヘｐＨ７，６） ３０μＬ
５ｍＭ ΔＴＰ３０μ＆、Ｔ４リガーゼ（全酒造
社製）０．３単位および水１２０ ｔｔＱを加え、１２
℃で１６時間反応させた。
ウム・グルタミクムＡＴＣＣ２１５４３の染色体ＤＮＡ
８μｇを含む制限酵素ＥＣ０ＲＴ用反応液（ＩＱｍＭト
リス塩酸緩衝液、７ｍｎＭ ＭｇＣＪ’２．１００ｍ
ＭＮａＣ１、ｐＨ７，５） １２０ｔｔＱに１２単位の
ＥｃｏＲＩ（全酒造社製）を添加し、３７℃の温度条件
下で６０分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を
停止した。該反応消化物にＴ４’Ｊガーゼ用反応液（６
６０ｍＭ）リス塩酸緩衝液、６６ｍＭＭｇＣＬ 、１０
０ｍＭジチオスレイトーノヘｐＨ７，６） ３０μＬ
５ｍＭ ΔＴＰ３０μ＆、Ｔ４リガーゼ（全酒造
社製）０．３単位および水１２０ ｔｔＱを加え、１２
℃で１６時間反応させた。
このリガーゼ反応物を前述の大腸菌ＴＭ１３５株の形質
転換に供した。ＴＭ１３５株のコンピテントセルはダジ
ェルト（Ｄａｇｅｒｔ ）らの方法〔ジー７ （Ｇｅｎ
ｅ） 、第６巻、２３頁、 １９７９年〕で調製した。
転換に供した。ＴＭ１３５株のコンピテントセルはダジ
ェルト（Ｄａｇｅｒｔ ）らの方法〔ジー７ （Ｇｅｎ
ｅ） 、第６巻、２３頁、 １９７９年〕で調製した。
すなわち、ジアミノピメリン酸５０μｇ ／ｍｌを補っ
たＬ培地５ＱｍｌにＴＭ１３５株を植菌し、東京光電社
製比色計で６６０ｎｍにおける吸光度（以下０、Ｄ、と
略ず）が０．５になるまで３７℃で培養した。
たＬ培地５ＱｍｌにＴＭ１３５株を植菌し、東京光電社
製比色計で６６０ｎｍにおける吸光度（以下０、Ｄ、と
略ず）が０．５になるまで３７℃で培養した。
培養液を氷水中で１０分間冷却後、菌体を遠心集菌し、
冷却した０、１Ｍ塩化カルシウム２０ｍ１に懸濁して、
０℃にて２０分間静置した。その後閑体を遠心集菌し、
０．１Ｍ塩化カルシウム溶液Ｑ、５ｍｌに再懸濁し、０
℃で１８時間放置した。該菌液４００ρに、前記リガー
ゼ反応物２００μｇを添加混合し、０℃に１０分間装い
てから３７℃で５分間加温した。次いで、ジアミノピメ
リン酸５０ｘ／ｍｌを含むＬ培地９ｍｌを添加し、３７
℃で２時間振盪培養した。生理食塩水を用いて、２回遠
心洗滌後、アンピシリン５０ｕｇ／ｍｌを添加したＭ９
最少寒天培地上に塗布し、３７℃で３日間培養した。
冷却した０、１Ｍ塩化カルシウム２０ｍ１に懸濁して、
０℃にて２０分間静置した。その後閑体を遠心集菌し、
０．１Ｍ塩化カルシウム溶液Ｑ、５ｍｌに再懸濁し、０
℃で１８時間放置した。該菌液４００ρに、前記リガー
ゼ反応物２００μｇを添加混合し、０℃に１０分間装い
てから３７℃で５分間加温した。次いで、ジアミノピメ
リン酸５０ｘ／ｍｌを含むＬ培地９ｍｌを添加し、３７
℃で２時間振盪培養した。生理食塩水を用いて、２回遠
心洗滌後、アンピシリン５０ｕｇ／ｍｌを添加したＭ９
最少寒天培地上に塗布し、３７℃で３日間培養した。
出現したアンピシリン耐性でかつジアミノピメリン酸非
要求性の形質転換株につきアンピシリン５０μｇ／ｍｌ
を含むＬ寒天平板培地上で小集落分離を行った。
要求性の形質転換株につきアンピシリン５０μｇ／ｍｌ
を含むＬ寒天平板培地上で小集落分離を行った。
純化した形質転換株からアン（Ａｎ ）らの方法〔ジャ
ーナル・オフ・バクテリオロジイ（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、 １４０巻、４００
頁、 １９７９年〕によりプラスミドを単離した。こ
のプラスミドを数種の制限酵素で消化した後、アガロー
スゲル電気泳動で解析した結果、該プラスミドはｐＢＲ
３２２の唯一のＥｃｏＲＩ切断部位に５．３Ｋｂおよび
２．７Ｋｂの２つのＥｃｏＲＩ ＤＮΔ断片が挿入さ
れた構造を有していることがわかった。このプラスミド
をｐＤＤ３と命名した（第１図参照）。
ーナル・オフ・バクテリオロジイ（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、 １４０巻、４００
頁、 １９７９年〕によりプラスミドを単離した。こ
のプラスミドを数種の制限酵素で消化した後、アガロー
スゲル電気泳動で解析した結果、該プラスミドはｐＢＲ
３２２の唯一のＥｃｏＲＩ切断部位に５．３Ｋｂおよび
２．７Ｋｂの２つのＥｃｏＲＩ ＤＮΔ断片が挿入さ
れた構造を有していることがわかった。このプラスミド
をｐＤＤ３と命名した（第１図参照）。
ｐＤＤ３を保有する大腸菌の培養菌体からの粗抽出液中
にはＤＤＨ活性があることが活性染色法で確認された。
にはＤＤＨ活性があることが活性染色法で確認された。
プラスミド非保有株の粗酵素抽出液中にはＤＤＨ活性は
検出されなかった。このことから、ｐＤＤ３プラスミド
上にはコリネバクテリウム・グルタミクム由来のＤＤＨ
遺伝子がクローン化されていることがわかる。
検出されなかった。このことから、ｐＤＤ３プラスミド
上にはコリネバクテリウム・グルタミクム由来のＤＤＨ
遺伝子がクローン化されていることがわかる。
実施例３゜
バチルス・スフエリカスのＤＤＨ遺伝子のクローン化；
前記と同様、クローン化には大腸菌の宿主・ベクター系
を利用する。ベクターとしてはｐＢＲ３２２プラスミド
を用いる。供与体ＤＮＡとしてはＢチルス・スフエリカ
スＡＴＣＣ１，０２０８から斉藤−三浦（Ｓａｉｔｏ−
Ｍｉｕｒａ ）の方法〔バイオキミカ・ハイオフィジカ
・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａ八ｃｔａ）、 ７へ巻、６１９頁、 １９６
３年〕によって調製した染色体ＤＮＡを用いる。
を利用する。ベクターとしてはｐＢＲ３２２プラスミド
を用いる。供与体ＤＮＡとしてはＢチルス・スフエリカ
スＡＴＣＣ１，０２０８から斉藤−三浦（Ｓａｉｔｏ−
Ｍｉｕｒａ ）の方法〔バイオキミカ・ハイオフィジカ
・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａ八ｃｔａ）、 ７へ巻、６１９頁、 １９６
３年〕によって調製した染色体ＤＮＡを用いる。
ｐＢＲ３２２Ｄ ＮΔ ４μｇおよびバチルス・スフエ
リカス八ＴＣＣ１０２０８の染色体ＤＮＡ ８ｇｇを含
む制限酵素）（ｉｎｄｌｌ’Ｊ用反応液（１０ｍＭ ）
Ｕス塩酸緩衝液、７ｍＭ ＭｇＣβ２ 、５０ｍＭ
ＮａＣβ、ｐＨ７，５）１２０μｆｆに１２単位の
ＨｉｎｄＴＩＩ（全酒造社製）を添加し、３７℃で６０
分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止した
。次に、該反応消化物に前項と同様の方法でＴ４１Ｊガ
ーゼを作用させた。
リカス八ＴＣＣ１０２０８の染色体ＤＮＡ ８ｇｇを含
む制限酵素）（ｉｎｄｌｌ’Ｊ用反応液（１０ｍＭ ）
Ｕス塩酸緩衝液、７ｍＭ ＭｇＣβ２ 、５０ｍＭ
ＮａＣβ、ｐＨ７，５）１２０μｆｆに１２単位の
ＨｉｎｄＴＩＩ（全酒造社製）を添加し、３７℃で６０
分間反応後、６５℃で１０分間加温して反応を停止した
。次に、該反応消化物に前項と同様の方法でＴ４１Ｊガ
ーゼを作用させた。
このリガーセ反応物を用いて、ＴＭ１３５株の形質転換
を行った。形質転換および形質転換体の選択は前項と同
様の方法で行った。出現したアンピシリン耐性でかつジ
アミノピメリン酸非要求性の形質転換株につき５０μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含むＬ寒天平板培地上で単集落
分離を行った。
を行った。形質転換および形質転換体の選択は前項と同
様の方法で行った。出現したアンピシリン耐性でかつジ
アミノピメリン酸非要求性の形質転換株につき５０μｇ
／ｍｌのアンピシリンを含むＬ寒天平板培地上で単集落
分離を行った。
純化した形質転換株の培養菌体から前記のアン（Ａｎ
）らの方法でプラスミドＤＮＡを単離した。
）らの方法でプラスミドＤＮＡを単離した。
このプラスミドＤＮＡを制限酵素消化とアガロースゲル
電気泳動により解析した結果、同プラスミドはｐＢＲ３
２２の唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位に約１Ｑ
ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩＤＮΔ断片が挿入された構造を有
していることがわかった。このプラスミドをｐＤＤｌｏ
と命名したく第２図参照）。
電気泳動により解析した結果、同プラスミドはｐＢＲ３
２２の唯一のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素切断部位に約１Ｑ
ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩＤＮΔ断片が挿入された構造を有
していることがわかった。このプラスミドをｐＤＤｌｏ
と命名したく第２図参照）。
得られた形質転換株の菌体破砕粗酵素液中には、活性染
色法でＤＤＨ活性が検出され、ｐＤＤ１０プラスミド上
にバチルス・スフエリカス由来のＤ Ｄ Ｈ遺伝子が存
在することが確認された。
色法でＤＤＨ活性が検出され、ｐＤＤ１０プラスミド上
にバチルス・スフエリカス由来のＤ Ｄ Ｈ遺伝子が存
在することが確認された。
実施例４゜
プラスミドｐＤＤ８の作製：
コリネバクテリウム・グルタミクム由来のクローン化Ｄ
ＤＨ遺伝子をコリネ型グルタミン酸生産菌中に保持せし
めるために、実施例２で作製したプラスミドｐＤＤ３を
、コリネバクテリウム・グルタミクムのベクタープラス
ミドｐｃＧ１１と組み換え、シャトルプラスミドｐＤＤ
８を以下の工程で誘導した。
ＤＨ遺伝子をコリネ型グルタミン酸生産菌中に保持せし
めるために、実施例２で作製したプラスミドｐＤＤ３を
、コリネバクテリウム・グルタミクムのベクタープラス
ミドｐｃＧ１１と組み換え、シャトルプラスミドｐＤＤ
８を以下の工程で誘導した。
先ず、プラスミドｐｃｃ １１を、それを保有する菌株
（コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ３９０２
２）から特開昭５７−１３４５００実施例１ 第１項
Ｉに記載の方法に従って単離した。ｐＣＧ
ｌｌおよびｐＤＤ３プラスミドＤＮＡを各々４鴻含む制
限酵素ＰｓｔＩ用反応液［２０ｍＭ ）Ｕス塩酸緩衝
液、１０ｍＭ ＭｇＣβ２ 、５０ｍＭ （ＮＨ４）
２ ＳＯ４゜０．０１％ウシ血清アルブミン（シグマ社
製）、ｐＨ７，２）１２０μＱにＰｓｔＩ制限酵素（全
酒造社製）８単位を添加し、３７℃で６０分間反応させ
た。これを、６５℃で１０分間加温して反応を停止させ
た後、Ｔ４１Ｊガーゼ用緩衝液３０μｇ、５ｍＭ Ａ
ＴＰ ３０μｆｆ、Ｔ４リガーゼ０．３単位およびＨ
２Ｃ１２０１１１を加え、１２℃で１６時間反応させた
。次に、該リガーゼ反応生成物を用いて、実施例２に示
した方法で、ＴＭ１３５株を形質転換した。すなわち、
スペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＭ９寒天平
板培地上に出現した形質転換株の１株について、同一組
成の寒天平板上で単集落分離を行い、得られる純化株の
培養菌体から前記のアン（Ａｎ ）らの方法でプラスミ
ドＤＮＡを単離した。該プラスミドＤＮＡの構造を制限
酵素切断とアガロースゲル電気泳動により調べた結果、
該プラスミドはｐＤＤ３プラスミド内のｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡ部分上に存在するＰｓｔＩ切断部位にｐＣＧｌｌプ
ラスミドが挿入された構造を有していた。
（コリネバクテリウム・グルタミクム＾ＴＣＣ３９０２
２）から特開昭５７−１３４５００実施例１ 第１項
Ｉに記載の方法に従って単離した。ｐＣＧ
ｌｌおよびｐＤＤ３プラスミドＤＮＡを各々４鴻含む制
限酵素ＰｓｔＩ用反応液［２０ｍＭ ）Ｕス塩酸緩衝
液、１０ｍＭ ＭｇＣβ２ 、５０ｍＭ （ＮＨ４）
２ ＳＯ４゜０．０１％ウシ血清アルブミン（シグマ社
製）、ｐＨ７，２）１２０μＱにＰｓｔＩ制限酵素（全
酒造社製）８単位を添加し、３７℃で６０分間反応させ
た。これを、６５℃で１０分間加温して反応を停止させ
た後、Ｔ４１Ｊガーゼ用緩衝液３０μｇ、５ｍＭ Ａ
ＴＰ ３０μｆｆ、Ｔ４リガーゼ０．３単位およびＨ
２Ｃ１２０１１１を加え、１２℃で１６時間反応させた
。次に、該リガーゼ反応生成物を用いて、実施例２に示
した方法で、ＴＭ１３５株を形質転換した。すなわち、
スペクチノマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＭ９寒天平
板培地上に出現した形質転換株の１株について、同一組
成の寒天平板上で単集落分離を行い、得られる純化株の
培養菌体から前記のアン（Ａｎ ）らの方法でプラスミ
ドＤＮＡを単離した。該プラスミドＤＮＡの構造を制限
酵素切断とアガロースゲル電気泳動により調べた結果、
該プラスミドはｐＤＤ３プラスミド内のｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡ部分上に存在するＰｓｔＩ切断部位にｐＣＧｌｌプ
ラスミドが挿入された構造を有していた。
該プラスミドをｐＤＤ８と命名したく第１図参照）。
ｐＤＤ８保有株においてもｐＤＤ３保有株と同様に、Ｄ
ＤＨの産生があることが、活性染色法で確言忍された。
ＤＨの産生があることが、活性染色法で確言忍された。
実施例５゜
ｐＤＤ８プラスミドのコリネバクテリウム・グルタミク
ムへの導入： ｐＤＤ８プラスミドを用いて、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムのし一リジン生産菌ＡＴＣＣ２１５４３の形
質転換を行った。ＡＴＣＣ２１５４３の種培養液０．１
ｍｌをＬ−ホモセリン５０ｇ／ｍｌとＬ−ロイシン１０
０μｇ／ｍｌを含む１０ｍ１の３３Ｍ培地〔グルコース
２０ｇ、（ＮＨ４）２Ｓ○４１０ｇ、尿素３ｇ、酵母エ
キスＩｇ、ＫＨ２Ｐ○ａ １ ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ
２００，４ｇ５ＦｅＳ○４ ・７Ｈ２０１０ｍｇ。
ムへの導入： ｐＤＤ８プラスミドを用いて、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムのし一リジン生産菌ＡＴＣＣ２１５４３の形
質転換を行った。ＡＴＣＣ２１５４３の種培養液０．１
ｍｌをＬ−ホモセリン５０ｇ／ｍｌとＬ−ロイシン１０
０μｇ／ｍｌを含む１０ｍ１の３３Ｍ培地〔グルコース
２０ｇ、（ＮＨ４）２Ｓ○４１０ｇ、尿素３ｇ、酵母エ
キスＩｇ、ＫＨ２Ｐ○ａ １ ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ
２００，４ｇ５ＦｅＳ○４ ・７Ｈ２０１０ｍｇ。
ＭｎＳ○＜・４〜６Ｈ２００，２ｍｇ、Ｚｎ５Ｏ＜・７
Ｈ２００，９ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４ｍｇ。
Ｈ２００，９ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，４ｍｇ。
Ｎａ２Ｂ＜０７’１ＯＨ２００，０９ｍｇ、（ＮＨ４）
６ＭＯ７０２４・４Ｈ２００，０４＋＋＋ｇｓビオチン
３０■、チアミン・ＨＣｌ １＋＋＋ｇ、水ＩＣｐＨ７
，２）に接種し３０℃で振盪培養した。０．Ｄ、が０．
１５になった時点で０．５単位／ｍｌになるようにペニ
シリンＧを添加した。さらに培養を続け０．Ｄ、が０．
６になったところで集菌し１ｍｇ／ｍｌのりゾチームを
含む２ｍｌのＲＣＧＰ培地〔グルコース５ｇ、カザミノ
酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、に２Ｈｐｏ、 ３．５
ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ、Ｍｇ（１２・６Ｈ２００，
４１ｇ、Ｆｅ５０＜・７Ｈ２０１０ｍｇＳＭＴＩＳＯ４
’４〜６８２０２ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２００，９ｍ
ｇ、 （ＮＨａ） ６Ｍ０７０２４ ・
４ Ｆ１２０ ０． ０ ４ ｍｇ１ビオチン
３０μｇ、チアミン・ＨＣｌ２ ２ｍｇ、コハク酸二ナ
トリウム１３５ ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量１
０．ＱＱ［）） ３０ ｇ、水１１．ｐｉ（７，２）に
懸濁し、３０℃で１４時時間巾かに振盪して細胞をプロ
トプラスト化した。このプロトプラスト菌液１ｍｌを２
．５００ Ｘ ｇで１５分間遠心分離し、得られるプロ
トプラストの沈澱をＴＳＭＣ緩衝液〔１０ｍＭ Ｍ
ｇ Ｃ（１２，３０ｍＭ Ｃａ（１２，５０ｍＭ）リ
ス塩酸緩衝液（ｐｔ１７．５ ） 、４００ｍＲ１蔗糖
〕１ｍｌに懸濁して遠心洗滌後ＴＳＭＣ緩衝液Ｑ、１ｍ
ｌに再懸濁した。この懸濁液に、ｐＤＤ８プラスミドＤ
ＮＡ２０μＱを混和し、次いで２０％（Ｗ／Ｖ）のポリ
エチレングリコール（ＰＥＧと略す）６．０００を含む
ＴＳＭＣ緩衝液０．８ｍｌを添加して混合した。３分後
、これにＲＣＧＰ培地２培地２添ｌし、２．５００ Ｘ
ｇで５分間遠心分離にかけてプロトプラストを沈降させ
た。得られたプロトプラストの沈澱を１ｍｌのＲＣＧＰ
培地に懸濁し３０℃で２時間緩やかに振盪培養した。次
いでこのプロトプラスト懸濁液Ｑ、１ｍｌを、スヘクチ
ノマイシン４００ＪＬｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地
（寒天１．４％を添加したＲＣＧＰ培地）に塗布し、３
０℃で６日間培養した。
６ＭＯ７０２４・４Ｈ２００，０４＋＋＋ｇｓビオチン
３０■、チアミン・ＨＣｌ １＋＋＋ｇ、水ＩＣｐＨ７
，２）に接種し３０℃で振盪培養した。０．Ｄ、が０．
１５になった時点で０．５単位／ｍｌになるようにペニ
シリンＧを添加した。さらに培養を続け０．Ｄ、が０．
６になったところで集菌し１ｍｇ／ｍｌのりゾチームを
含む２ｍｌのＲＣＧＰ培地〔グルコース５ｇ、カザミノ
酸５ｇ、酵母エキス２．５ｇ、に２Ｈｐｏ、 ３．５
ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ、Ｍｇ（１２・６Ｈ２００，
４１ｇ、Ｆｅ５０＜・７Ｈ２０１０ｍｇＳＭＴＩＳＯ４
’４〜６８２０２ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２００，９ｍ
ｇ、 （ＮＨａ） ６Ｍ０７０２４ ・
４ Ｆ１２０ ０． ０ ４ ｍｇ１ビオチン
３０μｇ、チアミン・ＨＣｌ２ ２ｍｇ、コハク酸二ナ
トリウム１３５ ｇ、ポリビニルピロリドン（分子量１
０．ＱＱ［）） ３０ ｇ、水１１．ｐｉ（７，２）に
懸濁し、３０℃で１４時時間巾かに振盪して細胞をプロ
トプラスト化した。このプロトプラスト菌液１ｍｌを２
．５００ Ｘ ｇで１５分間遠心分離し、得られるプロ
トプラストの沈澱をＴＳＭＣ緩衝液〔１０ｍＭ Ｍ
ｇ Ｃ（１２，３０ｍＭ Ｃａ（１２，５０ｍＭ）リ
ス塩酸緩衝液（ｐｔ１７．５ ） 、４００ｍＲ１蔗糖
〕１ｍｌに懸濁して遠心洗滌後ＴＳＭＣ緩衝液Ｑ、１ｍ
ｌに再懸濁した。この懸濁液に、ｐＤＤ８プラスミドＤ
ＮＡ２０μＱを混和し、次いで２０％（Ｗ／Ｖ）のポリ
エチレングリコール（ＰＥＧと略す）６．０００を含む
ＴＳＭＣ緩衝液０．８ｍｌを添加して混合した。３分後
、これにＲＣＧＰ培地２培地２添ｌし、２．５００ Ｘ
ｇで５分間遠心分離にかけてプロトプラストを沈降させ
た。得られたプロトプラストの沈澱を１ｍｌのＲＣＧＰ
培地に懸濁し３０℃で２時間緩やかに振盪培養した。次
いでこのプロトプラスト懸濁液Ｑ、１ｍｌを、スヘクチ
ノマイシン４００ＪＬｇ／ｍｌを含むＲＣＧＰ寒天培地
（寒天１．４％を添加したＲＣＧＰ培地）に塗布し、３
０℃で６日間培養した。
得られたスペクチノマイシン耐性形質転換株ＲＬ Ｃ−
９から、特開昭５７−１３４５００ 、実施例１、第１
項に記載の方法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
９から、特開昭５７−１３４５００ 、実施例１、第１
項に記載の方法に従ってプラスミドＤＮＡを抽出した。
単離したプラスミドは制限酵素で切断後アガロースゲル
電気泳動で解析した結果、形質転換に用いたｐＤＤ８と
同じ構造をしていることが１ｉ１ｆ認された（第１図参
照）。さらに、ＡＴＣＣ２１５４３株にくらべて、ｐＤ
Ｄ８を導入した株ではＤ Ｄ Ｈ活性が著しく高いこと
がわかった（第２表）。
電気泳動で解析した結果、形質転換に用いたｐＤＤ８と
同じ構造をしていることが１ｉ１ｆ認された（第１図参
照）。さらに、ＡＴＣＣ２１５４３株にくらべて、ｐＤ
Ｄ８を導入した株ではＤ Ｄ Ｈ活性が著しく高いこと
がわかった（第２表）。
第２表
菌 株 ＤＤＨ活性（△Ｑ
、 Ｄ、 ３４０／＋ｎ＋ｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）
また、プラスミドｐＤＤ８保有菌の菌体破砕粗抽出液中
には、活性染色で、親株であるＡＴＣＣ２１５４３株の
それと同一の挙動を示しかつ親株よりも著しく強いＤＤ
Ｈ活性を認めた。
、 Ｄ、 ３４０／＋ｎ＋ｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）
また、プラスミドｐＤＤ８保有菌の菌体破砕粗抽出液中
には、活性染色で、親株であるＡＴＣＣ２１５４３株の
それと同一の挙動を示しかつ親株よりも著しく強いＤＤ
Ｈ活性を認めた。
実施例６゜
種菌として前述のプラスミドｐＤＤ８保有株ＲＬＣ−９
を用い、種培地〔廃糖蜜（糖換算）５％、大豆粕分解物
（固形物換算）２％、コーン・スチープ・リカー１％、
ＫＨ２Ｐ ０４ ０．０５ ％、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５
％、ＭｇＳＯ３”７Ｈ２００、０２５％、ＦｅＳＯ４・
７Ｈ２０１０μｇ／（！、。
を用い、種培地〔廃糖蜜（糖換算）５％、大豆粕分解物
（固形物換算）２％、コーン・スチープ・リカー１％、
ＫＨ２Ｐ ０４ ０．０５ ％、Ｋ２ＨＰＯ４０，０５
％、ＭｇＳＯ３”７Ｈ２００、０２５％、ＦｅＳＯ４・
７Ｈ２０１０μｇ／（！、。
Ｍｎ（Ｊ！、・４〜６Ｈ２０１０％ｇ／１２．尿素０．
３％、チアミン・ＨＣ＃ １００μｇ／２、ビオチン
５０μｇ／７７、Ｌ−ａイシン１００．ｑ／ｍｌ、スヘ
クチノマイシ７１００ｕ／ｍｌ、ｐＨ７，２〕５０ｍｌ
を含む３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３０℃、２
１０ｒｐｍの振盪条件下でロータリーシェーカー上で２
４時間振盪培養した。得られた種培養液を集めて３００
ｍｌとし、これを２，７１の上記と同一組成の種培地を
含む５ｊ２容ジャーファーメンタ−に接種し、６００ｒ
ｐｍの回転数、３１ ／ｍｉｎの通気条件、３０℃の温
度条件下で、アンモニア水でｐＨを７．０に維持しつつ
２４時間通気攪拌培養した。
３％、チアミン・ＨＣ＃ １００μｇ／２、ビオチン
５０μｇ／７７、Ｌ−ａイシン１００．ｑ／ｍｌ、スヘ
クチノマイシ７１００ｕ／ｍｌ、ｐＨ７，２〕５０ｍｌ
を含む３００ｍｌ容三角フラスコに接種し、３０℃、２
１０ｒｐｍの振盪条件下でロータリーシェーカー上で２
４時間振盪培養した。得られた種培養液を集めて３００
ｍｌとし、これを２，７１の上記と同一組成の種培地を
含む５ｊ２容ジャーファーメンタ−に接種し、６００ｒ
ｐｍの回転数、３１ ／ｍｉｎの通気条件、３０℃の温
度条件下で、アンモニア水でｐＨを７．０に維持しつつ
２４時間通気攪拌培養した。
得られた種培養液１．８１を１７’６の生育培地（グル
コース１０％、硫安３％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、Ｍｇ
ＳＯ３”７Ｈ２００，０４％、ＦｅＳ○４’７８２０１
０ｍｇ／Ａ’、ＭｎＣｌ２・４〜６Ｈ２０１０μｇ／β
、ビオチン５００μｇ／β、チアミン・ＨＣＡ２００μ
ｇ／Ｃパントテン酸カルシウム５００μｇ／１１ニコチ
ン酸５００μｇ／６、コーン・スチープ・リカー０．２
％、Ｌ−ｏイシ７２００μｇ／ｍＬＬ−スレオニン２０
０ｍｇ／ｍｌ、Ｌ−メチオニン１００μｇ／ｍｌ、スペ
クチノマイシ７１００μｇ／ｍｌ）を含む３０５容ジャ
ーファーメンタ−に接種し、４０Ｏｒｐｍの回転数、１
８Ａ ／ｍｉｎ ノ通気、３０℃の温度条件下でアンモ
ニア水でｐ Ｈを７．０に維持しつつ３０時間培養した
。
コース１０％、硫安３％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、Ｍｇ
ＳＯ３”７Ｈ２００，０４％、ＦｅＳ○４’７８２０１
０ｍｇ／Ａ’、ＭｎＣｌ２・４〜６Ｈ２０１０μｇ／β
、ビオチン５００μｇ／β、チアミン・ＨＣＡ２００μ
ｇ／Ｃパントテン酸カルシウム５００μｇ／１１ニコチ
ン酸５００μｇ／６、コーン・スチープ・リカー０．２
％、Ｌ−ｏイシ７２００μｇ／ｍＬＬ−スレオニン２０
０ｍｇ／ｍｌ、Ｌ−メチオニン１００μｇ／ｍｌ、スペ
クチノマイシ７１００μｇ／ｍｌ）を含む３０５容ジャ
ーファーメンタ−に接種し、４０Ｏｒｐｍの回転数、１
８Ａ ／ｍｉｎ ノ通気、３０℃の温度条件下でアンモ
ニア水でｐ Ｈを７．０に維持しつつ３０時間培養した
。
得られた培養液を遠心分離して菌体を集め、０．８５％
の食塩水で洗滌後再び遠心分離して集菌した。集めた菌
体のうち３５０ｇ （湿菌体重量）を５０ｍＭのリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）に懸濁してダイナミル菌
体摩砕機で菌体を破砕し、７、ＯＯＯｒｐｍの回転数で
３０分間遠心分離した。
の食塩水で洗滌後再び遠心分離して集菌した。集めた菌
体のうち３５０ｇ （湿菌体重量）を５０ｍＭのリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）に懸濁してダイナミル菌
体摩砕機で菌体を破砕し、７、ＯＯＯｒｐｍの回転数で
３０分間遠心分離した。
得られた上澄にプロクミン３ｇを加え３０分間攪拌後同
様に遠心分離した。得られた上澄に、６０％飽和になる
ように硫安を添加して塩析し、遠心分離をして沈澱を集
め、これを５０ｍＭＩＪン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，
４） ４５０ｍｌに溶解してこれを同じ組成の緩衝液に
対して透析した。透析残液に５０ｍＭのリン酸カリウム
緩衝液（ｐ Ｈ７，４）を加えて１０００ｍｌとし、Ｄ
Ｅ八へ−セファセル（ファルマシア・ファイン・ケミカ
ル社製）ヲ充填したカラム（２Ｘ４２ｃｍ）に通して蛋
白質を吸着させた後、１０ｍＭ’＋Ｊン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７，４）を用い、Ｎａ（１２０，１５Ｍから０
．５ Ｍの塩濃度勾配により１２０ｍｌ／ｈｒの溶出速
度で溶出して、２２ｍ１ずつの分画に集めた。得られた
分画のうちＮｏ、５５〜６５にＤＤＨ活性を認めたので
これらを集めた。かくして得られた活性画分を限外濾過
して濃縮し、これをセファデックスＧ−１５０（ファル
マシア・ファイン・ケミカル社製）を充填したカラム（
２Ｘ４０ｃｍ）に通塔して蛋白質をこれに吸着せしめた
。次に、１０％グリセリンを含む１０ｍＭ’Ｊン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７，４）で３９ｍ１／ｈｒの溶出速度
で溶出し、５ｍｌずつの分画を集めた。得られた分画の
うち、Ｎｏ、 ３８〜４１にＤＤＨ活性を認めたのでこ
れらを集め、これを精製ＤＤＨとしてその酵素的性質を
調べた。
様に遠心分離した。得られた上澄に、６０％飽和になる
ように硫安を添加して塩析し、遠心分離をして沈澱を集
め、これを５０ｍＭＩＪン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，
４） ４５０ｍｌに溶解してこれを同じ組成の緩衝液に
対して透析した。透析残液に５０ｍＭのリン酸カリウム
緩衝液（ｐ Ｈ７，４）を加えて１０００ｍｌとし、Ｄ
Ｅ八へ−セファセル（ファルマシア・ファイン・ケミカ
ル社製）ヲ充填したカラム（２Ｘ４２ｃｍ）に通して蛋
白質を吸着させた後、１０ｍＭ’＋Ｊン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７，４）を用い、Ｎａ（１２０，１５Ｍから０
．５ Ｍの塩濃度勾配により１２０ｍｌ／ｈｒの溶出速
度で溶出して、２２ｍ１ずつの分画に集めた。得られた
分画のうちＮｏ、５５〜６５にＤＤＨ活性を認めたので
これらを集めた。かくして得られた活性画分を限外濾過
して濃縮し、これをセファデックスＧ−１５０（ファル
マシア・ファイン・ケミカル社製）を充填したカラム（
２Ｘ４０ｃｍ）に通塔して蛋白質をこれに吸着せしめた
。次に、１０％グリセリンを含む１０ｍＭ’Ｊン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７，４）で３９ｍ１／ｈｒの溶出速度
で溶出し、５ｍｌずつの分画を集めた。得られた分画の
うち、Ｎｏ、 ３８〜４１にＤＤＨ活性を認めたのでこ
れらを集め、これを精製ＤＤＨとしてその酵素的性質を
調べた。
その結果、得られたＤＤＨは第３表に示すような酵素的
性質を示した。
性質を示した。
第３表 ＤＤＨの性質
本発明の方法によって、ＤＤＨをコードする遺伝子を含
む組換えプラスミドを得ることができる。
む組換えプラスミドを得ることができる。
該プラスミドを利用して例えばコリネ型グルタミン酸生
産菌のＤＤＨ活性を増強したり、大腸菌にＤＤＨ活性を
与えたりすることができるので、安価に大量にＤＤＨを
製造することができる。また、コリネ型グルタミン酸生
産菌から誘導されるＬ−リジン生産菌あるいはメソ−α
、ε−ジアミノピメリン酸生産菌でのＤＤＨ活性の増強
にともなうし一リジンあるいはメソ−α、ε−ジアミノ
ピメリン酸の生成収率の向上、生成速度の向上が期待さ
れる。
産菌のＤＤＨ活性を増強したり、大腸菌にＤＤＨ活性を
与えたりすることができるので、安価に大量にＤＤＨを
製造することができる。また、コリネ型グルタミン酸生
産菌から誘導されるＬ−リジン生産菌あるいはメソ−α
、ε−ジアミノピメリン酸生産菌でのＤＤＨ活性の増強
にともなうし一リジンあるいはメソ−α、ε−ジアミノ
ピメリン酸の生成収率の向上、生成速度の向上が期待さ
れる。
第１図はプラスミドｐＤＤ８の造成工程を示す。
第２図はｐＤＤｌｏの造成工程を示す。
図中の記号は下記酵素の切断部位を示す。
Ｐ ： ＰｓｔＪ
Ｂ ： ＢｇｌＩＩ
Ｅ ： ＥｃｏＲＩ
Ｈ： ＨｉｎｄＩ［Ｉ
ｐＤＤ １０
（１４，７Ｋｂ）
Claims (2)
- （１）メソ−α，ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素を
コードする遺伝子を含む組換え体プラスミド。 - （２）メソ−α，ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素を
コードする遺伝子を含む組換え体プラスミドでコリネバ
クテリウム属微生物菌体を形質転換し、得られた形質転
換体を培地に培養し培養物中に該酵素を蓄積させ、該培
養物から該酵素を採取することを特徴とするメソ−α，
ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60129508A JPH0611230B2 (ja) | 1985-06-14 | 1985-06-14 | 新規組換え体プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60129508A JPH0611230B2 (ja) | 1985-06-14 | 1985-06-14 | 新規組換え体プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61289887A true JPS61289887A (ja) | 1986-12-19 |
| JPH0611230B2 JPH0611230B2 (ja) | 1994-02-16 |
Family
ID=15011222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60129508A Expired - Lifetime JPH0611230B2 (ja) | 1985-06-14 | 1985-06-14 | 新規組換え体プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0611230B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0811682A3 (en) * | 1996-06-05 | 1998-06-10 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing L-lysine |
-
1985
- 1985-06-14 JP JP60129508A patent/JPH0611230B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0811682A3 (en) * | 1996-06-05 | 1998-06-10 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing L-lysine |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0611230B2 (ja) | 1994-02-16 |
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