DE60207820T2

DE60207820T2 - Verfahren zur fermentativen herstellung von d-pantothensäure und/oder deren salzen

Info

Publication number: DE60207820T2
Application number: DE60207820T
Authority: DE
Inventors: Thomas Hermann; Achim Marx; Walter Pfefferle; Mechthild Rieping
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-02-13
Filing date: 2002-01-11
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2022-01-12
Also published as: EP1360305A2; WO2002064806A3; US20020137149A1; DE60207820D1; DK1360305T3; EP1360305B1; WO2002064806A2; DE10106461A1; AU2002254883A1; ATE312181T1; AU2002254883A8; US6682915B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder ihrer Salze oder Gemische bereit, die diese enthalten, wobei Mikroorganismen aus der Familie Enterobacteriaceae verwendet werden, in denen zumindest das Gen glyA überexprimiert wird.
Stand der Technik
Pantothensäure wird in der gesamten Welt in Mengen von mehreren Tausend Tonnen pro Jahr produziert. Es wird unter Anderem in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und in der Nahrungsmittelindustrie verwendet. Ein großer Anteil der verwendeten Pantothensäure wird zum Füttern von Nutzvieh, wie Geflügel und Schweinen, verwendet. Der Bedarf steigt.
Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen in geeigneten Nährmedien hergestellt werden. Im Falle der chemischen Synthese ist DL-Pantolacton eine wichtige Vorstufe. Diese wird in einem Mehrschrittverfahren aus Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt, das racemische Gemisch wird in einem nachfolgenden Verfahrensschritt getrennt, D-Pantolacton wird mit β-Alanin kondensiert, und auf diese Weise wird D-Pantothensäure erhalten.
Die übliche kommerzielle Form ist das Calciumsalz von D-Pantothensäure. Das Calciumsalz des racemischen Gemischs D,L-Pantothensäure ist ebenfalls weithin verfügbar.
Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch Mikroorganismen ist die direkte Bildung der gewünschten stereoisomeren Form, d.h. der D-Form, die keine L-Pantothensäure enthält. Verschiedene Bakterienarten, wie beispielsweise Escherichia coli (E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen, wie beispielsweise Debaromyces castellii, können wie in EP-A 0 493 060 gezeigt D-Pantothensäure in einem Nährmedium erzeugen, das Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält. Darüber hinaus zeigt EP-A 0 493 060, dass im Fall von E. coli die Bildung von D-Pantothensäure durch die Amplifikation der auf den Plasmiden pFV3 und pFV5 befindlichen Pantothensäure-Biosynthesegene aus E. coli in einem Glucose, DL-Panoinsäure und β-Alanin enthaltenden Nährmedium verbessert wird.
EP-A 0 590 857 und US-Patent 5 518 906 beschreibt Mutanten, die vom E. coli-Stamm IFO3547 hergeleitet sind, wie FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069, welche eine Resistenz gegen verschiedene Antimetabolite, wie Salicylsäure, α-Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure, O-Methylthreonin und α-Ketoisovaleriansäure tragen. Sie produzieren Pantoinsäure in einem Nährmedium, das Glucose und D-Pantothensäure in einem Glucose- und β-Alanin-haltigen Medium enthält. Zudem wird in EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 dargelegt, dass die Produktion von D-Pantoinsäure in einem glucosehaltigen Nährmedium verbessert wird und die Produktion von D-Pantothensäure in einem Glucose und β-Alanin enthaltenden Nährmedium nach der Amplifikation der Pantothen-Biosynthesegene panB, panC und panD, die sich auf dem Plasmid pFV31 befinden sollten, in den vorstehend genannten Stämmen verbessert wird.
Zudem beschreibt WO97/10340 die vorteilhafte Wirkung der Verstärkung des ilvGM-Operons auf die Produktion von D-Pantothensäure. Schließlich beschreibt EP-A-1001027 die Wirkung der Verstärkung des Gens panE auf die Bildung von D-Pantothensäure.
Gemäß dem Stand der Technik wird D-Pantothensäure oder das entsprechende Salz aus der Fermentationsbrühe isoliert und gereinigt (EP-A-0590857 und WO96/33283) und dann in gereinigter Form verwendet, oder die gesamte D-Pantothensäure-haltige Brühe wird getrocknet (EP-A-1050219) und insbesondere als Futtermittelzusatz verwendet.
Aufgabe der Erfindung
Der Erfinder führt die Bereitstellung neuer Schritte für die verbesserte fermentative Herstellung von D-Pantothensäure und/oder ihrer Salze oder von Futtermittelzusätzen, die diese enthalten, als Aufgabe der Erfindung an.
Zusammenfassung der Erfindung
Wenn immer D-Pantothensäure, Pantothensäure oder Pantothenat nachstehend erwähnt werden, sollen diese nicht nur die freien Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure beinhalten, wie beispielsweise das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder ihrer Salze oder von Futtermittelzusätzen bereit, die außer diesen weitere Bestandteile aus der Fermentation rekombinanter Mikroorganismen aus der Familie Enterobateriaceae, insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure produzieren, enthalten, bei dem man

a) die in den Mikroorganismen befindliche(n) Nukleotidsequenz(en), die das endogene Gen glyA codiert bzw. codieren, unter für die Produktion von Serin-Hydroxymethyltransferase geeigneten Bedingungen überexprimiert,
b) D-Pantothensäure und/oder ihre Salze im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen anreichert und
c) die D-Pantothensäure und/oder ihre Salze nach Beendigung der Fermentation isoliert, wobei eine Menge von 0 bis 100% der Biomasse und/oder weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe abgetrennt werden, wobei die Mikroorganismen D-Pantothensäure erzeugen.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, bei dem nach Beendigung der Fermentation die gesamte Biomasse oder ein Teil davon in der Fermentationsbrühe verbleibt und die auf diese Weise erhaltene Brühe verarbeitet wird, nachdem sie gegebenenfalls aufkonzentriert wurde, so dass man ein festes Gemisch erhält, das D-Pantothensäure und/oder ihre Salze enthält, und das auch andere Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
In diesem Zusammenhang beschreibt der Ausdruck "Steigerung" den Anstieg der Zellaktivität von einem oder mehreren Enzymen oder Proteinen in einem Mikroorganismus, die von der entsprechenden DNA codiert werden, beispielsweise indem man die Kopienzahl des Gens oder der Gene mit Hilfe eines starken Promotors erhöht und gegebenenfalls diese Schritte kombiniert.
Als Ergebnis dieses Steigerungsschrittes, insbesondere der Überexpression, wird die Konzentration des entsprechenden Proteins gewöhnlich um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, höchstens bis zu 1000% oder 2000% in Bezug auf die des Proteins im Ausgangsmikroorganismus erhöht.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten Mikroorganismen können D-Pantothensäure aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol produzieren. Sie sind Mitglieder der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere aus der Gattung Escherichia. Von der Gattung Escherichia wird insbesondere die Spezies Escherichia coli erwähnt. Innerhalb der Spezies Escherichia coli sind die sogenannten K-12-Stämme, wie beispielsweise der Stamm MG1655 oder W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli und Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D. C.)) oder der Wildtypstamm Escherichia coli IFO3547 (Institut für Fermentation, Osaka, Japan) und davon hergeleitete Mutanten geeignet, wobei diese D-Pantothensäure produzieren können.
Geeignete D-Pantothensäure produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Spezies Escherichia coli, sind beispielsweise
Escherichia coli FV5069/pFV31
Escherichia coli FV5069/pFV202
Escherichia coli FE6/pFE80 und
Escherichia coli KE3
Es wurde gefunden, dass Enterobacteriaceae nach der Überexpression des Gens glyA, das die Serin-Hydroxymethyltransferase codiert, D-Pantothensäure auf verbesserte Weise produzieren.
Die Nukleotidsequenzen im Gen glyA aus Escherichia coli wurden veröffentlicht von Plamann et al. (Nucleic Acids Research 11(7): 2065–2075 (1983)) und können auch aus der Genomsequenz für Escherichia coli, unter der Zugangsnummer AE000374, veröffentlicht von Blattner et al. (Science 277, 1453–1462 (1997)) erhalten werden.
Das in den vorstehend aufgeführten Literaturstellen beschriebene Gen glyA kann erfindungsgemäß verwendet werden. Zudem können Allele des Gens glyA, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes oder durch funktionell neutrale Sense-Mutationen produziert werden, verwendet werden.
Zum Herbeiführen einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder der Promotor und der Regulationsbereich oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, kann mutiert werden. Expressionskassetten, die sich stromaufwärts des Strukturgens befinden, wirken auf die gleiche Weise. Man kann auch die Expression im Verlauf der fermentativen D-Pantothensäure-Produktion mittels induzierbarer Promotoren steigern. Die Expression wird auch durch Schritte verbessert, die die Lebensdauer der mRNA verlängern. Durch Hemmung des Abbaus des Enxzmproteins wird die Enzymaktivität darüber hinaus auch gesteigert. Die Gene oder Genstrukturen können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl oder im Chromosom integriert und amplifiziert vorhanden sein. Alternativ kann die Überexpression der beteiligten Gene erzielt werden, indem man die Zusammensetzung des Mediums ändert und durch Steuerung der Anzucht.
Der Fachmann findet Anweisungen dafür unter Anderem in Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141–1156 (1987)), in Hartley und Gregori (Gene 13: 347–353 (1981)), in Amann und Brosius (Gene 40: 183–190 (1985)), in de Broer et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America 80: 21–25 (1983)), in LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187–193 (1993)), in PCT/US97/13359, in Llosa et al. (Plasmid 26: 222–224 (1991)), in Quandt und Klipp (Gene 80: 161–169 (1989)), in Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617–4622 (1989)), in Jensen und Hammer (Biotechnology und Bioengineering 58, 191–195 (1998)) und in bekannten Fachbüchern über Genetik und Molekularbiologie.
Plasmidvektoren, die sich in Enterobacteriaceae replizieren lassen, wie beispielsweise Klonierungsvektoren, die von pACYC184- (Bartolomé et al.; Gene 102, 75–78 (1991)), pTrc99A- (Amann et al.; Gene 69: 301–315 (1988)) oder pSC101-Derivaten (Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Science USA 80 (21): 6557–6561 (1983)) hergeleitet sind, können verwendet werden. Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren kann ein mit einem Plasmidvektor transformierter Stamm verwendet werden, wobei der Plasmidvektor mindestens die Nukleotidsequenz enthält, die das Gen glyA codiert.
Für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen aus der Familie Enterobacteriaceae kann es darüber hinaus vorteilhaft sein, dass man nicht nur das Gen glyA überexprimiert, sondern auch eines oder mehrere endogene Gene getrennt oder gemeinsam überexprimiert, ausgewählt aus:

• dem ilvGM-Operon, das die Acetohydroxysäuresynthase II codiert (WO 97/10340),
• dem Gen panB, das die Ketopantoat-hydroxymethyltransferase codiert (US-A-5,518,906)
• dem Gen panE, das die Ketopantoatreduktase codiert (EP-A-1001027)
• dem Gen panD, das die Aspartatdecarboxylase codiert (US-A-5,518,906)
• dem Gen panC, das die Pantothenatsynthetase codiert (US-A-5,518,906)
• dem Gen serC, das die Phosphoserintransaminase codiert (Duncan und Coggins, Biochemical Journal 234: 49–57 (1986)) und
• den Genen gcvT, gcvH und gcvP, die das Glycin-Spaltungssystem codieren (Okamura-Ikeda et al., European Journal of Biochemistry 216, 539–548 (1993)).

Für die Produktion von D-Pantothensäure mit Hilfe von Stämmen der Familie Enterobacterioceae kann es schließlich vorteilhaft sein, dass man nicht nur das Gen glyA überexprimiert, sondern auch folgendes Gen attenuiert, insbesondere abschaltet oder in geringerer Menge exprimiert:

• das avtA-Gen, das die Transaminase C codiert (EP-A-1001027).

Der Begriff "Attenuation" in diesem Zusammenhang beschreibt das Reduzieren oder das Abschalten der intrazellulären Aktivität von einem oder mehreren Enzymen (Proteinen) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel verwendet, das ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer niedrigeren Aktivität codiert oder das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert, und gegebenenfalls diese Schritte kombiniert.
Die Aktivität oder die Konzentration des entsprechenden Proteins wird durch den Attenuationsschritt gewöhnlich auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtypproteins oder der Aktivität oder Konzentration des Proteins in den Ausgangsmikroorganismen gesenkt.
Es kann darüber hinaus für die Produktion der D-Pantothensäure vorteilhaft sein, dass man nicht nur das Gen glyA überexprimiert, sondern auch ungewünschte Sekundärreaktionen abschaltet (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms" in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Hrsg.), Academic Press, London, UK, 1982). In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Bakterien verwendet werden, in denen die Stoffwechselwege, die die Bildung der D-Pantothensäure reduzieren, zumindest partiell abgeschaltet sind.
Erfindungsgemäß hergestellte Mikroorganismen können in einem diskontinuierlichen Verfahren, in einem Fed-Batch-Verfahren oder in einem wiederholten Fed-Batch-Verfahren gezüchtet werden. Zusammenfassungen bekannter Anzuchtverfahren sind im Fachbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Fachbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Anzuchtmedium muss den Anforderungen des jeweiligen Stamms auf geeignete Weise genügen. Anzuchtmedien für verschiedene Mikroorganismen sind in dem Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" von der American Society for Bacteriology (Washington D. C. USA, 1981) beschrieben. Verwendete Kohlenstoffquellen sind Zucker und Kohlenhydrate, wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie beispielsweise Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosnussbutter, Fettsäuren, wie beispielsweise Palmitinsäure, Stearinsäure und Linoleinsäure, Alkohole, wie beispielsweise Glycerin und Ethanol und organische Säuren, wie beispielsweise Essigsäure. Diese Substanzen können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
Verwendete Stickstoffquellen können organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maiseinweichflüssigkeit, Sojamehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, sein. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
Verwendbare Phosphorquellen sind Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze. Darüber hinaus muss das Anzuchtmedium Salze von Metallen enthalten, wie beispielsweise Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum erforderlich sind. Essentielle Wachstumssubstanzen, wie Aminosäuren und Vitamine, können schließlich zusätzlich zu den vorstehend genannten Substanzen verwendet werden. Darüber hinaus können Vorstufen von D-Pantothensäure, wie Aspartat, β-Alanin, Ketoisovaleriat, Ketopantoinsäure oder Pantoinsäure und gegebenenfalls ihre Salze zu dem Anzuchtmedium dazugegeben werden. Die genannten Einsatzmaterialien können in der Form eines Einmal-Batchs zugefügt werden oder während der Anzucht auf geeignete Weise in das Anzuchtmedium eingespeist werden.
Basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder Ammoniakwasser, oder saure Verbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, werden auf geeignete Weise zur Steuerung des pH-Wertes der Kultur verwendet.
Man kann auch die Erdalkalisalze der Pantothensäure, insbesondere das Calciumsalz, herstellen, damit eine Suspension oder Lösung einer erdalkalihaltigen anorganischen Verbindung, wie beispielsweise Calciumhydroxid, oder eine organische Verbindung, wie das Erdalkalisalz einer organischen Säure, beispielsweise Calciumacetat, kontinuierlich oder diskontinuierlich während der Fermentation zugefügt wird. Das zur Herstellung des gewünschten Erdalkalisalzes der D-Pantothensäure erforderliche Kation wird auf diese Weise direkt in die Fermentationsbrühe in der gewünschten Menge, gewöhnlich im Verhältnis von 0,8 bis 1,2 bis 1, in Bezug auf die Pantothensäure, vorzugsweise in stöchiometrischen Mengen, eingebracht.
Antischäummittel, wie beispielsweise Polyglycolester von Fettsäuren, werden zur Regulation der Produktion von Schaum verwendet. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität der Plasmide können selektiv wirkende Substanzen, beispielsweise Antibiotika, zu dem Medium gegeben werden. Zur Aufrechterhaltung der vorhandenen aeroben Bedingungen, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasgemische, wie beispielsweise Luft, in die Kultur eingeleitet. Die Temperatur der Kultur beträgt gewöhnlich 25°C bis 45°C und vorzugsweise 30°C bis 40°C. Die Anzucht wird fortgesetzt, bis eine Höchstmenge an D-Pantothensäure entstanden ist. Diese Aufgabe wird gewöhnlich innerhalb von 10 bis 160 Std. erzielt.
Die D-Pantothensäure oder die entsprechenden Salze von der in der Fermentationsbrühe enthaltenen D- Pantothensäure kann dann wie im Stand der Technik beschrieben isoliert und gereinigt werden.
Man kann die Biomasse auch vorzugsweise zuerst teilweise (≥ 0 bis 100%) oder vollständig aus der Fermentationsbrühe, die die D-Pantothensäure und/oder ihre Salze enthält, durch bekannte Trennungsverfahren, wie Zentrifugieren, Filtrieren, Dekantieren oder durch eine Kombination aus diesen, entfernen. Man kann auch die gesamte Biomasse in der Fermentationsbrühe belassen. Im Allgemeinen wird die Suspension oder Lösung vorzugsweise eingeengt und zur Herstellung eines Pulvers aufgearbeitet, beispielsweise mit einem Sprühtrockner oder einer Gefriertrocknungseinheit. Dann wird dieses Pulver zu einem grobkörnigen, sehr frei-fließenden lagerfähigen und größtenteils staubfreien Produkt mit einer Teilchengrößenverteilung von 20 bis 2000 μm, insbesondere 100 bis 140 μm, umgewandelt, wobei geeignete Kompaktierungs- oder Granulationsverfahren verwendet werden, wie beispielsweise auch das Pelletieren. Die Verwendung herkömmlicher organischer oder anorganischer Zusatzsubstanzen oder Träger, wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivate oder ähnlichen Substanzen, wie sie herkömmlicherweise in Futtermitteln oder bei der Tierfutterverarbeitung als Bindemittel, Gelierungsmittel oder Verdicker verwendet werden, oder anderer Substanzen, wie beispielsweise Silicamaterialien, Silikate oder Stearate, ist beim Granulieren oder Kompaktieren vorteilhaft.
Alternativ kann das Fermentationsprodukt mit oder ohne andere herkömmliche Bestandteile aus der Fermentationsbrühe auf einer organischen oder anorganischen Trägersubstanz, die bekannt ist und herkömmlicherweise im Futtermittelverarbeitungssektor verwendet wird, wie beispielsweise Silicamaterialien, Silikate, Schrot, Kleie, Mehl, Stärke, Zucker oder andere abgelagert werden und/oder mit herkömmlichen Verdickungsmitteln oder Bindemitteln stabilisiert werden. Beispiele für Anwendungen und Verfahren dafür sind in der Literatur beschrieben (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817).
Gegebenenfalls wird in einem geeigneten Verfahrensschritt D-Pantothensäure oder das gewünschte Salz der D-Pantothensäure oder ein Präparat, das diese Verbindungen enthält, zu dem Produkt gegeben, damit die gewünschte Konzentration der Pantothensäure oder des gewünschten Salzes erzeugt oder eingestellt wird.
Die gewünschte Konzentration liegt gewöhnlich im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% (Trockengewicht).
Die Konzentration der Pantothensäure kann mit Hilfe von bekannten chemischen (Velisek; Chromatographic Science 60, 515–560 (1992)) oder mikrobiologische Verfahren, wie beispielsweise mit dem Lactobacillus plantarum-Test (DIFCO MANUAL, 10te Auflage, S. 1100–1102; Michigan, USA), bestimmt werden.
Eine reine Kultur des folgenden Mikroorganismus wurde bei der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) am 8. September 200 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt:

• Escherichia coli K12-Stamm FE6-1, als DSM 13721.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden eingehender anhand der Arbeitsbeispiele erläutert.
Die Minimal- (M9) und Komplett-(LB) Medien für Escherichia coli sind von J. H. Miller (A short course in bacterial genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Die Isolation von Plasmid-DNA aus Escherichia coli und sämtliche Techniken für die Spaltungs-, Klenow- und alkalische-Phosphatase-Behandlung erfolgen gemäß Sambrook et al. (Molecular Cloning – A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Die Transformation von Escherichia coli erfolgt wenn nicht anders beschrieben gemäß Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172–2175).
Beispiel 1
Konstruktion des Expressionsplasmids pTrc99AglyA Das Gen glyA aus E. coli K 12 wird mit Polymerasekettenreaktion (PCR) und synthetischen Oligonukleotiden amplifiziert. Ausgehend von der Nukleotidsequenz für das Gen glyA in E. coli K12 MG1655 (Zugangsnummer AE000341, Blattner et al., (Science 277, 1453–1462 (1997) werden PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):
Die für die PCR verwendete chromosomale DNA aus E. coli K12 MG1655 wird nach den bereitgestellten Herstellerangaben mit "Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Ein etwa 1400 bp großes Fragment kann mit spezifischen Primern unter Standard-PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) mittels DNA-Polymerase Pfu (Promega Corporation, Madison, USA) amplifiziert werden. Das PCR-Produkt wird nach den bereitgestellten Herstellerangaben mit dem Vektor pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und im E. coli-Stamm TOP10 transformiert. Die Auswahl der Zellen, die das Plasmid tragen, erfolgt auf mit 50 μg/ml Kanamycin behandeltem LB-Agar. Nach der Isolation der Plasmid-DNA wird der Vektor-pCR-Blunt II-TOPOglyA mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI gespalten, und das glyA-Fragment wird nach der Trennung in einem 0,8%igen Agarosegel mit dem QIAquick Gelextraktions-Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wird mit den Enzymen HindIII und XbaI gespalten und mit dem isolierten glyA-Fragment ligiert. Der E. coli-Stamm XL1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit dem Ligationsgemisch transformiert, und Zellen, die das Plasmid tragen, werden auf mit 50 μg/ml Ampicillin behandeltem LB-Agar selektiert. Eine erfolgreiche Klonierung kann nach der Plasmid-DNA-Isolation durch Kontrollspaltung mit dem Enzym SspI erfasst werden. Das Plasmid hat die Bezeichnung pTrc99AglyA (1).
Beispiel 2
Präparation des Stamms FE6-1/pTrc99AglyA
Der E. coli-Stamm FE6 ist eine valinresistente Mutante von E. coli K12 MG1655 (US-B-6171845) und ist als DSM12379 an der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig Deutschland) hinterlegt. Ausgehend von FE6 werden spontane Mutanten nach der Inkubation bei 37°C auf Minimalagar isoliert, der mit 2 g/l Glucose und 1 g/l β-Hydroxyasparaginsäure behandelt wurde. Eine selektierte β-Hydroxyasparaginsäure-resistente Einzelkolonie wird dann bei 37°C auf Minimalagar inkubiert, der 2 g/l Glucose und 0,2 g/l O-Methylthreonin enthält. Eine als FE6-1 bezeichnete Mutante FE6-1 ist nach diesem Schritt resistent gegenüber Valin, α-Ketoisovaleriansäure, β-Hydroxyasparaginsäure und O-Methylthreonin. Das Plasmid pTrc99AglyA wird im Stamm FE-6-1 transformiert, und Zellen, die das Plasmid tragen, werden auf mit 50 μg/ml Ampicillin behandeltem LB-Agar ausgewählt. Der erhaltene Stamm hat die Bezeichnung FE6-1/pTrc99 AglyA.
Beispiel 3
Präparation des Stammes FE6-1/pTrc99AglyA, pACYC184panBC
Der D-Pantothensäure-produzierende E. coli-Stamm FV5069/pFV31 ist in EP-A-0590857 beschrieben und ist gemäß dem Budapester Vertrag als FERM BP 4395 hinterlegt. Das Plasmid pFV31 wird aus FV5069/pFV31 isoliert und mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten.
Nach der Auftrennung in einem 0,8%igen Agarosegel wird das etwa 2600 bp große DNA-Fragment, auf dem sich die panBC-Gene befinden, mit dem QIAquick Gel-Extraktionskit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pACYC184 (Chang, A. C. Y. und Cohen, S. N., Journal of Bacteriology 134, 1141–1156 (1978); ATCC37033 (American Type Culture Collection, Manassas, USA)) wird mit dem Enzym EcoRI gespalten und mit dem isolierten panBC-Fragment ligiert. Der E. coli-Stamm FE6-1 wird mit dem Ligationsgemisch transformiert, und Zellen, die das Plasmid tragen, werden auf mit 10 μg/ml Tetracyclin behandeltem LB-Agar selektiert. Die erfolgreiche Klonierung kann durch Kontrollspaltung mit den Enzymen EcoRV und EcoRI nach der Plasmid-DNA-Isolation erfasst werden. Das Plasmid hat die Bezeichnung pACYC184panBC (2). Der in Beispiel 2 beschriebene Stamm FE6-1/pTrc99AglyA wird mit dem Plasmid pACYC184panBC transformiert. Die Selektion wird auf mit 50 μg/ml Ampicillin und 10 μg/ml Tetracyclin behandeltem LB-Agar durchgeführt. Der auf diese Weise erzeugte Stamm hat die Bezeichnung FE6-1/pTrc99AglyA, pACYC184panBC.
Beispiel 4
Produktion von D-Pantothensäure mit von FE6-1 hergeleiteten Stämmen
Die Pantothenat-Produktion der E. coli-Stämme FE6-1, FE6-1/pTrc99AglyA, FE6-1/pACYC184panBC, FE6-1/pTrc99AglyA, pACYC184panBC wird in diskontinuierlichen 10 ml-Kulturen überprüft, sich in konischen 100 ml-Kolben befinden. Zu diesem Zweck werden 10 ml Vorkultur-Medium mit der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄·7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, mit einer Einzelkolonie beimpft und 20 Std. bei 33°C und 200 U/min in einem ESR-Inkubator von Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. 200 μl-Portionen dieser Vorkultur werden jeweils in 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄·7H₂O, 0,03 g/l FeSO₄·7H₂O, 0,018 g/l MnSO₄ 1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 20 g/l β-Alanin, 250 mg/l Thiamin) überimpft und für 48 Std. bei 37°C inkubiert. Während der Inkubation von FE6-1/pTrc99AglyA, werden auch 50 mg/l Ampicillin zum Medium gegeben, während der Inkubation von FE6-1/pACYC184panBC werden auch 10 mg/l Tetracyclin zum Medium gegeben und während der Inkubation von Fe6-1/pTrc99AglyA, pACYC184panBC werden 50 mg/l Ampicillin und 10 mg/l Tetracyclin zum Medium gegeben. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension bei einer Testwellenlänge von 660 nm mit einem LP2W-Photometer von Dr. Lange Co. (Düsseldorf, Deutschland) bestimmt.
Dann wird die Konzentration des in der steril filtrierten Kulturüberstandsflüssigkeit entstandenen D-Pantothenats bestimmt, wobei die Lactobacillus plantarum ATCC8014-Pantothenat-Assays gemäß der Daten von DIFCO (DIFCO MANUAL, 10. Auflage, S. 1100–1102; Michigan, USA) verwendet wurden. Das Calcium-Salz von D(+)-Pantothensäurehydrat (Katalognummer 25, 972-1, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland) wird zu Kalibrierungszwecken verwendet.
Die Tabelle 1 gibt die Ergebnisse des Tests wider.
Tabelle 1
Kurze Beschreibung der Figuren:
1: Karte des das Gen glyA enthaltenden Plasmids pTrc99AglyA.
2: Karte des das Gen panBC enthaltenden Plasmids pACYC184panBC.

Daten bezüglich der Längen werden als Näherungswerte gegeben. Die Abkürzungen und Namen sind wie folgt:

• Amp:	Ampicillin-Resistenzgen
• Tc:	Tetracyclin-Resistenzgen
• lacI:	Gen für das Repressorprotein des trc-Promotors
• Ptrc:	trc-Promotorbereich, IPTG-induzierbar
• glyA:	codierender Bereich des Gens glyA
• 5S:	5S-rRNA-Bereich
• rrnBT:	rRNA-Terminatorbereich
• panB:	codierender Bereich des Gens panB
• panC:	codierender Bereich des Gens panC

Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme sind wie folgt:

• BamHI:	Restriktionsendonuklease aus Bacillus amyloliquefaciens
• BglII:	Restriktionsendonuklease aus Bacillus globigii
• ClaI:	Restriktionsendonuklease Caryphanon latum
• EcoRI:	Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
• EcoRV:	Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
• HindIII	Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenzae
• KpnI:	Restriktionsendonuklease aus Klebsiella pneumoniae
• PstI:	Restriktionsendonuklease aus Providencia stuartii
• PvuI:	Restriktionsendonuklease aus Proteus vulgaris

• SacI:	Restriktionsendonuklease aus Streptomyces achromogenes
• SalI:	Restriktionsendonuklease aus Streptomyces albus
• SmaI:	Restriktionsendonuklease aus Serratia marcescens
• XbaI:	Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas badrii
• XhoI:	Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas holcicola

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder ihre Salze enthaltenden Futtermittelzusätzen durch Fermentation rekombinanter Mikroorganismen aus der Familie Enterobacteriaceae, die bereits D-Pantothensäure produzieren, bei dem man a)i) ein Polynukleotid mit Nukleotidsequenz(en) des endogenen Gens glyA unter für die Produktion von Serin-Hydroxymethyltransferase geeigneten Bedingungen überexprimiert oder eines oder mehrere der endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe: 1.1 das für Acetohydroxysäure-Synthase II codierende ilvGM-Operon, 1.2 das für Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase codierende Gen panB, 1.3 das für Ketopantoat-Reduktase codierende Gen panE, 1.4 das für Aspartat-Decarboxylase codierende Gen panD, 1.5 das für Pantothenat-Synthetase codierende Gen panC, 1.6 das für Phosphoserin-Transaminase codierende Gen serC, 1.7 die für das Glycin-Spaltsystem codierenden Gene gcvT, gcvH und gcvP, überexprimiert oder ii) zur Herstellung von D-Pantothensäure ein Polynukleotid mit Nukleotidsequenz(en) des endogenen Gens glyA überexprimiert, b) D-Pantothensäure und/oder ihre Salze im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen anreichert und c) die D-Pantothensäure und/oder ihre Salze nach Beendigung der Fermentation isoliert, wobei eine Menge von 0 bis 100 der Biomasse und/oder weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe abgetrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei man die Fermentation in Gegenwart von Erdalkalisalzen durchführt, wobei diese in der benötigten Menge kontinuierlich oder diskontinuierlich zugeführt werden und ein ein Erdalkalisalz der D-Pantothensäure enthaltendes oder daraus bestehendes Produkt erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mikroorganismen aus der Familie Enterobacteriaceae zur Gattung Escherichia gehören.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Mikroorganismen von der Spezies Escherichia coli stammen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Bakterien, in denen das für Transaminase C codierende Gen avtA attenuiert ist, verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentration des Produkts (Proteins) des Gens glyA in bezug auf die des Proteins im Ausgangsmikroorganismus um 10 bis 2000% erhöht ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei man die Überexpression durch Erhöhen der Kopienzahl des Gens erreicht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei man a) 0 bis 100% der Biomasse und/oder weiterer Bestandteile der Fermentationsbrühe von der Fermentationsbrühe, die durch Fermentation erhaltene D-Pantothensäure und/oder Salze davon enthält, abtrennt und b) das D-Pantothensäure und/oder D-Pantothenat enthaltende Gemisch mit geeigneten Maßnahmen in eine frei fließende Form umwandelt und c) daraus einen frei fließenden Tierfutterzusatz mit einer Teilchengrößenverteilung von 20 bis 2000 μm produziert.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei man nach Abtrennen der Biomasse und/oder weiterer Bestandteile in einer Menge von 0 bis 100 das Gemisch auf konzentriert.
Verfahren zur Produktion von D-Pantothensäure und/oder ihre Salze, gewählt aus der Gruppe der Magnesium- oder Calciumsalze, enthaltenden Tierfutterzusätzen gemäß Anspruch 2, bei dem man a) 0 bis 100 der während der Fermentation gebildeten Biomasse abtrennt, b) D-Pantothensäure und/oder ihre Salze zu der gemäß a) behandelten Fermentationsbrühe gibt, wobei die Verbindungen in einer solchen Menge zugegeben werden, daß deren Gesamtkonzentration in dem Tierfutterzusatz im Bereich von etwa 20 bis 80 Gew.-% (Trockengewicht) liegt, und c) den Tierfutterzusatz in der gewünschten Pulver- oder vorzugsweise Granulatform produziert.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei man vor Abtrennen der Biomasse Wasser aus der Fermentationsbrühe entfernt.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei man die Umwandlung des Tierfutterzusatzes in die gewünschte Pulver- oder Granulatform durch a) Trocknung und Kompaktierung oder b) Sprühtrocknung oder c) Sprühtrocknung und Granulierung oder d) Sprühtrocknung und Pelletierung erreicht.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei man vor dem Umwandeln mittels Kompaktierungs- oder Granulierungsverfahren eine organische oder anorganische Hilfssubstanz zugibt.