-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung
von Panthenol. Genauer gesagt, bezieht sich die vorliegende Erfindung
auf ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Panthenol durch
Kultivieren eines Mikroorganismus in einem geeigneten Fermentationsmedium
unter geeigneten Fermentationsbedingungen unter gleichzeitiger Einspeisung
von 3-Aminopropanol (AMP) oder einem Derivat davon und nach Bedarf
Gewinnung des Panthenols.
-
Panthenol
ist 2,4-Dihydroxy-N-(3-hydroxypropyl)-3,3-dimethylbutyramid oder
N-Pantoyl-3-propanolamin, wobei der Alkohol Pantothensäure
entspricht. Aufgrund seiner Membranschützenden Eigenschaften
wird Panthenol verbreitet in der Kosmetikindustrie genutzt. Die
D(+)- oder R-Form von Panthenol, die in Verbindung mit der vorliegenden
Erfindung die bevorzugte Form ist, verfügt über
Vitaminaktivität, und seine Verwendung als Prophylaxemittel
im Bereich der Medizin sowie als Nahrungsergänzung ist
daher wohl begründet, und es werden stetig neue Anwendungen
entwickelt.
-
Das
herkömmliche Herstellungsverfahren von Panthenol ist die
chemische Kondensation von synthetischem R-Pantolacton (α-Hydroxy-β,β-dimethyl-γ-butyrolacton)
mit 3-Aminopropanol (siehe z. B. Schnider, O.: Synthesis
of Panthenol and its transformation into pantothenic acid. Jubiläumsband
Emil Barell 1946, 85–91).
-
Bisher
ist kein Verfahren zur Herstellung von Panthenol durch ein biotechnologisches
Verfahren unter Verwendung von Mikroorganismen beschrieben worden.
-
CN 1367253 beschreibt die
Herstellung von D-Panthenol durch mikrobielle enzymatische Hydrolyse von
DL-Pantoinsäurelacton unter Verwendung von Fusarium monoliforme,
das D-Pantoinsäurelactonhydrolase erzeugt, und Umsetzen
der resultierenden D-Pantoinsäure mit 3-Aminopropanol.
-
Die
vollständige oder teilweise Biosynthese von Panthenol bei
niedrigeren Herstellungskosten als bei den bekannten chemischen
Verfahren ist noch immer ein attraktives technisches Ziel, das es
zu erreichen gilt.
-
Die
vollständige oder teilweise Biosynthese von Panthenol bei
niedrigeren Herstellungskosten als bei den bekannten chemischen
Verfahren ist noch immer ein attraktives technisches Ziel, das es
zu erreichen gilt.
-
EP 859 848 B1 (BASF
AG) beansprucht ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure,
wobei das Verfahren das Kultivieren einer Transformante von E. coli
in Gegenwart von β-Alanin umfaßt.
WO 01/21772 (Omnigene Bioproducts/BASF
AG) beansprucht ein Verfahren zur Herstellung von Pantothenat oder Pantoat
durch Kultivieren genetisch modifizierter Mikroorganismen der Gattung
Bacillus, speziell B. subtilis, worin mindestens ein Enzym, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus PanB (Ketopantoathydroxymethyltransferase),
PanC (Pantothenatsynthetase), PanD (Aspartat-α-decarboxylase)
und PanE (Ketopantoatreduktase), überexprimiert wird.
-
Während
PanC in einem Mikroorganismus unter Bildung von Pantothenat bekanntermaßen
die Kondensation von β-Alanin mit Pantoat katalysiert,
ist nunmehr überraschend herausgefunden worden, daß PanC unter
Bildung von Panthenol auch die Kondensation von 3-Aminopropanol
mit Pantoat katalysieren kann.
-
Daher
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung
von Panthenol, gekennzeichnet durch das Kultivieren eines Mikroorganismus,
der mindestens ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus den Enzymen in der Pantoatbiosynthese und PanC, überexprimieren
kann, unter geeigneten Kultivierungsbedingungen unter gleichzeitiger
Einspeisung von 3-Aminopropanol oder einem geeigneten Derivat davon
und gegebenenfalls Gewinnen des Panthenols aus dem Zellkultivierungsmedium.
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Panthenol, ob nun gemäß einem
solchen Verfahren hergestellt oder nicht, und auf die Verwendung
von PanC oder einer Mutante davon mit erhöhter katalytischer Aktivität
in einem Verfahren zur Herstellung von Panthenol aus 3-Aminopropanol
oder einem Derivat davon und Pantoat.
-
Der
Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung kann eukaryotisch oder
prokaryotisch sein. Bevorzugt ist der Mikroorganismus prokaryotisch.
Der prokaryotische Mikroorganismus kann Gram-positiv oder Gram-negativ
sein. Gram-positive Mikroorganismen umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Mikroorganismen, die zu einer der Gattungen Bacillus, Corynebacterium,
Lactobacillus, Lactococus und Streptomyces gehören. Bevorzugt
gehört der Mikroorganismus zur Gattung Bacillus. Beispiele
sind Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus
subtilis, Bacillus puntis, Bacillus halodurans usw. Am stärksten
bevorzugt ist der Mikroorganismus Bacillus subtilis.
-
Die
Enzyme des Pantoat-Biosyntheseweges – sowie der DNA-Sequenzen,
die für diese kodieren – sind einem Fachmann bekannt
und umfassen ohne Einschränkung PanB, PanE, ilvB, ilvC,
ilvD, ilvN, GlyA, SerA und SerC sowie die Enzyme des Glycin-Spaltungsweges.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung
wird mindestens eines der Enzyme PanB, PanC, PanE und ilvD überexprimiert.
In einer weiteren speziellen Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung wird PanD, das unter Bildung von β-Alanin die α-Decarboxylierung
von Aspartat katalysiert, durch die teilweise oder vollständige
Deletion des entsprechenden PanD-Gens inaktiviert.
-
In
der Literatur werden viele spezifische genetisch manipulierte und
transformierte Mikroorganismen beschrieben, die eines oder mehrere
Enzyme des Pantoat-Biosyntheseweges überexprimieren oder
die mikrobielle Produktion von Pantoat steigern und daher in der
vorliegende Erfindung, gegebenenfalls nach Einführung zusätzlicher
vorteilhafter Änderungen, verwendet werden können.
Beispiele für Veröffentlichungen solcher Mikroorganismen
in der Patentliteratur sind:
WO
97/10340 ,
EP 1 001 027 ,
EP 1 006 189 ,
WO 01/21772 ,
WO 01/92556 ,
EP 1 167 520 ,
WO 02/24936 ,
WO 02/29020 ,
WO 02/055711 ,
WO 02/057474 ,
WO 02/057476 ,
WO 02/061108 ,
WO 02/064806 ,
WO 02/072838 ,
WO 02/072840 ,
WO 02/072854 ,
WO 02/072855 ,
EP 1 247 868 ,
WO 03/004672 ,
WO 03/006664 ,
DE 102 01 540 A1 ,
WO 03/029476 ,
WO 2004/005525 und
WO 2004/005527 .
-
Unter
dem Ausdruck „überexprimieren" oder „Überexprimierung"
ist die Exprimierung eines Genproduktes zu einem höheren
Niveau als dem, der vor der Modifikation des Mikroorganismus oder
in einem vergleichbaren Mikroorganismus, der nicht modifiziert worden
ist, exprimiert wird. In einer Ausführungsform überexprimiert
der Mikroorganismus der Erfindung eines oder mehrere Gen(e), ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus panB, panC, panE, ilvB, ilvC, ilvD,
ilvN, glyA, serA und serC, und die gcv-Gene, die in den Glycin-Spaltungsweg
involviert sind, sowie Mutanten davon, was zur Synthese kodierter
Enzyme mit verbesserten katalytischen Eigenschaften führt.
-
Unter
dem Ausdruck „dereguliert" oder „Deregulation"
ist eine derartige Veränderung oder Modifikation eines
Gens in einem Mikroorganismus zu verstehen, daß der Gehalt
oder die Aktivität des Genproduktes in einem Mikroorganismus
verändert oder modifiziert wird. Bevorzugt wird mindestens
ein Gen so verändert oder modifiziert, daß das
Genprodukt gesteigert/erhöht oder vermindert/verringert
wird.
-
Die Überexpression
oder Deregulation eines Gens in einem Mikroorganismus kann gemäß irgendeiner
in der Technik bekannten Methodologie durchgeführt werden.
In einer Ausführungsform kann der Mikroorganismus genetisch
manipuliert, z. B. genetisch verändert werden. Die genetische
Manipulation kann das Verändern oder Modifizieren von Regulationssequenzen
oder -stellen, die mit der Expression eines speziellen Gens assoziiert
sind, z. B. durch Zugabe starker Promotoren, induzierbarer Promotoren
oder mehrerer Promotoren, oder durch Entfernen von Regulationssequenzen,
so daß die Expression konstitutiv ist, das Modifizieren der
Chromosomenlokation eines speziellen Gens, das Verändern
von Nukleinsäuresequenzen neben einem speziellen Gen wie
einer Ribosomenbindungsstelle oder eines Transkriptionsterminators,
Erhöhung der Kopiezahl eines speziellen Gens, Modifizieren
von Proteinen, z. B. Regulationsproteinen, Suppressoren, Enhancern,
Transkriptionsaktivatoren und dergleichen, involviert in die Transkription
eines speziellen Gens und/oder die Translation eines speziellen
Genproduktes, oder irgendwelche anderen herkömmlichen Mittel
zur Deregulation der Expression eines speziellen Gens, die in der
Technik üblich sind (einschließlich, aber nicht
beschränkt auf die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuremolekülen,
z. B. zur Blockierung der Expression von Repressorproteinen) umfassen,
ist aber nicht darauf beschränkt. Beispiele für
geeignete Promotoren sind Pveg, P15 und P26, sind
aber nicht darauf beschränkt (Lee et. al., 1980,
Mol. Gen. Genet. 180: 57–65 und Moran et. al., 1982, Mol.
Gen. Genet. 186: 339–46.
-
Alternativ
kann der Mikroorganismus physikalisch oder umwelttechnisch so manipuliert
werden, das er den Gehalt an Genprodukt überexprimiert,
der größer ist als der vor der Manipulation des
Mikroorganismus oder in einem vergleichbaren Mikroorganismus, der
nicht manipuliert worden ist, exprimierte. Beispielsweise kann ein
Mikroorganismus mit einem Mittel, das bekanntermaßen oder
vermutlich die Transkription eines speziellen Gens und/oder die
Translation eines speziellen Genproduktes erhöht, behandelt
oder in dessen Gegenwart so kultiviert werden, daß die
Transkription und/oder Translation gesteigert oder erhöht
wird. Ferner kann ein Mikroorganismus bei einer Temperatur, die
so gewählt wurde, daß die Transkription eines
speziellen Gens und/oder Translation eines speziellen Genproduktes
erhöht wird, so kultiviert werden, daß die Transkription und/oder
Translation gesteigert oder erhöht wird.
-
Der
Ausdruck „Kultivieren eines Mikroorganismus unter geeigneten
Kultivierungsbedingungen" bezieht sich auf Verfahren zur Erhaltung
und/oder zum Züchten eines lebenden Mikroorganismus der
vorliegenden Erfindung, die in der Technik allgemein bekannt sind.
Die Mikroorganismen können in flüssigen, festen oder
halbfesten Medien kultiviert werden. Bevorzugt wird der Mikroorganismus
der Erfindung in flüssigen Medien kultiviert, die Nährstoffe
umfassen, die zur Erhaltung und/oder zum Züchten des Mikroorganismus
essentiell oder nützlich sind. Solche Nährstoffe
umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Kohlenstoffquellen
oder Kohlenstoffsubstrate, wie Alkohole, Zucker, Zuckeralkohole,
komplexe Kohlenhydrate wie Stärken, Kohlenwasserstoffe,
Fettsäuren, andere organische Säuren; Öle,
Fette; Stickstoffquellen, zum Beispiel Pflanzenproteine, Hefeextrakt,
Peptone, Peptide und Aminosäuren, die aus Körnern,
Bohnen und Knollen oder aus tierischen Quellen wie Fleisch oder
Milch, Fleischextrakten und Kaseinhydrolysaten stammen; anorganische Stickstoffquellen
wie Harnstoff, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und
Ammoniumphosphat; Phosphorquellen, z. B. Phosphorsäure
und Natrium- oder Kaliumsalze davon; Spurenelemente, z. B. Magnesium-,
Eisen-, Mangan-, Calcium-, Kupfer-, Zink-, Bor-, Molybdän-
und/oder Kobaltsalze; sowie Wachstumsfaktoren wie Vitamine, Wachstumspromotoren
und dergleichen.
-
Die
Mikroorganismen werden bevorzugt unter kontrolliertem pH kultiviert.
In einer Ausführungsform werden die Mikroorganismen bei
einem pH zwischen 6,0 und 8,5, stärker bevorzugt einem
pH von etwa 7 kultiviert. Der gewünschte pH kann durch
ein Verfahren aufrechterhalten werden, das einem Fachmann bekannt ist.
-
Bevorzugt
werden die Mikroorganismen ferner unter kontrollierter Belüftung
und unter kontrollierten Temperaturen kultiviert. In einer Ausführungsform
umfassen die kontrollierten Temperaturen Temperaturen zwischen 15
und 70°C, bevorzugt liegen die Temperaturen zwischen 20
und 55°C, stärker bevorzugt zwischen 30 und 45°C
oder zwischen 30 und 50°C.
-
Die
Mikroorganismen können in flüssigen Medien entweder
kontinuierlich, halbkontinuierlich oder diskontinuierlich durch
herkömmliche Kultivierungsverfahren wie Stehkultur, Teströhrchenkultur,
Schüttelkultur, Lüftungsdrehkultur (aeration spinner
culture) oder Fermentation kultiviert werden. Bevorzugt werden die
Mikroorganismen in einem Fermenter kultiviert. Die Fermentationsverfahren
der Erfindung umfassen Batch-, Fed-Batch- und kontinuierliche Fermentationsverfahren.
Es ist eine Vielzahl solcher Verfahren entwickelt worden und in
der Technik allgemein bekannt.
-
Das
Kultivieren wird üblicherweise so lange durchgeführt,
bis die gewünschte Menge an Panthenol erzeugt worden ist.
-
Das
wesentliche Merkmal der Kultivierung der Mikroorganismen gemäß der
vorliegenden Erfindung ist das gleichzeitige Einspeisen von 3-Aminopropanol
(AMP) oder einem geeigneten Derivat davon. Geeignete Derivate von
AMP sind die, die unter den Kultivierungsbedingungen in AMP umgewandelt
werden, wie 3-Alkoxypropylamine, bevorzugt 3-Methoxy- oder 3-Ethoxy-propylamine,
3-Halogenpropylamine, z. B. 3-Chlorpropyl-amin, oder 3-Aminopropanthiol.
-
Obgleich
bakterielle Kulturen innerhalb von 72 h angelegt wurden, wurden
die Modalitäten der AMP-Co-Einspeisung sowohl für
die Schüttelkolben- als auch die Fermentationsexperimente
gewissenhaft an jede Art von Panthenol-Herstellungsexperiment angepaßt.
In Schüttelkolben wurde AMP dem Wachstumsmedium zum Zeitpunkt
der Inokulation und mit einer Konzentration von 40 g/l zugegeben.
Während der Fed-Batch-Fermentation folgte einer er sten
24-h-Wachstumsphase, die ohne gleichzeitige AMP-Einspeisung durchgeführt
wurde, die Einspeisung von AMP während 24 h bei 14 g/l.
Diese AMP-Einspeisung wurde dann für die letzten 24 h des
Wachstums erhöht. In beiden Fällen ist es wichtig,
den pH durch Neutralisation mit HCl konstant zu halten (der pH betrug
7,2 für Schüttelkolbenexperimente und 6,8 für
Rührkesselfermentation).
-
In
einer speziellen Ausführungsform der Erfindung kann die
Ausbeute an mikrobiell erzeugtem Panthenol durch gleichzeitige oder
periodische Co-Einspeisung von Pantoinsäure, einem geeigneten
Pantoinsäurederivat oder einem Präkursor von Pantoat
in den Biosyntheseweg erhöht werden. Die optimale Menge
einer solchen Co-Einspeisung unter den speziellen Kultivierungsbedingungen
kann leicht durch Routineexperimente bestimmt werden.
-
Das
gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene Panthenol
in der Fermentationsbrühe kann entweder ohne Gewinnung
oder nach der Gewinnung verwendet werden. Der Ausdruck „Gewinnung"
umfaßt das Isolieren, Extrahieren, Ernten, Trennen oder
Reinigen der Verbindung aus dem Kulturmedium. Das Isolieren der
Verbindung kann gemäß einer herkömmlichen
Isolations- oder Reinigungsmethodologie, die in der Technik bekannt
ist, durchgeführt werden, einschließlich, aber
nicht beschränkt auf Behandlung mit einem herkömmlichen
Harz, Behandlung mit einem herkömmlichen Adsorbens, Änderung
des pH, Lösungsmittelextraktion, Dialyse, Filtration, Konzentration,
Kristallisation, Umkristallisation, pH-Einstellung und dergleichen.
Beispielsweise kann die Panthenolverbindung aus dem Kulturmedium
gewonnen werden, indem zunächst die Mikroorganismen aus
der Kultur entfernt werden. Die Lösung wird dann durch
oder über ein Kationenaustauschharz geführt, um
unerwünschte Kationen zu entfernen, und dann durch oder über
ein Anionenaustauschharz, um unerwünschte anorganische
Anionen und organische Säuren zu entfernen.
-
Die
Erfindung wird durch die folgende Beschreibung der allgemeinen Methodologie
sowie durch nicht einschränkende spezielle Beispiele weiter
veranschaulicht.
-
Allgemeine Methodologie
-
Stämme
und Plasmide. Die Bacillus subtilis-Stämme der vorliegenden
Erfindung stammen aus Stamm 1A747 (Bacillus Genetic Stock Center,
The Ohio State University, Columbus, Ohio 43210 USA), welcher ein
prototrophes Derivat von B. subtilis 168 (trpC2) ist (GenBank AL009126).
Die Chloramphenicol-Resistenzgenkassette (cat) wurde aus Plasmid
pC194 erhalten (GenBank M19465, Kat. # 1 E17, Bacillus Genetic Stock
Center, The Ohio State University, Columbus, Ohio 43210 USA). Das
S. aureus-Erythromyzin-Resistenzgen (GenBank V01278) wurde aus Plasmid
pDG646 amplifiziert (Guerout-Fleury et. al., 1995).
Das S. aureus-Spectinomyzin-Resistenzgen (XO3216) wurde aus Plasmid
pDG1726 amplifiziert (Guerout-Fleury et. al., 1995).
Die P15- und P26-Promotoren
des B. subtilis-Bakteriophagen SPO1 (Lee et. al., 1980,
Mol. Gen. Genet. 180: 57–65) wurden aus Derivaten
von Plasmid pXI2 erhalten (Hümbelin et. al., 1999,
J. Ind. Microbiol. Biotech. 22: 1–7), die SPO1-15-
und SPO1-26-Promoten aus RB50::[pRF69]::[pRF93] enthalten (Perkins
et. al., 1999, J. Ind. Microbiol. Biotech. 22: 8–18).
-
Medien.
Standard-Minimalmedium (MM) für B. subtilis enthält
1 X Spizizen-Salze, 0,04% Natriumglutamat und 0,5% Glucose. Festes
Standard-Vollmedium ist Tryptone-Blood-Agar-Kulturlösung
(TBAB, Difco. Flüssiges Standard-Vollmedium ist Veal-Infusion-Hefeextrakt-Kulturlösung
(VY). Die Zusammensetzungen dieser Medien werden nachstehend beschrieben:
- TBAB-Medium: 33 g Difco Tryptone Blood Agar Base (Katalog #
0232), 1 l Wasser. Autoklav.
- VY-Medium: 25 g Difco-Veal-Infusion-Kulturlösung (Katalog
# 0344), 5 g Difco Hefeextrakt (Katalog # 0127), 1 l Wasser. Autoklav.
- Minimalmedium (MM): 100 ml 10 X Spizizen-Salze; 10 ml 50% Glucose;
1 ml 40%iges Natriumglutamat, qsp 1 l Wasser.
- 10 X Spizizen-Salze: 140 g K2HPO4; 20 g (NH4)2SO4; 60 g KH2PO4; 10 g Na3-Citrat·2H2O;
2 g MgSO47·H2O; qsp
1 l mit Wasser.
- 10 X VFB-Minimalmedium (10 X VFB-MM): 2,5 g Na-Glutamat; 15,7
g KH2PO4; 15,7 g
K2HPO4; 27,4 g Na2HPO4·12H2O; 40 g NH4Cl; 1
g Zitronensäure; 68 g (NH4)2SO4; qsp 1 l Wasser.
- Spurenelementelösung: 1,4 g MnSO4·H2O; 0,4 g CoCl2·6H2O; 0,15 g (NH4)6Mo7O24·4H2O; 0,1 g AlCl3·6H2O; 0,075 g CuCl2·2H2O; qsp 200 ml Wasser
- Fe-Lösung: 0,21 g FeSO4·7H2O; qsp 10 ml Wasser.
- CaCl2-Lösung: 15,6 g CaCl2·2H2O; qsp 500 ml Wasser.
- Mg/Zn-Lösung: 100 g MgSO4·7H2O; 0,4 g ZnSO4·7H2O; qsp 200 ml Wasser.
- VFB-MM-Medium: 100 ml 10 X VFB-MM; 10 ml 50% Glucose; 2 ml Spurenelementelösung;
2 ml Fe-Lösung; 2 ml CaCl2-Lösung;
2 ml Mg/Zn-Lösung; 882 ml steriles destilliertes Wasser.
- VFB-MMGT-Medium: 100 ml 10 X VFB-MM; 100 ml 0,5 M Tris (pH 6,8);
44 ml 50%ige Glucose; 2 ml Spurenelementelösung; 2 ml Fe-Lösung;
2 ml CaCl2-Lösung; 2 ml Mg/Zn-Lösung;
748 ml steriles destilliertes Wasser.
- VF-Fermentations-Batch-Medium: Sterilisiert vor Ort in Lösung:
0,75 g Natriumglutamat; 4,71 g KH2PO4; 4,71 g K2HPO4; 8,23 g Na2HPO4·12H2O;
0,23 g NH4Cl; 1,41 g (NH4)2SO4; 11,77 g Hefeextrakt (Merck); 0,2 ml
Basildon-Entschäumer; qsp 1 l.
- Als autoklavierte Lösung in den Fermenter gegeben:
27,3 g Glucose-H2O; qsp 1 l.
- Als Filter-sterilisierte Lösung in den Fermenter gegeben:
2 ml Spurenelementelösung; 2 ml CaCl2-Lösung;
2 ml Mg/Zn-Lösung; 2 ml Fe-Lösung; qsp 1 l.
- VF-Fermentations-Speisemedium: 660 g Glucose·H2O; qsp 1 l. Autoklav. Zugabe von 2 g MgSO4·7H2O;
14,6 mg MnSO4·H2O;
4 mg ZnSO4·H2O;
qsp 1 l (autoklaviert).
- VYS-Medium (g/l): Veal-Infusion-Kulturlösung, 30; Hefeextrakt,
5; Sorbitol, 10; K2HPO4,
2,5. Dieses Medium wurde in der ersten Stufe der Impfkultur verwendet.
- Co-Einspeisungsmedien: Stammlösungen aus Pantoat und
3-Aminopropanol wurden mit Endkonzentrationen von 415 g/l bzw. 980
g/l hergestellt.
-
Molekular-
und Gentechniken. Standard-Gen- und -Molekularbiologietechniken
sind in der Technik allgemein bekannt und sind bereits beschrieben
worden. DNA-Transformation, PBS1-generalisierte Transduktion und
andere Standard-B. subtilis-Gentechniken sind auch allgemein in
der Technik bekannt und bereits beschrieben worden (Harwood und
Cutting, 1992).
-
Fermentationen.
Die Stämme wurden in Rührkesselfermentern, zum
Beispiel New Brunswick 20 Liter-Gefäßen, die anfänglich
6 Liter VF-Fermentations-Batch-Medium mit Glucose/Salzlösung
enthielten, gezüchtet. Die Computersteuerung erfolgte durch
die kommerzielle NBS Biocommand 32-Software (New Brunswick Scientific
Co., Inc., Edison, NJ, USA); Lucullus-Software (Biospecktra AG,
Schlieren, Schweiz) wurde zur Datensammlung und Kontrolle der Glucoseeinspeisung
verwendet.
-
Zur
Herstellung der Impfkultur für die Fermentation wurde ein
Zwei-Impfkultur-Protokoll verwendet. In der ersten Stufe wurden
2 ml Stammkultur, zuvor hergestellt und bei –25°C
konserviert, in 25 ml VYS-Kulturlösung in einen 100-ml-Erlenmeyerkolben
inokuliert, was dann für 3 h bei 39°C auf einem
Rundschüttler bei 200 U/min inkubiert wurde. In der zweiten
Stufe wurden 0,1 ml dieser Kultur in 300 ml der Herstellungsmedien überführt.
Diese zweite Vorkultur wurde in einem 2-1-Erlenmeyerkolben angelegt
und erneut bei 39°C 21 h inkubiert, wobei während
dieser Zeit eine OD > 12
erreicht wurde. Für die Endstufe wurde der Inhalt des Kolbens keimfrei
in den Rührkesselreaktor (Fermenter) überführt,
was ungefähr 5 Gew.-% Impfkulturkonzentration ergab. Gefrorene
Bakterienstämme wurden durch Züchten von Bakterien
in VY-Medium bis zur späten exponentiellen Stufe (OD600 = 0,8 – 1,0), Zugabe von sterilem
Glycerol auf eine Endkonzentration von 20% und dann Einfrieren von
1-ml-Proben auf Trockeneis und Lagern der gefrorenen Bakterien bei –80°C
hergestellt.
-
Während
der Fermentation wurde durch automatische Zugabe von 27%iger Ammoniumhydroxidlösung
und 3M HCl ein pH von 6,8 konstant in dem Reaktor gehalten. Die
Fermentationstemperatur betrug 39°C. Die Mindestkonzentration
von 15% gelöstem Sauerstoff (pO2)
wurde durch automatische Kaskadenbildung des Rührers (im
Bereich von 400 U/min bis 1000 U/min) und des Luftstroms bei Niveaus
von mehr als 1 vvm erreicht. Entschäumer (Basildon) wurde
manuell nach Bedarf zugegeben.
-
Die
Fermentationen können Batch-Verfahren sein, sind bevorzugt
aber Kohlenhydratbeschränkte, Fed-Batch-Verfahren. Daher
wurde dem Reaktor nach Verbrauch der anfänglichen Glucose
eine definierte VF-Fermentations-Speiselösung (siehe oben)
zugeführt, was für gewöhnlich nach 6
bis 8 Stunden Verfahrenszeit der Fall war. Zu diesem Zeitpunkt wurde
eine konstante Zugabe der Speiselösung mit einer Geschwindigkeit
von 84 g/h initiiert.
-
Bestimmung von Panthenol, Pantothenat,
Pantoat, Aminopropanol und THMP (2,3,4-Trihydroxy-3-methyl-pentan)
-
Die
Menge an Panthenol, Pantothenat, Pantoat, Aminopropanol und THMP
wurde durch 1H-NMR-Spektroskopie wie folgt
bestimmt: 500 μl Überstand wurden 500 μl
einer Standardlösung, die eine genau bekannte Menge an
Maleinsäure (5,607 g/l) enthält, zugegeben. Nach
der Lyophilisierung und erneuten Auflösung in 650 μl
D2O wurde das 1H-NMR-Spektrum
bei 600 MHz bei 300 K auf einem Bruker Avance 600-Spektrometer gemessen.
Die Relaxationsverzögerung wurde auf 30 Sekunden eingestellt,
um eine vollständige Relaxation zwischen den Scans sicherzustellen.
Es wurden insgesamt 16 Scans gemessen. Aus dem Verhältnis
zwischen den Integralen aus den Methylresonanzen der in Frage stehenden
Verbindung wurde die genaue Menge der vorliegenden Komponenten berechnet.
-
BEISPIEL 1
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion des Pantothenat-überproduzierenden
Stammes PA12.
-
Polymerasekettenreaktion
(PCR) wurde zur Erzeugung einer Deletionsmutation in der Promotorregion des
panBCD-Operons eines prototrophen B. subtilis-Stammes 1A747, worin
eine 215 bp lange Nukleotidregion zwischen birA und panB durch die
Chloramphenicol(cat-)-Resistenzkassette aus Staphylococcus aureus (GeneBank
M58515) ersetzt wurde, verwendet. Hierfür wurde die cat-Kassette
zunächst zwischen die NheI- und ClaI-Stellen des pBR322-Plasmids
(GeneBank J01749) entgegengesetzt zur transkriptionalen Richtung von
panB eingernhrt. Dann wurden zwei PCR-Fragment-„arme” erzeugt:
0,2 μl einer 100-mM-Lösung von Primer panB/up2/for/R1
und panB/up2/rev/ClaI oder den Primern panB/down2/for/NheI und panB/down2/rev/Bam
(Tabelle 1) wurden 0,1 μg 1 A747 Chromosomen-DNA in einem
Reaktionsvolumen von 50 μl, enthaltend 1 μ140
mM dNTPs, 5 μl 10X-Puffer und 0,75 μl PCR-Enzym
(Taq und Tgo), zugegeben, wie vom Hersteller beschrieben (Expand
High fidelity PCR System-Roche Applied Science). Die PCR-Reaktion wurde über
30 Zyklen unter Anwendung einer Annealingtemperatur von 58°C
und einer Elongationszeit von 60 Sekunden durchgeführt.
Die resultierenden Fragmente, F1 bzw. F2 genannt, wurden gereinigt
und nacheinander jeweils zwischen die EcoRI- und ClaI-Stellen (für
F1) und die NheI- und BamHI-Stellen (für F2) von pBR322
eingeführt. Ligierte DNA wurde in E. coli-TOP10-Zellen
(Invitrogen), selektiert auf Ampicillinresistenz bei einer Konzentration
von 100 μg/ml, transformiert. Dies führte zu dem
E. coli-Plasmid pPA5. Dann wurde die ΔpanBp::cat-Deletionskassette
durch DNA-Transformation in das Chromosom von B. subtilis 1A747,
selektiert auf Chloramphenicolresistenz (Cmr),
auf TBAB-Agarplatten, enthaltend 5 μg/ml Chloramphenicol
(Cm), unter Verwendung von Standardbedingungen eingeführt.
Eine einzelne Cmr-Kolonie mit einer Deletion
in der panB-Promotor-Region wurde isoliert und PA1 (ΔpanBp::cat) genannt. Wie erwartet, war PA1 auch
ein Pantothenat-Auxotrophe (Pan), der Pantothenat zum Wachstum auf
Minimalmedium benötigt. Die Deletionsmutation wurde durch
diagnostische PCR unter Verwendung von panB/up2/for/RI- und panB/down2/rev/Bam-Primern (Tabelle
1) wieder unter Verwendung von Standardreaktionsbedingungen bestätigt.
-
Tabelle
1. Primer, die zur Erzeugung eines B. subtilis-Stammes, enthaltend
eine ΔpanB
p::cat-Deletionsmutation,
verwendet werden.
-
Der
nächste Schritt war die Einführung eines starken
konstitutiven Promotors upstream des panB-Gens. Solche Promotoren
sind in der Literatur beschrieben, einschließlich derer,
die aus dem SPOT-Bakteriophagen von B. subtilis stammen, P15 und P26 (Lee
et. al., 1980). Long-Flanking-Homology-Polymerasekettenreaktion
(LFH-PCR) (Wach, 1996) wurde zur Erzeu gung von
DNA-Fragmenten, die P15 upstream der Ribosomenbindungsstelle
(RBS) von panB enthalten, verwendet. Hierfür wurden zunächst
zwei PCR-Fragment-„arme” erzeugt: 0,2 μl
einer 100-mM-Lösung von Primer P1panBCD und P2panBCD oder
den Primer P3panBCD und P4panBCD (Tabelle 2) wurden zu 0,1 μg
1A747 Chromosomen-DNA in einem Reaktionsvolumen von 50 μl,
enthaltend 1 μl 40 mM dNTPs, 5 μl 10X-Puffer und
0,75 μl PCR-Enzym (Taq und Tgo), zugegeben, wie vom Hersteller
(Expand High fidelity PCR System-Roche Applied Science) beschrieben.
Die PCR-Reaktion wurde über 30 Zyklen unter Anwendung einer
Annealingtemperatur von 55,7°C und einer Elongationszeit
von 45 Sekunden durchgeführt. Die resultierenden Fragmente,
F3 bzw. F4 genannt, wurden gereinigt und als Primer in einer zweiten
PCR-Runde verwendet. F3- und F4-Fragmente wurden 50fach verdünnt, und
1 μl von jedem wurde zu 0,1 μg des linearisierten
Plasmids pXI23roDTD-SPO1-15 (enthaltend den P15-Promotor)
in einem Reaktionsvolumen von 50 μl zugegeben. In den ersten
10 Zyklen wurden eine Annealingtemperatur von 63°C und
eine Elongationszeit von 6 Minuten verwendet. In den nächsten
20 Zyklen wurde die Elongationszeit um 20 Sekunden nach jedem Zyklus
ausgedehnt. Die resultierenden Produkte wurden dann in einer dritten
PCR-Runde als eine Matrize verwendet. Die PCR-Produkte wurden 50fach
verdünnt, und 1 μl wurde mit 0,2 μl einer
100-mM-Lösung von Primer PIpanBCD und P4panBCD in einem
Reaktionsvolumen von 50 μl, enthaltend dNTPs, Puffer und
Enzyme, wie oben beschrieben, vereinigt. Die PCR-Reaktionsparameter
waren mit denen, die in der zweiten PCR-Runde verwendet wurden,
identisch. Die fertigen PCR-Fragmente wurden als nächstens
durch DNA-Transformation in den panB-Promotor-deletierten Stamm
PA1, selektiert auf Pantothenatprototrophie (Pan+),
auf Minimalmedium-Agarplatten unter Verwendung von Standardbedingungen
transformiert. Diese Pan+-Kolonien waren
auch Chloramphenicol-sensitiv (Cms), was
die Insertion der Promotorkassette bestätigte. Eine einzelne
Pan+-Cms-Kolonie,
enthaltend ein panBCD-Operon, exprimiert aus dem P15-Promotor,
wurde isoliert und PA12 (P15panBCD) genannt.
Die Gegenwart des P15-Promotors upstream
des panB-Gens wurde durch diagnostische PCR unter Verwendung von
P15seq- und P4panBCD-Primern (Tabelle 2) wieder unter Verwendung
von Standardreaktionsbedingungen bestätigt.
-
Tabelle
2. Primer, die zur Erzeugung eines B. subtilis-Stammes, enthaltend
eine P
15panBCD-Expressionskassette, verwendet
werden.
-
BEISPIEL 2
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion des Pantothenat-überproduzierenden
Stammes PA49.
-
Zur
Konstruktion eines Stammes, der auch einen starken konstitutiven
Promotor upstream des panE-Gens (ylbQ) enthielt, wurde zunächst
eine Deletionsmutation konstruiert. Die Untersuchung des panE-Gens
deckte zwei potentielle Startstellen auf: Startstelle 1 (5'-AAATTGGGTG-3'(RBS)-7
nt-ATG), die eine BspHI-Stelle überlappt und sich 33 bp
upstream von Startstelle 2 (5'-GGAGG-3'(RBS)-5 nt-TTG) befindet,
die eine BsaXI-Stelle überlappt. Folglich wurde eine 219
bp-Deletion der panE/ylbQ-Promotorregion durch LFH-PCR unter Verwendung
eines S. aureus-Erythromyzinresistenz-(Emr-)-Gens
konstruiert (GenBank V01278). Hierfür wurden zunächst
zwei PCR-Fragment-„arme” erzeugt: 0,2 μl
einer 100-mM-Lösung von Primer P1panE und P2panE/Er oder
den Primer P3panE/Er/2 und P4panE (Tabelle 3) wurden zu 0,1 μg
1A747 chromosomaler DNA in einem Reaktionsvolumen von 50 μl,
enthaltend 1 X140 mM dNTPs, 5 μl 10X-Puffer und 0,75 μl
PCR-Enzym (Taq und Tgo), zugegeben, wie vom Hersteller (Expand High
fidelity PCR System-Roche Applied Science) beschrieben. Die PCR-Reaktion
wurde über 30 Zyklen unter Verwendung einer Annealingtemperatur
von 55,7°C und einer Elongationszeit von 45 Sekunden durchgeführt.
Die resultierenden Fragmente, F1 bzw. F2 genannt, wurden gereinigt
und als Primer in einer zweiten PCR-Runde verwendet. Die F1- und
F2-Fragmente wurden 50fach verdünnt, und 1 μ1
von jedem wurde zu 0,1 μg des linearisierten Plasmids pDG646
(enthaltend die erm-Kassette; Guerout-Fleury et. al., 1995)
in einem Reaktionsvolumen von 50 μl zugegeben. In den ersten
10 Zyklen wurden eine Annealingtemperatur von 63°C und
eine Elongationszeit von 6 Minuten verwendet. In den folgenden 20
Zyklen wurde die Elongationszeit um 20 Sekunden nach jedem Zyklus ausgedehnt.
Die resultierenden Pro dukte wurden dann in einer dritten PCR-Runde
als eine Matrize verwendet. Die PCR-Produkte wurden 50fach verdünnt,
und 1 μl wurde mit 0,2 μl einer 100-mM-Lösung
von Primer P1panE und P4panE in einem Reaktionsvolumen von 50 μl,
enthaltend dNTPs, Puffer und Enzym, wie oben beschrieben, vereinigt.
Die PCR-Reaktionsparameter waren mit denen, die in der zweiten PCR-Runde
verwendet wurden, identisch. Die fertigen PCR-Fragmente wurden als
nächstes in PA4 (Trp+-Kolonien,
erhalten aus B. subtilis CU550 trpC2 ilvC4 leu-124 durch Transformation
mit 1A747 chromosomaler DNA) transformiert, was zu Emr-Kolonien
führte, die Pantothenat-Auxotrophen waren. Dieser Stamm
wurde PA5 (ΔpanEp::erm ilvC leuC)
genannt. Diagnostische PCR wurde zur Bestätigung der Struktur
der Deletion verwendet. Anschließend wurde die panB-Promotordeletion
durch Transformation in PA5 von PA1 chromosomaler DNA bei nicht
kongressionaler (non-congressional) Konzentration eingeführt,
wodurch PA6 (ilvC leuC ΔpanBp::cat ΔpanEp::erm) erzeugt wurde.
-
Tabelle
3. Primer, die zur Erzeugung eines B. subtilis-Stammes, enthaltend
eine ΔpanE
p::ermt-Deletionsmutation,
verwendet werden.
-
Der
nächste Schritt war die gleichzeitige Einführung
starker konstitutiver P15-Promotoren upstream
sowohl von panB als auch panE. LFH-PCR wurde erneut zur Erzeugung
von DNA-Fragmenten, enthaltend P15 upstream
des offenen Leserasters von panB und enthaltend P15 upstream
des offenen Leserasters von panE, verwendet. Hierfür wurden
zwei PCR-Fragment„arme" für panB und panE unter
Verwendung der Primer P1 panB und P2panB/P15 (F1) und der Primer
P3panB/P15 und P4panB (F2) (Tabellen 1 und 2, P15panB-Konstruktion),
und P1panE und P2panE/P15 (F1) und P3panE/P15 und P4panE (F2) (Tabellen
3 und 4, P15panE-Konstruktion), unter Verwendung
desselben PCR-Protokolls, das zur Konstruktion von PAl2 verwendet
wurde (siehe oben) erzeugt.
-
Tabelle
4. Primer, die zur Erzeugung eines B. subtilis-Stammes, enthaltend
eine P
15panE-Expressionskassette, verwendet
werden.
-
Die
fertigen P15panB- und P15panE-PCR-Fragmente
wurden dann durch DNA-Transformation unter Verwendung von Standardbedingungen
zusammen in den panB- und panE-Promotor-deletierten Stamm PA6 (ilvC
leuC ΔpanBp::cat ΔpanEE::erm), selektiert auf Pantothenatprototrophie
(Pan±), auf Minimalmedium-Agarplatten
transformiert. Die gewonnen Pan+-Kolonien
waren ebenso Cms- und Erythromyzin-sensitiv
(Ems), was die Insertion der Promotorkassetten
bestätigte. Eine einzelne Pan+-Cms-Ems-Kolonie, enthaltend
sowohl ein panBCD-Operon als auch ein panE-Gen, exprimiert aus dem
P15-Promotor, wurde isoliert und PA32 genannt. Die
Gegenwart des P15-Promotors upstream des
panB-Gens wurde durch diagnostische PCR unter Verwendung von P15seq-
und P4panB-Primern (Tabellen 1 und 2) erneut unter Anwendung von
Standardreaktionsbedingungen bestätigt. Eine identische
Kontrolle wurde an dem panE-Gen unter Verwendung von P15seq- und P4panB-Primern
durchgeführt (Tabellen 3 und 4). Die anschließende
Sequenzierung des P15-Promotors vor panE
deckte jedoch eine teilweise Deletion des P15-Promotors
auf.
-
Zum
Austausch des teilweise deletierten P15panE-Gens
mit der richtigen Konstruktion wurde die ΔpanEp::erm-Mutation
durch DNA-Transformation unter Verwendung chromosomaler DNA aus
PA5 (ΔpanEp::erm ilvC leuC) und
Selektieren auf Erythromyzinresistenz erneut in PA32 eingeführt.
Dies führte zu dem Stamm PA41 (P15panBCD
ApanEp::erm ilvC leuC). Die P15panE-DNA-Fragmente,
erzeugt durch LFH-PCR wie oben beschrieben, wurden dann in PA41,
selektiert auf Pan+-Prototrophen, transformiert.
Dies führte zu dem Stamm PA43 (ilvC leuC P15panBCD
P15panE). Dieser auxotrophe Ilv–Leu–-Stamm wurde dann unter Verwendung
eines PBS1-Phagenlysats, hergestellt auf Wildtyp-B. subtilis 1A747,
unter Verwendung von Standardprozeduren in Ilv+Leu+-Prototrophie transduziert. Dies führte
zu dem Stamm PA49 (P15panBCD P15panE).
-
BEISPIEL 3
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion des Stammes PA112, ein Derivat
von PA49, das eine Deletion von panC enthält.
-
Long-Flanking-Homology-Polymerasekettenreaktion
(LFH-PCR) wurde zur Erzeugung einer Deletionsmutation in der kodierenden
Region despanC-offenen Leserasters des panBCD-Operons verwendet,
worin eine 487 bp lange Nukleotidregion von panC durch die Chloramphenicol-(cat-)-Resistenzkassette
aus Staphylococcus aureus (GenBank M58515) ersetzt wurde. Hierfür
wurden zunächst zwei PCR-Fragment-„arme” erzeugt:
0,2 μl einer 100-μM-Lösung der Primer
P1panC und P2panC-cat oder der Primer P3panC und P4panC-cat (Tabelle
5) wurden zu 0,1 μg 1A747 chromosomaler DNA in einem Reaktionsvolumen
von 50 μl, enthaltend 1 μl 40 mM dNTPs, 5 μl
10X-Puffer und 0,75 μl PCR-Enzym (Taq und Tgo), zugegeben,
wie vom Hersteller (Expand High fidelity PCR System-Roche Applied
Science) beschrieben. Die PCR-Reaktion wurde über 30 Zyklen
unter Anwendung einer Annealingtemperatur von 55,7°C und
einer Elongationszeit von 45 Sekunden durchgeführt. Die
resultierenden Fragmente, F1 bzw. F2 genannt, wurden gereinigt und
als Primer in einer zweiten PCR-Runde verwendet. Die F1- und F2-Fragmente
wurden 50fach verdünnt, und 1 μl von jedem wurde
zu 0,1 μg des linearisierten Plasmids pPA4 (enthaltend
die cat-Kassette) in einem Reaktionsvolumen von 50 μl zugegeben.
In den ersten 10 Zyklen wurden eine Annealingtemperatur von 63°C
und eine Elongationszeit von 3 Minuten verwendet. In den nächsten
20 Zyklen wurde die Elongationszeit um 20 Sekunden nach jedem Zyklus
ausgedehnt. Die resultierenden Produkte wurden dann in einer dritten
PCR-Runde als eine Matrize verwendet. Die PCR-Produkte wurden 50fach
verdünnt, und 1 μl wurde mit 0,2 μl einer
100-μM-Lösung der Primer P1panC und P4panC in
einem Reaktionsvolumen von 50 μl, enthaltend dNTPs, Puffer
und Enzym, wie oben beschrieben, vereinigt. Die PCR-Reaktionsparameter
waren mit denen identisch, die in der zweiten PCR-Runde verwendet
wurden. Die fertigen PCR-Fragmente wurden als nächstes
in den Pantothenat-überexprimierenden Stamm PA49, selektiert
auf Chloramphenicolresistenz auf TBAB-Medium (Cm
r),
transformiert. Eine einzelne Cm
r Kolonie,
deletiert für panC, wurde isoliert und PA112 (P
wtpanBΔC::catD) genannt. Die Gegenwart
der cat-Kassette wurde durch diagnostische PCR unter Verwendung
von P1panC und P4panC erneut unter Verwendung von Standardreaktionsbedingungen
bestätigt. Phenotypisch gesehen, konnte PA112 auf Minimalmedium
(MM), angereichert mit entweder 1 mM Pantoat oder 1 mM Pantoat plus
1 mM β-Alanin, nicht wachsen, wuchs aber normal auf MM
mit 1 mM Pantothenat. In Schüttelkolbenkulturen wuchs PA112
schlecht mit entweder 1 μM oder 10 μM Pantothenat,
aber normal, wenn die Pantothenat-Ergänzung auf 100 μM
oder 1 mM erhöht wurde. Tabelle
5. Primer, die zur Erzeugung einer ΔpanC::cat-Deletionsmutation
verwendet werden
- Unterstrichene Sequenzen waren homolog
mit derpanC-Region
-
BEISPIEL 4
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion des Stammes PA121, ein Derivat
von PA49, das eine Deletion von panCD enthält.
-
Long-Flanking-Homology-Polymerasekettenreaktion
(LFH-PCR) wurde zur Erzeugung einer Deletionsmutation, umfassend
die kodierenden Regionen der panC- und panD-offenen Leseraster des
panBCD-Operons, verwendet, worin eine 874 bp lange Nukleotidregion
von panC und panD durch die Chloramphenicol-(cat-)-Resistenzkassette
aus Staphylococcus aureus (GenBank M58515) ersetzt wurde. Hierfür
wurden zunächst zwei PCR-Fragment-„arme” erzeugt:
0,2 μl einer 100-μM-Lösung der Primer
P1panC und P2panC-cat oder der Primer P3panD-cat und P4panD (Tabelle
6) wurden zu 0,1 μg 1A747 chromosomaler DNA in einem Reaktionsvolumen
von 50 μl, enthaltend 1 μl 40 mM dNTPs, 5 μl
10X-Puffer und 0,75 μl PCR-Enzym (Taq und Tgo), zugegeben,
wie vom Hersteller (Expand High fidelity PCR System-Roche Applied
Science) beschrieben. Die PCR-Reaktion wurde über 30 Zyklen
unter Anwendung einer Annealingtemperatur von 55,7°C und
einer Elongationszeit von 45 Sekunden durchgeführt. Die
resultierenden Fragmente, F1' bzw. F2' genannt, wurden gereinigt
und als Primer in einer zweiten PCR-Runde verwendet. Die F1'- und
F2'-Fragmente wurden 50fach verdünnt, und 1 μl
von jedem wurde zu 0,1 μg des linearisierten Plasmids pPA4
(enthaltend die cat-Kassette) in einem Reaktionsvolumen von 50 μl
zugegeben. In den ersten 10 Zyklen wurden eine Annealingtemperatur
von 63°C und eine Elongationszeit von 5 Minuten verwendet.
In den nächsten 20 Zyklen wurde die Elongationszeit um
20 Sekunden nach jedem Zyklus ausgedehnt. Die resultierenden Produkte
wurden dann in einer dritten PCR-Runde als eine Matrize verwendet.
Die PCR-Produkte wurden 50fach verdünnt, und 1 μl
wurde mit 0,2 μl einer 100-μM-Lösung
der Primer P1panC und P4panD in einem Reaktionsvolumen von 50 μl,
enthaltend dNTPs, Puffer und Enzym, wie oben beschrieben, vereinigt.
Die PCR-Reaktionsparameter waren mit denen identisch, die in der
zweiten PCR-Runde verwendet wurden. Die fertigen PCR-Fragmente wurden
als nächstes in den Pantothenat-überexprimierenden
Stamm PA49, selektiert auf Chloramphenicolresistenz auf TBAB-Medium
(Cm
r), transformiert. Eine einzelne Cm
r-Kolonie, deletiert für panCD,
wurde isoliert und PA121 (P
wtpanBΔCD::cat)
genannt. Die Gegenart der cat-Kassette wurde durch diagnostische
PCR unter Verwendung von P1panC und P4panD erneut unter Verwendung
von Standardreaktionsbedingungen bestätigt. Wie Stamm PA112
konnte PA121 phenotypisch gesehen auf Minimalmedium (MM), angereichert
mit entweder 1 mM Pantoat oder 1 mM Pantoat plus 1 mM β-Alanin,
nicht wachsen, wuchs aber normal auf MM mit 1 mM Pantothenat. In
Schüttelkolbenkulturen wuchs PA121 schlecht mit entweder
1 μM oder 10 μM Pantothenat, aber normal, wenn
die Pantothenat-Ergänzung auf 100 μM oder 1 mM
erhöht wurde. Tabelle
6. Primer, die zur Erzeugung einer ΔpanCD::cat-Deletionsmutation
verwendet werden
- Unterstrichene Sequenzen waren homolog
mit der panCD-Region
-
BEISPIEL 5
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion des Pantothenat-überproduzierenden
Stammes PA73.
-
LFH-PCR
wurde zur Erzeugung von DNA-Fragmenten, enthaltend einen P26-Promotor
upstream von ilvD, verwendet. Zunächst wurden zwei PCR-Fragment-„arme” unter
Verwen dung der Primer P1/ilvD/for und P2/ilvD/f/26 für
den F1-Arm und der Primer P3/ilvD/r/26 und P4/ilvD/rev (F2-Arm)
(Tabelle 7) amplifiziert. Die Matrize war chromosomale DNA von 1A747.
Die resultierenden F1- und F2-Arme wurden als Primer in einer zweiten
PCR-Runde mit dem linearisierten Plasmid pUC18SP01-26 (enthaltend
den P
26-Promotor) verwendet. Das resultierende
F1-P
26-F2-LFH-PCR-Produkt wurde mit den
Primern P1/ilvD/for und P4/ilvD/rev (Tabelle 7) in einer dritten
PCR-Runde amplifiziert. Das F1-P
26-F2-LFH-PCR-Fragment,
enthaltend P
26ilvD, wurde in den ilvD-Promotor-deletierten
Stamm PA24 (ΔilvD::spec) transformiert, was zu PA27 (P
26ilvD) führte. P
26ilvD
wurde durch Transduktion mit PBS1-Lysat aus PA27 in den ilvD-Promotor-deletierten
Stamm PA60 (P
15panBCD P
15panE ΔilvD::spec)
eingeführt. Die prototrophen und Spectinomyzin-sensitiven
(Specs) ilvD-Kolonien wurden auf Minimal-Agarplatten selektiert.
Der resultierende Stamm PA62 (P
15panBCD
P
15panE P
26ilvDG
320D) trug eine einzelne Punktmutation in
der ilvD-kodierenden Region, die eine Gly-zu-Asp-Aminosäureänderung
in Rest 320 verursachte. Die ilvD-Kodierungssequenz wurde dann zum
Wildtyp rekonstruiert, indem zunächst ein internes Segment
des ilvD-Gens, das diese Mutation umfaßt, unter Verwendung
von LFH-PCR entfernt wurde. Zwei PCR-Fragment-„arme” wurden
mit den Primern P1c/ilvD/for und P2c/ilvD/cat für den F1-Arm
und den Primern P3c/ilvD/cat und P4c/ilvD/rev für den F2-Arm
amplifiziert (Tabelle 7). Die Matrix-DNA war chromosomale DNA von
1 A747. Die resultierenden F1- und F2-Arme wurden als Primer in
einer zweiten PCR-Runde mit dem linearisierten Plasmid pTH5 (enthaltend
die cat-Kassette; GenBank M58515) verwendet. Das F1-cat-F2-LFH-PCR-Fragment
wurde in PA26 transformiert und der Cm
r-
und ilvD
–-Auxotrophenstamm PA64 (P
15panBCD P
15panE
P
26ΔilvD::cat) wurde selektiert.
Diagnostische PCR wurde zur Bestätigung der Struktur der
Deletion verwendet. Der Stamm PA64 wurde dann unter Verwendung chromosomaler
DNA des Wildtypstammes 1A747 prototroph gemacht. In dem resultierenden
Stamm PA73 (P
15panBCD P
15panE
P
26ilvD) wurde die Gegenwart des P
26-Promotors upstream von ilvD und die Abwesenheit
des cat-Gens durch diagnostische PCR unter Verwendung der P26seq-
und P4/ilvD/rev-Primer bestätigt (Tabelle 7). Tabelle
7. Primer, die zur Erzeugung einer ΔilvD::spec-Deletionsmutation
und P26-getriebenen Überexpression von ilvD verwendet werden
- unterstrichene Sequenzen waren homolog
mit der ilvD-Region
-
BEISPIEL 6
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion von PA207, ein Derivat von
PA12, das eine Deletion des panD-Gens enthält.
-
Ein
Stamm mit einem P15panBCΔpanD::spec-Operon
wurde in zwei Schritten konstruiert.
-
Zunächst
wurde die panD-Deletionskassette in den Stamm PA1, der eine Deletion
der panB-Leaderregion enthielt, transformiert. Long-Flanking-Homology-Polymerasekettenreaktion
(LFH-PCR) wurde zur Erzeugung einer Deletionsmutation in der kodierenden
Region des panD-offenen Leserasters des panBCD-Operons verwendet,
worin die Nukleotidregion von panD durch die Adenyltransferasekassette
aus Staphylococcus aureus (Zugriffszahl Xo3216), die Resistenz gegen
Spectinomycin verleiht, ersetzt wurde. Hierfür wurden zunächst
zwei PCR-Fragment-„arme” erzeugt: 0,2 μl
einer 100-μM-Lösung der Primer P1panD und P2panD-spec oder
der Primer P3panD-spec und P4panDb (Tabelle 8) wurden zu 0,1 μg
1A747 chromosomaler DNA in einem Reaktionsvolumen von 50 μl,
enthaltend 1 μl 40 mM dNTPs, 5 μl 10X-Puffer und
0,75 μl PCR-Enzym (Taq und Tgo), zugegeben, wie vom Hersteller
(Expand High fidelity PCR System-Roche Applied Science) beschrieben.
Die PCR-Reaktion wurde über 30 Zyklen unter Verwendung
einer Annealingtemperatur von 55,7°C und einer Elongationszeit
von 45 Sekunden durchgeführt. Die resultierenden Fragmente,
F1 bzw. F2 genannt, wurden gereinigt und als Primer in einer zweiten
PCR-Runde verwendet. Die F1- und F2-Fragmente wurden 50fach verdünnt,
und 1 μl von jedem wurden zu 0,1 μg des linearisierten
Plasmids pDG1726 (enthaltend die spec-Kassette) in einem Reaktionsvolumen
von 50 μl zugegeben. In den ersten 10 Zyklen wurden eine
Annealingtemperatur von 63°C und eine Elongationszeit von
3 Minuten verwendet. In den nächsten 20 Zyklen wurde die
Elongationszeit um 20 Sekunden nach jedem Zyklus ausgedehnt. Die
resultierenden Produkte wurden dann in einer dritten PCR-Runde als
eine Matrize verwendet. Die PCR-Produkte wurden 50fach verdünnt,
und 1 μl wurde mit 0,2 μl einer 100-μM-Lösung
der Primer P1panD und P4panD in einem Reaktionsvolumen von 50 μ1,
enthaltend dNTPs, Puffer und Enzym, wie oben beschrieben, vereinigt.
Die PCR-Reaktionsparameter waren mit denen identisch, die in der
zweiten PCR-Runde verwendet wurden. Die fertigen PCR-Fragmente wurden
dann in den Stamm PA1, selektiert auf Spectinomycinresistenz auf
TBAB-Medium (Spr), transformiert. Eine einzelne Spr-Kolonie, deletiert
für panD, wurde isoliert und PA203 genannt. Ein DNA-Fragment,
enthaltend den P15-Promotor (siehe Konstruktion
von PA12) wurde dann in den Stamm PA203 transformiert, um so das
genetisch hergestellte P15panBCΔD-Operon
zu rekonstruieren. Zellen, die dieses Operon enthalten, wurden durch
Aufarbeitung für Pan+-Prototrophie
und Verlust an Chloramphenicolresistenz selektiert. Dies führte zu
dem Stamm PA207. Die phenotypische Analyse zeigte, daß PA207
ein β-Alanin-Bradyotroph war. Die Gegenwart der spec-Kassette
wurde durch diagnostische PCR unter Verwendung von P1panD und P4panDb
erneut unter Verwendung von Standardreaktionsbedingungen bestätigt.
-
Tabelle
8. Primer, die zur Erzeugung einer dpanD::spec-Deletionsmutation
verwendet wurden
-
BEISPIEL 7
-
Dieses
Beispiel demonstriert die Herstellung von Panthenol durch Einspeisung
von 3-Aminopropanol in die Stämme PA49, PA73, PA112, PA121
und PA207.
-
Über-Nacht-Kulturen
von PA112, PA121 und PA207 wurden bei 37°C gezüchtet
und 1:100 in 200 ml frisch hergestelltem SMG-Medium verdünnt.
Drei 40-ml-Aliquote jeder Kultur wurden dann in 250-ml-Kolben, enthaltend
Styroformstopper, überführt. Eine HCl-neutralisierte
Lösung von 3-Aminopropanol (pH 7,2) wurde auf eine Endkonzentration
von 40 g/l in jeden Kolben gegeben. Es wurde bei 37°C für
72 Stunden weiter gezüchtet, wobei zu diesem Zeitpunkt
die Zellen durch Zentrifugation entfernt und Überstände
steril filtriert wurden. Als Kontrollen wurden Pantoat und 3-Aminopropanol
in das Kulturmedium ohne Zellen gegeben und 72 Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Panthenol-, Pantoat- und Pantothenat-Gehalte wurden
durch NMR gemessen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefaßt.
Die Herstellung von Panthenol wurde eindeutig in den Stämmen
PA49, PA73 und PA207 detektiert. Die Stämme PA112 und PA121,
die eine Deletion von panC enthielten, produzierten kein Panthenol.
Es wurde keine spontane Bildung von Panthenol detektiert, wenn Pantoat und
3-Aminopropanol 72 Stunden in Kulturmedium (keine Zellen) inkubiert
wurden. Diese Ergebnisse zeigen, daß das PanC-Enzym, das
normalerweise unter Bildung von Pantothenat Pantoat und β-Alanin
koppelt, unter Bildung von Panthenol auch Pantoat und 3-Aminopropanol
koppeln kann. Offensichtlich können die enzymatischen Eigenschaften
von PanC zur Katalyse der Umwandlung von Pantoat und 3-Aminopropanol
zu Panthenol unter Verwendung von Verfahren (z. B. PCR-Mutagenese,
Proteinentwicklung), die einem Fachmann allgemein bekannt sind,
enorm verbessert werden. Tabelle
9. Herstellung von Panthenol in verschiedenen Pantothenat-Herstellungsstämmen,
die in Gegenwart von 40 g/Liter Aminopropanol heranwuchsen.
- a Durchschnitt
von drei Proben
- b 1 mM Pantothenat, zugegeben zu den
Kulturen, da PA112 und PA121 Pantothenatauxotrophen sind.
-
BEISPIEL 8
-
Dieses
Beispiel demonstriert die Herstellung von Panthenol durch Einspeisung
von 3-Aminopropanol und Pantoat in den Stamm PA207 in einem Rührkesselreaktor
unter Verwendung des Fed-Batch-Verfahrensmodus.
-
Stamm
PA207 wurde in Standard-Glucose-beschränkter Fed-Batch-Fermentation
71 Stunden gezüchtet. Nach anfänglich ~6 h der
Batch-Phase wurde die Fed-Batch-Phase unter Verwendung einer 80%igen Glucosespeisung
im Bereich von 84 bis 95 g/h gestartet. Nach 25 h Fermentationszeit
wurde eine 98%ige Lösung von 3-Aminopropanol mit einer
Durchschnittsge schwindigkeit von 14 g/h über 22 h zugeführt.
Zehn Stunden nach Beginn der 3-Aminopropanoleinspeisung wurde eine
41,5%ige Pantoatlösung mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit
von 26 g/h für ungefähr 16 h zugegeben.
-
Wie
in Tabelle 10 gezeigt, wurde Panthenol durch NMR eindeutig detektiert,
wenn sowohl Pantoat als auch 3-Aminopropanol in die Fermentation
co-eingespeist wurden. Tabelle
10. Herstellung von Panthenol in Pantoat- und 3-Aminopropanol-Co-Einspeisungs-Fermentation
von Stamm PA207 (PA49 ΔpanD::spec)
- a Durchschnitt
von drei Proben.
Sequenzprotokoll
-
Zusammenfassung
-
Verfahren
zur Herstellung von Panthenol durch das Kultivieren eines Mikroorganismus,
der mindestens ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus den Enzymen in der Pantoatbiosynthese und PanC, überexprimieren
kann, unter geeigneten Kultivierungsbedingungen unter gleichzeitiger
Einspeisung von 3-Aminopropanol oder einem geeigneten Derivat davon
und gegebenenfalls Gewinnen des Panthenols aus dem Zellkultivierungsmedium.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - CN 1367253 [0005]
- - EP 859848 B1 [0008]
- - WO 01/21772 [0008, 0015]
- - WO 97/10340 [0015]
- - EP 1001027 [0015]
- - EP 1006189 [0015]
- - WO 01/92556 [0015]
- - EP 1167520 [0015]
- - WO 02/24936 [0015]
- - WO 02/29020 [0015]
- - WO 02/055711 [0015]
- - WO 02/057474 [0015]
- - WO 02/057476 [0015]
- - WO 02/061108 [0015]
- - WO 02/064806 [0015]
- - WO 02/072838 [0015]
- - WO 02/072840 [0015]
- - WO 02/072854 [0015]
- - WO 02/072855 [0015]
- - EP 1247868 [0015]
- - WO 03/004672 [0015]
- - WO 03/006664 [0015]
- - DE 10201540 A1 [0015]
- - WO 03/029476 [0015]
- - WO 2004/005525 [0015]
- - WO 2004/005527 [0015]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Schnider,
O.: Synthesis of Panthenol and its transformation into pantothenic
acid. Jubiläumsband Emil Barell 1946, 85–91 [0003]
- - Lee et. al., 1980, Mol. Gen. Genet. 180: 57–65 und
Moran et. al., 1982, Mol. Gen. Genet. 186: 339–46 [0018]
- - Guerout-Fleury et. al., 1995 [0030]
- - Guerout-Fleury et. al., 1995 [0030]
- - Lee et. al., 1980, Mol. Gen. Genet. 180: 57–65 [0030]
- - Hümbelin et. al., 1999, J. Ind. Microbiol. Biotech.
22: 1–7 [0030]
- - Perkins et. al., 1999, J. Ind. Microbiol. Biotech. 22: 8–18 [0030]
- - Lee et. al., 1980 [0040]
- - Wach, 1996 [0040]
- - Guerout-Fleury et. al., 1995 [0042]