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Die Erfindung betrifft ein neues
Herstellungsverfahren und ein Reinigungsverfahren für D-Pantoinsäure und/oder
D-Pantothensäure
(oder eines Salzes davon), eine Mikrobe, die in der Lage ist, sie
herzustellen, und eine plasmide DNA mit dem Bereich oder einem Teil
des Bereiches eines an der Biosynthese von Pantothensäure oder
eines Salzes davon beteiligten Gens. Pantothensäure ist eine nützliche
Vitaminsubstanz. D-Pantoinsäure
ist eine Substanz, die als ein wichtiges Zwischenprodukt für die Synthese
von Pantothensäure und
CoA verwendbar ist.
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Herkömmliche Herstellungsverfahren
für D-Pantothensäure (oder
eines Salzes davon), einer wichtigen Vitaminsubstanz, beinhalten
(1) ein Verfahren, wobei D-Pantolacton, erhalten durch Antipodentrennung von
DL-Pantolacton, und β-Alanin (oder ein
Salz davon) in Methanol chemisch kondensiert werden, (2) ein Verfahren,
wobei D-Pantothensäureester
zu D-Pantothensäure
hydrolysiert wird, oder ein Verfahren, wobei die D-Konfiguration
von DL-Pantothensäureester
selektiv zu D-Pantothensäure
hydrolysiert wird, wobei beide Verfahren eine Mikrobe oder ein Enzym
verwenden (ungeprüfte
japanische Patentpublikationen Nr. 228487/1989 und 228488/1989),
(3) ein Verfahren, wobei Kalium-Pantothenat, β-Alanin und ATP in Tris-Puffer
in Kontakt mit ruhenden Zellen oder einem mikrobiellen Enzym gebracht
werden, um Pantothensäure
zu ergeben ([beschrieben in dem Journal of Biological Chemistry,
Vol. 198, Seite 23 (1952), den Zusammenfassungen von Beiträgen, die
bei dem 176. American Chemical Society National Meeting, Division
of Microbial and Biochemical Technology, Nr. 48 (1978) vorgetragen
wurden, und anderen Veröffentlichungen].
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Außerdem beschreibt EP-A-0493060
ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure, welches umfasst, DL-Pantoinsäure, DL-Pantolacton
oder eine Mischung davon und β-Alanin
mit einem Mikroorganismus in Berührung
zu bringen, der aus DL-Pantoinsäure
und β-Alanin
D-Pantothensäure
herstellen kann, der aber keine L-Pantothensäure herstellt. Gemäß EP-A-0493060
kann jeder Mikroorganismus verwendet werden, der aus DL-Pantoinsäure und β-Alanin D-Pantothensäure herstellen
kann, im Wesentlichen aber keine L-Pantothensäure herstellt.
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Herkömmliche Herstellungsverfahren
für D-Pantoinsäure und/oder
D-Pantolacton beinhalten (4) ein Verfahren, wobei ein Aufspaltungsmittel
wie Chinin oder Brucin zur Antipodentrennung verwendet wird, (5)
ein Verfahren, bei dem das L-Pantolacton in DL-Pantolacton unter
Verwendung einer speziellen Mikrobe zersetzt wird, um D-Pantolacton
allein zu erhalten (geprüfte
japanische Patentpublikation Nr. 19745/1972), (6) ein Verfahren,
bei dem lediglich das L-Pantolacton in DL-Pantolacton unter Verwendung
einer speziellen Mikrobe zu Ketopantolacton oxidiert wird, das dann
asymmetrisch zu D-Pantolacton reduziert wird (geprüfte japanische Patentpublikation
Nr. 293386/1986), (7) ein Verfahren, wobei chemisch synthetisiertes
Ketopantolacton unter Verwendung einer speziellen Mikrobe asymmetrisch
zu D-Pantolacton reduziert wird (geprüfte japanische Patentpublikation
Nr. 14797/1986), (8) ein Verfahren, wobei die L-Konfiguration in
DL-Pantolacton selektiv unter Verwendung einer speziellen Mikrobe
asymmetrisch zu L-Pantoinsäure
hydrolysiert wird (ungeprüfte
japanische Patentpublikationen Nr. 152895/1982 und 294092/1987)
und (9) ein Verfahren, wobei die D-Konfiguration in DL-Pantolacton
selektiv unter Verwendung einer speziellen Mikrobe asymmetrisch
zu D-Pantoinsäure
hydrolysiert wird (geprüfte
japanische Patentpublikation Nr. 65198/1991).
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Bezüglich der Art, wie ein Salz
von Pantothensäure
einzusammeln ist, gibt es ein bekanntes Verfahren, wobei Calciumchlorid
vor der Kristallisation zugesetzt wird, um ein Komplexsalz aus Calcium-Pantothenat und
Calciumchlorid mit hoher Ausbeute und hoher Reinheit auszukristallisieren
(US-Patent Nr. 2 957 025, eingereicht von Jonathan O. Brooks am
18. Oktober 1960, geprüfte
japanische Patentpublikation Nr. 49571/1972 usw.). Jedoch gibt es
kein Verfahren, das Calciumchlorid aus dem so erhaltenen Komplexsalz
zu entfernen, um Calcium-Pantothenat mit hoher Ausbeute zu erhalten,
weshalb das Komplexsalz derzeit als das Endprodukt behandelt wird.
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Bei der industriellen Herstellung
von D-Pantothensäure
(einschließlich
Salzen davon; dies gilt auch für das
Nachstehende) benötigt
das Verfahren (1) nicht nur ein kompliziertes Verfahren zum Synthetisieren
des Ausgangsmaterials DL-Pantolacton, sondern auch ein mühseliges
und schwieriges Verfahren zu dessen Antipodentrennung. Das Verfahren
(2) hat den Nachteil, dass ein Verfahren zum Herstellen von D-Pantothensäureester
oder DL-Pantothensäureester
aus DL-Pantolacton benötigt
wird. Das Verfahren (3) ist dadurch nachteilig, dass teures ATP
und Tris-Puffer verwendet werden sollen; es liefert nur eine Spurenmenge
von Pantothensäure
und ist unpraktisch, wenn teure D-Pantoinsäure (oder ein Salz davon) als
ein Ausgangsmaterial verwendet werden.
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Die meisten Herstellungsverfahren
für D-Pantoinsäure und/oder
D-Pantolacton sind auch darin mangelhaft, dass sie DL-Pantolacton
als Ausgangsmaterial verwenden, das einen mühseligen Syntheseablauf erfordert.
Darüber
hinaus hat das Verfahren (4) Nachteile wie die Verwendung eines
teuren Aufspaltungsmittels zur Antipodentrennung und die schwierige
Rückgewinnung
von D-Pantolacton, und das Verfahren (5) hat den Nachteil, dass
die Hälfte
des hergestellten DL-Pantolactons verloren geht. Bei den Verfahren
(6), (7), (8), und (9) ist es sehr schwierig, die D-Konfiguration
allein mit 100% optischer Reinheit in der Kulturlösung herzustellen,
wegen der Art der verwendeten Mikrobe oder der Art des Pantolactons
(oder der Pantoinsäure).
Die Verfahren (4), (8) und (9) bringen auch einen zusätzlichen
mühseligen
Verfahrensablauf mit sich, weil die restliche L-Konfiguration zurückgewonnen,
racemisiert und wiederverwendet wird.
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Durch intensive Forschungsarbeit über industriell
vorteilhafte und wirkungsvollere Herstellungsverfahren für D-Pantothensäure haben
die Erfinder gefunden, dass Kultivieren einer Mikrobe in einem durch β-Alanin ergänzten Medium
die Bildung von D-Pantothensäure
zur Folge hat. Die Erfinder haben auch gefunden, dass D-Pantoinsäure akkumuliert
werden kann, indem ein gegen Salicylsäure resistenter Stamm kultiviert
wird, dass D-Pantothensäure
mit höheren
Konzentrationen hergestellt werden kann, indem der gegen Salicylsäure resistente
Stamm in einem durch β-Alanin
ergänzten
Medium kultiviert wird, und dass Verwendung des Stammes, dem Resistenz
gegen α-Ketoisovaleriansäure, α-Ketobuttersäure, α-Aminobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure und/oder
O-Methylthreonin verliehen wurde, eine erhöhte Menge an hergestellter
D-Pantoinsäure und/oder
D-Pantothensäure
zur Folge hat. Gleichzeitig untersuchten die Erfinder die Anwendung
der Gen-Rekombinationstechnik bei der Aufzucht von Stämmen, wobei
sie fanden, dass ein Stamm, der mit einem Plasmid, das an der Biosynthese
von Pantothensäure
oder eines Salzes davon beteiligte Gene trägt, transformiert ist, D-Pantothensäure oder
D-Pantoinsäure
(und/oder D-Pantolacton) mit noch höheren Konzentrationen im Medium
akkumuliert. Die Erfinder führten
weitere auf diesen Ergebnissen beruhende Untersuchungen durch und
entwickelten die vorliegende Erfindung.
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Demgemäß betrifft die vorliegende
Erfindung
- [I] ein Verfahren zur Herstellung
von D-Pantoinsäure
oder eines Salzes davon, welches das Kultivieren einer zu der Familie
Enterobacteriaceae gehörenden
Mikrobe, die Resistenz gegen Salicylsäure aufweist und in der Lage
ist, D-Pantoinsäure
zu produzieren, das Akkumulieren der D-Pantoinsäure oder eines Salzes davon
und dessen Gewinnen umfasst;
- [II] das Verfahren zur Herstellung nach [I] unter Verwendung
einer Mikrobe, die mindestens eine Resistenz-Art aufweist, ausgewählt aus
der Resistenz gegen α-Ketoisovaleriansäure, der
Resistenz gegen α-Ketobuttersäure, der
Resistenz gegen α-Aminobuttersäure, der
Resistenz gegen β-Hydroxyasparaginsäure und
der Resistenz gegen O-Methylthreonin.
- [III] ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure oder
eines Salzes davon, dadurch gekennzeichnet, dass eine zu der Familie
Enterobacteriaceae gehörende
Mikrobe, die Resistenz gegen Salicylsäure aufweist und die D-Pantothensäure erzeugen
kann, in Berührung
mit β-Alanin
gebracht wird.
- [IV] das Verfahren zur Herstellung nach [III], wobei eine Mikrobe
verwendet wird, die mindestens eine Resistenz-Art aufweist, ausgewählt aus
der Resistenz gegen α-Ketoisovaleriansäure, der
Resistenz gegen α-Ketobuttersäure, der
Resistenz gegen α-Aminobuttersäure, der
Resistenz gegen β-Hydroxyasparaginsäure und
der Resistenz gegen O-Methylthreonin und
- [V] das Verfahren zur Herstellung nach [I]–[IV], wobei die Mikrobe eine
Mikrobe ist, die mit einer Plasmid-DNA transformiert ist, die das
Gebiet eines an der Biosynthese von Pantothensäure oder eines Salzes davon
beteiligten Gens oder eines Teils des Gebietes trägt.
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Die vorliegende Erfindung stellt
auch eine transformierte Mikrobe und ein Plasmid zum Erhalten einer solchen,
bei diesen Herstellungsverfahren verwendeten Mikrobe und ein Verfahren
zum Reinigen und Isolieren der gewünschten Verbindung bereit.
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Die vorliegende Erfindung hat die
vielen Vorteile, dass es nicht nötig
ist, DL-Pantoinsäure,
Pantolacton usw. als Ausgangsmaterialien zu verwenden, dass die
Verbindungen mit D-Konfiguration mit 100% optischer Reinheit erhalten
werden können
und dass das Verfahren zur Rückgewinnung
der Verbindungen mit L-Konfiguration und das zu ihrer Racemisierung,
um die erhaltene racemische Verbindung wieder zu verwenden, nicht notwendig
sind.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnung:
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1 zeigt
die Restriktionskarte des in Beispiel 3 erhaltenen Plasmides pFV31.
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In 1 steht
E für EcoRI;
EV steht für
EcoRV; P steht für
PvuII; B steht für
Bg1II.
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Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend
in Einzelheiten beschrieben.
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Die D-Pantoinsäure, D-Pantothensäure und
das β-Alanin
in der vorliegenden Erfindung können
Salze davon sein. Wenn D-Pantoinsäure, D-Pantothensäure und β-Alanin in
der vorliegenden Spezifikation erwähnt werden, sind nicht nur
die freien Formen, sondern auch Salze davon inbegriffen. Salze von
D-Pantoinsäure, D-Pantothensäure und β-Alanin schließen Salze
mit Alkalimetallen und Erdalkalimetallen ein. In jedem Fall sind
das Calciumsalz, das Natriumsalz und das Kaliumsalz bevorzugt.
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Das vorliegende Verfahren zur Synthese
von D-Pantothensäure
und D-Pantoinsäure
ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Mikrobe, die Pantothensäure und
D-Pantoinsäure
herstellen kann, kultiviert wird, um auf mikrobielle Weise aus verschiedenen
Kohlenstoffquellen wie Glucose D-Pantoinsäure herzustellen, welche D-Pantoinsäure in dem
Medium akkumuliert oder mit β-Alanin
kondensiert wird, indem die Mikrobe mit β-Alanin, beispielsweise durch
Zusatz von β-Alanin
zu dem Medium, in Berührung
gebracht wird, um D-Pantothensäure
herzustellen. Mikroben, die D-Pantothensäure oder D-Pantoinsäure in der
Gegenwart von β-Alanin
herstellen können,
können
für die
vorliegende Erfindung verwendet werden. Insbesondere sind Mikroben bevorzugt,
die zur Familie Enterobacteriaceae gehören, wie Mikroben die zu den
Gattungen Citrobacter, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Salmonella
und Escherichia gehören.
Noch stärker
bevorzugt werden für
die vorliegende Erfindung Mikroben der Gattung Escherichia gehören sowie
davon abgeleitete verwendet, einschließlich bekannter Stämme von
Escherichia coli, die in der Liste der Kulturen, B. Auflage, 1988,
veröffentlicht
von dem Institut für
Gärung,
Osaka, aufgelistet sind, wie Escherichia coli K-12 (IFO 3301) und
Escherichia coli IFO 3547.
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Bei einem Versuch, ein effizienteres,
wirtschaftlicheres Herstellungsverfahren für D-Pantoinsäure mittels
de-novo-Synthese aus Kohlenstoffquellen wie Zuckern unter Verwendung
von Mikroben der Gattung Escherichia coli und anderer Gattungen
zu entwickeln, haben die Erfinder Untersuchungen angestellt und Stämme gefunden,
die große
Mengen von D-Pantoinsäure
herstellen können,
wenn sie auf künstliche
Weise resistent gegen Salicylsäure
gemacht werden. Die Erfinder fanden auch, dass es möglich ist,
große
Mengen von D-Pantothensäure
zu akkumulieren, indem eine solche Mikrobe in einem Medium, das
Kohlenstoffquellen enthält,
mit β-Alanin
in Berührung
gehalten wird.
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Außerdem haben die Erfinder gefunden,
dass D-Pantothensäure
mit höheren
Konzentrationen hergestellt werden kann, indem diesen gegen Salicylsäure resistenten
Stämmen
Resistenz gegen α-Ketoisovaleriansäure, Resistenz
gegen α-Ketobuttersäure, Resistenz
gegen α-Aminobuttersäure, Resistenz
gegen β-Hydroxyasparaginsäure und/oder
Resistenz gegen O-Methylthreonin verliehen wird.
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Mutanten, die für das Verfahren der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, schließen zu der Familie Enterobacteriaceae
gehörende
Mikroben ein, unter anderen zu der Gattung Escherichia gehörende Mikroben,
die D-Pantoinsäure oder
D-Pantothensäure
herstellen können.
In spezifischer Weise sind Beispiele für solche Mutanten Escherichia
coli FV5714 (IFO 15368), die gegen Salicylsäure resistent ist, Escherichia
coli FV525 (IFO 15369), die sowohl gegen Salicylsäure wie
auch gegen α-Ketoisovaleriansäure resistent
ist, Escherichia coli FV814 (IFO 15370), die gegen Salicylsäure, α-Ketoisovaleriansäure und α-Ketobuttersäure resistent
ist, Escherichia coli FV521, die gegen Salicylsäure, α-Ketovisoleriansäure, α-Ketobuttersäure und α-Aminobuttersäure resistent
ist, Escherichia coli FV221, die gegen Salicylsäure, α-Ketoisovaleriansäure, α-Ketobuttersäure und β-Hydroxyasparaginsäure resistent
ist, Escherichia coli FV6051 und Escherichia coli FV5069, die gegen
Salicylsäure, α-Ketoisovaleriansäure, α-Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure und O-Methylthreonin
resistent sind.
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Die Mutante FV5714 für die vorliegende
Erfindung wird erhalten, indem Escherichia coli IFO 3547 als Elternstamm
einer gewöhnlichen
mutagenen Behandlung unterworfen wird, wie Ultraviolett-Bestrahlung
oder Behandlung mit einem chemischen Mittel wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin,
und dann auf einer Agarplatte als Medium kultiviert wird, die Salicylsäure in einer
Konzentration enthält,
die so ist, dass der Elternstamm nicht wachsen kann, und dann die
auf dem Plattenmedium wachsende Kolonie abgetrennt wird. In gleicher
Weise wird FV525 erhalten, indem FV5714 als Elternstamm auf einer
Agarplatte als Medium kultiviert wird, die α-Ketoisovaleriansäure in einer
Konzentration enthält,
die so ist, dass der Elternstamm nicht wachsen kann, und dann die
auf dem Plattenmedium wachsende Kolonie abgetrennt wird. FV814 wird
erhalten, indem FV525 als Elternstamm auf einer Agarplatte als Medium
kultiviert wird, die α-Ketobuttersäure in einer
Konzentration enthält,
die so ist, dass der Elternstamm nicht wachsen kann, und dann die
auf dem Plattenmedium wachsende Kolonie abgetrennt wird. FV521 wird
erhalten, indem FV814 als Elternstamm auf einer Agarplatte als Medium
kultiviert wird, die α-Aminobuttersäure in einer
Konzentration enthält,
die so ist, dass der Elternstamm nicht wachsen kann, und dann die
auf dem Plattenmedium wachsende Kolonie abgetrennt wird. FV221 wird
erhalten, indem FV814 als Elternstamm auf einer Agarplatte als Medium
kultiviert wird, die β-Hydroxyasparaginsäure in einer
Konzentration enthält,
die so ist, dass der Elternstamm nicht wachsen kann, und dann die
auf dem Plattenmedium wachsende Kolonie abgetrennt wird. FV6051
wird erhalten, indem FV221 als Elternstamm auf einer Agarplatte
als Medium kultiviert wird, die O-Methylthreonin in einer Konzentration
enthält, die
so ist, dass der Elternstamm nicht wachsen kann, und dann die auf
dem Plattenmedium wachsende Kolonie abgetrennt wird. FV5069 wird
erhalten, indem FV6051 als Elternstamm auf einer Agarplatte als
Medium kultiviert wird, die α-Ketobuttersäure in einer
Konzentration enthält,
die so ist dass der Elternstamm nicht wachsen kann, und dann die
auf dem Plattenmedium wachsende Kolonie abgetrennt wird.
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Zum letztendlichen Erhalten eines
Stammes, der dem Ziel der vorliegenden Erfindung dient, können Resistenzen
gegen Medikamente wie Salicylsäure, α-Ketoisovaleriansäure, α-Ketobuttersäure, α-Aminobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure und
O-Methylthreonin in jeder Reihenfolge Stämmen verliehen werden. Auch
kann α-Ketoisovaleriansäure, α-Aminobuttersäure und
O-Methylthreonin durch bekannte verzweigte Aminosäureanaloga
wie 4-Azaleucin, 4-Thiaisoleucin und Norvalin ersetzt werden.
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Das Ausmaß an Resistenz der vorstehend
erwähnten
Stämme
gegen Salicylsäure, α-Ketoisovaleriansäure, α-Ketobuttersäure, α-Aminobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure oder
O-Methylthreonin wird in den nachstehenden experimentellen Beispielen
gezeigt.
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Experimentalbeispiele
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Nachdem ein Medium der in Tabelle
1 gezeigten Zusammensetzung (nachfolgend bedeutet „%", wenn nicht andennreitig
vermerkt, Gewicht/Volumen in %) bei 121°C 10 Minuten lang wärmesterilisiert
worden war, wurden vorher zur Sterilisierung filtrierte Salicylsäure oder α-Ketoisovaleriansäure, α-Ketobuttersäure, α-Aminobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure oder
O-Methylthreonin zugesetzt, so dass sich die in Tabelle 2 gezeigten
Konzentrationen ergaben. Das Medium wurde dann auf sterile Petrischalen
von 9 cm Durchmesser verteilt. Jedem dieser Agarmedien wurde 0,1
ml einer Kulturlösung
der Stämme,
ausgewählt
aus Escherichia coli IFO 3547, FV5714, FV525, FV814, FV521 FV221,
FV6051 und FV5069, wie in Tabelle 2 aufgeführt, welche 24 Stunden in Minimalmedium
kultiviert wurden, zugesetzt, gefolgt von 30 Stunden langer Kultivierung. Die
Ausmaße
des Wachstums werden in Tabelle 2 gezeigt.
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Tabelle
2
1. Ausmaß des
Wachstums auf Salicylsäure-Platte
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2.
Ausmaß des
Wachstums auf α-Ketoisovaleriansäure-Platte
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3.
Ausmaß des
Wachstums auf α-Ketobuttersäure-Platte
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4.
Ausmaß des
Wachstums auf α-Aminobuttersäure-Platte
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5.
Ausmaß des
Wachstums auf β-Hydroxyasparaginsäureplatte-Platte
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6.
Ausmaß des
Wachstums auf O-Methylthreonin-Platte
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In Tabelle 2 haben die Symbole die
folgende Bedeutungen:
- ++
- sehr gutes Wachstum,
- +
- gutes Wachstum,
- ±
- schlechtes Wachstum,
- –
- kein Wachstum
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In der Zwischenzeit haben die Erfinder
auf der Grundlage des vorstehend beschriebenen Herstellungsverfahrens
für D-Pantothensäure gefunden,
dass eine Mikrobe der Familie, die einen Vektor enthält, der den
Bereich eines an der Biosynthese von Pantothensäure oder eines Salzes davon
beteiligten Gens oder einen Teil des Bereiches trägt, abgeleitet
von einem Chromosom einer Mikrobe der speziellen Familie, hohe Konzentrationen
von D-Pantothensäure
und/oder D-Pantoinsäure
akkumuliert.
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Das hierin erwähnte, an der Biosynthese von
Pantothensäure
beteiligte Gen ist das panB, panC oder panD Gen, entsprechend den
Enzymen Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase, Pantothenat-Synthetase
beziehungsweise Aspartat-α-Decarboxylase.
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Mikroben als Donor für derartige
DNA schließen
die vorstehend erwähnten
Mikroben, vorzugsweise Escherichia-Mikroben, die Pantothensäure herstellen
können,
ein. Konkrete sind dafür
bekannte Stämme
der Liste der Kulturen, B. Auflage, 1988, veröffentlicht vom Institut für Fermentation,
Osaka, wie Escherichia coli K-12 (IFO 3301) und Escherichia coli
IFO 3547 beispielhaft genannt. Es ist wirkungsvoller, die vorstehend
erwähnten
Mutanten zu verwenden, wie Escherichia coli FV5714, FV525, FV814,
FV521, FV221, FV6051 und FV5069.
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Verfahren zur Herstellung eines DNA-Fragmentes,
das ein an der Biosynthese von Pantothensäure oder eines Salzes davon
beteiligtes Gen enthält,
beinhalten das Verfahren, bei dem chromosomale DNA zuerst aus einer
Donormikrobe extrahiert wird, mittels einem bekannten Verfahren
wie demjenigen, das von H. Saito und K. Miura in Biochim. Biophys.
Acta, 72, 619 (1963) beschrieben wird oder einem dazu analogen Verfahren,
wonach es mit dem Restriktionsenzym EcoRI abgespalten wird. Als
nächstes
wird das derart erhaltene chromosomale DNA-Fragment, das ein an
der Biosynthese von Pantothensäure
oder eines Salzes davon beteiligtes Gen enthält, in Vektor-DNA eingefügt.
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Die für die vorliegende Erfindung
zu verwendende Vektor-DNA kann aus denjenigen als geeignet ausgewählt werden,
die in Wirts-Mikroben proliferieren können. Plasmide, die in Wirts-Mikroben
proliferieren können,
beinhalten pSC101 [Proceedings of the National Academy of Sciences
of the USA, 70, 3240 (1973)] und pBR322 [Gene, 4, 121 (1978)], sind
aber nicht darauf beschränkt;
auch neu isolierte oder synthetisierte Vektor-DNA's kann verwendet
werden, so lange das Ziel der vorliegenden Erfindung erreicht werden
kann.
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Insertion eines DNA-Fragments, das
ein an der Biosynthese von Pantothensäure oder eines Salzes davon
beteiligtes Gen enthält,
in diese Plasmidvektoren kann mittels des bekannten, von T. Maniatis
et al. in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, University of Tokyo Press, 1982 beschriebenen Verfahrens
oder einem darauf beruhenden Verfahren erreicht werden.
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Um einen Plasmidvektor, der ein an
der Biosynthese von Pantothensäure
oder eines Salzes davon beteiligtes Gen trägt, in eine Wirts-Mikrobe einzuführen, kann
ein bekanntes Transformationsverfahren wie das in dem Journal of
Molecular Biology, 53, 159 (1979) beschriebene oder ein darauf beruhendes
Verfahren verwendet werden. Beispiele des Wirts-Bakteriums beinhalten
bekannte Stämme
wie den Stamm Escherichia coli C600 [Bacteriology Review, 36, 525
(1972)].
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Der Transformant, der ein Plasmid
enthält,
das ein an der Biosynthese von Pantothensäure oder eines Salzes davon
beteiligtes Gen trägt,
kann aus den Transformanten ausgewählt werden, indem ein für Pantothensäure auxotropher
Organismus als DNA-Empfänger
transformiert wird und ein Stamm ausgewählt wird, der als Ergebnis
der Transformation in der Lage ist, in einem Pantothensäure-freien
Medium zu wachsen. Diese Selektion wird erleichtert, indem ein Medium
verwendet wird, das die Selektion von Stämmen gestattet, die als Marker
für Plasmid-DNA
dienen. Die derart erhaltene Vektor-DNA, die ein an der Biosynthese
von Pantothensäure
oder eines Salzes davon beteiligtes Gen trägt, kann dazu verwendet werden,
rekombinante DNA aus dem sie tragenden Stamm zu extrahieren und
sie in eine andere, Wirts-Mikrobe einzuführen oder aus der extrahierten
rekombinanten DNA ein DNA-Fragment herzustellen, das ein an der
Biosynthese von Pantothensäure
oder eines Salzes davon beteiligtes Gen trägt und es mit einem anderen
Vektor-Plasmid zu ligieren. Beispiele für derart erhaltene Transformanten
beinhalten die folgenden:
Stamm Escherichia coli 3547/pFV31
(IFO 15371)
Stamm Escherichia coli 5714/pFV31 (IFO 15372)
Stamm
Escherichia coli 525/pFV31 (IFO 15373)
Stamm Escherichia coli
814/pFV31 (IFO 15374) (FERM BP 4401)
Stamm Escherichia coli
521/pFV31,
Stamm Escherichia coli 221/pFV31 (IFO 15524),
Stamm
Escherichia coli 6051/pFV31 (IFO 15525) und
Stamm Escherichia
coli 5069/pFV31 (IFO 15526) (FERM BP 4395)
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Der vorstehende Stamm Escherichia
coli 3547/pFV31 wird erhalten, indem das von Escherichia coli FV525
abgeleitete, ein an der Biosynthese von Pantothensäure oder
eines Salzes davon beteiligtes Gen tragende Plasmid pFV31 in den
Stamm IFO 3547 eingeführt
wird, der Stamm Escherichia coli 5714/pFV31 entsteht aus der Einführung von
pFV31 in den Stamm FV5714, der Stamm Escherichia coli 525/pFV31
entsteht aus der Einführung
von pFV31 in den Stamm FV525, der Stamm Escherichia coli 814/pFV31
entsteht aus der Einführung
von pFV31 in den Stamm FV814, der Stamm Escherichia coli 521/pFV31
entsteht aus der Einführung
von pFV31 in den Stamm FV521, der Stamm Escherichia coli 221/pFV31
entsteht aus der Einführung
von pFV31 in den Stamm FV221, der Stamm Escherichia coli 6051/pFV31
entsteht aus der Einführung
von pFV31 in den Stamm FV6051 und der Stamm Escherichia coli 5069/pFV31
entsteht aus der Einführung
von pFV31 in den Stamm FV5069.
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In der vorliegenden Spezifikation
stehen IFO-Nummern für
Eingangsnummern bei dem Institut für Fermentation, Osaka (2-17-85,
Jyuso Honmachi, Yodogawa-ku, Osaka-shi), wobei FERM BP-Nummern für Eingangsnummern
nach dem Vertrag von Budapest bei dem Fermentationsforschungsinstitut
der Agency of Industrial Science and Technology (1-1-3, Higashi,
Tsukuba-shi, Ibaraki) stehen.
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Der derart erhaltene Stamm kann,
kontinuierlich oder intermittierend, mit gängigen Kultivierverfahren, wie
Standkultur, Schüttelkultur,
(Rotationsschüttelkultur
usw.) und Spinnerkultur mit Luftzufuhr kultiviert werden. Das verwendete
Medium kann von herkömmlicher
Zusammensetzung sein, welche ein Wachstum der verwendeten Mikrobe
erlaubt. Kohlenstoffquellen, die die Mikrobe assimilieren kann,
sind geeigneterweise aus Kohlenwasserstoffen, Ölen und Fetten, Fettsäuren, organischen
Säuren
und Alkoholen ausgewählt,
die allein oder in Kombination eingesetzt werden. Stickstoffquellen
beinhalten zum Beispiel organische Stickstoffquellen wie Pepton,
Sojabohnenmehl, Baumwollsaatöl,
Maisquellwasser, Hefeextrakte, Fleischextrakte, Malzextrakte und
Harnstoff sowie anorganische Stickstoffquellen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat und Ammoniumphosphat, die, je nach
Anforderung, allein oder in Kombination verwendet werden. Es ist
vorteilhaft, auch Monokaliumphosphat oder Dikaliumphosphat als Phosphorquelle
zu verwenden. Das Medium kann in normaler Weise mit für das Wachstum
notwendigen Metallsalzen (zum Beispiel Magnesiumsulfat) und essentiellen
Wachstumsfaktoren wie Aminosäuren
und Vitaminen und Wachstumsbeschleunigern sowie mit Kohlenstoffquellen,
Stickstoffquellen und Phosphorquellen ergänzt werden. Um den pH-Wert
der Kultur und das Schäumen
zu steuern, können
basische Substanzen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak und
Calciumcarbonat wie sachdienlich zugesetzt werden, wobei der Zusatz
von Entschäumungsmitteln
wirksam ist. Diese Substanzen können,
wie sachdienlich, während
der Kultivierung zugesetzt werden. Auch Begasen mit Sauerstoff ist
wirksam, das Milieu unter aeroben Bedingungen zu halten. Es ist
vorteilhaft, die Kultivierungstemperatur normalerweise in dem Bereich
von 15 bis 45°C
zu halten, vorzugsweise 25 bis 40°C.
Die Kultivierung wird fortgesetzt, bis die Menge an akkumulierter
Pantothensäure
und/oder Pantoinsäure
im Wesentlichen das Maximum erreicht hat; das Ziel der vorliegenden
Erfindung kann normalerweise in 6 bis 120 Stunden erreicht werden.
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Beim Herstellen von D-Pantothensäure kann
das Ausgangsmaterial β-Alanin
in Berührung
mit den Zellen gebracht werden, indem das Ausgangsmaterial zu einem
geeigneten Zeitpunkt vor der Initiierung oder während der Kultivierung des
Stamms zugesetzt wird, oder indem das Ausgangsmaterial zu einem geeigneten Zeitpunkt
verarbeiteten Zellen zugesetzt wird. Die hierin erwähnten verarbeiteten
Zellen beinhalten gewaschene Zellkulturen und in Acetonpulver, Polyacrylamidgel
oder κ-Carrageenan
eingeschlossene und fixierte Zellen. Das Ausgangsmaterial wird in
der Form einer Lösung
oder Suspension in einem geeigneten Lösemittel wie Wasser, oder in
Pulvertorm, auf einmal oder während
einer gegebenen Zeitdauer kontinuierlich oder intermittierend zugegeben.
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Die Konzentration des zugesetzten β-Alanins
entspricht vorzugsweise der Produktivität der Mikrobe beim Zusatz in
das Medium; in wirtschaftlicher Hinsicht ist es vorzuziehen, β-Alanin mit
Konzentrationen von 0,1 bis 5% Gew./Vol. zuzusetzen, noch bevorzugter
0,5 bis 3% Gew./Vol.
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Wenn D-Pantothensäure oder ein Salz davon aus
der vorstehend beschriebenen Kultur oder dem Reaktionsprodukt isoliert
wird, kann sie mittels eines Routineverfahrens gewonnen werden.
Zum Beispiel kann D-Pantothensäure
oder ein Salz davon isoliert werden, indem Zellen aus der Kulturlösung entfernt
werden und dann einer oder mehrere bekannte Verfahrensabläufe wie
Behandlung mit Ionenaustauscherharz, Adsorbensbehandlung mit Aktivkohle
etc., Kristallisation, Aussalzen oder Elektrodialyse durchgeführt werden.
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Eine freie Form der mittels der vorstehenden
Reaktion erhaltenen D-Pantothensäure
kann mittels eines herkömmlichen
Verfahrens in ein Salz umgewandelt werden; ein mittels der vorstehenden
Reaktion erhaltenes Salz der D-Pantothensäure kann mittels eines herkömmlichen
Verfahrens in die freie Form umgewandelt werden.
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Zum Beispiel kann Calcium-Pantothenat
wie folgt isoliert werden:
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Die Zellen werden aus der Pantothensäure oder
ein Salz davon enthaltenden Kulturlösung entfernt. Diese Flüssigkeit
wird durch eine Säule
mit Kationenaustauscherharz (zum Beispiel DIAION PK-216 (H-Typ) oder
PK-228 (H-Typ), beide hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries)
hindurchgelassen, um Kationen zu entfernen, und dann durch eine
Säule mit
Anionenaustauscherharz (zum Beispiel DIAION PA-412 (OH-Typ) oder
WA-30 (OH-Typ), beide hergestellt von Mitsubishi Chemical Industries),
um organische Säuren
zu entfernen, die saurer als die anorganischen Anionen und Pantothensäure sind.
Der Effluent (pH 3 ± 1)
wird durch Zusatz von Calciumhydroxid auf beinahe neutralen pH-Wert
(pH 7 ± 2)eingestellt,
wonach Aktivkohle (zum Beispiel Shirasagi A, hergestellt von Takeda
Chemical Industries) zugesetzt wird, gefolgt von Filtration. Das
entstandene Filtrat wird aufkonzentriert, und eine geeignete Menge
eines niederen Alkohols (zum Beispiel Methanol, Ethanol, Isopropanol)
wird zugesetzt, wonach ein Impfkristall zugesetzt wird, um die Kristallisation
von Calcium-D-Pantothenat zu bewirken, und der entstandene Calcium-D-Pantothenat-Kristall
abgetrennt und getrocknet wird. Wenn die Ausbeute dieses Calcium-D-Pantothenat-Kristalls
unzureichend ist, kann mittels angemessenem Zusatz von Calciumchlorid
vor der Kristallisation ein Komplexsalz von Calcium-D-Pantothenat und
Calciumchlorid mit hoher Ausbeute und hoher Reinheit kristallisiert
werden, gemäß den in
dem US-Patent Nr. 2 957 025 (eingereicht von Jonathan O. Brooks,
18. Oktober 1960) und in der geprüften japanischen Patentveröffentlichung
Nr. 49571/1972 beschriebenen Verfahren. Obwohl das zu diesem Zweck
zugesetzte Calciumchlorid ein Kristall eines wasserfreien, eines
Dihydrat- oder eines Hexahydratsalzes sein kann, wird einem wasserfreien
oder Dihydratsalz der Vorzug gegeben. Die Menge an zugesetztem Calciumchlorid
ist normalerweise im molaren Verhältnis 0,5 bis 5 mal, vorzugsweise
1 bis 3 mal größer als
die des Calcium-Pantothenates. In Betreff dieses Komplexsalzes von
Calcium-Pantothenat und Calciumchlorid stellt das US-Patent Nr.
2 957 025 (eingereicht von Jonathan O. Brooks, 18. Oktober 1960)
fest, dass es nicht hygroskopisch und als Futterzusatz für Tiere
wirksam ist; das britische Patent Nr. 933 669 stellt fest, dass
es in Tabletten stabiler als Calcium-Pantothenat ist.
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Es gab bisher keine Berichte über Verfahren
zur Entfernung des Calciumchlorids aus dem dergestalt erhaltenen
Komplexsalz von Calcium-D-Pantothenat und Calciumchlorid, um Calcium-D-Pantothenat
mit hoher Ausbeute zu erhalten. Die Erfinder haben nach intensiven
Untersuchungen von verschiedenen zur Erreichung dieses Zwecks führenden
Verfahren ein sehr effektives Elektrodialyseverfahren ausgearbeitet.
Die Erfinder haben speziell gefunden, dass Calciumchlorid aus einer
wässrigen
Lösung
des Komplexsalzes von Calcium-D-Pantothenat und Calciumchlorid wirkungsvoll
mittels Elektrodialyse entfernt werden kann, indem eine für Anionen
permeable Membran, die Chloridionen, nicht aber Pantothensäure durchlässt (zum
Beispiel die selektiv für
einwertige Ionen durchlässige
Membran Neocepter ACS, hergestellt von Tokuyamam Soda) und eine
wässrige
Calciumnitratlösung
als Elektrodenflüssigkeit
verwendet wird. Obwohl die Konzentration dieses Komplexsalzes in
der wässrigen
Lösung
wahlfrei ist, wird es normalerweise innerhalb des Konzentrationsbereiches
von normalerweise von 1 bis 60% (Gew./Vol.), vorzugsweise von 4
bis 40% (Gew./Vol.) aufgelöst.
Die durch diese elektrodialytische Behandlung erhaltene wässrige Lösung von
Calcium-D-Pantothenat kann einem üblichen Verfahrensablauf, wie
Sprühtrocknung,
unterworfen werden, um ein Pulver von Calcium-D-Pantothenat zu ergeben.
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Calcium-D-Pantothenat kann so wirkungsvoll
aus der Kulturlösung
isoliert werden.
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D-Pantoinsäure kann abgetrennt werden,
indem die Zellen aus der Kulturlösung
entfernt werden, die Flüssigkeit
mit Schwefelsäure
oder Salzsäure
auf pH 1 bis 2 eingestellt wird, wobei zu Pantolacton, einem cyclisierten
Derivat von Pantoinsäure,
derivatisiert wird, es mit einem Lösemittel (zum Beispiel Isopropylacetat, Ethylacetat)
extrahiert wird und dann Aufkonzentration und Kristallisation durchgeführt werden,
um einen Kristall zu ergeben. Das derart erhaltene Pantolacton kann
durch Zusatz von Natriumhydroxid usw. leicht zu Pantoinsäure zurückverwandelt
werden.
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Beispiele
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Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend
mittels der folgenden Beispiele näher beschrieben, die lediglich
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung sind und die in keiner Weise den Geltungsbereich
der Erfindung einschränken.
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D-Pantothensäure wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
[Säule:
Shimadzu SCR101 H (7,9 mm Durchmesser × 30 cm); mobile Phase: 0,008
N Schwefelsäure;
Durchflussgeschwindigkeit: 0,8 ml/min; Detektor: Differentialrefraktometer]
und/oder mikrobielles Bioassay [Indikatorstamm: Lactobacillus plantrum
IFO 3070; Medium: im Handel erhältliches Assaymedium
für Pantothensäure (hergestellt
von DIFCO)] quantitativ bestimmt. Die quantitative Bestimmung und
die Bestimmung der optischen Reinheit von Pantoinsäure wurde
mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
[Säule:
SUMICHIRAL OA-1200; mobile Phase: n-Hexan/1,2-Dichlorethan/Ethanol = 90/8/2; Durchflussgeschwindigkeit:
1,0 ml/min; Detektor: UV] des Ethylacetat-Extraktes durchgeführt, nach
Entfernung der Zellen aus der Kulturlösung mittels Zentrifugation,
Zusatz von 6 N Salzsäure
zu dem Überstand
und darauffolgendem 15 Minuten langem Erwärmen in einem Wasserbad bei
80°C (durch
diese Operation wird im Gleichgewicht vorliegende Pantoinsäure zu Pantolacton umgewandelt).
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Beispiel 1
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Einem konischen 200 ml-Kolben, der
20 ml eines ersten sterilen Aussaatmediums der in Tabelle 3 gezeigten
Zusammensetzung enthielt, wurde jeweils eine Platinimpföse voll
des Stammes Escherichia coli IFO 3547, des Stammes FV5714 (IFO 15368),
des Stammes FV525 (IFO 15369), des Stammes FV814 (IFO 15370) oder
des Stammes FV521 aus Schrägmedium
eingeimpft, gefolgt von einer Rotationsschüttelkultur für 20 Stunden
bei 220 Upm und 30°C.
Ein Teil von 1 ml dieser ersten Aussaatkultur wurde in einen mit
Rippen versehenen konischen 200 ml-Kolben überführt, der 20 ml eines sterilen
Mediums der in Tabelle 4 gezeigten Zusammensetzung enthielt, gefolgt
von Kultivieren für
20 Stunden bei 38°C,
unmittelbar wonach 2,5 ml einer 54%igen wässrigen Glucoselösung jedem
Kolben zugesetzt wurden, gefolgt von Kultivierung für 24 weitere Stunden.
Die Menge und die optische Reinheit der hergestellten Pantoinsäure und
die Menge der akkumulierten Pantothensäure, jeweils nach Abschluss
der Kultivierung, werden in Tabelle 5 angegeben.
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Beispiel 2
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Einem konischen 200 ml-Kolben, der
20 ml eines ersten sterilen Aussaatmediums der in Tabelle 3 gezeigten
Zusammensetzung enthielt, wurde jeweils eine Platinimpföse voll
des Stammes Escherichia coli FV221, des Stammes FV6051 beziehungsweise
des Stammes FV5069 aus Schrägmedium
eingeimpft, gefolgt von einer Rotationsschüttelkultur für 20 Stunden
bei 220 Upm und 30°C.
Ein Teil von 1 ml dieser ersten Aussaatkultur wurde in einen mit
Rippen versehenen konischen 200 ml-Kolben überführt, der 40 ml eines sterilen Mediums
der in Tabelle 6 gezeigten Zusammensetzung enthielt, gefolgt von
Kultivieren für
20 Stunden bei 38°C,
wonach unmittelbar 5 ml einer 54%igen wässrigen Glucoselösung jedem
Kolben zugesetzt wurden, gefolgt von Kultivieren für weitere
24 Stunden. Die Menge und die optische Reinheit der hergestellten
Pantoinsäure
und die Menge der akkumulierten Pantothensäure, jeweils nach Abschluss
der Kultivierung, werden in Tabelle 7 angegeben.
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Beispiel 3
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i) Herstellung chromosomaler
DNA
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Dem Stamm Escherichia coli FV525,
der D-Pantothensäure
herstellen kann, wurde 1 Liter L-Medium (1% Bactotrypton, 0,5% Hefeextrakt,
0,5% Natriumchlorid) eingeimpft, gefolgt von Kultivierung bei 37°C über Nacht.
Zum Schluss wurden 3,3 mg chromosomale DNA, mittels des Verfahrens
nach Saito et al. [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)] unter
Verwendung, von Phenol, aus den Zellen erhalten.
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ii) Insertion von chromosomaler
DNA in den Vektor Plasmid pMW118
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Die Abläufe in dem folgenden Experiment
waren gemäß dem Verfahren,
das von T. Maniatis et al. in Molecular Cloning, veröffentlicht
durch die University of Tokyo Press, 1982, beschrieben wurde, wenn
nicht als anders vermerkt.
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10 μg der in dem vorstehenden Absatz
i) erhaltenen chromosomalen DNA und pMW118 (hergestellt von Nippon
Gene) wurden jeweils mit dem Restriktionsenzym EcoRI (hergestellt
von Nippon Gene) abgespalten, gefolgt von Mischung und Ligierung
in der Gegenwart von aus dem T4-Phagen abgeleiteter DNA-Ligase (hergestellt
von Nippon Gene).
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iii) Klonierung des Gens
des Systems zur Biosynthese von Pantothensäure
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Die Transformation wurde mittels
des Verfahrens der kompetenten Zelle durchgeführt. Speziell wurden kompetente
Zellen hergestellt unter Verwendung des für D-Pantothensäure auxotrophen
Stammes A4C (IFO 15251, FERM BP-3677),
der mittels Nitrosoguanidin-Mutagenese aus dem Stamm Escherichia
coli C600 abgeleitet ist. Zu dieser Suspension wurde die in dem
vorstehenden Abschnitt ii) hergestellte Plasmid-DNA zugesetzt, um
sie zur Transformation zu inkorporieren. Als nächstes wurde eine diesen Transformanten
enthaltende Suspension über
ein Kulturplatte eines M-9 Agarmediums gespreitet, (0,6% Dinatriumhydrogenphosphat,
0,3% Dikaliumhydrogenphosphat, 0,1% Ammoniumchlorid, 0,05% Natriumchlorid,
1 mM Magnesiumsulfat, 0,1 mM Calciumchlorid, 0,5% Glucose, 10 μg/ml Vitamin
B1, 50 μg/ml
Threonin, 50 μg/ml
Leucin, 1,5% Agar, pH 7,2), ergänzt
mit 50 μg/ml
des Natriumsalzes von Ampicillin, gefolgt von 2 Tage langer Kultivierung bei
37°C. Aus
den auf dem Plattenmedium wachsenden Kolonien wurde ein Transformant
erhalten, der gegen Ampicillin resistent und in der Lage, D-Pantothensäure herzustellen
ist. Der auf diese Weise mit einem Plasmid, das ein von der chromosomalen
DNA des Stammes Escherichia coli FV525 abgeleitetes Insert trägt, transformierte
Stamm A4C wurde Stamm A4C/pFV31 genannt (IFO 15367).
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iv) Extraktion von Plasmid
aus dem Transformanten
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Zuletzt wurden 600 μg des Plasmids
aus 1 Liter der Kulturlösung
des transformanten Stammes Escherichia coli A4C/pFV31 erhalten und
es wurde pFV31 genannt.
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v) Analyse des Plasmids
pFV31
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pFV31 wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen
abgespalten und der Elektrophorese auf Agarose-Gel unterworfen.
Aus den elektrophoretischen Mustern wurde die in 1 gezeigte Abspaltungskarte der Restriktionsenzyme
auf der Grundlage des Molekulargewichtes des HindIII Verdauungsproduktes
der Lambda-Phagen-DNA (hergestellt von Nippon Gene) hergestellt.
Es wurde gefunden, dass pFV 31 ein rekombinantes Plasmid ist, das
ein etwa 2,5 kb großes
DNA-Fragment an der EcoRI-Stelle von pMW118 trägt.
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vi) Rückverwandlung
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Um das Vorhandensein eines an der
Biosynthese von Pantothensäure
oder eines Salzes davon beteiligten Gens auf pFV 31 zu bestätigen, wurde
der für α-Ketopantoinsäure auxotrophe
Stamm A1B, der für β-Alanin auxotrophe
Stamm A17D und der für
Pantothensäure
auxotrophe Stamm A4C, die alle durch Nitrosoguanidin-Mutagenese
von dem Stamm Escherichia coli C600 abgeleitet sind, mit der vorstehenden
plasmiden DNA zurückverwandelt.
Alle entstandenen Transformanten konnten auf dem vorstehenden M-9
Agarmedium wachsen, was das Vorhandensein von Genen für Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase,
Aspartat-α-Decarboxylase
und Pantothenatsynthetase auf pFV31 aufzeigt.
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Um überdies die Auswirkung auf
die Fähigkeit
des Transformanten zur Herstellung von Pantothensäure zu bestätigen, wurden
die Stämme
Escherichia coli IFO 3547, FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051
und FV5069 mit pFV31 transformiert. Die so erhaltenen Transformanten
wurden Stamm Escherichia coli 3547/pFV31, 5714/pFV31, 525/pFV31,
814/pFV31, 521/pFV31, 221/pFV31, 6051/pFV31 beziehungsweise 5069/pFV31
genannt.
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Beispiel 4
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Ein flüssiges Medium der in Tabelle
3 gezeigten Zusammensetzung wurde 15 Minuten lang bei 121°C in einem
Autoklaven thermisch sterilisiert und dann mit 20 ml pro Kolben
auf konische 200 ml-Kolben verteilt. Jeder Kolben wurde mit jeweils
einer Platinimpföse
voll der Stämme
Escherichia coli 3547/pFV31, 5714/pFV31, 525/pFV31, 814/pFV31 oder
521/pFV31, wie in Absatz vi) in Beispiel 3 aus Schrägmedium
erhalten, geimpft, gefolgt von einer Rotationsschüttelkultur
für 20
Stunden bei 220 Upm und 30°C.
Ein Teil von 1 ml dieser Saatkultur wurde in 20 ml eines Mediums
der in Tabelle 4 gezeigten Zusammensetzung übertragen, gefolgt von Kultivieren
für 20
Stunden bei 38°C
in einem mit Rippen versehenen konischen 200 ml-Kolben, unmittelbar
wonach 2,5 ml einer 54%igen wässrigen
Glucoselösung
jedem Kolben zugesetzt wurde, gefolgt von Kultivieren für weitere
24 Stunden. Die Menge und die optische Reinheit der hergestellten
Pantoinsäure und
die Menge der akkumulierten Pantothensäure, jeweils nach Abschluss
der Kultivierung, werden in Tabelle 8 angegeben.
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Beispiel 5
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Ein flüssiges Medium der in Tabelle
3 gezeigten Zusammensetzung wurde 15 Minuten lang bei 121°C in einem
Autoklaven thermisch sterilisiert und dann mit 20 ml pro Kolben
auf konische 200 ml-Kolben verteilt. Jeder Kolben wurde mit jeweils
einer Platinimpföse
voll der Stämme
Escherichia coli 221/pFV31, 6051/pFV31 beziehungsweise 5069/pFV31,
wie in Absatz vi) in Beispiel 3 aus Schrägmedium erhalten, geimpft,
gefolgt von einer Rotationsschüttelkultur
für 20
Stunden bei 220 Upm und 30°C.
Ein Teil von 2 ml dieser Saatkultur wurde in 40 ml eines Mediums
der in Tabelle 6 gezeigten Zusammensetzung übertragen, gefolgt von Kultivieren
für 24
Stunden bei 38°C
in einem mit Rippen versehenen konischen 200 ml-Kolben, wonach unmittelbar
5 ml einer 54%igen wässrigen
Glucoselösung
jedem Kolben zugesetzt wurde, gefolgt von Kultivieren für weitere
24 Stunden. Die Menge und die optische Reinheit der hergestellten
Pantoinsäure
und die Menge der akkumulierten Pantothensäure, jeweils nach Abschluss
der Kultivierung, werden in Tabelle 9 angegeben.
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Beispiel 6
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Einem konischen 200 ml-Kolben, der
20 ml eines ersten sterilen Aussaatmediums der in Tabelle 3 gezeigten
Zusammensetzung enthielt, wurde jeweils eine Platinimpföse voll
des Stammes Escherichia coli 814/pFV31 aus Schrägmedium zugesetzt, gefolgt
von einer Rotationsschüttelkultur
für 24
Stunden bei 220 Upm und 30°C.
Ein Teil von 20 ml dieser ersten Aussaatkultur wurde in einen mit
Rippen versehenen konischen 1000 ml-Kolben überführt, der 200 ml eines zweiten
sterilen Mediums der gleichen Zusammensetzung enthielt, gefolgt
von 24 Stunden langer Rotationsschüttelkultur bei 220 Upm und
30°C. Ein
Teil von 125 ml dieser zweiten Aussaatkultur wurde in ein 5-Liter-Fermentationsgefäß überführt, welches
2,3 Liter eines sterilen Mediums enthielt, das 250 g Glucose, 12,5
g Maismaischesaft, 37,5 g Ammoniumsulfat, 1,25 g Monokaliumphosphat,
2,5 g Dikaliumphosphat, 0,5 g Magnesiumphosphat, 75 g Calciumcarbonat
und 33 g β-Alanin
enthielt (pH 7,0), gefolgt von Kultivieren bei 38°C mit Belüftung (0,8
vol/vol/min) und Rühren
(800 Upm). Während des
Zeitraums von 16 bis 62 Stunden nach der Initiierung der Kultivierung
wurde fortlaufend Glucose zugesetzt, um ihre Konzentration zwischen
2% und 3% zu halten. Nach 68 Stunden Kultivierung betrug das Endvolumen
der Flüssigkeit
2,5 Liter, wobei die Menge der hergestellten Pantothensäure 38,5
g/Liter war.
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Beispiel 7
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Ein Teil von 2,0 Liter (enthaltend
77,0 g D-Pantothensäure)
der in Beispiel 6 erhaltenen Fermentationslösung wurde erwärmt (80°C, 10 min)
und dann filtriert, um Zellen und unlösliche Substanzen zu entfernen. Das
Filtrat wurde mit den Waschflüssigkeiten
vereinigt, um 2,4 Liter Flüssigkeit
zu ergeben, die durch eine mit 600 ml DIAION PK-216 (H-Typ) gepackte
Säule und
dann durch eine mit 340 ml DIAION PA-412 (OH-Typ) gepackte Säule hindurchgelassen
wurde, um bei Vereinigung mit dem Effluentwasser eine Gesamtmenge
von 4,1 Liter verarbeiteter Flüssigkeit
(pH 3,2) zu ergeben. Diese verarbeitete Flüssigkeit wurde mittels Zusatz
von Calciumhydroxid auf den pH-Wert 6,8 eingestellt, wonach 5 g
Aktivkohle (Shirasagi A) zugesetzt wurde, gefolgt von Filtration.
Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten
wurden vereinigt, um 4,2 Liter Flüssigkeit zu ergeben, die 75,1
g Pantothensäure
enthielt, aus welcher Zahl der Gehalt an Calcium-D-Pantothenat als
82,0 g betragend berechnet wurde. Diese Flüssigkeit wurde als die Ausgangsflüssigkeit
für die
Kristallisation verwendet.
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Ein Teil von 2,1 Liter (enthaltend
41,0 g Calcium-D-Pantothenat) der so erhaltenen Ausgangsflüssigkeit
zur Kristallisation wurde unter vermindertem Druck auf eine Endkonzentration
an Calcium-D-Pantothenat von etwa 43 Gew.-% eingeengt. Diesem Konzentrat
wurden 410 ml Methanol zugesetzt, und ein Impfkristall von 0,5 g
wurde zugesetzt, gefolgt von 5 Stunden langem allmählichem
Rühren
bei 30°C.
Die Flüssigkeit
wurde dann 14 Stunden lang bei 5°C
stehen gelassen, wonach der Kristall mittels Filtration abgetrennt
und getrocknet wurde. Es wurde gefunden, dass der erhaltene Kristall
6,3 g wog und eine Reinheit von 98,5% hatte.
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Beispiel 8
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Ein Teil von 2,1 Liter (enthaltend
41,0 g Calcium-D-Pantothenat) der 4,2 Liter in Beispiel 7 erhaltenen Ausgangsflüssigkeit
zur Kristallisation wurde unter vermindertem Druck auf eine Endkonzentration
an Calcium-D-Pantothenat von etwa 43 Gew.-% eingeengt. Diesem Konzentrat
wurden 100 ml Methanol zugesetzt. Nach gründlichem Mischen wurde eine
Lösung
von 37,94 g Calciumchlorid-Dihydrat in 310 ml Methanol zugesetzt,
und ein Impfkristall von 0,5 g wurde zugesetzt, gefolgt von 5 Stunden
langem allmählichem
Rühren
bei 50°C.
Der Kristall wurde mittels Filtration abgetrennt und getrocknet.
Es wurde gefunden, dass der erhaltene Kristall 41,95 g wog und eine
Zusammensetzung von 74,3 Gew.-% D-Pantothensäure, 13,6 Gew.-% Ca und 12,1
Gew.-% Cl hatte. Dieser Befund zeigt, dass dieser Kristall ein Komplexsalz
von D-Pantothensäure
und Calciumchlorid in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 ist.
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40 g dieses Komplexsalzes wurden
in etwa 2 Liter Wasser gelöst
und unter Verwendung eines Elektrodialysegerätes der Elektrodialyse unterworfen,
[Modell TS-2-10 (Tokuyama Soda); für Kationen durchlässige Membran:
Neocepter CM-1; für
Anionen durchlässige
Membran: Neocepter ACS; Elektrodenflüssigkeit: 0,2 normale wässrige Calciumnitratlösung; Durchflussrate:
0,3 Liter/min; Spannung: 10 V]. Als Folge davon wurde das Calciumchlorid
aus dem System entfernt und eine wässrige Lösung von Calcium-D-Pantothenat
(pH 7,0), enthaltend D-Pantothensäure und Calcium in einem molaren
Verhältnis
von 2 : 1 wurde erhalten. Diese wässrige Lösung von Calcium-D-Pantothenat
wurde unter vermindertem Druck auf eine Konzentration von etwa 50 Gew.-%
eingeengt und dann unter Verwendung eines Sprühtrockners sprühgetrocknet,
um 34,0 g eines Pulvers aus Calcium-D-Pantothenat zu ergeben. Dieses Pulver
hatte eine Reinheit an Calcium-D-Pantothenat
von 99,8 Gew.-% ([α]D = +28,1 (c = 5, H2O)).
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Beispiel 9
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Einem konischen 200 ml-Kolben, der
20 ml eines ersten sterilen Aussaatmediums der in Tabelle 3 gezeigten
Zusammensetzung enthielt, wurde jeweils eine Platinimpföse voll
des Stammes Escherichia coli 5069/pFV31 aus Schrägmedium zugesetzt, gefolgt
von einer Rotationsschüttelkultur
für 24
Stun den bei 220 Upm und 30°C.
Ein Teil von 20 ml dieser ersten Aussaatkultur wurde in einen konischen
1000 ml-Kolben überführt, der
200 ml eines zweiten sterilen Aussaatmediums der gleichen Zusammensetzung
enthielt, gefolgt von einer Rotationsschüttelkultur für 24 Stunden
bei 30°C.
Ein Teil von 75 ml dieser zweiten Aussaatkultur wurde in ein 3-Liter-Fermentationsgefäß überführt, welches
1,35 Liter eines sterilen Mediums enthielt, das 75 g Glucose, 30
g Maisquellwasser, 22,5 g Ammoniumsulfat, 0,75 g Monokaliumphosphat,
1,5 g Dikaliumphosphat, 0,3 g Magnesiumphosphat, 45 g Calciumcarbonat,
0,75 mg Vitamin B1 und 15 g β-Alanin enthielt
(pH 7,0), gefolgt von Kultivieren bei 38°C unter Belüftung (0,8 vol/vol/min) und
Rühren
(700 Upm). Glucose wurde intermittierend 15, 27 und 38,5 Stunden
nach der Initiierung der Kultur zugesetzt, um eine Konzentration
von 5% aufrecht zu erhalten. Weiter zugesetzt wurden β-Alanin,
27 und 46,5 Stunden nach der Initiierung der Kultur zu einer Konzentration
von 1%, und 30 und 50 Stunden nach der Initiierung der Kultur 0,75
mg Vitamin B1. Nach 72 Stunden Kultivierung
betrug das Flüssigkeitsvolumen
zum Schluss 1,58 Liter, wobei die Menge an D-Pantothensäure 65,4
g/Liter war.
