HU230180B1 - Eljárás D-pantoténsav és/vagy sói előállítására állati takarmányadalékként - Google Patents

Description

A találmány tárgya javított eljárás O-pantoténsav és/vagy sói előállítására és alkalmazása állati taksrmányadalékként.

.Koenzím A bipszíntézísének kiindulási vegyü iet © kén t. a D-pantotenát a növény- és állatvilágban széles körben elterjedt. Az emberrel ellentétben - aki a pantoténsavat kielégítő mennyiségben megszerzi az élelemmel - mind a növények, mind az állatok esetében gyakran Írnak le D-paniotenát hiánytüneteket. Ezért D-pantotenát hozzáférhetősege komoly gazdasági fontossággal bír, különösen az állati takarmányok előállításánál.

D-Pantofeenát szokásos előállítása kémiai szintézissel történik D-pantoiaktonből és p-alanin kaiciumsójáfoöl íülimannds Sncyoiopedia of Industríal Chemístry β^ΪΛ ed. (1999), electroníe release, Kapitei ,, VitaminéD-pantoiakton előállításához diasztereomer sokon keresztül költséges, klasszikus racém felbontásra van szükség.; A kémiai szintézisből nyert kereskedelmi termék legtöbbször D-pantoténsav kalciumsója, Ca-pantotenát.

A kémiai szintézissel szemben a mikroorganízmusokkal történő biotechnológiai előállítások előnye a pantoténsav ~ magasabb rendű. szervezetek számára felhasználható - D-formájának (tiszta emantiomergémek) szelektív előállítása. Ezáltal fölöslegessé válik a kémiai szintézisnél szükséges récém felbontás.

D-Fantoténsav mikroorganízmusokka1 történő ferrnentácíős előállítására számos eljárás ismeretes, így például többek között az Eb 0 590857, EF 1 001027, EF 1 000109, EF 1 006192 és SP 1 006193 számú, európai szabadalmi leírásokban, a WO 96/33203 és WO 97/10340: közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésekben, az US 6, 013,492 számú és DE 19S 46 4.99 számú szabadalmi leírásokban közölt eljárások.,

As SP 1 00102? és EP 1 006189 számú európai szabadalmi leírások. pantotenát előállítására: olyan eljárást Írnak le, ahol a fermentlében legfeljebb 1 g/1 D-pantoténsav tartalmat érnek el, Ilyen csekély, szárazanyagra vonatkoztatva 10%-nál kevesebb pantotenát tartalom a fermentlében azonban D-pantoténsav tartalmú állati takarmánykiegészitö gazdasági, előállítására nem megfelelő., Az eddig leírt eljárások további hátránya, hogy a termékek elválasstásá a fermentlétől számos költséges feldolgozási lépest igényel, Nagy léptékű gazdasági előállításra még nem tettek közzé eljárást.

A DE 100 16 321 számú szabadalmi iratban D-pantofénsavat tartalmazó állati takarmányadalék előállítására írnak le fermentációs: eljárást. Ennek az eljárásnak azonban - ugyanúgy, mint a fent említett. D-pantoténsav előállítási eljárásoknak - lényeges hátránya, hogy a kívánt termék gazdaságos hozamának eléréséhez a pantoténsav képződés első lépcsőjében a mikroorganizmus számára a tápközeghez feltétlenül kell ^-alanint adagolni.

Az ES 6,013,492 számú szabadalmi ieirás és a WO 96/332939 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés leírja továbbá a D-pantoténsav feldolgozását a fermentiébői, az oldhatatlan alkotórészek (például sejt törmelék) kiszűrését a tapóidatbői, a szőriét adszorpcióját aktív szénen, ezt követően a D-pántoténsav elűcióját szerves oldószerrel, előnyösen metanollal, semlegesítését kaicium-hidrorlddal és végül a Ca-pantofen.át kikristáiyo oltását. Lényeges hátrányok a kristályosításnál fellépő értékes anyag veszteség, valamint as oldószer alkalmazása, amelyet nehezen lehet a termékhői. eltávolítani és költséges oldószer visszanyerést tesz szükségessé.

Az E? 0 590 857 számú európai szabadalmi leírás olyan D-~psntoténsav előállítási eljárást ír le, amelyben a. mikroorganizmus tenyésztésénél feltétlenül szükség van β-alanin adagolásra. A fermeotlevet a biomassza eltávolítása céljából szűrik, azután először katíoncserélő, majd anioncserélő gyantán vezetik keresztül, kalcium-hidroniddal. semiegesitík, felgőzőlik, aktív szenet adnak hozzá, még egyszer szűrik és metanol és kalcium-klorid hozzáadása mellett kristályosítják, Az eredményül kapott Ca-pantotenát tartalmú termék a. D~psntoténssv kalcium sója mellett 1:1. mólarényban tartalmaz meg kalcium-kioridot, A kalcium-klorid tartalom csökkentése érdekében szükség van élektrodializísre ahhoz kapcsolódó porlasztva szárítással. Ez az eljárás a költséges feldolgozási lépések sokasága és a szerves oldószer alkalmazása miatt sem gazdaságilag sem ökológiai szempontból nem előnyös.

A találmány feladata 0-pantöténsavat és/vagy annak sóját tartalmazó állati takarmányadalék rendelkezésre bocsátása, valamint ennek előállítása D-pantoiénsav és/vagy sója előállítására irányuló olyan javított eljárással, amely az előzőekben említett hátrányoktól mentes. Itt. gazdasági megfontolások miatt olyan eljárás kívánatos, amelyben a β-alanin rátáplálás erőteljesen csökkentett vagy egyáltalán nincs szükség β-alanin adagolásra. Továbbá a D-pantoténsav annak kétértékű sója tormájában képződik és itt mindenekelőtt alkáliföldfémek előnyösek, mivel a kétértékű 77.ZS3/3K sók kevésbé higroszkóposak, mint a pahtotéhsav egyértékű sói és ezáltal a további felhasználásnál - például állati takarmanyadalékként ~ lóval kevésbé hajlamosak Összecsomősodásra

Ezt a feladatot előnyös módon oldja meg a jelen találmány.

A találmány tárgyát D-pantoténsav és/vagy sója előállítására irányuló eljárás képezi, azzal jellemezve, hogy

a) legalább egy olyan D-pantöténsavat termelő mikroorganizmust alkalmazunk, amelynek pantoténsav (pan) és/vagy izoleucin/valin (ilv) bioszintézise deregulált és tenyésztő tápközegben fermentációval legalább 2 g/1 D-pantoténsav sót képez, ahol a tenyésztő tápközeghoz Θ-20 g/1 szabad β-alanint és/vagy β-aianin sót adagolunk, bj a képződő D-psntotánsavhoz többértéku kationt tartalmazó sókat adagolunk, amelynek követkertében a D-pantoténsav többértékű sója keletkezik,

e) a D-pantoténsav többértékű sóját tartalmasé oldatot nanoszűréssel dolgozzuk fel, amelynek következtében a D-pantoténsav többértékö sója feldúsul, és

d) a nánoszurés D-pantoténsav többértékű sóját tartalmazó retentátumát (szűrés után visszamaradt, hetöményedett anyagát) száritásmak és/vagy íormulázásnak vetjük alá.

A találmány szerinti eljárás egy megvalósítási formájában a c) lépésben keletkező retentátum a D-pantoténsav többértékű sóját tartalmazó szuszpenziő..

Továbbá a fermentáció végezhető batch, ied-bateb vagy ismételt fed-hsteh technikával vagy folytonos eljárással, A keletkező D-pantoténsav semlegesílésére szokásos poffér rendszereket.

**<.·* * mint például foszfát puffért nátrium-hidroxiddai, káli.um-hid.roxiddal vagy ammőn iával alkalmazunk.

A találmány szerinti eljárás további megvalősitási formáiban az a) lépesben legalább lö g/I, előnyösen legalább 20 g/l, különösen előnyösen legalább 40 g/l, még előnyösebben legalább 60 g/l és legelőnyösebben legalább 70 g/l D-pantoténsav sója keletkezik a tápoldatban a fermentáció: során.

& találmány szerint „termelés alatt azt értjük, hogy a szervezet a saját anyagcseréjéhez szükségesnél nagyobb mennyiségű D-pantoténsavat és/vagy sóját képes szintetizálni. Egy találmány szerint előnyös megvalósítási formában a szintetizáiődott B-pantoténsav és/vagy sója nem a sejt belsejében található, hanem ideális esetben a szervezet teljes egészében kiválasztja a tápközegbe. Sz a kiválasztás ismert mechanizmusok alapján lehet aktív vagy passzív.

A találmány szerinti D-pantoténsav termelő szervezetek mikroorganizmusok,. Ezek a találmány szerint gombák, élesztők és/vagy baktériumok. A találmány szerint előnyben részesítünk gombákat, mint például Zőucort, vagy élesztőket, mint például ásccharornyceet vagy Debsromyeest és itt különösen Sacoharomyces eerevlsiae-t„ A találmány szerint előnyben, részesítünk coryneform baktériumokat vagy a Eacillaceae család tagjait, A találmány szerint előnyben részesítjük például a Corynebacterium, Sscherichia, Bacillus, áriéróbactér, Brevibacterium, Bseudcmonas, BadmoreJia, Klebsielis, P.rcteus, .4 cl ne tóba c tar vagy Bhizohiu® nemzetségbe tartozó baktériumokat., Különösen előnyben részesítjük itt például a Corynebacisrinm glutárnicnm, Brevi

I φ φ**

- .»· ΧΦΦΦ * * *

ΦΦ * φ** *♦ bacteriom breve vagy Bacilius rrbtzízr, B, iícheriíonsis, B. awioíígnefaciens, B. cerens, B. iehtimoröus,, s. leníus, &, firrnna, S. panterhénticos, B, círculsns , B. coagaíans, B, >eg®teri.:OT,- B. poaílas,. B. thsringiensis, B. hrsvl&_f B, stearorheraiophílus fajokat és egyéb, a llsANS-sel jellemzett, az 1. csoportba tartozó Bacilltis fajokat, vagy áctinum myéefe.aííst, Ez a felsorolás tájékoztató jellegé és nem jelenti az oltalmi kör korlátozását.

Ezenkívül a találmány tárgyát képezi genetikailag átalakított mikroorganizmusok alkalmazása szabad D-panöoténsavat és/vagy sóját tartalmazó állati takarmányadalék találmány szerinti előállítására. Ilyen genetikailag átalakított mikroorganizmusok eiőáiiithatók péidáui kémiai mutagenezissel és ezt kővetően izolálhatok - megfelelő soreenelést eljárással történő szelekcióval. Szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak úgynevezett termelő törzsek, amelyek a találmány szellemében alkalmasak a termék előállítására és az anyagcsere folyamatokban Dpantcténsav irányában genetikailag ágy módosítottak, hogy a változtatások a D-pantoténsavnak és/vagy sóinak a sejtmembránon keresztül történő kiválasztását is érintik. Ez elérhető például az alkalmazott mikroorganizmus releváns anyagcsere-bioszíntézís ütvonalai kulcspozícióinak megváltoztatásával.

Alkalmazhatók olyan homológ és/vagy hete.ro lóg nukieotid-szekvenciák átvitele révén eredményül kapott transzgén szervezetek is, amelyek szükségesek a kívánt termék szintéziséhez vagy kedvezőek lehetnek. Itt szóba jöhet egy vagy több gén túlzott kifejezése és/vagy deregulációja egyenként és/vsgy kombináció'Ú.2S3/BZ

X Φ Φφ * φ: '

,. ♦ , .«»» ·” « * * , * . φ φ φ.φ φφ* * * ^χ bán, a genomban és/vagy egy vektoron Lokalizálta;··., Az ilyen transzgén szervezetek előnyösen tartalmazhatnak további másolatokat és/vagy genetikailag megváltoztatott géneket a panB~t, panC-t, pauO-t, panB-t tartalmazó csoportból és/vagy ezek kombinációit és/vagy akár szervezeti egységeket, mint a panBC.0 cperont. Ezenkívül előnyösen manipulálhatók további anyagcsere útvonalak a szervezetben, mint például az izoieucin-valin bioszintézis útvonal, amelyet például az £? 1 001027, EB 1 006100, Er 1 000192 és EB 1 006193 számú európai szabadalmi leírásokban Írnak le. Ezáltal a pantoténsav-bíoszintézls elágazó láncú prekurzorai megnövekedett mennyiségben állnak rendelkezésre. Adott esetben előnyösen ennek a bioszintézis útvonalnak a génjei, azaz IJvB, iivN, ilvO í mánv oltalmi körébe tartoznak.

vagy	ilvD túlz	ottan	kifejezettek.
antot	; én savat t;	armeiő	szervezetben
íoD)	genetikai	váltós	ásal, például
ragu	láció révé	n szir	ítén a talál-
att z	i találmány	’ sseri	at a követke-
V	nal enzimj	ét kód	olo, legalább
’iy m	ódon, hogy	az en	zím aktivítá-
tosi j	fe vagy mód	iosul.	Előnyben ré~
	enzimjét k<	idolő,	legalább egy

sa a génnek oly módon történő megváltoztatását, hogy a géntermék képződése fel erősödik vagy aktivitása .fokozódik. A „deregulált anyagcsere útvonal* kifejezés olyan bioszintézís útvonalra utal, amelyben egynél több enzimet kódoló, egynél több gént úgy változtatunk meg vagy módosítunk, hogy egynél több enzim megváltó77_v 2 £3 ««« ♦» <«»*

1elsütve η

Κ*Φ* «

X « *' * ♦ « *··» zik vagy módosul.

A változtatások vagy módosítások - korlátozást nem

- tartalmazhatják endogén promoterek vagy szabályozó elemek eltávolítását; erős promoterek, Indukálható promőterek vagy egyidejűleg több promófcer beillesztését; szabályozó szekvenciák eltávolítását oly módon, hogy a géntermékek kifejeződése megváltozzon; a gén kromoszőmslis helyzetének megváltoztatását; a gén közeiében vagy a génen belül levő DNS szekvencia, például a rifooszórna-kötő hely (ridősemé binding slte - ESS) megváltoztatását; a gén példányszámának megnövelését a genomban vagy plszmldok különböző példányszámban történő bevitelével; a gén transzkripciójánál és/vagy a géntermékhez vezető transzlációnál szerepet gátsző fehérjék (például szabályozó fehérjék, szuppresszorok, fokosok, transzkripoíbs aktivátorok és hasonlók) módosítását. ide tartozik még minden egyéb, a technika mai szintjén a gének kifejeződésének deregulációjához vezető lehetőség, mint például sntiszenz oligonnkleotidők alkalmazása vagy represszor fehérjék, blokkolása. A dereguláció jelenthet a gének kódoló régióiban történő változtat ásókat is, amelyek például a gén termék, feedbacfc gátlásának megszüntetéséhez vagy a géntermek nagyobb vagy kisebb specifikus aktivitásához vezetnek.

Ezenkívül a találmány szerint előnyösek az enzimek olyan géntechnológiai változtatásai, amelyek a pántoténsav prekursorainak lebomlását és/vagy a pantoténsav koenzim A-vá történő átalakulását befolyásoljak. Ilyen enzimeket kódoló génekre példák; aisD, avt'A, ilvS,. ansB, coaA, coaX és egyebek. Ez a felsorolás szemléltetésül szolgál, nem jelenti az: oltalmi kör korlátozását. 77.ZÖ3/SS ♦ ** • *** * ; * χ ·» * φ « » **♦ i* « * *«»* X * _ö5xx _β> * »** ** **^χχ

Továbbá előnyösek olyan géntechhikaí változtatások, amelyek ko~ faktorok (például metilén-tetrahidrofolát, redozekvivalensek; hozzáférhetőségét a pantoténsav termeléshez optimális mennyiségben biztosítják.

Előnyösen β-alanin már olyan megemelt koncentrációban áll rendelkezésre a sejtekben - ellentétben a, genetikailag megfelelően nem módosított szervezetekkel hogy azt prekurzorként nem szükséges a tápközeghez adagolni, mint ahogyan, például az EB-úé 0 5:90 857 számú szabadalmi iratban szükséges. Előnyösek olyan mikroorganizmusok, amelyeknek pántoténsav (pan) és/vagy ízoleucin-valín (ilvj bioszintézis útvonalak. és/vagy aszpartát-a-dekarboxiláz (panCj ezimjük deregnlált. További előny, ha a mikroorganizmusok ketopantoát-reduktáz (psnS) enzimje túlzottan kifejezett.

A találmány szerint előny továbbá, ha adott esetben a koenzim A szintéziséhez szükséges coaA gén aktivitása lecsökkenteti vagy (például Bacillus fajoknál) teljesen ki van kapcsolva. Bscíllus fajok ugyanis a ooaA mellett egy további gént is tartalmaznak ehhez az enzimes funkcióhoz (ooak), Ennek a coaX génnek vagy a megfelelő enzimnek. az aktivitása is megváltoztatható, előnyösen csökkenthető vagy akár deletá.Iható, amennyiben coaA még elegendő, bár szintén csökkent enzimaktivitást mutat, azaz a coaA enzimakbivitás nem szűnt meg teljesen. A különböző gének túlzott kifejezése mellett ezen gének promoter régióinak olyan genetikai manipulációja is előnyös lehet, amely a géntermék túlA találmány egy megvalösitásí formájában a mellékletben (PÜT/ÜS 0025993 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés) leírt

77.2S3/8K **

X * >**

...., baktériumtörzseket, mint például a Baoillus subtilis PA82< jelűt és/vagy ennek származékait alkalmazzuk. Egy további megvalósítási formában a mellékletben (ŐS €0/262,995: sorozatszámü szabadalmi bejelentés) leirt Bucii!us suhíiiís PA668 törzset alkalmazzuk a találmány szerinti eljárásban. A PA824 és PA668 törzseket a következők szerint állltottűk elő;

A trpC2 (?rp~5 genotípnsű BaciLIus subtiiis 168 (Marburcj törzs, &TCC €051) törzsből kiindulva a Trp” merhet (Bacillns subfilis W23 vad törzsből) fcrsnszdukeiójavai hoztuk létre a PY79 törzset. A PY79 törzsbe klasszikus géntechnikai módszerekkel [Harwood and Cutting, Molecuiar Bioiogicai methods fór Bucíllus, John Wíley and Sons, Chiohester, Angisod ClüBöjj ÁpanB és ApanEÍ mutációkat vittünk be.

Az eredményül kapott törzset a Baciüus suhtííis PA221 törzs genomiálís DWS-ével (genotípus P^gparECD, trpC2 (Trp“)) és a Baoíllus subtiüs P&303 törzs genomiálís SDS-ével (genotípus B^spSüEl) transzformáltuk.. Az eredményül kapott 9A327 jelű törzs genotípusa B₂gpanBCD és P^epanSl és fríptofán auxotrőf ÍTrp”) . A Bacillas subtilis PA327 törzzsel 10 ml-es tenyészetben S¥Y tápközegben (25 g/1 Difco borjűhűs infúziós leves, 5 g/i öífco élesztőkívonat, 5 g/1 ha-glutamát, 2,7 g/1 ammőnium--szulfát '740 ml-re viszel feltöltve, autoklávozva, majd hozzáadva 200 ml 1 M kálium-feazfátot, pH 7,0 és 60 ml 50%-os steril giükőzöidatot), amelyet 5 g/1 β-alaninnal és 5 g/1 a-kefcoizovaleráttal egészítettünk ki, 3,0 g/1 pantoténssv títert értünk el (24 óra alatt).

A Beeillus subtiils PA221 törzset (genotípus PjgpanBCö, trpC2 (Irp”) 1 á következők szerint állítottuk elő;.

77.2S3/BE

Klasszikus géntechnikai módszerekkel, az A. coli-bői szá.OTa~ zó panBCD opecon szekvencia információja segítségével [Markel et ai_:., FSMS Microbioi. Lett. 143, 247-2.52 (1995)] egy Lacii les sűbtílis SP27S plazmiö könyvtárból kiindulva klónoztunk Lscii.ivs panBCD-t. A klónozáshoz az £„ coli SM4062 (bir^tö) törzset és azt az információt .használtuk fel, hogy a Sscíiius operon a bizA gén közelében helyezkedik el. A. panBGD operont !.. coii-ban replikálódní képes plazmádba vittük be. A panBCD operon kifejeződésének javítása céljából a Lacilius sabtilis tág Síül (£bs) erős, konstitutív promötereít alkalmaztuk és a penB gén előtti tiboszómakötő helyet (EBS-fi mesterséges RBS-sei helyettesítettük. A. plazmádon a llspanBCD kazetta elé a Lacii.) us-ban a natív por3 génhez képest közvetlenül üpstream elhelyezkedd DNS fragmentumot lignitünk. Ezt a piazmidot transzformáltuk a Lacilius subtiiis RL~1 törzsbe (a Lseillus sabtliis 168 (Marburg törzs, ATCC 6051 trpC2 íTrp) ) klasszikus mvtagenezísseX létrehozott származékába· és a psuBCD operont homológ rekombinációval PgspanBCD operonra cseréltük.. Az. eredményül kapott törzs jele PA221 és genotípusa. PzepanBCD, frpC2 (TrpJ . A Laciiina suötiiis BA221 törzzsel 10 ml-es tenyészetben, 5 g/1 p-alanínnai és 5 g/1. u-fcetoizovaieráttai kiegészített SVY tápközegben 5,92 g/1 pántoténsav titert értünk el (24 óra alatti,

A Bacliiss subtflis PA303 törzs (genotípus f₂<panSl) elkészítését az alábbiakban ismertetjük;

Az A. coll panE génszekvencía segítségévei a Ssciiins panE szekvenciát hasonlóan klónoztuk. Kiderült, hogy B. subái.) ís~ben az E. coli panS génjének: két homológja létezik, amelyeknek jelö7 7.2/33 SZ * * « *** «· ' « Φ* '·*· lése panbl és ponti, Deléolós analízissel kimutattak, hogy a panBl 90%-ban felelős a pantoténsav termelésért, míg a panEl gén deiéeíojának nem volt szignifikáns hatása a pantoténsav termelésre. Itt is a panBCD operon kiönözéséhez hasonlóan a promotart az erős, konstitutív Pgt promóterrel helyettesítettük és a panSl gén előtti ríbeszórna-kötő helyet mesterséges RBS-re cseréltük, & PgspanEl. fragmentumot egy vektorba klónoztuk, amely olyan kialakításé volt, hogy a PsspanBl fragmentum a Baoíllus subfilis genom jában az eredeti panfíl iőkusz helyére be tudott épülni. A transzformáció és homológ rekombináció után kapott törzs jele Bá.303 és genotípusa FespanSl, Á Saoilíss subtilía 9A303 törzzsel 10 ml-es tenyészetben, S g/1 β-alaninnal és 5 g/i a-ketoizovaleráttai kiegészített SVY tápközegfoen 1,66 g/1 pantoténsav titert értünk el (29 óra alatt).

A további törzsösszeállitás a PA32? törzsnek olyan plazmiddal való transzformációjával történt, amely tartalmazta a Pzgh-hrBNC operont és a spectínomycin markor gént. A Pa^tlvBNC operon beépült az amyü lőkaszrs, amelyet BCR-rei bizonyítottunk, Sgy transzformánst PA340 (genotípus FggpanBCD, ÉaspanEl, P₂«iXvS^C, speoB, ferpC2 (TrpH jelöléssel láttunk el. A Bacillus subtills FA340 törzzsel 10 ml-es tenyészetben, csupán 5 g/1 β-aianínnal kiegészített SVY tápközegben 3,6 g/1 pantoténsav tatért értünk el (24 őrs alatt). 10 ml-es tenyészetben 5 g/1 β-alanínnal és 5 g/1 o-ketoizovaleráttal kiegészített SVY tápközegben 4,1 g/1 pantoténsav titert értünk el (24 óra alatt).

.A továbbiakban a PA340 törzsbe deregulált ilvD kazettát vittünk be. Ehhez a PA340 törzset egy olyan plazmáddal transz7 7.2 V; /SS

1.3 , .ί ·>* formáltuk, amely as ilvD gént a p_2e promót-er kontrollja alatt# mesterséges R8S2~vel tartalmazta. Ennél a P₂._g. ilvD gént homológ rekombinációval az eredeti iivD lókuszra ép i wttük be. Az eredményül kapott PA374 törzs genotípusa PggpenBÜD, FsgpanEi, P^gilvBEC,, PggilvD specR éa trpC2 (Trp} . A öaciiius subtilis PA374 törzzsel 10 ml-es tenyészetben, csupán 5 g/1 p-alaninnal kiegészített SVY tápközegben 2,99 g/i pantoténsav titért értünk ei (24 Óra alatt).

Ahhoz, hogy a PA374 törzzsel jl-alanín adagolás nélkül termeltessünk panfoténsavat, a törzsbe az aszpartát-,a-dekarboxíiázt kódoló panD génből vittünk, be további példányokat. Ehhez a FA374, törzset a PA401 törzs kromoszómalis WS-ével transzformáltuk. Tetracikiinre végzett szelekcióval kaptuk a pA377 jelű törzset. Az eredményül kapott FA377 törzs genotípusa P^psoBCD, B^gpenEl, FjgiivBRC, PggilvD specR, tetR és trpC2 (Trp^-; < A Baoillus sübfcíils PA374 törzzsel 10 ml-es tenyészetben, prekurzor adagolása nélkül SVY tápközegben 1,31 g/1 pantoténsav titért értünk el (24 óra alatt) .A Saeíllus subtilis FA481 törzs előállítása a következők szerint történt:

A Saciilus subtllis psanD gént a psnBCB operönfoőí egy tetraciklín markor gént tartalmazó vektorba klónoztuk. A panD gén elé a promötert és egy fentiekben leírt mesterséges RBS-t klónoztunk. Restrikciós enzimes emésztéssel a tetracíkiin markor gént és a P^spanD gént tartalmazó fragmentumot készítettünk. Ezt a fragmentumot újra ligáitok és a fent már leírt 2A222 törzsbe transzformáltuk. Ezáltal a fragmentum beépült a PA221 törzs «9V *** * ♦ ⁴ * «» •fc»**

7?,2éZ/SE:

$ΐνχ. * < » * * .

Λ '.·.· Λ ' Λ ΦΦ - X ' - * *** _χ ***>. χ^Χ χν** V*** genomjába, Az eredményül kapott PA4Ö1 törzs genotípusa PgspamBCD, E’ztpanb, tetR és trpC2 (Trp~) .. A Baciiíns subtíiis RA401 törzzsel 10 ml-es tenyészetben, 5 g/1 a-ketoizovaieráttal. kiegészített

SVY tápközegben 0,3 g/1 pantoténsav títert értünk el (24 óra alatt) „ 10 ml-es tenyészetben, 5 g/.l D~pantoáttai és lö g/1. 1·-aszpartátfal kiegészített SVY tápközegben 2,2 g/1 pantoténsav títert értünk el. (24 óra alatt) .

A RA37? törzsből kiindulva a RT73 törzs kromoszómális DBSévei történt transzformáéióval egy triptofán prototróf törzset hoztunk létre. Ez a RA824 jelű törzs a P₂gpanBCS, P^gpsnEl., PggilvWC, Bsgilvö specR, tetR és Trp genotípussal rendelkezik. A Baciiius subtíiis 2Λ824 törzzsel 10 mí-es tenyészetben, prekurzor adagolása nélkül SVY tápközegben 4,9 g/1 pantoténsav títert értünk el (4 8 óra alatt), összehasonlításként a PA377 törzzsel 3,0 g/l-t értünk el 48 óra alatt. A törzsek pontos öszszeállitása kivehető a PCT/US 0025993 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés mellékletéből.

A	RMS8 törzs	előállíta	sát az alább	rabban írjuk le;
A	Ba őri Ina pár	i3 gént a	vad típusú /;	:srBCD operonből klónoztuk
és oly,	an vektorba	inszertál	tűk, amely *	3gy kloramfenikoi rezisz-
tencia	gén mellett	a B, sut	ítiiis vpr Is	íkuszának szekvenciáit is
tartair	Eiazta. Az el-	:ős konst;	ttűtív R2g p	•romót ért a panB gén 5* -
végére	vezettük be	. A Pzspaz	;B gént és a	kiéramf©η 1 tol rez i s z ten -
cia ma	rker gént,	valamint	Sa ci 11 as su	biliis ypr szekvenciákat

tartalmazó fragmentumot restrikciós enzimes emésztéssel kapóul meg. Az izolált fragmentumot újra ligáituk és ezzel transzformál tufc a PA824 törzset. Az igy kapott PA6S8 jelű törzs genotipu. 2«/3Z * ?·*♦* <···* * φ ΛΦ» Φ* * X

’.ζ 'ú' -sa Py^acBCö, P_3:SpanEX, PggíivBdÜ, 'Pg^ilvb, PjgpunB, specR, CmR és Trp/ PA668 két telepét izoláltuk és az egyiket PX.668-2A, a másikat PA668-24 jelzéssel láttuk el. A Sacílius subtiXis PASS8-2A törzzsel 10 ml-es tenyészetben, prekurzor adagolása nélkül SVY tápközegben 1,5 g/1 pantoténsav titert értőnk el 48 éra alatt. 10 g/i L-aszpartáttal kiegészített 10 ml-es tenyészetekben 5 g/i pantoténsav titert értünk el. A S. söbéílis PA66B-24 törzzsel 10 ml-es tenyészetben, prekurzor adagolása nélkül SVi tápközegben 1,8 g/i pantoténsav titert értünk el 48 éra alatt. 10 g/i b-aszpartáttsl kiegészített 10 ml-es tenyészetekben 4,9 g/i pántokénsav titert értünk el, A törzsek pontos összeállítása kivehető a PCT/US 0025993 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés és az US 60/262,995 sorozatszámú szabadalmi bejelentés mellékletéből.

A fent leírt PA377 törzzsel glüköz-iimitait fermentációban, SVY fcápközegben (25 g/1. Difco borjúhús infúziós leves, 5 g/I

Difco élesztokivonat, 5 g/i triptofán, 5 g/1 Na-giutamát, 2 g/i (NH^gSOt, 10 g/1 KH₂PÖ₄, 20 g/1 K₂HP0o Q> 1· g/1 CaCl_a, 1 g/1 dgSCg, 1 g/i Na-citrát, 0,01 g/1 FeSüh x 7BzO és 1 ml nyomelem oldat, amelynek Összetétele a következő: 0,15 g Na₂MoCü x 2.H₂O,

2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCl₂ x 8^:Hgö> 0,25 g CuSO<; x SbgO, 1,6 g MnCl^ x 4HjO, 0,3 g 2nSCu χ THtö vízzel 1 literre feltöltve) 10 literes léptékben, a glükóz oldat folyamatos rátápiáiásával 36 őrá (48 óra) alatt a fermentlében 18-19 g/1 (22-25 g/i) pantoténsav koncentrációkat értünk el.

PA824 - a PA377 triptofán prototróf származéka - glükőzXimitált fermentációjánál élesztőkívonatos tápközegben (10 g/1

Difco ólesatőfcívonat, 5 g/i Na-glntamát, 8 g/i (WhjzSC/í· 70' g/1

T?.2«3./BE «♦-> * X * * ♦ '* *- * Φ « « νν« ♦ ♦ ·* V <♦*» ♦ « « * #< * «*« V* »**»

Kü₂Pö₄, 20 g/l &2.HPÖ4, 0,1 g/l Caei₂, 1 g/l ^:MgSŰ₄, 1 g/l Na -extrát, 0,01 g/l PeSÖ4 x 7H'2^;Ö és 1 ml a fent leírt nyomelem oldatbői) 10 literes léptékben, glükóz oldat folyamatos rátápiálása mellett 36, 42 és 72 éra után rendre á következő pantoténsav koncentrációkat értők el: 20 g/l, 23 g/l és 36 g/l.

További tápközeg optimalizálással, glükóz-limitált fermentáóiéban, lő g/l Difoo élesztőkivonat, 10 g/l N2 Amíne A (Quest International GmbH, Srftstadt )lő g/l Na-giutamát, 4 g/l (HH4)₂GQ_4í M g/l Wö<, 2ő g/l KgHFOá, 0,1 g/l CaCI₂, 1 g/l MgStb, 1 g/l Na-eítrát, ü, öl g/l FeSO^ x 7Hgő és a fent leírt nyomelem oldatból 1 ml összetételt tápközegben, 10 literes léptékben, glükóz oldat folyamatos rátáplálása mellett 36 óra (48 őre) után 37 g./l (<8 g/l) pantoténsav koncentrációt értünk el a.

férméntlében.

A fermentiében a pantoténsav koncentráció további emelése lehetséges további tápközeg optimalizálással, a fermentáció: idejének növelésével, az eljárás és a törzsek javításával, valamint az egyes lépések kombinálásával, Ily módon a fant leírt pantoténsav koncentrációk olyan törzsek fermentálásával is elérhetők, amelyek a fent leírt 6A824 törzsnek származékai.. Származékok készíthetők klasszikus törzsjavítással, valamint további géníechnikaí manipulációkkal., A tápközeg, a törzs és a fermentációs eljárás fejlesztésével a fermentiében akár 40, 45, 5ő, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 és >90 g/l pantoténsav tifer is elérhető.

A találmány szerinti eljárás lényeges előnye, hogy a fermentációt olyan táp közegben végezzük, amely a kiindulási anyagként legalább egy szénforráson és nítregénforráson kívül nem tártál77.ZS3/SE

máz prekurzorf.. Azaz D-pantoténsáv bloszíntézíss nem függ további prekurzorok adagolásától. Ilyen prekurzorok alatt a találmány szerint olyan anyagokat értünk, mint például β-alanin és/vagy b-aszpartst és/vagy L-valin és/vagy g-ketolzovalerát és/vagy ezek kombinációja., A találmány szerinti eljárás egy előnyben részesített változatában a D-pantoténsavat termelő szervezettel olyan tápközegben fermentálunk, amely szénforrást és nitrogénforrást tartalmaz, szabad β-alanint és/vagy β-slanin. sóját azonban nem és azt a fermentáció lefutása alatt sem adagolunk hozzá. Azaz fermentlére vonatkoztatva legalább 10 g/1, előnyösen legalább 20 g/1, különösen előnyösen legalább 40 g/i, még előnyösebben legalább Sö g/1 és legelőnyösebben legalább 70 g/1 D-pantoténsav előállításához a találmány szerint nem. szükséges szabad β-alanin és/vagy β-alanin sójának adagolása, A találmány szerinti eljárás fontos gazdasági előnye a prekurzorok adagolásától független előállítás szemben az eddig ismert eljárásokkal, mivel számos prekurzor nagyon drága.

β-a.Lenin, és/vagy β-alanin sójának adagolása ugyanakkor a találmány szarInt nem kizárt, amennyiben ennek következtében a B-pantoténsav hozam β-alanín és/vagy β-alanín sójának adagolásával tovább javítható. Feltételezve például, hogy a pantoténsav minden prekarzora kielégítő mennyiségben rendelkezésre áll, csupán a panD gén aktivitása korlátozza a pantoténsav termelést, így a pantoténsav hozam például további 50%-kal növelhető szabad 8-alanin és/vagy β-aianin sójának adagolásával.

A találmány egy előnyben részesített megválásitési formájában a tápközegben akár 20 g/1 szabad β-alanín és/vagy β-alanin 77.ZS1/EE <· φ χ χφφ * « Φ Φ * χ* ♦ Φ * * »« Φ φ φφ φ* φ Χ-Χ-.χ sója a pantoténsav hozamot több, mint 50%-kal növelheti, Előnyben részesítjük körülbelül 15 g/i szabad β-alanin és/vagy β-alanín sójának adagolását a tápközeghez.

Az előzőekben megnevezett szervezetek fermentációjához találmány szerint alkalmas szénforrásokra példák a cukrok, úgymint keményítő hídrólízsfcumok (mono-, di- és oíigoszaoharídok), előnyösen glükóz vagy szacharóz valamint répa- vagy nyersemkormelaszok, fehérjék, fehérje hídrólizátumok, szőjalíszt, kukoriea~duzzasztö víz, zsírok, szabad zsírsavak, befejezett fermentációból visszavezetett sejttömeg vagy annak hidrolizátuma, valamint élesztőkivonat, Ez a felsorolás nem jelenti a találmány oltalmi körének korlátozását,

A találmány szerinti eljárás előnye továbbá, hogy a teljes cukortartalmat a fermentáció: végéig minimumra redukáljuk, mivel ez ellenkező esetben a fermentié későbbi szárítását és/vagy fórmulázását ragacsossága miatt megnehezíti. Ez a találmány szerint ágy érhető: el, hogy a szénforrás kimerülése után (batoh fermentáció esetén) vagy miután a szénforrás adagolást megszakítottuk (fed-hatch vagy ismételt fed-batoh üzemmódnál), a fermentációt még egy ideig tovább vezetjük és/vagy úgy szabályozzuk, hogy a szénforrás koncentrációja közel nullára csökkenjen (fed-batoh, ismételt fed-batoh vagy folytonos fermentációnál), Ez a találmány szerint úgy történik, hogy a szénforrás adagolás megszüntetését követően, a fermentációt addig folytatjuk, amíg a férmént~ lében az oldott oxigén koncentráció (p0₂) a telítési értéknek legalább 80%-át, előnyösen 9Q%~át és különösen előnyösen 95%-át el nem éri.

~7.2S3/S£

Példák a találmány szerint alkalmas nitrogénforrásra az ammónia, ammónium-szulf át, karoamid, fehérjék, fehérje hidrolizátumok vagy élesztők!vonat, Ez a felsorolás sá em jelenti a találmány oltalmi körének korlátozását.

A fermentációs tápközeg tartalmas továbbá ásványi sókat és/vagy nyomelemeket, úgymint aminosavakat és vitaminokat, Számos fermentációs tápközeg ismert és a szakember számára hozzáférhető, A fermentációs tápközegnek alkalmas D-pantotensav termeié szervezettel (a szakember száméra ismert sejtsürűséggai) történő beoltása után, adott esetben habzásgátló adagolása mellett, történik a szervezet tenyésztése, A tápközeg pH értékének adott esetben szükséges szabályozása végezhető különböző szervetlen vagy szerves lúgokkal vagy savakkal, például NaCH-dal, KQH~dal, azímöniával, fősz fór savval, kénsavvai, sósavval, hangyasavval, borostyánkösavval, cítromsavval vagy hasonlóval,

A fermentáció során bevitt puffer-rendszer alapién - amely az előbbiek szerint például NaOH, KOH, ammónia, foszforsav, kénsav, sósav, hangyasav, borostyánkősav, citromsav vagy hasonló lehet - a keletkezett D~pantoténsav a bevitt puffer-rendszernek megfelelő sőjkj formájában lesz jelen, hívei itt a D-pantoténeav egyértékö kationokkal képzett sói különösen előnytelenek, a fermentlevet a találmány szerint nanoszűréssel dolgozzuk fel. Ehhez először a képződött D-pantotenáthos a találmány szerint többértékű kationok sóit adjak, amelynek következtében a ö-pantoténsav többértékű sói alakulnak ki, A többértékű kationokat tartalmazó sók hozzáadása a találmány szerint történhet szilárd formában vagy vizes oldatként a fermentáció alatt, előnyösen a. végén vagy

77,263/SE ο

az a) lépést a fermentációt követően. Sgy többértékü kation sóját tartalmazó vizes oldat adagolása történhet például folyamé-LO *

Továbbá a találmány szerinti eljárásban a nanoszűrés elé beiktatott lépésben, tehát a ej lépésben, elvégezhető a sejttömeg vagy egyéb, az oldatból kivált komponensek elválasztása a fermentlétöl. Itt az elválasztás történhet dekantálássai vagy membránszűréssel, előnyösen ultraszűréssel. A találmány egy megválósírási formájában a memhránszűrést diaszőrésfcént végezzük. A taiáimány szerint itt is megtörténhet a többértékű kationokat tartalmazó sók hozzáadása szilárd formában vagy oldatként a D-pantotenát tartalmú oldat membránszúrése alatt: vagy azt követően. Ennél a többértékű kationokat tartalmazó oldat hozzáadása például folyamatosan történik.

A sejttömeg és/vagy egyéb, az oldatból kivált komponensek mint például nehezen oldódó vagy oldhatatlan foszfátsók illetve szuifátsök, enzimek, hormonok, fehérjék, antibiotikumok, pirogénak, vírusok, polts z achar.i doh, kolloidok, tenzidek, pesztleídek vagy egyéb szerves anyagok - elválasztása a nehézségi erő, centrifugáiís erő:, nyomás vagy vákuum kihasználásával történik. Ilyen eljárásokra példák többek között, a defeantáiás, elutriáciö, rostálás, iégrétegezés, szortírozás, szűrés, dialízis, sze~ dimentáoió, mikroszűrés, ultraszűrés, flotácíő, hahfrakoionálás, süllyedés-lebegéses feldolgozás, feltisztulás, centrífugálás és leválasztás. Összefoglalóan membránszűrés fogalom alatt értünk olyan membrán-elválászfcási műveleteket, ahol a betáplálás és a permeátum oldal között nyomáskülönbség áll fenn, mint mífero77.2 « AS /1 φ**

X «** φ

X Φ Φ «φ φφφ* szűrést és alttaszűrést. Az eljárások ezekben az esetekben az elválasztási határokban különböznek egymástól. így az uitraszűrésnéi például a kizárási határ (out off) a mikroszaréstől eltérően nem a részecskeméretre vonatkozik, hanem a mőitömeore, amely körülbelül 10' és 2 x 10° közé esik. Oltraszűrésnei a szűrlet (germeátum) mellett úgynevezett koncentrátum (retentátum) keletkezik.

Közepes vagy nagymolekulájú, szilárd vagy feldúsított vagy elszegényített oldott anyagok elválasztásához előnyösen asszímetrikusan struktúráit, porózus membránokat használunk. A találmány szerint felhasznált membránok előnyben részesített megvalósításnál egy, a tulajdonképpeni anyagéiválasztást végző él választó rétegből és egy vagy több, az elválasztó réteget hordozó olyan támasztó rétegből épülnek, fel, amely az elválasztó rétegnél nagyobb pőrasméretü. Mind az elválasztó réteg, mind a támasztó réteg készülhet szerves vagy szervetlen polimerekből, kerámiából, fémből vagy szénből, és a reákelőéléggyel szemben valamint az eljárás hőmérsékletén stabilnak kell lennie. A találmány oltalmi körét nem korlátozó példákat mutatunk be erre vonatkozóan az 1, táblázatban..

A membránok lehetnek tömlő, cső, kapilláris, üreges szál vagy lapos membrán alakúak, ismert módon lapos, csöves, többcsatornás elemekbe:, kapilláris vagy tekercselt, modulokba beépítettek:. Az optimális transzmembrán nyomások a retentátum és a permaátnm között lényegében a membráogőrüsok átmérőjétől illetve az elválasztási határtól (molekulatömeg egységben megadva), a membrán mechanikai stabilitásától és a membrán fajtájától függően 1

77.2S3/3S *♦«» ♦ Χ*Φ* Φ* XX

Λ φ X Φ Φ Φ

Φ X Φ Φ*Χ «*Φ * * φ χφφφ φ X ♦ * *Φ X «♦* Φ«*« és 40 bar közöttiek, Nagyobb transzmembrán nyomások nagyobb permeátum áramokhoz vezetnek. Ennélfogva, abban az esetben, ha a rátáglálás (a feldolgozandó oldat felvitele) tói nagy nyomással történik, a transzmembrán nyomás a permeátum nyomásának megemelésével h o z z ái g a s í t ha t ő«

Az Üzemi hőmérséklet a termék éa a membrán stabilitásától függ. Körülbelül 20 és 90 között, előnyösen 40 és Ό °C között van, Magasabb hőmérsékletek nagyobb permeátum. áramokhoz vezetnek, Alkalmazhatok például a 2. táblázat szerinti membránok, amelyek azonban nem jelentik a találmány oltalmi körének korlátozását .

A sejtek elválasztása á találmány szerint előnyösen a membránszűrésnek egy különleges formájával, nevezetesen diaszűréssel történhet, A diaszűrés szakaszosan végezhető, ahol a D-pantoténsav többértékű sóját tartalmazó oldatot egy tartályból, pumpából és egy vagy több membránmodulböi álló rendszeren keresztül keringetjük, és a membránmodulokban úgy állítjuk be a nyomást, hogy a permeátum átjusson. Folyamatosan vagy bizonyos időközönként vizet vagy -· az elválasztandó terméket nem vagy csekély koncentráciőfean tartalmazó ~ vizes oldatot adunk hozzá az elválasztó keringetésbe történő hozzáadás időpontjaként» A vizes oldat a találmány szerint tartalmazhatja többértékö kationok sóit, mint például Ca- vagy Mg-halogenideket vagy ezek kombinációját, előnyösen Ca- és/vagy Mg-klorídot.

A sejteiválasztás diaszüréssel a találmány szerint történhet folyamatosan is, ahol előnyösen több membránmodul, vagy egy vagy több membránmodult tartalmazó pumpáé keringető rendszer sorba ruzeí/rs

...» ,

Φ *φ φφφφ *« φ *«♦ φ*χ φ * * * X φ** «φ «X* van kötve. A membránmodulok vagy a pumpáé keringető rendszerek előtt, közben vagy után vizet vagy ·- az elválasztandó terméket nem vagy csekély koncentrációban tartalmazö - vizes oldatot adunk hozzá az elválasztó keringetésbe történő hozzáadás helyeként, ahol a szakaszos változathoz hasonlóan, az oldat többértékö kationok sóit, mint például Ca- vagy Mg-halogenideket vagy ezek kombinációját, előnyösen Ca- és/vagy £4g~kloridot tartalmazhat.

A találmány szerint az ultraszürés vagy diaszürés elvégezhető közvetlenül a termettlével vagy a fermenfclé valamilyen kezelése, például oentrifügáiása, dekantálasa vagy hasonló előzetes lépés után.

Amennyiben megtörténik a sejttömeg vagy az oldatból kivált komponensek találmány szerinti elválasztása, a többértékö kationokat tartalmazó sók hozzáadása elvégezhető a találmány szerinti eljárás b} lépése szerint, az ultraszürés. vagy diaszürés előtt, közben vagy után. A találmány szerinti, eljárás változataiban többértékö kation sójaként adható Ca- és/vagy Hg-klorid, -nitrát, -hidroxid, -formiát, -acetát, -propionát, -glioinat és/vagy -laktál. Itt többértékö kationként például a Ca'^ adagolható 0, 0 5-50 mól üa²\/mói D-pantotenát, előnyösen 0,2-2 mól Ca²''/mől D~panfe otarát Mennyiségben,

A találmány szerinti eljárás c) lépésében azután a D-pantoténsav többértékö sóit tartalmazó oldatot nanoszűréssel dolgozzuk fel, amelynek során a D-pantoténsav többértékn sói feldúsulnak és egyidejűleg .csökken a nemkívánatos egyértékű ionok, előnyösen a kationok, mint például ammőnium-, nátrium- vagy kálium-ionok mennyisége. A találmány szerinti eljárást az jellem t4»4 *4' xX «» 4:4 :« x . .

* 4 * 4 * 4 ·« * « 444 444 *

». **»»4: ·»* 4 4

X. »4.4. «4 »444 zi, hogy az egyértékö kationok, előnyösen a.z ammóniáim-·, nátriumés/vagy káli ura-ionok mennyisége az oldatban kevesebb, mint 5 g/ky oldat koncentrációra csökken.

A találmány szerinti eljárás felölel minden iparilag rendelkezésre álló nanoszűrő rendszert. Az elválasztás előnyösen aszimmetrikusan struktúráit porózus membránokon történik. A találmány szerinti eljárás egy előnyben részesített változatában ehhez olyan membránokat használunk fel, amelyek egy, a tulajdonképpeni snyagelválasztást végző elválasztó rétegből és egy- vagy többrétegű, az elválasztó réteget tartó, annál nagyobb pőrusméretű támasztó rétegből épülnek fel. Mind az elválasztó réteg, mind a támasztó réteg készülhet szerves polimerekből, kerámiából, fémből vagy szénből, és a reákelőéléggyel szemben valamint az eljárás hőmérsékletén stabilnak keli lennie. Az elválasztó: réteghez előnyben részesített anyagok poliamid, poliimid vagy pofisgek rendelkezhetnek pozitiv vágj is. Aníonosan működésbe hozott

-membránra egy példa Lálmány oltalmi körét membránra <

A membránok lehetnek tömlő, eső, kapilláris, üreges szál vagy lapos membrán alakúak, ismert módon lapos, csöves, többcsatornás elemekbe, kapilláris vagy tekercselt modulokba beéoítet-

u Az el válasz'	tő rétegek ·
felületi tölt	éssel is.
í -memb r án r a egy	példa a DSS
lálmánv oltaim	1 körét nem

A találmány szerinti eljárás előnyben részesített változataiban a nanoszürésnéi a c) lépésben a membránon keresztül. 5-100 bar, előnyösen 2Ö-8© bar és különösen előnyösen 40-7S bar nyoTj.zeuBE máskülönbséget·, hozunk létre. Az üzemi hőmérséklet előnyösen 20 és 30 °C közötti, még előnyösebben 38 és 68 'C közötti. A nsnoszűrés: végezhető továbbá a szakemberek által ismert módon egy vagy több lépésben, folyamatosan vagy szakaszosan.

Előnyben részesített megvalósítási formában egy vagy több nanoszűro lépés előtt többértékű kationokat tartalmazó sót adagolunk szilárd formában vagy vizes oldatként. A találmány szerinti eljárásban tóbbértékü kation sójaként Ca- és/vagy Mgkloridöt, -nitrátot, -hidrozldot_f -formiatot, -scetátot, -propionátot, -giicínátot és/vagy -laktatót adagolunk. Itt többértékű kationként, például a Ca** adagolható 8,85-50 mól Ca/'Vmól D-pan~ totanát, előnyösen 0,2-2 mól Ca^'/mői D-pantotenát mennyiségben (a bekeverés utáni állapotra vonatkoztatva) . A találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy a többértékű kationokat tartalmazó sók hozzáadása - szilárd vagy vízben, oldott formában - előnyösen a fermentációs a) lépés végén vagy annak befejeztével vagy a sejtelválasztás: alatt vagy után történik. Ezenkívül a találmány szerint a többértékű kationokat tartalmazó sók hozzáadása előnyösen történhet a nanoszüréses lépések alatt. Továbbá a tőbbértékű kationokat tartalmazó vizes oldat adagolása végezhető folyamatosan,

A találmány egy további megvalósítási formájában a nanoszűrést megelőző egy vagy több eljárási lépésben különböző termékkoncentrációjú oldatok esnek ki, Ezek a nevezett oldatok nanoszűréssei tovább feldolgozhatok oly módon, hogy a nevezett oldatok a növekvő termékkoncentráció sorrendjében, egymás után következő nanoszüréses lépésekbe vezethetők.

C.ZS.s/SS

A találmány szerint az előzőekben leírt találmány szerinti eljárás során a nanoszürés réténtáturnában mindenekelőtt a pantoténsav többértékü sói dúséinak fel. A permeátum oldatban főleg az egyértékű ionok, anionos formában működő nanöszürő-membrán alkalmazásakor az egyértékű kationok dúsainak fel. Ilyenformán az egyértékű kationok, előnyösen az ammóniám-, nátrium- és/vagy kálium-ionok mennyisége az oloatban kevesebb, mint. 5 g/kg oldat koncentrációra csökkenthető. A találmány szerint a nanoszürés permeátuma vagy annak egy része visszavezethető a találmány szerinti eljárás a) fermentációs lépésébe. A permeátum vagy egy részének ez a visszavezetése folyamatosan történhet. Az előzőekben leírt, a nanoszüréshez kiegészítésként végzett eljárási lépések á többértékű sók formájában levő D-pantotenát előzetes töményítéaére vagy további koncentrálására szolgálnak.

A találmány szerint alkalmazott nanoszürés további előnye, hogy az egyértékű kationok csökkenése (a réténtstumbanj együtt járhat a retentátum térfogatának egyidejű csökkenésével. A D-pantotenát tartalmú fermentlé feldolgozása nanoszűréssel a tóményités követkertében lényegesen csökkentheti a szárítás energiaigényét..

A találmány szerinti eljárás egy előnyben részesített megvalósítási formájában a fsrmentlevet centrífugálássel és/vagy dekantálássai és/vagy ultraszűréssei megszabadítjuk a sejttömegtől. Az előnyösen 0,01-10 mól Ca~'/1 hígított oldat formájában előkészített, ö,Ö5~Sű mól Cs:^4-* ion/möl D-pantotenát ion, előnyösen 0,2-2 mól. Ca²⁺ ion/mői D-pantotenát ion hozzáadása után az így kapott oldatot egy nanoszürő modulba vezetjük be, A membrán

77.2δ3/SS két oldala közötti nyomáskülönbség körülbelül 5-100 bar, előnyösen körülbelül 20-80 bar és különösen előnyösen körülbelül 4Q-7Ö bar. A nanoszürés előtt vagy alatt Ca“'' iont tartalmazó vizes oldat vezethető a. membrán betáplálási oldalán átáramló oldathoz. A rétén tátim·; térfogata a kiindulási oldat 30-200%-a. Továbbá az egyértékű kationoknak körülbelül 5-99%-át, előnyösen 3ö-80%~át távolittuk ei.

Az előnyösen Ge-D-pantotenátot, Mg-D-pantofcenátot vagy ennek keverékét tartalmazó retentátúrnőt végül száritásnak és/vagy f orma lázásnak vetjük alá. A Ca-D-pantotenátot és/vagy Mg-D-pantotenátot tartalmazó oldat szárítása és/vagy formulázása ismert eljárásokkal - mint például porlasztva szárítással, porlasztva gramilaássál, örvénylő réteg szárítással, örvénylő réteg granuTálassal, dobszárítással vagy spin-flash szárítással. - történik (öllmann* s Enoyclopedia of Industrial Chemíst.ry 6^ ed, (1999), electronic relea.se, Kapítei „Orying of Solid Materials*]. A konvekciős szárításnál a belépő gáz hőmérséklete 100-280 °C, előnyösen 12Ö-21G °C<. A kilépő gaz hőmérséklete 50-180 °C, előnyösen 60-150 %. Kívánt részecskeméret-eloszlás és ehhez kapcsolod© termék tulajdonságok beállításához a finom: részecskék elválaszthatók és visszavezethetők. Továbbá a durva termék malomban megőrölhető és azután ugyanúgy visszavezethető.

A találmány szerinti eljárás előnye, hogy a nemkívánatos kationokat hatékonyan és közel teljesen eltávolítja, ugyanakkor térfogatcsökkenést eredményez, amely a következő eljárási lépéseket - különösen a szárítást és/vagy iormulazási - egyszerűsíti vagy hatékonyabbá teszi. Továbbá nem történik vagy csak csekély

7-7.263/3®

Λ Χ\ «ίΐΐ * Φ*«Χ *« » « « « X χ . X * **Χ *** *

X *»ΑΧ « Φ * *

Φχ. * #> ***♦ mértékben, -termék bomlás, ugyanakkor magas a termék hozama. Többértékű kationok oldatának hozzáadása, a fermentáció alatt vagy végén, vagy az ultraszűrés vagy diaszörés alatt vagy végén, vagy a nanoszűréses lépés közben és/vagy a permestum visszavezetése a fermentlébe a D-pantotenát többértékű, előnyösen kétértékű ionos - Ca vagy Mg - formájának hozama tovább nő.

A találmány szerint a korábban bemutatott eljárásokhoz képest előnyös a költséges feldolgozási lépések csökkentése, különösen a szerves oldószer felhasználásának elkerülése, ugyanakkor biológiailag értékes kívánt termék előállítása. Továbbá a találmány szerint lényegesen csökken a keletkező szennyvíz mennyisége. Ez további, költséges feldolgozó és ártalmat Tanító berendezések megtakarítását teszi lehetővé, A találmány szerinti eljárást előnyösen az jellemzi,, hogy egyszerűbb, zavarásokra kevésbé érzékeny, kevésbé időigényes, egyértelműen olcsóbb és ezáltal gazdaságilag kedvezőbb, mint a hagyományos eljárások.

Ez nem zárja ki azt, hogy a találmány szerinti eljárás változtatható. Az előzőekben elmagyarázott találmány szerinti eljárás kiegészíthető egy vagy több, a következőkben leirt eljárási lépéssel, amelyek a szakemberekre rábízhatok. A következő eljárási lépések és az eddig megnevezett eljárási lépések minden elképzelhető kombinációja a találmány oltalmi körébe tartozik.

ily módon a találmány szerinti eljárás eredményeképpen létrejött oldatok például falhevítéssei (sferilezéssei) vagy más módszerékkel, mint például pasztőrözéssel vagy sterilre szűréssel esirátlanithatők.

A találmány szerinti el.járás további változataiban a rétén

ΧΛ'φφ φ* X* * * * ' *5·* tátusi: szárítása és/vagy formuiázása előtt, e-1 végezhető a következő lépések közül legalább egy vagy többnek kombinációja, beleértve a biotömeg 11zlsét és/vagy elölését és/vagy a biotömeg elválasztását a fermehtlétöl és/vagy további pőtanyagofc hozzáadását és/vagy a. fermentié töményítését, előnyösen vízelvonással.

Szintén a találmány tárgyát képezi olyan eljárás, ahol a

biotömeg	ii zás	ét és/vagy előle	lsét még a	farméntá	ciős tápoldatbán
vagy a r	dotöms	jg fermentiétői	való elvál	.ásatását.	követően végez-
zük el. j	Ez tör	ténhet; például fe	ökezelésse	I, előny<	>sen 80-200 ~C-on
és/vagy		kezeléssel, e	iőnyősen 1	kénsavval.	vagy sósavval
és/vsgy	enzime	sseη, eIönyős en	lizozimma	,1. Az 1	. s elképzelhet ö,
hogy a	keletk	szett hiötomeg	erválaszta	sát közv	etlenür a manó-
szűréséé.	ΐ., azs	z az egyértékű	kationok fc	óbbért é ki	ire történő őse-

régével egyidejűleg végezzük el·.

A nanoszüréses feldőlgozásbői eredményül kapott oldat szárítás és/vagy formuiázás előtt megfelelő bepárlóban, például· esőfilmes bepárlóban, vékonyréteg bepárlóban vagy rotációs bepárióbán betöménylthető. ilyen bepárlókat például a G1G (4800 Attnang Puchheim, üstére ©lob)„ GtA Canzler (52303 Düren, Deutschland), Préssel (31103 Hildesheim., Deutschland) és Pitfcon (35.2:74 KirGhhain, Deutschiand) cégek gyártanak.

A végtermék színének jgyitása. érdekében elvégezhető egy kiegészítő szűrési lépés, amelyben az eljárás során kapott oldatokhoz aktivszenet adunk és ezeket a szuszpemziőkat végül leszűrjük, Másik lehetőség, hogy a fermentáció során kapott oldatokat aktívszenes ágyon vezetjük keresztül. Az itt alkalmazandó aktívszén tömege nem haladja meg az oldat tömegét és a szakember 77.ZS3/BE

Ο ’<'Κ rw' Uh

A * Χφ. X, ·,' V.C tudása és mérései határozzák meg. Ezek a. szűrések megköriryíthetők, ha a mindenkori oldathoz a szűrés előtt szokásos flokkulálészert. (például -a BASF AC íLuduígéhaien) által gyártott Sedipur CF 902-t vagy Sedipur CL 9őQ~at) adunk.

A találmány szerinti eljárás egy előnyben részesített megvalósítási formájában a fermentáció végterméket {a. fament levet} felhevitessei sterilezzük és azután centri.fugáiással, szűréssel„ últraszőréssel vagy dekantálással megszabadítjuh a sejttömegtől. A fermentlére vonatkoztatva Sö-iööO mg/kg, előnyösen 100-200 mg/kg hagyományos flokkulálöszer hozzáadását követően rövid aktivszen.es és homokos ágyon átszűrjük., hogy biotömegtől mentes, magas D-pantofénsav tartalmú oldatot kapjunk. Végül az igy feldolgozott. oldatot nanoszűréssel töményitjük.

Ennek az oldatnak ezt követő szárítása történhet például porlasztva szárítással. Bz végezhető egyenáramban, ellenáramban vagy vegyes áramban. A. porlasztáshoz bármilyen ismert porlasztó alkalmazható, főleg centrifugál porlasztó (porlasztó tárcsa), egyutas vagy kétutas fúvóba. Előnyben részesített szárítási körülmények 150-250 °C belépő hőmérséklet és 70-130 °C kilépő hőmérséklet. Lehet: azonban ennél alacsonyabb vagy magasabb hőmérsékleten is szárítani. Nagyon alacsony nedvességtartalom eléréséhez beiktatható még egy, örvénylő^ ágyas szárítási lépes.

A porlasztva szárítás elvégezhető a Niro és APV-Anhydro cégek (bopenhagen., Sánemark) által épített FSD- vagy SBD-száritőbán (FSDj floídized spray dryer - fiuidizálfc porlasztva száritő? S3D: spray bed dryer ~ porlasztó ágyas szárító), amelyek a porlasztva száritő és az örvénylő ágyas szárító kombinációi.

77. ZS.7/SS:

φφφφ φ φ» φφ

Φ * Φ X Φ X φ X » Φ»Φ φ«χ φ » χ *-*τ «< φ Φ X X

Φ« Φ χχ.χ ΦΦ *»*Φ

A porlasztva szárításnál adagolható az áramlást elősegítő segédanyag. Ezáltal csökkenthető a szárító falára történő kitapadás és különösen a finomszemcsés porok áramlási sajátságai javulnak. Áramlást javító segédanyagként főleg szilikátofc> sztearátok, foszfátok és kukorícakeményítŐ jöhetnek szoba.

A szárítás elvileg történhet egy porlasztóit örvénylő rétegben is, amely folyamatosan és szakaszosan is működtethető. Az oldat befüvása történhet a berendezés tetején (topspray), alulról (bottomspray) és oidairöl is (sídespray).

A találmány tárgyát képezi továbbá állati takarmányadalékként és/vagy állati takarmány-kiegészítőként alkalmazható készítmény, amely előállítható oly módon, hogy

á.) legalább egy olyan D-pantoténsav termelő szervezetet alkalmazunk, amelynek pantoténsav (pan) és/vagy izoieucin-valin (ilv) bioszintézís útvonala deregulált és fermentációval legalább 2 g/1 D-pantóténsav sőt termel tápfcozegben, ahol a tápközeghez 0-20 g/1 szabad β-alantot és/vagy β-alanin sőt adagolunk,

b) a képződött D-pantoténsavhoz többértékű kátionokat tartalmazó sokat adagolunk, amelynek következtében D-pantoténsav többérté kű sói kelet ke zne fc,

o) a D-pantoténsav tőbbértékű sóit tartalmazó oldatot nanoszűrössel dolgozzuk fel, ahol D-pantoténsav többértékü sói feIdusülnek és

d) a nanoszörés D-pantoténsav többértékü sóit tartalmazó retentátumát szárításnak és/vagy formuiázásnak vetjük alá.

A találmány egy megvalósítási formája olyan készítmény, amelynek előállításánál a c> lépésben a nanoszurés előtt megtör•m.zssvss tértik a s-ejttőmeg vagy az. oldatból kivált komponensek elválasztásai előnyösen membránszűréssel, különösen előnyösen ultrassüréssel és legelőnyösebben diaszüréssel. A találmány oltalmi körébe tartozik továbbá olyan készítmény, amelynek előállításánál a sejttömeg vagy as oldatból kivált komponensek elválasztása alatt vagy után {szilárd formában vagy vizes oldatként) töbfoértékü kationokat tartalmazó sókat adagolunk. A találmány szerint egy további megvalósítási formában. ezeket a sókat a nanoszürés alatt is adagolhatjuk.

A találmány szerinti készítményt továbbá az jellemzi, hogy D-pantoténsav sóit legalább 1-100 tömsgé-barp előnyösen 20-100%ban és különösen előnyösen legalább 50%-ban tartalmazza. A találmány szerinti készítmény a D-pantoténsav sóit kétértékű katlonos formában, előnyösen kalcium- és/vagy megnő sí um-Ö-pantotenátként tartalmazza. A találmány szerint előnyben részesítünk olyan készítményt, amely D-pantoténsav egyértékü kationokkal képzett sóit kevesebb, mint S g/kg koncentrációban tartalmazza.

A találmány szerint az előzőekben leírt eljárás segítségévei kalcium- és/vagy magnézlum-D-pantotenát tartalmú készítményt állítunk elő, amely megfelel egy takarmányadalókkal szemben támasztott követelményeknek. Ilyen elvárások például a találmány szerinti termék viszonylag magas D~pantotenát tartalma és a célszervezet számára könnyű emészthetősége valamint vitamin-hatás szempcntjábó1 biológiai értékessége.

A találmányt közelebbről megvilágítjuk a következő példákkal, amelyek azonban nem jelentik az oltalmi kör korlátozását.

7,2-53/SS #*« X β φ φ ** X Φφ>

1. példa:

Keverövei és gázbevexstővel, ellátott 14 literes lafooratóriussí ferjnentorbs a következő összstételé vizes fcápoidatot mértük he::

|,·.·.·.......	összetevő		Koncentráció [g/lj
	Élesztők!vonat	1	5
	Szőjaliszt		4 0
1	Na~öfutamát x H20		5
	Ammőniurt-s zul tát	í	«

Sterilé rés után a kővetkező steril tápközeg-· komponenseket adtuk

A nycrsie lecsóidat összetétele a következő volt::

0,15 g NayMoög x 2X₂Ö_f 2,5 g H₃3O₃, 0,7 g CoCI₂ x 6H₂Ö, 0,25 g GuSOg x 5H₂Ö, 1,S 0 jBnCIa x 4H₂0, 0,3 g ZnSO^ X 7h_2:ö vízzel 1 literre feltöltve, A nyoméiemeIdát hozzáadása sterilre szűréssel történt, A kiindulási folyadéktérfogat 5 liter volt, A fent megr; vs?/»s **φ· adott mennyiségek erre az értékre vonatkoznak.

Ehhez az oldathoz hozzáadtunk 100 mi oacíil«s subtiiis PA668 törzsből készített inokuiumot {00 - 10) és 43 °C-on erős keverés mellett 12 1/perc levegőztetés mellett fermentáltuk. Bzt a törzset az OS 60/262,995 sorozatszámú szabadalmi bejelentés melléklete szerint írjuk le, órán belül 2,1 liter steril vizes oldatot adtunk hozzá.

Ennek összetétele a következő volt:

	összetevő	| Koncentráció j	g/i]
	Glükóz	[ 800
	Ka 1cinm-klorid	: 0,6
	da-glutamát x H;>0	5
	Natríum- cít rát	?
	FeSCy x 7ü2O	0,2
)	N y ome1emeIda t	6 ml.	11

A. fermentáció alatt a pH~t 2Sí-os ammónia oldattal illetve 20%-os foszfor savval 7,2 értéken.tartottuk, Az ammónia egyidejűleg nitrogénforrásként is szolgál a fermentációban. A keverő fordu.latszámát ágy szabályoztuk, hogy az oldott oxigén tartalom a telítési érték 30%-a legyen. A szénforrás adagolás megszakítása után a fermentációt addig folytattuk, amíg az oldott oxigén szint (pöj) a telítési érték 95%-át el nem érte. A D-pantotenát koncentráció 43 óra után 22,8 g/i volt.

Ehhez hasonlóan összeállíthatok olyan β-sianín mentes .fermentációs tápoldatok, amelyeken 20, 25·., 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 és >90 g/i D-panlotenát titerek érhetők el.

'ClSSZSE .5 0

ΦΦ < ΦΦφΦ φφ νφ * Φ X φ Φ Φ f φ Λ χΦΦ ΦΦφ φ φ * Φ Φ r * ΦΦΦ »* ♦♦φφ

Az I. példa szerint előállított fermentié 7000 mi-ét ultraszűrésnek vetettük alá, amelybe egy kerámiából készült egycsatornás csőmodult (Fa. Atech, Gladbeek, Deutsohland) vittünk be. Itt egy 20 kö pórusméretű (10 nm) membránt és egy 50 nm pórusméretet használtunk fel.

A kísérleteknél a hőmérséklet 40 ®C, az áramlási sebesség 4 m/s és a transsmembrán nyomás (T© ~ [p(betáplálás) t p(refentátűm}]2 ~ ρ(permeátum)}, ha másképpen nem jelezzük, 1 bar volt.

Az 1, ábrán a transzmembrán áramok (permed tűm áramok) a betöményítési faktor MK (MK(t) ^eyifcex/^scíartUfeixs&.C.t)) függvényében láthatók.

Ebből nyilvánvalóvá válik, hogy a kisebb pórusméretu membrán (20 kD) egyértelműen nagyobb áramot rn.ut.at, mint a nagyobb pórusméretű membrán (50 na) ..

3. példa:

Az 1, példa szerint előállított fermentié 7000 ml~ét a 2. példában leírtakhoz hasonlóan uitraszörésnek vetettük alá, ahol az alkalmazott membrán 20 kD pórusméretü volt.

A 2. ábra mutatja, hogy a már centrifugált fermentié betöményedóse egyértelműen nagyobb, mint a 2. példában.

Kaloium-pantotenátot tartalmazó vizes oldat 1000 isi-ét (3. táblázat, retentátum bevitel) egy maximálisan körülbelül 1,5 literes üzemtérfogatú keverő-nyomó cellába vittük. A nyomást ennél a cellánál nitrogén összenyomásával hoztuk létre és a membránon történő átáramoltatást egy mágneses knpplungon keresztül meghajtott Anker leverővel biztos ítót tűk. A DESAi 5 DK nahoszürő m.emb37..253/SS « * χφφ Φ ♦ ♦♦« < X Φ « ♦ «ΦΦ Λ* Χ««

..x ránt (Osmordcs beutsohland Grb! ín doers) alkalmaztuk. A fent nevezett oldattal történő kísérletek előtt, közben és után a membrán integritásának vizsgálatára visszatartási tesztet végeztünk MgSCR oldattal (2000 ppm) »

Az Rí visszatartás értékeket a 3. táblázat két jobboldali oszlopában tüntettük fel. A visszatartást a következőképpen deizníáljOiíc Rí ~ 1 — Cj._f.peria.eá'fciaa/'^i,reteatátun' abox R ~ az r Komponens visszatartása, CRpezneátn® ~ ^a- 1 komponens koncentrációja a perneát ómban, R, retentátum -az i komponens koncentráció ja a retentátüiaban. A koncentrációk a nem-stacioner folyamat során egy bizonyos időpontban beálló pillanatnyi koncentrációkat jelentik, nem a folyamat végén a frakciókban adódé koneentrációkat. Az Rí értéke ideális esetben koncentrációtól független, amelyet a frakciókban mért koncentrációkból adódó értékek számításánál is alapul vettünk. A 3. táblázatból kiderül, hogy a Ca²ⁱ' és pantotenát ionok visszatartása 84%-os illetve 99%-os, azaz a re t ént atomé· a n találd át ók fe-pantotenát vizes oldatának (0,2 mól/lj feldolgozásánál a

4. példához hasonló körülmények között, nanoszüzéssei végeztünk töményítést. A 4. táblázat mutatja, hogy a. pantotenát visszatartás 8Ö% körüli, β« példa:

daCl/üaCls efcvimoiáris elegyének betöményitését a 4. példához hasonló körülmények között az 5. táblázatban foglaljuk őszsze. Itt azt látjuk, hogy a membrán Ca²' ion. visszatartása il%~ kai illetve 42%-kal viszonylag csekély a pantotenáttal kapcsolódó kalcium ionok nagyarányú visszatartásához képest (5. példa).

TU.2S3/BZ *4» ♦

Χ*«« «*· ΦΧ * * ♦ « ♦ «* «

X Φ « * «* ♦Κίχ

Magyarázat az ábrákhoz és táblázatokhoz:

1, ábra: Farmentié transzmembrán áramlásának (permeátum áramlásának) grafikus bemutatása ultraszürésnéi a betöményedésí faktor (M.K) függvényében, 50 _nTG és 20 gy pórusmératü membránok a 1 ka I ma z ás á ná 1„

2„ ábra: Centrifugáit fermentlé transzmembrán áramlásának (permeátum áramlásának) grafikus bemutatása ultraszürésnéi a betöméuyedési faktor (MK) függvényeben, 20 kD pőrusméretü membrán alkalmazásánál,

1. táblázat: Sejttömeg vagy oldatból kivált komponensek elválasztására szolgáló aszimmetrikusan struktúráit membránok áttekintése ,

2. táblázat: Sejttömeg vagy oldatból kivált komponensek elválasztására szolgáló membránok: és azok tulajdonságainak áttekintése,

3. táblázat: Kanoszörés analízis értékeinek áttekintése, különös tekintettel kalcium és pantotenát ionok visszatartására 0;, 1 mól/kg Ca-pantotenátot és 0,2 mől/kg NaCl-ot tartalmazó vizes oldatban«

4. táblázat: dánoszürés analízis értékeinek: áttekintése, különös tekintettel kalcium és pantotenát ionok visszatartására 0,2 mől/kg üa-pantoienátot és 0,1 möl/kg CaCly-ot tartalmazó vizes oldatban.

5. táblázat: fianosznrés analízis értékeinek áttekintése, különös tekintettel kalcium ionok visssatattásárá NaCl és Gátig ekvimoiáris mennyiségeit tartalmazó vizes oldatban.

Claims (7)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás :D-pan t o t énsa v é s / vagy ső i e 1 oá 11 i tásá r a, az £ a i j e 11emezve, hogy

   a) legalább egy olyan D-pantoténsav&t termelő mikroorganizmust· alkalmazunk, amelynek pantoténs&v (páni és/vagy izoleucinvalin (ilv) bioszintézis útvonala, deregulált és amely fermentációval legalább 2 g/l D-pantoténsav sót termei tápközegben, ahol a tápkőzeghez 0-20 g/l szabad, β-alaninf és/vagy β-aianín sót adagolunk;

   b) a keletkezett pantoténsav semlegesítésére szokásos pnffer-rendszereket alkalmazunk és a képződött D-pantotenathoz többértékű kationokat tartalmazó sókat adagolunk, amikor a D-pantoténsav többértékü sói képződnek;

   c} a D-pantoténsav többértékű sóit tartalmazó oldatot nanoszűréssel feldolgozva a D-pantoténsav többértékű sói feldúsulnsa, és

   d) a nanoszűrés D-pantoténsav többértékö sóit. tartalmazó retentátumát szárításnak és/vagy formuláz.ásnak vetjük alá·.
2. 2. Az 1. igény pont s zeri n t i e1járás, azzal jellemezve, hogy a tápközeghez nem adagolunk szabad β-alanint és/vagy β-aianin sót.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy D-pantoténsavat termelő szervezetként egy baktériumot, élesztőt vagy gombát alkalmazunk,
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy -mikroorganizmusként a Bacillaoeae családba tartozó baktériumot alkalmazunk.
5. 5< óz 1-4, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, -azzal ??, 2«3/B£/R?i2ip2 jellemezve, hogy -egy, a nemzetségbe, előnyösen a B, snbhilis, B, Jichéniformis vagy B. amyioligoefaoiens fejbőr tartozó baktériumot alkalmazunk.

   f. Az 1-5, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ezrei j e 11 »g z v e, h o g y a z a} 1 é ρ é s be n D- ρ a n t. o t én s a vb ó 1 é s / v a g y s
6. 6 1 b ö 1 legalább 10 g/i tápközeg, előnyösen legalább 20 g/1 tápközeg, különösen előnyösen legalább 40 g/1 tápközeg és legelőnyösebben legalább 60 g/1 tápközeg mennyiség képződik, ?, Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy é nanoeznrés előtt, a o) lépésben megtörténik a sejttömeg vagy az oldatból kivált komponensek elválasztása.

   0. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a z e1vá1ászt ás dekantáláa sa1 vag y membrán s z Gr ás s e1, e1őnyöaen aitraszaréssel történik.

   9. A l, vagy S. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a membránszűrést diaszürésként hajtjnk végre, lö. Az 1-9, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a többértékö kationokat tartalmazó sók hozráadása szilárd formában vagy vizes oldatként az a) lépésben a fermentáció során, előnyösen a végén vagy a fermentációt követően vagy a D~pantotenát tártaimé oldat membránszűrése alatt vagy azt kővetőén történik.

   11. Az 1-10, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hegy a többéttékű kationokat tartalmazó sok hozzáadása szilárd formában vagy vizes oldatként egy nsnoszürés alatt történik.

   12. Az 1-11, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy _:a többértékű kationokat tartalmazd vizes oldat hozzáadagolása folyamatosan történik,
7. 7? „ z sz /zz / sz s go

   4Ö

   13. Az 1-12, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ezzal jellemezve, hogy a többértékű kationokat kalcium- és/vagy magnézium- klór id, -nitrát, -hidrox.id, -formiét, -acetát, -própíonát, -giicinát és/vagy -1 aktát förmájáhan adagο1juk.

   14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy többértéka kationként Ca‘~ ionokat 0,05-50 mól Ca^Vmői D-pantotenát, előnyösen 0,2-2 mól Ca⁴⁺7‘mól D-pantotenát koncé n t rációhan adagolun k.

   15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nanoszűrésnél a c) lépésben a membrán két oldala között 5-100 bar, előnyösen 20-30 bar és különösen előnyösen 40-70 bar tartományba eső nyomáskülönbséget alakítunk ki.

   16. Az 1-15, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben a nanoszűrés által az egyérzékű kationok, előnyösen ammónium-, kálium- és/vagy nátrium-ionok koncentráció ja < 5 g/kg oldat-ra csökken,

   17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésből származó permeátumot vagy annak egy részét a fermentációban, visszavezetjük az a) lépésbe.

   18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a permeátum vagy részeinek visszavezetése folyamatosan történik.

   19. Az 1-18, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésből kapott retentátum a D-pantoténsav többértékű sóit tartalmazó szuszpenzió.