ES2278929T3 - Procedimiento para la obtencion del acido d-pantotenico y/o sales como aditivos para piensos de animales. - Google Patents
Procedimiento para la obtencion del acido d-pantotenico y/o sales como aditivos para piensos de animales. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la adición de sales que contienen cationes polivalentes en forma sólida o como solución acuosa se lleva a cabo durante una nanofiltración.
Description
Procedimiento para la obtención del ácido
D-pantoténico y/o sales como aditivos para piensos
de animales.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención del ácido
D-pantoténico y/o de sus sales y al empleo como
aditivo para piensos para animales.
El D-pantotenato se encuentra
ampliamente extendido en el reino vegetal y animal como producto de
partida de la biosíntesis del coenzima A. En contra de lo que
ocurre en los seres humanos, que ingieren el ácido pantoténico en
cantidades suficientes a través de la alimentación, se han descrito
sin embargo frecuentemente síntomas de carencias del
D-pantotenato tanto en el caso de las plantas como
en el caso de los animales. La disponibilidad del
D-pantotenato es, por lo tanto, de un gran interés
económico, especialmente en la industria de los piensos para
animales.
Tradicionalmente, se lleva a cabo la obtención
del D-pantotenato mediante síntesis química a partir
de la D-pantolactona y del alaninato de calcio
(Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6^{th} edition,
1999, electronic release, capítulo "Vitamins"). Para la puesta
a disposición de la D-pantolactona se requiere una
disociación costosa, clásica, de racematos a través de las sales
diastereómeras. El producto comercializable, que resulta de la
síntesis química es, en la mayoría de los casos, la sal de calcio
del ácido D-pantoténico, el
D-pantotenato de calcio.
Frente a las síntesis químicas, los
procedimientos biotecnológicos de obtención con microorganismos
tienen como ventaja la puesta a disposición selectiva
(enantiómeramente pura) de la forma D del ácido pantoténico
empleable por los organismos superiores. Por lo tanto se elimina una
disociación, costosa, del racemato, como se requiere en el caso de
las síntesis químicas.
Los procedimientos de fermentación para la
obtención del ácido D-pantoténico con
microorganismos son conocidos en gran número, de este modo pueden
verse, entre otras, las publicaciones EP 0 590 857, WO 96/33283, US
6,013,492, WO 97/10340, DE 198 46 499, EP 1 001 027, EP 1 006 189,
EP 1 006 192 y EP 1 006 193.
De este modo, las publicaciones EP 1 006 189 y
EP 1 001 027 describen procedimientos para la obtención de
pantotenato en los cuales se consigue un contenido en la solución de
fermentación de 1 g/l como máximo de ácido
D-pantoténico. Los contenidos en ácido pantoténico
bajos, de este tipo, en la solución de fermentación, es decir por
debajo del 10% en peso con relación al contenido en materia sólida,
son inadecuados, sin embargo, para la fabricación económica de
suplementos para piensos de animales que contengan el ácido
D-pantoténico. Otro inconveniente de los
procedimientos, conocidos hasta ahora, consiste en que el
aislamiento del producto, a partir del medio de fermentación,
requiere un gran número de etapas de elaboración, costosas. No se ha
divulgado un procedimiento económico para la fabricación a escala
industrial.
En la solicitud de patente alemana publicada, no
examinada DE 100 16 321 se ha descrito un procedimiento de
fermentación para la fabricación de suplementos para piensos de
animales que contienen el ácido D-pantoténico. Un
inconveniente esencial de este procedimiento consiste, sin embargo,
en que tiene que añadirse obligatoriamente, como en el caso de los
procedimientos de fermentación, precedentemente indicados, para la
obtención del ácido D-pantoténico, el precursor del
ácido pantoténico, constituido por la
\beta-alanina, al microorganismo a través del
medio de fermentación para alcanzar rendimientos económicos del
producto deseado.
Además, las publicaciones US 6,013,492 y WO
96/332839 describen la elaboración del ácido
D-pantoténico a partir de la solución de
fermentación mediante separación por filtración de los componentes
no solubles (por ejemplo material celular) del medio de cultivo,
una adsorción del filtrado sobre carbón activo, una elución,
subsiguiente, del ácido D-pantoténico con un
disolvente orgánico, preferentemente el metanol, una neutralización
con hidróxido de calcio y una cristalización subsiguiente del
D-pantotenato de calcio. Los inconvenientes
esenciales en este caso consisten en las pérdidas de producto
valioso que se producen durante la cristalización así como en el
empleo de un disolvente orgánico, que únicamente puede ser separado
con dificultad del producto y que requiere una recuperación costosa
del disolvente.
La publicación EP 0 590 857 describe un
procedimiento de fermentación para la obtención del ácido
D-pantoténico, en el cual es obligatoria la adición
de \beta-alanina durante el cultivo de un
microorganismo. La solución de la fermentación se filtra para la
separación de la biomasa, a continuación se hace pasar a través de
un intercambiador de cationes y finalmente a través de un
intercambiador de aniones, como conclusión se neutraliza con
hidróxido de calcio, se concentra por evaporación, se combina con
carbón activo, se filtra de nuevo y se cristaliza con adición de
metanol y de cloruro de calcio. El producto resultante, que contiene
pantotenato de calcio comprende, además del ácido
D-pantoténico en forma de sal de calcio también
cloruro de calcio en una relación molar de 1:1. Para la reducción
del contenido en cloruro de calcio se requiere una electrodiálisis
con un secado por pulverización subsiguiente. Este procedimiento
tiene el inconveniente de que ni es económico ni es ecológico
debido al gran número de etapas complicadas del procedimiento y
debido al empleo de disolventes orgánicos.
La tarea de la presente invención consiste en la
puesta a disposición de un suplemento para pienso de animales, que
contienen ácido D-pantoténico y/o sus sales, así
como su obtención por medio de un procedimiento mejorado para la
obtención del ácido D-pantoténico y/o de sus sales,
que no presenta los inconvenientes precedentemente citados. En este
caso es deseable, por motivos económicos, un procedimiento en el que
se reduzca drásticamente o que sea completamente innecesaria una
adición de \beta-alanina. Además es deseable la
obtención del ácido D-pantoténico en forma de sus
sales divalentes y, en este caso, ante todo en forma de las sales
alcalinotérreas, puesto que las sales divalentes presentan
propiedades menos higroscópicas que las sales monovalentes del ácido
pantoténico y por lo tanto tienen menos tendencia a la formación de
grumos durante la aplicación ulterior, por ejemplo como suplemento
para el pienso de los animales.
Esta tarea se resuelve de manera ventajosa por
medio de la presente invención.
El objeto de la presente invención consiste en
un procedimiento para la obtención del ácido
D-pantoténico y/o de sus sales, caracterizado
porque
- a)
- se emplea, al menos, un microorganismo productor del ácido D-pantoténico, cuya biosíntesis del ácido pantoténico-(pan) y/o isoleucina/valina-(ilv) esté desregulada y que forme, al menos, 2 g/l de sales del ácido D-pantoténico mediante fermentación en un medio de cultivo, añadiéndose al medio de cultivo desde 0 hasta 20 g/l de \beta-alanina y/o de sal de \beta-alanina,
- b)
- se añaden al D-pantotenato formado sales que contengan cationes polivalentes, con lo que se forman sales polivalentes del ácido D-pantoténico,
- c)
- se elabora la solución, que contiene las sales polivalentes del ácido D-pantoténico mediante nanofiltración, enriqueciéndose las sales polivalentes del ácido D-pantoténico y
- d)
- se somete a un secado y/o a una formulación al retentato de la nanofiltración que contiene las sales polivalentes del ácido D-pantoténico.
En una variante del procedimiento, según la
invención, el retentato procedente de la etapa c) es una suspensión,
que contiene sales polivalentes del ácido
D-pantoténico.
Además, la fermentación puede llevarse a cabo
según una manera de proceder conocida mediante trabajo en tandas,
en alimentación por tandas o en alimentación por tandas repetidas o
mediante una conducción en continuo del procedimiento. Para la
neutralización del ácido pantoténico formado se utilizarán en este
caso los sistemas tampón usuales tales como, por ejemplo, el tampón
de fosfato con NaOH, con KOH o con amoníaco.
En otra variante del procedimiento, según la
invención, se forman en la etapa a), al menos 10 g/l,
preferentemente, al menos, 20 g/l, de forma especialmente
preferente, al menos, 40 g/l, en el caso más especialmente
preferente, al menos, 60 g/l y, en particular, al menos, 70 g/l de
sales del ácido D-pantoténico mediante fermentación
en el medio de cultivo.
Según la invención, debe entenderse por la
expresión "producción", que el microorganismo puede sintetizar
cantidades del ácido D-pantoténico y/o de sus sales
mayores que las que se requieren para las necesidades propias de
metabolismo. En una variante ventajosa, según la invención, la
cantidad sintetizada de ácido D-pantoténico y/o de
sus sales no se encuentra dentro de las células sino que se
desprende, de manera ideal, por completo desde el microorganismo
hasta el medio de cultivo. Esta descarga puede llevarse a cabo de
manera activa o pasiva según mecanismos en sí conocidos.
Según la invención, se emplearán como
microorganismos, productores del ácido
D-pantoténico, hongos, levaduras y/o bacterias.,
según la invención, se emplearán preferentemente hongos tal como,
por ejemplo, Mucor o levaduras, tales como por ejemplo
Saccharomyces o Debaromyces y, en este caso, preferentemente
Saccharaomyces cerevisiae. Ventajosamente se emplearán,
según la invención, bacterias o bacilos corineformes., según la
invención, quedan abarcadas, por ejemplo, preferentemente bacterias
de los géneros Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Arthrobacter,
Bevibacterium, Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella, Proteus,
Acinetobacter o Rhizobium. En este caso son especialmente
preferentes, por ejemplo, Corynebacterium glutamicum,
Brevibacterium breve o Bacillus subtilis, B.
licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B.
lentimorbus, B. lentus, B. firmus, B. pantothenticus, B. circulans,
B. coagulans, B. megaterium, B. pumilus, B. thuringiensis, B.
brevis, B. stearothermophilus y otros tipos de Bacillus del
grupo 1, que se caracterizan por medio de su 16sARN o Actinum
mycetalis. Esta enumeración sirve para la explicación y en
ningún caso limita la presente invención.
Además, la presente invención abarca también el
empleo de microorganismos genéticamente modificados para la
obtención, según la invención, de un suplemento para el pienso de
los animales que contenga ácido D-pantoténico libre
y/o sus sales. Tales microorganismos, genéticamente modificados,
pueden aislarse, por ejemplo, mediante mutagénesis química y
subsiguiente selección por medio de un "procedimiento de
selección" adecuado., según la invención, quedan abarcadas
también las denominadas "cepas para la producción", que son
adecuadas para la obtención de los productos en el sentido de la
presente invención y que presentan modificaciones genéticas en lo
que se refiere al flujo del metabolismo en el sentido del ácido
D-pantoténico, entendiéndose como tal también las
modificaciones en lo que se refiere a la descarga del ácido
D-pantoténico y/o de sus sales a través de la
membrana celular. Esto puede conseguirse por ejemplo mediante la
modificación de las posiciones claves en las vías relevantes de la
biosíntesis del metabolismo del microorganismo empleado.
Del mismo modo, puede imaginarse el empleo de
microorganismos transgénicos, que resulten de la transferencia de
secuencias de nucleótidos homólogas y/o heterólogas, que sean
necesarias o que pudieran ser necesarias para la síntesis del
producto deseado. En este caso puede imaginarse la sobreexpresión
y/o la desregulación de uno o varios genes individuales y/o en
combinación, localizada en el genoma y/o sobre un vector.
Tales microorganismos transgénicos pueden
contener de manera ventajosa, adicionalmente, copias y/o genes
genéticamente modificados elegidos del grupo formado por panB,
panC, panD, panE y/o por sus combinaciones y/o incluso por unidades
organizadas, tales como el operón panBCD. Además pueden manipularse
ventajosamente en los microorganismos otras vías de metabolismo
tales como, por ejemplo, las vías para la síntesis de la
isoleucina-valina, como se ha descrito, por
ejemplo, en las publicaciones EP 1 006 189, EP 1 006 192, EP 1 006
193 o EP 1 001 027. De este modo se ponen a disposición substancias
precursoras, de cadena ramificada, en mayor cantidad para la
biosíntesis del ácido pantoténico. Ventajosamente se
sobreexpresarán, en caso dado, los genes para esta vía de
biosíntesis, es decir ilvB, ilvN, ilvC y/o ilvD.
Además, quedan abarcadas las modificaciones
genéticas de la
aspartato-\alpha-descarboxilasa
(panD), por ejemplo mediante la sobreexpresión y/o la
desregulación, según la invención, en los microorganismos empleados
productores del ácido D-pantoténico.
Según la invención, debe entenderse por la
expresión "desregulación" lo siguiente: variación o
modificación al menos de un gen, que codifique un enzima en una vía
del metabolismo biosintético, de tal manera que la actividad del
enzima se varíe o se modifique en el microorganismo. Es preferente
que al menos un gen, que codifique un enzima de una vía del
metabolismo biosintético, se modifique de tal manera que el producto
genético se forme con mayor intensidad o que presente una actividad
acrecentada. La expresión "vía del metabolismo desregulada"
abarca también una vía del metabolismo biosintética, en la cual se
varíe o se modifique más de un gen, que codifique más de un enzima,
de tal manera que se varíen o se modifiquen las actividades de más
de un enzima.
Las variaciones o las modificaciones pueden
comprender, pero no están limitadas a: la eliminación del promotor
endógeno o del elemento regulador; la introducción de promotores más
potentes, de promotores inducibles o de varios promotores a la vez;
la eliminación de secuencias reguladoras de tal manera que se
modifique la expresión del producto genético; la modificación de la
posición cromosómica del gen; la modificación de la secuencia de
ADN en las proximidades del gen o dentro del gen tales como por
ejemplo los puntos de enlace ribosómicos (RBS); el aumento del
número de copias del gen en el genoma o mediante introducción de
plásmidos con un número variable de copias; la modificación de las
proteínas (por ejemplo proteínas reguladoras, supresoras,
reforzadoras, activadores de transcripción, y similares), que
jueguen un papel durante la transcripción del gen y/o durante la
traducción para dar el producto genético. Para esta finalidad se
cuenta también con otras posibilidades para la desregulación de la
expresión de los genes, que constituyen el estado de la técnica,
tales como por ejemplo el empleo de oligonucleótidos antisentido o
el bloqueo de proteínas represoras.
La desregulación puede comprender también las
variaciones de genes en una región codificante, que, por ejemplo,
conduzcan a la eliminación de la regulación inversa en el producto
genético o a una actividad específica mayor o menor del producto
genético.
Además, son ventajosas, según la invención, las
modificaciones genéticas en los enzimas, que influyan sobre la
efluencia de precursores del ácido pantoténico y/o sobre el flujo
del ácido pantoténico hacia el coenzima A. Ejemplos de genes, que
codifican tales enzimas son: alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA, coaX y
muchos más. Esta enumeración tiene carácter explicativo y en ningún
caso limita la presente invención.
Además, son ventajosas las variaciones
genéticas, que aseguren la puesta a disposición celular de
cofactores (por ejemplo de tetrahidrofolato de metileno,
equivalentes Redox y similares) en cantidades óptimas para la
producción de ácido pantoténico.
De manera ventajosa está presente ya la
\beta-alanina en las células en concentraciones
elevadas frente a los microorganismos correspondientes que no han
sido modificados genéticamente y, por lo tanto, no tiene que
añadirse como precursor al medio de cultivo, como es necesario por
ejemplo en el caso de la publicación
EP-A-0 590 857. Son ventajosos
aquellos microorganismos cuyas biosíntesis del ácido pantoténico
-(pan) y/o de isoleucina-valina-(ilv) y/o cuya
desregulación de la
aspartato-\alpha-descarboxilasa
(panD) esté desregulada. Además, es ventajosa una sobreexpresión
adicional de la cetopantoato-reductasa (panE) en los
microorganismos.
Del mismo modo, es ventajoso, según la
invención, que se reduzca la actividad en caso dado del gen coaA,
que es necesario para la síntesis del coenzima A o que sea
inactivado por completo (por ejemplo en especies de Bacillus). Los
Bacillus contienen concretamente además del coaA otro gen para la
función enzimática (= coaX). Del mismo modo puede modificarse la
actividad de este gen coaX o del encima correspondiente,
preferentemente puede reducirse o incluso puede eliminarse en tanto
en cuanto el coaA propiamente dicho presente una actividad
enzimática suficiente, aún cuando esté disminuida, es decir que la
actividad enzimática del coaA no se pierda por completo. Además de
la sobreexpresión de los diversos genes es ventajosa también una
manipulación genética de las regiones promotoras de este gen de tal
manera, que esta manipulación conduzca a una sobreexpresión del
producto genético.
\newpage
En una variante de realización de la presente
invención, encuentran aplicación las cepas bacterianas descritas
según el anexo (WO 01/21772), tales como por ejemplo Bacillus
subtilis PA 824 y/o derivados del mismo. En otra variante de
realización encuentra aplicación, según la invención, el
microorganismo Bacillus subtilis PA 668, tal como se ha
descrito en el anexo (US 2004/0091979), en el procedimiento según la
invención. Estas cepas de Bacillus subtilis PA824 y PA668 se
prepararon de la manera siguiente:
A partir de la cepa Bacillus subtilis 168
(Marburg cepa ATCC 6051), que presenta el genotipo trpC2
(Trp^{-}), se generó la cepa PY79 mediante traducción del marcador
Trp^{+} (procedente de Bacillus subtilis tipo salvaje
W23). En la cepa PY79 se introdujeron las mutaciones \DeltapanB y
\DeltapanE1 mediante métodos genéticos clásicos (como se han
descrito, por ejemplo, en la publicación de Harwood, C.R. and
Cutting, S.M. (editors), Molecular Biological Methods for
Bacillus (1990) John Wiley & Sons, Ltd., Chichester,
Inglaterra).
La cepa resultante se transformó con el ADN
genómico de Bacillus subtilis cepa PA221 (genotipo
P_{26}panBCD, trpC2 (Trp^{-})) y con ADN genómico de
Bacillus subtilis cepa PA303 (genotipo P_{26}panE1).
La cepa resultante PA327 tiene el genotipo P_{26}panBCD,
P_{26}panE1 y es triptofano auxótrofo (Trp^{-}). Con el
Bacillus subtilis cepa PA327 se alcanzó, en 10 ml de cultivos
con medio SVY (25 g/L de Difco Veal Infusion Broth, 5 g/L de Difco
Yeast Extract, 5 g/L de glutamato de Na, 2,7 g/L de sulfato de
amonio, enrasados con agua hasta 740 ml, sometido al autoclave y
adición a continuación de 200 ml de fosfato de potasio 1 M, pH 7,0
y 60 ml de solución de glucosa estéril al 50%), que se había
suplementado con 5 g/L de \beta-alanina y con 5
g/L de \alpha-cetoisovalerato, ácido pantoténico
con un título de hasta 3,0 g/L (24 horas).
La obtención del Bacillus subtilis cepa
PA221 (genotipo P_{26}panBCD, trpC2 (Trp^{-})) se
describe en el párrafo siguiente:
Con ayuda de métodos clásicos de ingeniería
genética se clonó el operón panBCD de Bacillus con
ayuda de la información secuencial del operón panBCD de
E. coli (véase la publicación de Merkel et al., FEMS
Microbiol. Lett., 143, 1996:247-252) a partir de una
biblioteca de plásmidos de Bacillus subtilis GP275. Para la
clonación se utilizó el E. coli cepa BM4062 (bir^{ts}) y la
información, que está presente en el operón de Bacillus en
las proximidades del gen birA. El operón panBCD se
introdujo en un plásmido replicable en E. coli. Para mejorar
la expresión del operón panBCD se utilizaron promotores
constituyentes, fuertes del Bacillus subtilis fago SP01
(P_{26}) y se reemplazó el punto de enlace de los ribosomas
(=RBS) por delante del gen panB por un RBS artificial. Por
delante de la caja P_{26}panBCD sobre el plásmido se
enlazó un fragmento de ADN, que se encontraba inmediatamente aguas
arriba (upstream) del gen nativo panB en
Bacillus. Este plásmido se transformó en el Bacillus
subtilis cepa RL-1 (derivado del Bacillus
subtilis 168 obtenido mediante mutagénesis clásica (Marburg cepa
ATCC 6051), genotipo trpC2 (Trp^{-})) y se reemplazó
mediante recombinación homóloga el operón nativo panBCD por
el operón p_{26}panBCD. La cepa resultante se llama PA221 y tiene
el genotipo P_{26}panBCD, trpC2 (Trp^{-}).
Con el Bacillus subtilis cepa PA221 se
alcanzó en cultivos de 10 ml con medio SVY, que había sido
suplementado con 5 g/L de \beta-alanina y con 5
g/L de \alpha-cetoisovalerato, ácido pantoténico
con un título de hasta 0,92 g/L (24 horas).
La obtención del Bacillus subtilis cepa
PA303 (genotipo P_{26}panE1) se describe en el párrafo
siguiente:
Con ayuda de la secuencia genómica E. coli
panE se clonó de manera análoga la secuencia Bacillus
panE. Se observa que en B. subtilis existen dos
homólogos, el gen panE de E. coli, que se designaron
como panE1 y panE2. Mediante análisis de eliminación
se observa que el gen panE1 es responsable en un 90% en la
producción del ácido pantoténico, mientras que la eliminación del
gen panE2 no tenía ningún efecto significativo sobre la
producción del ácido pantoténico. También en este caso se reemplazó,
de manera análoga a la de la clonación del operón panBCD del
promotor por el promotor constituyente, potente, P_{26} y se
reemplazó el punto de enlace de los ribosomas por delante del gen
panE1 por puntos de enlace artificiales. El fragmento
P_{26}panE1 se clonó en un vector que estaba constituido de
tal manera que el fragmento P_{26}panE1 pudo integrarse en
el sitio del panE1 original en el genoma de Bacillus
subtilis. La cepa resultante tras la transformación y la
recombinación homóloga se llama PA303 y tiene el genotipo
P_{26}panE1.
P_{26}panE1.
Con el Bacillus subtilis cepa PA303 se
alcanzó en cultivos de 10 ml con medio SVY, que había sido
suplementado con 5 g/L de \beta-alanina y con 5
g/L de \alpha-cetoisovalerato, un título en ácido
pantoténico de hasta 1,66 g/L (24 horas).
La otra construcción de la cepa se llevó a cabo
mediante transformación de PA327 con un plásmido, que contiene el
operón P_{26}ilvBNC y el gen marcador de espectinomicina.
El operón P_{26}ilvBNC integra en el sitio amyE, lo
cual ha sido demostrado mediante PCR. Un transformante se denominó
como PA340. (Genotipo P_{26}panBCD, P_{26}panE1,
P_{26}ilvBNC, specR, trpC2 (Trp^{-})).
Con el Bacillus subtilis cepa PA340 se
alcanzó en cultivos de 10 ml con medio SVY, que había sido
suplementado con 5 g/L de \beta-alanina, un
título en ácido pantoténico de hasta 3,6 g/L (24 horas), en cultivos
de 10 ml con medio SVY, que había sido suplementado con 5 g/L de
\beta-alanina y con 5 g/L de
\alpha-cetoisovalerato, se alcanzó un título en
ácido pantoténico de hasta 4,1 g/L (24 horas).
Además, se introdujo en la cepa PA340 una caja
desreguladora ilvD. Para ello se transformó en PA340 un
plásmido que contiene el gen ilvD bajo el control del
promotor P_{26} con el RBS2 artificial. En este caso se integró
en el sitio original ilvD el gen P_{26}ilvD mediante
recombinación homóloga. La cepa resultante PA374 tiene un genotipo
P_{26}panBCD, P_{26}panE1, P_{26}ilvBNC,
P_{26}ilvD, specR y trpC2 (Trp^{-}).
Con el Bacillus subtilis cepa PA374 se
alcanzó en cultivos de 10 ml con medio SVY, que había sido
suplementado con 5 g/L de \beta-alanina, un
título en ácido pantoténico de hasta 2,99 g/L (24 horas).
Con el fin de producir con la cepa PA374 el
ácido pantoténico, exento de adición de
\beta-alanina, se incorporaron en la cepa PA374,
adicionalmente, copias del gen panD que codifica la
aspartato-\alpha-descarboxilasa.
Para ello se transformó en PA374 el ADN cromosómico de la cepa
PA401. Mediante selección sobre tetraciclina se obtuvo la cepa
PA377.
La cepa PA377, resultante, tenía el genotipo
P_{26}panBCD, P_{26}panE1, P_{26}ilvBNC,
P_{26}ilvD, specR, tetR y trpC2 (Trp^{-}).
Con la cepa de Bacillus subtilis PA377 se
alcanzó en cultivos de 10 ml con medio SVY ácido pantoténico exento
de adición de precursores con un título de hasta 1,31 g/L (24
horas).
La obtención de la Bacillus subtilis cepa
PA401 (genotipo P_{26}panD) se ha descrito en el párrafo
siguiente:
El gen de Bacillus subtilis panD se clonó
a partir del operón panBCD en un vector, que porta el gen
marcador de tetraciclina. Por delante del gen panD se clonó
el promotor P_{26} y un RBS artificial, precedentemente descrito.
Mediante digestión de restricción se preparó un fragmento que
contenía el gen marcador de la tetraciclina y el gen
P_{26}panD. Este fragmento se enlazó de nuevo y se
transformó en la cepa PA221 anteriormente descrita. En este caso se
integró el fragmento en el genoma de la cepa PA211. La cepa PA401
resultante tenía el genotipo P_{26}panBCD,
P_{26}panD, tetR y trpC2 (Trp^{-}).
Se consiguió con la cepa de Bacillus
subtilis PA401 en cultivos de 10 ml en medio SVY, que había sido
suplementado con 5 g/L de \alpha-cetoisovalerato,
ácido pantoténico con un título de hasta 0,3 g/L (24 horas). En
cultivos de 10 ml con medio SVY que había sido suplementado con 5
g/L de ácido D-pantoico y con 10 g/L de
L-aspartato, se alcanzó un título en ácido
pantoténico de hasta 2,2 g/L (24 horas).
A partir de la cepa PA377 se generó una cepa de
triptofano prototrófero mediante transformación con ADN cromosómico
de la cepa PY79. Esta cepa PA824 tiene el genotipo
P_{26}panBCD, P_{26}panE1, P_{26}ilvBNC,
P^{26}ilvD, specR, tetR y Trp^{+}.
Con el Bacillus subtilis cepa PA824 se
alcanzó en cultivos de 10 ml en medio SVY ácido pantoténico exento
de adición de promotores con un título de hasta 4,9 g/L (48 horas)
(compárese con PA377: hasta 3,6 g/L en 48 horas). La construcción
exacta de la cepa puede tomarse según el anexo de la publicación WO
01/21772.
La obtención de PA668 se describe en el párrafo
siguiente:
El gen Bacillus panB se clonó a partir
del tipo salvaje del operón panBCD y se insertó en un vector
que contiene, además de un gen resistente al cloroanfenicol, también
secuencias de B. subtilis del sitio vpr.
Se insertó el promotor constituyente potente
P_{26} por delante del extremo 5' del gen panB. Se obtuvo
mediante digestión por restricción un fragmento que contiene el gen
P_{26}panB, el gen marcador para la resistencia al
cloroanfenicol así como las secuencias de Bacillus subtilis
vpr. El fragmento aislado se enlazó de nuevo y de este modo se
transformó en la cepa PA824. La cepa obtenida se denominó como
PA668. El genotipo de PA668 es: P_{26}panBCD,
P_{26}panE1, P_{26}ilvBNC, P_{26}ilvD,
P_{26}panB, specR, tetR, CmR y Trp^{+}.
Se aislaron dos colonias de PA668 y una de ellas
se denominó PA668-2A, la otra se denominó
PA668-24.
Con B. subtilis cepa
PA668-2A se alcanza en cultivos de 10 mL en medio
SVY, sin adición de precursores, ácido pantoténico con un título de
1,5 g/L en 48 horas. En cultivos de 10 mL, que han sido
suplementados con 10 g/L de aspartato se alcanzan títulos de hasta
5 g/L.
Con B. subtilis cepa
PA668-24 se alcanza en cultivos de 10 mL en medio
SVY, sin adición de precursores, ácido pantoténico con un título de
1,8 g/L en 48 horas. En cultivos de 10 mL, que han sido
suplementados con 10 g/L de L-aspartato se alcanzan
títulos de hasta 4,9 g/L.
La construcción exacta de las cepas puede verse
según los anexos de las publicaciones WO 01/21772 y US
2004/0091979.
Con la cepa PA377, precedentemente descrita, se
alcanzan en el caso de la fermentación limitada con glucosa en medio
SVY (25 g/L de Difco Veal Infusion Broth, 5 g/L de Difco Yeast
Extract, 5 g/L de triptofano, 5 g/L de glutamato de Na, 2 g/L de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 10 g/L de KH_{2}PO_{4}, 20 g/L
de K_{2}HPO_{4}, 0,1 g/L de CaCl_{2}, 1 g/L de MgSO_{4}, 1
g/L de citrato de sodio, 0,01 g/L de FeSO_{4}*7 H_{2}O y 1 ml/L
de una suspensión de sales en trazas con la siguiente composición:
0,15 g de Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O, 2,5 g de H_{3}BO_{3},
0,7 g de CoCl_{2} x 6 H_{2}O, 0,25 g de CuSO_{4} x 5
H_{2}O, 1,6 g de MnCl_{2} x 4 H_{2}O, 0,3 g de ZnSO_{4} x 7
H_{2}O, completado con agua hasta 1 litro)) a escala de 10 litros
mediante adición continua de una solución de glucosa en 36 horas (48
horas) concentraciones en ácido pantoténico en el caldo de
fermentación de 18-19 g/L (22-25
g/L).
En el caso de una fermentación limitada con
glucosa de PA824, que es el derivado de triptofano prototrófeno de
PA377, en medio de extracto de levadura (10 g/L de Difco Yeast
Extract, 5 g/L de glutamato de Na, 8 g/L de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 10 g/L de KH_{2}PO_{4}, 20 g/L
de K_{2}HPO_{4}, 0,1 g/L de CaCl_{2}, 1 g/L de MgSO_{4}, 1
g/L de citrato de sodio, 0,01 g/L de FeSO_{4}*7 H_{2}O y 1 ml/L
de la suspensión de sales en trazas anteriormente descrita), a
escala de 10 litros con alimentación continua de una solución de
glucosa al cabo de 36 horas, 48 horas y 72 horas, las
concentraciones siguientes en ácido pantoténico en los caldos de
fermentación: 20 g/L, 28 g/L y 36 g/L.
Mediante otra optimación del medio se alcanza
con la cepa PA824 en el caso de la fermentación limitada con
glucosa, en un medio constituido por 10 g/L de Difco Yeast Extract,
10 g/L de NZ Amina A (Quest International GmbH, Erftstadt), 10 g/L
glutamato de Na, 4 g/L de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 10 g/L
de KH_{2}PO_{4}, 20 g/L de K_{2}HPO_{4}, 0,1 g/L de
CaCl_{2}, 1 g/L de MgSO_{4}, 1 g/L de citrato de sodio, 0,01 g/L
de FeSO_{4}*7 H_{2}O y 1 ml/L de la solución de las sales en
trazas anteriormente descrita a escala de 10 litros con adición
continua de una solución de glucosa al cabo de 36 horas (48 horas)
concentraciones del ácido pantoténico de 37 g/L (48 g/L) en los
caldos de fermentación.
Pueden imaginarse otros aumentos de la
concentración en ácido pantoténico en los caldos de fermentación
mediante otra optimación del medio, mediante aumento de la duración
de la fermentación, mediante mejoras del procedimiento y de la cepa
así como mediante combinaciones de las etapas individuales. De este
modo pueden conseguirse las concentraciones en ácido pantoténico
anteriormente descritas también mediante fermentación de las cepas,
que sean derivados de la PA824 anteriormente descrita. Los derivados
pueden prepararse por medio de desarrollo clásico de las cepas así
como por medio de otras manipulaciones de ingeniería genética.
Mediante el desarrollo de los medios, de las cepas y de los
procedimientos de fermentación pueden aumentarse los títulos del
ácido pantoténico en los caldos de fermentación por encima de 40, de
45, de 50, de 55, de 60, de 65, de 70, de 75, de 80, de 85, y >
90 g/L.
Otra ventaja esencial del procedimiento, según
la invención, consiste en que la fermentación se lleva a cabo en un
medio de cultivo que además de, al menos, una fuente de carbono y
una fuente de nitrógeno como compuestos de partida no contiene otros
ascendentes (precursor). Es decir que la biosíntesis del ácido
D-pantoténico es independiente de la adición de
otros precursores. Deben entenderse por tales precursores, según la
invención, aquellas substancias tales como por ejemplo la
\beta-alanina y/o el L-aspartato
y/o la L-valina y/o el
\alpha-cetoisovalerato y/o sus
combina-
ciones.
ciones.
En una variante preferente del procedimiento,
según la invención, se llevará a cabo la fermentación del
microorganismo, productor del ácido D-pantoténico,
en un medio de cultivo, que contenga una fuente de carbono y una
fuente de nitrógeno, a la que, sin embargo, no se ha añadido
\beta-alanina libre y/o sales de
\beta-alanina o en el transcurso de la
fermentación. Es decir que para la obtención del ácido
D-pantoténico a escalas de, al menos, 10 g/l de
medio de cultivo, preferentemente de al menos 20 g/l, de forma
especialmente preferente de, al menos, 40 g/l, de forma muy
especialmente preferente de, al menos, 60 g/l y, especialmente, de
al menos, 70 g/l, no se requiere, según la invención, una adición
de \beta-alanina libre y/o de sales de
\beta-alanina.
La independencia con respecto al aporte de
precursores representa, especialmente, una ventaja económica
esencial del procedimiento, según la invención, frente a los
procedimientos conocidos, puesto que un gran número de los
precursores son de elevado precio.
Sin embargo, no queda excluida, según la
invención, la adición de \beta-alanina y/o de
sales de \beta-alanina de tal manera que, como
consecuencia, pueden mejorarse todavía más los rendimientos en ácido
D-pantoténico mediante la adición de
\beta-alanina y/o de sales de
\beta-alanina. Si, por ejemplo, se supone que
todos los precursores necesarios del ácido pantoténico están
presentes en cantidades suficientes limitando simplemente la
actividad del gen panD un aumento adicional de la producción del
ácido pantoténico, podrá aumentarse el rendimiento en ácido
pantoténico por ejemplo en otro 50% mediante la adición de
\beta-alanina libre y/o de sales de
\beta-alanina.
En una variante ventajosa de la presente
invención pueden añadirse hasta 20 g/l de
\beta-alanina libre y/o de sales de
\beta-alanina al medio de cultivo para el aumento
adicional de los rendimientos en ácido pantoténico en más de un 50%.
Es preferente la adición de aproximadamente 15 g/l de
\beta-alanina libre y/o de sales de
\beta-alanina al medio de
cultivo.
cultivo.
Ejemplos de fuentes de carbono adecuadas, según
la invención, para el empleo en el medio de cultivo para la
fermentación de los microorganismos, precedentemente citados, son
los azúcares, tales como los hidrolizados de almidón (monosacáridos,
disacáridos, oligosacáridos), preferentemente la glucosa o la
sacarosa así como las melazas de remolacha o de caña de azúcar, las
proteínas, los hidrolizados de proteína, la harina de soja, el agua
de maíz hinchado, las grasas, los ácidos grasos libres, las células
recicladas procedentes de fermentaciones ya realizadas o sus
hidrolizados así como extractos de levadura. Estas enumeraciones no
son limitativas de la presente invención.
Además, el procedimiento presente se caracteriza
de manera ventajosa porque el contenido total en azúcares se reduce
a un mínimo hasta el final de la fermentación, puesto que éstas
dificultarían, en otro caso, el secado ulterior y/o la formulación
de la solución de la fermentación debido a la pegajosidad. Esto
puede conseguirse, según la invención, si la fermentación se
continua durante algún tiempo adicional, desde que se haya consumido
la fuente de carbono (en el caso del cultivo según un
funcionamiento por tandas) o una vez que se haya interrumpido el
aporte de carbono (en el caso de una conducción del proceso en
alimentación por tandas o en alimentación por tandas repetidas) y/o
se regulará de tal manera que la concentración de la fuente de
carbono sea prácticamente nula (en el caso en que el procedimiento
se conduzca según la alimentación por tandas, la alimentación por
tandas repetidas o de manera continua).
Esto se lleva a cabo, según la invención, si
tras la interrupción de la dosificación de la fuente de carbono (por
ejemplo solución de azúcar) se continua la fermentación hasta que se
alcance la concentración en oxígeno disuelto (pO_{2}) de al menos
el 80%, preferentemente el 90% y, de forma especialmente preferente,
el 95% del valor de saturación en la solución de fermentación.
Ejemplos de fuentes de nitrógeno adecuadas,
según la invención, son el amoníaco, el sulfato de amonio, la urea,
las proteínas, los hidrolizados de proteína o los extractos de
levadura. Esta enumeración tampoco es limitativa de la presente
invención.
Además, el medio de fermentación contiene sales
minerales y/o elementos en trazas, tales como aminoácidos y
vitaminas. Las composiciones exactas de los medios de fermentación
adecuados son ampliamente conocidas y están a disposición del
técnico en la materia.
Tras inoculación del medio de fermentación con
un microorganismo adecuado, productor del ácido
D-pantoténico (con la densidad celular conocida por
el técnico en la materia) se lleva a cabo el cultivo del
microorganismo, en caso dado con adición de un agente antiespumante.
Una regulación, necesaria en caso dado, del valor del pH del medio
puede llevarse a cabo con diversas lejías o ácidos inorgánicos u
orgánicos tales como por ejemplo NaOH, KOH, amoníaco, ácido
fosfórico, ácido sulfúrico, el ácido clorhídrico, ácido fórmico,
ácido succínico, ácido cítrico o similares.
Debido a los sistemas tampón, empleados durante
la fermentación, que pueden ser como se han descrito
precedentemente, por ejemplo NaOH, KOH, amoníaco, ácido fosfórico,
ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido fórmico, ácido succínico,
el ácido cítrico o similares, el ácido
D-pantoténico formado se presenta en la solución de
fermentación, según el medio tampón empleado, en forma de la o de
las sales correspondientes. Puesto que en este caso no son
ventajosas especialmente las sales del ácido
D-pantoténico en forma de sus cationes monovalentes,
se elaborará la solución de la formulación, según la invención,
mediante nanofiltración. Para ello se añadirán, en primer lugar, al
D-pantotenato formado, sales, según la invención,
que contengan cationes polivalentes, con lo cual se forman sales
polivalentes del ácido D-pantoténico., según la
invención, la adición de las sales, que contienen cationes
polivalentes, puede llevarse a cabo en forma sólida o en forma de
solución acuosa durante, preferentemente al final, o tras la
fermentación en la etapa a). La alimentación de una solución acuosa
que contenga cationes polivalentes puede llevarse a cabo, por
ejemplo, de manera continua.
Del mismo modo, puede llevarse a cabo en una de
las etapas aguas arriba de la nanofiltración, es decir como paso
previo a la nanofiltración en la etapa c) del procedimiento según la
invención, una separación de la masa celular o de los componentes
precipitados en la solución. En este caso puede llevarse a cabo la
separación mediante decantación o mediante filtración a través de
membranas, preferentemente mediante ultrafiltración. En una variante
del procedimiento, según la invención, se llevará a cabo la
filtración por medio de membranas en forma de diafiltración.
También en este caso puede llevarse a cabo, según la invención, la
adición de sales, que contengan cationes polivalentes, en forma
sólida o como solución acuosa durante o después de una filtración a
través de membranas de una solución que contenga
D-pantotenato. A modo de ejemplo se lleva a cabo en
este caso de manera continua el aporte de una solución acuosa que
contenga cationes polivalentes.
Durante la separación de la masa celular y/o de
los componentes precipitados en la solución, tales como, por
ejemplo, sales de fosfato o bien sales de sulfato, enzimas,
hormonas, proteínas, antibióticos, pirógenos, virus, polisacáridos,
coloides, tensioactivos, pesticidas u otras substancias orgánicas
difícilmente solubles o insolubles, la separación se basa en el
aprovechamiento de la fuerza de la gravedad, de la fuerza
centrífuga, de la presión y del vacío. Los procedimientos
ejemplificativos son, entre otros: la decantación, la elutriación,
el tamizado, el aventado, la clasificación, la filtración, la
diálisis, las sedimentación, la microfiltración, la ultrafiltración,
la flotación, el fraccionamiento con ayuda de espuma, la separación
por medio de piel sobrenadante, el aclarado, la centrifugación o la
separación. Como filtración por medio de membrana se abarca un
procedimiento de separación por medio de membranas que trabaja
mediante una diferencia de presión entre el lado de alimentación y
el lado del permeato, tal como la microfiltración o la
ultrafiltración. Los procedimientos se diferencian, por ejemplo,
por los límites de separación. De este modo, en el caso de la
ultrafiltración, el límite de exclusión (cut-off) no
se refiere al tamaño de las partículas tal como se hace, por
ejemplo, en el caso de la microfiltración, sino que se refiere al
peso molecular, que se encuentra en el intervalo desde
aproximadamente 10^{3} hasta 2x10^{6}. En el caso de la
ultrafiltración se obtiene, además del filtrado (permeato) el
denominado concentrado (retentato).
Para la separación de productos sólidos o para
el enriquecimiento o para el empobrecimiento de productos disueltos
de peso molecular medio y elevado se emplearán, ventajosamente,
membranas porosas, estructuradas de manera asimétrica.
Las membranas, empleadas según la invención,
pueden estar constituidas, en una variante preferente, por una capa
de separación, que provoca la separación de los productos
propiamente dicha, y por una capa protectora con una o con varias
capas, que porta la capa de separación y que presenta poros de mayor
tamaño que los de la capa de separación. Las capas de separación así
como la capa protectora pueden estar constituidas por polímeros
orgánicos o inorgánicos, por cerámica, por metal o por carbono y
deben ser estables en el medio de la reacción y a la temperatura del
procedimiento. Ejemplos a este respecto han sido enumerados en la
tabla 1, sin embargo sin que quede limitada la presente
invención:
Las membranas pueden emplearse en forma de
mangueras, de tubos, de capilares, de fibras huecas o de membranas
planas en módulos, en sí conocidos, planos, tubulares, con canales
múltiples, capilares o enrollados.
Las presiones transmembranales, óptimas, entre
el retentato y el permeato se encuentran comprendidas,
esencialmente, en función del diámetro de los poros de la membrana o
bien del límite de separación (dado en unidades de peso molecular),
de la estabilidad mecánica de la membrana y según el tipo de
membrana, entre 1 y 40 bares. Presiones transmembranales mayores
conducen, por regla general, a mayores flujos de permeato. En este
caso podrá adaptarse la presión transmembranal mediante el aumento
de la presión del permeato en el caso en que la alimentación
(solución a ser elaborada) sea introducida con una presión demasiado
elevada.
La temperatura de trabajo depende de la
estabilidad del producto y de la estabilidad de la membrana. Ésta se
encuentra comprendida entre aproximadamente 20 y 90ºC,
preferentemente entre aproximadamente 40 y 70ºC. Temperaturas
mayores conducen a mayores flujos de permeato. En este caso pueden
emplearse, por ejemplo, membranas según la tabla 2, que, sin
embargo, no limitan la presente invención.
La separación celular puede llevarse a cabo,
según la invención, de manera ventajosa también por medio de una
forma especial de la filtración por medio de membranas,
concretamente por medio de la diafiltración.
La diafiltración puede llevarse a cabo de manera
discontinua, conduciéndose la solución, que contiene las sales
polivalentes del ácido D-pantoténico, a través de un
circuito cerrado, que contiene un recipiente, una bomba y uno o
varios módulos de membranas y, en este caso, se ajusta la presión en
los módulos con membranas de tal manera, que se obtenga el permeato.
En este caso se alimentará permanentemente o a determinados
intervalos de tiempo, agua o una solución acuosa, que no contenga el
producto a ser separado o que lo contenga a una concentración menor
que la existente en el instante de la adición en el circuito de
separación. La solución acuosa puede contener, según la invención,
sales de cationes polivalentes, tales como por ejemplo halogenuros
de calcio o de magnesio o sus combinaciones, preferentemente cloruro
de calcio y/o cloruro de magnesio. La separación celular mediante la
diafiltración puede llevarse a cabo, según la invención, también de
manera continua, conectándose en serie preferentemente varios
módulos con membranas o conectándose en serie respectivamente uno o
varios circuitos cerrados de bombeo que contengan el módulo con
membrana. Puede añadirse agua o una solución acuosa, que no contenga
el producto a ser separado o que lo contenga en una concentración
menor que la que se presenta en el punto de la adición, antes, entre
o después de los módulos con membrana o de los circuitos cerrados
de bombeo, pudiendo contener la solución acuosa, como ocurre en la
variante discontinua, sales de cationes polivalentes, tales como por
ejemplo halogenuros de calcio o de magnesio o sus combinaciones.
Preferentemente cloruro de calcio y/o de magnesio.
Según la invención, puede llevarse a cabo la
ultrafiltración o la diafiltración directamente con la descarga de
la fermentación o después de un tratamiento de la descarga de la
fermentación, por ejemplo mediante centrifugación, decantación o
procedimientos similares.
En tanto en cuanto se lleve a cabo, según la
invención, una separación de la masa celular o de los componentes
precipitados en la solución, podrá llevarse a cabo la adición de
sales que contienen cationes polivalentes según la etapa b) del
procedimiento según la invención, antes, durante o después de la
ultrafiltración o de la diafiltración. En las variantes del
procedimiento, según la invención, se añadirán como cationes
polivalentes, por ejemplo, cloruro, nitrato, hidróxido, formiato,
acetato, propionato, glicinato y/o lactato de calcio y/o de
magnesio. En este caso puede añadirse como catión polivalente por
ejemplo Ca^{2+} en una concentración desde 0,05 hasta 50 moles de
Ca^{2+}/mol de D-pantotenato, preferentemente
desde 0,2 hasta 2 moles de Ca^{2+}/mol de
D-pantotenato.
En la etapa c) del procedimiento, según la
invención, se elabora por lo tanto la solución que contiene sales
polivalentes del ácido D-pantoténico mediante
nanofiltración, enriqueciéndose las sales polivalentes del ácido
D-pantoténico y empobreciéndose, simultáneamente,
los iones monovalentes indeseables, preferentemente los cationes
monovalentes tales como, por ejemplo, los iones de amonio, de sodio
o de potasio. El procedimiento, según la invención, se caracteriza
porque el contenido en cationes monovalentes, preferentemente en
iones amonio, potasio y/o sodio, se reduce hasta una concentración
de 5 g/kg de solución.
La presente invención abarca todos los sistemas
de nanofiltración disponibles en la industria. La separación se
lleva a cabo, ventajosamente, sobre membranas porosas, estructuradas
de manera asimétrica. En una variante preferente del procedimiento,
según la invención, se emplearán, para ello, membranas, que estén
constituidas por una capa de separación, que provoca la separación
del producto propiamente dicha, y por una capa de protección con
una o varias capas, que porta la capa de separación y que presenta
poros de mayor tamaño que los de la capa de separación. Las capas
de separación así como la capa protectora pueden estar constituidas
por polímeros orgánicos, cerámica, metal o carbono y deben ser
estables en el medio de la reacción y a la temperatura del
procedimiento. Los materiales preferentes para la capa de separación
son las poliamidas, las poliimidas o las polipiperazinas. Las capas
de separación pueden presentar también una carga superficial
positiva o negativa. Como ejemplo de una membrana de nanofiltración
funcionalizada de manera aniónica debe citarse la membrana DESAL 5
DK, sin que la presente invención quede limitada, sin embargo, al
empleo exclusivo de esta membrana.
Las membranas pueden emplearse en forma de
mangueras, de capilares, de fibras huecas o de membranas planas en
módulos, en sí conocidos, planos, tubulares, con elementos
múltiples, capilares o enrollados.
En las variantes preferentes del procedimiento,
según la invención, se aplicará durante la nanofiltración, en la
etapa c), una diferencia de presión sobre la membrana en el
intervalo desde 5 hasta 100 bares, preferentemente desde 20 hasta
80 bares y, de forma especialmente preferente, desde 40 hasta 70
bares.
La temperatura del procedimiento se encuentra
comprendida de forma ventajosa entre 20 y 80, preferentemente entre
30 y 60ºC. Además, la nanofiltración puede llevarse a cabo en una
manera conocida por el técnico en la materia en una o varias
etapas, de manera continua o de manera discontinua.
En una variante preferente se alimentará
respectivamente, como paso previo a una o varias etapas de
nanofiltración, una sal que contenga cationes polivalentes en forma
sólida o en solución acuosa., según la invención, se alimentarán
los cationes polivalentes en forma de cloruro, de nitrato, de
hidróxido, de formiato, de acetato, de propionato, de glicinato y/o
de lactato de calcio y/o de magnesio. En este caso puede añadirse el
catión polivalente Ca^{2+} en una concentración desde 0,05 hasta
50 moles de Ca^{2+}/mol de D-pantotenato,
preferentemente desde 0,2 hasta 2 moles de Ca^{2+}/mol de
D-pantotenato (referido al estado tras la
mezcla).
El procedimiento, según la invención, se
caracteriza porque la adición de las sales que contienen cationes
polivalentes en forma sólida o en forma de solución acuosa se lleva
a cabo durante, preferentemente al final, o después de la
fermentación en la etapa a) o durante o después de la separación
celular.
Según la invención puede llevarse a cabo
preferentemente, además, la adición de las sales que contienen los
cationes polivalentes durante la etapa de nanofiltración. Además, el
aporte de una solución acuosa, que contenga cationes polivalentes,
puede llevarse a cabo de manera continua.
En otra variante del presente procedimiento
puede imaginarse que se obtengan soluciones con una concentración
variable del producto en una o varias de las etapas del
procedimiento conectadas aguas arriba de la nanofiltración. Estas
soluciones citadas pueden elaborarse adicionalmente por medio de una
nanofiltración de tal manera, que las soluciones citadas sean
alimentadas en el orden de las concentraciones crecientes en
producto a las etapas subsiguientes de nanofiltración.
Según la invención, se enriquecerán en el
retentato de la nanofiltración, ante todo, las sales polivalentes
del ácido pantoténico mediante el procedimiento, según la invención,
precedentemente descrito. En la solución del permeato se
enriquecerán, fundamentalmente, los iones monovalentes, cuando se
utilice una membrana de nanofiltración, funcionalizada de manera
aniónica, se enriquecerán los cationes monovalentes. El contenido
en cationes monovalentes, preferentemente los iones de amonio, de
potasio y/o de sodio, en el retentato puede reducirse en este caso
hasta una concentración de 5 g/kg de solución.
Según la invención, puede reciclarse el permeato
de la nanofiltración o una parte del mismo hasta la fermentación en
la etapa a) del procedimiento según la invención. Este reciclo del
permeato o de partes del mismo puede llevarse a cabo de manera
continua. Las etapas del procedimiento precedentemente descritas,
realizadas además de la nanofiltración, sirven para la
concentración previa o para la concentración ulterior del
D-pantotenato en forma de sales polivalentes.
Otra ventaja de la nanofiltración, empleada
según la invención, consiste en que la reacción de los cationes
monovalentes (en la solución del retentato) puede ir acompañada
simultáneamente de una disminución del volumen del retentato. La
elaboración de la solución de la fermentación, que contiene el
D-pantotenato mediante nanofiltración puede
emplearse, por lo tanto, según la invención, como procedimiento para
el intercambio de iones y procedimiento para la concentración para
la obtención del D-pantotenato.
Esto conduce, de manera ventajosa, a una
simplificación y, al mismo tiempo, a una mayor eficacia de las
etapas siguientes del procedimiento. A modo de ejemplo puede
reducirse sensiblemente el coste energético para el secado debido a
la concentración.
En una forma preferente de realización de la
presente invención se liberará la solución de la fermentación de la
masa celular mediante centrifugación y/o decantación y/o
ultrafiltración. Tras adición de 0,05 hasta 50 moles de iones
(Ca^{2+})/mol de ión pantotenato, preferentemente desde 0,2 hasta
2 moles de iones Ca^{2+}/mol de ión pantotenato, que se disponen
preferentemente en forma de una solución diluida con 0,01 hasta 10
moles de Ca^{2+}/l, se hace pasar la solución, obtenida de este
modo, a través de un módulo de nanofiltración. La diferencia de
presión sobre la membrana se encuentra en el intervalo desde
aproximadamente 5 hasta 100 bares, preferentemente desde
aproximadamente 20 hasta 80 bares, de forma especialmente preferente
desde aproximadamente 40 hasta 70 bares. Antes o durante la
nanofiltración puede añadirse en este caso una solución acuosa, que
contenga iones Ca^{2+} a la solución que barre el lado de
alimentación de la membrana. El retentato tiene un volumen de un 30
hasta un 200% de la solución de partida. Además se elimina desde
aproximadamente un 5 hasta un 99%, preferentemente desde un 30
hasta un 80% de los cationes monovalentes contenidos.
El retentato contiene, preferentemente,
D-pantotenato de calcio,
D-pantotenato de magnesio o una mezcla de los
mismos, a continuación se somete a un secado y/o a una formulación.
El secado y/o la formulación de la solución, que contiene
D-pantotenato de calcio y/o de magnesio, se lleva a
cabo según procedimientos en sí conocidos, tales como por ejemplo
el secado por pulverización, la granulación por pulverización, el
secado en lecho fluidificado, la granulación en lecho fluidificado,
el secado en tambor o el secado mediante centrifugación instantánea
(Spin-flash) (Ullmann's Encyclopedia of Industrial
Chemistry, 6^{th} edition, 1999, electronic release, capítulo
"Drying of Solid Materials" (Secado de materiales sólidos)). La
temperatura de entrada de los gases en el caso del secado por
convección se encuentra en el intervalo desde 100 hasta 280ºC,
preferentemente entre 120 y 210ºC. La temperatura de salida de los
gases se encuentra comprendida entre 50 y 180ºC, preferentemente se
encuentra comprendida entre 60 y 150ºC. Para el ajuste de una
distribución deseada del volumen de las partículas y de las
propiedades del producto, relacionadas con ello, pueden separarse
las partículas finas y reciclarse. Además, el producto grosero
puede molerse en un molino y, igualmente, reciclarse a
continuación.
El procedimiento, según la invención, presenta
la ventaja de que se eliminan de manera eficiente y casi por
completo los cationes indeseables y, al mismo tiempo, se verifica
una reducción del volumen, que simplifica o que hace más eficientes
las siguientes etapas del procedimiento, especialmente el secado y/o
la formulación. Además no tiene lugar una descomposición del
producto o únicamente lo hace en una proporción extraordinariamente
reducida, al mismo tiempo que se alcanzan elevados rendimientos en
producto. Mediante el aporte de soluciones salinas de cationes
polivalentes durante o al final de la fermentación o durante o al
final de una ultrafiltración o de una diafiltración o durante la
etapa de nanofiltración y/o un reciclo del permeato hasta la
solución de fermentación se aumentan los rendimientos en
D-pantotenato en forma de iones polivalentes,
preferentemente en forma de iones divalentes, tales como calcio o
magnesio.
Según la invención es ventajoso en el
procedimiento precedentemente descrito, además, la reducción de
costosas etapas de elaboración, especialmente la eliminación del
empleo de disolventes orgánicos, con la puesta a disposición
simultánea de un producto deseado con buen valor biológico. Además,
según la invención, se reduce esencialmente la cantidad de aguas
residuales formadas. Esto da como resultado un ahorro adicional de
instalaciones costosas para la elaboración y para la eliminación.
Por lo tanto, el procedimiento, según la invención, se caracteriza,
de manera ventajosa, porque es más sencillo, está menos propenso a
perturbaciones, requiere una menor cantidad de tiempo, es
claramente de coste más conveniente y, por lo tanto, más económico
que los procedimientos tradicionales.
Sin embargo esto no excluye que el
procedimiento, según la invención, pueda ser modificado. El
procedimiento precedentemente descrito, según la invención, puede
complementarse por una o varias de las etapas siguientes del
procedimiento, que, tomadas en sí mismas, son familiares para el
técnico en la materia. En este caso quedan abarcadas todas las
combinaciones imaginables de las etapas del procedimiento siguientes
con las etapas del procedimiento según la invención, citadas hasta
ahora.
De este modo las soluciones, resultantes del
procedimiento según la invención, pueden liberarse de los gérmenes
mediante calentamiento (esterilización) o por medio de otros
métodos, tales como por ejemplo pasteurización o filtración
estéril.
En otras variantes del procedimiento, según la
invención, puede llevarse a cabo, como paso previo al secado y/o a
la formulación del retentato, al menos una etapa o una combinación
de las etapas siguientes, que comprenden la lisis y/o la
destrucción de la biomasa y/o la separación de la biomasa de la
solución de fermentación y/o la adición de otros aditivos y/o la
concentración de la solución de la fermentación, preferentemente
mediante eliminación del agua.
El objeto de la presente invención consiste
también, por lo tanto, en un procedimiento según el cual se lleva a
cabo la lisis y/o la destrucción de la biomasa además en la solución
de fermentación o solamente después de la separación de la biomasa
de la solución de fermentación. Esto puede llevarse a cabo, por
ejemplo, mediante un tratamiento térmico, preferentemente a 80
hasta 200ºC y/o mediante un tratamiento ácido, preferentemente con
ácido sulfúrico o ácido clorhídrico y/o enzimático, preferentemente
con lisozima.
También puede imaginarse que la separación de la
masa celular formada se lleve a cabo directamente mediante la
nanofiltración, es decir simultáneamente con el intercambio de los
cationes monovalentes por los cationes poliva-
lentes.
lentes.
La solución, resultante de la elaboración
mediante nanofiltración, puede concentrarse como paso previo al
secado y/o a la formulación por medio de un evaporador adecuado, por
ejemplo evaporador de película descendente, evaporador de capa
delgada o evaporador rotativo. Tales evaporadores son fabricados,
por ejemplo, por las firmas GIG (4800 Attnang Puchheim, Austria),
GEA Canzler (52303 Düren, Alemania), Diessel (31103 Hildesheim,
Alemania) y Pitton (35274 Kirchhain, Alemania).
Para mejorar las propiedades de color del
producto final puede llevarse a cabo una etapa adicional de
filtración, en la cual se añade un poco de carbón activo a las
soluciones obtenidas durante el procedimiento y a continuación se
filtra esta suspensión. O bien las soluciones obtenidas durante la
fermentación pueden hacerse pasar a través de un pequeño lecho de
carbón activo. Las cantidades de carbón activo empleado, necesarias
en este caso, se encuentran en algunos % en peso de la solución y
corresponden a los conocimientos y al arbitrio del técnico en la
materia.
Estas filtraciones pueden facilitarse si se
añade a la solución correspondiente, como paso previo a la
filtración, un agente auxiliar para la floculación, usual en el
comercio (por ejemplo Sedipur CF 902 o Sedipur CL 930 de la firma
BASF AG, Ludwigshafen).
En una forma ventajosa de realización de la
presente invención se esterilizará mediante calentamiento la
descarga de la fermentación (caldo de la fermentación) y a
continuación se libera de la masa celular mediante centrifugación,
filtración, ultrafiltración o decantación. Tras adición de 50 hasta
1.000 mg/kg, preferentemente desde 100 hasta 200 mg/kg de un agente
auxiliar de la floculación, usual en el comercio, con relación a la
descarga de la fermentación, se filtra a través de un lecho corto
de carbón activo y de arena para obtener una solución exenta de
biomasa con un elevado contenido en ácido
D-pantoténico. A continuación se elabora mediante
nanofiltración esta solución elaborada.
El secado de esta solución, subsiguiente, puede
llevarse a cabo, por ejemplo, mediante secado por pulverización.
Este puede llevarse a cabo en corrientes paralelas, a
contracorriente o en corriente mixta. Para la pulverización pueden
utilizarse todos los pulverizadores conocidos, especialmente los
pulverizadores por centrifugación (discos pulverizadores), las
toberas para un solo componente o las toberas para dos componentes.
Las condiciones preferentes de temperatura para el secado son desde
150 hasta 250ºC de temperatura de entrada en la torre y desde 70
hasta 130ºC de temperatura de salida de la torre. Sin embargo puede
llevarse a cabo el secado también a un nivel de temperaturas mayor
o menor. Con el fin de conseguir una humedad residual baja puede
conectarse aguas abajo también otra etapa de secado en un lecho
fluidificado.
El secado por pulverización puede llevarse a
cabo en un secadero FSD o SBD (FSD: Fluidized Spray Dryer (Secadero
con pulverización fluidificada); SBD: Spray Bed Dryer (Secadero con
lecho pulverizado)), como los que son construidos por las firmas
Niro (Kopenhagen, Dinamarca) y APV-Anhydro
(Kopenhagen, Dinamarca), que representan una combinación del
secadero por pulverización y del lecho fluidificado.
En el caso del secado por pulverización puede
añadirse un agente auxiliar de la fluencia. De este modo puede
reducirse la formación de depósitos sobre las paredes laterales del
secadero y pueden mejorarse los comportamientos a la fluencia,
precisamente en el caso de los polvos de grano fino. Como agentes
auxiliares de la fluencia entran en consideración, especialmente,
los silicatos, los estearatos, los fosfatos o el almidón de
maíz.
En principio puede llevarse a cabo el secado
también en una capa fluidificada para el secado, pudiéndose hacer
funcionar ésta tanto de manera continua como también de manera
discontinua. La inserción por pulverización de la solución puede
llevarse a cabo tanto por la parte superior (pulverización en la
cabeza -Topspray-), desde la parte inferior (pulverización desde el
fondo -Bottomspray-) así como también de manera lateral
(pulverización lateral -Sidespray-).
El objeto de la presente invención está
constituido, además, por una composición para el empleo como aditivo
para pienso de los animales y/o como agente para el complemento del
pienso de los animales, pudiéndose preparar ésta si
- a)
- se emplea, al menos, un microorganismo productor del ácido D-pantoténico, cuya biosíntesis del ácido pantoténico-(pan) y/o de la isoleucina/valina-(ilv) esté desregulada y que forme, al menos, 2 g/l de sales del ácido D-pantoténico mediante fermentación en un medio de cultivo, añadiéndose al medio de cultivo desde 0 hasta 20 g/l, preferentemente 0 g/l de \beta-alanina libre y/o de sal de \beta-alanina,
- b)
- se añaden al D-pantotenato formado, sales que contengan cationes polivalentes, formándose sales polivalentes del ácido D-pantoténico,
- c)
- la solución de la fermentación, que contienen el D-pantotenato se elabora mediante nanofiltración, enriqueciéndose las sales polivalentes del ácido D-pantoténico,
- d)
- se somete al retentato de la nanofiltración, que contiene las sales polivalentes del ácido D-pantoténico, a un secado y/o a una formulación.
En una variante de la presente invención queda
abarcada una composición que se caracteriza porque puede prepararse
si se lleva a cabo, como paso previo a la nanofiltración en la etapa
c), una separación de la masa celular o de los componentes
precipitados en la solución, preferentemente mediante filtración a
través de membranas, de forma especialmente preferente mediante
ultrafiltración y, de forma muy especialmente preferente, mediante
diafiltración. La presente invención se refiere, además, a una
composición que se caracteriza porque puede prepararse si se añaden
sales (en forma sólida o como solución acuosa) que contienen
cationes polivalentes durante o después de la separación de la masa
celular o de los componentes precipitados en la solución., según la
invención, pueden añadirse las sales también, en otra variante,
durante la nanofiltración.
Según la invención se caracteriza la
composición, además, porque contiene las sales del ácido
D-pantoténico en una concentración de al menos 1
hasta 100% en peso, preferentemente desde 20 hasta 100% en peso y,
de forma especialmente preferente, al menos del 50% en peso. El
objeto de la presente invención es una composición que contiene las
sales del ácido D-pantoténico en forma de cationes
divalentes, preferentemente como D-pantotenato de
calcio y/o de magnesio., según la invención, es preferente una
composición que se caracteriza porque el contenido en sales del
ácido D-pantoténico en forma de cationes
monovalentes es de 5 g/kg.
Según la invención se obtiene mediante el
procedimiento, precedentemente descrito, un
D-pantotenato de calcio o de magnesio, que cumple
las exigencias de un aditivo para piensos. Estos requisitos son, por
ejemplo, un contenido relativamente elevado en
D-pantotenato y una buena compatibilidad con el
organismo al que va dirigido así como una buena valencia biológica
en el sentido del "efecto vitamina" del producto según la
invención.
La presente invención se explicará con mayor
detalle por medio de los ejemplos siguientes que, sin embargo, no
constituyen ninguna limitación de la invención:
Se dispone en un fermentador de laboratorio, con
agitador y con dispositivo de gasificación, con una capacidad de 14
litros, medio de fermentación acuoso con la siguiente
composición:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la esterilización se añadieron
adicionalmente los siguientes componentes del medio estériles:
La solución de la sal den trazas está
constituida de la manera siguiente:
Se completaron con agua hasta 1 litro 0,15 g
de Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O, 2,5 g de H_{3}BO_{3}, 0,7 g
de CoCl_{2} x 6 H_{2}O, 0,25 g de CuSO_{4} x 5 H_{2}O, 1,6 g
de MnCl_{2} x 4 H_{2}O, 0,3 g de ZnSO_{4} x 7 H_{2}O. La
adición de la solución de las sales en trazas se llevó a cabo a
través de una filtración esterilizante. El volumen del líquido
inicial fue de 5 litros. Los contenidos anteriormente indicados
están referidos a este valor.
Se añadieron, a esta solución, 100 ml de cultivo
de inoculación (OD = 10) de Bacillus subtilis PA668 y se
fermentaron a 43ºC bajo viva agitación con una velocidad de
gasificación de 12 l/min. Esta cepa se describe según el anexo en
la US 2004/0091979.
Se dosificaron, en el transcurso de 47 horas,
2,1 litros de una solución acuosa estéril. La composición fue:
Durante la fermentación se mantuvo el valor del
pH en 7,2 mediante la dosificación de solución de amoníaco al 25% o
bien de ácido fosfórico al 20%. El amoníaco sirve, al mismo tiempo,
como fuente de nitrógeno para la fermentación. El número de
revoluciones del órgano de agitación se reguló manteniéndose el
contenido en oxígeno disuelto en el 30% del valor de la saturación.
Tras interrupción de la dosificación de la fuente de carbono se
prosiguió la fermentación hasta que el contenido en carbono disuelto
(pO_{2}) había alcanzado un valor del 95% del valor de la
saturación. La concentración en D-pantotenato en el
momento de la interrupción al cabo de 48 horas fue de 22,8 g/l.
De manera análoga pueden generarse caldos de
fermentación que presentan ácido pantoténico exento de adición de
\beta-alanina con un título mayor que 20, que 25,
que 30, que 35, que 40, que 45, que 50, que 55, que 60, que 65, que
70, que 75, que 80, que 85, y >90 g/L.
Se sometieron 7.000 ml de la descarga de la
fermentación, preparados según el ejemplo 1, a una
ultracentrifugación empleándose un módulo de agitación cerámico
monocanal (firma Atech, Gladbeck, Alemania). En este caso se empleó,
por un lado, una membrana con una anchura de poros de 20 kD (10 nm)
y, por otro lado, con una anchura de poros de 50 nm.
La temperatura durante los ensayos fue de 40ºC,
la velocidad de rebose fue de 4 m/s y la presión transmembranal
(TMP= [p(alimentación) + p(retentato)]/2 -
p(permeato)), fue de 1 bar, en tanto en cuanto no se diga
otra cosa.
En la figura 1 se han representado los flujos
transmembranales (flujo de permeato) en función del factor de
concentración MK (MK(t) = m_{carga} / m_{retentato}
(t).
En este caso se pone claramente de manifiesto
que la membrana con la menor anchura de poros (20 kD) muestra
flujos claramente mayores que las membranas con la mayor anchura de
poros (50 nm).
Se sometieron 7.000 ml de la descarga de
fermentación, preparada según el ejemplo 1, a una ultrafiltración
de manera análoga a la del ejemplo 2, presentando la membrana
empleada una anchura de poros de 20 kD.
La figura 2 muestra que la concentración con la
descarga de la fermentación ya centrifugada es claramente mayor que
en el ejemplo 2.
Se emplearon 1.000 ml de una solución acuosa que
contiene pantotenato de calcio (véase tabla 3, columna carga de
retentato) en una célula a presión con agitación con un contenido
máximo de trabajo de aproximadamente 1,5 litros. La presión de
alimentación ("Feed") se genera en esta célula mediante
introducción a presión de nitrógeno y el rebose de la membrana se
asegura mediante agitación con un agitador de ancla que se hace
funcionar por medio de un acoplamiento magnético.
Se utilizó una membrana de nanofiltración DESAL
5 DK, adquirida en la firma Osmonics Deutschland GmbH en Moers.
Antes, entre y después de los ensayos con la
solución anteriormente citada se llevaron a cabo ensayos de
retención, para la verificación de la integridad de la membrana,
con solución de MgSO_{4} (2.000 ppm en peso).
La retención R_{i}, se ha indicado en las dos
columnas de la derecha en la tabla 3. En este caso la retención se
define de la manera siguiente: R_{i} = 1 -
c_{i,permeato}/c_{i,retentato}; con R_{i} = retención para el
componente i, c_{i,permeato} = concentración del componente i en
el permeato, c_{i,retentato} = concentración del componente i en
el retentato.
Con las concentraciones quieren indicarse las
concentraciones momentáneas que se establecen en un instante dado
con el ensayo no estacionario, pero no las concentraciones en las
fracciones, que se presenta después del final del ensayo. La
retención R_{i} es independiente de la concentración en el caso
ideal, lo cual se demostró también en el caso del cálculo de los
valores indicados a partir de las concentraciones en las
fracciones.
Por la tabla 3 puede verse que el Ca^{2+} y el
pantotenato son retenidos en un 84 y, respectivamente, o bien en un
99%, es decir que están presentes en el retentato.
En la elaboración de una solución acuosa formada
por pantotenato de Na (0,2 moles/litro) se llevó a cabo, bajo
condiciones análogas a las del ejemplo 4, una concentración mediante
nanofiltración. La tabla 4 muestra que la retención del pantotenato
es del 80%.
La concentración de una solución equimolar de
NaCl/CaCl_{2} bajo condiciones análogas a las del ejemplo 4 se ha
reunido en la tabla 5. En este caso puede verse que la retención de
la membrana para el Ca^{2+}, con un valor del 41% o bien del 42%,
es relativamente baja frente a la elevada retención del calcio en
combinación con el pantotenato
(ejemplo 5).
(ejemplo 5).
- Figura 1:
- representación gráfica del flujo transmembranal (flujo de permeato) de la descarga de la fermentación en una ultrafiltración en función del factor de concentración MK con empleo de membranas con una anchura de poros de 50 nm y de 20 kD.
- Figura 2:
- representación gráfica del flujo transmembranal (flujo de permeato) de la descarga de la fermentación, centrifugada, en el caso de una ultrafiltración en función del factor de concentración MK con empleo de una membrana con una anchura de 20 kD.
- Tabla 1:
- recopilación de las membranas estructuras de manera asimétrica para la separación de la masa celular o de los componentes precipitados en solución.
- Tabla 2:
- recopilación de las membranas y sus propiedades para la separación de la masa celular o de los componentes precipitados en solución.
- Tabla 3:
- recopilación sobre los valores analíticos de una nanofiltración, especialmente en lo que se refiere a la retención de los iones calcio y pantotenato, en una solución acuosa que contiene 0,1 mol/kg de pantotenato de Ca y 0,2 mol/kg de NaCl.
- Tabla 4:
- recopilación de los valores analíticos de una nanofiltración, especialmente en lo que se refiere a la retención de los iones calcio y pantotenato, en una solución acuosa que contiene 0,2 mol/l de pantotenato de Na y 0,1 mol/l de CaCl_{2}.
- Tabla 5:
- recopilación de los valores analíticos de una nanofiltración, especialmente en lo que se refiere a la retención de los iones calcio, en una solución acuosa que contiene cantidades equimolares de NaCl y de CaCl_{2}.
Claims (19)
1. Procedimiento para la obtención de ácido
D-pantoténico y/o de sus sales, caracterizado
porque
- a)
- se emplea, al menos, un microorganismo productor del ácido D-pantoténico, cuya biosíntesis del ácido pantoténico-(pan) y/o de la isoleucina/valina-(ilv) esté desregulada y que forme, al menos, 2 g/l de sales del ácido D-pantoténico mediante fermentación en un medio de cultivo, añadiéndose al medio de cultivo desde 0 hasta 20 g/l de \beta-alanina libre y/o de sal de \beta-alanina,
- b)
- empleándose sistemas tampón usuales para la neutralización del ácido pantoténico formado y se añaden al D-pantotenato formado sales que contienen cationes polivalentes, formándose sales polivalentes del ácido D-pantoténico,
- c)
- la solución que contiene las sales polivalentes del ácido D-pantoténico se elabora mediante nanofiltración, enriqueciéndose las sales polivalentes del ácido D-pantoténico y
- d)
- el retentato de la nanofiltración, que contiene las sales polivalentes del ácido D-pantoténico se somete a un secado y/o a una formulación.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque no se añade al medio de cultivo
\beta-alanina libre y/o sal de
\beta-alanina.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque se emplea una
bacteria, una levadura o un hongo como organismo productor del
ácido D-pantoténico.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se emplea una
bacteria de la familia de los Bacillaceos como microorganismo.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se emplea una
bacteria del género Bacillus y, preferentemente, de la especie
B. subtilis, B. licheniformis o B. amyloliquefaciens.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque en la etapa a)
se forma un contenido en ácido D-pantoténico y/o de
sus sales de, al menos, 10 g/l de medio de cultivo, preferentemente
de, al menos, 20 g/l, de forma especialmente preferente de, al
menos, 40 g/l y, en el caso más preferente de, al menos, 60 g/l de
medio de cultivo.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque antes de la
nanofiltración en la etapa c) se lleva a cabo una separación de la
masa celular o de los componentes precipitados en la solución.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque la separación se lleva a cabo mediante
decantación o mediante filtración con membranas, preferentemente
mediante ultrafiltración.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 7 o 8, caracterizado porque se lleva a cabo
la filtración por medio de membranas en forma de diafiltración.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se lleva a cabo
la adición de sales que contienen cationes polivalentes en forma
sólida o de solución acuosa durante, preferentemente al final, o
tras la fermentación en la etapa a) o durante o después de una
filtración por medio de membranas, a una solución que contiene
D-pantotenato.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la adición de
sales que contienen cationes polivalentes en forma sólida o como
solución acuosa se lleva a cabo durante una nanofiltración.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se lleva a cabo
de manera continua la alimentación de una solución acuosa que
contiene cationes polivalentes.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se añaden los
cationes polivalentes en forma de cloruro, de nitrato, de
hidróxido, de formiato, de acetato, de propionato, de glicinato y/o
de lactato de calcio y/o de magnesio.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque catión
polivalente se alimenta Ca^{2+} en una concentración desde 0,05
hasta 50 moles de Ca^{2+}/mol de D-pantotenato,
preferentemente desde 0,2 hasta 2 moles de Ca^{2+}/mol de
D-pantotenato.
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque durante la
nanofiltración en la etapa c) se establece una diferencia de
presión sobre la membrana en el intervalo desde 5 hasta 100 bares,
preferentemente desde 20 hasta 80 bares y, de forma especialmente
preferente, desde 40 hasta 70 bares.
16. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque mediante la
nanofiltración, en la etapa c), se reduce el contenido en cationes
monovalentes, preferentemente en iones amonio, potasio y/o sodio,
hasta una concentración de \leq 5 g/kg de solución.
17. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el permeato
procedente de la etapa c), o una parte del mismo, se recicla hasta
la fermentación en la etapa a).
18. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el reciclo del
permeato o de una parte del mismo se lleva a cabo de manera
continua.
19. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el retentato
procedente de la etapa c) es una suspensión que contiene sales
polivalentes del ácido D-pantoténico.
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