ES2278929T3 - Procedimiento para la obtencion del acido d-pantotenico y/o sales como aditivos para piensos de animales. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la adición de sales que contienen cationes polivalentes en forma sólida o como solución acuosa se lleva a cabo durante una nanofiltración.

Description

Procedimiento para la obtención del ácido D-pantoténico y/o sales como aditivos para piensos de animales.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención del ácido D-pantoténico y/o de sus sales y al empleo como aditivo para piensos para animales.
El D-pantotenato se encuentra ampliamente extendido en el reino vegetal y animal como producto de partida de la biosíntesis del coenzima A. En contra de lo que ocurre en los seres humanos, que ingieren el ácido pantoténico en cantidades suficientes a través de la alimentación, se han descrito sin embargo frecuentemente síntomas de carencias del D-pantotenato tanto en el caso de las plantas como en el caso de los animales. La disponibilidad del D-pantotenato es, por lo tanto, de un gran interés económico, especialmente en la industria de los piensos para animales.
Tradicionalmente, se lleva a cabo la obtención del D-pantotenato mediante síntesis química a partir de la D-pantolactona y del alaninato de calcio (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6^{th} edition, 1999, electronic release, capítulo "Vitamins"). Para la puesta a disposición de la D-pantolactona se requiere una disociación costosa, clásica, de racematos a través de las sales diastereómeras. El producto comercializable, que resulta de la síntesis química es, en la mayoría de los casos, la sal de calcio del ácido D-pantoténico, el D-pantotenato de calcio.
Frente a las síntesis químicas, los procedimientos biotecnológicos de obtención con microorganismos tienen como ventaja la puesta a disposición selectiva (enantiómeramente pura) de la forma D del ácido pantoténico empleable por los organismos superiores. Por lo tanto se elimina una disociación, costosa, del racemato, como se requiere en el caso de las síntesis químicas.
Los procedimientos de fermentación para la obtención del ácido D-pantoténico con microorganismos son conocidos en gran número, de este modo pueden verse, entre otras, las publicaciones EP 0 590 857, WO 96/33283, US 6,013,492, WO 97/10340, DE 198 46 499, EP 1 001 027, EP 1 006 189, EP 1 006 192 y EP 1 006 193.
De este modo, las publicaciones EP 1 006 189 y EP 1 001 027 describen procedimientos para la obtención de pantotenato en los cuales se consigue un contenido en la solución de fermentación de 1 g/l como máximo de ácido D-pantoténico. Los contenidos en ácido pantoténico bajos, de este tipo, en la solución de fermentación, es decir por debajo del 10% en peso con relación al contenido en materia sólida, son inadecuados, sin embargo, para la fabricación económica de suplementos para piensos de animales que contengan el ácido D-pantoténico. Otro inconveniente de los procedimientos, conocidos hasta ahora, consiste en que el aislamiento del producto, a partir del medio de fermentación, requiere un gran número de etapas de elaboración, costosas. No se ha divulgado un procedimiento económico para la fabricación a escala industrial.
En la solicitud de patente alemana publicada, no examinada DE 100 16 321 se ha descrito un procedimiento de fermentación para la fabricación de suplementos para piensos de animales que contienen el ácido D-pantoténico. Un inconveniente esencial de este procedimiento consiste, sin embargo, en que tiene que añadirse obligatoriamente, como en el caso de los procedimientos de fermentación, precedentemente indicados, para la obtención del ácido D-pantoténico, el precursor del ácido pantoténico, constituido por la \beta-alanina, al microorganismo a través del medio de fermentación para alcanzar rendimientos económicos del producto deseado.
Además, las publicaciones US 6,013,492 y WO 96/332839 describen la elaboración del ácido D-pantoténico a partir de la solución de fermentación mediante separación por filtración de los componentes no solubles (por ejemplo material celular) del medio de cultivo, una adsorción del filtrado sobre carbón activo, una elución, subsiguiente, del ácido D-pantoténico con un disolvente orgánico, preferentemente el metanol, una neutralización con hidróxido de calcio y una cristalización subsiguiente del D-pantotenato de calcio. Los inconvenientes esenciales en este caso consisten en las pérdidas de producto valioso que se producen durante la cristalización así como en el empleo de un disolvente orgánico, que únicamente puede ser separado con dificultad del producto y que requiere una recuperación costosa del disolvente.
La publicación EP 0 590 857 describe un procedimiento de fermentación para la obtención del ácido D-pantoténico, en el cual es obligatoria la adición de \beta-alanina durante el cultivo de un microorganismo. La solución de la fermentación se filtra para la separación de la biomasa, a continuación se hace pasar a través de un intercambiador de cationes y finalmente a través de un intercambiador de aniones, como conclusión se neutraliza con hidróxido de calcio, se concentra por evaporación, se combina con carbón activo, se filtra de nuevo y se cristaliza con adición de metanol y de cloruro de calcio. El producto resultante, que contiene pantotenato de calcio comprende, además del ácido D-pantoténico en forma de sal de calcio también cloruro de calcio en una relación molar de 1:1. Para la reducción del contenido en cloruro de calcio se requiere una electrodiálisis con un secado por pulverización subsiguiente. Este procedimiento tiene el inconveniente de que ni es económico ni es ecológico debido al gran número de etapas complicadas del procedimiento y debido al empleo de disolventes orgánicos.
La tarea de la presente invención consiste en la puesta a disposición de un suplemento para pienso de animales, que contienen ácido D-pantoténico y/o sus sales, así como su obtención por medio de un procedimiento mejorado para la obtención del ácido D-pantoténico y/o de sus sales, que no presenta los inconvenientes precedentemente citados. En este caso es deseable, por motivos económicos, un procedimiento en el que se reduzca drásticamente o que sea completamente innecesaria una adición de \beta-alanina. Además es deseable la obtención del ácido D-pantoténico en forma de sus sales divalentes y, en este caso, ante todo en forma de las sales alcalinotérreas, puesto que las sales divalentes presentan propiedades menos higroscópicas que las sales monovalentes del ácido pantoténico y por lo tanto tienen menos tendencia a la formación de grumos durante la aplicación ulterior, por ejemplo como suplemento para el pienso de los animales.
Esta tarea se resuelve de manera ventajosa por medio de la presente invención.
El objeto de la presente invención consiste en un procedimiento para la obtención del ácido D-pantoténico y/o de sus sales, caracterizado porque
a)
se emplea, al menos, un microorganismo productor del ácido D-pantoténico, cuya biosíntesis del ácido pantoténico-(pan) y/o isoleucina/valina-(ilv) esté desregulada y que forme, al menos, 2 g/l de sales del ácido D-pantoténico mediante fermentación en un medio de cultivo, añadiéndose al medio de cultivo desde 0 hasta 20 g/l de \beta-alanina y/o de sal de \beta-alanina,
b)
se añaden al D-pantotenato formado sales que contengan cationes polivalentes, con lo que se forman sales polivalentes del ácido D-pantoténico,
c)
se elabora la solución, que contiene las sales polivalentes del ácido D-pantoténico mediante nanofiltración, enriqueciéndose las sales polivalentes del ácido D-pantoténico y
d)
se somete a un secado y/o a una formulación al retentato de la nanofiltración que contiene las sales polivalentes del ácido D-pantoténico.
En una variante del procedimiento, según la invención, el retentato procedente de la etapa c) es una suspensión, que contiene sales polivalentes del ácido D-pantoténico.
Además, la fermentación puede llevarse a cabo según una manera de proceder conocida mediante trabajo en tandas, en alimentación por tandas o en alimentación por tandas repetidas o mediante una conducción en continuo del procedimiento. Para la neutralización del ácido pantoténico formado se utilizarán en este caso los sistemas tampón usuales tales como, por ejemplo, el tampón de fosfato con NaOH, con KOH o con amoníaco.
En otra variante del procedimiento, según la invención, se forman en la etapa a), al menos 10 g/l, preferentemente, al menos, 20 g/l, de forma especialmente preferente, al menos, 40 g/l, en el caso más especialmente preferente, al menos, 60 g/l y, en particular, al menos, 70 g/l de sales del ácido D-pantoténico mediante fermentación en el medio de cultivo.
Según la invención, debe entenderse por la expresión "producción", que el microorganismo puede sintetizar cantidades del ácido D-pantoténico y/o de sus sales mayores que las que se requieren para las necesidades propias de metabolismo. En una variante ventajosa, según la invención, la cantidad sintetizada de ácido D-pantoténico y/o de sus sales no se encuentra dentro de las células sino que se desprende, de manera ideal, por completo desde el microorganismo hasta el medio de cultivo. Esta descarga puede llevarse a cabo de manera activa o pasiva según mecanismos en sí conocidos.
Según la invención, se emplearán como microorganismos, productores del ácido D-pantoténico, hongos, levaduras y/o bacterias., según la invención, se emplearán preferentemente hongos tal como, por ejemplo, Mucor o levaduras, tales como por ejemplo Saccharomyces o Debaromyces y, en este caso, preferentemente Saccharaomyces cerevisiae. Ventajosamente se emplearán, según la invención, bacterias o bacilos corineformes., según la invención, quedan abarcadas, por ejemplo, preferentemente bacterias de los géneros Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Arthrobacter, Bevibacterium, Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella, Proteus, Acinetobacter o Rhizobium. En este caso son especialmente preferentes, por ejemplo, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium breve o Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. lentimorbus, B. lentus, B. firmus, B. pantothenticus, B. circulans, B. coagulans, B. megaterium, B. pumilus, B. thuringiensis, B. brevis, B. stearothermophilus y otros tipos de Bacillus del grupo 1, que se caracterizan por medio de su 16sARN o Actinum mycetalis. Esta enumeración sirve para la explicación y en ningún caso limita la presente invención.
Además, la presente invención abarca también el empleo de microorganismos genéticamente modificados para la obtención, según la invención, de un suplemento para el pienso de los animales que contenga ácido D-pantoténico libre y/o sus sales. Tales microorganismos, genéticamente modificados, pueden aislarse, por ejemplo, mediante mutagénesis química y subsiguiente selección por medio de un "procedimiento de selección" adecuado., según la invención, quedan abarcadas también las denominadas "cepas para la producción", que son adecuadas para la obtención de los productos en el sentido de la presente invención y que presentan modificaciones genéticas en lo que se refiere al flujo del metabolismo en el sentido del ácido D-pantoténico, entendiéndose como tal también las modificaciones en lo que se refiere a la descarga del ácido D-pantoténico y/o de sus sales a través de la membrana celular. Esto puede conseguirse por ejemplo mediante la modificación de las posiciones claves en las vías relevantes de la biosíntesis del metabolismo del microorganismo empleado.
Del mismo modo, puede imaginarse el empleo de microorganismos transgénicos, que resulten de la transferencia de secuencias de nucleótidos homólogas y/o heterólogas, que sean necesarias o que pudieran ser necesarias para la síntesis del producto deseado. En este caso puede imaginarse la sobreexpresión y/o la desregulación de uno o varios genes individuales y/o en combinación, localizada en el genoma y/o sobre un vector.
Tales microorganismos transgénicos pueden contener de manera ventajosa, adicionalmente, copias y/o genes genéticamente modificados elegidos del grupo formado por panB, panC, panD, panE y/o por sus combinaciones y/o incluso por unidades organizadas, tales como el operón panBCD. Además pueden manipularse ventajosamente en los microorganismos otras vías de metabolismo tales como, por ejemplo, las vías para la síntesis de la isoleucina-valina, como se ha descrito, por ejemplo, en las publicaciones EP 1 006 189, EP 1 006 192, EP 1 006 193 o EP 1 001 027. De este modo se ponen a disposición substancias precursoras, de cadena ramificada, en mayor cantidad para la biosíntesis del ácido pantoténico. Ventajosamente se sobreexpresarán, en caso dado, los genes para esta vía de biosíntesis, es decir ilvB, ilvN, ilvC y/o ilvD.
Además, quedan abarcadas las modificaciones genéticas de la aspartato-\alpha-descarboxilasa (panD), por ejemplo mediante la sobreexpresión y/o la desregulación, según la invención, en los microorganismos empleados productores del ácido D-pantoténico.
Según la invención, debe entenderse por la expresión "desregulación" lo siguiente: variación o modificación al menos de un gen, que codifique un enzima en una vía del metabolismo biosintético, de tal manera que la actividad del enzima se varíe o se modifique en el microorganismo. Es preferente que al menos un gen, que codifique un enzima de una vía del metabolismo biosintético, se modifique de tal manera que el producto genético se forme con mayor intensidad o que presente una actividad acrecentada. La expresión "vía del metabolismo desregulada" abarca también una vía del metabolismo biosintética, en la cual se varíe o se modifique más de un gen, que codifique más de un enzima, de tal manera que se varíen o se modifiquen las actividades de más de un enzima.
Las variaciones o las modificaciones pueden comprender, pero no están limitadas a: la eliminación del promotor endógeno o del elemento regulador; la introducción de promotores más potentes, de promotores inducibles o de varios promotores a la vez; la eliminación de secuencias reguladoras de tal manera que se modifique la expresión del producto genético; la modificación de la posición cromosómica del gen; la modificación de la secuencia de ADN en las proximidades del gen o dentro del gen tales como por ejemplo los puntos de enlace ribosómicos (RBS); el aumento del número de copias del gen en el genoma o mediante introducción de plásmidos con un número variable de copias; la modificación de las proteínas (por ejemplo proteínas reguladoras, supresoras, reforzadoras, activadores de transcripción, y similares), que jueguen un papel durante la transcripción del gen y/o durante la traducción para dar el producto genético. Para esta finalidad se cuenta también con otras posibilidades para la desregulación de la expresión de los genes, que constituyen el estado de la técnica, tales como por ejemplo el empleo de oligonucleótidos antisentido o el bloqueo de proteínas represoras.
La desregulación puede comprender también las variaciones de genes en una región codificante, que, por ejemplo, conduzcan a la eliminación de la regulación inversa en el producto genético o a una actividad específica mayor o menor del producto genético.
Además, son ventajosas, según la invención, las modificaciones genéticas en los enzimas, que influyan sobre la efluencia de precursores del ácido pantoténico y/o sobre el flujo del ácido pantoténico hacia el coenzima A. Ejemplos de genes, que codifican tales enzimas son: alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA, coaX y muchos más. Esta enumeración tiene carácter explicativo y en ningún caso limita la presente invención.
Además, son ventajosas las variaciones genéticas, que aseguren la puesta a disposición celular de cofactores (por ejemplo de tetrahidrofolato de metileno, equivalentes Redox y similares) en cantidades óptimas para la producción de ácido pantoténico.
De manera ventajosa está presente ya la \beta-alanina en las células en concentraciones elevadas frente a los microorganismos correspondientes que no han sido modificados genéticamente y, por lo tanto, no tiene que añadirse como precursor al medio de cultivo, como es necesario por ejemplo en el caso de la publicación EP-A-0 590 857. Son ventajosos aquellos microorganismos cuyas biosíntesis del ácido pantoténico -(pan) y/o de isoleucina-valina-(ilv) y/o cuya desregulación de la aspartato-\alpha-descarboxilasa (panD) esté desregulada. Además, es ventajosa una sobreexpresión adicional de la cetopantoato-reductasa (panE) en los microorganismos.
Del mismo modo, es ventajoso, según la invención, que se reduzca la actividad en caso dado del gen coaA, que es necesario para la síntesis del coenzima A o que sea inactivado por completo (por ejemplo en especies de Bacillus). Los Bacillus contienen concretamente además del coaA otro gen para la función enzimática (= coaX). Del mismo modo puede modificarse la actividad de este gen coaX o del encima correspondiente, preferentemente puede reducirse o incluso puede eliminarse en tanto en cuanto el coaA propiamente dicho presente una actividad enzimática suficiente, aún cuando esté disminuida, es decir que la actividad enzimática del coaA no se pierda por completo. Además de la sobreexpresión de los diversos genes es ventajosa también una manipulación genética de las regiones promotoras de este gen de tal manera, que esta manipulación conduzca a una sobreexpresión del producto genético.
\newpage
En una variante de realización de la presente invención, encuentran aplicación las cepas bacterianas descritas según el anexo (WO 01/21772), tales como por ejemplo Bacillus subtilis PA 824 y/o derivados del mismo. En otra variante de realización encuentra aplicación, según la invención, el microorganismo Bacillus subtilis PA 668, tal como se ha descrito en el anexo (US 2004/0091979), en el procedimiento según la invención. Estas cepas de Bacillus subtilis PA824 y PA668 se prepararon de la manera siguiente:
A partir de la cepa Bacillus subtilis 168 (Marburg cepa ATCC 6051), que presenta el genotipo trpC2 (Trp^{-}), se generó la cepa PY79 mediante traducción del marcador Trp^{+} (procedente de Bacillus subtilis tipo salvaje W23). En la cepa PY79 se introdujeron las mutaciones \DeltapanB y \DeltapanE1 mediante métodos genéticos clásicos (como se han descrito, por ejemplo, en la publicación de Harwood, C.R. and Cutting, S.M. (editors), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, Inglaterra).
La cepa resultante se transformó con el ADN genómico de Bacillus subtilis cepa PA221 (genotipo P_{26}panBCD, trpC2 (Trp^{-})) y con ADN genómico de Bacillus subtilis cepa PA303 (genotipo P_{26}panE1). La cepa resultante PA327 tiene el genotipo P_{26}panBCD, P_{26}panE1 y es triptofano auxótrofo (Trp^{-}). Con el Bacillus subtilis cepa PA327 se alcanzó, en 10 ml de cultivos con medio SVY (25 g/L de Difco Veal Infusion Broth, 5 g/L de Difco Yeast Extract, 5 g/L de glutamato de Na, 2,7 g/L de sulfato de amonio, enrasados con agua hasta 740 ml, sometido al autoclave y adición a continuación de 200 ml de fosfato de potasio 1 M, pH 7,0 y 60 ml de solución de glucosa estéril al 50%), que se había suplementado con 5 g/L de \beta-alanina y con 5 g/L de \alpha-cetoisovalerato, ácido pantoténico con un título de hasta 3,0 g/L (24 horas).
La obtención del Bacillus subtilis cepa PA221 (genotipo P_{26}panBCD, trpC2 (Trp^{-})) se describe en el párrafo siguiente:
Con ayuda de métodos clásicos de ingeniería genética se clonó el operón panBCD de Bacillus con ayuda de la información secuencial del operón panBCD de E. coli (véase la publicación de Merkel et al., FEMS Microbiol. Lett., 143, 1996:247-252) a partir de una biblioteca de plásmidos de Bacillus subtilis GP275. Para la clonación se utilizó el E. coli cepa BM4062 (bir^{ts}) y la información, que está presente en el operón de Bacillus en las proximidades del gen birA. El operón panBCD se introdujo en un plásmido replicable en E. coli. Para mejorar la expresión del operón panBCD se utilizaron promotores constituyentes, fuertes del Bacillus subtilis fago SP01 (P_{26}) y se reemplazó el punto de enlace de los ribosomas (=RBS) por delante del gen panB por un RBS artificial. Por delante de la caja P_{26}panBCD sobre el plásmido se enlazó un fragmento de ADN, que se encontraba inmediatamente aguas arriba (upstream) del gen nativo panB en Bacillus. Este plásmido se transformó en el Bacillus subtilis cepa RL-1 (derivado del Bacillus subtilis 168 obtenido mediante mutagénesis clásica (Marburg cepa ATCC 6051), genotipo trpC2 (Trp^{-})) y se reemplazó mediante recombinación homóloga el operón nativo panBCD por el operón p_{26}panBCD. La cepa resultante se llama PA221 y tiene el genotipo P_{26}panBCD, trpC2 (Trp^{-}).
Con el Bacillus subtilis cepa PA221 se alcanzó en cultivos de 10 ml con medio SVY, que había sido suplementado con 5 g/L de \beta-alanina y con 5 g/L de \alpha-cetoisovalerato, ácido pantoténico con un título de hasta 0,92 g/L (24 horas).
La obtención del Bacillus subtilis cepa PA303 (genotipo P_{26}panE1) se describe en el párrafo siguiente:
Con ayuda de la secuencia genómica E. coli panE se clonó de manera análoga la secuencia Bacillus panE. Se observa que en B. subtilis existen dos homólogos, el gen panE de E. coli, que se designaron como panE1 y panE2. Mediante análisis de eliminación se observa que el gen panE1 es responsable en un 90% en la producción del ácido pantoténico, mientras que la eliminación del gen panE2 no tenía ningún efecto significativo sobre la producción del ácido pantoténico. También en este caso se reemplazó, de manera análoga a la de la clonación del operón panBCD del promotor por el promotor constituyente, potente, P_{26} y se reemplazó el punto de enlace de los ribosomas por delante del gen panE1 por puntos de enlace artificiales. El fragmento P_{26}panE1 se clonó en un vector que estaba constituido de tal manera que el fragmento P_{26}panE1 pudo integrarse en el sitio del panE1 original en el genoma de Bacillus subtilis. La cepa resultante tras la transformación y la recombinación homóloga se llama PA303 y tiene el genotipo
P_{26}panE1.
Con el Bacillus subtilis cepa PA303 se alcanzó en cultivos de 10 ml con medio SVY, que había sido suplementado con 5 g/L de \beta-alanina y con 5 g/L de \alpha-cetoisovalerato, un título en ácido pantoténico de hasta 1,66 g/L (24 horas).
La otra construcción de la cepa se llevó a cabo mediante transformación de PA327 con un plásmido, que contiene el operón P_{26}ilvBNC y el gen marcador de espectinomicina. El operón P_{26}ilvBNC integra en el sitio amyE, lo cual ha sido demostrado mediante PCR. Un transformante se denominó como PA340. (Genotipo P_{26}panBCD, P_{26}panE1, P_{26}ilvBNC, specR, trpC2 (Trp^{-})).
Con el Bacillus subtilis cepa PA340 se alcanzó en cultivos de 10 ml con medio SVY, que había sido suplementado con 5 g/L de \beta-alanina, un título en ácido pantoténico de hasta 3,6 g/L (24 horas), en cultivos de 10 ml con medio SVY, que había sido suplementado con 5 g/L de \beta-alanina y con 5 g/L de \alpha-cetoisovalerato, se alcanzó un título en ácido pantoténico de hasta 4,1 g/L (24 horas).
Además, se introdujo en la cepa PA340 una caja desreguladora ilvD. Para ello se transformó en PA340 un plásmido que contiene el gen ilvD bajo el control del promotor P_{26} con el RBS2 artificial. En este caso se integró en el sitio original ilvD el gen P_{26}ilvD mediante recombinación homóloga. La cepa resultante PA374 tiene un genotipo P_{26}panBCD, P_{26}panE1, P_{26}ilvBNC, P_{26}ilvD, specR y trpC2 (Trp^{-}).
Con el Bacillus subtilis cepa PA374 se alcanzó en cultivos de 10 ml con medio SVY, que había sido suplementado con 5 g/L de \beta-alanina, un título en ácido pantoténico de hasta 2,99 g/L (24 horas).
Con el fin de producir con la cepa PA374 el ácido pantoténico, exento de adición de \beta-alanina, se incorporaron en la cepa PA374, adicionalmente, copias del gen panD que codifica la aspartato-\alpha-descarboxilasa. Para ello se transformó en PA374 el ADN cromosómico de la cepa PA401. Mediante selección sobre tetraciclina se obtuvo la cepa PA377.
La cepa PA377, resultante, tenía el genotipo P_{26}panBCD, P_{26}panE1, P_{26}ilvBNC, P_{26}ilvD, specR, tetR y trpC2 (Trp^{-}).
Con la cepa de Bacillus subtilis PA377 se alcanzó en cultivos de 10 ml con medio SVY ácido pantoténico exento de adición de precursores con un título de hasta 1,31 g/L (24 horas).
La obtención de la Bacillus subtilis cepa PA401 (genotipo P_{26}panD) se ha descrito en el párrafo siguiente:
El gen de Bacillus subtilis panD se clonó a partir del operón panBCD en un vector, que porta el gen marcador de tetraciclina. Por delante del gen panD se clonó el promotor P_{26} y un RBS artificial, precedentemente descrito. Mediante digestión de restricción se preparó un fragmento que contenía el gen marcador de la tetraciclina y el gen P_{26}panD. Este fragmento se enlazó de nuevo y se transformó en la cepa PA221 anteriormente descrita. En este caso se integró el fragmento en el genoma de la cepa PA211. La cepa PA401 resultante tenía el genotipo P_{26}panBCD, P_{26}panD, tetR y trpC2 (Trp^{-}).
Se consiguió con la cepa de Bacillus subtilis PA401 en cultivos de 10 ml en medio SVY, que había sido suplementado con 5 g/L de \alpha-cetoisovalerato, ácido pantoténico con un título de hasta 0,3 g/L (24 horas). En cultivos de 10 ml con medio SVY que había sido suplementado con 5 g/L de ácido D-pantoico y con 10 g/L de L-aspartato, se alcanzó un título en ácido pantoténico de hasta 2,2 g/L (24 horas).
A partir de la cepa PA377 se generó una cepa de triptofano prototrófero mediante transformación con ADN cromosómico de la cepa PY79. Esta cepa PA824 tiene el genotipo P_{26}panBCD, P_{26}panE1, P_{26}ilvBNC, P^{26}ilvD, specR, tetR y Trp^{+}.
Con el Bacillus subtilis cepa PA824 se alcanzó en cultivos de 10 ml en medio SVY ácido pantoténico exento de adición de promotores con un título de hasta 4,9 g/L (48 horas) (compárese con PA377: hasta 3,6 g/L en 48 horas). La construcción exacta de la cepa puede tomarse según el anexo de la publicación WO 01/21772.
La obtención de PA668 se describe en el párrafo siguiente:
El gen Bacillus panB se clonó a partir del tipo salvaje del operón panBCD y se insertó en un vector que contiene, además de un gen resistente al cloroanfenicol, también secuencias de B. subtilis del sitio vpr.
Se insertó el promotor constituyente potente P_{26} por delante del extremo 5' del gen panB. Se obtuvo mediante digestión por restricción un fragmento que contiene el gen P_{26}panB, el gen marcador para la resistencia al cloroanfenicol así como las secuencias de Bacillus subtilis vpr. El fragmento aislado se enlazó de nuevo y de este modo se transformó en la cepa PA824. La cepa obtenida se denominó como PA668. El genotipo de PA668 es: P_{26}panBCD, P_{26}panE1, P_{26}ilvBNC, P_{26}ilvD, P_{26}panB, specR, tetR, CmR y Trp^{+}.
Se aislaron dos colonias de PA668 y una de ellas se denominó PA668-2A, la otra se denominó PA668-24.
Con B. subtilis cepa PA668-2A se alcanza en cultivos de 10 mL en medio SVY, sin adición de precursores, ácido pantoténico con un título de 1,5 g/L en 48 horas. En cultivos de 10 mL, que han sido suplementados con 10 g/L de aspartato se alcanzan títulos de hasta 5 g/L.
Con B. subtilis cepa PA668-24 se alcanza en cultivos de 10 mL en medio SVY, sin adición de precursores, ácido pantoténico con un título de 1,8 g/L en 48 horas. En cultivos de 10 mL, que han sido suplementados con 10 g/L de L-aspartato se alcanzan títulos de hasta 4,9 g/L.
La construcción exacta de las cepas puede verse según los anexos de las publicaciones WO 01/21772 y US 2004/0091979.
Con la cepa PA377, precedentemente descrita, se alcanzan en el caso de la fermentación limitada con glucosa en medio SVY (25 g/L de Difco Veal Infusion Broth, 5 g/L de Difco Yeast Extract, 5 g/L de triptofano, 5 g/L de glutamato de Na, 2 g/L de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 10 g/L de KH_{2}PO_{4}, 20 g/L de K_{2}HPO_{4}, 0,1 g/L de CaCl_{2}, 1 g/L de MgSO_{4}, 1 g/L de citrato de sodio, 0,01 g/L de FeSO_{4}*7 H_{2}O y 1 ml/L de una suspensión de sales en trazas con la siguiente composición: 0,15 g de Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O, 2,5 g de H_{3}BO_{3}, 0,7 g de CoCl_{2} x 6 H_{2}O, 0,25 g de CuSO_{4} x 5 H_{2}O, 1,6 g de MnCl_{2} x 4 H_{2}O, 0,3 g de ZnSO_{4} x 7 H_{2}O, completado con agua hasta 1 litro)) a escala de 10 litros mediante adición continua de una solución de glucosa en 36 horas (48 horas) concentraciones en ácido pantoténico en el caldo de fermentación de 18-19 g/L (22-25 g/L).
En el caso de una fermentación limitada con glucosa de PA824, que es el derivado de triptofano prototrófeno de PA377, en medio de extracto de levadura (10 g/L de Difco Yeast Extract, 5 g/L de glutamato de Na, 8 g/L de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 10 g/L de KH_{2}PO_{4}, 20 g/L de K_{2}HPO_{4}, 0,1 g/L de CaCl_{2}, 1 g/L de MgSO_{4}, 1 g/L de citrato de sodio, 0,01 g/L de FeSO_{4}*7 H_{2}O y 1 ml/L de la suspensión de sales en trazas anteriormente descrita), a escala de 10 litros con alimentación continua de una solución de glucosa al cabo de 36 horas, 48 horas y 72 horas, las concentraciones siguientes en ácido pantoténico en los caldos de fermentación: 20 g/L, 28 g/L y 36 g/L.
Mediante otra optimación del medio se alcanza con la cepa PA824 en el caso de la fermentación limitada con glucosa, en un medio constituido por 10 g/L de Difco Yeast Extract, 10 g/L de NZ Amina A (Quest International GmbH, Erftstadt), 10 g/L glutamato de Na, 4 g/L de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 10 g/L de KH_{2}PO_{4}, 20 g/L de K_{2}HPO_{4}, 0,1 g/L de CaCl_{2}, 1 g/L de MgSO_{4}, 1 g/L de citrato de sodio, 0,01 g/L de FeSO_{4}*7 H_{2}O y 1 ml/L de la solución de las sales en trazas anteriormente descrita a escala de 10 litros con adición continua de una solución de glucosa al cabo de 36 horas (48 horas) concentraciones del ácido pantoténico de 37 g/L (48 g/L) en los caldos de fermentación.
Pueden imaginarse otros aumentos de la concentración en ácido pantoténico en los caldos de fermentación mediante otra optimación del medio, mediante aumento de la duración de la fermentación, mediante mejoras del procedimiento y de la cepa así como mediante combinaciones de las etapas individuales. De este modo pueden conseguirse las concentraciones en ácido pantoténico anteriormente descritas también mediante fermentación de las cepas, que sean derivados de la PA824 anteriormente descrita. Los derivados pueden prepararse por medio de desarrollo clásico de las cepas así como por medio de otras manipulaciones de ingeniería genética. Mediante el desarrollo de los medios, de las cepas y de los procedimientos de fermentación pueden aumentarse los títulos del ácido pantoténico en los caldos de fermentación por encima de 40, de 45, de 50, de 55, de 60, de 65, de 70, de 75, de 80, de 85, y > 90 g/L.
Otra ventaja esencial del procedimiento, según la invención, consiste en que la fermentación se lleva a cabo en un medio de cultivo que además de, al menos, una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno como compuestos de partida no contiene otros ascendentes (precursor). Es decir que la biosíntesis del ácido D-pantoténico es independiente de la adición de otros precursores. Deben entenderse por tales precursores, según la invención, aquellas substancias tales como por ejemplo la \beta-alanina y/o el L-aspartato y/o la L-valina y/o el \alpha-cetoisovalerato y/o sus combina-
ciones.
En una variante preferente del procedimiento, según la invención, se llevará a cabo la fermentación del microorganismo, productor del ácido D-pantoténico, en un medio de cultivo, que contenga una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno, a la que, sin embargo, no se ha añadido \beta-alanina libre y/o sales de \beta-alanina o en el transcurso de la fermentación. Es decir que para la obtención del ácido D-pantoténico a escalas de, al menos, 10 g/l de medio de cultivo, preferentemente de al menos 20 g/l, de forma especialmente preferente de, al menos, 40 g/l, de forma muy especialmente preferente de, al menos, 60 g/l y, especialmente, de al menos, 70 g/l, no se requiere, según la invención, una adición de \beta-alanina libre y/o de sales de \beta-alanina.
La independencia con respecto al aporte de precursores representa, especialmente, una ventaja económica esencial del procedimiento, según la invención, frente a los procedimientos conocidos, puesto que un gran número de los precursores son de elevado precio.
Sin embargo, no queda excluida, según la invención, la adición de \beta-alanina y/o de sales de \beta-alanina de tal manera que, como consecuencia, pueden mejorarse todavía más los rendimientos en ácido D-pantoténico mediante la adición de \beta-alanina y/o de sales de \beta-alanina. Si, por ejemplo, se supone que todos los precursores necesarios del ácido pantoténico están presentes en cantidades suficientes limitando simplemente la actividad del gen panD un aumento adicional de la producción del ácido pantoténico, podrá aumentarse el rendimiento en ácido pantoténico por ejemplo en otro 50% mediante la adición de \beta-alanina libre y/o de sales de \beta-alanina.
En una variante ventajosa de la presente invención pueden añadirse hasta 20 g/l de \beta-alanina libre y/o de sales de \beta-alanina al medio de cultivo para el aumento adicional de los rendimientos en ácido pantoténico en más de un 50%. Es preferente la adición de aproximadamente 15 g/l de \beta-alanina libre y/o de sales de \beta-alanina al medio de
cultivo.
Ejemplos de fuentes de carbono adecuadas, según la invención, para el empleo en el medio de cultivo para la fermentación de los microorganismos, precedentemente citados, son los azúcares, tales como los hidrolizados de almidón (monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos), preferentemente la glucosa o la sacarosa así como las melazas de remolacha o de caña de azúcar, las proteínas, los hidrolizados de proteína, la harina de soja, el agua de maíz hinchado, las grasas, los ácidos grasos libres, las células recicladas procedentes de fermentaciones ya realizadas o sus hidrolizados así como extractos de levadura. Estas enumeraciones no son limitativas de la presente invención.
Además, el procedimiento presente se caracteriza de manera ventajosa porque el contenido total en azúcares se reduce a un mínimo hasta el final de la fermentación, puesto que éstas dificultarían, en otro caso, el secado ulterior y/o la formulación de la solución de la fermentación debido a la pegajosidad. Esto puede conseguirse, según la invención, si la fermentación se continua durante algún tiempo adicional, desde que se haya consumido la fuente de carbono (en el caso del cultivo según un funcionamiento por tandas) o una vez que se haya interrumpido el aporte de carbono (en el caso de una conducción del proceso en alimentación por tandas o en alimentación por tandas repetidas) y/o se regulará de tal manera que la concentración de la fuente de carbono sea prácticamente nula (en el caso en que el procedimiento se conduzca según la alimentación por tandas, la alimentación por tandas repetidas o de manera continua).
Esto se lleva a cabo, según la invención, si tras la interrupción de la dosificación de la fuente de carbono (por ejemplo solución de azúcar) se continua la fermentación hasta que se alcance la concentración en oxígeno disuelto (pO_{2}) de al menos el 80%, preferentemente el 90% y, de forma especialmente preferente, el 95% del valor de saturación en la solución de fermentación.
Ejemplos de fuentes de nitrógeno adecuadas, según la invención, son el amoníaco, el sulfato de amonio, la urea, las proteínas, los hidrolizados de proteína o los extractos de levadura. Esta enumeración tampoco es limitativa de la presente invención.
Además, el medio de fermentación contiene sales minerales y/o elementos en trazas, tales como aminoácidos y vitaminas. Las composiciones exactas de los medios de fermentación adecuados son ampliamente conocidas y están a disposición del técnico en la materia.
Tras inoculación del medio de fermentación con un microorganismo adecuado, productor del ácido D-pantoténico (con la densidad celular conocida por el técnico en la materia) se lleva a cabo el cultivo del microorganismo, en caso dado con adición de un agente antiespumante. Una regulación, necesaria en caso dado, del valor del pH del medio puede llevarse a cabo con diversas lejías o ácidos inorgánicos u orgánicos tales como por ejemplo NaOH, KOH, amoníaco, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, el ácido clorhídrico, ácido fórmico, ácido succínico, ácido cítrico o similares.
Debido a los sistemas tampón, empleados durante la fermentación, que pueden ser como se han descrito precedentemente, por ejemplo NaOH, KOH, amoníaco, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido fórmico, ácido succínico, el ácido cítrico o similares, el ácido D-pantoténico formado se presenta en la solución de fermentación, según el medio tampón empleado, en forma de la o de las sales correspondientes. Puesto que en este caso no son ventajosas especialmente las sales del ácido D-pantoténico en forma de sus cationes monovalentes, se elaborará la solución de la formulación, según la invención, mediante nanofiltración. Para ello se añadirán, en primer lugar, al D-pantotenato formado, sales, según la invención, que contengan cationes polivalentes, con lo cual se forman sales polivalentes del ácido D-pantoténico., según la invención, la adición de las sales, que contienen cationes polivalentes, puede llevarse a cabo en forma sólida o en forma de solución acuosa durante, preferentemente al final, o tras la fermentación en la etapa a). La alimentación de una solución acuosa que contenga cationes polivalentes puede llevarse a cabo, por ejemplo, de manera continua.
Del mismo modo, puede llevarse a cabo en una de las etapas aguas arriba de la nanofiltración, es decir como paso previo a la nanofiltración en la etapa c) del procedimiento según la invención, una separación de la masa celular o de los componentes precipitados en la solución. En este caso puede llevarse a cabo la separación mediante decantación o mediante filtración a través de membranas, preferentemente mediante ultrafiltración. En una variante del procedimiento, según la invención, se llevará a cabo la filtración por medio de membranas en forma de diafiltración. También en este caso puede llevarse a cabo, según la invención, la adición de sales, que contengan cationes polivalentes, en forma sólida o como solución acuosa durante o después de una filtración a través de membranas de una solución que contenga D-pantotenato. A modo de ejemplo se lleva a cabo en este caso de manera continua el aporte de una solución acuosa que contenga cationes polivalentes.
Durante la separación de la masa celular y/o de los componentes precipitados en la solución, tales como, por ejemplo, sales de fosfato o bien sales de sulfato, enzimas, hormonas, proteínas, antibióticos, pirógenos, virus, polisacáridos, coloides, tensioactivos, pesticidas u otras substancias orgánicas difícilmente solubles o insolubles, la separación se basa en el aprovechamiento de la fuerza de la gravedad, de la fuerza centrífuga, de la presión y del vacío. Los procedimientos ejemplificativos son, entre otros: la decantación, la elutriación, el tamizado, el aventado, la clasificación, la filtración, la diálisis, las sedimentación, la microfiltración, la ultrafiltración, la flotación, el fraccionamiento con ayuda de espuma, la separación por medio de piel sobrenadante, el aclarado, la centrifugación o la separación. Como filtración por medio de membrana se abarca un procedimiento de separación por medio de membranas que trabaja mediante una diferencia de presión entre el lado de alimentación y el lado del permeato, tal como la microfiltración o la ultrafiltración. Los procedimientos se diferencian, por ejemplo, por los límites de separación. De este modo, en el caso de la ultrafiltración, el límite de exclusión (cut-off) no se refiere al tamaño de las partículas tal como se hace, por ejemplo, en el caso de la microfiltración, sino que se refiere al peso molecular, que se encuentra en el intervalo desde aproximadamente 10^{3} hasta 2x10^{6}. En el caso de la ultrafiltración se obtiene, además del filtrado (permeato) el denominado concentrado (retentato).
Para la separación de productos sólidos o para el enriquecimiento o para el empobrecimiento de productos disueltos de peso molecular medio y elevado se emplearán, ventajosamente, membranas porosas, estructuradas de manera asimétrica.
Las membranas, empleadas según la invención, pueden estar constituidas, en una variante preferente, por una capa de separación, que provoca la separación de los productos propiamente dicha, y por una capa protectora con una o con varias capas, que porta la capa de separación y que presenta poros de mayor tamaño que los de la capa de separación. Las capas de separación así como la capa protectora pueden estar constituidas por polímeros orgánicos o inorgánicos, por cerámica, por metal o por carbono y deben ser estables en el medio de la reacción y a la temperatura del procedimiento. Ejemplos a este respecto han sido enumerados en la tabla 1, sin embargo sin que quede limitada la presente invención:
Las membranas pueden emplearse en forma de mangueras, de tubos, de capilares, de fibras huecas o de membranas planas en módulos, en sí conocidos, planos, tubulares, con canales múltiples, capilares o enrollados.
Las presiones transmembranales, óptimas, entre el retentato y el permeato se encuentran comprendidas, esencialmente, en función del diámetro de los poros de la membrana o bien del límite de separación (dado en unidades de peso molecular), de la estabilidad mecánica de la membrana y según el tipo de membrana, entre 1 y 40 bares. Presiones transmembranales mayores conducen, por regla general, a mayores flujos de permeato. En este caso podrá adaptarse la presión transmembranal mediante el aumento de la presión del permeato en el caso en que la alimentación (solución a ser elaborada) sea introducida con una presión demasiado elevada.
La temperatura de trabajo depende de la estabilidad del producto y de la estabilidad de la membrana. Ésta se encuentra comprendida entre aproximadamente 20 y 90ºC, preferentemente entre aproximadamente 40 y 70ºC. Temperaturas mayores conducen a mayores flujos de permeato. En este caso pueden emplearse, por ejemplo, membranas según la tabla 2, que, sin embargo, no limitan la presente invención.
La separación celular puede llevarse a cabo, según la invención, de manera ventajosa también por medio de una forma especial de la filtración por medio de membranas, concretamente por medio de la diafiltración.
La diafiltración puede llevarse a cabo de manera discontinua, conduciéndose la solución, que contiene las sales polivalentes del ácido D-pantoténico, a través de un circuito cerrado, que contiene un recipiente, una bomba y uno o varios módulos de membranas y, en este caso, se ajusta la presión en los módulos con membranas de tal manera, que se obtenga el permeato. En este caso se alimentará permanentemente o a determinados intervalos de tiempo, agua o una solución acuosa, que no contenga el producto a ser separado o que lo contenga a una concentración menor que la existente en el instante de la adición en el circuito de separación. La solución acuosa puede contener, según la invención, sales de cationes polivalentes, tales como por ejemplo halogenuros de calcio o de magnesio o sus combinaciones, preferentemente cloruro de calcio y/o cloruro de magnesio. La separación celular mediante la diafiltración puede llevarse a cabo, según la invención, también de manera continua, conectándose en serie preferentemente varios módulos con membranas o conectándose en serie respectivamente uno o varios circuitos cerrados de bombeo que contengan el módulo con membrana. Puede añadirse agua o una solución acuosa, que no contenga el producto a ser separado o que lo contenga en una concentración menor que la que se presenta en el punto de la adición, antes, entre o después de los módulos con membrana o de los circuitos cerrados de bombeo, pudiendo contener la solución acuosa, como ocurre en la variante discontinua, sales de cationes polivalentes, tales como por ejemplo halogenuros de calcio o de magnesio o sus combinaciones. Preferentemente cloruro de calcio y/o de magnesio.
Según la invención, puede llevarse a cabo la ultrafiltración o la diafiltración directamente con la descarga de la fermentación o después de un tratamiento de la descarga de la fermentación, por ejemplo mediante centrifugación, decantación o procedimientos similares.
En tanto en cuanto se lleve a cabo, según la invención, una separación de la masa celular o de los componentes precipitados en la solución, podrá llevarse a cabo la adición de sales que contienen cationes polivalentes según la etapa b) del procedimiento según la invención, antes, durante o después de la ultrafiltración o de la diafiltración. En las variantes del procedimiento, según la invención, se añadirán como cationes polivalentes, por ejemplo, cloruro, nitrato, hidróxido, formiato, acetato, propionato, glicinato y/o lactato de calcio y/o de magnesio. En este caso puede añadirse como catión polivalente por ejemplo Ca^{2+} en una concentración desde 0,05 hasta 50 moles de Ca^{2+}/mol de D-pantotenato, preferentemente desde 0,2 hasta 2 moles de Ca^{2+}/mol de D-pantotenato.
En la etapa c) del procedimiento, según la invención, se elabora por lo tanto la solución que contiene sales polivalentes del ácido D-pantoténico mediante nanofiltración, enriqueciéndose las sales polivalentes del ácido D-pantoténico y empobreciéndose, simultáneamente, los iones monovalentes indeseables, preferentemente los cationes monovalentes tales como, por ejemplo, los iones de amonio, de sodio o de potasio. El procedimiento, según la invención, se caracteriza porque el contenido en cationes monovalentes, preferentemente en iones amonio, potasio y/o sodio, se reduce hasta una concentración de 5 g/kg de solución.
La presente invención abarca todos los sistemas de nanofiltración disponibles en la industria. La separación se lleva a cabo, ventajosamente, sobre membranas porosas, estructuradas de manera asimétrica. En una variante preferente del procedimiento, según la invención, se emplearán, para ello, membranas, que estén constituidas por una capa de separación, que provoca la separación del producto propiamente dicha, y por una capa de protección con una o varias capas, que porta la capa de separación y que presenta poros de mayor tamaño que los de la capa de separación. Las capas de separación así como la capa protectora pueden estar constituidas por polímeros orgánicos, cerámica, metal o carbono y deben ser estables en el medio de la reacción y a la temperatura del procedimiento. Los materiales preferentes para la capa de separación son las poliamidas, las poliimidas o las polipiperazinas. Las capas de separación pueden presentar también una carga superficial positiva o negativa. Como ejemplo de una membrana de nanofiltración funcionalizada de manera aniónica debe citarse la membrana DESAL 5 DK, sin que la presente invención quede limitada, sin embargo, al empleo exclusivo de esta membrana.
Las membranas pueden emplearse en forma de mangueras, de capilares, de fibras huecas o de membranas planas en módulos, en sí conocidos, planos, tubulares, con elementos múltiples, capilares o enrollados.
En las variantes preferentes del procedimiento, según la invención, se aplicará durante la nanofiltración, en la etapa c), una diferencia de presión sobre la membrana en el intervalo desde 5 hasta 100 bares, preferentemente desde 20 hasta 80 bares y, de forma especialmente preferente, desde 40 hasta 70 bares.
La temperatura del procedimiento se encuentra comprendida de forma ventajosa entre 20 y 80, preferentemente entre 30 y 60ºC. Además, la nanofiltración puede llevarse a cabo en una manera conocida por el técnico en la materia en una o varias etapas, de manera continua o de manera discontinua.
En una variante preferente se alimentará respectivamente, como paso previo a una o varias etapas de nanofiltración, una sal que contenga cationes polivalentes en forma sólida o en solución acuosa., según la invención, se alimentarán los cationes polivalentes en forma de cloruro, de nitrato, de hidróxido, de formiato, de acetato, de propionato, de glicinato y/o de lactato de calcio y/o de magnesio. En este caso puede añadirse el catión polivalente Ca^{2+} en una concentración desde 0,05 hasta 50 moles de Ca^{2+}/mol de D-pantotenato, preferentemente desde 0,2 hasta 2 moles de Ca^{2+}/mol de D-pantotenato (referido al estado tras la mezcla).
El procedimiento, según la invención, se caracteriza porque la adición de las sales que contienen cationes polivalentes en forma sólida o en forma de solución acuosa se lleva a cabo durante, preferentemente al final, o después de la fermentación en la etapa a) o durante o después de la separación celular.
Según la invención puede llevarse a cabo preferentemente, además, la adición de las sales que contienen los cationes polivalentes durante la etapa de nanofiltración. Además, el aporte de una solución acuosa, que contenga cationes polivalentes, puede llevarse a cabo de manera continua.
En otra variante del presente procedimiento puede imaginarse que se obtengan soluciones con una concentración variable del producto en una o varias de las etapas del procedimiento conectadas aguas arriba de la nanofiltración. Estas soluciones citadas pueden elaborarse adicionalmente por medio de una nanofiltración de tal manera, que las soluciones citadas sean alimentadas en el orden de las concentraciones crecientes en producto a las etapas subsiguientes de nanofiltración.
Según la invención, se enriquecerán en el retentato de la nanofiltración, ante todo, las sales polivalentes del ácido pantoténico mediante el procedimiento, según la invención, precedentemente descrito. En la solución del permeato se enriquecerán, fundamentalmente, los iones monovalentes, cuando se utilice una membrana de nanofiltración, funcionalizada de manera aniónica, se enriquecerán los cationes monovalentes. El contenido en cationes monovalentes, preferentemente los iones de amonio, de potasio y/o de sodio, en el retentato puede reducirse en este caso hasta una concentración de 5 g/kg de solución.
Según la invención, puede reciclarse el permeato de la nanofiltración o una parte del mismo hasta la fermentación en la etapa a) del procedimiento según la invención. Este reciclo del permeato o de partes del mismo puede llevarse a cabo de manera continua. Las etapas del procedimiento precedentemente descritas, realizadas además de la nanofiltración, sirven para la concentración previa o para la concentración ulterior del D-pantotenato en forma de sales polivalentes.
Otra ventaja de la nanofiltración, empleada según la invención, consiste en que la reacción de los cationes monovalentes (en la solución del retentato) puede ir acompañada simultáneamente de una disminución del volumen del retentato. La elaboración de la solución de la fermentación, que contiene el D-pantotenato mediante nanofiltración puede emplearse, por lo tanto, según la invención, como procedimiento para el intercambio de iones y procedimiento para la concentración para la obtención del D-pantotenato.
Esto conduce, de manera ventajosa, a una simplificación y, al mismo tiempo, a una mayor eficacia de las etapas siguientes del procedimiento. A modo de ejemplo puede reducirse sensiblemente el coste energético para el secado debido a la concentración.
En una forma preferente de realización de la presente invención se liberará la solución de la fermentación de la masa celular mediante centrifugación y/o decantación y/o ultrafiltración. Tras adición de 0,05 hasta 50 moles de iones (Ca^{2+})/mol de ión pantotenato, preferentemente desde 0,2 hasta 2 moles de iones Ca^{2+}/mol de ión pantotenato, que se disponen preferentemente en forma de una solución diluida con 0,01 hasta 10 moles de Ca^{2+}/l, se hace pasar la solución, obtenida de este modo, a través de un módulo de nanofiltración. La diferencia de presión sobre la membrana se encuentra en el intervalo desde aproximadamente 5 hasta 100 bares, preferentemente desde aproximadamente 20 hasta 80 bares, de forma especialmente preferente desde aproximadamente 40 hasta 70 bares. Antes o durante la nanofiltración puede añadirse en este caso una solución acuosa, que contenga iones Ca^{2+} a la solución que barre el lado de alimentación de la membrana. El retentato tiene un volumen de un 30 hasta un 200% de la solución de partida. Además se elimina desde aproximadamente un 5 hasta un 99%, preferentemente desde un 30 hasta un 80% de los cationes monovalentes contenidos.
El retentato contiene, preferentemente, D-pantotenato de calcio, D-pantotenato de magnesio o una mezcla de los mismos, a continuación se somete a un secado y/o a una formulación. El secado y/o la formulación de la solución, que contiene D-pantotenato de calcio y/o de magnesio, se lleva a cabo según procedimientos en sí conocidos, tales como por ejemplo el secado por pulverización, la granulación por pulverización, el secado en lecho fluidificado, la granulación en lecho fluidificado, el secado en tambor o el secado mediante centrifugación instantánea (Spin-flash) (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6^{th} edition, 1999, electronic release, capítulo "Drying of Solid Materials" (Secado de materiales sólidos)). La temperatura de entrada de los gases en el caso del secado por convección se encuentra en el intervalo desde 100 hasta 280ºC, preferentemente entre 120 y 210ºC. La temperatura de salida de los gases se encuentra comprendida entre 50 y 180ºC, preferentemente se encuentra comprendida entre 60 y 150ºC. Para el ajuste de una distribución deseada del volumen de las partículas y de las propiedades del producto, relacionadas con ello, pueden separarse las partículas finas y reciclarse. Además, el producto grosero puede molerse en un molino y, igualmente, reciclarse a continuación.
El procedimiento, según la invención, presenta la ventaja de que se eliminan de manera eficiente y casi por completo los cationes indeseables y, al mismo tiempo, se verifica una reducción del volumen, que simplifica o que hace más eficientes las siguientes etapas del procedimiento, especialmente el secado y/o la formulación. Además no tiene lugar una descomposición del producto o únicamente lo hace en una proporción extraordinariamente reducida, al mismo tiempo que se alcanzan elevados rendimientos en producto. Mediante el aporte de soluciones salinas de cationes polivalentes durante o al final de la fermentación o durante o al final de una ultrafiltración o de una diafiltración o durante la etapa de nanofiltración y/o un reciclo del permeato hasta la solución de fermentación se aumentan los rendimientos en D-pantotenato en forma de iones polivalentes, preferentemente en forma de iones divalentes, tales como calcio o magnesio.
Según la invención es ventajoso en el procedimiento precedentemente descrito, además, la reducción de costosas etapas de elaboración, especialmente la eliminación del empleo de disolventes orgánicos, con la puesta a disposición simultánea de un producto deseado con buen valor biológico. Además, según la invención, se reduce esencialmente la cantidad de aguas residuales formadas. Esto da como resultado un ahorro adicional de instalaciones costosas para la elaboración y para la eliminación. Por lo tanto, el procedimiento, según la invención, se caracteriza, de manera ventajosa, porque es más sencillo, está menos propenso a perturbaciones, requiere una menor cantidad de tiempo, es claramente de coste más conveniente y, por lo tanto, más económico que los procedimientos tradicionales.
Sin embargo esto no excluye que el procedimiento, según la invención, pueda ser modificado. El procedimiento precedentemente descrito, según la invención, puede complementarse por una o varias de las etapas siguientes del procedimiento, que, tomadas en sí mismas, son familiares para el técnico en la materia. En este caso quedan abarcadas todas las combinaciones imaginables de las etapas del procedimiento siguientes con las etapas del procedimiento según la invención, citadas hasta ahora.
De este modo las soluciones, resultantes del procedimiento según la invención, pueden liberarse de los gérmenes mediante calentamiento (esterilización) o por medio de otros métodos, tales como por ejemplo pasteurización o filtración estéril.
En otras variantes del procedimiento, según la invención, puede llevarse a cabo, como paso previo al secado y/o a la formulación del retentato, al menos una etapa o una combinación de las etapas siguientes, que comprenden la lisis y/o la destrucción de la biomasa y/o la separación de la biomasa de la solución de fermentación y/o la adición de otros aditivos y/o la concentración de la solución de la fermentación, preferentemente mediante eliminación del agua.
El objeto de la presente invención consiste también, por lo tanto, en un procedimiento según el cual se lleva a cabo la lisis y/o la destrucción de la biomasa además en la solución de fermentación o solamente después de la separación de la biomasa de la solución de fermentación. Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante un tratamiento térmico, preferentemente a 80 hasta 200ºC y/o mediante un tratamiento ácido, preferentemente con ácido sulfúrico o ácido clorhídrico y/o enzimático, preferentemente con lisozima.
También puede imaginarse que la separación de la masa celular formada se lleve a cabo directamente mediante la nanofiltración, es decir simultáneamente con el intercambio de los cationes monovalentes por los cationes poliva-
lentes.
La solución, resultante de la elaboración mediante nanofiltración, puede concentrarse como paso previo al secado y/o a la formulación por medio de un evaporador adecuado, por ejemplo evaporador de película descendente, evaporador de capa delgada o evaporador rotativo. Tales evaporadores son fabricados, por ejemplo, por las firmas GIG (4800 Attnang Puchheim, Austria), GEA Canzler (52303 Düren, Alemania), Diessel (31103 Hildesheim, Alemania) y Pitton (35274 Kirchhain, Alemania).
Para mejorar las propiedades de color del producto final puede llevarse a cabo una etapa adicional de filtración, en la cual se añade un poco de carbón activo a las soluciones obtenidas durante el procedimiento y a continuación se filtra esta suspensión. O bien las soluciones obtenidas durante la fermentación pueden hacerse pasar a través de un pequeño lecho de carbón activo. Las cantidades de carbón activo empleado, necesarias en este caso, se encuentran en algunos % en peso de la solución y corresponden a los conocimientos y al arbitrio del técnico en la materia.
Estas filtraciones pueden facilitarse si se añade a la solución correspondiente, como paso previo a la filtración, un agente auxiliar para la floculación, usual en el comercio (por ejemplo Sedipur CF 902 o Sedipur CL 930 de la firma BASF AG, Ludwigshafen).
En una forma ventajosa de realización de la presente invención se esterilizará mediante calentamiento la descarga de la fermentación (caldo de la fermentación) y a continuación se libera de la masa celular mediante centrifugación, filtración, ultrafiltración o decantación. Tras adición de 50 hasta 1.000 mg/kg, preferentemente desde 100 hasta 200 mg/kg de un agente auxiliar de la floculación, usual en el comercio, con relación a la descarga de la fermentación, se filtra a través de un lecho corto de carbón activo y de arena para obtener una solución exenta de biomasa con un elevado contenido en ácido D-pantoténico. A continuación se elabora mediante nanofiltración esta solución elaborada.
El secado de esta solución, subsiguiente, puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante secado por pulverización. Este puede llevarse a cabo en corrientes paralelas, a contracorriente o en corriente mixta. Para la pulverización pueden utilizarse todos los pulverizadores conocidos, especialmente los pulverizadores por centrifugación (discos pulverizadores), las toberas para un solo componente o las toberas para dos componentes. Las condiciones preferentes de temperatura para el secado son desde 150 hasta 250ºC de temperatura de entrada en la torre y desde 70 hasta 130ºC de temperatura de salida de la torre. Sin embargo puede llevarse a cabo el secado también a un nivel de temperaturas mayor o menor. Con el fin de conseguir una humedad residual baja puede conectarse aguas abajo también otra etapa de secado en un lecho fluidificado.
El secado por pulverización puede llevarse a cabo en un secadero FSD o SBD (FSD: Fluidized Spray Dryer (Secadero con pulverización fluidificada); SBD: Spray Bed Dryer (Secadero con lecho pulverizado)), como los que son construidos por las firmas Niro (Kopenhagen, Dinamarca) y APV-Anhydro (Kopenhagen, Dinamarca), que representan una combinación del secadero por pulverización y del lecho fluidificado.
En el caso del secado por pulverización puede añadirse un agente auxiliar de la fluencia. De este modo puede reducirse la formación de depósitos sobre las paredes laterales del secadero y pueden mejorarse los comportamientos a la fluencia, precisamente en el caso de los polvos de grano fino. Como agentes auxiliares de la fluencia entran en consideración, especialmente, los silicatos, los estearatos, los fosfatos o el almidón de maíz.
En principio puede llevarse a cabo el secado también en una capa fluidificada para el secado, pudiéndose hacer funcionar ésta tanto de manera continua como también de manera discontinua. La inserción por pulverización de la solución puede llevarse a cabo tanto por la parte superior (pulverización en la cabeza -Topspray-), desde la parte inferior (pulverización desde el fondo -Bottomspray-) así como también de manera lateral (pulverización lateral -Sidespray-).
El objeto de la presente invención está constituido, además, por una composición para el empleo como aditivo para pienso de los animales y/o como agente para el complemento del pienso de los animales, pudiéndose preparar ésta si
a)
se emplea, al menos, un microorganismo productor del ácido D-pantoténico, cuya biosíntesis del ácido pantoténico-(pan) y/o de la isoleucina/valina-(ilv) esté desregulada y que forme, al menos, 2 g/l de sales del ácido D-pantoténico mediante fermentación en un medio de cultivo, añadiéndose al medio de cultivo desde 0 hasta 20 g/l, preferentemente 0 g/l de \beta-alanina libre y/o de sal de \beta-alanina,
b)
se añaden al D-pantotenato formado, sales que contengan cationes polivalentes, formándose sales polivalentes del ácido D-pantoténico,
c)
la solución de la fermentación, que contienen el D-pantotenato se elabora mediante nanofiltración, enriqueciéndose las sales polivalentes del ácido D-pantoténico,
d)
se somete al retentato de la nanofiltración, que contiene las sales polivalentes del ácido D-pantoténico, a un secado y/o a una formulación.
En una variante de la presente invención queda abarcada una composición que se caracteriza porque puede prepararse si se lleva a cabo, como paso previo a la nanofiltración en la etapa c), una separación de la masa celular o de los componentes precipitados en la solución, preferentemente mediante filtración a través de membranas, de forma especialmente preferente mediante ultrafiltración y, de forma muy especialmente preferente, mediante diafiltración. La presente invención se refiere, además, a una composición que se caracteriza porque puede prepararse si se añaden sales (en forma sólida o como solución acuosa) que contienen cationes polivalentes durante o después de la separación de la masa celular o de los componentes precipitados en la solución., según la invención, pueden añadirse las sales también, en otra variante, durante la nanofiltración.
Según la invención se caracteriza la composición, además, porque contiene las sales del ácido D-pantoténico en una concentración de al menos 1 hasta 100% en peso, preferentemente desde 20 hasta 100% en peso y, de forma especialmente preferente, al menos del 50% en peso. El objeto de la presente invención es una composición que contiene las sales del ácido D-pantoténico en forma de cationes divalentes, preferentemente como D-pantotenato de calcio y/o de magnesio., según la invención, es preferente una composición que se caracteriza porque el contenido en sales del ácido D-pantoténico en forma de cationes monovalentes es de 5 g/kg.
Según la invención se obtiene mediante el procedimiento, precedentemente descrito, un D-pantotenato de calcio o de magnesio, que cumple las exigencias de un aditivo para piensos. Estos requisitos son, por ejemplo, un contenido relativamente elevado en D-pantotenato y una buena compatibilidad con el organismo al que va dirigido así como una buena valencia biológica en el sentido del "efecto vitamina" del producto según la invención.
La presente invención se explicará con mayor detalle por medio de los ejemplos siguientes que, sin embargo, no constituyen ninguna limitación de la invención:
Ejemplo 1
Se dispone en un fermentador de laboratorio, con agitador y con dispositivo de gasificación, con una capacidad de 14 litros, medio de fermentación acuoso con la siguiente composición:
\vskip1.000000\baselineskip
1
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la esterilización se añadieron adicionalmente los siguientes componentes del medio estériles:
3
La solución de la sal den trazas está constituida de la manera siguiente:
Se completaron con agua hasta 1 litro 0,15 g de Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O, 2,5 g de H_{3}BO_{3}, 0,7 g de CoCl_{2} x 6 H_{2}O, 0,25 g de CuSO_{4} x 5 H_{2}O, 1,6 g de MnCl_{2} x 4 H_{2}O, 0,3 g de ZnSO_{4} x 7 H_{2}O. La adición de la solución de las sales en trazas se llevó a cabo a través de una filtración esterilizante. El volumen del líquido inicial fue de 5 litros. Los contenidos anteriormente indicados están referidos a este valor.
Se añadieron, a esta solución, 100 ml de cultivo de inoculación (OD = 10) de Bacillus subtilis PA668 y se fermentaron a 43ºC bajo viva agitación con una velocidad de gasificación de 12 l/min. Esta cepa se describe según el anexo en la US 2004/0091979.
Se dosificaron, en el transcurso de 47 horas, 2,1 litros de una solución acuosa estéril. La composición fue:
4
Durante la fermentación se mantuvo el valor del pH en 7,2 mediante la dosificación de solución de amoníaco al 25% o bien de ácido fosfórico al 20%. El amoníaco sirve, al mismo tiempo, como fuente de nitrógeno para la fermentación. El número de revoluciones del órgano de agitación se reguló manteniéndose el contenido en oxígeno disuelto en el 30% del valor de la saturación. Tras interrupción de la dosificación de la fuente de carbono se prosiguió la fermentación hasta que el contenido en carbono disuelto (pO_{2}) había alcanzado un valor del 95% del valor de la saturación. La concentración en D-pantotenato en el momento de la interrupción al cabo de 48 horas fue de 22,8 g/l.
De manera análoga pueden generarse caldos de fermentación que presentan ácido pantoténico exento de adición de \beta-alanina con un título mayor que 20, que 25, que 30, que 35, que 40, que 45, que 50, que 55, que 60, que 65, que 70, que 75, que 80, que 85, y >90 g/L.
Ejemplo 2
Se sometieron 7.000 ml de la descarga de la fermentación, preparados según el ejemplo 1, a una ultracentrifugación empleándose un módulo de agitación cerámico monocanal (firma Atech, Gladbeck, Alemania). En este caso se empleó, por un lado, una membrana con una anchura de poros de 20 kD (10 nm) y, por otro lado, con una anchura de poros de 50 nm.
La temperatura durante los ensayos fue de 40ºC, la velocidad de rebose fue de 4 m/s y la presión transmembranal (TMP= [p(alimentación) + p(retentato)]/2 - p(permeato)), fue de 1 bar, en tanto en cuanto no se diga otra cosa.
En la figura 1 se han representado los flujos transmembranales (flujo de permeato) en función del factor de concentración MK (MK(t) = m_{carga} / m_{retentato} (t).
En este caso se pone claramente de manifiesto que la membrana con la menor anchura de poros (20 kD) muestra flujos claramente mayores que las membranas con la mayor anchura de poros (50 nm).
Ejemplo 3
Se sometieron 7.000 ml de la descarga de fermentación, preparada según el ejemplo 1, a una ultrafiltración de manera análoga a la del ejemplo 2, presentando la membrana empleada una anchura de poros de 20 kD.
La figura 2 muestra que la concentración con la descarga de la fermentación ya centrifugada es claramente mayor que en el ejemplo 2.
Ejemplo 4
Se emplearon 1.000 ml de una solución acuosa que contiene pantotenato de calcio (véase tabla 3, columna carga de retentato) en una célula a presión con agitación con un contenido máximo de trabajo de aproximadamente 1,5 litros. La presión de alimentación ("Feed") se genera en esta célula mediante introducción a presión de nitrógeno y el rebose de la membrana se asegura mediante agitación con un agitador de ancla que se hace funcionar por medio de un acoplamiento magnético.
Se utilizó una membrana de nanofiltración DESAL 5 DK, adquirida en la firma Osmonics Deutschland GmbH en Moers.
Antes, entre y después de los ensayos con la solución anteriormente citada se llevaron a cabo ensayos de retención, para la verificación de la integridad de la membrana, con solución de MgSO_{4} (2.000 ppm en peso).
La retención R_{i}, se ha indicado en las dos columnas de la derecha en la tabla 3. En este caso la retención se define de la manera siguiente: R_{i} = 1 - c_{i,permeato}/c_{i,retentato}; con R_{i} = retención para el componente i, c_{i,permeato} = concentración del componente i en el permeato, c_{i,retentato} = concentración del componente i en el retentato.
Con las concentraciones quieren indicarse las concentraciones momentáneas que se establecen en un instante dado con el ensayo no estacionario, pero no las concentraciones en las fracciones, que se presenta después del final del ensayo. La retención R_{i} es independiente de la concentración en el caso ideal, lo cual se demostró también en el caso del cálculo de los valores indicados a partir de las concentraciones en las fracciones.
Por la tabla 3 puede verse que el Ca^{2+} y el pantotenato son retenidos en un 84 y, respectivamente, o bien en un 99%, es decir que están presentes en el retentato.
Ejemplo 5
En la elaboración de una solución acuosa formada por pantotenato de Na (0,2 moles/litro) se llevó a cabo, bajo condiciones análogas a las del ejemplo 4, una concentración mediante nanofiltración. La tabla 4 muestra que la retención del pantotenato es del 80%.
Ejemplo 6
La concentración de una solución equimolar de NaCl/CaCl_{2} bajo condiciones análogas a las del ejemplo 4 se ha reunido en la tabla 5. En este caso puede verse que la retención de la membrana para el Ca^{2+}, con un valor del 41% o bien del 42%, es relativamente baja frente a la elevada retención del calcio en combinación con el pantotenato
(ejemplo 5).
Leyendas de las figuras y de las tablas
Figura 1:
representación gráfica del flujo transmembranal (flujo de permeato) de la descarga de la fermentación en una ultrafiltración en función del factor de concentración MK con empleo de membranas con una anchura de poros de 50 nm y de 20 kD.
Figura 2:
representación gráfica del flujo transmembranal (flujo de permeato) de la descarga de la fermentación, centrifugada, en el caso de una ultrafiltración en función del factor de concentración MK con empleo de una membrana con una anchura de 20 kD.
Tabla 1:
recopilación de las membranas estructuras de manera asimétrica para la separación de la masa celular o de los componentes precipitados en solución.
Tabla 2:
recopilación de las membranas y sus propiedades para la separación de la masa celular o de los componentes precipitados en solución.
Tabla 3:
recopilación sobre los valores analíticos de una nanofiltración, especialmente en lo que se refiere a la retención de los iones calcio y pantotenato, en una solución acuosa que contiene 0,1 mol/kg de pantotenato de Ca y 0,2 mol/kg de NaCl.
Tabla 4:
recopilación de los valores analíticos de una nanofiltración, especialmente en lo que se refiere a la retención de los iones calcio y pantotenato, en una solución acuosa que contiene 0,2 mol/l de pantotenato de Na y 0,1 mol/l de CaCl_{2}.
Tabla 5:
recopilación de los valores analíticos de una nanofiltración, especialmente en lo que se refiere a la retención de los iones calcio, en una solución acuosa que contiene cantidades equimolares de NaCl y de CaCl_{2}.

Claims (19)

1. Procedimiento para la obtención de ácido D-pantoténico y/o de sus sales, caracterizado porque
a)
se emplea, al menos, un microorganismo productor del ácido D-pantoténico, cuya biosíntesis del ácido pantoténico-(pan) y/o de la isoleucina/valina-(ilv) esté desregulada y que forme, al menos, 2 g/l de sales del ácido D-pantoténico mediante fermentación en un medio de cultivo, añadiéndose al medio de cultivo desde 0 hasta 20 g/l de \beta-alanina libre y/o de sal de \beta-alanina,
b)
empleándose sistemas tampón usuales para la neutralización del ácido pantoténico formado y se añaden al D-pantotenato formado sales que contienen cationes polivalentes, formándose sales polivalentes del ácido D-pantoténico,
c)
la solución que contiene las sales polivalentes del ácido D-pantoténico se elabora mediante nanofiltración, enriqueciéndose las sales polivalentes del ácido D-pantoténico y
d)
el retentato de la nanofiltración, que contiene las sales polivalentes del ácido D-pantoténico se somete a un secado y/o a una formulación.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque no se añade al medio de cultivo \beta-alanina libre y/o sal de \beta-alanina.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque se emplea una bacteria, una levadura o un hongo como organismo productor del ácido D-pantoténico.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se emplea una bacteria de la familia de los Bacillaceos como microorganismo.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se emplea una bacteria del género Bacillus y, preferentemente, de la especie B. subtilis, B. licheniformis o B. amyloliquefaciens.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque en la etapa a) se forma un contenido en ácido D-pantoténico y/o de sus sales de, al menos, 10 g/l de medio de cultivo, preferentemente de, al menos, 20 g/l, de forma especialmente preferente de, al menos, 40 g/l y, en el caso más preferente de, al menos, 60 g/l de medio de cultivo.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque antes de la nanofiltración en la etapa c) se lleva a cabo una separación de la masa celular o de los componentes precipitados en la solución.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la separación se lleva a cabo mediante decantación o mediante filtración con membranas, preferentemente mediante ultrafiltración.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 7 o 8, caracterizado porque se lleva a cabo la filtración por medio de membranas en forma de diafiltración.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se lleva a cabo la adición de sales que contienen cationes polivalentes en forma sólida o de solución acuosa durante, preferentemente al final, o tras la fermentación en la etapa a) o durante o después de una filtración por medio de membranas, a una solución que contiene D-pantotenato.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la adición de sales que contienen cationes polivalentes en forma sólida o como solución acuosa se lleva a cabo durante una nanofiltración.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se lleva a cabo de manera continua la alimentación de una solución acuosa que contiene cationes polivalentes.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se añaden los cationes polivalentes en forma de cloruro, de nitrato, de hidróxido, de formiato, de acetato, de propionato, de glicinato y/o de lactato de calcio y/o de magnesio.
14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque catión polivalente se alimenta Ca^{2+} en una concentración desde 0,05 hasta 50 moles de Ca^{2+}/mol de D-pantotenato, preferentemente desde 0,2 hasta 2 moles de Ca^{2+}/mol de D-pantotenato.
15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque durante la nanofiltración en la etapa c) se establece una diferencia de presión sobre la membrana en el intervalo desde 5 hasta 100 bares, preferentemente desde 20 hasta 80 bares y, de forma especialmente preferente, desde 40 hasta 70 bares.
16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque mediante la nanofiltración, en la etapa c), se reduce el contenido en cationes monovalentes, preferentemente en iones amonio, potasio y/o sodio, hasta una concentración de \leq 5 g/kg de solución.
17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque el permeato procedente de la etapa c), o una parte del mismo, se recicla hasta la fermentación en la etapa a).
18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el reciclo del permeato o de una parte del mismo se lleva a cabo de manera continua.
19. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el retentato procedente de la etapa c) es una suspensión que contiene sales polivalentes del ácido D-pantoténico.
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