ES2274967T3 - Procedimiento para la produccion de acido d-pantotenico y/o sus sales como aditivo de alimentos para animales. - Google Patents
Procedimiento para la produccion de acido d-pantotenico y/o sus sales como aditivo de alimentos para animales. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la producción de ácido D-pantoténico y/o sus sales, caracterizado porque e) se utiliza al menos un microorganismo que produce ácido D-pantoténico, cuya biosíntesis de ácido pantoténico (pan) y/o de isoleucina/valina (ilv) está desregulada y que forma al menos 2 g/l de sales del ácido pantoténico mediante la fermentación en un medio de cultivo, añadiéndose al medio de cultivo 0 - 20 g/l de Beta-alanina libre y/o sal de Beta-alanina, f) se conduce la solución de fermentación que contiene D-pantotenato mediante la aplicación de un campo eléctrico a través de una o varias membranas selectivas de iones, eliminándose los iones de bajo peso molecular de la solución que contiene D-pantotenato, g) se ajusta el ácido D-pantoténico libre contenido en la solución mediante la adición de una base de calcio y/o de magnesio hasta un valor de pH de 3-10, obteniéndose una solución, que contiene pantotenato de calcio y/o de magnesio y h) se somete la solución que contiene pantotenato de calcio y/o de magnesio a un secado y/o formulación.
Description
Procedimiento para la producción de ácido
D-pantoténico y/o sus sales como aditivo de
alimentos para animales.
La presente invención se refiere a un método
mejorado para la producción de ácido D-pantoténico
y/o sus sales y a su uso como aditivo de alimentos para
animales.
El D-pantotenato es un producto
de partida de la biosíntesis de la coenzima A muy extendido en el
mundo animal y vegetal. En contraposición con el ser humano, que
ingiere el ácido pantoténico en cantidades suficientes a través de
la alimentación, sin embargo se describen con frecuencia tanto para
las plantas como para los animales síntomas de deficiencia para el
D-pantotenato. Por tanto, la disponibilidad de
D-pantotenato es de gran interés económico,
especialmente en la industria de los alimentos para animales.
De manera convencional, la producción de
D-pantotenato tiene lugar mediante la síntesis
química a partir de D-pantolactona y
\beta-alaninato de calcio (Ullmann's Encyclopedia
of Industrial Chemistry, 6ª edición, 1999, versión electrónica,
capítulo "Vitamins"). Para la preparación de
D-pantolactona se necesita un clásico
desdoblamiento de racematos costoso a través de sales
diastereómeras. El producto comercial que resulta a partir de la
síntesis química es en la mayoría de los casos la sal de calcio del
ácido D-pantoténico, D-pantotenato
de calcio.
Con respecto a la síntesis química la ventaja de
los procedimientos de producción biotecnológicos con microorganismos
radica en la preparación selectiva (pura desde el punto de vista de
los enantiómeros) de la forma D del ácido pantoténico útil para los
organismos superiores. Por consiguiente se suprime un desdoblamiento
de racematos costoso, tal como es necesario en el caso de la
síntesis química.
Se conocen numerosos casos de procedimientos
fermentativos para la producción de ácido
D-pantoténico con microorganismos, así entre otros
a partir de los documentos EP 0 590 857, WO 96/33283, US 6.013.492,
WO 97/10340, DE 198 46 499, EP 1 001 027, EP 1 006 189, EP 1 006
192 y EP 1 006 193.
Así describían los documentos EP 1 006 189 y EP
1 001 027 procedimientos para la producción de pantotenato en los
que en la solución de fermentación se alcanza un contenido como
máximo de 1 g/l de ácido D-pantoténico. Sin
embargo, tales contenidos reducidos de ácido pantoténico en la
solución de fermentación, o sea inferiores al 10% en peso con
respecto al contenido en sólidos, no son adecuados para una
producción económica de complementos de alimento para animales que
contienen ácido D-pantoténico. Otro inconveniente en
los procedimientos descritos hasta el momento es, que el
aislamiento del producto a partir del medio de fermentación requiere
numerosas etapas de tratamiento costosas. No se da a conocer un
procedimiento de producción económico para la escala
industrial.
En la publicación para información de solicitud
de patente alemana DE 100 16 321 se describe un procedimiento de
fermentación para la producción de un complemento de alimento para
animales que contiene ácido D-pantoténico. Sin
embargo un inconveniente esencial de este procedimiento es, al igual
que en el caso de los procedimientos fermentativos mencionados
anteriormente para la producción de ácido
D-pantoténico, que al microorganismo se le debe
añadir a través del medio de fermentación obligatoriamente el
precursor del ácido pantoténico \beta-alanina,
para obtener rendimientos económicos del producto deseado.
Además los documentos US 6.013.492 y WO
96/332839 describen el tratamiento del ácido
D-pantoténico a partir de la solución de
fermentación mediante la filtración de componentes insolubles (por
ejemplo material celular) del medio de cultivo, una adsorción del
filtrado en carbón activado, una elución posterior del ácido
D-pantoténico con un disolvente orgánico,
preferiblemente metanol, una neutralización con hidróxido de calcio
y una cristalización posterior de D-pantotenato de
calcio. Inconvenientes esenciales son las pérdidas de producto de
valor que aparecen durante la cristalización así como el uso de un
disolvente orgánico, que sólo puede eliminarse del producto con
dificultad y que hace necesaria una recuperación del disolvente
costosa.
El documento EP 0 590 857 describe un
procedimiento de fermentación para la producción de ácido
D-pantoténico, en el que el cultivo de un
microorganismo requiere obligatoriamente la adición de
\beta-alanina. Se filtra la solución de
fermentación para la separación de la biomasa, entonces se conduce a
través de un intercambiador catiónico y posteriormente a través de
un intercambiador aniónico, a continuación de esto se neutraliza con
hidróxido de calcio, se concentra, se mezcla con carbón activado,
se filtra otra vez y se cristaliza con la adición de metanol y
cloruro de calcio. El producto que contiene pantotenato de calcio
resultante contiene además de ácido D-pantoténico
en forma de la sal de calcio incluso cloruro de calcio en una razón
molar de 1:1. Para la reducción del contenido en cloruro de calcio
se requiere una electrodiálisis con un secado por pulverización
posterior. Este procedimiento tiene la desventaja de no ser
económico ni ecológico debido el gran número de etapas de
procedimiento costosas y al uso de disolventes orgánicos.
Es objetivo de la presente invención la
preparación de un complemento de alimento para animales que contiene
ácido D-pantoténico y/o sus sales así como su
producción mediante un procedimiento mejorado para la producción de
ácido D-pantoténico y/o sus sales, que no presenta
los inconvenientes mencionados anteriormente. A este respecto es
deseable, por motivos económicos, un procedimiento, en el que se
reduce drásticamente una adición de \beta-alanina
o ni siquiera es necesaria. Además es deseable la producción de
ácido D-pantoténico en forma de sus sales
bivalentes y a este respecto sobre todo de las sales
alcalinotérreas, dado que las sales bivalentes presentan menos
propiedades higroscópicas que las sales monovalentes del ácido
pantoténico y para el uso adicional, por ejemplo como complemento
de alimento para animales, tienden por consiguiente con menor
intensidad a apelmazamientos. Este objetivo se soluciona
ventajosamente mediante la presente invención.
Objeto de la presente invención es un
procedimiento para la producción de ácido
D-pantoténico y/o sus sales, caracterizado
porque
- a)
- se utiliza al menos un microorganismo que produce ácido D-pantoténico, cuya biosíntesis de ácido pantoténico (pan) y/o de isoleucina/valina (ilv) está desregulada y que forma al menos 2 g/l de sales del ácido pantoténico mediante la fermentación en un medio de cultivo, añadiéndose al medio de cultivo 0 - 20 g/l de \beta-alanina libre y/o sal de \beta-alanina,
- b)
- se conduce la solución de fermentación que contiene D-pantotenato mediante la aplicación de un campo eléctrico a través de una o varias membranas selectivas de iones, eliminándose los iones de bajo peso molecular de la solución que contiene D-pantotenato,
- c)
- se ajusta el ácido D-pantoténico libre contenido en la solución mediante la adición de una base de calcio y/o de magnesio hasta un valor de pH de 5-10, obteniéndose una solución, que contiene pantotenato de calcio y/o de magnesio y
- d)
- se somete la solución que contiene pantotenato de calcio y/o de magnesio a un secado y/o formulación.
En una variante del procedimiento según la
invención se obtiene o se coloca previamente en la etapa c) o d)
una suspensión, que contiene pantotenato de calcio y/o de
magnesio.
Además la fermentación que tiene lugar según la
invención en la etapa a) puede realizarse según modos de proceder
conocidos con un funcionamiento discontinuo, discontinuo con
alimentación o discontinuo con alimentación repetida o con una
dirección del proceso continua. A este respecto para la
neutralización del ácido pantoténico que se produce se utilizan
sistemas tampón habituales, tales como por ejemplo tampón fosfato
con NaOH, KOH o amoniaco.
En variantes adicionales del procedimiento según
la invención se forman en la etapa a) al menos 10 g/l,
preferiblemente al menos 20 g/l, especialmente preferible al menos
40 g/l, lo más especialmente preferible al menos 60 g/l y
especialmente al menos 70 g/l de sales del ácido
D-pantoténico mediante fermentación en el medio de
cultivo.
Según la invención debe entenderse por la
formulación "producir", que el microorganismo puede sintetizar
mayores cantidades de ácido D-pantoténico y/o sus
sales, que las que son necesarias para las propias demandas
metabólicas. En una variante ventajosa según la invención la
cantidad sintetizada de ácido D-pantoténico y/o sus
sales no se encuentra en el interior de las células, sino que se
desprende de manera ideal del microorganismo al medio de cultivo.
Esta expulsión puede tener lugar de manera activa o pasiva según
mecanismos en sí conocidos.
Según la invención se utilizan como
microorganismos que producen ácido D-pantoténico
hongos, levaduras y/o bacterias. Según la invención se utilizan
preferiblemente hongos tales como por ejemplo Mucor o levaduras,
tales como por ejemplo Saccharomyces o Debaromyces y a
este respecto preferiblemente Saccharomyces cerevisiae.
Ventajosamente se utilizan según la invención bacterias corineformes
o Bacillaceae. Según la invención se comprenden
preferiblemente por ejemplo bacterias de los géneros
Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Arthrobacter,
Brevibacterium, Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella, Proteus,
Acinetobacter o Rhizobium. A este respecto se prefieren
especialmente por ejemplo Corynebacterium glutamicum,
Brevibacterium breve o Bacillus subtilis, B.
licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. lentimorbus, B.
lentus, B. firmus, B.pantothenticus, B. circulans, B. coagulans, B.
megaterium, B. pumilus, B. thuringiensis, B. brevis, B.
stearothermophilus y otras clases de Bacillus del grupo
1, que se caracterizan por su 16s ARN o Actinum mycetalis.
Esta enumeración sirve para la explicación y no es de ninguna
manera limitante para la presente invención.
Además la presente invención comprende también
la utilización de microorganismos modificados genéticamente para la
producción según la invención de un complemento de alimento para
animales que contiene ácido D-pantoténico libre y/o
sus sales. Los microorganismos modificados genéticamente de este
tipo pueden aislarse por ejemplo mediante mutagénesis química y
selección posterior mediante un "procedimiento de selección"
adecuado. Según la invención se comprenden también las denominadas
"cepas de producción", que son adecuadas para la producción
del producto en el sentido de la presente invención y que presentan
modificaciones genéticas con respecto al flujo metabólico en la
dirección del ácido D-pantoténico, estando incluidas
también las modificaciones con respecto a la expulsión del ácido
D-pantoténico y/o sus sales a través de la membrana
celular. Esto puede conseguirse por ejemplo mediante modificaciones
en las posiciones clave en rutas de biosíntesis metabólicas del
microorganismo utilizado.
Es concebible también la utilización de
microorganismos transgénicos, que resultan de la transferencia de
secuencias de nucleótidos homólogas y/o heterólogas, que son
necesarias o pueden ser favorables para la síntesis del producto
deseado. A este respecto es concebible la sobreexpresión y/o
desregulación de uno o varios genes individualmente y/o en
combinación, localizados en el genoma y/o en un vector. Los
microorganismos transgénicos de este tipo pueden contener
ventajosamente copias adicionales y/o genes modificados
genéticamente seleccionados del grupo de panB, panC, panD, panE y/o
sus combinaciones y/o incluso unidades de organización, tal como el
operón panBCD. Además pueden manipularse ventajosamente en los
microorganismos otras rutas metabólicas, tales como por ejemplo la
ruta de biosíntesis de isoleucina-valina, tal como
se describe por ejemplo en los documentos EP 1 006 189, EP 1 006
192, EP 1 006 193 o EP 1 001 027. Mediante esto se ponen a
disposición multiplicadas, las sustancias precursoras de cadena
ramificada de la biosíntesis del ácido pantoténico. Ventajosamente
se sobreexpresan dado el caso los genes para esta ruta de
biosíntesis, es decir ilvB, ilvN, ilvC y/o ilvD. Además se
comprenden según la invención modificaciones genéticas de la
aspartato-\alpha-descarboxilasa
(panD), por ejemplo mediante la sobreexpresión y/o desregulación,
en el microorganismo que produce ácido D-pantoténico
utilizado.
Por la formulación "desregulación" debe
entenderse según la invención lo siguiente: modificaciones o
alteraciones de al menos un gen, que codifica para una enzima en
una ruta metabólica biosintética, de modo que la actividad de la
enzima está modificada o alterada en el microorganismo. Se prefiere
que al menos un gen, que codifica para una enzima de una ruta
metabólica biosintética, esté modificado de tal manera, que el
producto génico se forma de manera reforzada o presenta una
actividad aumentada. El término "ruta metabólica desregulada"
incluye también una ruta metabólica biosintética, en la que más de
un gen, que codifica para más de una enzima, está modificado o
alterado de tal manera, que las actividades de más de una enzima
están modificadas o alteradas. Las modificaciones o alteraciones
pueden comprender, pero no se limitan a: eliminación del promotor
endógeno o de elementos reguladores; inserción de promotores
fuertes, promotores inducibles o varios promotores simultáneamente;
eliminar secuencias de regulación, de modo que la expresión del
producto génico está modificada; modificación de la situación
cromosómica del gen; modificación de la secuencia de ADN en la
proximidad del gen o dentro del gen tal como por ejemplo del sitio
de unión al ribosoma (RBS); aumento del número de copias del gen en
el genoma o diferente número de copias mediante la introducción de
plásmidos; alteración de proteínas (por ejemplo proteínas de
regulación, supresores, potenciadores, activadores
transcripcionales, y similares), que desempeñan un papel en la
transcripción del gen y/o en la traducción al producto génico. A
éstas pertenecen también otras posibilidades para la desregulación
de la expresión de genes que son estado de la técnica, tal como por
ejemplo el uso de oligonucleótidos antisentido, o el bloqueo de
proteínas represoras. La desregulación puede incluir también
modificaciones en la región codificante de genes, que conducen por
ejemplo a la anulación de la regulación por retroalimentación en el
producto génico o a una actividad específica mayor o menor del
producto génico.
Además son ventajosas según la invención las
modificaciones de ingeniería genética en enzimas, que influyen en
la emisión de precursores del ácido pantoténico y/o el flujo del
ácido pantoténico para dar coenzima A. A modo de ejemplo, los genes
que codifican para tales enzimas son: alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA,
coaX y otros más. Esta enumeración sirve para la explicación y no
es limitante de ninguna manera para la presente invención. Además
son ventajosas las modificaciones de ingeniería genética, que
garantizan una preparación celular de cofactores (por ejemplo de
tetrahidro-
folato de metileno, equivalentes redox y similares) en una cantidad óptima para la producción de ácido pantoténico.
folato de metileno, equivalentes redox y similares) en una cantidad óptima para la producción de ácido pantoténico.
De manera ventajosa se encuentra entonces ya la
\beta-alanina en las células en concentraciones
aumentadas con respecto a los microorganismos no modificados
genéticamente de manera correspondiente y no debe añadirse por
consiguiente como precursor al medio de cultivo, tal como es
necesario en el documento EP-A-0 590
857. Son ventajosos los microorganismos, cuya biosíntesis del ácido
pantoténico (pan) y/o la isoleucina-valina (ilv)
y/o
aspartato-\alpha-descarboxilasa
(panD) está desregulada. Además es ventajosa una sobreexpresión
adicional de la cetopantoato-reductasa (panE) en los
microorganismos.
Además es ventajoso según la invención si dado
el caso el gen coaA, que es necesario para la síntesis de coenzima
A, tiene su actividad reducida o (por ejemplo en las especies de
Bacillus) está completamente inactiva. Es decir
Bacillus contiene además de coaA otro gen para esta función
enzimática (= coaX). También la actividad de este gen coaX o de la
enzima correspondiente pueden modificarse, preferiblemente
reducirse, o incluso delecionarse, siempre que el propio coaA
presente todavía una actividad enzimática suficiente, aunque
reducida, es decir que la actividad enzimática de coaA no se ha
perdido completamente. Además de la sobreexpresión de los diferentes
genes también es ventajosa una manipulación genética de las
regiones promotoras de estos genes de tal manera, que esta
manipulación conduce a una sobreexpresión de los productos
génicos.
En una variante de realización de la presente
invención se utilizan las cepas bacterianas descritas según el
anexo (documento WO 01/21772), tales como por ejemplo Bacillus
subtilis PA 824 y/o derivados de los mismos. En una variante de
realización preferida se utiliza según la invención el
microorganismo Bacillus subtilis PA 668, tal como se
describe según el anexo (documento US 2004/0091979), en el
procedimiento según la invención. Estas cepas de Bacillus
subtilis PA 824 y PA 668 se produjeron tal como sigue:
- Partiendo de la cepa de Bacillus subtilis 168 (cepa Marburg ATCC 6051), que presenta el genotipo trpC2 (Trp^{-}), se generó mediante transducción del marcador Trp^{+} (del tipo natural W23 de Bacillus subtilis) la cepa PY79. En la cepa PY79 se insertaron mediante métodos de ingeniería genética clásicos (tal como se describen por ejemplo en Harwood, C. R. y Cutting, S. M. (editores), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, Inglaterra) las mutaciones \DeltapanB y \DeltapanE1.
- La cepa resultante se transformó con ADN genómico de la cepa PA221 de Bacillus subtilis (genotipo P_{26}panBCD, trpC2 (Trp-)) y ADN genómico de la cepa PA303 de Bacillus subtilis (genotipo P_{26}panE1). La cepa PA327 resultante tiene el genotipo P_{26}panBCD, P_{26}panE1 y es auxótrofo con respecto al triptófano (Trp^{-}). Con la cepa PA327 de Bacillus subtilis se consiguieron en cultivos de 10 ml con medio SVY (llenar 25 g/l de caldo infusión de ternera de Difco, 5 g/l de extracto de levadura de Difco, 5 g/l glutamato de Na, 2,7 g/l sulfato de amonio hasta 740 ml de agua, introducir en autoclave, posteriormente adición de 200 ml de fosfato de potasio 1 M, pH 7,0 y 60 ml de solución de glucosa estéril al 50%), complementados con 5 g/l de \beta-alanina y 5 g/l de \alpha-cetoisovalerato, títulos de ácido pantoténico de hasta 3,0 g/l (24 h).
La producción de la cepa PA221 de Bacillus
subtilis (genotipo P_{26}panBCD, trpC2 (Trp-)) se
describe en el párrafo siguiente:
- Mediante métodos de ingeniería genética clásicos con ayuda de la información de secuencia del operón panBCD de E. coli (véase Merkel et al., FEMS Microbiol. Lett., 143, 1996:247-252) partiendo de una biblioteca de plásmidos de Bacillus subtilis GP275 se clonó el operón panBCD de Bacillus. Para la clonación se utilizó la cepa BM4062 de E. coli (bir^{ts}) y la información de que el operón de Bacillus se encuentra en la proximidad del gen birA. El operón panBCD se insertó en un plásmido replicable de E. coli. Para la mejora de la expresión del operón panBCD se utilizaron promotores constitutivos fuertes del fago SP01 de Bacillus subtilis (P_{26}) y se sustituyó el sitio de unión al ribosoma (= RBS) antes del gen panB por un RBS artificial. Antes del casete P_{26}panBCD en el plásmido se ligó un fragmento de ADN, que se encuentra directamente en el sentido 5' del gen panB nativo en Bacillus. Este plásmido se transformó en la cepa RL-1 de Bacillus subtilis (derivado obtenido mediante mutagénesis clásica del Bacillus subtilis 168 (cepa de Marburg ATCC 6051), genotipo trpC2 (Trp^{-})) y mediante recombinación homóloga se sustituyó el operón panBCD nativo por el operón P_{26}panBCD. La cepa resultante recibe el nombre de PA221 y tiene el genotipo P_{26}panBCD, trpC2 (Trp^{-}).
- Con la cepa PA221 de Bacillus subtilis en cultivos de 10 ml con medio SVY, complementados con 5 g/l de \beta-alanina y 5 g/l de \alpha-cetoisovalerato, se consiguieron títulos de ácido pantoténico de hasta 0,92 g/l (24 h).
La producción de la cepa PA303 de Bacillus
subtilis (genotipo P_{26}panE1) se describe en el
párrafo siguiente:
- Con ayuda de la secuencia génica panE de E. coli se clonó de manera análoga la secuencia panE de Bacillus. Se demostró, que en B. subtilis existen dos homólogos del gen panE de E. coli, que se denominaron panE1 y panE2. Mediante análisis de deleción se demostró, que el gen panE1 es responsable del 90% de la producción de ácido pantoténico, mientras que la deleción del gen panE2 no tuvo ningún efecto significativo en la producción de ácido pantoténico. También aquí de manera análoga para la clonación del operón panBCD se sustituyó el promotor por el promotor constitutivo fuerte P_{26} y el sitio de unión al ribosoma antes del gen panE1 por el sitio de unión artificial. Se clonó el fragmento P_{26}panE1 en un vector, que estaba configurado de tal manera, que el fragmento P_{26}panE1 podía integrarse en el locus panE1 original en el genoma de Bacillus subtilis. La cepa resultante tras la transformación y la recombinación homóloga recibe el nombre de PA303 y tiene el genotipo P_{26}panE1.
- Con la cepa PA303 de Bacillus subtilis, en cultivos de 10 ml con medio SVY, complementados con 5 g/l de \beta-alanina y 5 g/l de \alpha-cetoisovalerato, se consiguieron títulos de ácido pantoténico de hasta 1,66 g/l (24 h).
La construcción de la cepa adicional tuvo lugar
mediante la transformación de PA327 con un plásmido, que contenía
el operón P_{26}ilvBNC y el gen marcador para
espectinomicina. El operón P_{26}ilvBNC se integraba en el
locus amyE, lo que pudo confirmarse mediante PCR. Un
transformante se denominó PA340 (genotipo P_{26}panBCD,
P_{26}panE1, P_{26}ilvBNC, specR, trpC2
(Trp^{-})). Con la cepa PA340 de Bacillus subtilis en
cultivos de 10 ml con medio SVY, complementados sólo con 5 g/l de
\beta-alanina, se consiguieron títulos de ácido
pantoténico de hasta 3,6 g/l (24 h), en cultivos de 10 ml con medio
SVY, complementados con 5 g/l de \beta-alanina y
5 g/l de \alpha-cetoisovalerato, se consiguieron
títulos de ácido pantoténico de hasta 4,1 g/l (24 h).
Por lo demás se insertó en la cepa PA340 un
casete ilvD desregulado. Para ello se transformó un plásmido,
que contiene el gen ilvD bajo el control del promotor
P_{26} con el RBS2 artificial, en PA340. A este respecto se
integró el gen P_{26}ilvD mediante recombinación homóloga
en el locus ilvD original. La cepa PA374 resultante tiene el
genotipo P_{26}panBCD, P_{26}panE1,
P_{26}ilvBNC, P_{26}ilvD, specR y trpC2
(Trp^{-}). Con la cepa PA374 de Bacillus subtilis en
cultivos de 10 ml con medio SVY, complementados sólo con 5 g/l de
\beta-alanina, se consiguieron títulos de ácido
pantoténico de hasta 2,99 g/l (24 h).
Para producir con la cepa PA374 ácido
pantoténico sin adición de \beta-alanina, se
insertaron en la cepa PA374 copias adicionales del gen panD
que codifica para la
aspartato-\alpha-descarboxilasa.
Para ello se transformó ADN cromosómico de la cepa PA401 en PA374.
Mediante la selección sobre tetraciclina se obtuvo la cepa PA377.
La cepa PA377 resultante tiene el genotipo P_{26}panBCD,
P_{26}panE1, P_{26}ilvBNC, P_{26}ilvD,
specR, tetR y trpC2 (Trp^{-}).
Con la cepa PA377 de Bacillus subtilis en
cultivos de 10 ml con medio SVY se consiguieron títulos de ácido
pantoténico sin adición de precursores de hasta 1,31 g/l (24 h).
La producción de la cepa PA401 de Bacillus
subtilis (genotipo P_{26}panD) se describe en el
párrafo siguiente:
- Se clonó el gen panD de Bacillus subtilis a partir del operón panBCD en un vector, que porta el gen marcador de tetraciclina. Antes del gen panD se clonaron el promotor P_{26} y un RBS artificial descrito anteriormente. Mediante digestión de restricción se produjo un fragmento, que contenía el gen marcador de tetraciclina y el gen P_{26}panD. Volvió a ligarse este fragmento y se transformó en la cepa PA221 mencionada anteriormente. A este respecto se integró el fragmento en el genoma de la cepa PA221. La cepa PA401 resultante tiene el genotipo P_{26}panBCD, P_{26}panD, tetR y trpC2 (Trp^{-}).
- Con la cepa PA401 de Bacillus subtilis, en cultivos de 10 ml en medio SVY, complementados con 5 g/l de \alpha-cetoisovalerato, se consiguieron títulos de ácido pantoténico de hasta 0,3 g/l (24 h). En cultivos de 10 ml con medio SVY, complementados con 5 g/l de ácido D-pantoico y 10 g/l de L-aspartato, se consiguieron títulos de ácido pantoténico de hasta 2,2 g/l (24 h).
Partiendo de la cepa PA377 se generó mediante la
transformación con ADN cromosómico de la cepa PY79 una cepa
prototrofa frente al triptófano. Esta cepa PA824 tiene el genotipo
P_{26}panBCD, P_{26}panE1, P_{26}ilvBNC,
P_{26}ilvD, specR, tetR y Trp^{+}. Con la cepa PA824 de
Bacillus subtilis en cultivos de 10 ml con medio SVY, se
consiguieron títulos de ácido pantoténico sin adición de precursores
de hasta 4,9 g/l (48 h) (Comparación con PA377: hasta 3,6 g/l en 48
h).
La producción de PA688 se describe en el párrafo
siguiente:
- Se clonó el gen panB de Bacillus a partir del operón panBCD de tipo natural y se insertó en un vector, que además de un gen de resistencia al cloranfenicol contiene también secuencias de B. subtilis del locus vpr.
- El promotor constitutivo fuerte P26 se insertó antes del extremo 5' del gen panB. Se obtuvo un fragmento, que contiene el gen P_{26}panB, el gen marcador para la resistencia frente al cloranfenicol así como secuencias vpr de Bacillus subtilis, mediante digestión de restricción. Volvió a ligarse el fragmento aislado y con ello se transformó la cepa PA824. La cepa obtenida se denominó PA668. El genotipo de PA668 es: P_{26}panBCD, P_{26}panE1, P_{26}ilvBNC, P_{26}ilvD, P_{26}panB, specR, tetR, CmR y Trp^{+}.
- Se aislaron dos colonias de PA668 y una se denominó PA668-2A y la otra PA668-24.
- Con la cepa PA668-2A de B. subtilis, en cultivos de 10 ml en medio SVY, sin la adición de precursores, se consiguieron títulos de ácido pantoténico de 1,5 g/l en 48 h. En cultivos de 10 ml, complementados con 10 g/l de aspartato, se consiguieron títulos de ácido pantoténico de hasta 5 g/l.
- Con la cepa PA668-24 de B. subtilis, en cultivos de 10 ml en medio SVY, sin la adición de precursores, se consiguieron títulos de ácido pantoténico de 1,8 g/l en 48 h. En cultivos de 10 ml, complementados con 10 g/l de L-aspartato, se consiguieron títulos de ácido pantoténico de hasta 4,9 g/l.
La construcción exacta de las cepas debe tomarse
según los anexos de los documentos WO 01/21772 y US
2004/0091979.
Con la cepa PA377 descrita anteriormente con
fermentación limitada en glucosa en medio SVY (25 g/l de caldo
infusión de ternera de Difco, 5 g/l de extracto de levadura de
Difco, 5 g/l de triptófano, 5 g/l de glutamato de Na, 2 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 10 g/l de KH_{2}PO_{4}, 20 g/l
de K_{2}HPO_{4}, 0,1 g/l de CaCl_{2}, 1 g/l de MgSO_{4}, 1
g/l de citrato de sodio, 0,01 g/l de FeSO_{4} x 7 H_{2}O y 1
ml/l de una solución salina de oligoelementos de composición
siguiente: 0,15 g de Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O, 2,5 g de
H_{3}BO_{3}, 0,7 g de CoCl_{2} x 6 H_{2}O, 0,25 g de
CuSO_{4} x 5 H_{2}O, 1,6 g de MnCl_{2} x 4 H_{2}O, 0,3 g
de ZnSO_{4} x 7 H_{2}O, llena con agua hasta 1 l) en la medida
de 10 l con alimentación continua de una solución de glucosa en 36
h (48 h) se consiguieron concentraciones de ácido pantoténico en el
caldo de fermentación de 18-19 g/l
(22-25 g/l).
Con una fermentación limitada en glucosa de
PA824, el derivado prototrofo frente a triptófano de PA377, en
medio de extracto de levadura (10 g/l de extracto de levadura de
Difco, 5 g/l de glutamato de Na, 8 g/l de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 10 g/l de KH_{2}PO_{4}, 20 g/l
de K_{2}HPO_{4}, 0,1 g/l de CaCl_{2}, 1 g/l de MgSO_{4}, 1
g/l de citrato de sodio, 0,01 g/l de FeSO_{4} x 7 H_{2}O y 1
ml/l de la solución salina de oligoelementos descrita
anteriormente) en la medida de 10 l con alimentación continua de una
solución de glucosa en 36 h, 48 h y 72 h se consiguen las
concentraciones de ácido pantoténico siguientes en caldos de
fermentación: 20 g/l, 28 g/l y 36 g/l.
Mediante una optimización de los medios
adicional con la cepa PA824 con una fermentación limitada en glucosa
en un medio que consiste en 10 g/l de extracto de levadura de
Difco, 10 g/l de NZ Amine A (Quest International GmbH, Erftstadt),
10 g/l de glutamato de Na, 4 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4},
10 g/l de KH_{2}PO_{4}, 20 g/l de K_{2}HPO_{4}, 0,1 g/l de
CaCl_{2}, 1 g/l de MgSO_{4}, 1 g/l de citrato de sodio, 0,01 g/l
de FeSO_{4} x 7 H_{2}O y 1 ml/l de la solución salina de
oligoelementos descrita anteriormente en la medida de 10 l con
alimentación continua de una solución de glucosa en 36 h (48 h) se
consiguen las concentraciones de ácido pantoténico de 37 g/l (48
g/l) en caldos de fermentación. Aumentos adicionales de la
concentración de ácido pantoténico en el caldo de fermentación son
concebibles mediante optimización adicional de los medios, mediante
aumento de la duración de la fermentación, mediante la mejora de la
cepa y del procedimiento así como mediante combinaciones de las
etapas individuales. Así pueden conseguirse las concentraciones de
ácido pantoténico descritas anteriormente también mediante la
fermentación de cepas, que son derivados de la PA824 descrita
anteriormente. Los derivados pueden producirse mediante el
desarrollo de la cepa clásico así como mediante manipulaciones de
ingeniería genética adicionales. Mediante el desarrollo del
procedimiento de fermentación, de los medios y de la cepa pueden
aumentarse los títulos de ácido pantoténico en los caldos de
fermentación hasta más de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 y
> 90 g/l.
Una ventaja esencial del procedimiento según la
invención es que la fermentación se realiza en un medio de cultivo,
que además de al menos una fuente de carbono y de nitrógeno como
compuestos de partida no contiene otras etapas previas
(precursores). Es decir la biosíntesis del ácido
D-pantoténico es independiente de la alimentación
de otros precursores. Por precursores de este tipo deben entenderse
según la invención sustancias tales como por ejemplo
\beta-alanina y/o L-aspartato y/o
L-valina y/o
\alpha-cetoisovalerato y/o sus combinaciones. En
una variante preferida del procedimiento según la invención se
realiza la fermentación del microorganismo que produce ácido
D-pantoténico en un medio de cultivo, que contiene
una fuente de carbono y una de nitrógeno, pero que no se mezcla con
ninguna \beta-alanina libre y/o sales de
\beta-alanina o no se le añade en el transcurso
de la fermentación. Es decir para la producción de ácido
D-pantoténico en intervalos de al menos 10 g/l de
medio de cultivo, preferiblemente de al menos 20 g/l, especialmente
preferible de al menos 40 g/l, lo más especialmente preferible de
al menos 60 g/l y especialmente de al menos 70 g/l, no se necesita
según la invención ninguna alimentación de
\beta-alanina libre y/o sales de
\beta-alanina. La independencia de la
alimentación de precursores representa especialmente una ventaja
económica esencial del procedimiento según la invención con
respecto a los procedimientos conocidos, dado que un gran número de
precursores son muy caros.
Sin embargo la adición de
\beta-alanina y/o sales de
\beta-alanina no se descarta, de modo que en
consecuencia puede mejorarse todavía adicionalmente el rendimiento
de ácido D-pantoténico mediante la adición de
\beta-alanina y/o sales de
\beta-alanina. Si se parte por ejemplo de la base
de que todos los precursores necesarios del ácido pantoténico están
presentes en una cantidad suficiente y únicamente la actividad del
gen panD limita un aumento adicional de la producción de ácido
pantoténico, entonces puede aumentarse el rendimiento de ácido
pantoténico por ejemplo en un 50% adicional mediante la adición de
\beta-alanina libre y/o sales de
\beta-alanina. En una variante ventajosa de la
presente invención pueden añadirse hasta 20 g/l de
\beta-alanina libre y/o sales de
\beta-alanina al medio de cultivo para el aumento
adicional del rendimiento de ácido pantoténico en más del 50%. Se
prefiere la adición de aproximadamente 15 g/l de
\beta-alanina libre y/o sales de
\beta-alanina al medio de cultivo.
Ejemplos de fuentes de carbono adecuadas según
la invención para su utilización en un medio de cultivo para la
fermentación de los microorganismos mencionados anteriormente son
azúcares, tales como hidrolizados de almidón (mono, di,
oligosacáridos), preferiblemente glucosa o sacarosa así como melaza
de remolacha o de caña de azúcar, proteínas, hidrolizados de
proteína, harina de soja, agua empleada para remojar maíz, grasas,
ácidos grasos libres, células recirculadas de fermentaciones ya
realizadas o su hidrolizados así como extracto de levadura. Estas
enumeraciones no son limitantes para la presente invención.
Además el presente procedimiento se caracteriza
de manera ventajosa porque el contenido en azúcar total se reduce
hasta un mínimo hasta el final de la fermentación, dado que de otra
manera éste dificulta un secado posterior y/o formulación de la
solución de fermentación por adhesión. Esto puede conseguirse según
la invención porque la fermentación continúa realizándose todavía
algún tiempo después de que se haya consumido la fuente de carbono
(en el caso del cultivo en funcionamiento discontinuo) o después de
interrumpir la alimentación de carbono (en el caso de una dirección
del proceso en funcionamiento discontinuo con alimentación o
discontinuo con alimentación repetida) y/o se regula de tal manera,
que la concentración de la fuente de carbono prácticamente es cero
(en el caso de una dirección del proceso discontinua con
alimentación, discontinua con alimentación repetida o continua).
Esto tiene lugar según la invención porque tras la interrupción de
la dosificación de la fuente de carbono (por ejemplo solución de
azúcar) continúa realizándose la fermentación hasta conseguir una
concentración de oxígeno disuelto (pO_{2}) de al menos el 80%,
preferiblemente del 90% y especialmente preferible del 95% del
valor de saturación en la solución de fermentación.
Ejemplos de fuentes de nitrógeno adecuadas según
la invención son amoniaco, sulfato de amonio, urea, proteínas,
hidrolizados de proteína o extracto de levadura. Tampoco esta
enumeración es limitante para la presente invención.
Además el medio de fermentación contiene sales
minerales y/o oligoelementos, tales como aminoácidos y vitaminas.
Las composiciones exactas de los medios de fermentación adecuados
son muy conocidas y son accesibles para el experto. Tras la
inoculación del medio de fermentación con un microorganismo adecuado
que produce ácido D-pantoténico (con los espesores
celulares conocidos por el experto) tiene lugar, dado el caso con la
adición de un agente antiespumante, el cultivo del microorganismo.
Una regulación dado el caso necesaria del valor de pH del medio
puede tener lugar con diferentes ácidos o bases inorgánicas u
orgánicas, tales como por ejemplo NaOH, KOH, amoniaco, ácido
fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido fórmico, ácido
succínico, ácido cítrico o similares.
Debido a los sistemas tampón utilizados durante
la fermentación, que pueden ser tal como se describieron
anteriormente, por ejemplo NaOH, KOH, amoniaco, ácido fosfórico,
ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido fórmico, ácido succínico,
ácido cítrico o similares, se encuentra el ácido
D-pantoténico formado en la solución de fermentación
según el sistema tampón utilizado en forma de (de las)
sal(es) respectiva(s). Dado que a este respecto según
la invención son desventajosas sobre todo las sales del ácido
D-pantoténico en forma de sus cationes monovalentes
o se prefiere sobre todo el ácido D-pantoténico en
forma de sus sales de calcio o de magnesio, se trata la solución de
fermentación según la invención mediante un procedimiento de
separación por electromembrana.
A este respecto la presente invención comprende
todos los tipos de procedimientos disponibles de separación por
electromembrana, tales como las electrolisis de membrana o las
electrodiálisis. Pertenece al conocimiento del experto hacer una
selección adecuada. Según la invención se prefiere la utilización de
la electrodiálisis. A este respecto se utilizan tanto
electrodiálisis con membranas exclusivamente monopolares como
electrodiálisis con membranas mono y/o bipolares. Especialmente se
prefieren electrodiálisis con membranas exclusivamente monopolares,
especialmente electrodiálisis con membranas monopolares selectivas
para iones monovalentes, las denominadas membranas monoselectivas.
En principio, puede utilizarse cualquier membrana utilizada
habitualmente en el contexto de los procedimientos de
electrodiálisis para la realización del procedimiento según la
invención. En el caso de la membrana utilizada en el contexto de la
electrodiálisis según la invención, se utilizan preferiblemente
membranas de intercambio iónico habituales en el comercio. Como
membranas de intercambio aniónico que pueden usarse deben
mencionarse por ejemplo: Neosepta AM1, AM2, AM3, AMX, AMH, AFN, de
Tokuyama Corp. y AMV de Asahi Glass. Como membranas de intercambio
catiónico deben mencionarse a modo de ejemplo Neosepta CM1, CM2,
CMX, CMH, CMB, Asahi Glass CMV así como Nafion 435 o 350 de Du Pont
de Nemours. Como membrana de intercambio catiónico monoselectiva
debe mencionarse por ejemplo la membrana Neosepta CMS. Como membrana
de intercambio aniónico monoselectiva se tienen en consideración
por ejemplo las membranas Neosepta ACS de Tokuyama Corp. o Selmion
ASV de Asahi Glass. Como electrodos pueden utilizarse aceros
afinados, níquel, metales nobles tales como por ejemplo platino u
otros materiales adecuados conocidos por el experto.
Mediante la utilización de la electrodiálisis
monopolar, pueden conducirse según la invención tanto los aniones
como los cationes de la solución que contiene pantotenato mediante
la migración en el campo eléctrico por las membranas de intercambio
aniónico o catiónico a una segunda solución (solución concentrada,
CONC) y por consiguiente pueden eliminarse de la solución que
contiene ácido pantoténico (solución de material diluido, DIL). De
manera ventajosa, los iones de bajo peso molecular se eliminan según
la invención de la solución que contiene ácido pantoténico. Por
iones de bajo peso molecular se entienden aquéllos según la
invención que se introducen mediante la composición del medio de
cultivo y/o el sistema tampón en el caldo de fermentación, pero que
no son deseables en el producto final. A este respecto, por ejemplo
se trata de los siguientes iones: iones amonio, potasio, sodio,
hierro, cloruro, fosfato o sulfato.
En una variante de realización adicional de la
presente invención es posible realizar un intercambio iónico de
cationes monovalentes, tales como iones Na^{+} o amonio, por
cationes polivalentes, tales como Ca^{2+}. Para esto se utilizan
membranas de intercambio catiónico selectivas para iones
monovalentes. Así, por ejemplo se coloca previamente una solución
de CaCl_{2} en un circuito I y la solución de ácido pantoténico
que contiene los cationes monovalentes en un segundo circuito II
separado del circuito I mediante una membrana de intercambio
catiónico. Entonces, los cationes monovalentes preferiblemente se
conducen hacia una tercera cámara III mediante una membrana de
intercambio catiónico selectiva para iones monovalentes que se
encuentra entre la cámara II y la cámara III. Simultáneamente, se
conducen los aniones, tales como iones cloruro, de la cámara I a la
cámara III mediante una membrana de intercambio aniónico que se
encuentra entre la cámara I y la cámara III. Los iones Ca_{2+} se
conducen de la cámara I a la cámara II mediante una membrana de
intercambio catiónico. De esta manera se obtiene directamente el
D-pantotenato de calcio. En el caso de que exista
una sal de un ácido débil, tal como por ejemplo el ácido
pantoténico, también puede obtenerse ácido
D-pantoténico libre en un sistema de este tipo, si
se coloca previamente una solución de HCl acuosa en vez de
CaCl_{2} en la cámara I.
Según la invención se comprende también la
utilización de sales de calcio y/o de magnesio en forma de aniones
inorgánicos u orgánicos. De manera ventajosa se usan según la
invención cloruro, nitrato, hidróxido, formiato, acetato,
propionato, glicinato o lactato de calcio y/o de magnesio.
En una variante de realización de la presente
invención, pueden conducirse los cationes, en el caso de utilizar
la electrodiálisis bipolar de manera ventajosa con la proporción
simultánea de protones (mediante la disociación de agua en la
membrana bipolar), de la solución que contiene pantotenato mediante
las membranas de intercambio catiónico a una segunda solución y por
consiguiente pueden eliminarse de la solución que contiene ácido
pantoténico. En la segunda solución se forman las correspondientes
bases de los cationes que se conducen con los iones hidróxido
proporcionados en la membrana bipolar mediante la disociación de
agua.
En otra forma de realización de la presente
invención, pueden conducirse los aniones, en el caso de utilizar la
electrodiálisis bipolar de manera ventajosa con la proporción
simultánea de iones hidróxido (mediante la disociación de agua en
la membrana bipolar), de la solución que contiene pantotenato a una
segunda solución mediante la membrana de intercambio aniónico y por
consiguiente pueden eliminarse de la solución que contiene ácido
pantoténico. En la segunda solución se forman los correspondientes
ácidos de los aniones que se conducen con los protones
proporcionados en la membrana bipolar mediante la disociación de
agua.
Según la invención se comprende también una
variante de realización adicional en la que por un lado los aniones
mediante la utilización de la electrodiálisis bipolar con la
proporción simultánea de iones hidróxido (mediante la disociación
de agua en la membrana bipolar) se conducen de la solución que
contiene pantotenato a una segunda solución mediante una membrana
de intercambio aniónico y por consiguiente se eliminan de la
solución que contiene ácido pantoténico y por otro lado los
cationes con la proporción simultánea de protones (mediante la
disociación de agua en la membrana bipolar) se conducen de la
solución que contiene pantotenato a una tercera solución mediante
la membrana de intercambio catiónico y por consiguiente se eliminan
de la solución que contiene ácido pantoténico. En la segunda
solución se forman los correspondientes ácidos de los aniones que se
conducen con los protones proporcionados en la membrana bipolar
mediante la disociación de agua y en la tercera solución se forman
las correspondientes bases de los cationes que se conducen con los
iones hidróxido proporcionados en la membrana bipolar mediante la
disociación de agua.
\newpage
Según la invención se prefiere además, en el
caso del presente procedimiento, el ajuste del valor de pH de la
solución que contiene pantotenato, hasta el punto isoeléctrico del
ácido pantoténico con ayuda de ácidos o bases. Debido a eso, el
rendimiento del ácido D-pantoténico libre puede
aumentarse más o la pérdida puede minimi-
zarse.
zarse.
La electrodiálisis monopolar es una variante
especialmente preferida, dado que es muy económica en comparación
con la electrodiálisis bipolar.
Entonces, la electrodiálisis bipolar es
apropiada especialmente si los ácidos o bases no deben añadirse para
el ajuste del valor de pH o si puede reutilizarse el ácido o base
producido.
Todas las variantes de electrodiálisis ofrecen
según la invención la ventaja de que no presentan agua residual a
partir de la regeneración de las resinas de intercambio iónico.
Mediante la utilización según la invención del
procedimiento de separación de electrones preferiblemente se
eliminan los iones de bajo peso molecular no deseados (iones
extraños), tales como iones amonio, potasio, sodio, hierro,
cloruro, fosfato o sulfato, de la solución que contiene
D-pantotenato. Es decir, se produce(n)
preferiblemente ácido D-pantoténico libre o las
sales deseadas, tales como D-pantotenato de calcio
y/o de magnesio, Según la invención se reduce el contenido en
cationes monovalentes, preferiblemente iones amonio, potasio y/o
sodio, hasta una concentración de \leq 1 g/kg de solución.
También puede reducirse esencialmente el
contenido en aniones no deseados, tales como por ejemplo iones
cloruro, sulfato o fosfato, mediante la elección de la membrana de
intercambio iónico, preferiblemente mediante la utilización de una
membrana de intercambio aniónico.
La disolución así obtenida que contiene ácido
D-pantoténico libre se ajusta según la invención
mediante la adición de bases de calcio y/o de magnesio hasta un
valor de pH de 3-10. De manera ventajosa es un valor
de pH de 5-10. Se prefiere el ajuste del valor de
pH hasta un valor de 5-9, especialmente preferible
de 6-9 y muy especialmente preferible de
6-8. De esta manera se obtiene una solución que
contiene pantotenato de calcio y/o de magnesio. Preferiblemente, se
le añade a la solución para la neutralización hidróxido de calcio,
carbonato de calcio, óxido de calcio, hidróxido de magnesio y/o
carbonato de magnesio básico en forma de un sólido y/o como
suspensión acuosa. A este respecto, se prefiere según la invención,
si la neutralización de la solución que contiene ácido
D-pantoténico libre tiene lugar con ayuda de una
base de calcio y/o de magnesio en forma de una suspensión acuosa.
Mediante la utilización de una dispersión acuosa, la neutralización
tiene lugar más rápidamente y sin grandes fluctuaciones de pH como
es el caso de la utilización de un sólido correspondiente.
Según la invención el procedimiento se
caracteriza porque se añade a la solución en la etapa c) una
suspensión acuosa que contiene el 2-55% en peso,
preferiblemente el 10-50% en peso y especialmente
preferible el 20-40% en peso de hidróxido de
calcio. Según la invención se comprende además un procedimiento, en
el que se añade a la solución en la etapa c) una suspensión acuosa
que contiene el 2-65% en peso, preferiblemente el
10-50% en peso y especialmente preferible el
20-40% en peso de carbonato de calcio. En una
variante de realización adicional de la presente invención se añade
a la solución en la etapa c) del procedimiento según la invención,
una suspensión acuosa que contiene el 2-60% en peso,
preferiblemente el 10-50% en peso y especialmente
preferible el 20-40% en peso de hidróxido de
magnesio. Según la invención se comprende también un procedimiento,
añadiéndose a la solución en la etapa c) una suspensión acuosa que
contiene el 2-25% en peso, preferiblemente el
10-20% en peso de carbonato de magnesio básico.
El secado y/o la formulación de la solución de
fermentación tiene lugar según procedimientos en sí conocidos, tal
como por ejemplo el secado por pulverización, la granulación por
pulverización, el secado en lecho fluidizado, la granulación en
lecho fluidizado, el secado de tambor o el secado
spin-flash (Ullmann's Encyclopedia of Industrial
Chemistry, 6ª edición, 1999, versión electrónica, capítulo "Drying
of Solid Materials"). La temperatura de entrada de gas en el
caso del secado por convección se encuentra en el intervalo de
100-280ºC, preferiblemente a
120-210ºC. La temperatura de salida de gas se
encuentra a 50-180ºC, preferiblemente a
60-150ºC. Para el ajuste de una distribución del
tamaño de partícula deseado y de las propiedades del producto
relacionadas con ello pueden separase o recircularse partículas
finamente divididas. Además, puede molerse la partícula gruesa en
una moledora y también posteriormente recircularse.
Según la invención es ventajosa en el caso del
procedimiento presentado anteriormente la reducción de las etapas
costosas, especialmente prescindir de la utilización de disolventes
orgánicos, con la proporción simultánea de un producto deseado con
buena valencia biológica. Además, según la invención se reduce
esencialmente la cantidad en agua residual que se produce. Por
consiguiente, esto da como resultado ahorros adicionales en las
instalaciones y plantas de eliminación costosas. Por consiguiente,
el procedimiento según la invención se caracteriza de manera
ventajosa porque es más sencillo, menos propenso a averías, de menor
consumo de tiempo, claramente con menor coste y por tanto más
económico, que los procedimientos habituales.
Sin embargo, esto no excluye que pueda variarse
el procedimiento según la invención. Las etapas del procedimiento
a) hasta d) según la invención mencionadas anteriormente, pueden
complementarse mediante una o más de las etapas de procedimiento
siguientes, que por sí mismas son familiares para el experto. A este
respecto, se comprenden según la invención todas las combinaciones
concebibles de las etapas de procedimiento adicionales
(facultativas) con las etapas del procedimiento a) hasta d)
(esenciales).
Así, las soluciones que resultan a partir de las
etapas del procedimiento a)-c) pueden esterilizarse
por ejemplo mediante calentamiento (esterilización) u otros
métodos, tales como por ejemplo pasteurización o filtración
esterilizante.
En una variante adicional del procedimiento
según la invención antes del secado y/o de la formulación de la
solución, puede realizarse al menos una y/o combinaciones de las
etapas siguientes, que comprenden lisar y/o provocar la muerte de
la biomasa y/o separar la biomasa de la solución de fermentación y/o
añadir aditivos adicionales y/o concentrar la solución de
fermentación, preferiblemente mediante deshidratación.
Por consiguiente, también es objeto de la
presente invención un procedimiento realizándose la lisis y/o la
provocación de la muerte de la biomasa ya en la solución de
fermentación o no hasta que se produce la separación de la biomasa
de la solución de fermentación. Esto puede tener lugar por ejemplo
mediante un tratamiento de temperatura, preferiblemente a
80-200ºC y/o un tratamiento ácido, preferiblemente
con ácido sulfúrico o ácido clorhídrico y/o enzimático,
preferiblemente con lisozima.
En una forma de realización adicional de la
presente invención pueden eliminarse las células de los
microorganismos que fermentan mediante la filtración, separación
(por ejemplo centrifugación) y/o decantación de las soluciones de
las etapas a), b) o c) del procedimiento según la invención. También
es concebible que las etapas a), b) o c) pueden conducirse sin la
separación de los microorganismos que están contenidos directamente
mediante la aplicación de un campo eléctrico a través de una o
varias membranas selectivas de iones.
La solución que resulta a partir del tratamiento
a través de la electrolisis de membrana o electrodiálisis puede
concentrarse a continuación de la neutralización a través de un
concentrador adecuado, por ejemplo evaporador de película
descendente, evaporador de película delgada o evaporador de
rotación. Concentradores de este tipo se producen por ejemplo por
las empresas GIG (4800 Attnang Puchheim, Austria), GEA Canzler
(52303 Düren, Alemania), Diessel (31103 Hildesheim, Alemania) y
Pitton (35274 Kirchhain, Alemania).
Para mejorar las propiedades de color del
producto final, puede realizarse una etapa de filtración adicional,
en la que se añaden algo de carbón activado a las soluciones
obtenidas durante el procedimiento y posteriormente se filtra esta
suspensión. O pueden conducirse las soluciones obtenidas durante la
fermentación a través de un lecho de carbón activado. Las
cantidades necesarias para esto de carbón activado que se utiliza se
encuentran en el intervalo inferior al % en peso de la solución y
se encuentran en el conocimiento y cálculo del experto. Estas
filtraciones pueden facilitarse mientras añadiendo a cada solución
antes de la filtración un agente auxiliar de floculación habitual
en el comercio (por ejemplo Sedipur CF 902 o Sedipur CL 390 de la
empresa BASF AG, Ludwigshafen).
En una forma de realización ventajosa de la
presente invención se esteriliza el producto de salida de la
fermentación (caldo de fermentación) mediante calentamiento y
entonces se libera de la masa celular mediante centrifugación,
filtración o decantación. Tras la adición de 50-1000
mg/kg, preferiblemente de 100-200 mg/kg de un agente
auxiliar de floculación habitual en el comercio con respecto al
producto de salida de la fermentación, se filtra a través de lecho
corto de carbón activado y arena, para obtener una solución libre de
biomasa con alto contenido en ácido D-pantoténico.
Posteriormente se desplaza esta solución tratada mediante la
aplicación de un campo eléctrico a través de una o varias membranas
selectivas de iones.
El secado posterior de esta solución puede tener
lugar por ejemplo mediante secado por pulverización. Este puede
tener lugar en equicorriente, en contracorriente o corriente mixta.
Para la pulverización puede recurrirse a todos los pulverizadores
conocidos, especialmente el pulverizador centrífugo (pulverizador de
disco), tobera para sustancia única y tobera para dos sustancias.
Preferiblemente las condiciones de temperatura de secado son de
150-250ºC de temperatura de entrada a la torre y de
70-130ºC de temperatura de salida de la torre. Pero
también puede secarse a un nivel de temperatura mayor o menor. Para
generar una humedad residual muy baja, puede conectarse a
continuación incluso una etapa de secado adicional en un lecho
fluidizado.
El secado por pulverización puede realizarse
también en una secadora FSD o SBD (FSD: Fluidized Spray dryer
(secadora de pulverización fluidizada); SBD: Spray Bed Dryer
(secadora de lecho de pulverización), tal como se construyen por
las empresas Niro (Copenhague, Dinamarca) y
APV-Anhydro (Copenhague, Dinamarca), que representan
un combinación de secadora por pulverización y lecho fluidizado. En
el caso del secado por pulverización puede añadirse un
fluidificante. Debido a esto pueden reducirse las capas en las
paredes de la secadora y mejorarse las propiedades del flujo,
justamente en el caso de polvos de grano fino. Como fluidificantes
se tienen en consideración especialmente silicatos, estearatos,
fosfatos y almidón de maíz. En principio, el secado también puede
tener lugar en un lecho fluidizado por pulverización, pudiéndose
realizarse tanto de manera continua como discontinua. La
pulverización de la solución puede tener lugar tanto por la parte
superior (pulverización superior), por la parte inferior
(pulverización inferior) como por los lados (pulverización
lateral).
Es además objeto de la presente invención una
composición para su utilización como aditivo de alimento para
animales y/o como complemento de alimento para animales, pudiéndose
producirse
\newpage
- a)
- utilizando al menos un microorganismo que produce ácido D-pantoténico, cuya biosíntesis de ácido pantoténico (pan) y/o de isoleucina/valina (ilv) está desregulada y que forma al menos 2 g/l de sales del ácido D-pantoténico mediante la fermentación en un medio de cultivo, añadiéndose al medio de cultivo 0-20 g/l, preferiblemente 0 g/l de \beta-alanina libre y/o sal de \beta-alanina,
- b)
- conduciendo la solución de fermentación que contiene D-pantotenato mediante la aplicación de un campo eléctrico a través de una o varias membranas selectivas de iones, eliminándose los iones de bajo peso molecular de la solución que contiene D-pantotenato,
- c)
- ajustándose el ácido D-pantoténico libre contenido en la solución mediante la adición de una base de calcio y/o de magnesio hasta un valor de pH de 3-10, obteniéndose una solución, que contiene pantotenato de calcio y/o de magnesio y
- d)
- sometiendo la solución que contiene pantotenato de calcio y/o de magnesio a un secado y/o formulación.
En una variante de la presente invención, la
composición se caracteriza porque se obtiene o se coloca previamente
una suspensión en la etapa c) o d), que contiene el pantotenato de
calcio y/o de magnesio.
Según la invención la composición se caracteriza
además porque contiene sales del ácido D-pantoténico
en una concentración de al menos el 1-100% en peso,
preferiblemente de al menos el 20-100% en peso y
especialmente preferible de al menos el 50% en peso. Es objeto de
la presente invención una composición, que contiene sales del ácido
D-pantoténico en forma de cationes bivalentes,
preferiblemente D-pantotenato de calcio y/o de
magnesio. Según la invención se prefiere una composición que se
caracteriza porque el contenido en sales del ácido
D-pantoténico en forma de cationes monovalentes es
\leq 1 g/kg.
Según la invención se obtiene mediante el
procedimiento descrito anteriormente un
D-pantotenato de calcio o de magnesio, que
satisface las exigencias para un aditivo de alimento para animales.
Estos requisitos son por ejemplo un contenido relativamente alto en
D-pantotenato y una buena tolerancia para los
organismos objetivo así como una valencia biológica en el sentido
de "acción de vitamina" del producto según la invención.
La presente invención se explica más
detalladamente mediante los ejemplos siguientes, que sin embargo no
son limitantes para la invención:
Se colocó previamente en un fermentador de
laboratorio con agitador y dispositivo de gasificación con 14 l de
contenido un medio de fermentación acuoso con la siguiente
composición:
Tras la esterilización se añadieron
adicionalmente los siguientes componentes de los medios
estériles:
\newpage
La solución salina de oligoelementos se compone
tal como sigue:
0,15 g de Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O, 2,5 g
de H_{3}BO_{3}, 0,7 g de CoCl_{2} x 6 H_{2}O, 0,25 g de
CuSO_{4} x 5 H_{2}O, 1,6 g de MnCl_{2} x 4 H_{2}O, 0,3 g de
ZnSO_{4} x 7 H_{2}O se rellenan con agua hasta 1 litro. La
adición de la solución salina de oligoelementos tiene lugar mediante
una filtración esterilizante. El volumen de líquido inicial
asciende a 8,4 l. Los contenidos mencionados anteriormente se
refieren a este valor.
Se añadieron a esta solución 160 ml de cultivo
inoculante (OD = 10 en medio SVY (esterilizar el medio SVY: 25 g
caldo infusión de ternera de Difco, 5 g de extracto de levadura de
Difco, 5 g de glutamato de sodio, 2,7 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4} en 740 ml de H_{2}O; añadir 200 ml
de K_{2}HPO_{4} 1 M (pH 7) estéril y 60 ml de solución estéril
de glucosa al 50% (volumen final 1 l))) de Bacillus subtilis
PA824 y se fermentó a 43ºC con agitación fuerte a una velocidad de
gasificación de 12 l/min. Se describe esta cepa según el anexo en
el documento WO 01/21772.
Se dosificaron 6 l de una solución acuosa
estéril en el plazo de 52 h. La composición fue:
Se llevó a cabo la fermentación limitada en
glucosa. Durante la fermentación se mantuvo el valor de pH a 7,2
mediante la dosificación de solución de amoniaco al 25% o de ácido
fosfórico al 20%. El amoniaco sirve simultáneamente como fuente de
nitrógeno para la fermentación. Se reguló el número de revoluciones
del elemento agitador, manteniendo el contenido en oxígeno disuelto
al 30% del valor saturación. Se controló la formación de espuma
mediante dosificaciones ocasionales de un agente antiespumante. Tras
la interrupción de la dosificación de la fuente de carbono se
continuó tanto la fermentación, hasta que el contenido en oxígeno
disuelto (pO_{2}) hubo alcanzado un valor del 95% del valor de
saturación. Posteriormente, se finalizó la fermentación y se
provocó la muerte térmicamente del microorganismo. Para ello se
esterilizó la solución de fermentación durante 60 min. Se comprobó
la muerte mediante siembra. A continuación tiene lugar la separación
celular mediante centrifugación. Tras la separación celular, la
concentración de D-pantotenato tras 52 h asciende a
24,7 g/l.
De manera análoga, también pueden producirse
caldos de fermentación, que presentan títulos de ácido pantoténico
libre de alimentación de \beta-alanina superiores
a 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 y > 90
g/l.
Un producto de salida de la fermentación, que
tal como se describió anteriormente se esterilizó mediante
calentamiento y se liberó considerablemente de la biomasa mediante
la centrifugación, se mezcló con ácido D-pantoténico
adicional y se ajustó el valor de pH con ácido sulfúrico a
aproximadamente 2. Se filtró la solución obtenida de este modo
sobre un lecho pequeño de arena/carbón activado. El contenido en
ácido D-pantoténico en esta solución asciende a
67,7 g/l.
Se trataron con electrodiálisis 900 g de este
filtrado tal como sigue: en una célula de electrodiálisis (provista
de membranas intercambiadoras de cationes y aniones (de los tipos
Neosepta AMX Sb o CMX Sb de Tokuyama Corp.) con una superficie
celular eficaz de 1,85 dm^{2} y cinco cámaras, se desalinizó el
filtrado con una densidad de corriente inicial de 29 mA/cm^{2}.
La densidad de corriente se redujo en el transcurso del ensayo tras
alcanzar la tensión límite preestablecida de 20 V de manera
continua. La temperatura estaba entre 33ºC y 40ºC. Se colocó
previamente como entrada de concentrados una solución de NaCl al
0,5% (p/p). Se reconcentró este concentrado (CONC) en el transcurso
del ensayo con los iones extraños eliminados del filtrado (material
diluido, DIL) (por ejemplo iones amonio, cloruro, hierro, potasio,
sodio o fosfato). Se colocó previamente en el circuito de
electrolitos solución de sulfato de sodio al 5% (p/p) para la
limpieza de los electrodos. Se retiraron y analizaron en el
transcurso del ensayo a distintos valores de conductividad iónica de
la solución de material diluido muestras de la cámara que contiene
el material diluido. Se representa el análisis en la siguiente
tabla y dio como resultado que se eliminan del material diluido los
iones mencionados con la duración progresiva del ensayo y se redujo
correspondientemente la conductividad del material diluido. Los
iones pequeños, monovalentes, tales como por ejemplo los iones
cloruro, se eliminan más rápidamente que los iones voluminosos,
polivalentes, tales como por ejemplo, los iones fosfato.
Los resultados del análisis del material diluido
pueden tomarse de la siguiente tabla.
Los valores de pH de todas las muestras del
material diluido estaban entre 2-3. En 771 g del
producto de salida del material diluido están contenidos 76 g/l de
ácido D-pantoténico libre. Con esto se muestra que
puede liberarse con éxito de manera electrolítica una solución de
ácido D-pantoténico obtenida de manera fermentativa
de cationes interferentes. A partir del ácido
D-pantoténico desalinizado obtenido pueden
producirse un polvo de D-pantotenato de calcio no
higroscópico, tal como se describe en el ejemplo 2.
\newpage
Se colocó en un fermentador de laboratorio con
agitador y dispositivo de gasificación con 14 l de contenido un
medio de fermentación acuoso con la siguiente composición:
Tras la esterilización se añadieron
adicionalmente los siguientes componentes de los medios:
La solución salina de oligoelementos se compone
tal como sigue:
0,15 g de Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O, 2,5 g
de H_{3}BO_{3}, 0,7 g de CoCl_{2} x 6 H_{2}O, 0,25 g de
CuSO_{4} x 5 H_{2}O, 1,6 g de MnCl_{2} x 4 H_{2}O, 0,3 g de
ZnSO_{4} x 7 H_{2}O se rellenan con agua hasta un litro. La
adición de la solución salina de oligoelementos tiene lugar mediante
una filtración esterilizante. El volumen de líquido inicial
asciende a 5,5 l. Los contenidos mencionados anteriormente se
refieren a este valor.
Se añadieron a esta solución 55 ml de cultivo
inoculante (OD = 10 en medio SVY (esterilizar el medio SVY:
disolver 25 g de caldo infusión de ternera de Difco, 5 g de extracto
de levadura de Difco, 5 g de glutamato de sodio, 2,7 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4} en 740 ml de H_{2}O; añadir 200 ml
de K_{2}HPO_{4} 1 M (pH 7) estéril y 60 ml de solución estéril
de glucosa al 50% (volumen final 1 l))) de Bacillus subtilis
PA824 y se fermentó a 43ºC con agitación fuerte a una velocidad de
gasificación de 12 l/min. Se describe esta cepa según el anexo en
el documento WO 01/21772.
Se dosificaron 6 l de una solución acuosa
estéril en el plazo de 48 h. La composición fue:
Se llevó a cabo la fermentación limitada en
glucosa. Durante la fermentación se mantuvo el valor de pH a 7,2
mediante la dosificación de solución de amoniaco al 25% o de ácido
fosfórico al 20%. El amoniaco sirve simultáneamente como fuente de
nitrógeno para la fermentación. Se reguló el número de revoluciones
del elemento agitador, manteniendo el contenido en oxígeno disuelto
al 30% del valor saturación. Se controló la formación de espuma
mediante dosificaciones ocasionales de un agente antiespumante. Tras
la interrupción de la dosificación de la fuente de carbono se
continuó tanto la fermentación, hasta que el contenido en oxígeno
disuelto (pO_{2}) hubo alcanzado un valor del 95% del valor de
saturación. Posteriormente, se finalizó la fermentación y se
provocó la muerte térmicamente del microorganismo. Para ello se
esterilizó la solución de fermentación durante 30 min. Se comprobó
la muerte mediante siembra. La separación celular tuvo lugar
mediante centrifugación. Tras la separación celular la
concentración en D-patotenato tras 48 h, ascendió a
24,1 g/l. De una manera análoga, también pueden producirse caldos
de fermentación, que presentan títulos de ácido pantoténico libre
de alimentación de \beta-alanina superiores a 20,
25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 y > 90 g/l.
Se mezclaron 2817 ml del producto de salida de la fermentación con
1183 ml de una solución de ácido pantoténico de la concentración de
178,9 g/l y se neutralizó con una solución de hidróxido de amonio al
25% (pH 6,5). A continuación se filtró sobre arena/carbón activado.
El contenido en ácido D-pantoténico en el filtrado
ascendió a 67 g/l, principalmente en forma de la sal de amonio. Se
trataron con electrodiálisis aproximadamente 720 g de esta solución
según el ejemplo 1:
Se ajustaron a un valor de pH de 7,5 550 g del
producto de salida del material diluido (con una densidad de 1,017
g/ml) con 3,5 g de una suspensión de hidróxido de calcio al 40%. Se
obtuvo una solución acuosa de D-pantotenato de
calcio (551,03 g con un contenido en D-pantotenato
de calcio de 40,9 g/l). Se secó la solución acuosa de pantotenato
de calcio en un secador por pulverización de laboratorio de la
empresa Niro, tipo Minor. La temperatura de entrada en la torre
ascendió aproximadamente a 200ºC, la temperatura de salida de la
torre a 90ºC. La vaporización tuvo lugar por medio de una tobera de
dos sustancias a una presión de 2 bar. Como medio de pulverización
se añadió Sipemat 22F. A este respecto se obtuvo un producto
pulverizado de la siguiente especificación (datos en % en
peso):
Contenido en agua: 2,3%
D-pantotenato de calcio:
46,1%
Amonio: 0,60%
Potasio: 0,47%
Sodio: 1,1%
Se mezclaron en un fermentador con agitador y
dispositivo de gasificación 800 g de extracto de levadura al 50%,
438 g de glutamato de Na, 3200 g de harina de soja, 640 g de sulfato
de amonio, 800 g de KH_{2}PO_{4}, 1600 g de K_{2}HPO_{4} y
50 ml de agente antiespumante TegoKS con 70 l de agua con 200 litros
de contenido y se esterilizaron durante 30 min a 121ºC.
A continuación se añadieron la solución 1 y la
solución 2.
La solución 1 se prepara tal como sigue: se
disuelven en 9 l de agua 1670 g de glucosa x H_{2}O, 10,2 g de
CaCl_{2} x 2 H_{2}O y 170,7 g de MgCl_{2} x 6 H_{2}O y se
esterilizan durante 30 min.
La solución 2 se prepara tal como sigue: se
mezclaron 800 ml de solución de citrato-hierro (200
g/l de citrato de sodio, 2 g/l de FeSO_{4} x 7 H_{2}O, sometida
a filtración esterilizante) con 80 ml de solución salina de
oligoelementos (0,15 g de Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O, 2,5 g de
H_{3}BO_{3}, 0,7 g de CoCl_{2} x 6 H_{2}O, 0,25 g de
CuSO_{4} x 5 H_{2}O, 1,6 g de MnCl_{2} x 4 H_{2}O, 0,3 g de
ZnSO_{4} x 7 H_{2}O se rellenan con agua hasta un litro,
sometida a filtración esterilizante).
Se añadieron a esta solución 2 l de cultivo
inoculante (OD = 10 en medio SVY (esterilizar el medio SVY: 25 g de
caldo infusión de ternera de Difco, 5 g de extracto de levadura de
Difco, 5 g de glutamato de sodio, 2,7 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4} en 740 ml de H_{2}O; añadir 200 ml
de K_{2}HPO_{4} 1 M (pH 7) estéril y 60 ml de solución estéril
de glucosa al 50% (volumen final 1 l))) de Bacillus subtilis
PA668 y se fermentó a 43ºC con agitación fuerte a una velocidad de
gasificación de 3 m^{3}/min. Se describe esta cepa según el anexo
en el documento US 2004/0091979.
Se dosificaron aproximadamente 10 l de una
solución acuosa estéril de glucosa en el plazo de 48 h. La solución
se preparó tal como sigue: se mezclaron 90 kg de glucosa x H_{2}O
con 55 kg de agua y se esterilizaron durante 30 min. A continuación
se añadieron 300 ml de solución salina de oligoelementos (véase la
composición más arriba) así como 3 l de solución de
citrato-hierro (véase la composición más arriba). A
continuación se añadieron 11 de solución de CaCl_{2} x 2 H_{2}O
de 90 g/l sometida a filtración esterilizante así como 2 l de
solución de glutamato de sodio de 375 g/l sometida a filtración
esterilizante.
Se llevó a cabo la fermentación limitada en
glucosa. Durante la fermentación se mantuvo el valor de pH a 7,2
mediante la dosificación de solución de amoniaco al 25% o de ácido
fosfórico al 20%. El amoniaco sirve simultáneamente como fuente de
nitrógeno para la fermentación. Se reguló el número de revoluciones
del elemento agitador, manteniendo el contenido en oxígeno disuelto
al 30% del valor saturación. Se controló la formación de espuma
mediante dosificaciones ocasionales de un agente antiespumante. Tras
la interrupción de la dosificación de la fuente de carbono se
continuó tanto la fermentación, hasta que el contenido en oxígeno
disuelto (pO_{2}) hubo alcanzado un valor del 95% del valor de
saturación. Posteriormente, se finalizó la fermentación. La
separación celular tuvo lugar mediante la separación en un
separador de discos. Se provocó la muerte de las células restantes
en el líquido sobrenadante, térmicamente, mediante esterilización.
La concentración en D-pantotenato en la
interrupción tras 48 h ascendió a 13,7 g/l. Tras la separación y la
esterilización la concentración en D-pantotenato
ascendió a 10,7 g/l. De, manera análoga, también pueden producirse
caldos de fermentación, que presentan títulos de ácido pantoténico
libre de alimentación de \beta-alanina superiores
a 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 y
superiores a 90 g/l.
Se procedió con 3000 g de la solución de
fermentación así tratada previamente tal como sigue a continuación:
dos tercios de la mezcla básica se mezclaron a aproximadamente 10ºC
con una cantidad de CaCl_{2} correspondiente a la concentración
equivalente en aniones polivalentes (solución al 40%); se hace
precipitar un tercio de la mezcla básica de manera correspondiente
con una cantidad equivalente en Ca(OH)_{2} (sólido).
Se almacenaron las soluciones durante toda la noche en el
frigorífico y después se separaron por medio de un filtro a presión
y vacío (filtro de lecho profundo 700 de Seitz) del cuerpo base
precipitado. Posteriormente se mezclaron las soluciones y se
ajustaron de manera básica mediante adición de 10 g de
Ca(OH)_{2} adicionales a aproximadamente 10ºC (pH =
8,7) y se volvieron a precipitar. Asimismo se separó por filtración
el precipitado vuelto a precipitar.
Después se transformaron las sales de 1800 g de
la solución a 35ºC en una memoria de retención temporal de
electrodiálisis de tres compartimentos. A este respecto se condujo
el caldo de fermentación a través de una de las dos cámaras de
productos limitadas por las membranas de intercambio catiónico. En
la parte catódica una membrana de intercambio catiónico
monoselectiva (Tokuyama Soda, CMS) separó el producto del circuito
del concentrado, en la parte del ánodo se separó la cámara de
productos de una membrana de intercambio catiónico convencional
(Tokuyama Soda, CMS) del circuito del CaCl_{2}. El concentrado y
el circuito del CaCl_{2} se separaron a través de una membrana de
intercambio aniónico (Tokuyama Soda, AMX). En el concentrado se
colocaron previamente 750 g de una solución de NaCl al 0,5%, en el
circuito de CaCl_{2} 900 g de un solución de CaCl_{2} al 3,05%.
En el circuito de lavado de los electrodos se hizo circular una
solución de Na_{2}SO_{4} 0,1 molar. El ensayo se llevó a cabo
de manera galvanostática a 30 mA/cm^{2} en una memoria de
retención temporal constituida por cinco de las unidades
fundamentales descritas anteriormente con una superficie de membrana
total de 500 cm^{2} en funcionamiento discontinuo. Como criterio
de interrupción se eligió una conductividad mínima de 4 mS/cm en el
circuito de CaCl_{2}. Los resultados de los análisis de los
cationes en el circuito del concentrado y el producto se resumen en
la siguiente tabla.
De ahí se calculan enriquecimientos del 51% para
sodio, 66% para amonio y 61% para potasio. El rendimiento de
corriente medio ascendió al 82%. La pérdida de ácido pantoténico en
ambos circuitos contiguos fue respectivamente del 0,08% de la
cantidad de materia utilizada. El valor de pH del circuito de
producto fue en el transcurso de la pérdida entre pH =
7-7,5, en el concentrado y en el circuito de
CaCl_{2} de aproximadamente pH = 6. El residuo de tensión total
aumentó a lo largo del ensayo correspondientemente a la
conductividad decreciente en el circuito de CaCl_{2} de
aproximadamente 11 a 16 V.
A continuación se secó por pulverización la
solución así tratada por electrodiálisis con éxito para dar el
producto final. Con esto se muestra que con el pretratamiento
correspondiente puede utilizarse una electrodiálisis en tres
circuitos con una membrana de intercambio catiónico monoselectiva
para el intercambio de iones de cationes monovalentes por
divalentes, para aumentar la capacidad de secado por pulverización
del producto final.
Claims (21)
1. Procedimiento para la producción de ácido
D-pantoténico y/o sus sales, caracterizado
porque
- e)
- se utiliza al menos un microorganismo que produce ácido D-pantoténico, cuya biosíntesis de ácido pantoténico (pan) y/o de isoleucina/valina (ilv) está desregulada y que forma al menos 2 g/l de sales del ácido pantoténico mediante la fermentación en un medio de cultivo, añadiéndose al medio de cultivo 0 - 20 g/l de \beta-alanina libre y/o sal de \beta-alanina,
- f)
- se conduce la solución de fermentación que contiene D-pantotenato mediante la aplicación de un campo eléctrico a través de una o varias membranas selectivas de iones, eliminándose los iones de bajo peso molecular de la solución que contiene D-pantotenato,
- g)
- se ajusta el ácido D-pantoténico libre contenido en la solución mediante la adición de una base de calcio y/o de magnesio hasta un valor de pH de 3-10, obteniéndose una solución, que contiene pantotenato de calcio y/o de magnesio y
- h)
- se somete la solución que contiene pantotenato de calcio y/o de magnesio a un secado y/o formulación.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque no se le añade al medio de cultivo
ninguna \beta-alanina libre y/o sal de
\beta-alanina.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque se usa como
microorganismo que forma ácido D-pantoténico una
bacteria, una levadura o un hongo.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se usa como
microorganismo una bacteria de la familia de las
Bacillaceae.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se usa una
bacteria del género Bacillus y preferiblemente de la especie
B. subtilis, B. licheniformis o B. amyloliquefaciens.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque en la etapa a)
se forma un contenido en ácido D-pantoténico y/o
sus sales de al menos 10 g/l del medio de cultivo, preferiblemente
al menos 20 g/l, especialmente preferible al menos 40 g/l y lo más
especialmente preferible al menos 60 g/l del medio de cultivo.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque en la etapa c)
se ajusta el pH de la solución a un valor de
5-10.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque en la etapa c)
se ajusta el pH de la solución a un valor de 5-9,
preferiblemente de 6-9 y especialmente preferible de
6-8.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque en la etapa b)
se utilizan membranas de intercambio iónico monopolares y/o
bipolares.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque en la etapa b)
se utilizan membranas de intercambio iónico monopolares.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque en la etapa b)
se utilizan membranas de intercambio iónico monoselectivas.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se ajusta el
valor de pH de la solución de fermentación que contiene ácido
D-pantoténico antes del tratamiento en la etapa b)
al valor de pH isoeléctrico del ácido
D-pantoténico.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque en la etapa b)
se ajustan las densidades de corriente a 1-100
mA/cm^{2}, preferiblemente a 10-80 mA/cm^{2} y
especialmente preferible a de 20-40 mA/cm^{2}
para membranas de intercambio iónico monopolares.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque en la etapa b)
se ajustan las densidades de corriente a 1-150
mA/cm^{2}, preferiblemente a 30-100 mA/cm^{2} y
especialmente preferible a de 70-90 mA/cm^{2}
para membranas de intercambio iónico bipolares.
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque en la etapa b)
se reduce el contenido en cationes monovalentes, preferiblemente
iones amonio, potasio y/o sodio, a una concentración de \leq 1
g/kg de solución.
\newpage
16. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque en la etapa c)
se añade a la solución, para la neutralización hidróxido de calcio,
carbonato de calcio, óxido de calcio, hidróxido de magnesio y/o
carbonato de magnesio básico en forma de un sólido y/o como una
suspensión acuosa.
17. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque en la etapa c)
se le añade a la disolución una suspensión acuosa que contiene el
2-55% en peso, preferiblemente el
10-50% en peso y especialmente preferible el
20-40% en peso en hidróxido de calcio.
18. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque en la etapa c)
se le añade a la disolución una suspensión acuosa que contiene el
2-65% en peso, preferiblemente el
10-50% en peso y especialmente preferible el
20-40% en peso en carbonato de calcio.
19. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque en la etapa c)
se le añade a la disolución una suspensión acuosa que contiene el
2-60% en peso, preferiblemente el
10-50% en peso y especialmente preferible el
20-40% en peso en hidróxido de magnesio.
20. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque en la etapa c)
se le añade a la disolución una suspensión acuosa que contiende el
2-25% en peso, preferiblemente el
10-20% en peso en carbonato de magnesio básico.
21. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque en la etapa c)
o d) se obtiene o se coloca previamente una suspensión que contiene
pantotenato de calcio y/o de magnesio.
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