CZ20032223A3 - Způsob výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí jako přísady do zvířecích krmiv - Google Patents
Způsob výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí jako přísady do zvířecích krmiv Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20032223A3 CZ20032223A3 CZ20032223A CZ20032223A CZ20032223A3 CZ 20032223 A3 CZ20032223 A3 CZ 20032223A3 CZ 20032223 A CZ20032223 A CZ 20032223A CZ 20032223 A CZ20032223 A CZ 20032223A CZ 20032223 A3 CZ20032223 A3 CZ 20032223A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- pantothenic acid
- solution
- calcium
- weight
- pantothenate
- Prior art date
Links
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 171
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims abstract description 31
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 13
- 239000000654 additive Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 22
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 137
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 74
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 73
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 70
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 claims description 62
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 claims description 62
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 claims description 55
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 41
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 39
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 claims description 31
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 28
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 23
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 20
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 14
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 14
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 13
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 11
- ONSCBWDZUUNMMK-UBKPKTQASA-L magnesium;3-[[(2r)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound [Mg+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O ONSCBWDZUUNMMK-UBKPKTQASA-L 0.000 claims description 11
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 10
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 9
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 8
- 239000003014 ion exchange membrane Substances 0.000 claims description 8
- GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical class OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 7
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 claims description 7
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000005684 electric field Effects 0.000 claims description 7
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 claims description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 claims description 4
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 claims description 4
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 claims description 2
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 2
- BRPQOXSCLDDYGP-UHFFFAOYSA-N calcium oxide Chemical compound [O-2].[Ca+2] BRPQOXSCLDDYGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000292 calcium oxide Substances 0.000 claims description 2
- ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N calcium oxide Inorganic materials [Ca]=O ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 114
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 239000000047 product Substances 0.000 description 31
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 27
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 18
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 16
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 16
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 15
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 15
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 14
- -1 alkaline earth metal salts Chemical class 0.000 description 13
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 13
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 11
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 11
- ZLHZLMOSPGACSZ-NSHDSACASA-N (6s)-2-nitro-6-[[4-(trifluoromethoxy)phenyl]methoxy]-6,7-dihydro-5h-imidazo[2,1-b][1,3]oxazine Chemical compound O([C@H]1CN2C=C(N=C2OC1)[N+](=O)[O-])CC1=CC=C(OC(F)(F)F)C=C1 ZLHZLMOSPGACSZ-NSHDSACASA-N 0.000 description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 10
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 101150079396 trpC2 gene Proteins 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 8
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 8
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 8
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101150051152 coaX gene Proteins 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 7
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 101150081585 panB gene Proteins 0.000 description 6
- 101150076071 panD gene Proteins 0.000 description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 5
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 description 5
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 101150048956 coaA gene Proteins 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 5
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 5
- 101150043028 ilvD gene Proteins 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 101150028586 panE gene Proteins 0.000 description 5
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 5
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 101100242684 Mesorhizobium japonicum (strain LMG 29417 / CECT 9101 / MAFF 303099) panD1 gene Proteins 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 101150109763 coaW gene Proteins 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 101150105723 ilvD1 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 108010002447 aspartate-alpha-decarboxylase Proteins 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 3
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 3
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100028493 Haloferax volcanii (strain ATCC 29605 / DSM 3757 / JCM 8879 / NBRC 14742 / NCIMB 2012 / VKM B-1768 / DS2) pan2 gene Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000019730 animal feed additive Nutrition 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003311 flocculating effect Effects 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 2
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 2
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- ONSCBWDZUUNMMK-CTWWJBIBSA-L magnesium 3-[[(2S)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound C(CCNC([C@@H](O)C(C)(C)CO)=O)(=O)[O-].[Mg+2].C(CCNC([C@@H](O)C(C)(C)CO)=O)(=O)[O-] ONSCBWDZUUNMMK-CTWWJBIBSA-L 0.000 description 2
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 2
- HNZZAEBYPPNVOF-DHYYHALDSA-N (2s)-2-amino-3-methylbutanoic acid;(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O HNZZAEBYPPNVOF-DHYYHALDSA-N 0.000 description 1
- OTOIIPJYVQJATP-BYPYZUCNSA-N (R)-pantoic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(O)=O OTOIIPJYVQJATP-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SERHXTVXHNVDKA-BYPYZUCNSA-N (R)-pantolactone Chemical compound CC1(C)COC(=O)[C@@H]1O SERHXTVXHNVDKA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QYNUQALWYRSVHF-ABLWVSNPSA-N 5,10-methylenetetrahydrofolic acid Chemical compound C1N2C=3C(=O)NC(N)=NC=3NCC2CN1C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QYNUQALWYRSVHF-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M Aminoacetate Chemical compound NCC([O-])=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 1
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 1
- 241000193747 Bacillus firmus Species 0.000 description 1
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 1
- 108700040634 Bacillus subtilis Vpr Proteins 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000149420 Bothrometopus brevis Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 1
- 241000819038 Chichester Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 101100493587 Escherichia coli (strain K12) avtA gene Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001310335 Paenibacillus lentimorbus Species 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241001327530 Senilites Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101100125907 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) ilvC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101100056949 Wolinella succinogenes (strain ATCC 29543 / DSM 1740 / LMG 7466 / NCTC 11488 / FDC 602W) ansA gene Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150050280 alsD gene Proteins 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 101150082095 ansB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- JPNZKPRONVOMLL-UHFFFAOYSA-N azane;octadecanoic acid Chemical class [NH4+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O JPNZKPRONVOMLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 101150031021 birA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 235000020299 breve Nutrition 0.000 description 1
- 235000005939 calcium D-pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011680 calcium D-pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- QRTVQUYKMVAQBJ-UHFFFAOYSA-L calcium;3-aminopropanoate Chemical compound [Ca+2].NCCC([O-])=O.NCCC([O-])=O QRTVQUYKMVAQBJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000002036 drum drying Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 230000009123 feedback regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002413 ferric citrate Drugs 0.000 description 1
- 239000011640 ferrous citrate Substances 0.000 description 1
- 235000019850 ferrous citrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150033780 ilvB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150090497 ilvC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150099953 ilvE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150077793 ilvH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150060643 ilvN gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002891 organic anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000010970 precious metal Substances 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- 238000005245 sintering Methods 0.000 description 1
- HJHVQCXHVMGZNC-JCJNLNMISA-M sodium;(2z)-2-[(3r,4s,5s,8s,9s,10s,11r,13r,14s,16s)-16-acetyloxy-3,11-dihydroxy-4,8,10,14-tetramethyl-2,3,4,5,6,7,9,11,12,13,15,16-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-ylidene]-6-methylhept-5-enoate Chemical compound [Na+].O[C@@H]([C@@H]12)C[C@H]3\C(=C(/CCC=C(C)C)C([O-])=O)[C@@H](OC(C)=O)C[C@]3(C)[C@@]2(C)CC[C@@H]2[C@]1(C)CC[C@@H](O)[C@H]2C HJHVQCXHVMGZNC-JCJNLNMISA-M 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/12—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes by fermentation of natural products, e.g. of vegetable material, animal waste material or biomass
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/174—Vitamins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Physiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
Způsob výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí jako přísady do zvířecích krmiv
Oblast techniky
Předložený vynález se týká zlepšeného způsobu výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí a použití jako přísady do zvířecích krmiv.
Dosavadní stav techniky
Jako výchozí produkt pro biosyntézu koenzymu A je D-pantothenát v rostlinném a zvířecím světě široce rozšířen. Na rozdíl od člověka, který přijímá kyselinu pantothenovou v dostatečném množství ve výživě jsou však jak u rostlin tak i u zvířat často popisovány jevy nedostatku D-pantothenátu. Dostupnost D-pantothenátu je proto značným hospodářským zájmem, obzvláště v krmivářském průmyslu.
Obvyklým způsobem se provádí výroba D-pantothenátu chemickou syntézou z D-pantolaktou a kalcium-p-alaninátu (Ullmann s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6. vydání, 1999, elektronická verze, kapitola Vitamins). K přípravě D-pantolaktonu je nutné nákladné klasické štěpení racemátu přes diastereomerní soli. Výsledný prodejný produkt’z chemické syntézy je většinou vápenatá sůl kyseliny D-pantothenové kalcium-D-pantothenát.
Oproti chemické syntéze má biotechnologický způsob výroby pomocí mikroorganismů výhodu v selektivní (čisté enanciomery) přípravě D-formy kyseliny pantothenové, zhodno····
titelné vyššími organismy. Tím odpadá nákladné štěpení racemátu, které je nutné při chemické syntéze.
Fermentativní způsoby výroby kyseliny D-pantothenové pomocí mikroorganismů jsou běžně známy, mezi jiným z EP 0 590 857, VO 96/33283, US 6 013 492, VO 97/10340, DE 198 46 499, EP 1 001 027, EP 1 006 189, EP 1 006 192 a EP 1 006 193.
Tak popisuje EP 1 006 189 a EP 1 001 027 způsob výroby pantothenátu, při kterém se ve fermentačním roztoku dosáhne obsah nejvýše 1 g/1 kyseliny D-pantothenové. Takový nepatrný obsah kyseliny pantothenové ve fermentačním roztoku, tedy méně než 10 % hmotnostních, vztaženo na obsah pevné látky, je však pro hospodárnou výrobu doplňků zvířecího krmivá obsahujících kyselinu D-pantothenovou nevhodný. Další nevýhodou u dosud popisovaných způsobů je, že izolace produktu z fermentačního media vyžaduje početné a nákladné zpracovatelské kroky. Hospodárný způsob výroby ve velkoprovozním technickém měřítku není zveřejněn.
Ve vykládacím spisu DE 100 16 321 se popisuje způsob fermentace k výrobě doplňků zvířecího krmivá obsahujících kyselinu D-pantothenovou. Podstatnou nevýhodou tohoto způsobu je však, stejně jako u výše uvedeného fermentativního způsobu výroby kyseliny D-pantothenové, že se mikroorganismům pomocí fermentačního media musí nutně dodávat předstupeň kyseliny pantothenové, β-alanin, aby se dosáhlo hospodárných výtěžků požadovaného produktu.
Dále popisují US 6 013 492 a VO 96/332839 zpracování kyseliny D-pantothenové z fermentačního roztoku odfiltrováním nerozpustných podílů (příkladně buněčný materiál) z • · ·
-3kultivačního media, adsorpcí filtrátu na aktivním uhlí, následnou elucí kyseliny D-pantothenové organickým rozpouštědlem, s výhodou methanolem, neutralizací hydroxidem vápenatým a konečně krystalizací kalcium-D-pantothenátu. Podstatnými nevýhodami jsou ztráty cenného produktu, ke kterým dochází při krystalizaci a rovněž používání organického rozpouštědla, které se z produktu jen těžko odstraňuje a vyvolává nutnost nákladného zpětného získávání rozpouštědla.
EP 0 590 857 popisuje způsob fermentace k výrobě kyseliny D-pantothenové, při kterém se při kultivaci mikroorganismu nutně vyžaduje dokrmování β-alaninem. Fermentační roztok se k oddělení biohmoty filtruje, potom se vede přes kationtoměnič a následně přes aniontoměnič, potom se neutralizuje hydroxidem vápenatým, odpaří se, smíchá s aktivním uhlím, ještě jednou se přefiltruje a krystaluje se za přídavku methanolu a chloridu vápenatého. Výsledný produkt obsahuj ící kalciumpantothenát vedle kyseliny D-pantothenové ve formě její vápenaté soli obsahuje ještě chlorid vápenatý v molárním poměru 1:1. K redukci obsahu chloridu vápenatého je nutná elektrodialýza s následným sušením rozstřikováním. Tento způsob má nevýhodu, že pro velký počet nákladných procesních kroků a používání organických rozpouštědel není ani ekonomický ani ekologický.
Úkolem předloženého vynálezu je dát k dispozici doplněk zvířecího krmivá obsahující kyselinu D-pantothenovou a/nebo její soli a rovněž jeho výrobu zlepšeným způsobem výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí, který by neměl výše uvedené nevýhody. Přitom je z ekonomických důvodů žádoucí takový způsob, při kterém se dokrmování β-alaninu výrazně redukuje nebo dokonce není nutné. Dále je žádoucí výroba kyseliny D-pantothenové ve formě jejích dvojsytných
-4solí a zde především solí kovů alkalických zemin, protože dvojsytné soli mají méně hygroskopické vlastnosti než jednosytné soli kyseliny D-pantothenové a pro další použití, příkladně jako doplněk zvířecího krmivá tak mají méně výrazný sklon ke spékání.
Tento úkol byl výhodným způsobem vyřešen předloženým vynálezem.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je způsob výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí, vyznačující se tím, že
a) se použije nejméně jeden organismus produkující kyselinu D-pantothenovou, jehož biosyntéza kyseliny pantothenové-(pan) a/nebo isoleucin/valin-(ilv) je deregulovaná a v kultivačním mediu se fermentací tvoří nejméně 2 g/1 solí kyseliny D-pantothenové, přičemž se do kultivačního media uvádí 0 až 20 g/1 volného β-alaninu a/nebo solí β-alaninu
b) fermentační roztok obsahující D-pantothenát se uvádí vytvořením elektrického pole přes jednu nebo několik iontoselektivních membrán, přičemž se z roztoku obsahujícího D-pantothenát odstraní nízkomolekulární ionty,
c) volná kyselina D-pantothenová obsažená v roztoku se přídavkem vápenaté a/nebo hořečnaté báze upraví na hodnotu pH 5 až 10, přičemž se získá roztok, který obsahuje kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantot-5-
··· ftft
henát a
d) roztok obsahující kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát se podrobí sušení a/nebo tvorbě formulace.
Při jedné variantě způsobu podle vynálezu se v kroku c) nebo d) získá nebo předloží suspenze, která obsahuje kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát.
Dále se může fermentace podle vynálezu probíhající v kroku a) provádět známými způsoby šaržovým provozem, šaržovým provozem s dávkováním, opakovaným šaržovým provozem s dávkováním nebo kontinuálním způsobem vedení procesu.
K neutralizaci vznikající kyseliny pantothenové se přitom využívají obvyklé pufrovací systémy, jako je příkladně fosfátový pufr s hydroxidem sodným, hydroxidem draselným nebo s amoniakem.
V další variantě způsobu podle vynálezu se v kroku a) tvoří fermantací v kultivačním mediu nejméně 10 g/1, s výhodou nejméně 20 g/1, obzvláště výhodně nejméně 40 g/1, nanejvýš výhodně nejméně 60 g/1 a zvláště nejméně 70 g/1 solí kyseliny D-pantothenové.
Podle vynálezu se formulací produkovat'' rozumí, že organismus může syntetizovat větší množství kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí, než je nutné pro vlastní potřebu látkové výměny. V jedné výhodné variantě podle vynálezu se nevyskytuje syntetizované množství kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí interně v buňkách, nýbrž jsou z organismu ideálním způsobem vylučovány do kultivačního media. Toto vylučování se může provádět aktivně nebo pa·· » « • ·
-6• · • · * * ♦ <
·· ·· sivně známými mechanismy.
Podle vynálezu se jako mikroorganismy produkující kyselinu D-pantothenovou použijí mikroorganismy. K nim patří podle vynálezu houby, kvasinky a/nebo bakterie. Podle vynálezu jsou výhodné houby jako příkladně Mucor nebo kvasinky, jako příkladně Saccharomyces nebo Debaromyces, s výhodou se použije Saccharomyces cerevisiae. S výhodou se podle vynálezu použijí coryneformní bakterie nebo Bacillaceae. Podle vynálezu jsou s výhodou zahrnuty příkladně bakterie druhů Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Arthrobacter, Bevibacterium, Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella, Próteus, Acinetobacter nebo Rhizobium. Obzvláště výhodné jsou zde příkladně Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium breve nebo Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. lentimorbus, B. lentus, B. firmus, B. pantothenticus, B. circulans, B. coagulans, B. megaterium, B.pumilus, B. thuringiensis, B. brevis, B. stearothermophilus a další druhy bacilů ze skupiny 1, které jsou charakterizovány jejich lósRNA nebo Actinum mycetalis. Tento výčet slouží vysvětlení a v žádném případě není pro předložený vynález limitující.
Navíc zahrnuje předložený vynález také použití geneticky změněných organismů k výrobě doplňku zvířecího krmivá podle vynálezu obsahujícího volnou kyselinu D-pantothenovou a/nebo její solí. Takové geneticky změněné organismy se mohou příkladně izolovat chemickou mutagenezí a následnou selekcí vhodným screeningovým způsobem. Podle vynálezu jsou zahrnuty také tak zvané produkční kmeny, které jsou vhodné k výrobě produktu ve smyslu předloženého vynálezu a vykazují genetické změny z hlediska toku látkové výměny ve směru kyseliny D-pantothenové, přičemž jsou také zahrnuty ·· ····
• · : i · změny z hlediska vylučování kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí přes buněčnou membránu.Toho je možné dosáhnout příkladně změnami v klíčových pozicích relevantních cest biosyntézy při látkové výměně použitého organismu.
Možné je také použití transgeních organismů, které rezultují z přenosu homologních a/nebo heterologních sekvencí nukleotidů, které jsou nutné k syntéze požadovaného produktu nebo mohou být nápomocné.
Možná je přitom přeexprese a/nebo deregulace jednoho nebo několika genů jednotlivě a/nebo v kombinaci, lokalizovaných v genomu a/nebo na jeden vektor.
Transgení organismy takového druhu mohou s výhodou obsahovat dodatečné kopie a/nebo geneticky změněné geny vybrané ze skupiny panB, panC, panD, panE a/nebo jejich kombinací a/nebo dokonce organizační jednotky, jako je operon BCD.
Dále mohou být do organismů s výhodou manipulovány další cesty látkové výměny, jako příkladně cesta biosyntézy isoleucin-valin, jak se popisuje příkladně v EP 1 006 189,
EP 1 006 192, EP 1 006 193 nebo EP 1 001 027. Tím jsou ve zvýšené míře dány k dispozici výchozí sloučeniny pro biosyntézu kyseliny pantothenové s rozvětvenými řetězci. S výhodou se případně geny pro tuto cestu biosyntézy, to znamená ilvB, ilvN, ílvC a/nebo ílvD přeexpríaují.
Navíc jsou podle vynálezu do použitých organismů produkujících kyselinu pantothenovou zahrnuty genetické změny aspartát-a-dekarboxylázy (panD), příkladně přeexpresí a/nebo deregulací.
Termínem deregulace se podle vynálezu rozumí násle··♦·
-8dující : změna nebo modifikace nejméně jednoho genu, který kóduje pro enzym při biosyntetické cestě látkové výměny, takže aktivita enzymu v mikroorganismu je změněna nebo modifikována. Výhodné je, aby nejméně jeden gen, který kóduje pro enzym při biosyntetické cestě látkové výměny byl změněn takovým způsobem, aby se produkt genu tvořil intenzivněji nebo aby vykazoval zvýšenou aktivitu. Pojem deregulovaná cesta látkové výměny zahrnuje také biosyntetickou cestu látkové výměny, při které je více jak jeden gen, který kóduje pro více jak jeden enzym změněn nebo modifikován tak, aby byly změněny nebo modifikovány aktivity více jak jednoho enzymu.
Změny nebo modifikace mohou zahrnovat, avšak nejsou omezeny na :
odstranění endogeního promotoru nebo regulačních prvků; zavedení silných promotorů, indukovatelných promotorů nebo několika promotorů zároveň; odstranění regulačních sekvencí, takže se změní exprese genového produktu; změna chromosomální polohy genu; změna sekvence DNA v blízkosti genu nebo uvnitř genu jako je příkladně ribosomální místo vazby (RBS); zvýšení počtu kopií genu v genomu nebo různý počet kopií vnesením plasmidů; modifikace proteinů (příkladně regulačních proteinů, suppresorů, enhancem, trankriptionelních aktivátorů a podobně), které hrají roli při transkripci genu a/nebo při translaci na produkt genu. K tomu patří také všechny další možnosti k deregulaci exprese genů podle stavu techniky jako příkladně použití antisense-oleonukleotidů nebo blokace represorových proteinů.
Deregulace může také zahrnovat změny v kóduj ící oblasti genů, které příkladně vedou k posílení feedbackregulace v produktu genu nebo k větší nebo menší specifické ····
aktivitě produktu genu.
Navíc jsou podle vynálezu výhodné genově technické změny na enzymech, které ovlivňují úbytek výchozích látek pro kyselinu pantothenovou a/nebo přesun kyseliny pantothenové na koenzym A. Kódující geny pro takové enzymy jsou příkladně : alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA, coaX a další.
Tento výčet slouží vysvětlení a v žádném případě není limitující pro pro předložený vynález.
Dále jsou výhodné genově technické změny, které zajišťují celulární dostupnost kofaktorů (příkladně methylentetrahydrofolát, redox-ekvivalenťy a jiné) v množství optimálním pro produkci kyseliny pantothenové.
S výhodou je dostupný β-alanin již v buňkách ve zvýšené koncentraci oproti oproti odpovídajícím geneticky nezměněným organismům a nemusí se tak přidávat do kultivačního media jako prekursor, jak se požaduje příkladně podle EP-A 0 590 857. Výhodné jsou mikroorganismy, jejichž biosyntéza kyseliny pantothenové (pan)- a/nebo isoleucin-valin-(ilv)a/nebo asparát-a-dekarboxyláza jsou deregulované. Dále je výhodná dodatečná přeexprese ketopanthoátu-reduktázy (panE) v mikroorganismech.
Dále je podle vynálezu výhodné, jestliže případně coaA-gen, který je nutný pro syntézu koenzymu A, má sníženou aktivitu nebo (příkladně v druzích Bacillus) je zcela vyřazen. Bacillus totiž obsahuje vedle coaA další gen pro tuto enzymatickou funkci (= coaX). Také aktivita tohoto genu coaX nebo korespondujících enzymů se může změnit, s výhodou snížit, nebo dokonce deletovat, pokud coaA samotný vykazuje ještě dostatečnou, i když sníženou enzymatickou aktivi-10-
• · · · ·· ·· tu, to znamená, že enzymatická aktivita coaA není zcela potlačena. Vedle přeexprese různých genů je výhodná také genová manipulace oblasti promotorů těchto genů takovým způsobem, aby tato manipulace vedla k přeexpresi produktu genů.
V jedné variantě provedení předloženého vynálezu se použijí kmeny bakterií podle přílohy (PCT/US přihlášky 0025993), jako je příkladně Bacillus subtilis PA 824 a/nebo jeho deriváty. V jedné výhodné variantě provedení podle vynálezu se použije ke způsobu podle vynálezu mikroorganismus Bacilllus subtilis PA 668, který se popisuje v příloze (US-Serial-Nr. 60/262 995). Tyto kmeny Bacilllus subtilis PA 824 a PA 668 se vyrobí následovně :
Vychází se z kmene Bacillus subtilis 168 (kmen Marburg ATCC 6051), který vykazuje genotyp trpC2 (Trp-), ze kterého se transdukcí Trp+ markéru (z Bacillus subtilis divoký typ V 23) vyrobí kmen PY 79. Do kmenu PY 79 se klasickými metodami genových technologií (jak popisuje příkladně Harwood,
C.R. a Cutting, S.M. (vydavatel) Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Viley & Sons, Ltd., Chichester, Anglie) zavedou mutace c/eZťapanB a JeZtapanEl.
Výsledný kmen se transformuje genomickou DNA kmene Bacillus subtilis PA 221 (genotyp P2gpanBCD, trpC2 (Trp-)) genomickou DNA kmene Bacillus subtilis (genotyp
P7gpanEl). Výsledný kmen PA 327 má genotyp P2gpanBCD, P2gpanEl a je tryptofaně auxotrofní (Trp-). Se kmenem Bacillus subtilis PA 327 se vloží do 10 ml kultury s mediem SVY (25 g/1 Difco Veal Infusion Broth, 5 g/1 Difco Yeast Extract, 5 g/1 glutamátu sodného, 2,7 g/1 síranu amonného ve 740 ml vody, autoklávuje se, následně se přidá 200 ml 1 M fosforečnanu draselného, pH 7,0 a 60 ml 50 %-ního sterilního
-11·· ·· roztoku glukózy), ke kterému se přidá 5 g/1 β-alaninu a 5 g/1 α-ketoisovalerátu a dosáhne se titru kyseliny pantothenové až 3,0 g/1 (24 hodin).
Výroba kmene Bacillus subtilis PA 221 (genotyp P2óPan BCD, trpC2 (Trp-)) se popisuje v následujícím odstavci : klasickými metodami genových technik se s pomocí sekvenčních ionformací operonu panBCD E. coli (viz Merkel a spol., FEMS Microbiol.Lett., 143, 1996:247-252), přičemž se vychází z Bacillus subtilis GP 275 plasmidové knihovny se klonuje operon panBCD Bacillus. Ke klonování se použije kmen E. coli BM4062 (birts) a informace, že operon Bacillus leží v blízkosti genu birA. Operon panBCD se zavede do replikovatelného plasmidu E. coli. Ke zlepšení exprese operonu panBCD se použijí silné, konstitutivní promotory Bacillus subtilis fágy SP01 (P2g) a místo napojení ribosomu (= RBS) před panB-genem se nahradí artificiálním RBS. Před kazetu P2gpanBCD na plasmidu se liguje fragment DNA, který leží bezprostředně upstream nativního genu panB v Bacillus. Tento plasmid se transformuje v kmenu Bacillus subtilis RL-1 (klasickou mutagenezí získaný derivát Bacillus subtilis 168 (kmen Marburg ATCC 6051), genotyp trpC2 (Trp-) a homologovou rekombinaci se nahradí nativní operon panBCD operonem p2(< panBCD. Výsledný kmen se jmenuje PA 221 a má genotyp P2gpanBCD, trpC2 (Trp-). Se kmenem Bacillus subtilis PA 221 se v 10 ml kultury s mediem SVY, které se doplní 5 g/1 β-alaninu a 5 g/1 α-ketoisovalerátu se dosáhne titru kyseliny pantothenové až 0,92 g/1 (24 hodin).
Výroba kmene Bacillus subtilis PA 303 (genotyp P2^panEl) se popisuje v následujícím odstavci :
S pomocí genové sekvence E. coli panE se analogicky klonuje sekvence Bacillus panE. Ukazuje se, že v Bacillus subtilis ·· ·· • 4» • ··
-12• · · ·· · • · · · • · · • · · · · ·
existují dva homology genu panE E.coli, které se označují jako panEl a panE2. Deleční analýzou se ukazuje, že gen panEl vyvolává 90 % produkce kyseliny pantothenové, zatímco delece genu panE2 nemá žádný významný efekt na produkci kyseliny pantothenové. Také zde byl analogicky ke klonování operonu panBCD nahrazen promotor silněji konstitutivním promotorem P26 a místo napojení ribosomu před genem panEl se nahradí artificiálním místem vazby. Fragment P2gpanEl se klonuje do vektoru, který je vytvořen tak, aby fragment P2gpanEl se mohl integrovat do originální pozice panEl v genomu Bacillus subtilis. Po transformaci a homologické rekombinaci se výsledný kmen jmenuje PA 303 a má genotyp PžóPanEl. Se kmenem Bacillus subtilis PA 303 se v 10 ml kultury s mediem SVY, které se doplní 5 g/1 β-alaninu a 5 g/1 α-ketoisovalerátu se dosáhne titru kyseliny pantothenové až 1,66 g/1 (24 hodin).
Další konstrukce kmene se provádí transformací PA 327 plasmidem, který obsahuje operon P2gHvBNC a markerový gen pro spéctinomycin. Operon PggUvBNC integruje do pozice amyE, což bylo prokázáno pomocí PCR. Transformanty se označují jako PA 340 (genotyp PgóPanBCD, P2gpanEl, P2gHvBNC, specR, trpC2 (Trp).
Se kmenem Bacillus subtilis PA 340 se v 10 ml kultury s mediem SVY, které se doplní pouze 5 g/1 β-alaninu dosáhne titru kyseliny pantothenové až 3,6 g/1 (24 hodin), v 10 ml kultury s mediem SVY, které se doplní 5 g/1 β-alaninu a 5 g/1 α-ketoisovalerátu se dosáhne titru kyseliny pantothenové až 4,1 g/1 (24 hodin).
Dále byla uvedena do kmene PA 340 deregulovaná kazeta ilvD. K tomu se plasmid, který obsahuje ilvD gen za kontroly promotoru V 26 s artificiální RBS2 transformuje v PA • Μ »
-131 · ♦ 1 ·· ·· • ♦ · ·· » · • *· • · · • » -» • · · ·« • · • » ► * · , ·· ··
340. Přitom se gen P2gilvD integruje homologickou rekombinací do originální pozice ilvD. Výsledný kmen PA 374 má genotyp P2gpanBCD, P2gpanEl, P2gilvBNC, P2gilvD, specR a trpC2 (Trp-).
Se kmenem Bacillus subtilis PA 374 v 10 ml kultury s mediem SVY, které se doplní pouze 5 g/1 β-alaninu se dosáhne titru kyseliny pantothenové až 2,99 g/1 (24 hodin).
Aby bylo možné s kmenem PA 374 produkovat kyselinu pantothenovou bez dokrmování β-alaninu, byly do kmene PA 374 zavedeny dodatečné kopie genu panD kódující pro aspartát-a-dekarboxylázu. K tomu se transformuje chromosomální DNA kmene PA 401 na PA 374. Selekcí na tetracyklin se získá kmen PA 377. Výsledný kmen PA 377 má genotyp P2gpanBCD, P2gpanEl, P26ilvBNC, P2gilvD, specR, tetR a trpC2 (Trp-).
Se kmenem Bacillus subtilis PA 377 v 10 ml kultury s mediem SVY bez doplňování výchozích sloučenin se dosáhne titru kyseliny pantothenové až 1,31 g/1 (24 hodin).
Výroba kmene Bacillus subtilis PA 401 (genotyp P2gpanD) se popisuje v následujícím odstavci :
Bacillus subtilis panD se klonuje panBCD operonu do vektoru, který nese tetracyklinový markerový gen. Před panD se klonuje promotor P2g a výše popsaná artificiální RBS. Restrikóním trávením se vyrobí fragment, který obsahuje tetracyklinový markerový gen a a gen P^gpanD. Tento fragment se religuje a transformuje do výše popsaného kmenu PA 221. Přitom fragment integruje do genomu kmene PA 221. Výsledný kmen PA 401 má genotyp P2gPanBCD, P2gpanD, tetR a trpC2 (Trp-).
Se kmenem Bacillus subtilis PA 401 se v 10 ml kultury s mediem SVY, které se doplní 5 g/1 α-ketoisovalerátu dosáhne
-14·· • · * φ • · 9* • · · · >
• · · · *· ·· • * ·*♦φ » 9 • « « · » » · »» 99 titru kyseliny pantothenové až 0,3 g/1 (24 hodin). V 10 ml kultury s mediem SVY, které se doplní 5 g/1 kyseliny D-pantoinové a 10 g/1 L-aspartátu se dosáhne titru kyseliny pantothenové až 2,2 g/1 (24 hodin).
S výchozím kmenem PA 377 se transformací s chromosomální DNA kmene PY 79 generuje tryptofan-prototrofní kmen. Tento kmen PA 824 má genotyp P2gpanBCD, P2gpanEl,
P2gilvBNC, P2gilvD, specR, tetR a trp+.
Se kmenem Bacillus subtilis PA 824 v 10 ml kultury s mediem SVY bez doplňování výchozích sloučenin se dosáhne titru kyseliny pantothenové až 4,9 g/1 (48 hodin) (srovnání PA 377 : až 3,6 g/1 za 48 hodin.
Výroba PA 668 se popisuje v následujícím odstavci : Gen Bacillus panB se klonuje z divokého typu operonu panBCD a insertuje do vektoru, který vedle genu rezistentního na chloramfenikol obsahuje také sekvence B.subtilis vpr locus.
Silně konstitutivní promotor ?2g se zavede před 5 -konec genu panB. Fragment, který obsahuje gen PggpanB, markerový gen pro chloramfenikovou rezistenci a rovněž sekvence Bacillus subtilis vpr se získá restrikčním trávením. Isolovaný fragment se religuje a transformuje jim kmen PA 824. Získaný kmen se označuje PA 668. Genotyp PA 668 je p2gpanECD, P25PSJYEI» ?2ί> N-vBNC, P2^ilvD, P-^panB, specR, tetR, CmR a Trp+.
Izolují se dvě kolonie PA 668 a označí se PA 668-2A a druhá PA 668-24.
Se kmenem Bacillus subtilis PA 668-2A se v 10 ml kultury s mediem SVY bez doplňování výchozích sloučenin dosáhne titru kyseliny pantothenové až 1,5 g/1 ve 48 hodinách. V 10 ml kultury doplněné 10 g/1 aspartátu se dosáhne titru kyseliny
pantothenové až 5 g/1.
Se kmenem Bácillus subtilis PA 668-24 se v 10 ml kultury s mediem SVY bez doplňování výchozích sloučenin dosáhne titru kyseliny pantothenové až 1,8 g/1 ve 48 hodinách. V 10 ml kultury doplněné 10 g/1 L-aspartátu se dosáhne titru kyseliny pantothenové až 4,9 g/1.
Přesná konstrukce kmenů se popisuje v přílohách PCT/US-přihlášky 0025993 a v US-Serial-Nr. 60/262,995.
S výše popsaným kmenem PA 377 se při fermentaci limitované glukózou v mediu SVY (25 g/1 Difco Veal Infusion Broth, 5 g/1 Difco Yeast Extract, 5 g/1 tryptofanu, 5 g/1 Na-glutamátu, 2 g/1 (NH4)2S04, 10 g/1 KH2P04, 20 g/1 K2HP04, 0,1 g/1 CaCl2, 1 g/1 MgS04, 1 g/1 natriumcitrátu, 0,01 g/1 FeS04 x 7 H20 a 1 ral/1 roztoku stopových solí o následujícím složení : 0,15 g Na2Mo04 x 2 H20,
2.5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 x 6 H20, 0,25 g CuSO4 x 5 H20,
1.6 g MnCl2 x 4 H20, 0,3 g ZnS04 x 7 H20, doplněno vodou na 1 1) se v měřítku 10 1 při kontinuálním dokrmování roztoku glukózy dosáhne za 36 hodin (48 hodin) koncentrací kyseliny pantothenové ve fermentační břeěce 18 až 19 g/1 (22 až 25 g/1) ·
Při fermentaci PA 824 limitované glukózou, tryptofan-prototrofní derivát PA. 377 v mediu s kvasnicovým extraktem (10 g/1 Difco Yeast Extract, 5 g/1 Na-glutamátu, g/1 (NH4)2S04, 10 g/1 KH2P04, 20 g/1 K2HPO4, 0,1 g/1 CaCl2, 1 g/1 MgS04, 1 g/1 natriumcitrátu, 0,01 g/1 FeSO4 x 7 H20 a 1 ml/1 výše popsaného roztoku stopových solí) se v měřítku 10 1 při kontinuálním dokrmování roztoku glukózy dosáhne za 36 hodin, 48 hodin a 72 hodin následných koncentrací kyseliny pantothenové ve fermentační břeěce : 20 g/1,
• Λ • · ·· ·· g/1 a 36 g/1.
Další optimalizací media se kmenem PA 824 se při fermentaci limitované glukózou dosáhne v mediu sestávajícím z 10 g/1 Difco Yeast Extract, 10 g/1 NZ-aminu A (Quest International GmbH, Erftstadt), 10 g/1 Na-glutamátu, 4 g/1 (NH4)2S04, 10 g/1 KH2P04, 20 g/1 K2HP04, 0,1 g/1 CaCl2, 1 g/1 MgSO4, 1 g/1 natriumcitrátu, 0,01 g/1 FeS04 x 7 H20 a 1 ml/1 výše popsaného roztoku stopových solí se v měřítku 10 1 při kontinuálním dokrmování roztoku glukózy dosáhne za 36 hodin (48 hodin) koncentrace kyseliny pantothenové ve fermanační břečce 37 g/1 (48 g/1).
Je možné další zvyšování koncentrace kyseliny pantothenové ve fermentační břečce optimalizací media, prodloužením doby fermentace, zlepšováním procesu a kmene, a rovněž kombinací jednotlivých kroků. Tak je možné dosáhnout výše popsaných koncentrací kyseliny pantothenové také fermentací kmenů, které jsou deriváty výše popsaného PA 824. Deriváty se mohou vyrábět klasickým vývojem kmene a rovněž dalšími genově technickými manipulacemi. Vývojem medií, kmenů a způsobu fermentace se může titr kyseliny pantothenové ve fermentační břečce zvýšit i nad 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 a > 90 g/1.
Podstatnou výhodou způsobu podle vynálezu je.
fermentace provádí v kultivačním mediu, které kromě nejméně jednoho zdroje uhlíku a dusíku jako výchozích sloučenin neobsahuje žádné další předstupně (prekurzhory). To znamená, že biosyntéza kyseliny D-pantothenové je nezávislá na dokrmování dalších výchozích látek. Jako takové výchozí látky se podle vynálezu rozumí příkladně β-alanin nebo L-aspartát a/nebo L-valin a/nebo α-ketoisovalerát a/nebo jejich • · • · · ·
kombinace .
V jedné výhodné variantě způsobu podle vynálezu se provádí fermentace organismů produkujících kyselinu D-pantothenovou v kultivačním mediu, které obsahuje jeden zdroj uhlíku a jeden zdroj dusíku, ke kterému se ale nepřidává žádný volný β-alanin a/nebo soli β-alaninu a to ani v průběhu fermentace. To znamená, že k výrobě kyseliny D-pantothenové v rozmezí nejméně 10 g/1 kultivačního media, s výhodou nejméně 20 g/1, obzvláště výhodně nejméně 40 g/1, zcela obzvláště výhodně nejméně 60 g/1 a obzvláště nejméně 70 g/1 není podle vynálezu nutné žádné dokrmování volného β-alaninu a/nebo solí β-alaninu. Nezávislost na dokrmování výchozích látek představuje obzvláště významnou ekonomickou výhodu způsobu podle vynálezu oproti známým způsobům, neboř řada výchozích látek je velmi drahá.
Přídavek β-alaninu a/nebo solí β-alaninu však není podle vynálezu vyloučen, takže se může následně výtěžek kyseliny D-pantothenové přídavkem β-alaninu a/nebo solí β-alaninu ještě dále zlepšit. Pokud se příkladně vychází z toho, že potřebné výchozí látky kyseliny pantothenové jsou k dispozici v dostatečném množství a pouze aktivita genu panD limituje další nárůst produkce kyseliny D-pantothenové, pak se může příkladně výtěžek kyseliny D-pantothenové zvýšit o dalších 50 % přídavkem volného β-alaninu a/nebo solí β-alaninu.
V jedné výhodné variantě předloženého vynálezu se může ke kultivačnímu mediu přidat až 20 g/1 volného β-alaninu a/nebo solí β-alaninu k dodatečnému zvýšení výtěžku kyseliny pantothenové o více jak 50 %. Výhodný je přídavek asi 15 g/1 volného β-alaninu a/nebo solí β-alaninu ke kultivač• · · · · ·
-18nímu mediu.
Příklady vhodných zdrojů uhlíku podle vynálezu k použití v kultivačním mediu pro fermentaci výše uvedených organismů jsou cukry, jako hydrolyzáty škrobu (mono-, di-, oligosacharidy), s výhodou glukóza nebo sacharoza a rovněž řepná melasa nebo třtinová melasa, proteiny, hydrolyzáty proteinů, sojová moučka, kukuřičná voda, tuky, volné mastné kyseliny, opětovně použité buňky z již provedených fermentaci nebo jejich hydrolyzáty a rovněž kvasnicový extrakt. Tento výčet není pro předložený vynález limituj ící.
Dále se předložený vynález vyznačuje s výhodou tím, že celkový obsah cukru až do konce fermentace je zredukován na minimum, protože v opačném případě je pozdější sušení a/nebo formulace fermentačního roztoku ztížena slepováním. Toho lze podle vynálezu dosáhout tím, že se fermentace vede ještě nějaký čas po spotřebování zdroje uhlíku (při kultivaci v šaržovém způsobu) nebo poté, co se přeruší přívod uhlíku (při vedení procesu šaržovým provozem s dávkováním nebo opakovaným šaržovým provozem s dávkováním) a/nebo se regujluje takovým způsobem, že koncentrace zdroje uhlíku je téměř nulová (při vedení procesu šaržovým provozem s dávkováním, opakovaným šaržovým provozem s dávkováním nebo kontinuálním způsobem).
To se podle vynálezu provádí tak, že po přerušení dávkování zdroje uhlíku (příkladně roztoku cukru) se fermentace vede dále až k dosaženi koncentrace rozpuštěného kyslíku (p02) na nejméně 80 %, s výhodou 90 % a obzvláště výhodně 95 % hodnoty nasycení ve fermentačním roztoku.
• * • ft
ft • · · • · • ft • ft
Příklady vhodných zdrojů dusíku je amoniak, síran amonný, močovina, proteiny, hydrolyzáty proteinů nebo kvasnicový extrakt. Ani tento výčet není pro předložený vynález limituj ící.
Dále obsahuje fermentační medium minerální soli a/nebo stopové prvky, jako jsou aminokyseliny a vitaminy. Přesné složení vhodných fermentačních medií jsou opakovaně známé a odborníkům dostupné.
Po inokulaci fermentačního media vhodným organismem produkujícím kyselinu D-pantothenovou (s buněčnou hustotou známou odborníkům) případně po přidání prostředku proti pěnění dochází ke kultivaci organismu. Případně nutná regulace pH hodnoty media se může provádět různými anorganickými nebo organickými louhy nebo kyselinami, jako je příkladně NaOH, KOH, amoniak, kyselina fosforečná, kyselina sírová, kyselina solná, kyselina mravenčí, kyselina jantarová, kyselina citrónová a podobně.
Na základě pufrovacích systémů použitých během fermentace, které mohou být, jak bylo výše popsáno příkladně NaOH, KOH, amoniak, kyselina fosforečná, kyselina sírová, kyselina solná, kyselina mravenčí, kyselina jantarová, kyselina citrónová a podobně, je vytvořená kyselina pantothenová ve £ eraientačním roztoku podle použitého pufr ovací ho systému ve formě dané sol.i (daných solí) . Protože přitom podle vynálezu nejsou výhodné především soli kyseliny D-pantothenové ve formě jejich jednomocných kationtů případně je výhodná kyselina D-pantothenová ve formě jejích vápenatých nebo horečnatých solí, zpracuje se fermentační roztok podle vynálezu procesem elektro-membránové separace.
• ♦
-20» · · 1 • · ··
Předložený vynález přitom zahrnuje všechny dostupné druhy elektromembránových separačních procesů, jako je membránová elektrolýza nebo elektrodialýza. Provedení vhodného výběru patří ke znalostem odborníka.
Podle vynálezu výhodné je použití elektrodialýzy. Přitom se použije jak elektrodialýza s výhradně monopolárnními membránami, tak i elektrodialýza s mono- a/nebo bipolárními membránami. Obzvláště výhodná je elektrodialýza s výhradně monopolárnními membránami, obzvláště elektrodialýza s monopolárnními membránami selektivními pro jednomocné ionty, tak zvanými monoselektivními membránami.
V zásadě se k provedení způsobu podle vynálezu mohou použít libovolné, obvykle v rámci elektrodialyzových procesů používané membrány. V případě membrán použitých v rámci elektrodialyzových procesů podle vynálezu se s výhodou použijí běžně komerčně dodávané iontoměničové membrány.
Jako použitelné iontoměničové membrány je možné příkladně jmenovat :
Neosepta AM1, AM2 , AM3 , AMX, AMH, AFN firmy Tokuyama Corp. a AMV firmy Asahi Glass.
Jako kationtoměničové membrány je možné příkladně jmenovat :
Neosepta CM1, CM2, CMX, CMH, CMB, Asahi Glass CMV a rovněž Naflon 435 nebo 350 firmy Du Pont de Nemours.
Jako monoselektivní kationtoměničové membrány lze příkladně jmenovat membránu Neosepta CMS.
Jako monoselektivní aniontontoměničové membrány • * ► « • »
-21·· ·· ► · · « ♦ 99 » · ♦ « • · « ♦· ·<
přicházejí v úvahu membrány Neosepta ACS firmy Tokuyama Corp., nebo Selmion ASV firmy Asahi Glass.
Jako elektrody se mohou použít nerezavějící oceli, nikl, drahé kovy, nebo jiné vhodné materiály, které jsou odborníkům známé.
Použitím monopolární elektrodialýzy se podle vynálezu mohou jak anionty tak i kationty z roztoku obsahujícího pantothenát převést migrací aniontontoměničovou případně kationtoměničovou membránou v elektrickém poli převést do druhého roztoku (roztok koncentrátu, KONZ) a tak je odstranit z roztoku obsahujícího kyselinu pantothenovou (roztok diluátu, BIL). S výhodou se podle vynálezu odstraní z roztoku obsahuj ícího kyselinu pantothenovou nízkomolekulární ionty. Jako nízkomolekulární ionty se podle vynálezu rozumí takové ionty, které jsou do fermentační břečky vnášeny složením kultivačního media a/nebo pufrovacího systému, v konečném produktu jsou však nežádoucí. Příkladně se přitom jedná o následující ionty : amoniový, draselný, sodný, ionty železa, chloridové ionty, fosfátové nebo síranové ionty.
V jedné další variantě provedení předloženého vynálezu je možné provést výměnu jednomocných kationtů, jako jsou sodné nebo amoniové ionty, za vícemocné kationty, jako je vápenatý kation. K tomu se pro jednosytné ionty použijí selektivní kationtoměničové membrány. Tak se příkladně do okruhu I předloží roztok CaCl2 a do druhého okruhu II, odděleného od okruhu I kationtoměničovou membránou, se předloží roztok kyseliny pantothenové obsahující jednomocné kationty. Do třetí komory III se potom převedou kationtoměničovou membránou selektivní pro jednomocné ionty a umístě9 9 9999
-22nou mezi komorou II a komorou III, s výhodou jednomocné kationty. Zároveň se do komory I z komory III převedou aniontoměničovou membránou umístěnou mezi komorou I a komorou II anionty, jako chloridové ionty. Vápenaté ionty se z komory I převedou do komory II kationtoměničovou membránou. Tímto způsobem se získá přímo kalcium-D-pantothenát. Při výskytu solí slabé kyseliny, jako příkladně kyseliny pantothenové, je možné takovým uspořádáním získat také volnou kyselinu D-pantothenovou, jestliže se do komory I předloží místo CaCl2 vodný roztok HCI.
Podle vynálezu je zahrnuto také použití vápenatých a/nebo hořečnatých solí ve formě anorganických nebo organických aniontů. S výhodou se podle vynálezu použijí chlorid vápenatý a/nebo hořečnatý, dusičnan, hydroxid, mravenčan, acetát, propionát, glycinát nebo laktát.
V jedné formě provedení předloženého vynálezu se mohou při použití bipolární elektrodialýzy převést výhodným způsobem kationty při současné přípravě protonů - disociací vody v bipolární membráně - z roztoku obsahujícího pantothenát kationtoměničovou membránou do druhého roztoku a tak je odstranit z roztoku obsahujícího kyselinu pantothenovou. Ve druhém roztoku tvoří hydroxidové ionty vytvořené disociací vody na bipolární membráně odpovídající báze převedených kationtů.
V další formě provedení předloženého vynálezu se mohou při použití bipolární elektrodialýzy výhodným způsobem převést anionty při současném uvolnění hydroxidových iontů disociací vody v bipolární membráně - z roztoku obsahujícího pantothenát přes aniontoměničovou membránu do druhého roztoku a tak je odstranit z roztoku obsahujícího kyselinu * · • · · ·
pantothenovou. Ve druhém roztoku se tvoří kyseliny odpovídající převedeným aniontům s pomocí protonů uvolněných disociací vody na bipolární membráně.
Podle vynálezu je zahrnuta také další varianta provedení při které se při použití bipolární elektrodialýzy na jedné straně výhodným způsobem převedou anionty při současném uvolnění hydroxidových iontů - disociací vody v bipolární membráně - z roztoku obsahujícího pantothenát přes aniontoměničovou membránu do druhého roztoku a tím se odstraní z roztoku obsahujícího kyselinu pantothenovou a na druhé straně se převedou kationty při současném uvolnění protonů - disociací vody v bipolární membráně - z roztoku obsahujícího pantothenát přes kationtoměničovou membránu do třetího roztoku a tím se odstraní z roztoku obsahujícího kyselinu pantothenovou. Ve druhém roztoku se tvoří kyseliny odpovídající převedeným aniontům s pomocí protonů uvolněných disociací vody na bipolární membráně a ve třetím roztoku se tvoří báze odpovídající převedeným kationtům s pomocí hydroxidových iontů uvolněných disociací vody na bipolární membráně .
Podle vynálezu je při předloženém způsobu dále výhodné nastavení pH hodnoty roztoku obsahuj ícího pantothenát na isoelektrický bod kyseliny pantothenové s pomocí kyselin nebo bází. Na základě toho je možné dále zvýšit výtěžek volné kyseliny D-pantothenové případně dále snížit ztráty.
Monopolární elektrodialýza je obzvláště výhodnou variantou, protože je ve srovnání s bipolární elektrodialýzou cenově velmi výhodná.
Bipolární elektrodialýza se nabízí obzvláště tehdy, • · · ·
-24kdy se nemají přidávat kyseliny k nastavení pH hodnoty nebo jestliže se mají vznikající kyseliny nebo louhy dále používat .
Všechny varianty elektrodialýzy podle vynálezu nabízejí výhodu v tom, že z regenerace iontoměničových pryskyřic nevznikají žádné odpadní vody.
Použitím elektroseparačních způsobů podle vynálezu se z roztoku obsahujícího D-pantothenát odstraní výhodně nežádooucí nízkomolekulární ionty (cizí ionty) jako jako jsou amoniové, draselné, sodné, železnaté, chloridové, fosforečnanové nebo síranové ionty. To znamená, že vzniká s výhodou volná kyselina D-pantothenová nebo požadované soli, jako je kalcium- a/nebo magnesium-D-pantothenát. Podle vynálezu se obsah jednomocných kationtů, s výhodou amoniových, draselných a/nebo sodných iontů sníží na koncentraci =s 1 g/kg roztoku.
Také obsah nežádoucích aniontů, jako jsou příkladně chloridové, síranové nebo fosforečnanové ionty se může podstatně snížit volbou iontoměničové membrány, s výhodou použitím aniontoměničových membrán.
Takto získaný roztok obsahující volnou kyselinu D-pantothenovou ss podle vynálezu upraví přídavkem vápenaté a/nebo hořečnaté báze na hodnotu pH 3 až 10. Výhodná je pH hodnota 5 až 10. Výhodné je nastavení pH hodnoty na 5 až 9, obzvláště výhodně na 6 až 9 a zcela obzvláště výhodně na hodnotu 6 až 8. Tímto způsobem se získá roztok obsahující kalcium- a/nebo magnesium-pantothenát. S výhodou se do roztoku k neutralizaci přidá hydroxid vápenatý, uhličitan vápenatý, oxid vápenatý, hydroxid hořečnatý a/nebo bázický
····
·· uhličitan horečnatý ve formě pevné látky a/nebo vodné suspenze .
Přitom je podle vynálezu výhodné, jestliže se neutralizace roztoku obsahujícího volnou kyselinu D-pantothenovou provádí s pomocí vápenaté a/nebo hořečnaté báze ve formě vodné suspenze. Použitím vodné disperze probíhá neutralizace rychleji a bez výraznějšího kolísání pH než jak je tomu při použití odpovídající pevné látky.
Způsob podle vynálezu se vyznačuje tím, že se k roztoku v kroku c) přidá vodná suspenze obsahující 2 až 55 % hmotnostních, s výhodou 10 až 50 % hmotnostních a obzvláště výhodně 20 až 40 % hmotnostních hydroxidu vápenatého.
Podle vynálezu je dále zahrnut způsob, při kterém se k roztoku v kroku c) přidá vodná suspenze obsahující 2 až 65 % hmotnostních, s výhodou 10 až 50 % hmotnostních a obzvláště výhodně 20 až 40 % hmotnostních uhličitanu vápenatého. V jedné další variantě provedení předloženého vynálezu se k roztoku v kroku c) způsobu podle vynálezu přidá vodná suspenze obsahující 2 až 60 % hmotnostních, s výhodou 10 až 50 % hmotnostních a obzvláště výhodně 20 až 40 % hmotnostních hydroxidu hořečnatého. Podle vynálezu je zahrnut také způsob, při kterém se k roztoku v kroku c) přidá vodná suspenze ob:
ie:
% hmotnostních, s výhodou 10 až % hmotnostních bázického uhličitanu hořečnatého.
Sušení a/nebo formulace fermentačního roztoku se provádí známými způsoby, jako příkladně rozstřikovacím sušením, rozstřikovací granulací, sušením ve vířivé vrstvě, granulací ve vířivé vrstvě, sušením v bubnu nebo sušením spin-flash (Ulimann s Encyclopedia of Industrial Chemistry,
• 9 9
• ·
6. vydání, 1999, elektronická forma, kapitola Drying of Solid Materials). Vstupní teplota plynu při konvekčním sušení je v rozmezí 100 až 280 °C, s výhodou 120 až 210 °C. Výstupní teplota plynu je v rozmezí 50 až 180 °C, s výhodou 60 až 150 °C. K nastavení požadované velikosti částic a tím spojenými vlastnostmi produktu se mohou jemné čátice oddělit a uvést zpět. Dále se mohou velké částice senilit v mlýně a následně rovněž uvést zpět.
Podle vynálezu je výhodné při výše popsaném způsobu redukce nákladných zpracovatelských kroků, obzvláště nepoužívání organických rozpouštědel při současné přípravě požadovaného produktu s dobrou biologickou honítou. Dále se podle vynálezu podstatně snižuje množství vznikajících odpadních vod. Výsledkem jsou tak další úspory na nákladných čisticích a zneškodňovacích zařízeních. Tak se vyznačuje způsob podle vynálezu výhodně tak, že je jednodušší, méně náchylný k poruchám, méně časové náročný, výrazně ekonomičtější a tím hospodárnější než obvyklé způsoby.
To však nevylučuje, aby se způsob podle vynálezu neobměňoval. Výše uvedené procesní korky a) až d) podle vynálezu se mohou doplnit jedním nebo několika následujícími procesními kroky, které jsou samy o sobě odborníkům známé. Zde jsou podle vynálezu zahrnuty všechny možné kombinace dodatečných (fakultativních) procesních kroků se (základními) procesními kroky a) až d).
Tak se mohou výsledné roztoky z procesních kroků a) až c) zbavit zárodků zahřátím (sterilizací) nebo jinými metodami, jako je příkladně pasterizace nebo sterilní filtrace.
V dalších variantách způsobu podle vynálezu se může
před sušením a/nebo formulací roztoku provést nejméně jeden a/nebo kombinace následujících kroků, zahrnující lysí a/nebo usmrcení biohmoty a/nebo oddělení biohmoty od fermentačního roztoku a/nebo přídavek dalších přísad a/nebo koncentraci fermentačního roztoku, s výhodou odtažením vody.
Předmětem předloženého vynálezu je tak také způsob, kdy se lyse a/nebo usmrcení biohmoty provádí ještě ve fermentačním roztoku nebo teprve po oddělení biohmoty od fermentačního roztoku. To se může provádět příkladně tepelným ošetřením, s výhodou při teplotě 80 až 200 °C a/nebo okyselením, s výhodou kyselinou sírovou nebo kyselinou solnou a/nebo enzymaticky, s výhodou pomocí lysozymu.
V další formě provedení předloženého vynálezu se mohou buňky fermentačních mikroorganismů z roztoků v krocích
a), b) nebo c) způsobu podle vynálezu oddělit filtrací, separací (příkladně odstředěním) a/nebo dekantováním. Možné je také uvádět roztoky z kroků a), b) nebo c) bez oddělení obsažených mikroorganismů přímo přes jednu nebo několik iontoselektivních membrán v elektrickém poli.
Výsledný roztok ze zpracování membránovou elektrolýzou nebo elektrodialýzou se může návazně na neutralizaci koncentrovat na vhodné odparce, příkladně odparce se stékajícím filmem, odparce v tenké vrstvě nebo rotační odparce. Takové odparky vyrábí příkladně firmy GIG /4800 Attnang Puchheim, Rakousko), GEA Canzler (52303 Duřen, Německo) , Diessel (31103 Hildesheim, Německo) a Pitton (35274 Kirchhain, Německo).
Ke zlepšení barevných vlastností konečného produktu se může provést krok dodatečné filtrace, při kterém se k rozto'»· ··«»
-28kům získaným během procesu přidá něco aktivního uhlí a tato suspenze se následně filtruje. Nebo se roztoky získané během fermentace mohou vést přes malé lože s aktivním uhlím. K tomu požadované množství aktivního uhlí je v rozmezí několika málo % hmotnostních roztoku a je na znalostech a uvážení odborníka.
Tyto filtace se mohou usnadnit, jestliže se k danému roztoku před filtrací přidá obvyklý komerční flokulační pomocný prostředek (příkladně Sedipur CF 902 nebo Sedipur CL 930 firmy BASF AG, Ludwigshafen).
V jedné výhodné formě provedení předloženého vynálezu se výsledný materiál fermentace (fermentační břečka) sterilizuje zahřátím a potom se zbaví buněčné hmoty odstředěním, filtrací nebo dekantací. Po přídavku 50 až 1000 mg/kg, s výhodou 100 až 200 mg/kg komerčně dodávaného flokulačního pomocného prostředku vztaženo na výtěžek fermentace se filtruje přes krátké lože aktivního uhlí a písku, aby se získal roztok s vysokým obsahem kyseliny D-pantothenové zbavený biohmoty. Následně se tento vyčištěný roztok vede v elektrickém poli přes jednu nebo několik iontoselektivních membrán.
Následné sušení tohoto roztoku se může provádět příkladně rozstfikovacím sušením. To es může provádět v couproudu, protiproudu nebo ve smíšeném proudění. K rozprášení se mohou použít všechny známé rozprašovače, obzvláště odstředivé rozprašovače (rozprašovací disky), jednodruhové trysky nebo dvoudruhové trysky. Výhodné teplotní podmínky jsou 150 až 250 °C na vstupu do věže a 70 až 130 °C na výstupu z věže. Může se ale také sušit při vyšší nebo při nižší teplotě. K dosažení velmi nízké zbytkové vlhkosti se ·· ·· ·· i · • ·« • ··· ·
• · • · ·· • · · · ·· ale může dodatečně provést další fáze sušení ve vířivém loži .
Rozstřikovací sušení se může provádět v sušárnách FSD nebo SBD (FSD : Fluidized Spray Dryer, SBD : Spray Bed Dryer), které vyrábí firmy Niro (Kodaň, Dánsko) a APV-Anhydro (Kodaň, Dánsko), které představují kombinaci rozstřikovací sušárny a vířivého lože.
Při rozstřikovacím sušení se může přidat pomocný prostředek ke zlepšení tekutosti. Tím se sníží tvorba povlaků na stěnách sušárny a zlepší se i chování při tečení, zejména u jemnozrnných prášků. Jako prostředky ke zlepšeni tekutosti přicházejí v úvahu obzvláště silikáty, stearáty, fosfáty a kukuřičný škrob.
V zásadě se ale může sušení provádět také v nastřikované vířivé vrstvě, přičemž tato se může provozovat kontinuálně nebo diskontinuálně. Nastřikování roztoku se může provádět jak zeshora (Topspray), tak i zespoda (Bottomspray) nebo také ze strany (Sidespray).
Předmětem předloženého vynálezu je dále přípravek pro použití jako přísada do zvířecího krmivá a/nebo doplněk zvířecího krmivá, vyrobitelný tak, že
a) se použije nejméně jeden organismus produkující kyselinu D-pantothenovou, jehož biosyntéza kyseliny pantothenové-(pan) a/nebo isoleucin/valin-(ilv) je deregulovaná a v kultivačním mediu se fermentací tvoří nejméně 2 g/1 solí kyseliny D-pantothenové, přičemž se do kultivačního media uvádí 0 až 20 g/1, s výhodou 0 g/1 volného β-alaninu a/nebo
·»· * ··
-30• · • · · · · • · * » · • fr ·· solí β-alaninu
b) fermentační roztok obsahující D-pantothenát se uvádí vytvořením elektrického pole přes jednu nebo několik iontoselektivních membrán, přičemž se z roztoku obsahujícího D-pantothenát odstraní nízkomolekulární ionty,
c) volná kyselina D-pantothenová obsažená v roztoku se přídavkem vápenaté a/nebo hořečnaté báze upraví na hodnotu pH 3 až 10, přičemž se získá roztok, který obsahuje kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát a
d) roztok obsahující kalciumpantothenát a/nebo magnesium pant o thenát se podrobí sušení a/nebo tvorbě formulace,
Při jedné variantě předloženého vynálezu se vyznačuje přípravek tím, že se v kroku c) nebo d) získá nebo předloží suspenze, která obsahuje kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát.
Podle vynálezu se přípravek dále vyznačuje tím, že obsahuje soli kysleiny D-pantothenové v koncentraci nejméně 1 až 100 % hmotnostních, s výhodou nejméně 20 až 100 % hmotnostních a obzvláště výhodně nejméně 50 % hmotnostních. Předmětem předloženého vynálezu je přípravek, který obsahuje soli kyseliny D-pantothenové ve formě dvojmocných kationtů, s výhodou kalcium-D-pantothenát a/nebo magnesium-D-pantothenát. Podle vynálezu je výhodný přípravek, který se vyznačuje tím, že obsah solí kyseliny D-pantothenové ve formě jednomocných kationtů je 1 g/kg.
« ·
-31* · « · • · ···♦ · · • · ···· · · • · · · ·· · · · « • · · ···· · · ····· · β ·· ·
Podle vynálezu se výše popsaným způsobem získá kalcium-D-pantothenát a/nebo magnesium-D-pantothenát, který vyhoví požadavkům na přísady do krmiv. Těmito požadavky je příkladně relativně vysoký obsah D-pantothenátu a dobrá snášenlivost cílovým organismem a rovněž biologická bonita ve smyslu vitaminový účinek produktu podle vynálezu.
Předložený vynález bude blíže vysvětlen následujícími příklady, které však pro vynález nejsou limitující.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Do laboratorního fermentoru s míchadlem a plynovacím zařízením o obsahu 14 1 se předloží vodné fermentační medium o následujícím složení :
| Násada | Koncentrace (g/D |
| Kvasnicový extrakt | 10 |
| Natriumglutamát | 5 |
| Síran amonný | 8 |
| Přípravek proti pěněni | 1 ml /1 |
Po sterilizaci byly navíc přidány následující sterilní komponenty media:
• »
• · · · ·· «»
| Násada | Koncentrace (g/1) |
| kh2po4 | 10 |
| k2hpo4 | 20 |
| Glukóza | 2,5 |
| Chlorid vápenatý | 0,1 |
| Chlorid hořečnatý | 1 |
| Natriumcitrát | 0,1 |
| FeSO4 x 7 H20 | 0,1 |
| Roztok stopových solí | 1 ml/1 |
Roztok stopových solí má následující složení :
0,15 g Na2Mo04 x 2 H20, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 x 6 H20, 0,25 g CuS04 x 5 H20, 1,6 g MnCl2 x 4 H20, 0,3 g ZnS04 x 7 H20, doplněno vodou na 1 1. Přídavek roztoku stopových solí se provádí po sterilizaci. Počáteční objem kapaliny činí 8,4 1. Výše uvedené obsahy jsou vztaženy na tuto hodnotu.
K tomuto roztoku se přidá 160 ml očkovací kultury (OD = 10 v mediu SVY (25 g Difco Veal Infusion Broth, 5 g Difco Yeast Extract, 5 g glutamátu sodného, 2,7 g síranu amonného ve 740 ml vody, sterilizuje se, následně se přidá 200 ml sterilního 1 M K2HPO4 (pH 7,0) a 60 ml 50 %-ního sterilního roztoku glukózy (konečný objem 11)) Bacillus subtilis PA 824 a za intenzivního míchání se fermentuje při teplotě 43 °C při plynování 12 1/min. Tento kmen se popisuje v příloze přihlášky PCT/US 0025993.
V průběhu 52 hodin se nadávkuje 6 1 sterilního vodného
* · · · · ·
-33roztoku. Složení je následující :
| Násada | Koncentrace (g/D |
| Glukóza | 500 |
| Chlorid vápenatý | 0,6 |
| Roztok stopových solí | 7 ml/1 |
Fermentace se provádí s limitovanou glukózou. V průběhu fermentace se dávkováním 25 %-ního roztoku amoniaku případně 20 %-ní kyseliny fosforečné udržuje hodnota pH na 7,2. Amoniak zároveň slouží jako zdroj dusíku pro fermentaci. Počet otáček míchadla se reguluje, přičemž obsah rozpuštěného kyslíku se udržuje na hodnotě 30 % hodnoty při nasycení. Tvorba pěny se řídí občasným nadávkováním prostředku proti pěnění. Po přerušení dávkováni zdroje uhlíku se fermentace vede dále tak dlouho, dokud obsah rozpuštěného kyslíku (p02) nedosáhne hodnoty 95 % při nasycení. Potom se fermentace ukončí a organismy se tepelně usmrtí.
K tomu se fermentační roztok sterilizuje po dobu 60 minut. Usmrcení bylo prokázáno na deskách. Následně se odstředěním provede oddělení buněk. Po oddělení buněk činí koncentrace D-pantothenátu po 52 hodinách 24,7 g/1.
Analogickým způsobem je také možné vyrobit fermentační břecky, které vykazují titr kyseliny pantothenové bez dokrmování β-alaninu více jak 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,
60, 65, 70, 75, 80, 85 a > 90 g/1.
Tento produkt fermentace, který se výše popsaným způsobem sterilizuje zahřátím a v podstatě se zbaví biohmoty odstředěním se smíchá s dodatečnou kyselinou D-pantotheno• * ► 4
-34vou a pomocí kyseliny sírové se upraví hodnota pH na přibližně 2. Takto získaný roztok se filtruje přes malé lože písek/aktivní uhlí. Obsah kysleiny D-pantothenové v tomto roztoku činí 67,7 g/1.
900 g tohoto filtrátu se zpracuje elektrodialyticky následovně :
do elektrodialyzační buňky se (vybavené aniontoměničovými a kationtoměničovými membránami (typ Neosepta AMX Sb případně CMX Sb firmy Tokuyama Corp.) s efektivní plochou buňky 1,85 dm^ a s pěti komorami se nasadí filtrát při počáteční proudové hustotě 29 mA/cm . Hustota proudu se v průběhu pokusu po dosažení předem daného hraničního napětí 20 V kontinuálně snižuje. Teplota je mezi 33 a 40 °C. Jako násada koncentrátu se předloží 0,5 %-ní (w/w) roztok NaCl. Tento koncentrát (KONZ) se v průběhu pokusu obohacuje cizími ionty odstraněnými z filtrátu (diluátu, DIL) (příkaldně amoniové, chloridové, železnaté, draselné sodné nebo fosforečnanové ionty). Do elektrolytického okruhu se k promytí elektrod předloží 5 %-ní roztok (w/w) síranu sodného . V průběhu pokusu se při rozdílných hodnotách ionické vodivosti odebírají vzorky roztoku diluátu z komory obsahující diluát a analyzují se. Analýze je uvedena v následující tabulce a vyplývá z ní, že s pokračující dobou pokusu se z diluátu odstraňují uvedené ionty a vodivost diluátu odpovídajícím způsobem klesá. Malé, jedncmocné ionty, jako jsou příkladně chloridové ionty se odstraňují rychleji než objemné, vícemocné ionty, jako jsou příkladně fosforečnanové ionty.
Výsledky analyzy diluátu jsou uvedeny v následující tabulce :
35• * • · · · · ·
PTS = kyselíixct pantothenová
-3699 99 • · · * ·· · ·
Hodnoty pH všech vzorků diluátu leží mezi 2 až 3. Ve výtěžku 771 g diluátu je obsaženo 76 g/1 volné kyseliny D-pantothenové.
Tím je doloženo, že fermentativně získaný roztok kyseliny D-pantothenové lze úspěšně elektrolyticky zbavit rušivých kationtů. Ze získané odsolené kyseliny
D-pantothenové se nechá vyrobit nehygroskopický prášek kalcium-D-pantothenátu, jak se popisuje v příkladu 2.
Příklad 2
Do laboratorního fermentoru s míchadlem a plynovacím zařízením o obsahu 14 1 se předloží vodné fermentační medium o následujícím složení :
| Násada | Koncentrace (g/i) |
| Kvasnicový extrakt | 10 |
| Natriumglutamát | 5 |
| Síran amonný | 8 |
| kh2po4 | 8,4 |
| k2hpo4 | 15 |
Po sterilizaci byly navíc přidány následující sterilní komponenty media:
| Násada | Koncentrace (g/D |
| Glukóza | 2,5 |
| Chlorid vápenatý | 0,1 |
| Chlorid hořečnatý | 1 |
| Natriumcitrát | 1 |
| FeSO4 x 7 H20 | 0,01 |
| Roztok stopových solí | 1 ml |
Roztok stopových solí má následující složení :
0,15 g Na2Mo04 x 2 H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCl2 x 6 H2O, 0,25 g CuS04 x 5 H20, 1,6 g MnCl2 x 4 H20, 0,3 g ZnS04 x 7 H20, doplněno vodou na 1 1. Přídavek roztoku stopových solí se provádí po sterilizaci. Počáteční objem kapaliny činí 5,5 1. Výše uvedené obsahy jsou vztaženy na tuto hodnotu.
K tomuto roztoku se přidá 55 ml očkovací kultury (OD = 10 v mediu SVY (25 g Difco Veal Infusion Broth, g Difco Yeast Extract, 5 g glutamátu sodného, 2,7 g síranu amonného se rozpustí v 740 ml vody, sterilizuje se, následně se přidá 200 ml sterilního 1 M K2HP04 (pH 7,0) a 60 ml 50 %-ního sterilního roztoku glukózy (konečný objem 1 1)), Bacillus subtilis PA 824 a za intenzivního míchání se fermentuje při teplotě 43 °C při plynování 12 1/min. Tento kmen se popisuje v příloze přihlášky PCT/US 0025993.
V průběhu 48 hodin se nadávkuje 6 1 sterilního vodného roztoku. Složení je následující :
| Násada | Koncentrace (g/1) |
| Glukóza | 550 |
| Chlorid vápenatý | 0,6 |
| Roztok stopových solí | 6 ml/1 |
Fermentace se provádí s limitovanou glukózou. V průhu fermentace se dávkováním 25 %-ního roztoku amoniaku případně 20 %-ní kyseliny fosforečné udržuje hodnota pH na 7,2. Amoniak zároveň slouží jako zdroj dusíku pro fermentaci. Počet otáček míchadla se reguluje, přičemž obsah rozpuštěného kyslíku se udržuje na hodnotě 30 % hodnoty při nasycení. Tvorba pěny se řídí občasným nadávkováním prostředku proti pěnění. Po přerušení dávkováni zdroje uhlíku se fermentace vede dále tak dlouho, dokud obsah rozpuštěného kyslíku (pC>2) nedosáhne hodnoty 95 % při nasycení. Potom se fermentace ukončí a organismy se tepelně usmrtí.
K tomu se fermentační roztok sterilizuje po dobu 30 minut. Usmrcení bylo prokázáno na deskách. Následně se odstředěním provede oddělení buněk. Po oddělení buněk činí koncentrace D-pantothenátu po 48 hodinách 24,1 g/1.
Analogickým způsobem je také možné vyrobit fermentační břečky, které vykazují titr kyseliny pantothenové bez dokrmování β-alaninu více jak 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,
60, 65, 70, 75, 80, 85 a > 90 g/1.
2817 ml produktu z fermentace se smísí s 1183 ml roztoku kyseliny pantothenové o koncentraci 178,9 g/1 a neutralizuje se 25 %-ním roztokem hydroxidu amonného (pH 6,5). Následně se filtruje přes písek/aktivní uhlí. Obsah kyseliny D-pantothenové ve filtrátu činí 67 g/1, převážně ve
-39• · • * ·· ·· 4··· • · · 4 4 4 · • 4 44 4 4 4
44 4»· · · formě amonné soli.
Přibližně 720 g tohoto roztoku se zpracuje elektrodialýzou podle příkladu 1 :
550 g produktu diluátu (o hustotě 1,017 g/ml) se s pomocí 3,5 g 40 %-ní suspenze hydroxidu vápenatého upraví na hodnotu pH 7,5. Získá se vodný roztok kalcium-D-pantothenátu (551,03 g s obsahem kalcium-D-pantothenátu 40,9 g/1).
Vodný roztok kalcium-D-pantothenátu se vysuší v laboratorní rozstřikovací sušárně firmy Niro, typ Minor. Teplota na vstupu do věže činí asi 200 °C, teplota na výstupu z věže je 90 °C. Rozprášení se provádí pomocí dvoudruhové trysky při tlaku 0,2 MPa. Jako pudrovací prostředek se použije Sipemat 22F. Získá se přitom práškovitý produkt o následující specifikaci (údaje v % hmotnostních) :
| Obsah vody : | 2,3 % |
| Kalcium-D-pantothenát : | : 46,1 % |
| Amonium : | 0,60 % |
| Draslík : | 0,47 % |
| Sodík : | 1,1 % |
Příklad 3
V laboratorním fermentoru s míchadlem a plynovacím zařízením o obsahu 200 1 se smíchá 800 g 50 %-ního kvasnicového extraktu, 438 g glutamátu sodného, 3200 g sojové moučky, 640 g síranu amonného, 800 g KH2PO4, 1600 g K2HPO4 a 50 ml prostředku proti pěnění TegoKS se 70 1 vody a sterilizuje po dobu 30 minut při teplotě 121 °C.
• ·
-40• · * » * · 99 • · 9 9 t • 9 9 9
9 9 9
Následně se přidá roztok 1 a roztok 2.
Roztok 1 se připraví následovně :
1670 g glukózy x H20, 10,2 g CaCl2 x 2 H20 a 170,7 g MgCl2 x 6 H20 se rozpustí v 9 1 vody a sterilizuje se po dobu 30 minut.
Roztok 2 se připraví následovně :
800 ml roztoku citrátu železnatého (200 g/1 citrátu sodného, 2 g/1 FeS04 x H20, sterilizováno) se smíchá s 80 ml roztoku stopových solí ( 0,15 g Na2Mo04 x 2 H20, 2,5 g H^BO^, 0,7 g CoCl2 x 6 H20, 0,25 g CuSO4 x 5 H2O, 1,6 g MnCl2 x 4 H20,
0,3 g ZnS04 x 7 H20, doplněno vodou na 1 1, sterilizováno).
K tomuto roztoku se přidají 2 1 očkovací kultury (OD = 10 v mediu SVY (SVY medium : 25 g Difco Veal Infusion
Broth, 5 g Difco Yeast Extract, 5 g glutamátu sodného,
2,7 g síranu amonného se rozpustí v 740 ml vody, sterilizuje se, následně se přidá 200 ml sterilního 1 M K2HPO4 (pH 7,0) a 60 ml 50 %-ního sterilního roztoku glukózy (konečný objem
1)), Bacillus subtilis PA 668 a za intenzivního míchání se 2 fermentuje při teplotě 43 °C při plynování 3 m/min. Tento kmen se popisuje v příloze přihlášky US-Serial-Nr.
60/262995.
V průběhu 48 hodin se nadávkuje asi 10 1 sterilního vodného roztoku glukózy. Roztok se připraví následovně :
kg glukózy x H20 se smíchá s 55 kg vody a sterilizuje se po dobu 30 minut. Nálsedně se přidá 300 ml roztoku stopových solí (složení viz výše) a rovněž 3 1 roztoku citrátu železnatého (složení viz výše). Následně se přidá 1 1 sterilně filtrovaného roztoku 90 g/1 CaCl2 x 2 H20 a 2 1 sterilně filtrovaného orztoku 375 g/1 glutamátu sodného.
• · ···· • · · * · ·· · • · ♦ · · 9 ♦ * · · · · · · «·
Fermentace se provádí s limitovanou glukózou. V průhu fermentace se dávkováním 25 %-ního roztoku amoniaku případně 20 %-ní kyseliny fosforečné udržuje hodnota pH na 7,2. Amoniak zároveň slouží jako zdroj dusíku pro fermentaci. Počet otáček míchadla se reguluje, přičemž obsah rozpuštěného kyslíku se udržuje na hodnotě 30 % hodnoty při nasycení. Tvorba pěny se řídí občasným nadávkováním prostředku proti pěnění. Po přerušení dávkováni zdroje uhlíku se fermentace vede dále tak dlouho, dokud obsah rozpuštěného kyslíku (pC^) nedosáhne hodnoty 95 % při nasycení. Potom se fermentace ukončí. Oddělení buněk se provede separací na talířovém separátoru. Zbývající buňky se usmrtí termicky sterilizací. Koncentrace D-pantothenátu při přerušení po 48 hodinách činí 13,7 g/1. Po separaci a sterilizaci je koncentrace D-pantothenátu 10,7 g/1.
Analogickým způsobem je také možné vyrobit fermentační břečky, které vykazují titr kyseliny pantothenové bez dokrmování β-alaninu více jak 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50,
55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 a více jak 90 g/1.
Se 3000 g takto předupraveného fermentačního roztoku se postupuje následovně :
dvě třetiny násady se smíchají při teplotě asi 10 °C s množstvím roztoku CaCl2 (40 %) odpovídajícím ekvivalentní koncentraci vícemocných aniontů, třetina násady se vysráží Ca(0H)2 (pevný) v ekvivalentním množství. Roztoky se uloží přes noc do ledničky a potom se s pomocí tlakové filtrační nuče (Seitz Tiefenfilter 700) oddělí od vysrážené úsady. Roztoky se potom smísí a přídavkem dalších 10 g Ca(0H)2 při teplotě asi 10 °C se upraví bazické prostředí (pH = 8,7) a dosráží se. Sraženina se rovněž odfiltruje.
-42• · • ft ft ftft • ft • · • * · · • ftft · • · ftft • ftft · • ftft · ft* ftft
1800 g roztoku se potom při teplotě 35 °C zpracuje v troj okruhovém elektrodialyzačním zařízení. Přitom se fermentační břečka vede přes produktovou komoru ohraničenou dvěma kationtoměničovými membránami. Na katodové straně odděluje monoselektivní kationtoměničová membrána (Tokuyama Soda, CMS) produkt z okruhu koncentrátu, na anodové straně se v produktové komoře s obvyklou kationtoměničovou membránou (Tokuyama Soda, CMX) odděluje z okruhu CaC^· Okruh koncentrátu a CaCl2 se odděluje aniontoměničovou membránou (Tokuyama Soda, AMX). Do koncentrátu se předloží 750 g 0,5 %-ního roztoku chloridu sodného, do okruhu CaC^ 900 g 3,05 %-ního roztoku % CaC^· V promývacím okruhu elektrod cirkuluje 0,1 molární roztok síranu sodného. Pokus se provádí galvanostaticky při 30 mA/cm v zařízení sestávajícím z 5 výše popsaných základních jednotek s celkovou plochou o membrány 500 cm šaržovým způsobem. Jako kriterium pro ukončení byl zvolena minimální vodivost 4 mS/cm v okruhu CaCl2- Výsledky analýzy kationtů v produktovém okruhu a v okruhu koncentrátu jsou shrnuty v následující tabulce.
| PTS (g/1) | Ca2+ | Na+ | K+ | nh4 + | |
| 5329/01/82 produkt t=0 | 9,27 | 0,24 % | 0,15 % | 0,65 % | 0,24 % |
| 5329/01/82 produkt ΐ=0,83 h | 9,01 | 0,43 % | 0,07 % | 0,25 % | 0,06 % |
| 5329/01/82 produkt t=0 h | 0,0 | 0,0 % | 0,2 % | 0,0 % | 0,0 % |
| 5329/01/82 produkt ΐ=0,83 | 0,015 | 0,02 % | 0,47 % | 0,71 % | 0,29 % |
Z toho se vypočítá obohacení 51 % pro sodík, 66 % pro • · · ·
-43amonium εν 61 % pro draslík. Střední proudový výtěžek činí 82 %. Ztráta kyseliny pantothenové v obou hraničních okruzích činí vždy 0,08 % nasazeného množství látky. pH hodnota produktového okruhu je během pokusu mezi 7 až 7,5, v okruhu koncentrátu a v okruhu CaCl2 asi pH = 6. Celkový pokles napětí stoupl v průběhu pokusu ve shodě s poklesající vodivostí v okruhu CaCl2 z asi 11 na 16 V.
Roztok takto zpracovaný elektrodialýzou se následně úspěšně vysuší rozstřikováním na konečný produkt. Tím se dokládá, že při odpovídající přípravě se může použít troj okruhová elektrodialýza s jednou monoselektivní kationtoměničovou membránou k výměně jednomocných iontů za dvojmocné kationty, aby se zlepšila sušitelnost konečného produktu rozstřikováním .
Claims (26)
- «· «·PATENTOVÉ NÁROKY1.solí ,Způsob výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích vyznačující se tím, žea) se použije nejméně jeden organismus produkující kyselinu D-pantothenovou, jehož biosyntéza kyseliny pantothenové-(pan) a/nebo isoleucin/valin-(ilv) je deregulovaná a v kultivačním mediu se fermentací tvoří nejméně 2 g/1 solí kyseliny D-pantothenové, přičemž se do kultivačního media uvádí 0 až 20 g/1 volného β-alaninu a/nebo solí β-alaninub) fermentační roztok obsahující D-pantothenát se uvádí vytvořením elektrického pole přes jednu nebo několik iontoselektivních membrán, přičemž se z roztoku obsahujícího D-pantothenát odstraní nízkomolekulární ionty,c) volná kyselina D-pantothenová obsažená v roztoku se přídavkem vápenaté a/nebo hořečnaté báze upraví na hodnotu pH 5 až 10, přičemž se získá roztok, který obsahuje kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát ad) roztok obsahující kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát se podrobí sušení a/nebo tvorbě formulace.
- 2.v y zZpůsob podle nároku 1, načující se tím, že se ke kultivačnímu ·· ► « ··-45• · β · ·· »t • · 4 • ·· mediu nepřidává žádný volný β-alanin a/nebo soli β-alaninu.
- 3. Způsob podle některého z nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se jako organismy produkující kyselinu D-pantothenovou použijí bakterie, kvasinky nebo houby.
- 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že sej ako mikroorganismus použijí bakterie rodu Bacillaceae.
- 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se použije bakterie rodu Bacillus a s výhodou druhu B. subtilis, B. licheniformis nebo B. amyloliquefaciens.
- 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že se v kroku a) tvoří množství kyseliny pantothenové a/nebo jejích solí nejméně 10 g/1 kultivačního media, s výhodou nejméně 20 g/1 kultivačního media, obzvláště výhodně nejméně 40 g/1 kultivačního media a zcela obzvláště výhodně nejméně 60 g/1 kultivačního media.
- 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, v yzaačující se ti ni, že se v kroku c) upraví pH roztoku na hodnotu 5 až 10.
- 8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že se v kroku c) upraví pH roztoku na hodnotu 5 až 9, s výhodou 6 až 9 a obzvláště výhodně na 6 až 8.
- 9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8, • · ···· ·· «· • · 4 · • · ·· • · · · • · · · • · • · • · • · ·· vyznačující se tím, že se v kroku b) použije monopolární a/nebo bipolární iontoměničová membrána.
- 10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se v kroku b) použije monopolární iontoměničová membrána.
- 11. Způsob podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že se v kroku b) použije monoselektivní iontoměničová membrána.
- 12. Způsob podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že se pH hodnota fermentačního roztoku obsahujícího kysleinu D-pantothenovou upraví před zpracováním v kroku b) na isoelektrickou pH hodnotu kyseliny pantothenové.
- 13. Způsob podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že se v kroku b) nastaví pro monopolární iontoměničovoou membránu hustota proudu2 7 v z1 až 100 mA/cm , s výhodou 10 až 80 mA/cm , a obzvláště výhodně 20 až 40 mA/cm^.
- 14. Způsob podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že se v kroku b) nastaví pro bipolární iontoměničovoou membránu hustota proudu 1 až 150 mA/cm2', s výhodou 30 až 100 mA/cm2', a obzvláště výhodně 70 až 90 mA/cm .
- 15. Způsob podle některého z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že se v kroku b) obsah jednomocných kationtů, s výhodou amoniových, draselných a/nebo sodných iontů sníží na koncentraci 1 g/kg roztoku.• ····
- 16. Způsob podle některého z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že se do roztoku v kroku c) přidá k neutralizaci hydroxid vápenatý, uhličitan vápenatý, oxid vápenatý, hydroxid hořečnatý a/nebo bázický uhličitan hořečnatý ve formě pevné látky a/nebo vodné suspenze .
- 17. Způsob podle některého z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že se do roztoku v kroku c) přidá vodná suspenze obsahující 2 až 55 % hmotnostních, s výhodou 10 až 50 % hmotnostních a obzvláště výhodně 20 až 40 % hmotnostních hydroxidu vápenatého.
- 18. Způsob podle některého z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že se do roztoku v kroku c) přidá vodná suspenze obsahující 2 až 65 % hmotnostních, s výhodou 10 až 50 % hmotnostních a obzvláště výhodně 20 až 40 % hmotnostních uhličitanu vápenatého.
- 19. Způsob podle některého z nároků 1 až 18, vyznačující se tím, že se do roztoku v kroku c) přidá vodná suspenze obsahující 2 až 60 % hmotnostních, s výhodou 10 až 50 % hmotnostních a obzvláště výhodně 20 až 40 % hmotnostních hydroxidu hořečnatého.
- 20. Způsob podle některého z nároků 1 až 19, vyznačující se tím, že se do roztoku v kroku c) přidá vodná suspenze obsahující 2 až 25 % hmotnostních, s výhodou 10 až 20 % hmotnostních bázického uhličitanu hořečnatého.
- 21. Způsob podle některého z nároků 1 až 20, vyznačující se tím, že se v kroku c) nebo d) získá nebo předloží suspenze obsahující kalciumpantothe-48*· • · • · · • · ·9 9 9 • 9 « « ♦ ♦ ·· nát a/nebo magnesiumpantothenát.
- 22. Přípravek pro použití jako přísada do zvířecího krmivá a/nebo doplněk zvířecího krmivá, vyznačující se tím, že je vyrobitelný tak, žea) se použije nejméně jeden organismus produkující kyselinu D-pantothenovou, jehož biosyntéza kyseliny pantothenové-(pan) a/nebo isoleucin/valin-(ilv) je deregulovaná a v kultivačním mediu se fermentací tvoří nejméně 2 g/1 solí kyseliny D-pantothenové, přičemž se do kultivačního media uvádí 0 až20 g/1, s výhodou 0 g/1 volného β-alaninu a/nebo solí β-alaninub) fermentační roztok obsahující D-pantothenát se uvádí vytvořením elektrického pole přes jednu nebo několik iontoselektivních membrán, přičemž se z roztoku obsahujícího D-pantothenát odstraní nízkomolekulární ionty,c) volná kyselina D-pantothenová obsažená v roztoku se přídavkem vápenaté a/nebo hořečnaté báze upraví na hodnotu pH 3 až 10, přičemž se získá roztok, který obsahuje kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát ad) roztok obsahující kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát se podrobí sušení a/nebo tvorbě formulace.
- 23.Přípravek podle nároku 22,-49• fcfc ··«. · »· « · • · « » * · · « « · ·· • · · · • ·* · fc· 4« • fc fcfcfcfc • · · fc · » • · fc • · · fc ·· «· vyznačující se tím, že se v kroku c) nebo d) získá nebo předloží suspenze obsahující kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát.
- 24. Přípravek podle některého z nároků 22 nebo 23, vyznačující se tím, že obsahuje soli kyseliny D-pantothenové ve formě dvojmocných kationtů, s výhodou kalciumpantothenát a/nebo magnesiumpantothenát.
- 25. Přípravek podle některého z nároků 22 nebo 24, vyznačující se tím, že obsahuje soli kyseliny D-pantothenové o koncentraci nejméně 1 až 100 % hmotnostních, s výhodou nejméně 20 až 100 % hmotnostních a obzvláště výhodně nejméně 50 % hmotnostních.
- 26. Přípravek podle některého z nároků 22 až 25, vyznačující se tím, že obsah solí kyseliny D-pantothenové ve formě jednomocných kationtů je 1 g/kg.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10108223A DE10108223A1 (de) | 2001-02-21 | 2001-02-21 | Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20032223A3 true CZ20032223A3 (cs) | 2003-11-12 |
Family
ID=7674921
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20032223A CZ20032223A3 (cs) | 2001-02-21 | 2002-02-20 | Způsob výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí jako přísady do zvířecích krmiv |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7824891B2 (cs) |
| EP (1) | EP1362118B1 (cs) |
| JP (1) | JP2004531236A (cs) |
| KR (1) | KR20030075204A (cs) |
| CN (1) | CN1294273C (cs) |
| AT (1) | ATE342372T1 (cs) |
| AU (1) | AU2002250978B2 (cs) |
| BR (1) | BR0207474A (cs) |
| CA (1) | CA2438949A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ20032223A3 (cs) |
| DE (2) | DE10108223A1 (cs) |
| EE (1) | EE200300406A (cs) |
| ES (1) | ES2274967T3 (cs) |
| HU (1) | HUP0303304A3 (cs) |
| IL (1) | IL157496A0 (cs) |
| IN (1) | IN2003CH01315A (cs) |
| MX (1) | MX240870B (cs) |
| NO (1) | NO20033707L (cs) |
| PL (1) | PL363989A1 (cs) |
| RU (1) | RU2292397C2 (cs) |
| SK (1) | SK10452003A3 (cs) |
| UA (1) | UA77669C2 (cs) |
| WO (1) | WO2002066666A2 (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10108225A1 (de) | 2001-02-21 | 2002-10-10 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln |
| DE10344200A1 (de) * | 2003-09-22 | 2005-05-04 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement |
| DE202017007249U1 (de) * | 2016-03-07 | 2020-04-23 | Glycom A/S | Abtrennung von Oligosacchariden aus der Fermentationsbrühe |
| WO2019058377A1 (en) * | 2017-09-19 | 2019-03-28 | Evogene Ltd. | BACTERIAL GENES AND ISOLATES FOR CONFINING INSECT RESISTANCE |
| CN111621541A (zh) * | 2019-02-27 | 2020-09-04 | 上海艾美晶生物科技有限公司 | 使用电渗析技术拆分光学异构体的方法 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB562267A (en) | 1941-08-08 | 1944-06-26 | Hoffmann La Roche | Process for the manufacture of a crystallised, non-hygroscopic calcium salt of d-pantothenic acid |
| EP0493060A3 (en) * | 1990-12-25 | 1993-04-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production method of d-pantothenic acid and plasmids and microorganisms thereof |
| JP3710497B2 (ja) * | 1992-09-25 | 2005-10-26 | ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト | Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法 |
| PT822989E (pt) * | 1995-04-21 | 2001-07-31 | Basf Ag | Processo para a producao de d-pantotenato de calcio |
| SK284235B6 (en) | 1997-10-04 | 2004-11-03 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in the said method |
| AT407050B (de) | 1997-12-29 | 2000-11-27 | Chemie Linz Gmbh | Verfahren zur herstellung von l-asparaginsäure |
| US6110342A (en) * | 1998-07-21 | 2000-08-29 | Archer Daniels Midland Company | Process for production of amino acid hydrochloride and caustic via electrodialysis water splitting |
| DE19855313A1 (de) | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen |
| DK1050219T3 (da) | 1999-05-05 | 2003-03-17 | Degussa | Foderstofadditiver indeholdende D-pantothensyre og/eller salte deraf og fremgangsmåder til fremstilling deraf |
| AU7708700A (en) | 1999-09-21 | 2001-04-24 | Basf Aktiengesellschaft | Methods and microorganisms for production of panto-compounds |
| US8232081B2 (en) * | 1999-09-21 | 2012-07-31 | Basf Se | Methods and microorganisms for production of panto-compounds |
| FR2799754A1 (fr) * | 1999-10-18 | 2001-04-20 | Roquette Freres | Procede de separation et de purification d'acide lactique a partir d'un milieu de fermentation |
| DE10021515A1 (de) * | 2000-05-03 | 2001-11-08 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von Erdalkalisalzen der D-Pantothensäure |
| CA2422817A1 (en) | 2000-09-20 | 2003-03-19 | Basf Aktiengesellschaft | Animal feed supplement containing d-pantothenic acid and/or its salts, improved method for the production thereof, and its use |
| PL373006A1 (en) | 2001-01-19 | 2005-08-08 | Basf Aktiengesellschaft | Processes for enhanced production of pantothenate |
| HU227432B1 (hu) | 2001-01-19 | 2011-06-28 | Basf Ag | Mikroorganizmusok és eljárások pantotenát fokozott termelésére |
-
2001
- 2001-02-21 DE DE10108223A patent/DE10108223A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-02-20 AU AU2002250978A patent/AU2002250978B2/en not_active Ceased
- 2002-02-20 IL IL15749602A patent/IL157496A0/xx unknown
- 2002-02-20 CA CA002438949A patent/CA2438949A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-20 EP EP02719874A patent/EP1362118B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-20 HU HU0303304A patent/HUP0303304A3/hu unknown
- 2002-02-20 WO PCT/EP2002/001766 patent/WO2002066666A2/de active IP Right Grant
- 2002-02-20 KR KR20037010981A patent/KR20030075204A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-02-20 US US10/468,610 patent/US7824891B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-20 CN CNB028053303A patent/CN1294273C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-20 SK SK1045-2003A patent/SK10452003A3/sk not_active Application Discontinuation
- 2002-02-20 BR BR0207474-5A patent/BR0207474A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-02-20 ES ES02719874T patent/ES2274967T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-20 UA UA2003098597A patent/UA77669C2/uk unknown
- 2002-02-20 EE EEP200300406A patent/EE200300406A/xx unknown
- 2002-02-20 DE DE50208413T patent/DE50208413D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-20 PL PL02363989A patent/PL363989A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-02-20 RU RU2003128534/13A patent/RU2292397C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-02-20 CZ CZ20032223A patent/CZ20032223A3/cs unknown
- 2002-02-20 AT AT02719874T patent/ATE342372T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-02-20 JP JP2002566370A patent/JP2004531236A/ja active Pending
- 2002-02-20 MX MXPA03007383 patent/MX240870B/es active IP Right Grant
-
2003
- 2003-08-20 NO NO20033707A patent/NO20033707L/no not_active Application Discontinuation
- 2003-08-21 IN IN1315CH2003 patent/IN2003CH01315A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1492935A (zh) | 2004-04-28 |
| NO20033707D0 (no) | 2003-08-20 |
| DE10108223A1 (de) | 2002-10-10 |
| JP2004531236A (ja) | 2004-10-14 |
| RU2292397C2 (ru) | 2007-01-27 |
| CA2438949A1 (en) | 2002-08-29 |
| IN2003CH01315A (en) | 2005-11-25 |
| MXPA03007383A (es) | 2004-03-16 |
| US7824891B2 (en) | 2010-11-02 |
| NO20033707L (no) | 2003-10-20 |
| ATE342372T1 (de) | 2006-11-15 |
| EP1362118A2 (de) | 2003-11-19 |
| HUP0303304A2 (hu) | 2004-01-28 |
| HUP0303304A3 (en) | 2007-09-28 |
| IL157496A0 (en) | 2004-03-28 |
| CN1294273C (zh) | 2007-01-10 |
| US20040072306A1 (en) | 2004-04-15 |
| UA77669C2 (en) | 2007-01-15 |
| RU2003128534A (ru) | 2005-04-10 |
| DE50208413D1 (de) | 2006-11-23 |
| WO2002066666A2 (de) | 2002-08-29 |
| EP1362118B1 (de) | 2006-10-11 |
| ES2274967T3 (es) | 2007-06-01 |
| KR20030075204A (ko) | 2003-09-22 |
| BR0207474A (pt) | 2004-03-02 |
| MX240870B (es) | 2006-10-09 |
| PL363989A1 (en) | 2004-11-29 |
| AU2002250978B2 (en) | 2007-03-01 |
| SK10452003A3 (sk) | 2004-02-03 |
| WO2002066666A3 (de) | 2003-07-17 |
| EE200300406A (et) | 2003-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20032223A3 (cs) | Způsob výroby kyseliny D-pantothenové a/nebo jejích solí jako přísady do zvířecích krmiv | |
| US7611872B2 (en) | Method for the production of D-pantothenic acid and/or salts thereof via purification by nanofiltration as adjunct for animal feedstuffs | |
| US20040050335A1 (en) | Animal feed supplement containing d-pantothenic acid and/or its salts, improved method for the production thereof, and its use | |
| US7781192B2 (en) | Method for producing D-pantothenic acid and/or a salt thereof via purification by cation exchange as additive for animal food | |
| US7727748B2 (en) | Method for producing D-pantothenic acid and/or salts thereof via purification by anion exchange as an additive for animal feed | |
| JP2004529632A (ja) | パントテン酸塩の改良された製造方法 |