SK10452003A3 - Príprava kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí ako prísad do krmív - Google Patents
Príprava kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí ako prísad do krmív Download PDFInfo
- Publication number
- SK10452003A3 SK10452003A3 SK1045-2003A SK10452003A SK10452003A3 SK 10452003 A3 SK10452003 A3 SK 10452003A3 SK 10452003 A SK10452003 A SK 10452003A SK 10452003 A3 SK10452003 A3 SK 10452003A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- solution
- pantothenic acid
- pantothenate
- calcium
- weight
- Prior art date
Links
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 145
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims abstract description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title abstract description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 title abstract description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 title abstract 2
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 135
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 81
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 66
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 65
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 claims description 61
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 claims description 61
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 claims description 53
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 53
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 38
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 claims description 27
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 24
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 22
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 21
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 17
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 16
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 15
- ONSCBWDZUUNMMK-UBKPKTQASA-L magnesium;3-[[(2r)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound [Mg+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O ONSCBWDZUUNMMK-UBKPKTQASA-L 0.000 claims description 14
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 11
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 10
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 claims description 9
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 9
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 9
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 claims description 7
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000005684 electric field Effects 0.000 claims description 7
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 7
- GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical class OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 claims description 6
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 claims description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 6
- 239000003014 ion exchange membrane Substances 0.000 claims description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 claims description 4
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 claims description 4
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 claims description 2
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 2
- BRPQOXSCLDDYGP-UHFFFAOYSA-N calcium oxide Chemical compound [O-2].[Ca+2] BRPQOXSCLDDYGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000292 calcium oxide Substances 0.000 claims description 2
- ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N calcium oxide Inorganic materials [Ca]=O ODINCKMPIJJUCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 115
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 31
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 30
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 21
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 21
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 19
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- -1 alkaline earth metal salts Chemical class 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 14
- 239000002585 base Substances 0.000 description 13
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 13
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 13
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 13
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 11
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 11
- ZLHZLMOSPGACSZ-NSHDSACASA-N (6s)-2-nitro-6-[[4-(trifluoromethoxy)phenyl]methoxy]-6,7-dihydro-5h-imidazo[2,1-b][1,3]oxazine Chemical compound O([C@H]1CN2C=C(N=C2OC1)[N+](=O)[O-])CC1=CC=C(OC(F)(F)F)C=C1 ZLHZLMOSPGACSZ-NSHDSACASA-N 0.000 description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 9
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 101150076071 panD gene Proteins 0.000 description 9
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 9
- 101150079396 trpC2 gene Proteins 0.000 description 9
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 8
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 8
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 description 7
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101150051152 coaX gene Proteins 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 101150081585 panB gene Proteins 0.000 description 6
- 101150028586 panE gene Proteins 0.000 description 6
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 6
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 5
- 101100242684 Mesorhizobium japonicum (strain LMG 29417 / CECT 9101 / MAFF 303099) panD1 gene Proteins 0.000 description 5
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 101150048956 coaA gene Proteins 0.000 description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 5
- 101150043028 ilvD gene Proteins 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 5
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 101150109763 coaW gene Proteins 0.000 description 4
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 4
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 101150105723 ilvD1 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 4
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 3
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 3
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- HNZZAEBYPPNVOF-DHYYHALDSA-N (2s)-2-amino-3-methylbutanoic acid;(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O HNZZAEBYPPNVOF-DHYYHALDSA-N 0.000 description 2
- SERHXTVXHNVDKA-BYPYZUCNSA-N (R)-pantolactone Chemical compound CC1(C)COC(=O)[C@@H]1O SERHXTVXHNVDKA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 2
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000001574 stearyl tartrate Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 2
- OTOIIPJYVQJATP-BYPYZUCNSA-N (R)-pantoic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(O)=O OTOIIPJYVQJATP-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010070495 2-dehydropantoate 2-reductase Proteins 0.000 description 1
- QYNUQALWYRSVHF-ABLWVSNPSA-N 5,10-methylenetetrahydrofolic acid Chemical compound C1N2C=3C(=O)NC(N)=NC=3NCC2CN1C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QYNUQALWYRSVHF-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- 241000004176 Alphacoronavirus Species 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M Aminoacetate Chemical compound NCC([O-])=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 108010005694 Aspartate 4-decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 1
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 1
- 241000193747 Bacillus firmus Species 0.000 description 1
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 description 1
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 1
- 108700040634 Bacillus subtilis Vpr Proteins 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000149420 Bothrometopus brevis Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 1
- 241000819038 Chichester Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 239000001692 EU approved anti-caking agent Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 101100493587 Escherichia coli (strain K12) avtA gene Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 101100028493 Haloferax volcanii (strain ATCC 29605 / DSM 3757 / JCM 8879 / NBRC 14742 / NCIMB 2012 / VKM B-1768 / DS2) pan2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000557 Nafion® Polymers 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001310335 Paenibacillus lentimorbus Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101100125907 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) ilvC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 241000193396 Virgibacillus pantothenticus Species 0.000 description 1
- 101100056949 Wolinella succinogenes (strain ATCC 29543 / DSM 1740 / LMG 7466 / NCTC 11488 / FDC 602W) ansA gene Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150050280 alsD gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 101150082095 ansB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 108010002447 aspartate-alpha-decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- JPNZKPRONVOMLL-UHFFFAOYSA-N azane;octadecanoic acid Chemical class [NH4+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O JPNZKPRONVOMLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 101150031021 birA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 235000020299 breve Nutrition 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L calcium;3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L 0.000 description 1
- QRTVQUYKMVAQBJ-UHFFFAOYSA-L calcium;3-aminopropanoate Chemical compound [Ca+2].NCCC([O-])=O.NCCC([O-])=O QRTVQUYKMVAQBJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000002036 drum drying Methods 0.000 description 1
- SQNZJJAZBFDUTD-UHFFFAOYSA-N durene Chemical compound CC1=CC(C)=C(C)C=C1C SQNZJJAZBFDUTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000011552 falling film Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 230000009123 feedback regulation Effects 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical compound [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033780 ilvB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150090497 ilvC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150099953 ilvE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150077793 ilvH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150060643 ilvN gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 150000002891 organic anions Chemical class 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000010970 precious metal Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/12—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes by fermentation of natural products, e.g. of vegetable material, animal waste material or biomass
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/174—Vitamins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Physiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
Príprava kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí ako prísad do krmív
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka zlepšeného postupu na prípravu kyseliny Dpantoténovej a/alebo jej solí a ich použitia ako prísad do krmív.
Ako východisková látka biosyntézy koenzýmu A je D-pantotenát široko rozšírený vo flóre a faune. Na rozdiel od ľudí, ktorí konzumujú dostatočné množstvá kyseliny pantoténovej v potrave, symptómy nedostatku D-pantotenátu sú často opisované nielen pre rastliny ale aj pre zvieratá. Dostupnosť D-pantotenátu je preto ekonomicky veľmi zaujímavá, najmä v odvetví živočíšnych krmív.
Doterajší stav techniky
D-pantotenát sa konvenčné pripravuje chemickou syntézou z D-pantolaktónu a β-alaninátu vápenatého (Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6. vydanie, 1999, elektronická verzia, kapitola „Vitamins“). Príprava D-pantolaktónu vyžaduje zložité, klasické štiepenie racemátu cez diastereomérne soli. Komerčným produktom chemickej syntézy je zvyčajne vápenatá soľ kyseliny D-pantoténovej, D-pantotenát vápenatý.
V porovnaní s chemickou syntézou je výhodou biotechnologických výrobných procesov použitím mikroorganizmov selektívna (enantiomérne čistá) produkcia D formy kyseliny pantoténovej, ktorú možno použiť pre vyššie organizmy. Zložité štiepenie racemátu, ktoré vyžaduje chemická syntéza, takto nie je potrebné.
Je známych mnoho postupov na prípravu kyseliny D-pantoténovej použitím mikroorganizmov vrátane postupov v EP-0 590 857, WO 96/33283, US 6,013,492, WO 97/10340, DE 198 46 499, EP 1 001 027, EP 1 006 189, EP 1 006 192 a EP 1 006 193.
EP 1 006 189 a EP 1 001 027 opisujú postupy na prípravu pantotenátu, v ktorom sa dosahuje obsah najviac 1 g/l kyseliny D-pantoténovej vo fermentačnom roztoku. Taký nízky obsah kyseliny pantoténovej vo fermentačnom roztoku, teda menej ako 10 % hmotnostných vzhľadom na obsah tuhých látok, je však nevhodný na hospodárnu výrobu krmivových doplnkov obsahujúcich kyselinu D-pantoténovú. Ďalšou nevýhodou doposiaľ opísaných postupov je, že izolovanie produktu z fermentačného média vyžaduje početné spracovacie kroky. Ekonomický postup prípravy v priemyselnom meradle nie je známy.
Nemecká prihláška vyložená na verejné nahliadnutie DE 100 16 321 opisuje fermentačný postup na prípravu krmivového doplnku obsahujúceho kyselinu Dpantoténovú. Významnou nevýhodou tohto postupu ako aj vyššie opísaných fermentačných postupov na prípravu kyseliny D-pantoténovej však je, že prekurzor kyseliny pantoténovej, β-alanín, sa musí dodávať mikroorganizmu prostredníctvom fermentačného média, aby sa získali ekonomické výťažky požadovaného produktu.
Okrem toho US 6,013,492 a WO 96/332839 opisujú spracovanie kyseliny Dpantoténovej z fermentačného roztoku odfiltrovaním nerozpustných zložiek (napríklad bunkového materiálu), adsorbovaním filtrátu na aktívne uhlie, následne elúciou kyseliny D-pantoténovej organickým rozpúšťadlom, s výhodou metanolom, neutralizovaním hydroxidom vápenatým a následne vykryštalizovaním D-pantotenátu vápenatého. Významnými nevýhodami sú straty hodnotného produktu, ku ktorým dochádza počas kryštalizácie, a použitie organického rozpúšťadla, ktoré možno z produktu odstrániť len s ťažkosťami a ktoré vyžaduje zložitý krok regenerácie rozpúšťadla.
EP 0 590 857 opisuje fermentačný postup na prípravu kyseliny D-pantoténovej, pri ktorom kultivovanie mikroorganizmu vyžaduje prísun β-alanínu. Fermentačný roztok sa prefiltruje, aby sa oddelila biomasa, potom prejde cez katiónomenič a potom aniónomenič, neutralizuje sa hydroxidom vápenatým, nakoncentruje odparením, pridá sa aktívne uhlie, prefiltruje sa ešte raz a kryštalizuje sa s prídavkom metanolu a chloridu vápenatého. Výsledný produkt obsahujúci pantotenát popri kyseline Dpantoténovej vo forme vápenatej soli obsahuje aj chlorid vápenatý v molárnom pomere 1:1. Zníženie obsahu chloridu vápenatého vyžaduje elektrodialýzu s následným sušením rozprašovaním. Tento postup má tú nevýhodu, že nie je hospodárny ani ekologický vzhľadom na množstvo zložitých procesných krokov a použitie organických rozpúšťadiel.
Podstata vynálezu
Cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť krmivový doplnok obsahujúci kyselinu D-pantoténovú a/alebo jej soli a jej prípravu zlepšeným postupom na prípravu kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí, ktorý nemá vyššie uvedené nevýhody. Z ekonomických dôvodov je tu vhodný postup, pri ktorom je prísun β-alanínu výrazne znížený alebo vôbec nepotrebný. Okrem toho je vhodná príprava kyseliny Dpantoténovej vo forme jej dvojmocných solí a najmä solí kovov alkalických zemín, keďže dvojmocné soli majú menšie hygroskopické charakteristiky ako jednomocné soli kyseliny pantoténovej a teda majú menej výraznú tendenciu k agregácii pri ďalšom použití napríklad ako krmivového doplnku.
Zistili sme, že tento cieľ sa s výhodou dosiahne predloženým vynálezom.
Predložený vynález sa týka postupu na prípravu kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí, ktorý zahŕňa
a) použitie aspoň jedného organizmu, ktorý produkuje kyselinu Dpantoténovú a v ktorom je biosyntéza kyseliny pantoténovej (pan) a/alebo izoleucínu/valínu (ilv) deregulovaná a ktorý tvorí aspoň 2 g/l solí kyseliny Dpantoténovej fermentáciou v kultivačnom médiu, pričom sa do kultivačného média dodáva 0-20 g/l voľného β-alanínu a/alebo soli β-alanínu,
b) prechod fermentačného roztoku obsahujúceho D-pantotenát cez jednu alebo viacero iónovo selektívnych membrán aplikovaním elektrického poľa, pričom sa z roztoku obsahujúceho D-pantotenát odstraňujú nízkomolekulové ióny,
c) pridanie vápenatej bázy a/alebo horečnatej bázy, aby sa voľná kyselina D-pantoténová obsiahnutá v roztoku upravila na pH 5 - 10, pričom sa získa roztok, ktorý obsahuje pantotenát vápenatý a/alebo horečnatý, a
d) podrobenie roztoku obsahujúceho pantotenát vápenatý a/alebo pantotenát horečnatý sušeniu a/alebo formulácii.
Vo variante postupu podľa vynálezu sa v kroku c) alebo d) získava alebo nanáša suspenzia, ktorá obsahuje pantotenát vápenatý a/alebo horečnatý.
Fermentáciu prebiehajúcu v kroku a) podľa vynálezu možno ďalej uskutočňovať použitím postupov, ktoré sú všeobecne známe, v dávkovom, prísunovom dávkovom alebo opakovanom prísunovom dávkovom režime alebo kontinuálne. Získaná kyselina pantoténová sa v tomto prípade neutralizuje konvenčnými tlmivými systémami, napríklad fosfátovým tlmivým roztokom obsahujúcim NaOH, KOH alebo amoniak.
V iných variantoch postupu podľa vynálezu sa v kultivačnom médiu fermentáciou vytvorí v kroku á) najmenej 10 g/l, s výhodou najmenej 20 g/l, s osobitnou výhodou najmenej 40 g/l, s veľmi osobitnou výhodou najmenej 60 g/l a s najväčšou výhodou najmenej 70 g/l solí kyseliny D-pantoténovej.
Na účely predloženého vynálezu formy slova „produkovať“ znamenajú, že organizmus dokáže syntetizovať väčšie množstvá kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí, ako je potrebné na jeho vlastné metabolické potreby. Vo výhodnom variante vynálezu množstvo kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí nie je prítomné vo vnútri bunky, ale organizmus ho ideálne úplne uvoľňuje do kultivačného média. Toto uvoľňovanie môže byť aktívne alebo pasívne pomocou mechanizmov, ktoré sú samy osebe známe.
Podľa vynálezu sú použitými organizmami produkujúcimi kyselinu Dpantoténovú mikroorganizmy. Podľa vynálezu medzi ne patria plesne, kvasinky a/alebo baktérie. Podľa vynálezu je výhodné použitie plesní, napríklad piesne hlavičkatej, alebo kvasiniek, napríklad Saccharomyces alebo Debaromyces, a z týchto s výhodou Saccharomyces cerevisiae. S výhodou sa podľa vynálezu používajú koryneformné baktérie alebo Bacillaceae. Tie, ktoré sú v rozsahu vynálezu, sú s výhodou napríklad baktérie rodov Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Arthrobacter, Bevibacterium, Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella, Proteus,
Acinetobacter alebo Rhizobium. Osobitne výhodné sú tu Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium breve alebo Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. lentimorbus, B. lentus, B. firmus, B. pantothenticus, B. circulans, B. coagulans, B. megaterium, B. pumilus, B. thuringiensis, B. brevis, B. stearothermophilus a iné druhy Bacillus skupiny 1, ktoré sú charakterizované svojou 16sRNA, alebo Actinum mycetalis. Tento zoznam slúži na vysvetlenie a v žiadnom prípade neobmedzuje predložený vynález.
Predložený vynález ďalej zahŕňa použitie geneticky modifikovaných organizmov na prípravu krmivového doplnku obsahujúceho vofnú kyselinu D-pantoténovú a/alebo jej soli podľa vynálezu. Také geneticky modifikované organizmy možno izolovať napríklad chemickou mutagenézou a následnou selekciou použitím vhodného „skríningového procesu“. Podľa vynálezu sú tu zahrnuté aj „produkčné kmene“, ktoré sú vhodné na prípravu produktu v zmysle predloženého vynálezu a majú genetické modifikácie vzhľadom na metabolický tok v smere kyseliny D-pantoténovej, modifikácie vzhľadom na uvoľňovanie kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí cez bunkovú membránu. Toto možno dosiahnuť napríklad modifikáciami v kľúčových pozíciách v relevantných metabolických biosyntetických dráhach použitého organizmu.
Je tiež možné použiť transgénne organizmy, ktoré pochádzajú z transferu homologických alebo heterologických nukleotidových sekvencií, ktoré sú potrebné, alebo môžu byť potrebné na syntetizovanie požadovaného produktu. V tomto prípade je možná nadmerná expresia a/alebo deregulácia jedného alebo viacerých génov jednotlivo a/alebo v kombinácii lokalizovaných v genóme a/alebo na vektore.
Transgénne organizmy tohto typu môžu s výhodou obsahovať ďalšie kópie a/alebo geneticky modifikované gény vybrané zo skupiny, ktorú tvorí panB, panC, panD, panE a/alebo ich kombinácie a/alebo dokonca organizačné jednotky, ktoré obsahujú operón panBCD. Okrem toho možno v organizmoch s výhodou manipulovať iné metabolické dráhy, napríklad dráhu biosyntézy izoleucínu-valínu, ako je opísané napríklad v EP 1 006 189, EP 1 006 192, EP 1 006 193 alebo EP 1 001 027. V dôsledku toho sa stále viac sprístupňujú rozvetvené prekurzorové látky biosyntézy kyseliny pantoténovej. Ak je to vhodné, s výhodou sa gény pre túto biosyntetickú dráhu, t.j. ilvB, ilvN, ilvC a/alebo ilvD, exprimujú nadmerne.
Okrem toho vynález pokrýva genetické modifikácie aspartát a-dekarboxylázy (panD), napríklad prostredníctvom nadmernej expresie alebo deregulácie v použitom organizme produkujúcom kyselinu D-pantoténovú.
Na účely predloženého vynálezu slovo „deregulácia“ znamená zmenenie alebo modifikovanie aspoň jedného génu, ktorý kóduje jeden enzým v biosyntetickej metabolickej dráhe, takže aktivita enzýmu v mikroorganizme sa zmení alebo modifikuje. Je výhodné, aby sa aspoň jeden gén, ktorý kóduje jeden enzým biosyntetickej metabolickej dráhy, zmenil tak, že génový produkt sa tvorí vo zvýšenej miere, alebo má zvýšenú aktivitu. Pojem „deregulovaná metabolická dráha“ zahŕňa aj biosyntetickú metabolickú dráhu, v ktorej je zmenený alebo modifikovaný viac ako jeden gén, ktorý kóduje viac ako jeden enzým, takým spôsobom, že sa zmení alebo modifikuje aktivita viac ako jedného enzýmu.
Zmeny alebo modifikácie môžu zahŕňať okrem iných nasledujúce: odstránenie endogénneho promótora alebo regulačných prvkov; zavedenie silných promótorov, indukovateľných promótorov alebo viacerých promótorov súčasne; odstránenie regulačných sekvencií tak, že sa zmení expresia génového produktu; zmenenie chromozomálnej pozície génu; zmena DNA sekvencie v blízkosti génu alebo v rámci génu, napríklad ribozomálnych väzobných miest (RBS); zvýšenie počtu kópií génu v genóme alebo zavedením rôzneho počtu kópií plazmidov; modifikovanie proteínov (napr. regulačných proteínov, zoslabovačov, zosilňovačov, transkripčných aktivátorov a podobne), ktoré hrajú úlohu v transkripcii génu a/alebo v translácii za vzniku génového produktu. To zahŕňa všetky ostatné možnosti deregulácie expresie génov, ktoré patria do doterajšieho stavu techniky, napríklad použitie antisense oligonukleotidov alebo blokovanie represorových proteínov.
Deregulácia môže zahŕňať aj zmeny kódovacieho regiónu génov, ktoré vedú napríklad k odstráneniu spätnoväzobnej regulácie v génovom produkte alebo k vyššej alebo nižšej špecifickej aktivite génového produktu.
Ďalej sú výhodné genetické modifikácie enzýmov podľa vynálezu, ktoré ovplyvňujú výstup prekurzorov kyseliny pantoténovej a/alebo tok kyseliny pantoténovej za vzniku koenzýmu A. Medzi príklady génov kódujúcich také enzýmy patria: alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA, coaX atď. Tento zoznam slúži na vysvetlenie a v žiadnom prípade neobmedzuje predložený vynález.
Okrem toho sú výhodné genetické modifikácie, ktoré zabezpečujú bunkovú produkciu kofaktorov (napr. metyléntetrahydrofolátu, redox ekvivalentov a podobne) v množstve, ktoré je optimálne pre produkciu kyseliny pantoténovej.
Takto je β-alanín s výhodou už prítomný v bunkách vo zvýšených koncentráciách v porovnaní so zodpovedajúcimi geneticky nemodifikovanými organizmami, a preto ho netreba pridávať do kultivačného média ako prekurzor, ako je to potrebné napríklad v EP-A 0 590 857. Výhodné sú mikroorganizmy, v ktorých je biosyntéza kyseliny pantoténovej (pan) a/alebo izoleucín-valínu (ilv) a/alebo asparát-adekarboxylázy (panD) deregulovaná. Navyše je výhodná ďalšia nadmerná expresia ketopantoát reduktázy (panE) v mikroorganizmoch.
Ďalej je podľa vynálezu výhodné, ak je to vhodné, aby gén coaA, ktorý je potrebný na syntézu koenzýmu A, mal zníženú aktivitu, alebo bol úplne vypnutý (napríklad v druhoch Bacillus). Je to preto, lebo Bacillus popri coaA obsahuje ďalší gén na túto enzymatickú funkciu (= coaX). Aktivita tohto génu coaX alebo zodpovedajúceho enzýmu môže byť tiež zmenená, s výhodou znížená alebo dokonca odstránená za predpokladu, že coaA samotný ešte má dostatočnú enzýmovú aktivitu, hoci zníženú enzýmovú aktivitu, teda enzýmová aktivita coaA sa nestratí úplne. Popri nadmernej expresii rôznych génov je výhodná aj genetická manipulácia promótorových regiónov týchto génov za predpokladu, že táto manipulácia vedie k nadmernej expresii génových produktov.
V uskutočnení predloženého vynálezu sú použité bakteriálne kmene opísané podľa prílohy (PCT/US prihláška 0025993), napríklad Bacillus subtilis PA 824 a/alebo ich deriváty. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je použitý mikroorganizmus Bacillus subtilis PA 668 podľa opisu v prílohe (US č. 60/262,995). Tieto kmene Bacillus subtilis PA 824 a PA 668 boli pripravené nasledovne:
Vychádzajúc z kmeňa Bacillus subtilis 168 (kmeň Marburg ATCC 6051), ktorý má genotyp trpC2 (Trp), kmeň PY79 bol pripravený transdukciou Trp+ markera (z Bacillus subtilis štandardného typu W23). Klasické metódy genetického inžinieringu (opísané napríklad v monografii Harwood, C. R. a Cutting, S. M. (editors), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, England) zaviedli mutácie ApanB a ApanEI do kmeňa PY79.
Výsledný kmeň bol transformovaný použitím genomickej DNA kmeňa Bacillus subtilis PA221 (genotyp P2QpanBCD, trpC2 (Trp’)) a genomickej DNA kmeňa Bacillus subtilis PA303 (genotyp P^panE}). Výsledný kmeň PA327 má genotyp P2epanBCD, P2epanE1 a je tryptofánovým auxotrofom (Trp ). Titre kyseliny pantoténovej až do 3,0 g/l (24 h) sa dosiahli použitím kmeňa Bacillus subtilis PA327 v 10 ml kultúrach obsahujúcich médium SVY (25 g/l Difco Veal Infusion Broth, 5 g/l Difco Yeast Extract, 5 g/l glutamátu sodného, 2,7 g/l síranu amónneho v 740 ml vody, zmes sa autoklávovala a pridalo sa 200 ml 1 M fosforečnanu draselného s pH 7,0 a 60 ml 50 % sterilného roztoku glukózy), ktoré bolo suplementované 5 g/l β-alanínu a 5 g/l aketoizovalerátu.
Produkcia kmeňa Bacillus subtilis PA221 (genotyp P26panBCD, trpC2 (Trp )) je opísaná v nasledujúcej časti:
Klasické metódy genetického inžinieringu sa použili na klonovanie operónu panBCD pre Bacillus, s pomocou sekvenčnej informácie operónu panBCD pre E. coli (pozrite Merkel et al., FEMS Microbiol. Lett., 143, 1996:247-252) vychádzajúc z plazmidovej knižnice Bacillus subtilis GP275. Pri klonovaní sa použil kmeň E. coli BM4062 (bir,s) a informácia, že operón Bacillus je blízko génu birA. Operón panBCD sa zaviedol do plazmidu, ktorý možno replikovať v E. coli. Aby sa zlepšila expresia operónu panBCD, použili sa silné konštitutívne promótory fágov Bacillus subtilis SP01 (P26) a ribozómové väzobné miesto (=RBS) pred génom panB bolo nahradené umelým RBS. DNA fragment, ktorý je bezprostredne upstream od natívneho génu panB v Bacillus, bol ligovaný pred kazetu P2epanBCD na plazmide. Tento plazmid bol transformovaný na kmeň Bacillus subtilis RL-1 (derivát Bacillus subtilis 168 získaný klasickou mutagenézou (kmeň Marburg ATCC 6051), genotyp trpC2 (Trp)), a homologickou rekombináciou bol natívny operón panBCD nahradený operónom p26panBCD. Výsledný kmeň sa nazýva PA221 a má genotyp P^panBCD, trpC2 (Trp ).
Titer kyseliny pantoténovej až do 0,92 g/l (24 h) sa dosiahol použitím kmeňa Bacillus subtilis PA221 v 10 ml kultúr obsahujúcich médium SVY, ktoré bolo suplementované 5 g/l β-alanínu a 5 g/l a-ketoizovalerátu.
Produkcia kmeňa Bacillus subtilis PA303 (genotyp P26panE1) je opísaná v nasledujúcej časti:
Použitím génovej sekvencie E. coli panE sa klonovala sekvencia Bacillus panE analógiou. Zistilo sa, že v B. subtilis existujú dva homológy génu E. coli panE, ktoré boli označené panE1 a panE2. Analýzami deléciou sa zistilo, že gén panE1 je zodpovedný za 90 % produkcie kyseliny pantoténovej, zatiaľ čo delécia génu panE2 nemala žiadny významný efekt na produkciu kyseliny pantoténovej. Aj tu, podobne ako pri klonovaní operónu panBCD, sa promótor nahradil silným konštitutívnym promótorom P26 a ribozómové väzobné miesto pred génom panE1 sa nahradilo umelým väzobným miestom. Fragment P2GpanE1 sa klonoval do vektoru, ktorý bol konštruovaný tak, že fragment P2QpanE1 sa mohol integrovať do pôvodného lokusu panE1 v genóme Bacillus subtilis. Kmeň získaný po transformácii a homologickej rekombinácii sa označuje PA303 a má genotyp P2epanE1. Titer kyseliny pantoténovej až do 1,66 g/l (24 h) sa dosiahol použitím kmeňa Bacillus subtilis PA303 v 10 ml kultúr obsahujúcich médium SVY, ktoré bolo suplementované 5 g/l β-alanínu a 5 g/l aketoizovalerátu.
Kmeň bol ďalej konštruovaný transformovaním PA327 plazmidom, ktorý obsahoval operón P2eilvBNC a markerový gén pre spektinomycín. Operón P26ilvBNC sa integroval do lokusu amyE, čo bolo demonštrované pomocou PCR. Jeden transformant bol označený PA340 (genotyp P2QpanBCD, P26panE1, P26ÍlvBNC, specR, trpC2 (Trp )).
Titer kyseliny pantoténovej až do 3,6 g/l (24 h) sa dosiahol použitím kmeňa Bacillus subtilis PA340 v 10 ml kultúrach obsahujúcich médium SVY, ktoré bolo suplementované len 5 g/l β-alanínu; v 10 ml kultúrach obsahujúcich médium SVY, ktoré bolo suplementované 5 g/l β-alanínu a 5 g/l β-ketoízovalerátu, sa dosiahol titer kyseliny pantoténovej až do 4,1 g/l (24 h).
Okrem toho sa zaviedla deregulovaná kazeta ilvD do kmeňa PA340. S týmto cieľom sa plazmid, ktorý obsahuje gén ilvD pod kontrolou promótora P26 obsahujúceho umelý RBS2, transformoval do PA340. Gén P26//vC> bol integrovaný do pôvodného lokusu ilvD homologickou rekombináciou. Výsledný kmeň PA374 má genotyp P2&panBCD, P2&panE1, P2&ilvBNC, P2ôilvD, specR a trpC2 (Trp').
Titer kyseliny pantoténovej až do 2,99 g/l (24 h) sa dosiahol použitím kmeňa Bacillus subtilis PA374 v 10 ml kultúrach obsahujúcich médium SVY, ktoré bolo suplementované len 5 g/l β-alanínu.
Aby sa produkovala kyselina pantoténová použitím kmeňa PA374 bez prísunu β-alanínu, do kmeňa PA374 sa zaviedli ďalšie kópie génu panD kódujúceho aspartátα-dekarboxylázu. S týmto cieľom sa chromozomálna DNA kmeňa PA401 transformovala do PA374. Kmeň PA377 sa získal selekciou na tetracyklín.
Výsledný kmeň PA377 má genotyp P2e,panBCD, P2&panE1, P2eilvBNC, P2&ilvD, specR, tetR a trpC2 (Trp ).
Titer kyseliny pantoténovej až do 1,31 g/l (24 h) sa dosiahol bez prísunu prekurzorov použitím kmeňa Bacillus subtilis PA377 v 10 ml kultúrach obsahujúcich médium SVY.
Príprava kmeňa Bacillus subtilis PA401 (genotyp P26panD) je opísaná v nasledujúcej časti:
Gén Bacillus subtilis panD bol klonovaný z operónu panBCD do vektora, ktorý prenáša teracyklínový markerový gén. Promótor P26 a vyššie opísané RBS boli klonované pred gén panD. Reštrikčnou digesciou sa získal fragment, ktorý obsahoval tetracyklínový markerový gén a gén P2QpanD. Tento fragment bol religovaný a transformovaný do vyššie opísaného kmeňa PA221. Fragment sa integroval do genómu kmeňa PA211. Výsledný kmeň PA401 má genotyp P2QpanBCD, P2epanD, tetR a trpC2 (Trp).
Titer kyseliny pantoténovej až do 0,3 g/l (24 h) sa dosiahol použitím kmeňa Bacillus subtilis PA401 v 10 ml kultúrach obsahujúcich médium SVY, ktoré bolo suplementované 5 g/l α-ketoizovalerátu. V 10 ml kultúrach obsahujúcich médium SVY, ktoré bolo suplementované 5 g/l kyseliny D-pantoovej a 10 g/l L-aspartátu, sa získali titre kyseliny pantoténovej až do 2,2 g/l (24 h).
Vychádzajúc z kmeňa PA377 sa generoval tryptofán-prototrofický kmeň transformáciou chromozomálnou DNA z kmeňa PY79. Tento kmeň PA824 má genotyp P26panBCD, P26panE1, P26ÍlvBNC, P2qÍIvD, specR, tetR a Trp+.
Dosiahol sa titer kyseliny pantoténovej až do 4,9 g/l (48 h) bez prísunu prekurzorov použitím kmeňa Bacillus subtilis PA824 v 10 ml kultúrach v médiu SVY (porovnanie s PA377: do 3,6 g/l za 48 h).
Príprava PA668 je opísaná v nasledujúcej časti:
Gén Bacillus panB bol klonovaný z operónu panBCD štandardného typu a vložený do vektora, ktorý popri géne chloramfenikolovej rezistencie obsahuje aj sekvencie B. subtilis pre lokus vpr.
Silný konštitutívny promótor P26 bol zavedený pred koniec 5’ génu panB. Jeden fragment, ktorý obsahuje gén P2&panB, markerový gén pre chloramfenikolovú rezistenciu a tiež sekvencie Bacillus subtilis vpr bol získaný reštrikčnou digesciou. Izolovaný fragment bol religovaný a použitý na tansformovanie kmeňa PA824. Výsledný kmeň bol označený PA668. Genotyp PA668 je: P^panBCD, P2epanE1, P2QilvBNC, P2gÍIvD, P2epanB, specR, tetR, CmR a Trp+.
Boli izolované dve kolónie PA668 a označené PA668-2A a druhá PA668-24.
Použitím kmeňa B. subtilis PA668-2A sa dosahujú titre kyseliny pantoténovej
1,5 g/l za 48 h v 10 ml kultúrach v médiu SVY bez prísunu prekurzorov. V 10 ml kultúrach suplementovaných 10 g/l aspartátu sa dosahujú titre až do 5 g/l.
Použitím kmeňa B. subtilis PA668-24 sa dosahujú titre kyseliny pantoténovej
1,8 g/l za 48 h v 10 ml kultúrach v médiu SVY bez prísunu prekurzorov. V 10 ml kultúrach suplementovaných 10 g/l L-aspartátu sa dosahujú titre až do 4,9 g/l.
Presná konštrukcia kmeňa pochádza z príloh prihlášky PCT/US 0025993 a US č. 60/262,995.
Použitím vyššie opísaného kmeňa PA377 v glukózovo obmedzenej fermentácii v médiu SVY (25 g/l Difco Veal Infusion Broth, 5 g/l Difco Yeast Extract, 5 g/l tryptofánu, 5 g/l glutamátu sodného, 2 g/l (NH4)2SO4, 10 g/l KH2PO4, 20 g/l K2HPO4, 0,1 g/l CaCI2, 1 g/l MgSO4, 1 g/l citrátu sodného, 0,01 g/l FeSO4 7H2O a 1 ml/l roztoku stopových solí s nasledujúcim zložením: 0,15 g Na2MoO4 · 2H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCI2 · 6H2O, 0,25 g CuSO4 · 5H2O, 1,6 g MnCI2 · 4H2O, 0,3 g ZnSO4 7H2O, doplnené do 1 I vodou)) v 10 I škále s kontinuálnym prísunom glukózového roztoku sa získajú koncentrácie kyseliny pantoténovej vo fermentačnej zmesi 18 — 19 g/l 122 — 125 g/l) za 36 h (48 h).
V prípade glukózovo obmedzenej fermentácie PA824, tryptofán-prototrofného derivátu PA377, v médiu kvasnicového extraktu (10 g/l Difco Yeast Extract, 5 g/l glutamátu sodného, 8 g/l (NH4)2SO4, 10 g/l KH2PO4, 20 g/l K2HPO4, 0,1 g/l CaCI2, 1 g/l MgSO4, 1 g/l citrátu sodného, 0,01 g/l FeSO4 · 7H2O a 1 ml/l vyššie opísaného roztoku stopových solí) sa získajú nasledujúce koncentrácie kyseliny pantoténovej vo fermentačných zmesiach za 36 h, 48 h a 72 h: 20 g/l, 28 g/l a 36 g/l v škále 10 I s kontinuálnym prísunom glukózového roztoku.
Pomocou ďalšej optimalizácie média použitím kmeňa PA824 v glukózovo obmedzenej fermentácii v médiu obsahujúcom 10 g/l Difco Yeast Extract, 10 g/l NZ amínu A (Quest International GmbH, Erftstadt), 10 g/l glutamátu sodného, 4 g/l (NH4)2SO4, 10 g/l KH2PO4, 20 g/l K2HPO4, 0,1 g/l CaCI2, 1 g/l MgSO4, 1 g/l citrátu sodného, 0,01 g/l FeSO4 7H2O a 1 ml/l vyššie opísaného roztoku stopových solí sa získali koncentrácie kyseliny pantoténovej 37 g/l (48 g/l) vo fermentačných zmesiach za 36 h (48 h) v škále 10 I s kontinuálnym prísunom glukózového roztoku.
Ďalšie zvýšenia koncentrácie kyseliny pantoténovej vo fermentačnej zmesi možno dosiahnuť ďalšou optimalizáciou média, zvýšením fermentačného času, vylepšením postupu a kmeňa a kombináciou jednotlivých krokov. Vyššie uvedené koncentrácie kyseliny pantoténovej možno dosiahnuť aj fermentáciou kmeňov, ktoré sú derivátmi vyššie uvedeného PA824. Deriváty možno pripraviť klasickým vývojom kmeňov a ďalšími manipuláciami genetického inžinieringu. Vývojom média, kmeňa a fermentačného procesu možno zvýšiť titre kyseliny pantoténovej vo fermentačných zmesiach na viac ako 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 a > 90 g/l.
Podstatnou výhodou postupu podľa vynálezu je, že fermentácia sa uskutočňuje v kultivačnom médiu, ktoré okrem aspoň jedného zdroja uhlíka a zdroja dusíka neobsahuje ako východiskové zlúčeniny žiadne iné prekurzory. To znamená, že biosyntéza kyseliny D-pantoténovej je nezávislá od prísunu iných prekurzorov. Na účely predloženého vynálezu sú takými prekurzormi látky ako β-alanín a/alebo Laspartát a/alebo L-valín a/alebo α-ketoizovalerát a/alebo ich kombinácie.
Vo výhodnom variante postupu podľa vynálezu sa fermentácia organizmu produkujúceho kyselinu D-pantoténovú uskutočňuje v kultivačnom médiu, ktoré obsahuje zdroj uhlíka a zdroj dusíka, ale do ktorého sa nepridáva ani nedodáva v priebehu fermentácie žiadny voľný β-alanín a/alebo soli β-alanínu. To znamená, že na produkciu kyseliny D-pantoténovej v rozmedziach aspoň 10 g/l kultivačného média, s výhodou najmenej 20 g/l, s osobitnou výhodou najmenej 40 g/l, s veľmi osobitnou výhodou najmenej 60 g/l a s najväčšou výhodou najmenej 70 g/l nie je podľa vynálezu potrebný žiadny prísun voľného β-alanínu a/alebo solí β-alanínu.
Nezávislosť od prísunu prekurzorov je osobitne významnou ekonomickou výhodou postupu podľa vynálezu v porovnaní so známymi procesmi, keďže mnoho prekurzorov je veľmi drahých.
Vynález však nevylučuje pridávanie β-alanínu a/alebo solí β-alanínu, takže výťažok kyseliny D-pantoténovej možno ďalej zvýšiť pridaním β-alanínu a/alebo solí βalanínu. Ak sa napríklad predpokladá, že všetky potrebné prekurzory kyseliny pantoténovej sú prítomné v dostatočnom množstve, ďalšie zvýšenie produkcie kyseliny pantoténovej limituje len aktivita génu panD, potom výťažok kyseliny pantoténovej možno zvýšiť napríklad o ďalších 50 % pridaním voľného β-alanínu a/alebo solí βalanínu.
Vo výhodnom variante predloženého vynálezu možno do kultivačného média pridať až 20 g/l voľného β-alanínu a/alebo solí β-alanínu, aby sa výťažok kyseliny pantoténovej ďalej zvýšil o viac ako 50%. Uprednostňuje sa pridanie približne 15 g/l voľného β-alanínu a/alebo solí β-alanínu do kultivačného média.
Príkladmi zdrojov uhlíka, ktoré sú vhodné podľa vynálezu na použitie v kultivačnom médiu na fermentáciu vyššie uvedených organizmov, sú cukry, napríklad škrobové hydrolyzáty (mono-, di-, oligosacharidy), s výhodou glukóza alebo sacharóza, a tiež repné alebo trstinové cukrové melasy, proteíny, proteínové hydrolyzáty, sójová múka, kukuričný výluh, tuky, voľné mastné kyseliny, recirkulované bunky z predchádzajúcich fermentácií alebo ich hydrolyzáty, a tiež kvasnicový extrakt. Tento zoznam neobmedzuje predložený vynález.
Okrem toho sa tento proces s výhodou vyznačuje tým, že celkový obsah cukru sa do konca fermentácie zníži na minimum, keďže inak by sa sťažilo neskoršie sušenie a/alebo formulácia fermentačného roztoku v dôsledku lepenia. Toto možno podľa vynálezu dosiahnuť pokračovaním fermentácie určitý dodatočný čas po spotrebovaní zdroja uhlíka (v prípade dávkovej kultúry) alebo po prerušení alebo regulovaní prísunu uhlíka (v prípade procesného postupu v prísunovom dávkovom alebo opakovanom prísunovom dávkovom režime) tak, že koncentrácia zdroja uhlíka bude prakticky nulová (v prípade prísunového dávkového, opakovaného dávkového alebo kontinuálneho procesného postupu).
Toto sa podľa vynálezu dosahuje tak, že po prerušení pridávania zdroja uhlíka (napríklad roztoku cukru) fermentácia pokračuje, kým sa nedosiahne koncentrácia rozpusteného kyslíka (pO2) vo fermentačnom roztoku najmenej 80 %, s výhodou 90 % a s osobitnou výhodou 95 % hodnoty nasýtenia.
Príkladmi zdrojov dusíka, ktoré sú vhodné podľa vynálezu, sú amoniak, síran amónny, močovina, proteíny, proteínové hydrolyzáty alebo kvasnicový extrakt. Tento zoznam neobmedzuje predložený vynález.
Okrem toho fermentačné médium obsahuje minerálne soli a/alebo stopové prvky, napríklad aminokyseliny a vitamíny. Presné zloženia vhodných fermentačných médií sú všeobecne známe a dostupné odborníkom v danej oblasti.
Po naočkovaní fermentačného média vhodným organizmom produkujúcim kyselinu D-pantoténovú (v bunkových hustotách známych odborníkom v danej oblasti), v prípade potreby s prídavkom odpeňovača, sa tento organizmus kultivuje. Akúkoľvek potrebnú reguláciu pH média možno dosiahnuť použitím rôznych anorganických alebo organických zásad alebo kyselín, napríklad NaOH, KOH, amoniaku, kyseliny fosforečnej, kyseliny sírovej, kyseliny chlorovodíkovej, kyseliny mravčej, kyseliny jantárovej, kyseliny citrónovej a podobne.
Vzhľadom na tlmivé systémy používané pri fermentácii, ktorými môžu byť, ako je opísané vyššie, napríklad NaOH, KOH, amoniak, kyselina fosforečná, kyselina sírová, kyselina chlorovodíková, kyselina mravčia, kyselina jantárová, kyselina citrónová a podobne, vytvorená kyselina D-pantoténová je prítomná vo fermentačnom roztoku v závislosti od použitého tlmivého systému vo forme príslušných solí. Keďže v tomto prípade podľa vynálezu sú najmä soli kyseliny D-pantoténovej vo forme svojich jednomocných katiónov nevýhodné a kyselina D-pantoténová vo forme svojej vápenatej alebo horečnatej soli je výhodná, fermentačný roztok sa podľa vynálezu pripravuje elektromembránovými separačnými procesmi.
Predložený vynález zahŕňa všetky dostupné typy elektromembránových separačných procesov, napríklad membránové elektrolýzy alebo elektrodialýzy. Odborník urobí vhodný výber na základe svojich skúseností.
Podľa vynálezu sa uprednostňuje použitie elektrodialýzy. Tu možno použiť nielen elektrodialýzy použitím výlučne monopolárnych membrán ale aj elektrodialýzy použitím monopolárnych a/alebo bipolárnych membrán. Osobitne výhodné sú elektrodialýzy použitím výlučne monopolárnych membrán, najmä elektrodialýzy s monopolárnymi membránami, ktoré sú selektívne pre jednomocné ióny, nazývané monoselektívne membrány.
Na uskutočnenie postupu podľa vynálezu možno použiť v podstate akékoľvek membrány bežne používané v kontexte procesov elektrodialýzy. Membránou použitou v kontexte elektrodialýzy podľa vynálezu je s výhodou komerčne konvenčná iónovýmenná membrána.
Aniónovýmenné membrány, ktoré možno použiť, sú napríklad Neosepta AM1, AM2, AM3, AMX, AMH, AFN od firmy Tokuyama a AMV od firmy Asahi Glass.
Príkladmi katiónovýmenných membrán sú Neosepta CM1, CM2, CMX, CMH, CMB, Asahi glass CMV a tiež Nafion 435 alebo 350 od Du Pont de Nemours.
Monoselektívnou katiónovýmennou membránou, ktorú možno spomenúť, je napríklad membrána Neosepta CMS.
Monoselektívne aniónovýmenné membrány, ktoré možno použiť, sú napríklad membrány Neosepta ACS od firmy Tokuyama alebo Selmion ASV od Asahi Glass.
Použitými elektródami môže byť nehrdzavejúca oceľ, nikel, vzácne kovy, napríklad platina alebo iné vhodné materiály známe odborníkom v danej oblasti.
Použitím monopolárnej elektrodialýzy podľa vynálezu možno z roztoku obsahujúceho pantotenát preniesť nielen anióny ale aj katióny migráciou v elektrickom poli cez anióno- alebo katiónovýmenné membrány do druhého roztoku (roztok koncentrátu, CONC) a tým ich odstrániť z roztoku obsahujúceho kyselinu pantoténovú (roztok diluátu, DIL). Podľa vynálezu sa nízkomolekulové ióny s výhodou odstránia z roztoku obsahujúceho kyselinu pantoténovú. Na účely predloženého vynálezu sú nízkomolekulovými iónmi tie, ktoré sú zavedené do fermentačnej zmesi zložením kultivačného média a/alebo tlmivého systému, ale sú nežiaduce v koncovom produkte. Ide napríklad o nasledujúce ióny: amónne, draselné, sodné, železité, chloridové, fosforečnanové alebo síranové ióny.
V ďalšom uskutočnení predloženého vynálezu je možné uskutočniť iónovú výmenu jednomocných katiónov, napríklad Na+ alebo amónnych iónov, oproti viacmocným katiónom, napríklad Ca2+. Na toto sa používajú katiónovýmenné membrány, ktoré sú selektívne pre jednomocné ióny. Takto sa napríklad do okruhu I zavedie roztok CaCI2 a do druhého okruhu II oddeleného od okruhu I katiónovýmennou membránou sa zavedie roztok kyseliny pantoténovej obsahujúci jednomocný katión. Potom cez katiónovýmennú membránu, ktorá je selektívna pre jednomocné ióny a nachádza sa medzi komorou II a komorou III, sa jednomocné katióny s výhodou prenesú do tretej komory III. Súčasne anióny, napríklad chloridové ióny, sa prenesú z komory I do komory III cez aniónovýmennú membránu nachádzajúcu sa medzi komorou I a komorou III. Ióny Ca2+ sa prenesú z komory I do komory II cez katiónovýmennú membránu. Takýmto spôsobom sa získa priamo Dpantotenát vápenatý. Keď je prítomná soľ slabej kyseliny, napríklad kyseliny pantoténovej, môže sa v takomto usporiadaní produkovať aj voľná kyselina Dpantoténová, ak sa do komory I zavedie namiesto CaCI2 vodný roztok HCl.
Vynález zahŕňa aj použitie vápenatých solí a/alebo horečnatých solí vo forme anorganických alebo organických aniónov. Podľa vynálezu sa s výhodou použijú chlorid, dusičnan, hydroxid, mravčan, octan, propionát, glycinát alebo laktát vápenatý a/alebo horečnatý.
V alternatívnom uskutočnení predloženého vynálezu, keď sa používa bipolárna elektrodialýza, možno katióny s výhodou preniesť do druhého roztoku z roztoku obsahujúceho pantotenát cez katiónovýmenné membrány a tak odstrániť z roztoku obsahujúceho kyselinu pantoténovú so súčasným prísunom protónov disociáciou vody v bipolárnej membráne. V druhom roztoku sa tvoria zodpovedajúce bázy katiónov, ktoré boli prenesené, pomocou hydroxidových iónov získaných disociáciou vody v bipolárnej membráne.
V ďalšom uskutočnení predloženého vynálezu, keď sa používa bipolárna elektrodialýza, možno anióny s výhodou preniesť do druhého roztoku z roztoku obsahujúceho pantotenát cez aniónovýmennú membránu a tak odstrániť z roztoku obsahujúceho kyselinu pantoténovú so súčasným prísunom hydroxidových iónov disociáciou vody v bipolárnej membráne. V druhom roztoku sa tvoria zodpovedajúce kyseliny aniónov, ktoré boli prenesené, pomocou protónov získaných disociáciou vody v bipolárnej membráne.
Vynález zahŕňa aj ďalšie alternatívne uskutočnenie, v ktorom sa použitím bipolárnej elektrodialýzy najprv s výhodou anióny prenesú z roztoku obsahujúceho pantotenát do druhého roztoku cez aniónovýmenné membrány a tak sa odstránia z roztoku obsahujúceho kyselinu pantoténovú so súčasným prísunom hydroxidových iónov disociáciou vody v bipolárnej membráne, a katióny sa prenášajú z roztoku obsahujúceho pantotenát do tretieho roztoku cez katiónovýmenné membrány a tak sa odstraňujú z roztoku obsahujúceho kyselinu pantoténovú so súčasným prísunom protónov disociáciou vody v bipolárnej membráne. V druhom roztoku sa tvoria zodpovedajúce kyseliny prenesených aniónov pomocou protónov získaných disociáciou vody v bipolárnej membráne a v treťom roztoku sa tvoria zodpovedajúce bázy prenesených katiónov pomocou hydroxidových iónov získaných disociáciou vody v bipolárnej membráne.
Podľa vynálezu s výhodou v tomto procese sa navyše pH roztoku obsahujúceho pantotenát nastavuje na izoelektrický bod kyseliny pantoténovej použitím kyselín alebo báz. Vďaka tomu možno výťažok voľnej kyseliny Dpantoténovej ďalej zvýšiť alebo stratu možno dalej minimalizovať.
Monopolárna elektrodialýza je osobitne výhodný variant, keďže je vysoko nákladovo efektívna v porovnaní s bipolárnou elektrodialýzou.
Bipolárnu elektrodialýzu možno použiť najmä vtedy, keď sa nemajú pridávať kyseliny alebo bázy na úpravu pH, alebo keď možno existujúci roztok kyseliny alebo hydroxidu alkalického kovu ďalej použiť.
Varianty elektrodialýzy podľa vynálezu ponúkajú výhodu, že nevznikajú žiadne odpadové vody pri regenerácii iónovýmenných živíc.
Použitie elektroseparačných procesov podľa vynálezu s výhodou odstraňuje nežiaduce nízkomolekulové ióny (cudzie ióny) ako amónne, draselné, sodné, železité, chloridové, fosforečná nové alebo síranové ióny z roztoku obsahujúceho D-pantotenát. To znamená, že sa s výhodou tvorí voľná kyselina D-pantoténová alebo jej požadované soli, napríklad D-pantotenát vápenatý a/alebo horečnatý.
Podľa vynálezu je obsah jednomocných katiónov, s výhodou amónnych, draselných a/aiebo sodných iónov, znížený na koncentráciu < 1 g/kg roztoku.
Obsah nežiaducich aniónov, napríklad chloridových, síranových alebo fosforečnanových iónov, možno tiež výrazne znížiť voľbou iónovýmennej membrány, s výhodou použitím aniónovýmennej membrány.
Výsledný roztok obsahujúci voľnú kyselinu D-pantoténovú je podľa vynálezu nastavený na pH 3 - 10 pridaním vápenatej bázy a/alebo horečnatej bázy. Výhodné je pH 5 - 10. pH sa s výhodou nastaví na hodnotu 5 - 9, s osobitnou výhodou 6-9 a s veľmi osobitnou výhodou 6-8. Takto sa získa roztok obsahujúci pantotenát vápenatý a/alebo pantotenát horečnatý. Pri neutralizácií sa do roztoku s výhodou pridáva hydroxid vápenatý, uhličitan vápenatý, oxid vápenatý, hydroxid horečnatý a/alebo bázický uhličitan horečnatý vo forme tuhej látky a/alebo ako vodná suspenzia.
V tomto prípade je podľa vynálezu výhodné, ak sa roztok obsahujúci voľnú kyselinu D-pantoténovú neutralizuje vápenatou bázou a/alebo horečnatou bázou vo forme vodnej suspenzie. V dôsledku použitia vodnej disperzie sa neutralizácia uskutočňuje rýchlejšie a bez relatívne veľkých fluktuácií pH v porovnaní s prípadom, keď sa použije zodpovedajúca tuhá látka.
Podľa vynálezu sa postup vyznačuje tým, že do roztoku sa v kroku c) pridá vodná suspenzia obsahujúca 2 - 55% hmotnostných, s výhodou 10 - 50% hmotnostných a s osobitnou výhodou 20 - 40 % hmotnostných hydroxidu vápenatého. Vynález okrem toho zahŕňa postup, pri ktorom sa do roztoku v kroku c) pridá vodná suspenzia obsahujúca 2-65 % hmotnostných, s výhodou 10-50 % hmotnostných a s osobitnou výhodou 20 - 40 % hmotnostných uhličitanu vápenatého. V ďalšom uskutočnení predloženého vynálezu sa do roztoku v kroku c) postupu podľa vynálezu pridá vodná suspenzia obsahujúca 2 - 60% hmotnostných, s výhodou 10 - 50% hmotnostných a s osobitnou výhodou 20 - 40% hmotnostných hydroxidu horečnatého. Vynález zahŕňa aj postup, pri ktorom sa do roztoku v kroku c) pridá vodná suspenzia obsahujúca 2 - 25% hmotnostných, s výhodou 10 - 20% hmotnostných bázického uhličitanu horečnatého.
Fermentačný roztok sa vysuší a/alebo formuluje pomocou všeobecne známych postupov, napríklad sušením rozprašovaním, granuláciou rozprašovaním, sušením vo fluidnej vrstve, granuláciou vo fluidnej vrstve, bubnovým sušením alebo spin-flash sušením (Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6. vydanie, 1999, elektronická verzia, kapitola „Drying of Solid Materials“). Vstupná teplota plynu v konvekčnom sušení je v rozmedzí 100 - 280 °C, s výhodou 120-210 °C. Výstupná teplota plynu je 50 - 180 °C, s výhodou 60 - 150 °C. Aby sa dosiahla požadovaná distribúcia veľkosti častíc a súvisiace vlastnosti produktu, jemné častice možno oddeľovať a recirkulovať. Okrem toho hrubý materiál možno mlieť v mlyne a rovnako potom recirkulovať.
Podľa vynálezu je zníženie počtu zložitých spracovacích krokov výhodné, najmä vyhnutie sa používaniu organických rozpúšťadiel so súbežnou výrobou požadovaného produktu s vysokou biologickou hodnotou. Okrem toho sa podľa vynálezu významne znižuje množstvo produkovanej odpadovej vody. To vedie k ďalším úsporám v zložitých zariadeniach na spracovanie a manipuláciu. Postup podľa vynálezu sa teda s výhodou vyznačuje tým, že je jednoduchší, menej citlivý na chyby, menej časovo náročný, výrazne menej drahý a teda hospodárnejší ako konvenčné procesy.
To však nevylučuje, aby sa postup podľa vynálezu mohol meniť. Kroky postupu podľa vynálezu a) až d) spomenuté na začiatku možno doplniť jedným alebo viacerými z nasledujúcich procesných krokov, ktoré sú samy osebe známe odborníkom v danej oblasti. V tomto prípade sú všetky predstaviteľné kombinácie dodatočných (prevádzkových) procesných krokov so (základnými) procesnými krokmi a) až d) pokryté vynálezom.
Roztoky pochádzajúce z procesných krokov a) - c) možno dezinfikovať, napríklad zahriatím (sterilizáciou) alebo inými metódami, napríklad pasterizáciou alebo sterilnou filtráciou.
V ďalších variantoch postupu podľa vynálezu pred vysušením a/alebo formuláciou roztoku možno uskutočniť aspoň jeden krok a/alebo kombinácie z nasledujúcich krokov: lýza a/alebo sterilizovanie biomasy a/alebo oddelenie biomasy od fermentačného roztoku a/alebo pridanie ďalších prísad a/alebo nakoncentrovanie fermentačného roztoku, s výhodou odstránením vody.
Predložený vynález sa teda týka aj postupu, pri ktorom sa lýza a/alebo sterilizácia biomasy uskutoční ešte vo fermentačnom roztoku alebo nie až po odseparovaní biomasy od fermentačného roztoku. Toto možno uskutočniť napríklad tepelným spracovaním, s výhodou pri 80 - 200 °C a/alebo spracovaním kyselinou, s výhodou kyselinou sírovou alebo kyselinou chlorovodíkovou, a/alebo enzymaticky, s výhodou lyzozýmom.
V ďalšom uskutočnení predloženého vynálezu možno bunky fermentovaných mikroorganizmov odstrániť filtráciou, separáciou (napríklad centrifúgovaním) a/alebo dekantáciou z roztokov krokov a), b) alebo c) postupu podľa vynálezu. Je tiež možné, aby roztoky z krokov a), b) alebo c) bez separácie prítomných organizmov prechádzali priamo cez jednu alebo viacero iónoselektívnych membrán aplikovaním elektrického poľa.
Roztok získaný spracovaním membránovou elektrolýzou alebo elektrodialýzou možno po neutralizácii nakoncentrovať pomocou vhodnej odparky, napríklad odparky s klesajúcim filmom, odparky s tenkým filmom alebo rotačnej odparky. Také odparky vyrábajú napríklad firmy GIG (4800 Attnang Puchheim, Rakúsko), GEA Canzier (52303 Duren, Nemecko), Diessel (31103 Hildesheim, Nemecko) a Pitton (35274 Kirchhain, Nemecko).
Na zlepšenie farebných vlastností koncového produktu možno uskutočniť dodatočný krok filtrácie, pri ktorom sa do roztokov získaných počas postupu pridá troška aktívneho uhlia a táto suspenzia sa potom prefiltruje. Alternatívne možno roztoky získané počas fermentácie prefiltrovať cez malú vrstvu aktívneho uhlia. Použité množstvá aktívneho uhlia, ktoré sú na to potrebné, sú v rozmedzí niekoľkých hmotnostných percent roztoku a dokáže ich určiť odborník v danej oblasti na základe vedomostí a skúseností.
Tieto filtrácie možno zjednodušiť pridaním komerčného flokulačného činidla do príslušného roztoku pred filtráciou (napríklad Sedipur CF 902 alebo Sedipur CL 930 od BASF AG, Ludwigshafen).
Vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu sa fermentačný výstup (fermentačná zmes) sterilizuje zahrievaním a potom sa oddelí od bunkovej masy centrifugovaním, filtráciou alebo dekantáciou. Po pridaní 50 - 1000 mg/kg, s výhodou 100 - 200 mg/kg komerčne konvenčného flokulačného činidla vzhľadom na fermentačný výstup sa zmes prefiltruje cez malú vrstvu aktívneho uhlia a piesku, aby sa získal roztok bez biomasy s vysokým obsahom kyseliny D-pantoténovej. Tento spracovaný roztok sa potom nechá prejsť cez jednu alebo viacero iónovo selektívnych membrán aplikovaním elektrického poľa.
Tento roztok možno potom vysušiť, napríklad sušením rozprašovaním. Toto možno uskutočniť v súbežnom, protiprúdovom alebo zmiešanom toku. Na atomizáciu možno použiť všetky známe atomizátory, najmä centrifugálne atomizátory (atomizátorový disk), jednotekutinovú hubicu alebo dvojtekutinovú hubicu. Výhodné teplotné podmienky pri sušení sú 150 - 250 °C vstupná teplota veže a 70 - 130 °C výstupná teplota veže. Sušenie však možno uskutočniť aj pri vyšších alebo nižších teplotách. Aby sa dosiahla veľmi nízka zvyšková vlhkosť, v rámci ďalších krokov možno poskytnúť ďalší krok sušenia vo fluidnej vrstve.
Sušenie rozprašovaním možno uskutočniť aj v FSD alebo SBD sušičke (FSD: fluidized spray dryer; SBD: spray bed dryer), ktoré vyrábajú firmy Niro (Kodaň,
Dánsko) a APV-Anhydro (Kodaň, Dánsko), ktoré sú kombináciou rozprašovacej sušičky a fluidnej sušičky.
Pri sušení rozprašovaním možno pridať prostriedok proti spekaniu. Toto môže znížiť nanášanie materiálu na steny sušičky a zlepšiť správanie toku najmä v prípade jemnozrnných práškov. Prostriedky proti spekaniu, ktoré možno použiť, sú najmä silikáty, stearáty, fosfáty a kukuričný škrob.
Sušenie môže v zásade prebiehať aj v rozprašovanej fluidnej vrstve, kedy sušenie možno uskutočňovať nielen kontinuálne ale aj dávkovo. Roztok možno rozprašovať nielen zhora (horné rozprašovanie) a zospodu (dolné rozprašovanie), ale aj zboku (bočné rozprašovanie).
Predložený vynález sa ďalej týka kompozície na použitie ako krmivovej prísady a/alebo krmivového doplnku, kedy túto možno pripraviť nasledujúcimi krokmi:
a) použitie aspoň jedného organizmu, ktorý produkuje kyselinu Dpantoténovú a v ktorom je biosyntéza kyseliny pantoténovej (pan) a/alebo izoleucínu/valínu (ilv) deregulovaná a ktorý tvorí aspoň 2 g/l solí kyseliny Dpantoténovej fermentáciou v kultivačnom médiu, pričom sa do kultivačného média dodáva 0-20 g/l, s výhodou 0 g/l voľného β-alaninu a/alebo soli β-alanínu,
b) prechod fermentačného roztoku obsahujúceho D-pantotenát cez jednu alebo viacero iónovo selektívnych membrán aplikovaním elektrického poľa, pričom sa z roztoku obsahujúceho D-pantotenát odstraňujú nízkomolekulové ióny,
c) pridanie vápenatej bázy a/alebo horečnatej bázy, aby sa voľná kyselina D-pantoténová obsiahnutá v roztoku upravila na pH 3 - 10, pričom sa získa roztok, ktorý obsahuje pantotenát vápenatý a/alebo horečnatý, a
d) podrobenie roztoku obsahujúceho pantotenát vápenatý a/alebo pantotenát horečnatý sušeniu a/alebo formulácii.
Vo variante predloženého vynálezu sa kompozícia vyznačuje tým, že v kroku c) alebo d) sa získava alebo nanáša suspenzia, ktorá obsahuje pantotenát vápenatý a/alebo pantotenát horečnatý.
Podľa vynálezu sa kompozícia ďalej vyznačuje tým, že obsahuje soli kyseliny D-pantoténovej v koncentrácii najmenej 1-100 % hmotnostných, s výhodou najmenej 20 - 100 % hmotnostných a s osobitnou výhodou najmenej 50% hmotnostných. Predložený vynález sa týka kompozície, ktorá obsahuje soli kyseliny D-pantoténovej vo forme dvojmocných katiónov, s výhodou D-pantotenát vápenatý a/alebo horečnatý. Podľa vynálezu je výhodná kompozícia, ktorá sa vyznačuje tým, že obsah solí kyseliny D-pantoténovej vo forme jednomocných katiónov je < 1 g/kg.
Podľa vynálezu sa pomocou vyššie opísaného postupu získa D-pantotenát vápenatý alebo D-pantotenát horečnatý, ktorý vyhovuje požiadavkám na krmivové prísady. Tieto požiadavky sú napríklad pomerne vysoký obsah D-pantotenátu a vysoká kompatibilita s cieľovým organizmom a biologická hodnota v zmysle „vitamínovej aktivity“ produktu podľa vynálezu.
Predložený vynález bude teraz opísaný podrobnejšie na nasledujúcich príkladoch, ktoré však neobmedzujú rozsah vynálezu:
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1:
Do laboratórneho fermentora obsahujúcom miešadlo a zariadenie na prívod plynu s objemom 14 I sa dalo fermentačné médium s nasledujúcim zložením:
| Východisková látka | Koncentrácia [g/l] |
| Kvasnicový extrakt | 10 |
| Glutamát sodný | 5 |
| Síran amónny | 8 |
| Východisková látka | Koncentrácia [g/l] |
| Odpeňovač | 1 ml/l |
Po sterilizácii sa pridali nasledujúce sterilné zložky média:
| Východisková látka | Koncentrácia [g/l] |
| KH2PO4 | 10 |
| K2HPO4 | 20 |
| Glukóza | 2,5 |
| Chlorid vápenatý | 0,1 |
| Chlorid horečnatý | 1 |
| Citrát sodný | 0,1 |
| FeSO4 x 7H2O | 0,1 |
| Roztok stopových solí | 1 ml/l |
Roztok stopových solí má nasledujúce zloženie:
0,15 g Na2MoO4 · 2H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCI2· 6H2O, 0,25 g CuSO4 · 5H2O,
1,6 g MnCI2 · 4H2O, 0,3 g ZnSO4 · 7H2O sa doplní do 1 I vodou. Roztok stopových solí sa pridá sterilnou filtráciou. Počiatočný objem kvapaliny je 8,4 I. Vyššie uvedené obsahy sú založené na tejto hodnote.
Do tohto roztoku sa pridá 160 ml očkovacej kultúry (OD = 10 v médiu SVY (médium SVY: Difco Veal Infusion Broth 25 g, Difco Yeast Extract 5 g, glutamát sodný 5 g, 2,7 g (NH4)2SO4 v 740 ml H2O, sterilizovať; pridať 200 ml sterilného 1M K2HPO4 (pH 7) a 60 ml sterilného 50% glukózového roztoku (konečný objem 11)) Bacillus subtilis PA824 a fermentuje sa pri 43 °C pri intenzívnom miešaním s prietokom plynu 12 l/min. Tento kmeň je opísaný v súlade s prílohou v prihláške PCT/US 0025993.
V priebehu 52 h sa pridalo 6 I sterilného vodného roztoku. Zloženie bolo:
| Východisková látka | Koncentrácia [g/l] |
| Glukóza | 500 |
| Chlorid vápenatý | 0,6 |
| Roztok stopových solí | 7 ml/l |
Fermentácia sa uskutočňovala za glukózovo obmedzených podmienok. V priebehu fermentácie sa pH udržiavalo na hodnote 7,2 pridávaním 25 % roztoku amoniaku alebo 20 % kyseliny fosforečnej. Amoniak slúži súčasne ako zdroj dusíka pre fermentáciu. Rýchlosť rotácie miešacieho prvku sa regulovala tak, aby sa obsah rozpusteného kyslíka udržiaval na 30 % hodnoty nasýtenia. Penenie sa potláčalo príležitostným pridávaním odpeňovača. Po zastavení pridávania zdroja uhlíka fermentácia pokračovala, kým obsah rozpusteného kyslíka (pO2) nedosiahol hodnotu 95 % hodnoty nasýtenia. Fermentácia sa potom zastavila a organizmus sa termálne zničil. V rámci toho sa fermentačný roztok sterilizoval 60 min. Zničenie sa preukázalo kultiváciou. Bunky sa potom oddelili centrifugovaním. Po oddelení buniek je koncentrácia D-pantotenátu po 52 h 24,7 g/l.
Podobne možno pripraviť fermentačné zmesi, ktoré majú titre kyseliny pantoténovej bez prísunu β-alanínu vyššie ako 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 a > 90 g/l.
Fermentačný výstup, ktorý bol sterilizovaný zahrievaním, ako je opísané vyššie, a bol v podstate zbavený biomasy centrifugovaním, sa zmiešal s ďalšou kyselinou Dpantoténovou a pH sa potom upravilo na približne 2 pomocou kyseliny sírovej. Získaný roztok sa prefiltroval cez malú vrstvu piesku s aktívnym uhlím. Obsah kyseliny Dpantoténovej v tomto roztoku je 67,7 g/l.
900 g tohto filtrátu sa spracovalo elektrodialýzou nasledovne: v elektrodialyzačnej bunke (vybavenej anióno- a katiónovýmennými membránami (typy
Neosepta AMX Sb a CMX Sb, od firmy Tokuyama) s účinnou bunkovou plochou
1,85 dm2 a piatimi komorami sa filtrát odsolil pri počiatočnej prúdovej hustote 29 mA/cm2. Prúdová hustota v experimentálnom behu po dosiahnutí určeného limitného napätia 20 V kontinuálne klesala. Teplota bola od 33 °C do 40 °C. Ako nástrek koncentrátu sa použil 0,5 % (hmotnosť/hmotnosť) roztok NaCI. Tento koncentrát (CONC) sa v experimentálnom behu obohatil cudzími iómi (napr. amónnymi, chloridovými, železitými, draselnými, sodnými alebo fosforečnanovými iónmi) odstránenými z filtrátu (diluát, DIL). V elektrolytovom cykle sa na oplachovanie elektród použil 5 % (hmotnosť/hmotnosť) roztok síranu sodného. V experimentálnom behu sa pri rôznych hodnotách iónovej vodivosti roztoku diluátu odoberali vzorky z komory obsahujúcej diluát a analyzovali sa. Analýza je uvedená v nasledujúcej tabuľke a ukázala, že s postupujúcim časom experimentu boli tieto ióny odstránené z diluátu a vodivosť diluátu klesala zodpovedajúcim spôsobom. Malé jednomocné ióny, napríklad chloridové ióny, sa odstraňujú rýchlejšie ako objemné viacmocné ióny, napríklad fosforečná nové ióny.
Výsledky analýzy diluátu sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.
CN
| Na | 1 | 0,089% | 0,077% | 0,063% | 0,047% | 0,025% | 0,015% | 0.010% | |
| íb | |||||||||
| vp | θ' | s° θ' | θ' | sp θ' | SP θ' | T“ | |||
| CN | CN | CN | T— | V | o | o | |||
| O | O | O | o | o | o | o | o | ||
| O) | O | O | O | o | o | o | d | ô | |
| ZE | O | O | O | o | o | o | v | v | |
| θ' | ď' | Sp θ' | s° θ' | 9% | 8% | 6% | 9% | ||
| LO | o | co | CO | en | CO | V“ | o | ||
| xt | CO | CN | χ— | o | o | o | o | ||
| o' | o | O | o | o | o | o | ô | ||
| θ' | sp θ' | *p σ' | SP θ' | θ' | b0 θ' | b© θ' | b0 θ' | ||
| T- | T” | χ— | τ— | T“ | V“ | T“ | |||
| o | o | o | O | o | o | o | o | ||
| o | o | o | o | o | o | o | o | ||
| φ | o | o | o | o | o | o | o | o | |
| u. | v | v | v | v | v | v | v | v | |
| S? | |||||||||
| ď* | sp θ' | SP θ' | θ' | bc θ' | s° θ' | sp σ' | |||
| ω | LO | Ν' | co | CN | T” | V | o | ||
| o | O | O | o | O | o | o | o | ||
| CO | o | O | O | o | O | o | o | d | |
| O | o | d | o | o | O | o | o' | v | |
| sp θ' | |||||||||
| σ> | |||||||||
| *-» -CO | b- | ||||||||
| ω | d | C | sp θ' | SO θ' | s° θ' | SP σ' | sp σ' | bp θ' | |
| o | CO | co | CO | LO | CO | T“ | |||
| LL | CO | LO | LO | LO | M- | CO | CN | CN | |
| S | 1 O | O | o' | d | θ' | o | o' | d | o' |
| CO | |||||||||
| N | |||||||||
| >>, | |||||||||
| CO | |||||||||
| c | sp | SP | s° θ' | sp θ' | sp θ' | SP θ' | sp θ' | ||
| O b- | LO | en | CN | CO | Ό | t— | O | ||
| CO c | ô | en o o“ o | 0,6 | 0,4 | 0,3 | o | 0,0 | 0,0 | o v |
| ‘O | |||||||||
| 4—» | |||||||||
| CU u. | xO θ'· | ||||||||
| o O ro | nium | -0,40 | s° | s© θ' | SP θ' | sp θ' | sp θ' | sp θ' | b0 θ'* |
| >> | -O | io | CN | CO | CN | 00 | CO | CN | T— |
| c 'O | Am | CO o' | 0,2 | o' | τ- δ' | 0*0 | 0,0 | O CO | O o |
| < | b- | en | b- | T- | CM | en | CO | o | |
| H | r— | b- | r-T | o' | xfr | CO | en | LO | CO |
| Q. | en | CO | CO | b- | CO | b- | b- | b- | r'- |
| o | |||||||||
| ω | |||||||||
| c: | |||||||||
| en | LO | o | LO | o | o | ||||
| CM | CN | T~ | LO | CO | |||||
| 4—» 'CO | _J | _l | _J | _l | _j | _J | _J | ||
| -03 | Q | o | Q | O | Q | Q | Q | ||
| > | CO | co | CO | CO | CO | co | CD | ||
| o | en | en | en | en | en | σι | 03 | ||
| y— | χ— | T“ | V“ | V“ | |||||
| C/5 Λ | ro | δ | o | o | o | o | o | ||
| 35 E o o r~ — | 1/01 čm | 5 E o | 1/01 'cm | S E -P | 5 E | ° O | o T“ | ||
| o ω ί>£ | O E | 483 mS/ | 483 mS/ | S E | o- E | •sf E | 483 |
'CO >
O c
'Φ o
M—* c
CO
CiCC c
ω ω
II <
ΙΟ.
pH všetkých vzoriek diluátu bolo 2 - 3. 771 g výtoku diluátu obsahuje 76 g/í voľnej kyseliny D-pantoténovej.
Tu je ukázané, že roztok kyseliny D-pantoténovej získaný fermentáciou možno úspešne zbaviť interferujúcich katiónov elektrolýzou. Zo získanej odsolenej kyseliny Dpantoténovej možno pripraviť nehygroskopický práškový D-pantotenát vápenatý, ako je opísané v príklade 2.
Príklad 2:
Do laboratórneho fermentora obsahujúcom miešadlo a zariadenie na prívod plynu s objemom 14 I sa dalo fermentačné médium s nasledujúcim zložením:
| Východisková látka | Koncentrácia [g/l] |
| Kvasnicový extrakt | 10 |
| Glutamát sodný | 5 |
| Síran amónny | 8 |
| KH2PO4 | 8,4 |
| k2hpo4 | 15 |
Po sterilizácii sa pridali nasledujúce sterilné zložky média:
| Východisková látka | Koncentrácia [g/l] |
| Glukóza | 2,5 |
| Chlorid vápenatý | 0,1 |
| Chlorid horečnatý | 1 |
| Citrát sodný | 1 |
| FeSO4 · 7H2O | 0,01 |
| Roztok stopových solí | 1 ml |
Roztok stopových solí má nasledujúce zloženie:
0,15 g Na2MoO4 · 2H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCI2- 6H2O, 0,25 g CuSO4 · 5H2O,
1,6 g MnCI2 · 4H2O, 0,3 g ZnSO4 7H2O sa doplní do 1 I vodou. Roztok stopových solí sa pridá sterilnou filtráciou. Počiatočný objem kvapaliny je 5,5 I. Vyššie uvedené obsahy sú založené na tejto hodnote.
Do tohto roztoku sa pridá 55 ml očkovacej kultúry (OD = 10 v médiu SVY (médium SVY: Difco Veal Infusion Broth 25 g, Difco Yeast Extract 5 g, glutamát sodný 5 g, rozpustiť 2,7 g (NH4)2SO4 v 740 ml H2O, sterilizovať; pridať 200 ml sterilného 1M K2HPO4 (pH 7) a 60 ml sterilného 50 % glukózového roztoku (konečný objem 11)) Bacillus subtilis PA824 a fermentuje sa pri 43 °C pri intenzívnom miešaním s prietokom plynu 12 1/min. Tento kmeň je opísaný v súlade s prílohou v prihláške PCT/US 0025993.
V priebehu 48 h sa pridalo 6 I sterilného vodného roztoku. Zloženie bolo:
| Východisková látka | Koncentrácia [g/l] |
| Glukóza | 550 |
| Chlorid vápenatý | 0,6 |
| Roztok stopových solí | 6 ml |
Fermentácia sa uskutočňovala za glukózovo obmedzených podmienok. V priebehu fermentácie sa pH udržiavalo na hodnote 7,2 pridávaním 25 % roztoku amoniaku alebo 20 % kyseliny fosforečnej. Amoniak slúži súčasne ako zdroj dusíka pre fermentáciu. Rýchlosť rotácie miešacieho prvku sa regulovala tak, aby sa obsah rozpusteného kyslíka udržiaval na 30 % hodnoty nasýtenia. Penenie sa potláčalo príležitostným pridávaním odpeňovača. Po zastavení pridávania zdroja uhlíka fermentácia pokračovala, kým obsah rozpusteného kyslíka (pO2) nedosiahol hodnotu 95 % hodnoty nasýtenia. Fermentácia sa potom zastavila a organizmus sa termálne zničil. V rámci toho sa fermentačný roztok sterilizoval 30 min. Zničenie sa preukázalo kultiváciou. Bunky sa oddelili centrifúgovaním. Po oddelení buniek bola koncentrácia D-pantotenátu po 48 h 24,1 g/i.
Podobne možno pripraviť fermentačné zmesi, ktoré majú titre kyseliny pantoténovej bez prísunu β-alanínu vyššie ako 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 a > 90 g/l.
817 mi výstupu zfermentora sa zmiešalo s 1183 mi roztoku kyseliny pantoténovej s koncentráciou 178,9 g/l a neutralizovalo sa 25% roztoku hydroxidu amónneho (pH 6,5). Zmes sa potom prefiltrovala cez piesok s aktívnym uhlím. Obsah kyseliny D-pantoténovej vo filtráte bol 67 g/l, prevažne vo forme amónnej soli.
Približne 720 g tohto roztoku sa spracovalo elektrodialýzou podľa príkladu 1:
550 g výtoku diluátu (s hustotou 1,017 g/ml) sa upravilo na pH 7,5 pomocou 3,5 g 40 % suspenzie hydroxidu vápenatého. Získal sa vodný roztok D-pantotenátu vápenatého (551,03 g s obsahom D-pantotenátu vápenatého 40,9 g/l).
Vodný roztok pantotenátu vápenatého sa vysušil v laboratórnej rozprašovacej sušičke Niro Minor. Vstupná teplota veže bola približne 200 °C a výstupná teplota veže bola 90 °C. Atomizácia sa uskutočnila pomocou dvojtekutinovej hubice pri tlaku 2 bar. Ako práškovací prostriedok sa pridal Sipernat 22F. Získal sa práškový produkt nasledujúcej špecifikácie (čísla v hmotnostných percentách):
Obsah vody: 2,3 %
D-pantotenát vápenatý: 46,1 %
Amoniak: 0,60 %
Draslík: 0,47 %
Sodík: 1,1%
Príklad 3:
Vo fermentore obsahujúcom miešadlo a zariadenie na prívod plynu s kapacitou 200 litrov sa zmiešalo 800 g 50 % kvasnicového extraktu, 438 g glutamátu sodného, 3200 g sójovej múky, 640 g síranu amónneho, 800 g KH2PO4, 1 600 g K2HPO4 a 50 ml odpeňovača TegoKS so 70 I vody a zmes sa sterilizovala 30 min pri 121 °C.
Potom sa pridal roztok 1 a roztok 2.
Roztok 1 bol pripravený nasledovne: 1670 g glukózy · H2O, 10,2 g CaCI2 · 2H2O a 170,7 g MgCI2 · 6H2O sa rozpustia v 9 I vody a sterilizujú sa 30 min.
Roztok 2 sa pripraví nasledovne: 800 ml citrátovo-železnatého roztoku (200 g/l citrátu sodného, 2 g/l FeSO4 · 7H2O, sterilné prefiltrovaný) sa zmieša s 80 ml roztoku stopových solí (0,15 g Na2Mo04 · 2H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g CoCI2 · 6H2O, 0,25 g CuSO4 · 5H2O, 1,6 g MnCI2 · 4H2O, 0,3 g ZnSO4 · 7H2O sa doplnia do 1 I vodou a sterilné sa prefiltrujú).
Do tohto roztoku sa pridali 2 l očkovacej kultúry (OD = 10 v médiu SVY (médium SVY: Difco Veal Infusion Broth 25 g, Difco Yeast Extract 5 g, glutamát sodný 5 g, 2,7 g (NH4)2SO4 v 740 ml H2O, sterilizovať; pridať 200 ml sterilného 1M K2HPO4 (pH 7) a 60 ml sterilného 50% glukózového roztoku (konečný objem 11)) Bacillus subtilis PA668 a fermentoval sa pri 43 °C pri intenzívnom miešaním s prietokom plynu 3 m3/min. Tento kmeň je opísaný v súlade s prílohou v prihláške US č. 60/262,995.
V priebehu 48 h sa pridalo približne 10 I sterilného vodného roztoku glukózy. Roztok bol pripravený nasledovne: 90 kg glukózy · H2O sa zmiešalo s 55 kg vody a sterilizovalo sa 30 min. Potom sa pridalo 300 ml roztoku stopových solí (zloženie pozrite vyššie) a 3 I citrátovo-železnatého roztoku (zloženie pozrite vyššie). Potom sa pridal 1 I sterilné filtrovaného roztoku 90 g/l CaCI2 · 2H2O a 2 I sterilné filtrovaného roztoku 375 g/l glutamátu sodného.
Fermentácia sa uskutočňovala za glukózovo obmedzených podmienok. V priebehu fermentácie sa pH udržiavalo na hodnote 7,2 pridávaním 25 % roztoku amoniaku alebo 20 % kyseliny fosforečnej. Amoniak slúži súčasne ako zdroj dusíka pre fermentáciu. Rýchlosť rotácie miešacieho prvku sa regulovala tak, aby sa obsah rozpusteného kyslíka udržiaval na 30 % hodnoty nasýtenia. Penenie sa potláčalo príležitostným pridávaním odpeňovača. Po zastavení pridávania zdroja uhlíka fermentácia pokračovala, kým obsah rozpusteného kyslíka (pO2) nedosiahol hodnotu 95 % hodnoty nasýtenia. Fermentácia sa potom ukončila. Bunky sa oddelili separáciou na diskovom separátore. Bunky ostávajúce v supernatante sa termálne zničili sterilizáciou. Koncentrácia D-pantotenátu pri zastavení po 48 h bola 13,7 g/l. Po separácii a sterilizácii bola koncentrácia D-pantotenátu 10,7 g/l. Podobne možno pripraviť fermentačné zmesi, ktoré majú titre kyseliny pantoténovej bez prísunu β-alanínu vyššie ako 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 a vyššie ako 90 g/l.3 000 g takto predbežne spracovaného fermentačného roztoku bolo ďalej spracovaných nasledovne: dve tretiny dávky sa vyzrážali pri približne 10 °C množstvom CaCI2 zodpovedajúcim ekvivalentu koncentrácie viacmocných aniónov (40 % roztok); jedna tretina dávky sa podobne vyzrážala ekvivalentným množstvom Ca(OH)2 (tuhým). Roztoky sa uskladnili cez noc v chladničke a potom sa oddelili od vyzrážaného sedimentu pomocou tlakového filtra (hĺbkový filter Seitz 700). Roztoky sa potom zmiešali a zalkalizovali (pH = 8,7) pridaním ďalších 10 g Ca(OH)2 pri približne 10 °C a vyzrážali sa znova. Aj opakovane vyzrážaný sediment sa odfiltroval.
800 g roztoku sa potom podrobilo iónovej výmene pri 35 °C v trojokruhovom elektrodialyzačnom systéme. V tomto prípade fermentačný roztok prechádzal cez produktovú komoru ohraničenú dvoma katiónovýmennými membránami. Na katódovej strane monoselektívna katiónovýmenná membrána (Tokuyama Sóda, CMS) oddeľovala produkt od okruhu koncentrátu a na anódovej strane bola produktová komora oddelená od okruhu CaCI2 konvenčnou katiónovýmennou membránou (Tokuyama Sóda, CMX). Okruh koncentrátu a CaCI2 boli oddelené aniónovýmennou membránou (Tokuyama Sóda, AMX). Do koncentrátu sa dalo 750 g 0,5 % roztoku NaCl a do okruhu CaCI2 sa dalo 900 g 3,05% roztoku CaCI2. V okruhu oplachu elektród cirkuloval 0,1 molárny roztok Na2SO4. Experiment sa uskutočnil galvanostaticky pri 30 mA/cm2 v systéme pozostávajúcom z piatich zo základných jednotiek opísaných vyššie s celkovou plochou membrán 500 cm2 v dávkovom režime. Kritériom zvoleným na zastavenie bola minimálna vodivosť 4 mS/cm v okruhu CaCI2. Výsledky analýzy katiónov v okruhu produktu a koncentrátu sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.
| PTA [g/i] | Ca2+ | Na+ | K+ | nh4+ | |
| 5329/01/82 Produkt t = 0 | 9,27 | 0,24% | 0,15% | 0,65% | 0,24% |
| 5329/01/82 Produkt t = 0,83 h | 9,01 | 0,43% | 0,07% | 0,25% | 0,06% |
| 5329/01/82 Koncentrát t = 0 h | 0,0 | 0,0% | 0,2% | 0,0% | 0,0% |
| PTA [g/i] | Ca2+ | Na+ | K+ | nh4+ | |
| 5329/01/82 Koncentrát t = 0,83 h | 0,015 | 0,02% | 0,47% | 0,71% | 0,29% |
Z tohto sa vypočítajú ochudobnenia 51 % pre sodík, 66 % pre amoniak a 61 % pre draslík. Stredný aktuálny výťažok bol 82 %. Strata kyseliny pantoténovej v dvoch susedných okruhoch bola v každom prípade 0,08 % z množstva použitej látky. pH produktového okruhu bolo počas experimentu 7 - 7,5 a v okruhu koncentrátu a CaCI2 bolo približne pH = 6. Celkový potenciálový rozdiel stúpal v priebehu experimentu v súlade s klesajúcou vodivosťou v okruhu CaCI2 z približne 11 na 16 V.
Takto elektrodialyticky spracovaný roztok sa potom úspešne vysušil rozprašovaním, čím sa získal koncový produkt. Je tu ukázané, že v prípade vhodného predbežného spracovania možno použiť trojokruhovú dialýzu s použitím monoselektívnej kaitónovýmennej membrány na iónovú výmenu jednomocných katiónov oproti dvojmocným katiónom na zlepšenie možnosti sušiť koncový produkt rozprašovaním.
Claims (26)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Postup na prípravu kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí, vyznačujúci sa tým, že zahŕňaa) použitie aspoň jedného organizmu, ktorý produkuje kyselinu D-pantoténovú a v ktorom je biosyntéza kyseliny pantoténovej (pan) a/alebo izoleucínu/valínu (ilv) deregulovaná a ktorý tvorí aspoň 2 g/l solí kyseliny D-pantoténovej fermentáciou v kultivačnom médiu, pričom sa do kultivačného média dodáva 0-20 g/l voľného βalanínu a/alebo soli β-alanínu,b) prechod fermentačného roztoku obsahujúceho D-pantotenát cez jednu alebo viacero iónovo selektívnych membrán aplikovaním elektrického poľa, pričom sa z roztoku obsahujúceho D-pantotenát odstraňujú nízkomolekulové ióny,c) pridanie vápenatej bázy a/alebo horečnatej bázy, aby sa voľná kyselina Dpantoténová obsiahnutá v roztoku upravila na pH 3 - 10, pričom sa získa roztok, ktorý obsahuje pantotenát vápenatý a/alebo horečnatý, ad) podrobenie roztoku obsahujúceho pantotenát vápenatý a/alebo pantotenát horečnatý sušeniu a/alebo formulácii.
- 2. Postup podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že do kultivačného média sa nedodáva žiadny voľný β-alanín a/alebo soľ β-alanínu.
- 3. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 a 2, vyznačujúci sa tým, že použitým organizmom produkujúcim kyselinu D-pantoténovú je baktéria, kvasinka alebo pleseň.
- 4. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že použitým mikroorganizmom je baktéria z čeľade Bacillaceae.
- 5. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že sa používa baktéria rodu Bacillus a s výhodou druhy B. subtils, B. licheniformis alebo B. amyloliquefaciens.
- 6. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že v kroku a) sa vytvorí obsah kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí najmenej 10 g/l kultivačného média, s výhodou najmenej 20 g/l, s osobitnou výhodou najmenej 40 g/l a s najväčšou výhodou najmenej 60 g/l kultivačného média.
- 7. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že v kroku c) sa pH roztoku nastaví na 5 - 10.
- 8. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že v kroku c) sa pH roztoku nastaví na 5 - 9, s výhodou 6 - 9 a s osobitnou výhodou 6-8.
- 9. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že v kroku b) sa používajú monopolárne a/alebo bipolárne iónovýmenné membrány.
- 10. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že v kroku b) sa používajú monopolárne iónovýmenné membrány.
- 11. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že v kroku b) sa používajú monoselektívne iónovýmenné membrány.
- 12. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11, vyznačujúci sa tým, že pH fermentačného roztoku obsahujúceho kyselinu D-pantoténovú je pred spracovaním v kroku b) nastavený na izoelektrické pH kyseliny D-pantoténovej.
- 13. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa tým, že v kroku b) sa pre monopolárne iónovýmenné membrány nastavia prúdové hustoty 1-100 mA/cm2, s výhodou 10-80 mA/cm2 a s osobitnou výhodou 20 - 40 mA/cm2.
- 14. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 13, vyznačujúci sa tým, že v kroku b) sa pre bipolárne iónovýmenné membrány nastavia prúdové hustoty 1-150 mA/cm2, s výhodou 30- 100 mA/cm2 a s osobitnou výhodou 70 - 90 mA/cm2.
- 15. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 14, vyznačujúci sa tým, že v kroku b) je obsah jednomocných katiónov, s výhodou amónnych, draselných a/alebo sodných iónov, znížený na koncentráciu < 1 g/kg roztoku.
- 16. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15, vyznačujúci sa tým, že pri neutralizácii sa do roztoku v kroku c) pridáva hydroxid vápenatý, uhličitan vápenatý, oxid vápenatý, hydroxid horečnatý a/alebo bázický uhličitan horečnatý vo forme tuhej látky a/alebo ako vodná suspenzia.
- 17. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16, vyznačujúci sa tým, že do roztoku sa v kroku c) pridá vodná suspenzia obsahujúca 2-55 % hmotnostných, s výhodou 10- 50 % hmotnostných a s osobitnou výhodou 20 - 40 % hmotnostných hydroxidu vápenatého.
- 18. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 17, vyznačujúci sa tým, že do roztoku sa v kroku c) pridá vodná suspenzia obsahujúca 2-65 % hmotnostných, s výhodou 10- 50 % hmotnostných a s osobitnou výhodou 20 - 40 % hmotnostných uhličitanu vápenatého.
- 19. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 18, vyznačujúci sa tým, že do roztoku sa v kroku c) pridá vodná suspenzia obsahujúca 20 - 60 % hmotnostných, s výhodou 10-50 % hmotnostných a s osobitnou výhodou 20 - 40 % hmotnostných hydroxidu horečnatého.
- 20. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 19, vyznačujúci sa tým, že do roztoku sa v kroku c) pridá vodná suspenzia obsahujúca 2-25 % hmotnostných, s výhodou 10- 20 % hmotnostných bázického uhličitanu horečnatého.
- 21. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 20, vyznačujúci sa tým, že v kroku c) alebo d) získava alebo nanáša suspenzia, ktorá obsahuje pantotenát vápenatý a/alebo pantotenát horečnatý.
- 22. Kompozícia na použitie ako krmivová prísada a/alebo krmivový doplnok, vyznačujúca sa tým, že ju možno pripraviť nasledujúcimi krokmi:a) použitie aspoň jedného organizmu, ktorý produkuje kyselinu D-pantoténovú a v ktorom je biosyntéza kyseliny pantoténovej (pan) a/alebo izoleucínu/valínu (ilv) deregulovaná a ktorý tvorí aspoň 2 g/l solí kyseliny D-pantoténovej fermentáciou v kultivačnom médiu, pričom sa do kultivačného média dodáva 0-20 g/l, s výhodou 0 g/l voľného β-alanínu a/alebo soli β-alanínu,b) prechod fermentačného roztoku obsahujúceho D-pantotenát cez jednu alebo viacero iónovo selektívnych membrán aplikovaním elektrického poľa, pričom sa z roztoku obsahujúceho D-pantotenát odstraňujú nízkomolekulové ióny,c) pridanie vápenatej bázy a/alebo horečnatej bázy, aby sa voľná kyselina Dpantoténová obsiahnutá v roztoku upravila na pH 3 - 10, pričom sa získa roztok, ktorý obsahuje pantotenát vápenatý a/alebo horečnatý, ad) podrobenie roztoku obsahujúceho pantotenát vápenatý a/alebo pantotenát horečnatý sušeniu a/alebo formulácii.
- 23. Kompozícia podľa nároku 22, vyznačujúca sa tým, že v kroku c) alebo d) získava alebo je prítomná suspenzia, ktorá obsahuje pantotenát vápenatý a/alebo pantotenát horečnatý.
- 24. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 22 a 23, vyznačujúca sa tým, že obsahuje soli kyseliny D-pantoténovej vo forme dvojmocných katiónov, s výhodou Dpantotenát vápenatý a/alebo D-pantotenát horečnatý.
- 25. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 22 až 24, vyznačujúca sa tým, že obsahuje soli kyseliny D-pantoténovej v koncentrácii najmenej 1 - 100% hmotnostných, s výhodou najmenej 20 - 100 % hmotnostných a s osobitnou výhodou najmenej 50 % hmotnostných.
- 26. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 22 až 25, vyznačujúca sa tým, že obsah solí kyseliny D-pantoténovej vo forme jednomocných katiónov je < 1 g/kg.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10108223A DE10108223A1 (de) | 2001-02-21 | 2001-02-21 | Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln |
| PCT/EP2002/001766 WO2002066666A2 (de) | 2001-02-21 | 2002-02-20 | Verfahren zur herstellung von d-pantothensäure und/oder deren salze als zusatz zu tierfuttermitteln |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK10452003A3 true SK10452003A3 (sk) | 2004-02-03 |
Family
ID=7674921
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1045-2003A SK10452003A3 (sk) | 2001-02-21 | 2002-02-20 | Príprava kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí ako prísad do krmív |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7824891B2 (sk) |
| EP (1) | EP1362118B1 (sk) |
| JP (1) | JP2004531236A (sk) |
| KR (1) | KR20030075204A (sk) |
| CN (1) | CN1294273C (sk) |
| AT (1) | ATE342372T1 (sk) |
| AU (1) | AU2002250978B2 (sk) |
| BR (1) | BR0207474A (sk) |
| CA (1) | CA2438949A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ20032223A3 (sk) |
| DE (2) | DE10108223A1 (sk) |
| EE (1) | EE200300406A (sk) |
| ES (1) | ES2274967T3 (sk) |
| HU (1) | HUP0303304A3 (sk) |
| IL (1) | IL157496A0 (sk) |
| IN (1) | IN2003CH01315A (sk) |
| MX (1) | MX240870B (sk) |
| NO (1) | NO20033707L (sk) |
| PL (1) | PL363989A1 (sk) |
| RU (1) | RU2292397C2 (sk) |
| SK (1) | SK10452003A3 (sk) |
| UA (1) | UA77669C2 (sk) |
| WO (1) | WO2002066666A2 (sk) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10108225A1 (de) | 2001-02-21 | 2002-10-10 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln |
| DE10344200A1 (de) * | 2003-09-22 | 2005-05-04 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement |
| DE202017007249U1 (de) * | 2016-03-07 | 2020-04-23 | Glycom A/S | Abtrennung von Oligosacchariden aus der Fermentationsbrühe |
| WO2019058377A1 (en) * | 2017-09-19 | 2019-03-28 | Evogene Ltd. | BACTERIAL GENES AND ISOLATES FOR CONFINING INSECT RESISTANCE |
| CN111621541A (zh) * | 2019-02-27 | 2020-09-04 | 上海艾美晶生物科技有限公司 | 使用电渗析技术拆分光学异构体的方法 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB562267A (en) | 1941-08-08 | 1944-06-26 | Hoffmann La Roche | Process for the manufacture of a crystallised, non-hygroscopic calcium salt of d-pantothenic acid |
| EP0493060A3 (en) * | 1990-12-25 | 1993-04-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production method of d-pantothenic acid and plasmids and microorganisms thereof |
| JP3710497B2 (ja) * | 1992-09-25 | 2005-10-26 | ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト | Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法 |
| PT822989E (pt) * | 1995-04-21 | 2001-07-31 | Basf Ag | Processo para a producao de d-pantotenato de calcio |
| SK284235B6 (en) | 1997-10-04 | 2004-11-03 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in the said method |
| AT407050B (de) | 1997-12-29 | 2000-11-27 | Chemie Linz Gmbh | Verfahren zur herstellung von l-asparaginsäure |
| US6110342A (en) * | 1998-07-21 | 2000-08-29 | Archer Daniels Midland Company | Process for production of amino acid hydrochloride and caustic via electrodialysis water splitting |
| DE19855313A1 (de) | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen |
| DK1050219T3 (da) | 1999-05-05 | 2003-03-17 | Degussa | Foderstofadditiver indeholdende D-pantothensyre og/eller salte deraf og fremgangsmåder til fremstilling deraf |
| AU7708700A (en) | 1999-09-21 | 2001-04-24 | Basf Aktiengesellschaft | Methods and microorganisms for production of panto-compounds |
| US8232081B2 (en) * | 1999-09-21 | 2012-07-31 | Basf Se | Methods and microorganisms for production of panto-compounds |
| FR2799754A1 (fr) * | 1999-10-18 | 2001-04-20 | Roquette Freres | Procede de separation et de purification d'acide lactique a partir d'un milieu de fermentation |
| DE10021515A1 (de) * | 2000-05-03 | 2001-11-08 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von Erdalkalisalzen der D-Pantothensäure |
| CA2422817A1 (en) | 2000-09-20 | 2003-03-19 | Basf Aktiengesellschaft | Animal feed supplement containing d-pantothenic acid and/or its salts, improved method for the production thereof, and its use |
| PL373006A1 (en) | 2001-01-19 | 2005-08-08 | Basf Aktiengesellschaft | Processes for enhanced production of pantothenate |
| HU227432B1 (hu) | 2001-01-19 | 2011-06-28 | Basf Ag | Mikroorganizmusok és eljárások pantotenát fokozott termelésére |
-
2001
- 2001-02-21 DE DE10108223A patent/DE10108223A1/de not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-02-20 AU AU2002250978A patent/AU2002250978B2/en not_active Ceased
- 2002-02-20 IL IL15749602A patent/IL157496A0/xx unknown
- 2002-02-20 CA CA002438949A patent/CA2438949A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-20 EP EP02719874A patent/EP1362118B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-20 HU HU0303304A patent/HUP0303304A3/hu unknown
- 2002-02-20 WO PCT/EP2002/001766 patent/WO2002066666A2/de active IP Right Grant
- 2002-02-20 KR KR20037010981A patent/KR20030075204A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-02-20 US US10/468,610 patent/US7824891B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-20 CN CNB028053303A patent/CN1294273C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-20 SK SK1045-2003A patent/SK10452003A3/sk not_active Application Discontinuation
- 2002-02-20 BR BR0207474-5A patent/BR0207474A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-02-20 ES ES02719874T patent/ES2274967T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-20 UA UA2003098597A patent/UA77669C2/uk unknown
- 2002-02-20 EE EEP200300406A patent/EE200300406A/xx unknown
- 2002-02-20 DE DE50208413T patent/DE50208413D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-20 PL PL02363989A patent/PL363989A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-02-20 RU RU2003128534/13A patent/RU2292397C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-02-20 CZ CZ20032223A patent/CZ20032223A3/cs unknown
- 2002-02-20 AT AT02719874T patent/ATE342372T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-02-20 JP JP2002566370A patent/JP2004531236A/ja active Pending
- 2002-02-20 MX MXPA03007383 patent/MX240870B/es active IP Right Grant
-
2003
- 2003-08-20 NO NO20033707A patent/NO20033707L/no not_active Application Discontinuation
- 2003-08-21 IN IN1315CH2003 patent/IN2003CH01315A/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1492935A (zh) | 2004-04-28 |
| NO20033707D0 (no) | 2003-08-20 |
| DE10108223A1 (de) | 2002-10-10 |
| JP2004531236A (ja) | 2004-10-14 |
| RU2292397C2 (ru) | 2007-01-27 |
| CZ20032223A3 (cs) | 2003-11-12 |
| CA2438949A1 (en) | 2002-08-29 |
| IN2003CH01315A (en) | 2005-11-25 |
| MXPA03007383A (es) | 2004-03-16 |
| US7824891B2 (en) | 2010-11-02 |
| NO20033707L (no) | 2003-10-20 |
| ATE342372T1 (de) | 2006-11-15 |
| EP1362118A2 (de) | 2003-11-19 |
| HUP0303304A2 (hu) | 2004-01-28 |
| HUP0303304A3 (en) | 2007-09-28 |
| IL157496A0 (en) | 2004-03-28 |
| CN1294273C (zh) | 2007-01-10 |
| US20040072306A1 (en) | 2004-04-15 |
| UA77669C2 (en) | 2007-01-15 |
| RU2003128534A (ru) | 2005-04-10 |
| DE50208413D1 (de) | 2006-11-23 |
| WO2002066666A2 (de) | 2002-08-29 |
| EP1362118B1 (de) | 2006-10-11 |
| ES2274967T3 (es) | 2007-06-01 |
| KR20030075204A (ko) | 2003-09-22 |
| BR0207474A (pt) | 2004-03-02 |
| MX240870B (es) | 2006-10-09 |
| PL363989A1 (en) | 2004-11-29 |
| AU2002250978B2 (en) | 2007-03-01 |
| WO2002066666A3 (de) | 2003-07-17 |
| EE200300406A (et) | 2003-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7824891B2 (en) | Method for producing D-pantothenic acid and/or salts thereof via purification by electrodialysis as an additive for animal feed | |
| KR20030038751A (ko) | Ｄ-판토텐산 또는 그의 염을 포함하는 동물 사료 보충물,그의 개선된 제조 방법 및 그의 용도 | |
| US7781192B2 (en) | Method for producing D-pantothenic acid and/or a salt thereof via purification by cation exchange as additive for animal food | |
| SK10432003A3 (sk) | Príprava kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí ako prísad do krmív | |
| US7727748B2 (en) | Method for producing D-pantothenic acid and/or salts thereof via purification by anion exchange as an additive for animal feed | |
| JP2004529632A (ja) | パントテン酸塩の改良された製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FC9A | Refused patent application |