KR20030075204A

KR20030075204A - 동물 사료 첨가제로서의 ｄ-판토텐산 및(또는) 그의 염의제조 방법

Info

Publication number: KR20030075204A
Application number: KR20037010981A
Authority: KR
Inventors: 카이-우베 발데니우스; 크리스틴 벡; 안드레아스 피셔; 한스-페터 하르쯔; 마르쿠스 로샤이트; 마르틴 레만
Original assignee: 바스프 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2001-02-21
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2003-09-22
Also published as: CN1492935A; NO20033707D0; DE10108223A1; JP2004531236A; RU2292397C2; CZ20032223A3; CA2438949A1; IN2003CH01315A; MXPA03007383A; US7824891B2; NO20033707L; ATE342372T1; EP1362118A2; HUP0303304A2; HUP0303304A3; IL157496A0; CN1294273C; US20040072306A1; UA77669C2; RU2003128534A

Abstract

본 발명은 D-판토텐산 및(또는) 그의 염의 개선된 제조 방법 및 동물 사료 첨가제로서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

동물 사료 첨가제로서의 Ｄ-판토텐산 및(또는) 그의 염의 제조 방법 {Method for Producing D-Pantothenic Acid and/or Salts Thereof as an Additive for Animal Feed}

p-판토테네이트는 보조효소 A의 생합성의 출발 물질로서 식물 및 동물계에 널리 분포되어 있다. 식사를 통해 충분한 양의 판토텐산을 소모하는 인간과는 달리, 식물 뿐만 아니라 동물에서는 D-판토테네이트 결핍 증상이 종종 나타난다. 따라서, D-판토테네이트의 이용가능성은 특히 동물 사료 산업에서 경제적으로 매우 중요하다.

통상적으로, D-판토테네이트는 D-판토락톤과 칼슘 β-알라니네이트의 화학 합성에 의해 제조된다 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 제6판 1999년, 전자 발간, “비타민” 장]. D-판토락톤의 제조는 부분입체이성질체 염을 거쳐 복잡하고 전통적인 라세미체 분해를 필요로 한다. 화학 합성으로부터 생성된 시판 제품은 보통 D-판토텐산의 칼슘 염인 칼슘 D-판토테네이트이다.

화학 합성에 비하여, 미생물을 사용하는 생물공학적 제조 방법의 장점은, 고등 생물을 위해 사용될 수 있는 판토텐산의 D 형태를 선택적으로 (거울상이성질적으로 순수하게) 제조하는 것이다. 따라서, 화학 합성에서 요구되는 복잡한 라세미체 분해는 필요하지 않다.

미생물을 사용하여 D-판토텐산을 제조하기 위한 다수의 발효 방법이 예를 들어 EP 0 590 857, WO 96/33283, US 6,013,492, WO 97/10340, DE 198 46 499, EP 1 001 027, EP 1 006 189, EP 1 006 192 및 EP 1 006 193에 공지되어 있다.

즉, EP 1 006 189 및 EP 1 001 027호는, 발효 용액 중에 많아야 1 g/L의 D-판토텐산 함량이 달성되는 판토테네이트의 제조 방법을 기재하고 있다. 그러나, 발효 용액 중에서 이러한 낮은 판토텐산 함량, 다시 말해서 고체 함량을 기준으로 하여 10 중량％ 미만의 함량은, D-판토텐산-함유 동물 사료 보조제를 경제적으로 제조하기에는 부적절하다. 지금까지 알려진 방법들의 다른 단점은, 발효 배지로부터의 생성물 단리 단계가 다수의 복잡한 후처리 단계를 필요로 한다는 것이다. 산업적인 규모의 경제적인 제조 방법은 알려져 있지 않다.

독일 특허공개 DE 100 16 321호는 D-판토텐산-함유 동물 사료 보조제를 제조하기 위한 발효 방법을 기재하고 있다. 그러나, 이 방법의 중요한 단점은, 상기 기재된 D-판토텐산을 제조하기 위한 발효 방법에서와 같이, 원하는 생성물을 경제적인 수율로 수득하기 위해서는 판토텐산 전구체 β-알라닌을 발효 배지를 통해 미생물에 보충해야 한다는 것이다.

또한, US 6,013,492호 및 WO 96/332839호는, 배양 배지로부터 불용성 성분들 (예를 들어, 세포 물질)을 여과해 내고, 여액을 활성탄에 흡착시키고, 이어서 D-판토텐산을 유기 용매, 바람직하게는 메탄올로 용출시키고, 수산화칼슘으로 중화시킨다음 칼슘 D-판토테네이트를 결정화함으로써 발효 용액으로부터 D-판토텐산을 후처리하는 것을 기재하고 있다. 중요한 단점들은, 결정화 동안에 발생되는 주요 생성물이 소실되고, 생성물로부터 제거하기 곤란한 유기 용매가 사용되고, 복잡한 용매 회수 단계가 필요하다는 것이다.

EP 0 590 857호는, 미생물의 배양이 β-알라닌의 공급을 필요로 하는, D-판토텐산의 제조를 위한 발효 방법을 기재하고 있다. 생체물질을 분리해내기 위해 발효 용액을 여과한 다음, 양이온 교환기에 이어서 음이온 교환기를 통해 통과시키고, 이어서 수산화칼슘으로 중화시키고, 증발에 의해 농축시키고, 활성탄을 첨가하고, 한번 이상 여과하고 메탄올 및 염화칼슘을 첨가하여 결정화한다. 생성된 칼슘 판토테네이트-함유 생성물은 칼슘 염 형태의 D-판토텐산에 추가로 염화칼슘을 1:1의 몰비로 함유한다. 염화칼슘 함량의 저하는 전기투석과 이후의 분무 건조를 필요로 한다. 이러한 방법은 다수의 복잡한 단계들과 유기 용매의 사용으로 인해 경제적으로나 생태학적으로나 단점을 갖는다.

본 발명의 목적은, 상기 언급된 단점들을 갖지 않는 D-판토텐산 및(또는) 그의 염의 개선된 제조 방법에 의하여 D-판토텐산 및(또는) 그의 염을 함유하는 동물 사료 보조제 및 그의 제조 방법을 제공하는데 있다. 경제적인 이유에서, β-알라닌의 공급량을 크게 감소시키거나, β-알라닌의 공급이 전혀 필요하지 않은 방법이 바람직하다. 또한, 2가 염이 판토텐산의 1가 염에 비해 낮은 흡습성 특징을 가지므로 추가의 용도, 예를 들어 동물 사료 보조제를 위하여 응집되는 경향이 훨씬 낮기 때문에 2가 염 형태, 특히 알칼리 토금속 염 형태의 D-판토텐산을 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명자들은, 본 발명에 의해 이러한 목적이 유리하게 달성된다는 것을 알아내었다.

본 발명은

a) D-판토텐산을 생성하고 판토텐산 (pan) 및(또는) 이소루이신/발린 (ilv)의 생합성이 탈조절 (deregulation)되어 있는 하나 이상의 유기체를 0 내지 20 g/L의 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 공급한 배양 배지 중에서 발효시켜, 배양 배지에 2 g/L 이상의 D-판토텐산 염을 형성하는 단계,

b) D-판토테네이트-함유 발효 용액을 전기장을 인가한 하나 이상의 이온-선택 막(들)에 통과시켜, D-판토테네이트-함유 용액으로부터 저분자량의 이온을 제거하는 단계,

c) 칼슘 염기 및(또는) 마그네슘 염기를 첨가하여 유리 D-판토텐산-함유 용액의 pH를 5 내지 10으로 설정하고, 칼슘 판토테네이트 및(또는) 마그네슘 판토테네이트를 함유하는 용액을 수득하는 단계 및

d) 칼슘 판토테네이트- 및(또는) 마그네슘 판토테네이트-함유 용액을 건조 및(또는) 제형화하는 단계

를 포함하는, D-판토텐산 및(또는) 그의 염의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법의 변형법에서는, 단계 c) 또는 d)에서 칼슘 판토테네이트 및(또는) 마그네슘 판토테네이트를 함유하는 현탁액을 수득하거나 충진한다.

추가로, 본 발명의 방법의 단계 a)에서 수행하는 발효는 회분식, 유가배양식(fed-batch) 또는 반복 유가배양식으로 공지된 절차를 사용하거나 연속적으로 수행될 수 있다. 이러한 경우에, 생성된 판토텐산은 통상적인 완충 시스템, 예를 들어 NaOH, KOH 또는 암모니아를 함유하는 포스페이트 완충액을 사용하여 중화된다.

본 발명의 방법의 다른 변형법에서는, 단계 a)에서 발효에 의해 배양 배지 1 L 당 D-판토텐산의 염이 10 g 이상, 바람직하게는 20 g 이상, 특히 바람직하게는 40 g 이상, 매우 특히 바람직하게는 60 g 이상, 특히 70 g/L 이상으로 형성된다.

본 발명의 목적상, 용어 "생성하는"의 형태는, 유기체가 그 자체의 대사 필요량에 요구되는 것 보다 더 많은 양의 D-판토텐산 및(또는) 그의 염을 합성할 수 있음을 의미하는 것이다. 본 발명의 유리한 변형법에서, D-판토텐산 및(또는) 그의 염의 합성량이 세포의 내부에 존재하지 않고 유기체에 의해 배양 배지 내로 완전히 방출되는 것이 이상적이다. 이러한 방출은 그 자체로 공지된 메카니즘에 의하여 능동적이거나 수동적일 수 있다.

본 발명에 따르면, 사용되는 D-판토텐산-생성 유기체는 미생물이다. 본 발명에 있어서, 이것은 진균, 효모 및(또는) 세균을 포함한다. 본 발명에 따르면, 진균, 예를 들어 털곰팡이 (mucor) 또는 효모, 예를 들어 사카로마이세스 (Saccharomyces) 또는 데바로마이세스 (Debaromyces)를 사용하는 것이 바람직하며, 이들 중에서 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 바람직하다. 본 발명에 따르면, 유리하게는 코리네형 세균 또는 바실라시애 (Bacillaceae)가 사용된다. 본 발명의 범위내에 있는 미생물은 바람직하게는 예를 들어 코리네박테리움 (Corynebacterium), 에쉐리히아 (Escherichia), 바실러스 (Bacillus), 아르트로박터 (Arthrobacter), 베비박테리움 (Bevibacterium), 슈도모나스 (Pseudomonas), 살모넬라 (Salmonella), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 액시네토박터 (Acinetobacter) 또는 리조비움 (Rhizobium) 속의 세균이다. 여기에서 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 브레비박테리움 브레브 (Brevibacterium breve) 또는 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스 (B. licheniformis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), 바실러스 세레우스 (B. cereus), 바실러스 렌티모르부스 (B. lentimorbus), 바실러스 렌투스 (B. lentus), 바실러스 피르무스 (B. firmus), 바실러스 판토텐티쿠스 (B. pantothenticus), 바실러스 서큘란스 (B. circulans), 바실러스 코아귤란스 (B. coagulans), 바실러스 메가테리움 (B. megaterium), 바실러스 푸밀루스 (B. pumilus), 바실러스 투린기엔시스 (B. thuringiensis), 바실러스 브레비스 (B. brevis), 바실러스 스테아로서모필루스 (B. stearothermophilus) 및 그들의 16sRNA를 특징으로 하는 군 1의 기타 바실러스 종, 또는 액티눔 마이세탈리스 (Actinum mycetalis)가 특히 바람직하다. 이러한 목록은 설명을 위한 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하지 않는다.

또한, 본 발명은 유리 D-판토텐산 및(또는) 그들의 염을 함유하는 동물 사료 보조제의 제조에 있어서 유전적으로 변형된 유기체의 용도를 포함한다. 이러한 유전적으로 변형된 유기체는 예를 들어 화학적 돌연변이유발에 이어서 적절한 "스크리닝 공정"을 사용하여 선별함으로써 단리될 수 있다. 본 발명에 따르면, "생산 균주"라고 불리는 것은 본 발명의 의미에서 생성물을 제조하기 위해 적절하고 대사유동에 있어서 D-판토텐산 방향으로의 유전적인 변형을 갖는 것을 포함하며, 또한 세포막을 통해 D-판토텐산 및(또는) 그의 염을 방출하는데 있어서의 변형도 포함된다. 이것은 예를 들어, 사용되는 유기체의 관련된 대사 생합성 경로에 있어서, 주요 위치에서의 변형에 의해 달성될 수 있다.

또한, 원하는 생성물의 합성에 필요하거나 요구될 수 있는 동종 및(또는) 이종 뉴클레오티드 서열을 전달하여 생성된 트렌스제닉 유기체를 사용하는 것도 생각할 수 있다. 이러한 경우에, 게놈에서 및(또는) 벡터상에서 국소화된 하나 이상의 유전자를 개별적으로 및(또는) 조합적으로 과다발현 및(또는) 탈조절하는 것을 생각할 수 있다. 유리하게는, 이러한 유형의 트렌스제닉 유기체가, panB, panC, panD, panE 및(또는) 이들의 조합 및(또는) panBCD 오페론을 함유하는 조직화 단위로 구성된 군에서 선택되는 추가의 복제물 및(또는) 유전적으로 변형된 유전자를 함유할 수 있다. 또한, 예를 들어 EP 1 006 189호, EP 1 006 192호, EP 1 006 193호 또는 E 1 001 027호에 기재된 바와 같이, 다른 대사 경로, 예를 들어 이소루이신-발린 생합성 경로가 유기체에서 유리하게 조작될 수 있다. 그 결과, 판토텐산 생합성의 분지쇄 전구체 물질이 더욱 많이 이용가능하게 된다. 적절하다면, 이러한 생합성 경로를 위한 유전자, 다시 말해서 ilvB, ilvN, ilvC 및(또는) ilvD가 과다발현되는 것이 유리하다. 또한, 사용되는 D-판토텐산-생성 유기체에서 예를 들어 과다발현 및(또는) 탈조절을 통한 아스파테이트 α-데카르복실라제 (panD)의 유전적 변형도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 목적상, 용어 "탈조절"이란, 미생물에서 효소의 활성이 변화되거나 변형되도록, 생합성 대사 경로에서 하나의 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 변화시키거나 변형시키는 것을 의미한다. 유전자 생성물이 증가된 양으로 형성되거나 또는 증가된 활성을 갖게 되는 방식으로, 생합성 대사 경로의 하나의 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 변화시키는 것이 바람직하다. 용어 "탈조절된 대사 경로"는, 하나 이상의 효소의 활성이 변화되거나 변형되는 방식으로, 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자가 변화되거나 변형되어진 생합성 대사 경로를 포함한다. 변화 또는 변형은 내인성 프로모터 또는 조절 요소의 제거; 강력한 프로모터, 유도가능한 프로모터 또는 복수개의 프로모터들의 동시 도입; 유전자 생성물의 발현이 변화되도록 하는, 조절 서열의 제거; 유전자의 염색체 위치 변화; 유전자에 근접하거나 유전자 내에 있는 DNA 서열, 예를 들어 리보좀 결합 부위 (RBS)의 변화; 게놈 내의 유전자 복제 수 증가 또는 다양한 수의 플라스미드 복제물의 도입; 유전자 생성물을 수득하기 위한 유전자의 전사 및(또는) 번역에서 중요한 역할을 하는 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 서프레서 (suppressor), 인핸서, 전사 활성인자 등)의 변형 등이 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 이것은 선행 기술에 속하는 유전자의 발현을 탈조절하기 위한 기타 모든 가능성, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용 또는 레프레서 (repressor) 단백질의 차단을 포함한다. 또한, 탈조절은, 유전자 생성물에서의 피드백 조절을 제거하거나 또는 유전자 생성물의 비(比)활성을 더욱 크게하거나 더욱 낮게할 수 있는 유전자의 코딩 영역을 변화시키는 것을 포함한다.

더욱이, 본 발명에 있어서, 보조효소 A를 수득하기 위한 판토텐산 전구체의배출 및(또는) 판토텐산의 유출에 영향을 미치는 효소에 대한 유전적 변형이 유리하다. 이러한 효소를 코딩하는 유전자의 예는 alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA, coaX 등이다. 이러한 목록은 설명을 위한 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하지 않는다. 또한, 보조인자 (예를 들어 메틸렌 테트라히드로폴레이트, 산화환원 균등물 등)의 세포내 생성을 판토텐산 생성에 최적인 양으로 보장하는 유전적 변형이 유리하다.

세포에는 β-알라닌이 상응하는 비-유전적 변형된 유기체에 비해 증가된 농도로 이미 존재하고 있으며, 따라서 예를 들어 EP-A 0 590 857호에서 요구되는 바와 같이 이것을 전구체로서 배양 배지에 첨가할 필요가 없는 것이 유리하다. 판토텐산 (pan) 및(또는) 이소루이신-발린 (ilv) 및(또는) 아스파테이트-α-데카르복실라제 (panD)의 생합성이 탈조절되는 미생물이 유리하다. 또한, 미생물에서 케토판토에이트 환원효소 (panE)가 더욱 과다발현되는 것이 유리하다.

본 발명에 따르면, 적절한 경우, 보조효소 A의 합성을 위해 요구되는 coaA 유전자의 활성이 감소되거나 또는 완전히 없어지는 것이 또한 유리하다 (예를 들어, 바실러스 종의 경우). 이것은, 바실러스가 coaA 이외에도 이러한 효소 작용을 위한 추가의 유전자 (=coaX)를 함유하기 때문이다. coaA 자체가 여전히 충분한 효소 활성 (감소된 효소 활성이라 하더라도)을 갖는 한, 다시 말해서 coaA의 효소 활성이 완전히 소실되지 않는 한, 이 유전자 coaX 또는 상응하는 효소의 활성은 변화되거나, 바람직하게는 감소되거나, 또는 심지어 결실될 수도 있다. 다양한 유전자의 과다발현 이외에도 추가로, 이러한 유전자의 프로모터 영역의 유전자 조작이 유전자 생성물의 과다발현을 일으키는 한, 이러한 유전자 조작이 유리하다.

본 발명의 실시양태에서, 특허문헌 (PCT/US 출원 0025993)에 기재된 세균 균주, 예를 들어 바실러스 섭틸리스 PA824 및(또는) 그의 유도체가 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따르면, 특허문헌 (US 출원번호 60/262,995호)에 기재된 바와 같이 미생물 바실러스 섭틸리스 PA668이 본 발명의 방법에서 사용된다. 이러한 균주 바실러스 섭틸리스 PA824 및 PA668는 다음과 같이 제조되었다:

유전자형 trpC2 (Trp^-)를 갖는 균주 바실러스 섭틸리스 168 (마르부르크 (Marburg) 균주 ATCC 6051)로부터 출발하여, Trp⁺마커 (바실러스 섭틸리스 야생형 W23)의 형질도입을 통해 균주 PY79가 생성되었다. 전통적인 유전공학 방법 (예를 들어, 문헌 [Harwood,C.R. 및 Cutting,S.M. (편집자), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley & Sons,Ltd., 영국 치체스터]에 기재됨)은 균주 PY79내에 돌연변이 ΔpanB 및 ΔpanE1을 도입하였다. 생성된 균주를, 바실러스 섭틸리스 균주 PA221의 게놈 DNA (유전자형 P₂₆panBCD, trpC2 (Trp^-) 및 바실러스 섭틸리스 균주 PA303의 게놈 DNA (유전자형 P₂₆panE1)를 사용하여 형질전환시켰다. 생성된 균주 PA327은 유전자형 P₂₆panBCD, P₂₆panE1을 갖고 이것은 트립토판 영양요구변이주 (Trp^-)였다. 5 g/L의 β-알라닌 및 5 g/L의 α-케토이소발레레이트로 보충된 SVY 배지 (25 g/L의 디프코 비일 주입 브로쓰 (Difco Veal InfusionBroth), 5 g/L의 디프코 효모 추출물, 5 g/L의 글루탐산나트륨, 2.7 g/L의 황산암모늄을 740 mL의 물에 충진하고, 혼합물을 오토클레이브한 후에 200 mL의 1 M 인산칼륨 pH 7.0 및 60 mL의 살균된 50％ 글루코스 용액을 첨가함)를 함유하는 10 mL 배양액에서 바실러스 섭틸리스 균주 PA327을 사용하여 3.0 g/L 이하 (24시간)의 판토텐산 역가를 달성하였다.

바실러스 섭틸리스 균주 PA221 (유전자형 P₂₆panBCD, trpC2 (Trp^-))의 생성을 하기에 설명한다: 바실러스 섭틸리스 GP275 플라스미드 라이브러리로부터 출발하여, 대장균 (E.coli)의 panBCD 오페론 (Merkel 등 참조, [FEMS Microbiol.Lett., 143, 1996:247-252])의 서열 정보의 도움을 받아, 바실러스의 panBCD 오페론을 클로닝하기 위해 전통적인 유전공학 방법을 사용하였다. 클로닝을 위하여, 대장균 균주 BM4062 (bir^ts) 및 바실러스 오페론이 birA 유전자에 가깝다는 정보를 이용하였다. 대장균에서 복제될 수 있는 플라스미드내에 panBCD 오페론을 도입하였다. panBCD 오페론의 발현을 개선하기 위하여, 바실러스 섭틸리스 파지 SP01 (P₂₆)의 강력한 구성적 (constitutive) 프로모터를 사용하였고, panB 유전자 앞의 리포좀 결합 부위 (=RBS)를 인공 RBS로 대체하였다. 바실러스에서 천연 panB 유전자의 바로 상류에 있는 DNA 단편을, 플라스미드 위에서 P₂₆panBCD 카세트의 앞에 라이게이션시켰다. 이 플라스미드를 바실러스 섭틸리스 균주 RL-1 (전통적인 돌연변이유발 방법에 의해 수득되는 바실러스 섭틸리스 168의 유도체 (마르부르크 균주 ATCC6051), 유전자형 trpC2 (Trp^-))내로 형질전환하고, 상동성 재조합에 의해, 천연 panBCD 오페론을 P₂₆panBCD 오페론으로 대체하였다. 생성된 균주는 PA221이라 불리우며, 유전자형 P₂₆panBCD, trpC2 (Trp^-)를 가졌다. 5 g/L의 β-알라닌 및 5 g/L의 α-케토이소발레레이트로 보충한 SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액 내에서 바실러스 섭틸리스 균주 PA221을 사용하여 0.92 g/L까지 (24시간)의 판토텐산 역가가 달성되었다.

바실러스 섭틸리스 균주 PA303 (유전자형 P₂₆panE1)의 생성을 하기에 설명한다. 대장균 panE 유전자 서열을 사용하여, 바실러스 panE 서열을 유사성에 의해 클로닝하였다. 바실러스 섭틸리스에서, panE1 및 panE2라 불리우는 대장균 panE 유전자의 2개의 상동체가 존재한다. 결실 분석은, panE1 유전자가 판토텐산 생성의 90％의 원인이 되는 반면, panE2 유전자의 결실은 판토텐산 생성에 상당한 영향을 미치지 않는다는 것을 밝혀내었다. 여기에서, panBCD 오페론을 클로닝하는 것과 유사하게, 프로모터를 강력한 구성적 프로모터 P₂₆으로 대체하고, panE1 유전자의 앞에 있는 리보좀 결합 부위를 인공 결합 부위로 대체하였다. P₂₆panE1 단편이 바실러스 섭틸리스 게놈에 있는 근원 panE1 좌 안에 통합될 수 있도록 구성되어진 벡터 내에, P₂₆panE1 단편을 클로닝하였다. 형질전환 및 상동성 재조합 후에 생성된 균주를 PA303이라 명명하고, 이것은 유전자형 P₂₆panE1을 갖는다. 5 g/L의 β-알라닌 및 5 g/L의 α-케토이소발레레이트로 보충된 SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액에서 바실러스 섭틸리스 균주 PA303을 사용하여 1.66 g/L까지 (24시간)의 판토텐산 역가를 달성하였다.

스텍티노마이신에 대한 마커 유전자 및 P₂₆ilvBNC 오페론을 함유하는 플라스미드로 PA327를 형질전환함으로써 균주를 더욱 구축하였다. amyE 좌 안에 통합된 P₂₆ilvBNC 오페론을 PCR에 의해 증명하였다. 하나의 형질전환체를 PA340 (유전자형 P₂₆panBCD, P₂₆panE1, P₂₆ilvBNC, specR, trpC2 (Trp^-))라 명명하였다. 5 g/L의 β-알라닌만이 보충된 SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액에서 바실러스 섭틸리스 균주 PA340을 사용하여 3.6 g/L (24시간)까지의 판토텐산 역가를 달성하였다; 5 g/L의 β-알라닌 및 5 g/L의 α-케토이소발레레이트로 보충된 SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액에서 4.1 g/L (24시간)까지의 판토텐산 역가를 달성하였다.

또한, 탈조절된 ilvD 카세트를 균주 PA340내에 도입하였다. 이를 위하여, 인공 RBS2를 함유하는 P₂₆프로모터의 조절하에서 ilvD 유전자를 함유하는 플라스미드를 PA340내에 형질전환하였다. 상동성 재조합에 의해 근원 ilvD 좌 내에 P₂₆ilvD 유전자를 통합하였다. 생성된 균주 PA374는 유전자형 P₂₆panBCD, P₂₆panE1, P₂₆ilvBNC, P₂₆ilvD, specR 및 trpC2 (Trp^-)을 갖는다. 5 g/L의 β-알라닌만이 보충된 SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액 내에 바실러스 섭틸리스 균주 PA374를 사용하여 2.99 g/L (24시간)까지의 판토텐산 역가를 달성하였다.

β-알라닌의 공급 없이 균주 PA374를 사용하여 판토텐산을 생성하기 위하여, 아스파테이트-α-데카르복실라제를 코딩하는 유전자 panD의 추가의 복제를 균주 PA374 내에 도입하였다. 이를 위하여, 균주 PA401의 염색체 DNA를 PA374 내에 형질전환하였다. 테트라사이클린에 대한 선별에 의해 균주 PA377을 수득하였다. 생성된 균주 PA377은 유전자형 P₂₆panBCD, P₂₆panE1, P₂₆ilvBNC, P₂₆ilvD, specR, tetR 및 trpC2 (Trp^-)을 갖는다.

SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액에서 바실러스 섭틸리스 균주 PA377을 사용하여 전구체의 공급없이 1.31 g/L (24시간)까지의 판토텐산 역가를 달성하였다.

바실러스 섭틸리스 균주 PA401 (유전자형 P₂₆panD)의 제조를 이하에 설명한다: 테트라사이클린 마커 유전자를 보유한 벡터 내에 panBCD 오페론으로부터 바실러스 섭틸리스 panD 유전자를 클로닝하였다. 프로모터 P₂₆및 상기 기재된 인공 RBS를 panD 유전자의 앞에 클로닝하였다. 제한효소 소화는, 테트라사이클린 마커 유전자 및 P₂₆panD 유전자를 함유하는 단편을 생성하였다. 이 단편을 다시 라이게이션시키고, 상기 기재된 균주 PA221 내로 형질전환하였다. 단편을 균주 PA211의 게놈 내로 통합하였다. 생성된 균주 PA401은 유전자형 P₂₆panBCD, P₂₆panD, tetR 및 trpC2 (Trp^-)를 갖는다. 5 g/L의 α-케토이소발레레이트가 보충된 SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액 내에 바실러스 섭틸리스 균주 PA401을 사용하여 0.3 g/L (24시간)까지의 판토텐산 역가를 달성하였다. 5 g/L의 D-판토텐산 및 10 g/L의 L-아스파테이트가 보충된 SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액 내에서 2.2 g/L (24시간)까지의 판토텐산 역가를 달성하였다.

균주 PA377로부터 출발하여, 균주 PY79로부터의 염색체 DNA로 형질전환함으로써 트립토판-원영양 균주를 생성하였다. 이 균주 PA824는 유전자형 P₂₆panBCD, P₂₆panE1, P₂₆ilvBNC, P₂₆ilvD, specR, tetR 및 Trp⁺을 갖는다. SVY 배지 중의 10 mL 배양액에서 바실러스 섭틸리스 균주 PA824를 사용하여, 전구체의 공급없이 4.9 g/L (48시간)까지의 판토텐산 역가를 달성하였다 (비교 PA377: 48시간 동안 3.6 g/L까지).

PA668의 제조를 하기에 설명한다: 야생형 panBCD 오페론으로부터 바실러스 panB 유전자를 클로닝하고, 클로람페니콜 내성 유전자에 추가로 vpr 좌의 바실러스 섭틸리스 서열을 함유하는 벡터 내에 이것을 삽입하였다. 강력한 구성적 프로모터 P₂₆을 panB 유전자의 5'말단 앞에 도입하였다. P₂₆panB 유전자, 클로람페니콜 내성에 대한 마커 유전자 및 바실러스 섭틸리스 vpr 서열을 함유하는 하나의 단편을 제한효소 소화에 의해 수득하였다. 단리된 단편을 다시 라이게이션하고, 이것을 사용하여 균주 PA824를 형질전환하였다. 생성된 균주를 PA668이라 명명하였다. PA668의 유전자형은 P₂₆panBCD, P₂₆panE1, P₂₆ilvBNC, P₂₆panB, specR, tetR, CmR 및 Trp⁺이다. PA668의 2개의 콜로니를 단리하였으며, 하나를 PA668-2A라 명명하고 다른 것을 PA668-24라 명명하였다. 전구체의 공급 없이, 바실러스 섭틸리스 균주 PA668-2A를 사용하여 SVY 배지 중의 10 mL 배양액에서 48시간 내에 1.5 g/L의 판토텐산 역가를 달성하였다. 10 g/L의 아스파테이트로 보충된 10 mL 배양액에서, 5 g/L까지의 역가를 달성하였다. 바실러스 섭틸리스 균주 PA668-24를 사용하여, 전구체의 공급 없이 SVY 배지 중의 10 mL 배양액에서 48시간 내에 1.8 g/L의 판토텐산 역가를 달성하였다. 10 g/L의 L-아스파테이트로 보충된 10 mL 배양액에서, 4.9 g/L 까지의 역가를 달성하였다.

균주의 정확한 구축 방법은 PCT/US 출원 0025993호 및 US 출원번호 60/262,995호에서 찾아볼 수 있다.

상기 기재된 균주 PA377을 사용하면, 10 L 규모의 SVY 배지 (25 g/L의 디프코 비일 주입 브로쓰, 5 g/L의 디프코 효모 추출물, 5 g/L의 트립토판, 5 g/L의 글루탐산나트륨, 2 g/L의 (NH₄)₂SO₄, 10 g/L의 KH₂PO₄, 20 g/L의 K₂HPO₄, 0.1 g/L의 CaCl₂, 1 g/L의 MgSO₄, 1 g/L의 시트르산나트륨, 0.01 g/L의 FeSO₄·7HO 및 하기 조성을 가진 1 mL/L의 미량 염 용액: 0.15 g의 Na₂MoO₄·2H₂O, 2.5 g의 H₃BO₃, 0.7 g의 CoCl₂·6H₂O, 0.25 g의 CuSO₄·5H₂O, 1.6 g의 MnCl₂·4H₂O, 0.3 g의 ZnSO₄·7H₂O, 물로 1 L까지 만듬) 중의 글루코스-제한 발효에서, 글루코스 용액을 연속 공급하면서, 발효 브로쓰 중에 18 내지 19 g/L (22 내지 25 g/L)의 판토텐산 농도가 36시간 (48시간) 내에 달성된다.

PA377의 트립토판-원영양 유도체인 PA824의 글루코스-제한 발효의 경우에,효모 추출물 배지 (10 g/L의 디프코 효모 추출물, 5 g/L의 글루탐산나트륨, 8 g/L의 (NH₄)₂SO₄, 10 g/L의 KH₂PO₄, 20 g/L의 K₂HPO₄, 0.1 g/L의 CaCl₂, 1 g/L의 MgSO₄, 1 g/L의 시트르산나트륨, 0.01 g/L의 FeSO₄·7H₂O 및 1 mL/L의 상기 기재된 미량의 염 용액)에서, 글루코스 용액을 연속적으로 공급하면 10 L 규모에서 각각 36시간, 48시간 및 72시간 후에 발효 브로쓰 내에서 20 g/L, 28 g/L 및 36 g/L의 판토텐산 농도가 달성된다. 배지를 추가로 최적화함으로써, 10 g/L의 디프코 효모 추출물, 10 g/L의 NZ 아민 A (독일 에르프트스타트에 소재하는 퀘스트 인터내셔날 게엠베헤 (Quest International GmbH) 제품), 10 g/L의 글루탐산나트륨, 4 g/L의 (NH₄)₂SO₄, 10 g/L의 KH₂PO₄, 20 g/L의 K₂HPO₄, 0.1 g/L의 CaCl₂, 1 g/L의 MgSO₄, 1 g/L의 시트르산나트륨, 0.01 g/L의 FeSO₄·7H₂O 및 1 mL/L의 상기 기재된 미량 염 용액으로 구성된 배지 중에서의 글루코스-제한 발효에서, 균주 PA824를 사용하면, 글루코스 용액을 연속적으로 공급할 때 10 L 규모에서 36시간 (48시간)내에 발효 브로쓰 중에 37 g/L (48 g/L)의 판토텐산 농도가 달성된다. 배지를 추가로 최적화함으로써, 발효 시간을 증가시킴으로써, 공정 및 균주를 개량함으로써, 그리고 각각의 단계들을 조합함으로써, 발효 브로쓰 내에서 판토텐산 농도가 더욱 증가하는 것을 생각할 수 있다. 즉, 상기 기재된 PA824의 유도체인 균주의 발효에 의해 상기 기재된 판토텐산 농도가 달성될 수 있다. 유도체는 전통적인 균주 발생과 그 이후에 유전공학적 조작에 의해 제조될 수 있다. 배지, 균주 및 발효 공정의 개발에 의해, 발효 브로쓰내에서 판토텐산 역가가 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 및 >90 g/L 초과로 증가될 수 있다.

본 발명의 방법의 본질적인 장점은, 하나 이상의 탄소원 및 질소원과는 별도로, 출발 화합물로서의 다른 전구체를 함유하지 않는 배양 배지 중에서 발효가 수행된다는 점이다. 다시 말해서, D-판토텐산의 생합성은 다른 전구체의 공급과 무관하다. 본 발명의 목적상, 이러한 전구체는 β-알라닌 및(또는) L-아스파테이트 및(또는) L-발린 및(또는) α-케토이소발레레이트 및(또는) 이들의 조합과 같은 물질이다. 본 발명의 방법의 바람직한 변형법에서, 탄소원 및 질소원을 함유하지만 발효 과정 동안에 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염은 첨가되거나 공급되지 않는 배양 배지 중에서, D-판토텐산-생성 유기체의 발효가 수행된다. 다시 말해서, 본 발명에서는 배양 배지 1 L 당 10 g 이상, 바람직하게는 20 g 이상, 특히 바람직하게는 40 g 이상, 매우 특히 바람직하게는 60 g 이상, 특히 70 g 이상의 D-판토텐산을 생성하기 위하여 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 공급할 필요가 없다. 특히, 다수의 전구체가 매우 고가이기 때문에, 전구체의 공급이 필요하지 않다는 것은 공지의 방법에 비하여 본 발명의 방법의 중요한 경제적인 장점이 된다.

그러나, 본 발명은 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염의 첨가를 배제하지 않으며, 따라서 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 첨가함으로써 D-판토텐산의 수율이 더욱 증가될 수 있다. 예를 들어, 판토텐산의 요구되는 전구체가 모두 충분한 양으로 존재하는 것으로 가정하는 경우에는 panD 유전자의 활성만이 판토텐산 생성의 추가 증가를 제한하기 때문에, 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 첨가함으로써 판토텐산의 수율이 예를 들어 50％ 이상 더 증가될 수 있다. 본 발명의 유리한 변형법에서, 판토텐산 수율을 50％ 이상 더욱 증가시키기 위하여 20 g/L 이하의 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 배양 배지에 첨가할 수 있다. 약 15 g/L의 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 배양 배지에 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라 상기 언급된 유기체를 발효시키기 위해 배양 배지 중에서 사용하기에 적절한 탄소원의 예는 당, 예컨대 전분 가수분해물 (단당류, 이당류, 올리고당류), 바람직하게는 글루코스 또는 수크로스, 사탕무 또는 케인 당 당밀, 단백질, 단백질 가수분해물, 대두분, 옥수수 침지액, 지방, 유리 지방산, 이전의 발효로부터의 재순환 세포 또는 그의 가수분해물 및 효모 추출물이다. 이러한 목록은 본 발명을 제한하지 않는다.

또한, 본 발명의 방법은, 전체 당 함량이 발효의 마지막까지 최소로 감소되는 것을 유리한 특징으로 하는데, 그 이유는 그렇지 않을 경우 점착으로 인해 발효 용액의 건조 및(또는) 제형화가 곤란해지기 때문이다. 본 발명에 따르면, 이것은 탄소원이 소모된 후에 (회분 배양의 경우) 또는 탄소원의 농도가 실제로 제로 (유가배양, 반복된 유가배양 또는 연속 공정 절차의 경우)가 되도록 탄소 공급이 중단 및(또는) 조절된 후에 (유가배양 또는 반복된 유가배양에서의 공정 절차의 경우) 일부 시간 동안 발효를 계속함으로써 달성된다. 본 발명에 따르면, 이것은 탄소원 (예를 들어, 당 용액)의 첨가를 중단한 후에, 발효 용액 중에서 용존 산소 농도(pO₂)가 포화 수치의 80％ 이상, 바람직하게는 90％, 특히 바람직하게는 95％으로 달성될 때까지 계속 발효시킴으로써 달성된다.

본 발명에 따라 적절한 질소원의 예는 암모니아, 황산암모늄, 우레아, 단백질, 단백질 가수분해물 또는 효모 추출물이다. 이러한 목록은 본 발명을 제한하지 않는다.

또한, 발효 배지는 미네랄 염 및(또는) 미량 요소, 예컨대 아미노산 및 비타민을 함유한다. 적절한 발효 배지의 정확한 조성은 다수 공지되어 있고 당업자에게 이용가능하다. 적절하다면 소포제의 첨가와 함께, 적절한 D-판토텐산-생성 유기체를 발효 배지에 접종한 후에 (당업자에게 공지된 세포 밀도로) 유기체를 배양한다. 각종 무기 또는 유기 알칼리 또는 산, 예를 들어 NaOH, KOH, 암모니아, 인산, 황산, 염산, 포름산, 숙신산, 시트르산 등을 사용하여, 배지 pH의 필요한 조절을 달성할 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 예를 들어 NaOH, KOH, 암모니아, 인산, 황산, 염산, 포름산, 숙신산, 시트르산 등과 같은, 발효 동안에 사용되는 완충 시스템 때문에, 형성되는 D-판토텐산이 사용된 완충 시스템에 따라 각각의 염(들)의 형태로 발효 용액에 존재한다. 이러한 경우에, 본 발명에 있어서는 특히 1가 양이온 형태의 D-판토텐산 염이 불리하거나, 또는 칼슘 또는 마그네슘 염 형태의 D-판토텐산의 염이 바람직하기 때문에, 본 발명에 따라 전기막 분리 공정을 통해 발효 용액을 제조한다.

본 발명은 막 전기분해 또는 전기투석 등과 같은 모든 이용가능한 유형의 전기막 분리 공정을 포함한다. 당업자라면, 약간의 지식을 바탕으로 적절히 선택할 것이다. 본 발명에서는 전기투석을 이용하는 것이 바람직하다. 이때, 전적으로 단극성 막을 사용하는 전기투석 뿐 아니라, 단극성 막 및(또는) 양극성 막을 사용하는 전기투석도 사용할 수 있다. 전적으로 단극성 막을 사용하는 전기투석, 특히 1가 이온에 대해 선택적인, 단일선택적 (monoselective) 막이라 불리는 단극성 막을 사용하는 전기투석이 특히 바람직하다. 원칙적으로, 전기투석 공정에 통상적으로 사용되는 임의의 막을 본 발명의 방법 수행에 사용할 수 있다. 본 발명의 전기투석에 사용되는 막은 통상적으로 시판되는 이온 교환 막인 것이 바람직하다. 사용할 수 있는 음이온 교환 막의 예로는 도꾸야마 코포레이션 (Tokuyama Corp.)에서 시판하는 네오셉타 (Neosepta) AM1, AM2, AM3, AMX, AMH, AFN 및 아사히 글라스 (Asahi Glass)가 시판하는 AMV 등이 있다. 양이온 교환 막의 예로는 아사히 글라스 CMV가 시판하는 네오셉타 CM1, CM2, CMX, CMH, CMB 뿐 아니라 듀폰 드 네모아스 (Du Pont de Nemours)가 시판하는 나피온 (Nafion) 435 또는 350 등이 있다. 언급할 수 있는 단일선택적 양이온 교환 막의 예로는 막 네오셉타 CMS 등이 있다. 사용할 수 있는 단일선택적 음이온 교환 막의 예로는 도꾸야마 코포레이션이 시판하는 네오셉타 ACS 또는 아사히 글라스가 시판하는 셀미온 (Selmion) ASV 등의 막이 있다. 사용되는 전극은 스테인레스 강, 니켈, 귀금속, 예컨대 백금 또는 당업자에게 공지된 기타의 적절한 물질 등일 수 있다.

본 발명에 따라 단극성 전기투석을 사용하는 경우, 음이온 뿐 아니라 양이온까지도 전기장에서 판토테네이트-함유 용액에서 음이온 교환 막 또는 양이온 교환 막을 통해 이동하여 제2의 용액 (농축 용액, CONC)으로 이동할 수 있으므로 판토텐산-함유 용액 (묽은 용액, DIL)에서 제거된다. 본 발명에 따라 판토텐산-함유 용액에서 저분자량의 이온을 제거하는 것이 유리하다. 본 발명의 목적상, 저분자량의 이온은 배양 배지 및(또는) 완충 시스템의 조성을 통해 발효 브로쓰에 도입되었으나 최종 생성물에서는 원치 않는 이온이다. 이의 예는 다음과 같다: 암모늄, 칼륨, 나트륨, 철, 염소, 인 또는 황 이온.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 1가 양이온, 예를 들어 Na⁺또는 암모늄 이온을 다가 양이온, 예를 들어 Ca²⁺에 대하여 이온 교환할 수 있다. 이를 위해서, 1가 이온에 선택적인 양이온 교환 막을 사용한다. 따라서, 예를 들어 회로 I에는 CaCl₂용액을 충진하고, 양이온 교환 막에 의해 회로 I과 분리된 제2의 회로 II에는 1가 양이온-함유 판토텐산 용액을 충진한다. 이후, 1가 이온에 대해 선택적이고 챔버 II와 챔버 III 사이에 위치한 양이온 교환 막을 통해, 바람직하게는 1가 양이온이 제3의 챔버 III로 이동한다. 동시에, 염소 이온 등의 음이온이 챔버 I과 챔버 III 사이에 위치한 음이온 교환 막을 통해 챔버 I로부터 챔버 III으로 이동한다. Ca²⁺ 이온은 양이온 교환 막을 통해 챔버 I로부터 챔버 II로 이동한다. 이러한 방식으로 칼슘 D-판토테네이트를 직접 수득한다. 약산, 예를 들어 판토텐산의 염이 존재하는 경우, CaCl₂대신 HCl 수용액을 챔버 I에 충진한다면 유리 D-판토텐산도 이러한 배열로 생성될 수 있다.

또한, 본 발명은 무기 또는 유기 음이온 형태의 칼슘 염 및(또는) 마그네슘 염의 사용을 포함한다. 유리하게는, 본 발명에 따라 칼슘 및(또는) 마그네슘 클로라이드, 니트레이트, 히드록시드, 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 글리시네이트 또는 락테이트가 사용된다.

본 발명의 별법의 실시양태에서 양극성 전기투석을 사용하는 경우, 유리하게는 양이온이 양이온 교환 막을 통해 판토테네이트-함유 용액에서 제2 용액으로 이동하여 판토텐산-함유 용액으로부터 제거됨과 동시에, 양극성 막에서 물이 해리됨으로써 양성자가 제공될 수 있다. 제2 용액에서는, 양극성 막에서의 물 해리에 의해 제공된 수산화 이온을 사용하여, 이동된 양이온에 상응하는 염기가 형성된다.

본 발명의 다른 실시양태에서 양극성 전기투석을 사용하는 경우, 유리하게는 음이온이 음이온 교환 막을 통해 판토테네이트-함유 용액에서 제2 용액으로 이동하여 판토텐산-함유 용액으로부터 제거됨과 동시에, 양극성 막에서 물이 해리됨으로써 수산화 이온이 제공될 수 있다. 제2 용액에서는, 양극성 막에서의 물 해리에 의해 제공된 양이온을 사용하여, 이동된 음이온에 상응하는 산이 형성된다.

또한, 본 발명은 유리하게는 먼저 양극성 전기투석을 사용하여 음이온을 음이온 교환 막을 통해 판토테네이트-함유 용액에서 제2 용액으로 이동시켜 판토텐산-함유 용액으로부터 제거함과 동시에 양극성 막에서의 물 해리에 의해 수산화 이온을 제공하고, 두번째로 양이온을 양이온 교환 막을 통해 판토테네이트-함유 용액에서 제2 용액으로 이동시켜 판토텐산-함유 용액으로부터 제거함과 동시에양극성 막에서의 물 해리에 의해 양성자를 제공하는 추가의 별법의 실시양태를 포함한다. 제2 용액에서는 양극성 막에서의 물 해리에 의해 제공된 양성자를 사용하여, 이동된 음이온에 상응하는 산이 형성되고, 제3 용액에서는 양극성 막에서의 물 해리에 의해 제공된 수산화 이온을 사용하여, 이동된 양이온에 상응하는 염기가 형성된다.

또한, 본 발명에 따른 방법에서 산 또는 염기를 사용하여 판토테네이트-함유 용액의 pH를 판토텐산의 등전점으로 설정하는 것이 바람직하다. 이로 인해서, 유리 D-판토텐산의 수율을 더욱 증가시키거나, 손실을 더욱 감소시킬 수 있다.

단극성 전기투석은 양극성 전기투석에 비해 비용면에서 매우 효과적이기 때문에 특히 바람직한 변형법이다.

특히, 산 또는 염기를 첨가하여 pH를 조절하는 것이 아닌 경우에는 양극성 전기투석을 사용할 수 있고, 또는 존재하는 산 또는 알칼리 금속 수산화물 용액을 추가로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 모든 전기투석 변형법이 이온 교환 수지의 재생으로 인해 폐수가 생성되지 않는다는 잇점을 제공한다.

본 발명의 전기분리 공정을 사용함으로써, 원치않는 저분자량의 이온 (외래 이온), 예를 들어 암모늄, 칼륨, 나트륨, 철, 염소, 인 또는 황 이온을 D-판토테네이트-함유 용액에서 제거하는 것이 바람직하다. 즉, 유리 D-판토텐산 또는 원하는 염, 예를 들어 칼슘 D-판토테네이트 및(또는) 마그네슘 D-판토테네이트가 형성되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라서, 1가 양이온, 바람직하게는 암모늄, 칼륨 및(또는) 나트륨 이온의 함량은 용액 1 kg 당 1 g 이하의 농도로 감소된다.

원치않는 음이온, 예를 들어 염소, 황 또는 인 이온의 함량도 이온 교환 막의 선택에 따라, 바람직하게는 음이온 교환 막을 사용함으로써 상당히 감소될 수 있다.

본 발명에 따라 유리 D-판토텐산을 함유하는 생성 용액의 pH는 칼슘 염기 및(또는) 마그네슘 염기를 첨가하여 3 내지 10으로 설정한다. pH가 5 내지 10인 것이 유리하다. 바람직하게는, pH를 5 내지 9, 특히 바람직하게는 6 내지 9, 매우 특히 바람직하게는 6 내지 8의 값으로 설정한다. 이러한 방식으로, 칼슘 판토테네이트 및(또는) 마그네슘 판토테네이트를 함유하는 용액이 수득된다. 바람직하게는, 수산화칼슘, 탄산칼슘, 산화칼슘, 수산화마그네슘 및(또는) 염기성 탄산마그네슘을 고체 형태 및(또는) 수성 현탁액으로서 용액에 첨가하여 중화시킨다. 이러한 경우에, 본 발명에 따라 유리 D-판토텐산-함유 용액을 수성 현탁액 형태의 칼슘 염기 및(또는) 마그네슘 염기로 중화하는 것이 바람직하다. 수성 현탁액을 사용한 결과로서, 상응하는 고체가 사용될 경우에 비하여 pH 변동이 비교적 크지 않아도 중화가 더욱 신속하게 수행될 수 있다.

본 발명의 방법은 단계 c)의 용액에 2 내지 55 중량％, 바람직하게는 10 내지 50 중량％, 특히 바람직하게는 20 내지 40 중량％의 수산화칼슘을 포함하는 수성 현탁액을 첨가하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 단계 c)의 용액에 2 내지 65 중량％, 바람직하게는 10 내지 50 중량％, 특히 바람직하게는 20 내지 40 중량％의 탄산칼슘을 포함하는 수성 현탁액을 첨가하는 방법을 포함한다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 본 발명의 방법의 단계 c)의 용액에 2 내지 60 중량％, 바람직하게는 10 내지 50 중량％, 특히 바람직하게는 20 내지 40 중량％의 수산화마그네슘을 포함하는 수성 현탁액을 첨가한다. 또한, 본 발명은 단계 c)의 용액에 2 내지 25 중량％, 바람직하게는 10 내지 20 중량％의 염기성 탄산마그네슘을 포함하는 수성 현탁액을 첨가하는 방법을 포함한다.

잘 알려진 방법, 예를 들어 분무 건조, 분무 과립화, 유동층 건조, 유동층 과립화, 드럼 건조 또는 스핀-플래시 건조 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 제6판, 1999, 전자 발간, "고체 물질의 건조" 장]를 사용하여, 발효 용액을 건조 및(또는) 제형화한다. 대류 건조에서의 기체 입구 온도는 100 내지 280℃, 바람직하게는 120 내지 210℃이다. 기체 출구 온도는 50 내지 180℃, 바람직하게는 60 내지 150℃이다. 원하는 입도 분포 및 연관된 생성물 성질을 달성하기 위하여, 미립자를 분리해내고 재순환시킬 수 있다. 또한, 조립자 물질을 분쇄기에서 분쇄한 후에 유사하게 재순환시킬 수 있다.

상기 기재된 방법에서 본 발명에 따라, 복잡한 후처리 단계를 감소시키며, 특히 유기 용매의 사용을 피하는 동시에 높은 생물학적 가치를 가진 원하는 생성물을 생성하는 것이 유리하다. 또한, 본 발명에 따르면, 생성된 폐수의 양이 상당히 감소된다. 이로써 복잡한 후처리 및 폐기 설비가 더욱 절감된다. 따라서, 본 발명의 방법은 종래의 방법에 비해 더욱 간단하고 결점이 덜하고 시간-소모가 적고 훨씬 저렴하므로 더욱 경제적이라는 유리한 특징을 갖는다.

그러나, 본 발명의 방법이 변화될 수 있다는 것도 배제되지 않는다. 상기에언급된 본 발명의 방법의 단계 a) 내지 d)에 당업자에게 친숙한 하나 이상의 하기 공정 단계를 보충할 수 있다. 이러한 경우에, (필수적인) 방법 단계들 a) 내지 d)와 추가의 (사용가능한) 방법 단계들의 모든 생각가능한 조합이 본 발명에 포함된다.

따라서, 방법 단계 a) 내지 c)로부터 생성된 용액을 예를 들어 가열 (살균) 또는 기타 방법, 예를 들어 저온살균 또는 살균 여과에 의해 멸균시킬 수 있다.

본 발명의 방법의 다른 변형법에서, 용액의 건조 및(또는) 제형화 이전에, 생체물질의 용균 및(또는) 살균, 및(또는) 발효 용액으로부터 생체물질의 분리, 및(또는) 추가의 첨가제 첨가, 및(또는) 바람직하게는 물의 제거에 의한 발효 용액 농축을 포함하여, 이들 단계의 하나 이상 및(또는) 조합을 수행할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 여전히 발효 용액 중에서 또는 그렇지않으면 발효 용액으로부터 생체물질을 분리해 낸 후까지도 생체물질의 용균 및(또는) 살균을 수행하는 방법에 관한 것이다. 이것은 예를 들어 바람직하게는 80 내지 200℃에서의 온도 처리, 및(또는) 바람직하게는 황산 또는 염산으로의 산 처리, 및(또는) 바람직하게는 라이소자임으로의 효소 처리에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 발효된 미생물의 세포는 본 발명의 방법의 단계 a), b) 또는 c)의 용액으로부터 여과, 분리 (예를 들어, 원심분리) 및(또는) 경사분리에 의해 제거될 수 있다. 또한, 단계 a), b) 또는 c)의 용액에서 존재하는 유기체를 분리해 내지 않고도, 상기 용액을 전기장을 인가한 하나 이상의 이온-선택 막(들)에 직접 통과시킬 수 있음을 생각할 수 있다.

막 전기분해 또는 전기투석을 통한 후처리에서 생성된 용액은 중화시킨 후에 적절한 증발기, 예를 들어 강하-필름 증발기, 박막 증발기 또는 회전 증발기를 통해 농축될 수 있다. 이러한 증발기는 예를 들어 GIG (오스트리아 4800 아트낭 푸쉬헴), GEA 캔지어 (GEA Canzier) (독일 52303 뒤렌), 디쎌 (Diessel) (독일 31103 힐데샤임) 및 피톤 (Pitton) (독일 35274 키르흐하인) 회사들이 제조한 것이다.

최종 생성물의 색 성질을 개선하기 위하여, 공정 동안에 수득된 용액에 약간의 활성탄을 첨가한 후에 상기 현탁액을 여과하는 추가의 여과 단계를 수행할 수 있다. 또는, 발효 동안에 수득된 용액을 작은 활성탄 층에 통과시킬 수 있다. 이를 위해 필요한 활성탄의 사용량은 용액의 수 중량％의 범위이고, 당업자의 지식 및 경험에 따른다. 이러한 여과는 여과 이전에 통상적인 응집 보조제 (예를 들어, 독일 루드빅샤펜 바스프 아게 (BASF AG)로부터의 세디푸르 (Sedipur) CF 902 또는 세디푸르 CL 930)를 각각의 용액에 첨가함으로써 단순화될 수 있다.

본 발명의 유리한 실시양태에서, 가열에 의해 발효 배출물 (발효 브로쓰)을 살균한 다음, 원심분리, 여과 또는 경사분리에 의해 세포 물질을 제거한다. 발효 배출물을 기준으로 하여 50 내지 1000 mg/kg, 바람직하게는 100 내지 200 mg/kg의 통상적인 응집 보조제를 첨가한 후에, 혼합물을 활성탄과 모래의 짧은 층을 통해 여과시켜 D-판토텐산 함량이 높은 생체물질-비함유 용액을 수득한다. 이어서, 이렇게 처리된 용액을 전기장을 인가한 하나 이상의 이온-선택 막(들)에 통과시킨다.

이후, 상기 용액을 예를 들어 분무 건조에 의해 건조시킬 수 있다. 이것은 병류, 역류 또는 혼합류로 수행될 수 있다. 미립화를 위해, 모든 공지된 분무기,특히 원심분리 분무기 (분무기 원판), 1액 노즐 또는 2액 노즐을 사용할 수 있다. 바람직한 건조 온도 조건은 150 내지 250℃의 탑 입구 온도 및 70 내지 130℃의 탑 출구 온도이다. 그러나, 그 보다 더 높거나 낮은 온도 수준에서 건조를 수행할 수도 있다. 매우 낮은 잔류 수분을 달성하기 위하여, 유동층의 하류에서 추가의 건조 단계를 제공할 수 있다.

분무 건조기와 유동층의 조합인, 니로 (Niro) (덴마크 코펜하겐) 및 APV-안히드로 (APV-Anhydro) (덴마크 코펜하겐)에 의해 제조된 FSD 또는 SBD 건조기 (FSD: 유동화 분무 건조기; SBD: 분무 층 건조기)에서 분무 건조를 수행할 수도 있다. 분무 건조시에는 고결방지제를 첨가할 수 있다. 이것은 건조기 벽으로의 침착을 감소시킬 수 있고, 정확하게 미립 분말인 경우에는 유동 거동을 개선시킬 수 있다. 사용될 수 있는 고결방지제는 특히 실리케이트, 스테아레이트, 포스페이트 및 옥수수 전분이다. 원칙적으로, 분무 유동층에서 건조를 수행할 수 있고, 이 경우에 이것은 연속식으로 뿐만 아니라 회분식으로 조작될 수 있다. 용액을 윗쪽 (상부 분무) 및 아래쪽 (하부 분무) 뿐만 아니라 옆쪽 (측면 분무)에 분무할 수 있다.

또한, 본 발명은 a) D-판토텐산을 생성하고 판토텐산 (pan) 및(또는) 이소루이신/발린 (ilv)의 생합성이 탈조절되어 있는 하나 이상의 유기체를 0 내지 20 g/L, 바람직하게는 0 g/L의 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 공급한 배양 배지 중에서 발효시켜, 배양 배지에 2 g/L 이상의 D-판토텐산 염을 형성하는 단계; b) D-판토테네이트-함유 발효 용액을 전기장을 인가한 하나 이상의 이온-선택 막(들)에 통과시켜, D-판토테네이트-함유 용액으로부터 저분자량의 이온을 제거하는 단계; c) 칼슘 염기 및(또는) 마그네슘 염기를 첨가하여 유리 D-판토텐산-함유 용액의 pH를 3 내지 10으로 설정하고, 칼슘 판토테네이트 및(또는) 마그네슘 판토테네이트를 함유하는 용액을 수득하는 단계 및 d) 칼슘 판토테네이트- 및(또는) 마그네슘 판토테네이트-함유 용액을 건조 및(또는) 제형화하는 단계를 통해 제조될 수 있는, 동물 사료 첨가제 및(또는) 동물 사료 보조제로서 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 변형법에서, 상기 조성물은 단계 c) 또는 단계 d)에서 칼슘 판토테네이트 및(또는) 마그네슘 판토테네이트를 포함하는 현탁액을 수득하거나 충진한다는 점을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물은 D-판토텐산의 염을 1 내지 100 중량％ 이상, 바람직하게는 20 내지 100 중량％ 이상, 특히 바람직하게는 50 중량％ 이상의 농도로 포함함을 추가의 특징으로 한다. 본 발명은 D-판토텐산의 염을 2가 양이온, 바람직하게는 칼슘 D-판토테네이트 및(또는) 마그네슘 D-판토테네이트의 형태로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서, 1가 양이온 형태의 D-판토텐산의 염 함량이 1 g/kg 이하임을 특징으로 하는 조성물이 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 기재된 방법에 의해 사료 첨가제로서의 요건을 충족하는 칼슘 D-판토테네이트 또는 마그네슘 D-판토테네이트가 수득된다. 이러한 요건의 예는 비교적 높은 함량의 D-판토테네이트, 표적 유기체와의 높은 상용성 및 "비타민 활성"의 측면에서 본 발명의 생성물의 생물학적 가치이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명되지만, 실시예는 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예 1

14 L 용량의 교반기 및 기체-도입 장치가 장착된 실험실용 발효기에 하기 조성의 수성 발효 배지를 충진하였다:

출발 물질	농도 [g/L]
효모 추출물	10
글루탐산나트륨	5
황산암모늄	8
소포제	1 mL/L

살균 후에, 하기 살균 배지 성분들을 추가로 첨가하였다.

출발 물질	농도 [g/L]
KH₂PO₄	10
K₂HPO₄	20
글루코스	2.5
염화칼슘	0.1
염화마그네슘	1
시트르산나트륨	0.1
FeSO₄·7H₂O	0.1
미량 염 용액	1 mL/L

미량 염 용액의 조성은 다음과 같았다: 0.15 g의 Na₂MoO₄·2H₂O, 2.5 g의 H₃BO₃, 0.7 g의 CoCl₂·6H₂O, 0.25 g의 CuSO₄·5H₂O, 1.6 g의 MnCl₂·4H₂O, 0.3g 의 ZnSO₄·7H₂O를 물을 사용하여 1 L로 만들었다. 미량 염 용액을 살균 여과를 통해 첨가하였다. 초기 액체 부피는 8.4 L였다. 상기 기재된 함량은 이 값을 기초로 한다.

이 용액에 바실러스 섭틸리스 PA824의 접종 배양액 (SVY 배지 중 OD=10, SVY 배지: 디프코 비일 주입 브로쓰 25 g, 디프코 효모 추출물 5 g, 글루탐산나트륨 5 g, H₂O 740 mL 중 (NH₄)₂SO₄2.7 g, 살균; 200 mL의 살균 1 M K₂HPO₄(pH 7) 및 60 mL의 살균된 50％ 글루코스 용액을 첨가함 (최종 부피 1 L)) 160 mL를 첨가하고, 이를 12 L/분의 기체 유속으로 격렬하게 교반하면서 43℃에서 발효시켰다. 이 균주는 PCT/US 출원 0025993호에 설명되어 있다.

52시간 후에 6 L의 살균 수용액을 첨가하였으며, 그의 조성은 다음과 같았다:

출발 물질	농도 [g/L]
글루코스	500
염화칼슘	0.6
미량 염 용액	7 mL/L

글루코스-제한 조건하에서 발효를 수행하였다. 발효 동안에, 25％ 농도의 암모니아 용액 또는 20％ 농도의 인산을 첨가함으로써 pH를 7.2로 유지하였다. 동시에, 암모니아는 발효를 위한 질소원으로서 작용하였다. 용존 산소 함량이 포화 수치의 30％로 유지되도록 교반기 요소의 회전 속도를 조절하였다. 때때로 소포제를 첨가함으로써 발포를 제어하였다. 탄소원의 첨가를 중단한 후에, 용존 산소 함량 (pO₂)이 포화 수치의 95％에 도달할 때까지 계속 발효시켰다. 이어서, 발효를 종결하고 유기체를 열적으로 파괴시켰다. 이를 위하여, 발효 용액을 60분 동안 살균하였다. 평판도말에 의해 파괴를 증명하였다. 이어서, 원심분리에 의해 세포를 분리해 내었다. 세포 분리 후에, 52시간 후의 D-판토테네이트 농도는 24.7 g/L이었다.

유사하게, β-알라닌-공급-유리 판토텐산 역가가 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 및 >90 g/L 초과인 발효 브로쓰도 제조할 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 가열함으로써 살균되고 원심분리에 의해 생체물질이실질적으로 제거된 발효 배출물을 추가의 D-판토텐산과 혼합하고, 황산을 사용하여 pH를 약 2로 설정하였다. 생성된 용액을 모래/활성탄의 작은 층을 통해 여과시켰다. 상기 용액 중에서 D-판토텐산의 함량은 67.7 g/L이었다.

상기 여액 900 g을 다음과 같이 전기투석 처리했다: 셀의 유효 면적이 1.85 dm²이고, 5개의 챔버를 보유하는 전기투석 셀 (음이온 및 양이온 교환 막 (유형: 각각, 도꾸야마 코포레이션이 시판하는 네오셉타 AMX Sb 및 CMX Sb)이 장착되어 있음)에서, 상기 여액을 29 mA/cm²의 초기 전류 밀도에서 탈염하였다. 실험 운행 동안, 미리 설정된 제한 전압 20 V에 도달한 후에는 전류 밀도를 연속적으로 감소시켰다. 온도는 33℃ 내지 40℃였다. 농축액 공급물로서, 0.5％ 농도 (w/w)의 NaCl 용액을 충진했다. 실험 운행 동안 상기 농축액 (CONC)에는 여액 (희석액, DIL)으로부터 제거된 외래 이온 (예를 들어, 암모늄, 염소, 철, 칼륨, 나트륨 또는 인 이온)이 풍부했다. 전기분해 사이클 동안, 5％ 농도 (w/w)의 황산나트륨 용액을 충진하여 전극을 세정하였다. 실험 운행 동안, 희석액-함유 챔버의 다양한 이온 전도율 값의 묽은 용액에서 샘플을 취하여 분석하였다. 분석치는 하기의 표에제시하였으며, 이는 실험 시간이 진행됨에 따라 상기 이온이 희석액에서 제거되고 이에 상응하여 희석액의 전도율이 감소됨을 나타낸다. 작은 1가 이온, 예를 들어 염소 이온은 큰 부피의 다가 이온, 예를 들어 인 이온보다 더욱 신속하게 제거되었다.

희석액의 분석 결과는 하기 표로부터 알 수 있다:

모든 희석액 샘플의 pH는 2 내지 3이었다. 771 g의 희석액 방출물은 76 g/L의 유리 D-판토텐산을 함유했다. 이는, 발효를 통해 얻은 D-판토텐산 용액에서 전기분해에 의해 방해 양이온이 성공적으로 제거될 수 있음을 보여준다. 실시예 2에기재한 바와 같이, 수득된 탈염 D-판토텐산으로부터 비-흡습성 칼슘 D-판토테네이트 분말을 제조할 수 있다.

실시예 2

출발 물질	농도 [g/L]
효모 추출물	10
글루탐산나트륨	5
황산암모늄	8
KH₂PO₄	8.4
K₂HPO₄	15

살균 후에, 하기 살균 배지 성분들을 추가로 첨가하였다.

출발 물질	농도 [g/L]
글루코스	2.5
염화칼슘	0.1
염화마그네슘	1
시트르산나트륨	1
FeSO₄·7H₂O	0.01
미량 염 용액	1 mL

미량 염 용액의 조성은 다음과 같았다: 0.15 g의 Na₂MoO₄·2H₂O, 2.5 g의 H₃BO₃, 0.7 g의 CoCl₂·6H₂O, 0.25 g의 CuSO₄·5H₂O, 1.6 g의 MnCl₂·4H₂O, 0.3 g의 ZnSO₄·7H₂O를 물을 사용하여 1 L로 만들었다. 미량 염 용액을 살균 여과를 통해 첨가하였다. 초기 액체 부피는 5.5 L였다. 상기 기재된 함량은 이 값을 기초로 한다.

이 용액에 바실러스 섭틸리스 PA824의 접종 배양액 (SVY 배지 중 OD=10, SVY 배지: 디프코 비일 주입 브로쓰 25 g, 디프코 효모 추출물 5 g, 글루탐산나트륨 5g, H₂O 740 mL 중 (NH₄)₂SO₄2.7 g, 살균; 200 mL의 살균 1 M K₂HPO₄(pH 7) 및 60 mL의 살균된 50％ 글루코스 용액을 첨가함 (최종 부피 1 L)) 55 mL를 첨가하고, 이를 12 L/분의 기체 유속으로 격렬하게 교반하면서 43℃에서 발효시켰다. 이 균주는 PCT/US 출원 0025993호에 설명되어 있다.

48시간 후에 6 L의 살균 수용액을 첨가하였으며, 그의 조성은 다음과 같다:

출발 물질	농도 [g/L]
글루코스	550
염화칼슘	0.6
미량 염 용액	6 mL

글루코스-제한 조건하에서 발효를 수행하였다. 발효 동안에, 25％ 농도의 암모니아 용액 또는 20％ 농도의 인산을 첨가함으로써 pH를 7.2로 유지하였다. 동시에, 암모니아는 발효를 위한 질소원으로서 작용하였다. 용존 산소 함량이 포화 수치의 30％로 유지되도록 교반기 요소의 회전 속도를 조절하였다. 때때로 소포제를 첨가함으로써 발포를 제어하였다. 탄소원의 첨가를 중단한 후에, 용존 산소 함량 (pO₂)이 포화 수치의 95％에 도달할 때까지 계속 발효시켰다. 이어서, 발효를 종결하고 유기체를 열적으로 파괴시켰다. 이를 위하여, 발효 용액을 30분 동안 살균하였다. 평판도말에 의해 파괴를 증명하였다. 이어서, 원심분리에 의해 세포를 분리해 내었다. 세포 분리 후에, 48시간 후의 D-판토테네이트 농도는 24.1 g/L이었다. 유사하게, β-알라닌-공급-유리 판토텐산 역가가 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 및 >90 g/L 초과인 발효 브로쓰도 제조할 수 있다.

2817 mL의 발효기 배출물을 178.9 g/L 농도의 판토텐산 용액 1183 mL와 혼합하고, 25％ 농도의 수산화암모늄 용액으로 중화시켰다 (pH 6.5). 이어서, 혼합물을 모래/활성탄을 통해 여과시켰다. 여액 중의 D-판토텐산의 함량은 67 g/L이고, 원칙적으로 암모늄 염의 형태로 존재한다. 이 용액 약 720 g을 실시예 1에 따라 전기투석 처리하였다.

40％ 농도의 수산화칼슘 현탁액 3.5 g을 사용하여, 550 g의 희석액 방출물 (밀도는 1.017 g/mL임)의 pH를 7.5로 조정하였다. 칼슘 D-판토테네이트 수용액을 수득하였다 (칼슘 D-판토테네이트 함량이 40.9 g/L인 수용액 551.03 g). 상기 칼슘 판토테네이트 수용액을 니로 마이너 래보러토리 (Niro Minor laboratory) 분무 건조기에서 건조시켰다. 탑 입구 온도는 약 200℃였고 탑 출구 온도는 90℃였다. 4 bar의 압력에서 2액 노즐을 사용하여 미립화를 수행하였다. 첨가한 분말화제는 시퍼나트 (Sipernat) 22F였다. 하기 사항의 분말 생성물을 수득했다 (수치는 중량％로 나타낸 것임):

물 함량: 2.3％

칼슘 D-판토테네이트: 46.1％

암모늄: 0.60％

칼륨: 0.47％

나트륨: 1.1％

실시예 3

200 L 용량의 교반기 및 기체 도입 장치가 장착된 발효기에서, 800 g의 50％농도의 효모 추출물, 438 g의 글루탐산나트륨, 3200 g의 대두분, 640 g의 황산암모늄, 800 g의 KH₂PO₄, 1600 g의 K₂HPO₄및 50 mL의 소포제인 테고KS (TegoKS)를 70 L의 물과 혼합하고, 상기 혼합물을 121℃에서 30분 동안 살균하였다.

이어서, 용액 1 및 2를 첨가하였다.

용액 1을 다음과 같이 구성하였다: 1670 g의 글루코스·H₂O, 10.2 g의 CaCl₂·2H₂O 및 170.7 g의 MgCl₂· 6H₂O를 9 L의 물에 용해시키고, 30분 동안 살균하였다.

용액 2를 다음과 같이 구성하였다: 800 mL의 시트레이트-철 용액 (200 g/L의 시트르산나트륨, 2 g/L의 FeSO₄·7H₂O, 살균-여과)을 80 mL의 미량 염 용액 (0.15 g의 Na₂MoO₄·2H₂O, 2.5 g의 H₃BO₃, 0.7 g의 CoCl₂·6H₂O, 0.25 g의 CuSO₄·5H₂O, 1.6 g의 MnCl₂·4H₂O, 0.3 g의 ZnSO₄·7H₂O를 물과 함께 1 L로 만들고, 살균 여과함)과 혼합하였다.

이 용액에 바실러스 섭틸리스 PA668의 접종 배양액 (SVY 배지 중 OD=10, SVY 배지: 디프코 비일 주입 브로쓰 25 g, 디프코 효모 추출물 5 g, 글루탐산나트륨 5 g, H₂O 740 mL 중 (NH₄)₂SO₄2.7 g, 살균; 200 mL의 살균 1 M K₂HPO₄(pH 7) 및 60 mL의 살균된 50％ 글루코스 용액을 첨가함 (최종 부피 1 L)) 2 L를 첨가하고, 이를 3 m³/분의 기체 유속으로 격렬하게 교반하면서 43℃에서 발효시켰다. 이 균주는 US출원번호 60/262,995호에 설명되어 있다.

48시간 후에 약 10 L의 살균 글루코스 수용액을 첨가하였다. 용액을 다음과 같이 구성하였다: 90 kg의 글루코스·H₂O를 55 kg의 물과 혼합하고 30분 동안 살균하였다. 이어서, 300 mL의 미량 염 용액 (상기 조성 참조) 및 3 L의 시트레이트-철 용액 (상기 조성 참조)을 첨가하였다. 이어서, 1 L의 살균-여과된 90 g/L CaCl₂·2H₂O 용액을 첨가하고, 2 L의 살균-여과된 375 g/L 글루탐산나트륨 용액을 첨가하였다.

글루코스-제한 조건하에서 발효를 수행하였다. 발효 동안에, 25％ 농도의 암모니아 용액 또는 20％ 농도의 인산을 첨가함으로써 pH를 7.2로 유지하였다. 동시에, 암모니아는 발효를 위한 질소원으로서 작용하였다. 교반기 요소의 회전 속도를 조절하여, 용존 산소 함량을 포화 수치의 30％로 유지하였다. 때때로 소포제를 첨가함으로써 발포를 제어하였다. 탄소원의 첨가를 중단한 후에, 용존 산소 함량 (pO₂)이 포화 수치의 95％의 값에 도달할 때까지 계속 발효시켰다. 이어서, 발효를 종결했다. 원판 분리기에서 세포를 분리하였다. 상층액 중의 잔류 세포를 살균에 의해 열적으로 파괴하였다. 48시간이 지나 중지한 후, D-판토테네이트 농도는 13.7 g/L이었다. 분리 및 살균 후에, D-판토테네이트 농도는 10.7 g/L이었다. 유사하게, β-알라닌-공급-유리 판토텐산-역가가 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 및 90 g/L 초과인 발효 브로쓰도 생성할 수 있다.

이렇게 예비 처리한 3000 g의 발효 용액을 다음과 같이 추가로 처리하였다: 다가 음이온 (40％ 용액)의 농도에 동등하게 상응하는 양의 CaCl₂를 사용하여 회분 배양물의 3분의 2를 약 10℃에서 침전시켰고, 회분 배양물의 3분의 1은 동량의 Ca(OH)₂(고체)를 사용하여 상응하게 침전시켰다. 상기 용액을 냉장고에서 밤새 보관한 후에, 압력 여과기 (사이쯔 뎁트 필터 (Seitz depth filter) 700)를 사용하여 침전된 침강물로부터 분리하였다. 이어서, 상기 용액을 혼합하고 약 10℃에서 10 g의 Ca(OH)₂를 더 첨가하여 염기성 (pH=8.7)으로 만들어 재침전시켰다. 재침전된 침강물을 유사하게 여과해 냈다.

이어서, 1800 g의 상기 용액을 35℃의 3-회로 전기투석 스태크 (stack)에서 염 교환하였다. 이 경우, 발효 브로쓰를 2개의 양이온 교환 막이 부착된 생성물 챔버에 통과시켰다. 양극 (cathode) 쪽에서는 단일선택적 양이온 교환 막 (도꾸야마 소다 (Tokuyama Soda), CMS)이 농축물 회로로부터 생성물을 분리하고, 음극 (anode)쪽에서는 통상적인 양이온 교환 막 (도꾸야마 소다, CMX)에 의해 생성물 챔버가 CaCl₂회로와 분리되었다. 농축물 및 CaCl₂회로는 음이온 교환 막 (도꾸야마 소다, AMX)으로 분리되었다. 농축물에는 750 g의 0.5％ 농도의 NaCl 용액을 충진하고, CaCl₂회로에는 900 g의 3.05％ 농도의 CaCl₂용액을 충진하였다. 전극-세정 회로에서는 0.1 몰의 Na₂SO₄용액을 순환시켰다. 막의 총 면적이 500 cm²인 상기 기재한 5개의 기본 유닛으로 구성된 스태크에서 회분식으로 30 mA/cm²의 직류로 실험을 수행하였다. 중지하는데 선택한 기준은 CaCl₂회로에서의 최소 전도율 4 mS/cm였다. 생성물 및 농축물 회로에서의 양이온 분석 결과를 하기 표에 요약하였다:

이로부터, 나트륨은 51％, 암모늄은 66％, 칼륨은 61％가 고갈된 것으로 계산되었다. 평균 전류 수율은 82％였다. 2개의 연결 회로에서 판토텐산의 손실율은 각 경우에 사용된 물질량의 0.08％였다. 실험 동안 생성물 회로의 pH는 7 내지 7.5였고, 농축물 및 CaCl₂회로에서는 약 pH = 6이었다. 실험을 진행하는 동안, 총 전압 강하는 CaCl₂회로에서의 전도율 감소에 따라 약 11 V에서 16 V로 증가하였다.

이어서, 이와 같이 전기투석 처리한 용액을 성공적으로 분무 건조하여 최종 생성물을 수득하였다. 이는, 적당한 예비 처리시에는 2가 양이온에 대한 1가 양이온의 이온 교환에 단일선택적 양이온 교환 막을 사용한 3-회로 전기투석을 사용하여, 최종 생성물의 분무 건조력을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.

Claims

a) D-판토텐산을 생성하고 판토텐산 (pan) 및(또는) 이소루이신/발린 (ilv)의 생합성이 탈조절 (deregulation)되어 있는 하나 이상의 유기체를 0 내지 20 g/L의 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 공급한 배양 배지 중에서 발효시켜, 배양 배지에 2 g/L 이상의 D-판토텐산 염을 형성하는 단계,

b) D-판토테네이트-함유 발효 용액을 전기장을 인가한 하나 이상의 이온-선택 막(들)에 통과시켜, D-판토테네이트-함유 용액으로부터 저분자량의 이온을 제거하는 단계,

c) 칼슘 염기 및(또는) 마그네슘 염기를 첨가하여 유리 D-판토텐산-함유 용액의 pH를 3 내지 10으로 설정하고, 칼슘 판토테네이트 및(또는) 마그네슘 판토테네이트를 함유하는 용액을 수득하는 단계 및

d) 칼슘 판토테네이트- 및(또는) 마그네슘 판토테네이트-함유 용액을 건조 및(또는) 제형화하는 단계

를 포함하는, D-판토텐산 및(또는) 그의 염의 제조 방법.
제1항에 있어서, 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염이 배양 배지에 공급되지 않는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 사용되는 D-판토텐산-생성 유기체가 세균, 효모또는 진균인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 사용되는 미생물이 바실라시애 (Bacillaceae) 과의 세균인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바실러스 (Bacillus) 속의 세균, 바람직하게는 바실러스 섭틸리스 (B. subtilis), 바실러스 리케니포르미스 (B. licheniformis) 또는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens) 종이 사용되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 배양 배지 1 L 당 D-판토텐산 및(또는) 그의 염이 10 g 이상, 바람직하게는 20 g 이상, 특히 바람직하게는 40 g 이상, 매우 특히 바람직하게는 60 g 이상의 양으로 형성되는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 용액의 pH를 5 내지 10으로 설정하는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 용액의 pH를 5 내지 9, 바람직하게는 6 내지 9, 특히 바람직하게는 6 내지 8로 설정하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 단극성 이온 교환 막 및(또는) 양극성 이온 교환 막이 사용되는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 단극성 이온 교환 막이 사용되는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 단일선택적 (monoselective) 이온 교환 막이 사용되는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 처리 이전에 D-판토텐산-함유 발효 용액의 pH를 D-판토텐산의 등전점으로 설정하는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 단극성 이온 교환 막의 전류 밀도를 1 내지 100 mA/cm², 바람직하게는 10 내지 80 mA/cm², 특히 바람직하게는 20 내지 40 mA/cm²로 설정하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 양극성 이온 교환 막의 전류 밀도를 1 내지 150 mA/cm², 바람직하게는 30 내지 100 mA/cm², 특히 바람직하게는 70 내지 90 mA/cm²로 설정하는 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 1가 양이온, 바람직하게는 암모늄, 칼륨 및(또는) 나트륨 이온의 함량이 용액 1 kg 당 1 g 이하의 농도로 감소되는 것인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 용액에 수산화칼슘, 탄산칼슘, 산화칼슘, 수산화마그네슘 및(또는) 염기성 탄산마그네슘을 고체 형태 및(또는) 수성 현탁액으로서 첨가하여 중화시키는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 용액에 2 내지 55 중량％, 바람직하게는 10 내지 50 중량％, 특히 바람직하게는 20 내지 40 중량％의 수산화칼슘을 포함하는 수성 현탁액을 첨가하는 것인 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 용액에 2 내지 65 중량％, 바람직하게는 10 내지 50 중량％, 특히 바람직하게는 20 내지 40 중량％의 탄산칼슘을 포함하는 수성 현탁액을 첨가하는 것인 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 용액에 20 내지 60중량％, 바람직하게는 10 내지 50 중량％, 특히 바람직하게는 20 내지 40 중량％의 수산화마그네슘을 포함하는 수성 현탁액을 첨가하는 것인 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 용액에 2 내지 25 중량％, 바람직하게는 10 내지 20 중량％의 염기성 탄산마그네슘을 포함하는 수성 현탁액을 첨가하는 것인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c) 또는 d)에서 칼슘 판토테네이트 및(또는) 마그네슘 판토테네이트를 함유하는 현탁액을 수득하거나 충진하는 것인 방법.
a) D-판토텐산을 생성하고 판토텐산 (pan) 및(또는) 이소루이신/발린 (ilv)의 생합성이 탈조절되어 있는 하나 이상의 유기체를 0 내지 20 g/L, 바람직하게는 0 g/L의 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 공급한 배양 배지 중에서 발효시켜, 배양 배지에 2 g/L 이상의 D-판토텐산 염을 형성하는 단계; b) D-판토테네이트-함유 발효 용액을 전기장을 인가한 하나 이상의 이온-선택 막(들)에 통과시켜, D-판토테네이트-함유 용액으로부터 저분자량의 이온을 제거하는 단계; c) 칼슘 염기 및(또는) 마그네슘 염기를 첨가하여 유리 D-판토텐산-함유 용액의 pH를 3 내지 10으로 설정하고, 칼슘 판토테네이트 및(또는) 마그네슘 판토테네이트를 함유하는 용액을 수득하는 단계 및 d) 칼슘 판토테네이트- 및(또는) 마그네슘 판토테네이트-함유 용액을 건조 및(또는) 제형화하는 단계를 통해 제조될 수 있는, 동물 사료 첨가제 및(또는) 동물 사료 보조제로서 사용하기 위한 조성물.
제22항에 있어서, 단계 c) 또는 d)에서 칼슘 판토테네이트 및(또는) 마그네슘 판토테네이트를 함유하는 현탁액이 수득되거나 존재하는 것인 조성물.
제22항 또는 제23항에 있어서, 2가 양이온 형태의 D-판토텐산 염, 바람직하게는 칼슘 D-판토테네이트 및(또는) 마그네슘 D-판토테네이트를 포함하는 조성물.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, D-판토텐산 염을 적어도 1 내지 100 중량％, 바람직하게는 적어도 20 내지 100 중량％, 특히 바람직하게는 적어도 50 중량％의 농도로 포함하는 조성물.
제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 1가 양이온 형태의 D-판토텐산 염의 함량이 1 g/kg 이하인 조성물.