KR20030075205A - 동물 사료 첨가제로서의 ｄ-판토텐산 및(또는) 그의 염의제조 방법 - Google Patents

동물 사료 첨가제로서의 ｄ-판토텐산 및(또는) 그의 염의제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 D-판토텐산 및(또는) 그의 염의 개선된 제조 방법 및 동물 사료 첨가제로서 상기 물질의 용도에 관한 것이다.

Description

동물 사료 첨가제로서의 Ｄ-판토텐산 및(또는) 그의 염의 제조 방법 {METHOD FOR THE PRODUCTION OF D-PANTOTHENIC ACID AND/OR SALTS THEREOF AS ADJUNCT FOR ANIMAL FEEDSTUFFS}
본 발명은 D-판토텐산 및(또는) 그의 염의 개선된 제조 방법 및 동물 사료 첨가제로서의 그의 용도에 관한 것이다.
p-판토테네이트는 보조효소 A의 생합성의 출발 물질로서 식물 및 동물계에 널리 분포되어 있다. 식사를 통해 충분한 양의 판토텐산을 소모하는 인간과는 달리, 식물 뿐만 아니라 동물에서는 D-판토테네이트 결핍 증상이 종종 나타난다. 따라서, D-판토테네이트의 이용가능성은 특히 동물 사료 산업에서 경제적으로 매우 중요하다.
통상적으로, D-판토테네이트는 D-판토락톤과 칼슘 β-알라니네이트의 화학 합성에 의해 제조된다 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th edition, 1999년, electronic release, Chapter "Vitamins"]. D-판토락톤의 제조는 부분입체이성질체 염을 거쳐 복잡하고 전통적인 라세미체 분해를 필요로 한다. 화학 합성으로부터 생성된 시판 제품은 보통 D-판토텐산의 칼슘 염인 칼슘 D-판토테네이트이다.
화학 합성에 비하여, 미생물을 사용하는 생물공학적 제조 방법의 장점은, 고등 생물을 위해 사용될 수 있는 판토텐산의 D 형태를 선택적으로 (거울상이성질적으로 순수하게) 제조하는 것이다. 따라서, 화학 합성에서 요구되는 복잡한 라세미체 분해는 필요하지 않다.
미생물을 사용하여 D-판토텐산을 제조하기 위한 다수의 발효 방법이 예를 들어 EP 0 590 857, WO 96/33283, US 6,013,492, WO 97/10340, DE 198 46 499, EP 1 001 027, EP 1 006 189, EP 1 006 192 및 EP 1 006 193에 공지되어 있다.
즉, EP 1 006 189 및 EP 1 001 027호는, 발효 용액 중에 많아야 1 g/L의 D-판토텐산 함량이 달성되는 판토테네이트의 제조 방법을 기재하고 있다. 그러나, 발효 용액 중에서 이러한 낮은 판토텐산 함량, 다시 말해서 고체 함량을 기준으로 하여 10 중량％ 미만의 함량은, D-판토텐산-함유 동물 사료 보조제를 경제적으로 제조하기에는 부적절하다. 지금까지 알려진 방법들의 다른 단점은, 발효 배지로부터의 생성물 단리 단계가 다수의 복잡한 후처리 단계를 필요로 한다는 것이다. 산업적인 규모의 경제적인 제조 방법은 알려져 있지 않다.
독일 특허공개 DE 100 16 321호는 D-판토텐산-함유 동물 사료 보조제를 제조하기 위한 발효 방법을 기재하고 있다. 그러나, 이 방법의 중요한 단점은, 상기 기재된 D-판토텐산을 제조하기 위한 발효 방법에서와 같이, 원하는 생성물을 경제적인 수율로 수득하기 위해서는 판토텐산 전구체 β-알라닌을 발효 배지를 통해 미생물에 보충해야 한다는 것이다.
또한, US 6,013,492호 및 WO 96/332839호는, 배양 배지로부터 불용성 성분들 (예를 들어, 세포 물질)을 여과해 내고, 여액을 활성탄에 흡착시키고, 이어서 D-판토텐산을 유기 용매, 바람직하게는 메탄올로 용출시키고, 수산화칼슘으로 중화시킨 다음 칼슘 D-판토테네이트를 결정화함으로써 발효 용액으로부터 D-판토텐산을 후처리하는 것을 기재하고 있다. 중요한 단점들은, 결정화 동안에 발생되는 주요 생성물이 소실되고, 생성물로부터 제거하기 곤란한 유기 용매가 사용되고, 복잡한 용매 회수 단계가 필요하다는 것이다.
EP 0 590 857호는, 미생물의 배양이 β-알라닌의 공급을 필요로 하는, D-판토텐산의 제조를 위한 발효 방법을 기재하고 있다. 생체물질을 분리해내기 위해 발효 용액을 여과한 다음, 양이온 교환기에 이어서 음이온 교환기를 통해 통과시키고, 이어서 수산화칼슘으로 중화시키고, 증발에 의해 농축시키고, 활성탄을 첨가하고, 한번 이상 여과하고 메탄올 및 염화칼슘을 첨가하여 결정화한다. 생성된 칼슘 판토테네이트-함유 생성물은 칼슘 염 형태의 D-판토텐산에 추가로 염화칼슘을 1:1의 몰비로 함유한다. 염화칼슘 함량의 저하는 전기투석과 이후의 분무 건조를 필요로 한다. 이러한 방법은 다수의 복잡한 단계들과 유기 용매의 사용으로 인해 경제적으로나 생태학적으로나 단점을 갖는다.
본 발명의 목적은, 상기 언급된 단점들을 갖지 않는 D-판토텐산 및(또는) 그의 염의 개선된 제조 방법에 의하여 D-판토텐산 및(또는) 그의 염을 함유하는 동물 사료 보조제 및 그의 제조 방법을 제공하는데 있다. 경제적인 이유에서, β-알라닌의 공급량을 크게 감소시키거나 β-알라닌의 공급이 전혀 필요하지 않은 방법이 바람직하다. 또한, 2가 염이 판토텐산의 1가 염에 비해 낮은 흡습성 특징을 가지므로 추가의 용도, 예를 들어 동물 사료 보조제를 위하여 응집되는 경향이 훨씬 낮기 때문에 2가 염 형태, 특히 알칼리 토금속 염 형태의 D-판토텐산을 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은, 본 발명에 의해 이러한 목적이 유리하게 달성된다는 것을 알아내었다.
본 발명은
a) D-판토텐산을 생성하고 판토텐산 (pan) 및(또는) 이소루이신/발린 (ilv)의 생합성이 탈조절 (deregulation)되어 있는 하나 이상의 유기체를 0 내지 20 g/L의 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 공급한 배양 배지 중에서 발효시켜, 배양 배지에 2 g/L 이상의 D-판토텐산 염을 형성하는 단계,
b) 형성된 D-판토테네이트에 다가 양이온을 함유하는 염을 공급하여, D-판토텐산의 다가 염을 형성하는 단계,
c) D-판토텐산의 다가 염을 함유하는 용액을 나노여과 (nanofiltration)로 후처리하여, D-판토텐산의 다가 염을 농축하는 단계, 및
d) D-판토텐산의 다가 염을 함유하는 나노여과 보유액 (retentate)을 건조 및(또는) 제형화하는 단계를 포함하는,
D-판토텐산 및(또는) 그의 염의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법의 변형법에서는, 단계 c)에서 염화 칼슘 및(또는) 마그네슘을 함유하는 현탁액을 수득할 수 있다. 이후의 단계 d)에서 이 현탁액을 건조 및(또는) 제형화한다.
본 발명의 방법의 단계 a)에서 발효는 회분식, 유가배양식 (fed-batch) 또는반복 유가배양식으로 공지된 절차를 사용하거나 연속적으로 수행된다. 이러한 경우에, 생성된 판토텐산은 통상적인 완충 시스템, 예를 들어 NaOH, KOH 또는 암모니아를 함유하는 포스페이트 완충액을 사용하여 중화된다.
본 발명의 방법의 다른 변형법에서는, 단계 a)에서 발효에 의해 배양 배지 1 L 당 D-판토텐산의 염이 10 g 이상, 바람직하게는 20 g 이상, 특히 바람직하게는 40 g 이상, 매우 특히 바람직하게는 60 g 이상, 특히 70 g/L 이상으로 형성된다.
본 발명의 목적상, 용어 "생성하는"의 형태는, 유기체가 그 자체의 대사 필요량에 요구되는 것 보다 더 많은 양의 D-판토텐산 및(또는) 그의 염을 합성할 수 있음을 의미하는 것이다. 본 발명의 유리한 변형법에서, D-판토텐산 및(또는) 그의 염의 합성량이 세포의 내부에 존재하지 않고 유기체에 의해 배양 배지 내로 완전히 방출되는 것이 이상적이다. 이러한 방출은 그 자체로 공지된 메카니즘에 의하여 능동적이거나 수동적일 수 있다.
본 발명에 따르면, 사용되는 D-판토텐산-생성 유기체는 미생물이다. 본 발명에 있어서, 이것은 진균, 효모 및(또는) 세균을 포함한다. 본 발명에 따르면, 진균, 예를 들어 털곰팡이 (mucor) 또는 효모, 예를 들어 사카로마이세스 (Saccharomyces) 또는 데바로마이세스 (Debaromyces)를 사용하는 것이 바람직하며, 이들 중에서 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 바람직하다. 본 발명에 따르면, 유리하게는 코리네형 세균 또는 바실라시애 (Bacillaceae)가 사용된다. 본 발명의 범위내에 있는 미생물은 바람직하게는 예를 들어 코리네박테리움 (Corynebacterium), 에쉐리히아 (Escherichia), 바실러스 (Bacillus), 아르트로박터 (Arthrobacter), 베비박테리움 (Bevibacterium), 슈도모나스 (Pseudomonas), 살모넬라 (Salmonella), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 액시네토박터 (Acinetobacter) 또는 리조비움 (Rhizobium) 속의 세균이다. 여기에서 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 브레비박테리움 브레브 (Brevibacterium breve) 또는 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스 (B. licheniformis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), 바실러스 세레우스 (B. cereus), 바실러스 렌티모르부스 (B. lentimorbus), 바실러스 렌투스 (B. lentus), 바실러스 피르무스 (B. firmus), 바실러스 판토텐티쿠스 (B. pantothenticus), 바실러스 서큘란스 (B. circulans), 바실러스 코아귤란스 (B. coagulans), 바실러스 메가테리움 (B. megaterium), 바실러스 푸밀루스 (B. pumilus), 바실러스 투린기엔시스 (B. thuringiensis), 바실러스 브레비스 (B. brevis), 바실러스 스테아로서모필루스 (B. stearothermophilus) 및 그들의 16sRNA를 특징으로 하는 군 1의 기타 바실러스 종, 또는 액티눔 마이세탈리스 (Actinum mycetalis)가 특히 바람직하다. 이러한 목록은 설명을 위한 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하지 않는다.
또한, 본 발명은 유리 D-판토텐산 및(또는) 그들의 염을 함유하는 동물 사료 보조제의 제조에 있어서 유전적으로 변형된 유기체의 용도를 포함한다. 이러한 유전적으로 변형된 유기체는 예를 들어 화학적 돌연변이유발에 이어서 적절한 "스크리닝 공정"을 사용하여 선별함으로써 단리될 수 있다. 본 발명에 따르면, "생산 균주"라고 불리는 것은 본 발명의 의미에서 생성물을 제조하기 위해 적절하고 대사유동에 있어서 D-판토텐산 방향으로의 유전적인 변형을 갖는 것을 포함하며, 또한 세포막을 통해 D-판토텐산 및(또는) 그의 염을 방출하는데 있어서의 변형도 포함된다. 이것은 예를 들어, 사용되는 유기체의 관련된 대사 생합성 경로에 있어서, 주요 위치에서의 변형에 의해 달성될 수 있다.
또한, 원하는 생성물의 합성에 필요하거나 요구될 수 있는 동종 및(또는) 이종 뉴클레오티드 서열을 전달하여 생성된 트랜스제닉 유기체를 사용하는 것도 생각할 수 있다. 이러한 경우에, 게놈에서 및(또는) 벡터상에서 국소화된 하나 이상의 유전자를 개별적으로 및(또는) 조합적으로 과다발현 및(또는) 탈조절하는 것을 생각할 수 있다. 유리하게는, 이러한 유형의 트렌스제닉 유기체가, panB, panC, panD, panE 및(또는) 이들의 조합 및(또는) panBCD 오페론을 함유하는 조직화 단위로 구성된 군에서 선택되는 추가의 복제물 및(또는) 유전적으로 변형된 유전자를 함유할 수 있다. 또한, 예를 들어 EP 1 006 189호, EP 1 006 192호, EP 1 006 193호 또는 E 1 001 027호에 기재된 바와 같이, 다른 대사 경로, 예를 들어 이소루이신-발린 생합성 경로가 유기체에서 유리하게 조작될 수 있다. 그 결과, 판토텐산 생합성의 분지쇄 전구체 물질이 더욱 많이 이용가능하게 된다. 적절하다면, 이러한 생합성 경로를 위한 유전자, 다시 말해서 ilvB, ilvN, ilvC 및(또는) ilvD가 과다발현되는 것이 유리하다. 또한, 사용되는 D-판토텐산-생성 유기체에서 예를 들어 과다발현 및(또는) 탈조절을 통한 아스파테이트 α-데카르복실라제 (panD)의 유전적 변형도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 목적상, 용어 "탈조절"이란, 미생물에서 효소의 활성이 변화되거나 변형되도록, 생합성 대사 경로에서 하나의 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 변화시키거나 변형시키는 것을 의미한다. 유전자 생성물이 증가된 양으로 형성되거나 또는 증가된 활성을 갖게 되는 방식으로, 생합성 대사 경로의 하나의 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 변화시키는 것이 바람직하다. 용어 "탈조절된 대사 경로"는, 하나 이상의 효소의 활성이 변화되거나 변형되는 방식으로, 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자가 변화되거나 변형되어진 생합성 대사 경로를 포함한다. 변화 또는 변형은 내인성 프로모터 또는 조절 요소의 제거; 강력한 프로모터, 유도가능한 프로모터 또는 복수개의 프로모터들의 동시 도입; 유전자 생성물의 발현이 변화되도록 하는, 조절 서열의 제거; 유전자의 염색체 위치 변화; 유전자에 근접하거나 유전자 내에 있는 DNA 서열, 예를 들어 리보좀 결합 부위 (RBS)의 변화; 게놈 내의 유전자 복제 수 증가 또는 다양한 수의 플라스미드 복제물의 도입; 유전자 생성물을 수득하기 위한 유전자의 전사 및(또는) 번역에서 중요한 역할을 하는 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 서프레서 (suppressor), 인핸서, 전사 활성인자 등)의 변형 등이 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 이것은 선행 기술에 속하는 유전자의 발현을 탈조절하기 위한 기타 모든 가능성, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용 또는 레프레서 (repressor) 단백질의 차단을 포함한다. 또한, 탈조절은, 유전자 생성물에서의 피드백 조절을 제거하거나 또는 유전자 생성물의 비(比)활성을 더욱 크게하거나 더욱 낮게할 수 있는 유전자의 코딩 영역을 변화시키는 것을 포함한다.
더욱이, 본 발명에 있어서, 보조효소 A를 수득하기 위한 판토텐산 전구체의배출 및(또는) 판토텐산의 유출에 영향을 미치는 효소에 대한 유전적 변형이 유리하다. 이러한 효소를 코딩하는 유전자의 예는 alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA, coaX 등이다. 이러한 목록은 설명을 위한 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하지 않는다. 또한, 보조인자 (예를 들어 메틸렌 테트라히드로폴레이트, 산화환원 균등물 등)의 세포내 생성을 판토텐산 생성에 최적인 양으로 보장하는 유전적 변형이 유리하다.
세포에는 β-알라닌이 상응하는 비-유전적 변형된 유기체에 비해 증가된 농도로 이미 존재하고 있으며, 따라서 예를 들어 EP-A 0 590 857호에서 요구되는 바와 같이 이것을 전구체로서 배양 배지에 첨가할 필요가 없는 것이 유리하다. 판토텐산 (pan) 및(또는) 이소루이신-발린 (ilv) 및(또는) 아스파테이트-α-데카르복실라제 (panD)의 생합성이 탈조절되는 미생물이 유리하다. 또한, 미생물에서 케토판토에이트 환원효소 (panE)가 더욱 과다발현되는 것이 유리하다.
본 발명에 따르면, 적절한 경우, 보조효소 A의 합성을 위해 요구되는 coaA 유전자의 활성이 감소되거나 또는 완전히 없어지는 것이 또한 유리하다 (예를 들어, 바실러스 종의 경우). 이것은, 바실러스가 coaA 이외에도 이러한 효소 작용을 위한 추가의 유전자 (=coaX)를 함유하기 때문이다. coaA 자체가 여전히 충분한 효소 활성 (감소된 효소 활성이라 하더라도)을 갖는 한, 다시 말해서 coaA의 효소 활성이 완전히 소실되지 않는 한, 이 유전자 coaX 또는 상응하는 효소의 활성은 변화되거나, 바람직하게는 감소되거나, 또는 심지어 결실될 수도 있다. 다양한 유전자의 과다발현 이외에도 추가로, 이러한 유전자의 프로모터 영역의 유전자 조작이 유전자 생성물의 과다발현을 일으키는 한, 이러한 유전자 조작이 유리하다.
본 발명의 다양한 실시양태에서, 특허문헌 (PCT/US 출원 0025993)에 기재된 세균 균주, 예를 들어 바실러스 섭틸리스 PA824 및(또는) 그의 유도체가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따르면, 특허문헌 (US 출원번호 60/262,995호)에 기재된 바와 같이 미생물 바실러스 섭틸리스 PA668이 본 발명의 방법에서 사용된다. 이러한 균주 바실러스 섭틸리스 PA824 및 PA668는 다음과 같이 제조되었다:
유전자형 trpC2 (Trp-)를 갖는 균주 바실러스 섭틸리스 168 (마르부르크 (Marburg) 균주 ATCC 6051)로부터 출발하여, Trp+마커 (바실러스 섭틸리스 야생형 W23)의 형질도입을 통해 균주 PY79가 생성되었다. 전통적인 유전공학 방법 (예를 들어, 문헌 [Harwood,C.R. 및 Cutting,S.M.(편집자), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley & Sons,Ltd., 영국 치체스터]에 기재됨)은 균주 PY79내에 돌연변이 ΔpanB 및 ΔpanE1을 도입하였다. 생성된 균주를, 바실러스 섭틸리스 균주 PA221의 게놈 DNA (유전자형 P26panBCD, trpC2 (Trp-) 및 바실러스 섭틸리스 균주 PA303의 게놈 DNA (유전자형 P26panE1)를 사용하여 형질전환시켰다. 생성된 균주 PA327은 유전자형 P26panBCD, P26panE1을 갖고 이것은 트립토판 영양요구변이주 (Trp-)였다. 5 g/L의 β-알라닌 및 5 g/L의 α-케토이소발레레이트로 보충된 SVY 배지 (25 g/L의 디프코 비일 주입 브로쓰 (Difco Veal InfusionBroth), 5 g/L의 디프코 효모 추출물, 5 g/L의 글루탐산나트륨, 2.7 g/L의 황산암모늄을 740 mL의 물에 충진하고, 혼합물을 오토클레이브한 후에 200 mL의 1 M 인산칼륨 pH 7.0 및 60 mL의 50％ 살균 글루코스 용액을 첨가함)를 함유하는 10 mL 배양액에서 바실러스 섭틸리스 균주 PA327을 사용하여 3.0 g/L 이하 (24시간)의 판토텐산 역가를 달성하였다.
바실러스 섭틸리스 균주 PA221 (유전자형 P26panBCD, trpC2 (Trp-))의 생성을 하기에 설명한다: 바실러스 섭틸리스 GP275 플라스미드 라이브러리로부터 출발하여, 대장균 (E.coli)의 panBCD 오페론 (Merkel 등 참조, [FEMS Microbiol.Lett., 143, 1996:247-252])의 서열 정보의 도움을 받아, 바실러스의 panBCD 오페론을 클로닝하기 위해 전통적인 유전공학 방법을 사용하였다. 클로닝을 위하여, 대장균 균주 BM4062 (birts) 및 바실러스 오페론이 birA 유전자에 가깝다는 정보를 이용하였다. 대장균에서 복제될 수 있는 플라스미드내에 panBCD 오페론을 도입하였다. panBCD 오페론의 발현을 개선하기 위하여, 바실러스 섭틸리스 파지 SP01 (P26)의 강력한 구성적 (constitutive) 프로모터를 사용하였고, panB 유전자 앞의 리포좀 결합 부위 (=RBS)를 인공 RBS로 대체하였다. 바실러스에서 천연 panB 유전자의 바로 상류에 있는 DNA 단편을, 플라스미드 위에서 P26panBCD 카세트의 앞에 라이게이션시켰다. 이 플라스미드를 바실러스 섭틸리스 균주 RL-1 (전통적인 돌연변이유발 방법에 의해 수득되는 바실러스 섭틸리스 168의 유도체 (마르부르크 균주 ATCC6051), 유전자형 trpC2 (Trp-))내로 형질전환하고, 상동성 재조합에 의해, 천연 panBCD 오페론을 P26panBCD 오페론으로 대체하였다. 생성된 균주는 PA221이라 불리우며, 유전자형 P26panBCD, trpC2 (Trp-)를 가졌다. 5 g/L의 β-알라닌 및 5 g/L의 α-케토이소발레레이트로 보충한 SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액 내에서 바실러스 섭틸리스 균주 PA221을 사용하여 0.92 g/L까지 (24시간)의 판토텐산 역가가 달성되었다.
바실러스 섭틸리스 균주 PA303 (유전자형 P26panE1)의 생성을 하기에 설명한다. 대장균 panE 유전자 서열을 사용하여, 바실러스 panE 서열을 유사성에 의해 클로닝하였다. 바실러스 섭틸리스에서, panE1 및 panE2라 불리우는 대장균 panE 유전자의 2개의 상동체가 존재한다. 결실 분석은, panE1 유전자가 판토텐산 생성의 90％의 원인이 되는 반면, panE2 유전자의 결실은 판토텐산 생성에 상당한 영향을 미치지 않는다는 것을 밝혀내었다. 여기에서, panBCD 오페론을 클로닝하는 것과 유사하게, 프로모터를 강력한 구성적 프로모터 P26으로 대체하고, panE1 유전자의 앞에 있는 리보좀 결합 부위를 인공 결합 부위로 대체하였다. P26panE1 단편이 바실러스 섭틸리스 게놈에 있는 근원 panE1 좌 안에 통합될 수 있도록 구성되어진 벡터 내에, P26panE1 단편을 클로닝하였다. 형질전환 및 상동성 재조합 후에 생성된 균주를 PA303이라 명명하고, 이것은 유전자형 P26panE1을 갖는다.
5 g/L의 β-알라닌 및 5 g/L의 α-케토이소발레레이트로 보충된 SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액에서 바실러스 섭틸리스 균주 PA303을 사용하여 1.66 g/L까지 (24시간)의 판토텐산 역가를 달성하였다.
스텍티노마이신에 대한 마커 유전자 및 P26ilvBNC 오페론을 함유하는 플라스미드로 PA327를 형질전환함으로써 균주를 더욱 구축하였다. amyE 좌 안에 통합된 P26ilvBNC 오페론을 PCR에 의해 증명하였다. 하나의 형질전환체를 PA340 (유전자형 P26panBCD, P26panE1, P26ilvBNC, specR, trpC2 (Trp-))라 명명하였다. 5 g/L의 β-알라닌만이 보충된 SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액에서 바실러스 섭틸리스 균주 PA340을 사용하여 3.6 g/L (24시간)까지의 판토텐산 역가를 달성하였다; 5 g/L의 β-알라닌 및 5 g/L의 α-케토이소발레레이트로 보충된 SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액에서 4.1 g/L (24시간)까지의 판토텐산 역가를 달성하였다.
또한, 탈조절된 ilvD 카세트를 균주 PA340내에 도입하였다. 이를 위하여, 인공 RBS2를 함유하는 P26프로모터의 조절하에서 ilvD 유전자를 함유하는 플라스미드를 PA340내에 형질전환하였다. 상동성 재조합에 의해 근원 ilvD 좌 내에 P26ilvD 유전자를 통합하였다. 생성된 균주 PA374는 유전자형 P26panBCD, P26panE1, P26ilvBNC, P26ilvD, specR 및 trpC2 (Trp-)을 갖는다. 5 g/L의 β-알라닌만이 보충된 SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액 내에 바실러스 섭틸리스 균주 PA374를 사용하여 2.99 g/L (24시간)까지의 판토텐산 역가를 달성하였다.
β-알라닌의 공급 없이 균주 PA374를 사용하여 판토텐산을 생성하기 위하여, 아스파테이트-α-데카르복실라제를 코딩하는 유전자 panD의 추가의 복제를 균주 PA374 내에 도입하였다. 이를 위하여, 균주 PA401의 염색체 DNA를 PA374 내에 형질전환하였다. 테트라사이클린에 대한 선별에 의해 균주 PA377을 수득하였다. 생성된 균주 PA377은 유전자형 P26panBCD, P26panE1, P26ilvBNC, P26ilvD, specR, tetR 및 trpC2 (Trp-)을 갖는다. SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액에서 바실러스 섭틸리스 균주 PA377을 사용하여 전구체의 공급없이 1.31 g/L (24시간)까지의 판토텐산 역가를 달성하였다.
바실러스 섭틸리스 균주 PA401 (유전자형 P26panD)의 제조를 이하에 설명한다: 테트라사이클린 마커 유전자를 보유한 벡터 내에 panBCD 오페론으로부터 바실러스 섭틸리스 panD 유전자를 클로닝하였다. 프로모터 P26및 상기 기재된 인공 RBS를 panD 유전자의 앞에 클로닝하였다. 제한효소 소화는, 테트라사이클린 마커 유전자 및 P26panD 유전자를 함유하는 단편을 생성하였다. 이 단편을 다시 라이게이션시키고, 상기 기재된 균주 PA221 내로 형질전환하였다. 단편을 균주 PA211의 게놈 내로 통합하였다. 생성된 균주 PA401은 유전자형 P26panBCD, P26panD, tetR 및 trpC2 (Trp-)를 갖는다. 5 g/L의 α-케토이소발레레이트가 보충된 SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액 내에 바실러스 섭틸리스 균주 PA401을 사용하여 0.3 g/L (24시간)까지의 판토텐산 역가를 달성하였다. 5 g/L의 D-판토텐산 및 10 g/L의 L-아스파테이트가 보충된 SVY 배지를 함유하는 10 mL 배양액 내에서 2.2 g/L (24시간)까지의 판토텐산 역가를 달성하였다.
균주 PA377로부터 출발하여, 균주 PY79로부터의 염색체 DNA로 형질전환함으로써 트립토판-원영양 균주를 생성하였다. 이 균주 PA824는 유전자형 P26panBCD, P26panE1, P26ilvBNC, P26ilvD, specR, tetR 및 Trp+을 갖는다. SVY 배지 중의 10 mL 배양액에서 바실러스 섭틸리스 균주 PA824를 사용하여, 전구체의 공급없이 4.9 g/L (48시간)까지의 판토텐산 역가를 달성하였다 (비교 PA377: 48시간 동안 3.6 g/L까지). 균주의 정확한 구축 방법은 PCT/US 출원 0025993에 첨부된 것과 같다.
PA668의 제조를 하기에 설명한다: 야생형 panBCD 오페론으로부터 바실러스 panB 유전자를 클로닝하고, 클로람페니콜 내성 유전자에 추가로 vpr 좌의 바실러스 섭틸리스 서열을 함유하는 벡터 내에 이것을 삽입하였다. 강력한 구성적 프로모터 P26을 panB 유전자의 5'말단 앞에 도입하였다. P26panB 유전자, 클로람페니콜 내성에 대한 마커 유전자 및 바실러스 섭틸리스 vpr 서열을 함유하는 하나의 단편을 제한효소 소화에 의해 수득하였다. 단리된 단편을 다시 라이게이션하고, 이것을 사용하여 균주 PA824를 형질전환하였다. 생성된 균주를 PA668이라 명명하였다. PA668의 유전자형은 P26panBCD, P26panE1, P26ilvBNC, P26panB, specR, tetR, CmR 및 Trp+이다. PA668의 2개의 콜로니를 단리하였으며, 하나를 PA668-2A라 명명하고 다른 것을 PA668-24라 명명하였다. 전구체의 공급 없이, 바실러스 섭틸리스 균주 PA668-2A를 사용하여 SVY 배지 중의 10 mL 배양액에서 48시간 내에 1.5 g/L의 판토텐산 역가를 달성하였다. 10 g/L의 아스파테이트로 보충된 10 mL 배양액에서, 5 g/L까지의 역가를 달성하였다. 바실러스 섭틸리스 균주 PA668-24를 사용하여, 전구체의 공급 없이 SVY 배지 중의 10 mL 배양액에서 48시간 내에 1.8 g/L의 판토텐산 역가를 달성하였다. 10 g/L의 L-아스파테이트로 보충된 10 mL 배양액에서, 4.9 g/L 까지의 역가를 달성하였다.
균주의 정확한 구축 방법은 PCT/US 출원 0025993호 및 US 출원번호 60/262,995호에서 찾아볼 수 있다.
상기 기재된 균주 PA377을 사용하면, 10 L 규모의 SVY 배지 (25 g/L의 디프코 비일 주입 브로쓰, 5 g/L의 디프코 효모 추출물, 5 g/L의 트립토판, 5 g/L의 글루탐산나트륨, 2 g/L의 (NH4)2SO4, 10 g/L의 KH2PO4, 20 g/L의 K2HPO4, 0.1 g/L의 CaCl2, 1 g/L의 MgSO4, 1 g/L의 시트르산나트륨, 0.01 g/L의 FeSO4·7HO 및 하기 조성을 가진 1 mL/L의 미량 염 용액: 0.15 g의 Na2MoO4·2H2O, 2.5 g의 H3BO3, 0.7 g의 CoCl2·6H2O, 0.25 g의 CuSO4·5H2O, 1.6 g의 MnCl2·4H2O, 0.3 g의 ZnSO4·7H2O, 물로 1 L까지 만듬) 중의 글루코스-제한 발효에서, 글루코스 용액을 연속 공급하면서, 발효 브로쓰 중에 18 내지 19 g/L (22 내지 25 g/L)의 판토텐산 농도가 36시간 (48시간) 내에 달성된다.
PA377의 트립토판-원영양 유도체인 PA824의 글루코스-제한 발효의 경우에,효모 추출물 배지 (10 g/L의 디프코 효모 추출물, 5 g/L의 글루탐산나트륨, 8 g/L의 (NH4)2SO4, 10 g/L의 KH2PO4, 20 g/L의 K2HPO4, 0.1 g/L의 CaCl2, 1 g/L의 MgSO4, 1 g/L의 시트르산나트륨, 0.01 g/L의 FeSO4·7H2O 및 1 mL/L의 상기 기재된 미량의 염 용액)에서, 글루코스 용액을 연속적으로 공급하면 10 L 규모에서 각각 36시간, 48시간 및 72시간 후에 발효 브로쓰내에서 20 g/L, 28 g/L 및 36 g/L의 판토텐산 농도가 달성된다.
배지를 추가로 최적화함으로써, 10 g/L의 디프코 효모 추출물, 10 g/L의 NZ 아민 A (독일 에르프트스타트에 소재하는 퀘스트 인터내셔날 게엠베헤 (Quest International GmbH) 제품), 10 g/L의 글루탐산나트륨, 4 g/L의 (NH4)2SO4, 10 g/L의 KH2PO4, 20 g/L의 K2HPO4, 0.1 g/L의 CaCl2, 1 g/L의 MgSO4, 1 g/L의 시트르산나트륨, 0.01 g/L의 FeSO4·7H2O 및 1 mL/L의 상기 기재된 미량 염 용액으로 구성된 배지 중에서의 글루코스-제한 발효에서, 균주 PA824를 사용하면, 글루코스 용액을 연속적으로 공급할 때 10 L 규모에서 36시간 (48시간)내에 발효 브로쓰 중에 37 g/L (48 g/L)의 판토텐산 농도가 달성된다. 배지를 추가로 최적화함으로써, 발효 시간을 증가시킴으로써, 공정 및 균주를 개량함으로써, 그리고 각각의 단계들을 조합함으로써, 발효 브로쓰 내에서 판토텐산 농도가 더욱 증가하는 것을 생각할 수 있다. 즉, 상기 기재된 PA824의 유도체인 균주의 발효에 의해 상기 기재된 판토텐산 농도가 달성될 수 있다. 유도체는 전통적인 균주 발생과 그 이후에 유전공학적 조작에의해 제조될 수 있다. 배지, 균주 및 발효 공정의 개발에 의해, 발효 브로쓰내에서 판토텐산 역가가 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 및 >90 g/L 초과로 증가될 수 있다.
본 발명의 방법의 본질적인 장점은, 하나 이상의 탄소원 및 질소원과는 별도로, 출발 화합물로서의 다른 전구체를 함유하지 않는 배양 배지 중에서 발효가 수행된다는 점이다. 다시 말해서, D-판토텐산의 생합성은 다른 전구체의 공급과 무관하다. 본 발명의 목적상, 이러한 전구체는 β-알라닌 및(또는) L-아스파테이트 및(또는) L-발린 및(또는) α-케토이소발레레이트 및(또는) 이들의 조합과 같은 물질이다. 본 발명의 방법의 바람직한 변형법에서, 탄소원 및 질소원을 함유하지만 발효 과정 동안에 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염은 첨가되거나 공급되지 않는 배양 배지 중에서, D-판토텐산-생성 유기체의 발효가 수행된다. 다시 말해서, 본 발명에서는 배양 배지 1 L 당 10 g 이상, 바람직하게는 20 g 이상, 특히 바람직하게는 40 g 이상, 매우 특히 바람직하게는 60 g 이상, 특히 70 g 이상의 D-판토텐산을 생성하기 위하여 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 공급할 필요가 없다. 특히, 다수의 전구체가 매우 고가이기 때문에, 전구체의 공급이 필요하지 않다는 것은 공지의 방법에 비하여 본 발명의 방법의 중요한 경제적인 장점이 된다.
그러나, 본 발명은 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염의 첨가를 배제하지 않으며, 따라서 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 첨가함으로써 D-판토텐산의 수율이 더욱 증가될 수 있다. 예를 들어, 판토텐산의 요구되는 전구체가 모두 충분한양으로 존재하는 것으로 가정하는 경우에는 panD 유전자의 활성만이 판토텐산 생성의 추가 증가를 제한하기 때문에, 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 첨가함으로써 판토텐산의 수율이 예를 들어 50％ 이상 더 증가될 수 있다. 본 발명의 유리한 변형법에서, 판토텐산 수율을 50％ 이상 더욱 증가시키기 위하여 20 g/L 이하의 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 배양 배지에 첨가할 수 있다. 약 15 g/L의 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 배양 배지에 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라 상기 언급된 유기체를 발효시키기 위해 배양 배지 중에서 사용하기에 적절한 탄소원의 예는 당, 예컨대 전분 가수분해물 (단당류, 이당류, 올리고당류), 바람직하게는 글루코스 또는 수크로스, 사탕무 또는 케인 당 당밀, 단백질, 단백질 가수분해물, 대두분, 옥수수 침지액, 지방, 유리 지방산, 이전의 발효로부터의 재순환 세포 또는 그의 가수분해물 및 효모 추출물이다. 이러한 목록은 본 발명을 제한하지 않는다.
또한, 본 발명의 방법은, 전체 당 함량이 발효의 마지막까지 최소로 감소되는 것을 유리한 특징으로 하는데, 그 이유는 그렇지 않을 경우 점착으로 인해 발효 용액의 건조 및(또는) 제형화가 곤란해지기 때문이다. 본 발명에 따르면, 이것은 탄소원이 소모된 후에 (회분 배양의 경우) 또는 탄소원의 농도가 실제로 제로 (유가배양, 반복된 유가배양 또는 연속 공정 절차의 경우)가 되도록 탄소 공급이 중단 및(또는) 조절된 후에 (유가배양 또는 반복된 유가 배양에서의 공정 절차의 경우) 일부 시간 동안 발효를 계속함으로써 달성된다. 본 발명에 따르면, 이것은 탄소원(예를 들어, 당 용액)의 첨가를 중단한 후에, 발효 용액 중에서 용존 산소 농도 (pO2)가 포화 수치의 80％ 이상, 바람직하게는 90％, 특히 바람직하게는 95％으로 달성될 때까지 계속 발효시킴으로써 달성된다.
본 발명에 따라 적절한 질소원의 예는 암모니아, 황산암모늄, 우레아, 단백질, 단백질 가수분해물 또는 효모 추출물이다. 이러한 목록은 본 발명을 제한하지 않는다.
또한, 발효 배지는 미네랄 염 및(또는) 미량 요소, 예컨대 아미노산 및 비타민을 함유한다. 적절한 발효 배지의 정확한 조성은 다수 공지되어 있고 당업자에게 이용가능하다. 적절하다면 소포제의 첨가와 함께, 적절한 D-판토텐산-생성 유기체를 발효 배지에 접종한 후에 (당업자에게 공지된 세포 밀도로) 유기체를 배양한다. 각종 무기 또는 유기 알칼리 또는 산, 예를 들어 NaOH, KOH, 암모니아, 인산, 황산, 염산, 포름산, 숙신산, 시트르산 등을 사용하여, 배지 pH의 필요한 조절을 달성할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이 예를 들어 NaOH, KOH, 암모니아, 인산, 황산, 염산, 포름산, 숙신산, 시트르산 등과 같은, 발효 동안에 사용되는 완충 시스템 때문에, 형성되는 D-판토텐산이 사용된 완충 시스템에 따라 각각의 염(들)의 형태로 발효 용액에 존재한다. 이러한 경우에, 특히 1가 양이온 형태의 D-판토텐산의 염이 불리하기 때문에 본 발명에서는 양이온 교환기를 사용하여 발효 용액을 제조한다. 본 발명에 따라 나노여과에 의해 발효 용액을 후처리한다. 이를 위해, 본 발명에따라, 먼저, 형성된 D-판토테네이트에 다가 양이온을 함유하는 염을 공급하여 D-판토텐산의 다가 염을 형성한다. 본 발명에 따라, 다가 양이온을 함유하는 염을 단계 a)의 발효 단계 동안, 바람직하게는 단계 a)의 끝 또는 그 후에 고체 형태 또는 수용액으로 첨가한다. 다가 양이온을 함유하는 수용액은 예를 들어 연속적으로 공급할 수 있다.
또한, 나노여과의 상류의 단계, 즉 본 발명의 방법의 단계 c)의 나노여과 전에, 용액 중에 침전된 성분 또는 세포 덩어리를 분리 제거할 수 있다. 이 경우, 분리는 경사분리 또는 막 여과, 바람직하게는 한외여과에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 방법의 변형법으로, 막 여과를 투석여과 (diafiltration)로 수행한다. 이 때도 마찬가지로, 본 발명에 따라, 다가 양이온을 함유하는 염을 D-판토테네이트 함유 용액의 막 여과 동안 또는 그 후에 고체 형태 또는 수용액으로 첨가할 수 있다. 예를 들어, 이 때 다가 양이온을 함유하는 수용액을 연속으로 공급한다.
용액 중에 침전 분리된 성분 및(또는) 세포 덩어리, 예를 들어 약간 용해성이거나 또는 불용성인 인산염 또는 황산염, 효소, 호르몬, 단백질, 항생제, 파이로겐 (pyrogens), 바이러스, 다당류, 콜로이드, 계면활성제, 구충제 또는 다른 무기 물질의 분리에서, 분리는 중력, 원심력, 압력 또는 진공을 사용한다. 예시적인 방법은 특히 경사분리, 수력분급 (elutriation), 체질, 풍력분급, 분류, 여과, 투석, 침강, 정밀여과 (microfiltration), 한외여과, 부유, 거품 분별, 싱크-스윔 (sing-swin) 분리, 정화, 원심분리 또는 분리이다. 막 분리 공정, 예를 들어 공급면과 투과면 사이의 압력 차이에 의해 작동되는 정밀여과 또는 한외여과는 막 여과로 요약된다. 상기 방법들은 예를 들어 분리 한도가 상이하다. 즉, 한외여과의 경우, 차단 한도는 예를 들어 미세 여과의 경우에서와 같이 입자 크기를 기준으로 하지 않고, 약 103내지 2 ×106Da 범위의 몰량을 기준으로 한다. 한외여과의 경우, 여액 (투과액) 이외에, 농축물 (보유액)으로서 공지된 것이 또한 생성된다.
고체 물질을 분리 제거하거나 또는 용해된 중간 분자량 및 고분자량 물질을 농축하거나 또는 고갈시키기 위해, 유리하게는 비대칭적으로 구조화된 다공성 막을 사용한다. 유리한 변형법으로, 본 발명에 따라 사용되는 막은 실질적인 분리를 실행하는 분리층 및 분리층을 포함하며 분리층보다 더 큰 공극을 갖는 단일층 또는 다층의 지지층으로 구성된다. 분리층 및 지지층은 유기 또는 무기 중합체, 세라믹, 금속 또는 탄소로 이루어질 수 있으며, 반응 매질 및 공정 온도에서 안정하여야 한다. 이들의 예는 표 1에 나열되어 있으나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
막은 그 자체가 공지된 평면, 관형, 다중채널 요소, 모세관 또는 코일 (coiled) 모듈의 가요성 관, 모세관, 중공 섬유 또는 평면 막의 형태로 사용할 수 있다. 보유액 및 투과액 사이의 최적의 막횡단 압력은 막 공극의 직경 또는 차단 한도 (분자량 단위로 표시됨), 막의 기계적 안정성 및 막의 종류에 따라 본질적으로 1 내지 40 bar이다. 일반적으로, 막횡단 압력이 높을수록 투과액 유량이 높아진다. 공급물 (처리할 용액)을 과도한 압력에서 공급할 경우, 투과액 압력을 증가시켜 막횡단 압력을 조정할 수 있다.
운전 온도는 생성물 안정성 및 막 안정성에 따라 달라진다. 운전 온도는 약20 내지 90℃, 바람직하게는 약 40 내지 70℃이다. 온도가 높을수록 투과액 유량이 높아진다. 예를 들어 표 2에 따른 막을 사용할 수 있으나, 이들은 본 발명을 한정하지 않는다.
세포 분리도 또한 본 발명에 따라 유리하게는 특정 유형의 막 여과, 즉 투석여과로 수행할 수 있다. 투석여과는 D-판토텐산의 다가염을 함유하는 용액을 용기, 펌프 및 하나 이상의 막 모듈을 포함하는 회로에 통과시키고, 투과액이 생성될 수 있도록 막 모듈의 압력을 설정함으로 회분식으로 실시할 수 있다. 연속적으로, 또는 특정 시간에, 제거할 생성물을 함유하지 않거나 또는 분리 회로에 첨가되는 시점에 보다 낮은 농도로 함유하는 수용액 또는 물을 첨가한다. 본 발명에 따라서, 수용액은 다가 양이온의 염, 예를 들어 칼슘 할라이드 또는 마그네슘 할라이드 또는 이들의 조합, 바람직하게는 칼슘 및(또는) 마그네슘의 클로라이드를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명에 따라서, 투석여과에 의한 세포 제거는 바람직하게는 복수의 막 모듈을 직렬로 연결하거나 또는 각각 하나 이상의 막 모듈을 갖는 펌프 회로를 직렬로 연결하여 연속적으로 수행할 수 있다. 막 모듈 또는 펌프 회로의 상류, 또는 막 모듈과 펌프 회로들의 사이, 또는 막 모듈과 펌프 회로의 하류에서, 제거할 생성물을 함유하지 않거나 또는 공급면에서보다 더 낮은 농도로만 함유하는 수용액 또는 물을 첨가할 수 있으며, 이 때, 배치의 변형법으로서, 수용액은 다가 양이온의 염, 예를 들어 칼슘 할라이드 또는 마그네슘 할라이드 또는 이들의 조합, 바람직하게는 칼슘 및(또는) 마그네슘의 클로라이드를 함유할 수 있다.
본 발명에 따라서, 한외여과 또는 투석여과는 발효 배출물을 직접 사용하여 실시하거나 또는 발효 배출물을 예를 들어 원심분리, 경사분리 또는 유사한 절차로 처리한 후에 실시할 수 있다.
본 발명에 따라, 용액 중에 침전 분리된 성분 또는 세포 덩어리를 제거할 경우, 본 발명의 방법의 단계 b)에 따라 다가 양이온을 함유하는 염의 첨가는 한외여과 또는 투석여과 동안 또는 그 후에 실시할 수 있다. 본 발명의 방법의 변형법으로, 첨가되는 다가 양이온은 예를 들어 칼슘 및(또는) 마그네슘의 클로라이드, 니트레이트, 히드록사이드, 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 글리시네이트 및(또는) 락테이트이다. 이 경우, 다가 양이온, 예를 들어 Ca2+는 D-판토테네이트 1 몰 당 0.05 내지 50 몰, 바람직하게는 D-판토네이트 1 몰 당 0.2 내지 2 몰의 농도로 공급할 수 있다.
이어서, 본 발명의 방법의 단계 c)에서, D-판토텐산의 다가 염을 함유하는 용액을 나노여과로 후처리하여, D-판토텐산의 다가 염을 농축하는 동시에 원치 않는 1가 이온, 바람직하게는 1가 양이온, 예를 들면 암모늄, 나튼륨 또는 칼륨 이온을 고갈시킨다. 본 발명의 방법에서, 1가 양이온, 예를 들어 암모늄, 칼륨 및(또는) 나트륨 이온의 함량은 용액 1 kg 당 5 g 이하의 농도로 감소한다.
본 발명은 시판되는 모든 나노여과 시스템을 포함한다. 분리는 유리하게는 비대칭적으로 구조화된 다공성 막에서 수행한다. 본 발명의 방법의 바람직한 변형법에서, 분리에 사용되는 막은 실질적인 분리를 실행하는 분리층, 및 분리층을 포함하고 분리층보다 더 큰 공극을 갖는 단일층 또는 다층의 지지층으로 이루진다. 분리층 및 지지층은 유기 중합체, 세라믹, 금속 또는 탄소로 이루어질 수 있으며, 반응 매질 및 공정 온도에서 안정하여야 한다. 분리층을 위한 바람직한 재료는 폴리아미드, 폴리이미드 또는 폴리피페라진이다. 분리층은 또한 양성 또는 음성의 표면 전하를 갖는다. 음이온으로 관능화된 나노여과막의 예는 데잘 (DESAL) 5 DK 막이나, 본 발명은 배타적으로 이 막만을 사용하는 것에 한정되지 않는다.
막은 그 자체가 공지된 평면, 관형, 다중채널 요소, 모세관 또는 코일 모듈의 가요성 관, 모세관, 중공 섬유 또는 평면 막의 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 방법의 유리한 변형법으로, 단계 c)의 나노여과에서, 5 내지 100 bar, 바람직하게는 20 내지 80 bar 범위의 막횡단 압력 차이를 조성할 수 있다.
공정 온도는 유리하게는 20 내지 80℃, 바람직하게는 30 내지 60℃이다. 또한, 나노여과는 당업계의 숙련자들에게 공지된 방식으로 하나 이상의 단계의 회분식으로 또는 연속식으로 실시할 수 있다.
바람직한 변형법에서, 하나 이상의 각각의 나노여과 단계(들) 전에, 다가 양이온을 함유하는 염을 고체 형태 또는 수용액으로 첨가한다. 본 발명에 따라서, 다가 양이온은 칼슘 및(또는) 마그네슘의 클로라이드, 니트레이트, 히드록사이드, 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 글리시네이트 및(또는) 락테이트로서 첨가된다. 이 경우, 다가 양이온으로서 Ca2+은 D-판토테네이트 1 몰 당 0.05 내지 50 몰, 바람직하게는 D-판토테네이트 1 몰 당 0.2 내지 2 몰의 농도로 공급할 수 있다(혼합 후의 상태를 기준으로 한 것임).
본 발명의 방법에서, 다가 양이온을 함유하는 염은 단계 a)의 발효 동안, 바람직하게는 단계 a)의 발효의 끝 또는 그 후에, 또는 세포 분리 동안 또는 그 후에 고체 형태 또는 수용액으로 첨가된다.
또한, 본 발명에 따라, 나노여과 단계 동안 다가 양이온을 함유하는 염을 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 또한, 다가 양이온을 함유하는 수용액을 연속적으로 공급할 수 있다.
본 발명의 방법의 또다른 변형법으로, 나노여과의 상류에 하나 이상의 공정 단계에서 생성물 농도가 상이한 용액들이 발생할 수 있음을 생각할 수 있다. 상기 용액들을 생성물 농도가 증가하는 순서로 연속적인 나노여과 단계에 공급하는 방식으로, 상기 용액들을 나노여과로 추가로 가공할 수 있다.
본 발명에 따라, 상기한 본 발명의 방법의 결과로서, 주로 판토텐산의 다가 염이 나노여과의 보유액 중에 농축된다. 투과액 용액에는 주로 1가 이온이 농축되며, 음이온으로 관능화된 나노여과막을 사용할 경우에는 1가 양이온이 농축된다. 이 경우, 보유액 중 1가 양이온, 바람직하게는 암모늄, 칼륨 및(또는) 나트륨 이온의 함량은 용액 1 kg 당 5 g 이하의 농도로 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따라서, 나노여과의 투과액 또는 그의 일부를 본 발명의 방법의 단계 a)의 발효로 재순환시킬 수 있다. 투과액 또는 그 일부의 이러한 재순환은 연속적으로 수행할 수 있다. 나노여과 외에 실시되는 상기 공정 단계는 다가 염 형태의 D-판토테네이트의 예비농축 또는 추가 농축에 기여한다.
본 발명에 따라 사용되는 나노여과의 또다른 이점은 (보유액 용액 중의) 1가 양이온의 감소가 보유액의 부피 감소와 동시에 수행될 수 있다는 것이다. 즉, 나노여과를 통한 D-판토테네이트 함유 발효 용액의 후처리는 본 발명에 따라 D-판토테네이트의 생성을 위한 이온교환 및 농축 공정으로서 사용될 수 있다. 이것은 연속적인 공정 단계들의 단순화 및 그와 동시에 증가된 효율을 유발하는 이점이 있다. 예를 들어, 건조시의 에너지 소비는 농축으로 인해 크게 감소될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 원심분리 및(또는) 경사분리 및(또는) 한외여과를 사용하여, 발효 용액에서 세포 덩어리를 제거한다. 판토테네이트 이온 1 몰 당 0.05 내지 50 몰, 바람직하게는 판토테네이트 이온 1 몰 당 0.2 내지 2 몰의 Ca2+이온을 바람직하게는 0.01 내지 10 몰/L의 Ca2+를 갖는 희석 용액의 형태로 첨가한 후, 생성된 용액을 나노여과 모듈 내로 도입한다. 막횡단 압력의 차이는 약 5 내지 100 bar, 바람직하게는 약 20 내지 80 bar, 특히 바람직하게는 약 40 내지 70 bar 범위이다. 이 경우, 나노여과 전 또는 나노여과 동안, Ca2+이온을 함유하는 수용액을 공급면의 막을 가로질러 흐르는 용액에 첨가할 수 있다. 보유액의 부피는 출발 용액의 30 내지 200％이다. 또한, 존재하는 1가 양이온의 약 5 내지 99％, 바람직하게는 30 내지 80％가 제거된다.
이어서, 바람직하게는 칼슘 D-판토테네이트, 마그네슘 D-판토테네이트 또는 이들의 혼합물을 함유하는 보유액을 건조 및(또는) 제형화한다. 칼슘 D-판토테네이트 및(또는) 마그네슘-D-판토테네이트를 함유하는 용액의 건조 및(또는) 제형화는 그 자체가 공지된 방법, 예를 들면 분무 건조, 분무 과립화, 유동층 건조, 유동층 과립화, 드럼 건조 또는 스핀-플래쉬 (spin-flash) 건조 [Ullmann's Encylopedia of Industrial Chemistry, 6th edition, 1999, eletronic release, chapter "Drying of Solid Materials"]로 수행된다. 대류 건조의 기체 유입 온도는 100 내지 280℃, 바람직하게는 120 내지 210℃ 범위이다. 기체 배출 온도는 50 내지 180℃, 바람직하게는 60 내지 150℃이다. 목적하는 입자 크기 분포를 달성하기 위해, 미세한 입자를 분리 제거하여 재순환시킬 수 있다. 또한, 굵은 입자를 밀 (mill)에서 분쇄한 후, 마찬가지로 재순환시킬 수 있다.
본 발명의 방법은 원치 않는 양이온을 효과적이고도 실질적으로 완전하게 제거하는 동시에, 이후의 공정 단계들, 특히 건조 및(또는) 제형화를 단순화하거나 또는 보다 효율적이 되게 하는 부피의 감소가 일어난다는 이점을 갖는다. 또한, 생성물 분해가 발생하지 않거나 또는 단지 극도로 낮은 생성물 분해만이 발생하는 동시에, 생성물 수율이 높다. 발효 동안 또는 발효의 끝, 또는 한외여과 또는 투석여과 동안 또는 한외여과 또는 투석여과의 끝, 또는 나노여과 단계 동안 다가 양이온의 염 용액을 공급하고(거나), 투과액을 발효 용액으로 재순환시킴으로써, 다가 이온, 바람직하게는 칼슘 또는 마그네슘과 같은 2가 이온 형태의 D-판토테네이트의 수율이 더욱 증가한다.
또한, 상기 기재된 방법에서, 본 발명에 따라 복잡한 후처리 단계를 감소시키며, 특히 유기 용매의 사용을 피하는 동시에 높은 생물학적 가치를 가진 원하는 생성물을 생성하는 것이 유리하다. 또한, 본 발명에 따르면, 생성된 폐수의 양이상당히 감소된다. 이로써 복잡한 후처리 및 폐기 설비가 더욱 절감된다. 따라서, 본 발명의 방법은 종래의 방법에 비해 더욱 간단하고 결점이 덜하고 시간-소모가 적고 훨씬 저렴하므로 더욱 경제적이라는 유리한 특징을 갖는다.
그러나, 이로 인해 본 발명의 방법이 변형 가능성을 배제하는 것은 아니다. 상기한 본 발명의 방법은 모두 당업계에 숙련자에게 익숙한 하기 공정 단계들 중 하나 이상으로 보완될 수 있다. 이 경우, 하기 공정 단계 및 현재까지 공지된 공정 단계의 모든 생각할 수 있는 조합이 본 발명에 따라 포함된다.
따라서, 본 발명의 방법으로부터 생성된 용액은 예를 들어 가열 (살균) 또는 다른 방법, 예를 들면 저온살균법 또는 살균 여과에 의해 소독할 수 있다.
본 발명의 방법의 다른 변형법에서, 보유액의 건조 및(또는) 제형화 이전에, 생체물질의 용균 및(또는) 살균, 및(또는) 발효 용액으로부터 생체물질의 분리, 및(또는) 추가의 첨가제 첨가, 및(또는) 바람직하게는 물의 제거에 의한 발효 용액 농축을 포함하여, 이들 단계의 하나 이상 및(또는) 조합을 수행할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 여전히 발효 용액 중에서 또는 그렇지않으면 발효 용액으로부터 생체물질을 분리해 낸 후까지도 생체물질의 용균 및(또는) 살균을 수행하는 방법에 관한 것이다. 이것은 예를 들어 바람직하게는 80 내지 200℃에서의 온도 처리, 및(또는) 바람직하게는 황산 또는 염산으로의 산 처리, 및(또는) 바람직하게는 라이소자임으로의 효소 처리에 의해 수행될 수 있다. 또한, 존재하는 세포 덩어리를 나노여과를 통해 직접 제거하는 것, 즉 다가 양이온에 대한 1가 양이온의 교환과 동시에 제거하는 것을 생각할 수 있다.
나노여과를 통한 후처리로부터 생성된 용액은 건조 및(또는) 제형화 전에 적합한 증발기, 즉 강하경막 증발기, 박막 증발기 또는 회전증발기를 통해 농축시킬 수 있다. 이러한 증발기는 예를 들어 GIG사 (오스트리아 4800 아프난크 푸크하임 소재), GEA 칸츨러(Canzler)사 (독일 52303 뒤렌 소재), 디젤 (Diessel)사 (독일 31103 힐데스하임 소재) 및 피톤 (Pitton)사 (독일 35274 키르크하인 소재)에 의해 제작된다.
최종 생성물의 색 성질을 개선하기 위하여, 추가의 여과 단계를 수행할 수 있고, 이 때 공정 동안에 수득되는 용액 또는 현탁액에 약간의 활성탄을 첨가한 다음, 활성탄-함유 현탁액을 여과한다. 또는, 발효 동안에 수득되는 용액을 작은 활성탄 층을 통해 통과시킬 수 있다. 이를 위해 필요한 활성탄의 사용량은 발효 용액의 수 중량％의 범위이고, 당업자의 지식 및 경험에 따른다. 이러한 여과는 여과에 앞서 통상적인 응집 보조제를 각각의 용액에 첨가함으로써 단순화시킬 수 있다 (예를 들어, 루드빅샤펜 바스프 아게로부터의 세디푸르 (Sedipur) CF 902 또는 세디푸르 CL 930).
본 발명의 유리한 실시양태에서, 가열에 의해 발효 배출물 (발효 브로쓰)을 살균한 다음, 원심분리, 여과 또는 경사분리에 의해 세포 물질을 제거한다. 발효 배출물을 기준으로 하여 50 내지 1000 mg/kg, 바람직하게는 100 내지 200 mg/kg의 통상적인 응집 보조제를 첨가한 후에, 활성탄과 모래의 짧은 층을 통해 혼합물을 여과시켜 높은 D-판토텐산 함량을 가진 생체물질-비함유 용액을 수득한다. 이렇게처리된 용액을 이온-교환 층 (H+형태)을 통해 통과시킨다. 양이온 교환기를 통한 본 발명의 처리 단계 전에 생체물질이 분리되지 않는다면, 생체물질-함유 발효 용액이 바닥에서 위로, 다시 말해서 중력의 반대 방향으로 이온 교환 층을 통해 통과시키는 것이 유리할 수 있다.
이 용액의 이후 건조는 예를 들어 분무 건조에 의해 건조시킬 수 있다. 이것은 병류, 역류 또는 혼합류로 수행될 수 있다. 미립화를 위해, 모든 공지된 분무기, 특히 원심분리 분무기 (분무기 원판), 1액 노즐 또는 2액 노즐을 사용할 수 있다. 바람직한 건조 온도 조건은 150 내지 250℃의 탑 입구 온도 및 70 내지 130℃의 탑 출구 온도이다. 그러나, 그보다 더 높거나 낮은 온도 수준에서 건조를 수행할 수도 있다. 매우 낮은 잔류 수분을 달성하기 위하여, 유동층의 하류에서 추가의 건조 단계를 제공할 수 있다.
분무 건조기와 유동층의 조합인, 니로 (Niro) (덴마크 코펜하겐) 및 APV-안히드로 (APV-Anhydro) (덴마크 코펜하겐)에 의해 제조된 FSD 또는 SBD 건조기 (FSD: 유동화 분무 건조기; SBD: 분무 층 건조기)에서 분무 건조를 수행할 수도 있다. 분무 건조시에는 고결방지제를 첨가할 수 있다. 이것은 건조기 벽으로의 침착을 감소시킬 수 있고, 정확하게 미립 분말인 경우에는 유동 거동을 개선시킬 수 있다. 사용될 수 있는 고결방지제는 특히 실리케이트, 스테아레이트, 포스페이트 및 옥수수 전분이다. 원칙적으로, 분무 유동층에서 건조를 수행할 수 있고, 이 경우에 이것은 연속식으로 뿐만 아니라 회분식으로 조작될 수 있다. 용액 또는 현탁액을 윗쪽 (상부 분무) 및 아래쪽 (하부 분무) 뿐만 아니라 옆쪽 (측면 분무)에 분무할 수 있다.
본 발명은 또한
a) D-판토텐산을 생성하고 판토텐산 (pan) 및(또는) 이소루이신/발린 (ilv)의 생합성이 탈조절 (deregulation)되어 있는 하나 이상의 유기체를 0 내지 20 g/L, 바람직하게는 0 g/L의 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 공급한 배양 배지 중에서 발효시켜, 배양 배지에 2 g/L 이상의 D-판토텐산 염을 형성하는 단계, b) 형성된 D-판토테네이트에 다가 양이온을 함유하는 염을 공급하여 D-판토텐산의 다가 염을 생성하는 단계, c) D-판토테네이트 함유 발효 용액을 나노여과로 처리하여 D-판토텐산의 다가 염을 농축하는 단계 d) D-판토텐산의 다가 염을 함유하는 나노여과 보유액을 건조 및(또는) 제형화하는 단계로 제조할 수 있는, 동물 사료 첨가제 및(또는) 동물 사료 보조제로서 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 변법으로, 조성물은 단계 c)의 나노여과 전에 용액 중에 침전 분리된 성분 또는 세포 덩어리를 바람직하게는 막 여과, 특히 바람직하게는 한외여과, 매우 특히 바람직하게는 투석여과에 의해 제거함으로써 제조할 수 있는 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 용액 중에 침전 분리된 성분 또는 세포 덩어리를 제거하는 동안 또는 제거한 후에 다가 양이온을 함유하는 염 (고체 형태 또는 수용액임)을 공급함으로써 제조할 수 있는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따라서, 이들 염을 또한 추가의 변법에서 나노여과 동안에 공급할 수도 있다.
본 발명에 따라서, 조성물은 또한 D-판토텐산의 염을 적어도 1 내지 100 중량％, 바람직하게는 20 내지 100 중량％, 특히 바람직하게는 50 중량％ 이상의 농도로 함유한다는 점을 특징으로 한다. 본 발명은 D-판토텐산의 염을 2가 양이온, 바람직하게는 칼슘 D-판토테네이트 및(또는) 마그네슘 D-판토테네이트의 형태로 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따라서, 1가 양이온의 형태인 D-판토텐산의 염의 함량이 5 g/kg 이하인 것을 특징으로 하는 조성물이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 상기 기재된 방법에 의해 사료 첨가제로서의 요건을 충족하는 칼슘 D-판토테네이트 또는 마그네슘 D-판토테네이트가 수득된다. 이러한 요건이란, 예를 들어 표적 유기체와의 높은 상용성, 비교적 높은 함량의 D-판토테네이트, 및 "비타민 활성"의 의미에서 본 발명의 생성물의 생물학적 가치이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명되지만, 실시예는 본 발명을 제한하지 않는다.
<실시예 1>
14 L 용량의 교반기 및 기체 도입 장치가 설치된 실험실용 발효기에, 하기 조성의 수성 발효 배지를 충전하였다.
출발 물질 농도 [g/L]
효모 추출물 5
대두분 40
글루탐산나트륨·H2O 5
황산암모늄 8
KH2PO4 5
K2HPO4 10
NaH2PO4·2H2O 6.15
Na2HPO4·2H2O 12
살균 후에, 하기 살균 배지 성분들을 추가로 첨가하였다.
출발 물질 농도 [g/L]
글루코스·H2O 20
황산칼슘 0.1
황산마그네슘 1
시트르산나트륨 1
FeSO4·7H2O 0.01
미량 염 용액 1 mL
미량 염 용액은 하기 조성을 갖는다:
0.15 g의 Na2MoO4·2H2O, 2.5 g의 H3BO3, 0.7 g의 CoCl2·6H2O, 0.25 g의 CuSO4·5H2O, 1.6 g의 MnCl2·4H2O, 0.3 g의 ZnSO4·7H2O를 물을 사용하여 1 L로 만들었다. 미량 염 용액을 살균 여과를 통해 첨가하였다. 초기 액체 부피는 5 L이다. 상기 기재된 내용물은 이 값을 기초로 한다.
이 용액에 바실러스 섭틸리스 PA668의 접종 배양액 (OD=10) 100 mL를 첨가하고, 접종된 배양액을 12 L/분의 기체 도입 속도에서 격렬하게 교반하면서 43℃에서 발효시켰다. 이 균주는 US 출원 번호 60/262,995의 첨부에 따라 기술된다.
47시간 내에, 2.1 L의 살균 수용액을 첨가하였으며, 그의 조성은 다음과 같다:
출발 물질 농도 [g/L]
글루코스 800
염화칼슘 0.6
글루탐산나트륨·H2O 5
시트르산나트륨 2
FeSO4·7H2O 0.2
미량 염 용액 6 mL
발효 동안에, 25％ 농도 암모니아 용액 또는 20％ 농도 인산을 첨가함으로써 pH를 7.2로 조절하였다. 암모니아는 발효를 위한 질소원으로서 동시에 작용하였다. 용해된 산소 함량이 30％의 포화 수치로 유지되도록 교반기 요소의 회전 속도를 조절하였다. 탄소원의 첨가를 정지한 후에, 용해된 산소 함량 (pO2)이 포화 수치의 95％에 도달할 때까지 발효를 계속하였다. 48시간 후 종료시의 D-판토테네이트의 농도는 22.8 g/L이었다.
유사하게, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 및 >90 g/L 초과의 β-알라닌-공급-유리 판토텐산 역가를 가진 발효 브로쓰를 제조할 수 있었다.
<실시예 2>
실시예 1에 따라 생성된 발효 배출물 7000 mL를 초원심분리하였고, 세라믹 모노채널 관형 모듈 (아테크 (Atech), 독일 글라트베크 소재)을 사용하였다. 이 경우, 먼저 공극 너비가 20 kD (10 nm)인 막을 사용하고, 두번째로 공극 너비가 50 nm인 막을 사용하였다.
실험 온도는 40℃이었고, 유출 (overflow) 속도는 4 m/s이었고, 막횡단 압력 (TMP = [p (공급물) + p (보유액)]/2 - p (투과액)])은 다르게 언급되지 않은 한, 1 bar이었다.
도 1에서, 막횡단 유량 (투과액 유량)을 농축 인자 MK의 함수 (MK(t) = m공급물/m보유액(t))로서 도시하였다.
보다 작은 공극 너비 (20 kD)를 갖는 막이 보다 큰 공극 너비 (50 nm)를 갖는 막보다 현저하게 더 높은 유량을 나타낸다는 것이 명백하다.
<실시예 3>
실시예 1에 따라 생성된 발효 배출물 7000 mL를 실시예 2와 유사하게 초원심분리하였고, 사용된 막의 공극 너비 20 kD이었다.
도 2는 이미 원심분리한 발효 배출물을 사용한 농도가 실시예 2에서보다 현저하게 더 높았다는 것을 나타낸다.
<실시예 4>
칼슘 판토테네이트를 함유하는 수용액 (표 3, 칼럼 보유액 공급물) 1000 mL를 약 1.5 L의 최대 작업 용량을 갖는 교반기 압력 셀에 넣었다. 과도한 압력의 질소에 의해 "공급" 압력을 발생시키고, 막 유출은 마그네틱 커플링에 의해 구동되는 앵커 (anchor) 교반기를 사용한 교반에 의해 보장하였다.
독일 뫼르스 소재의 오스모닉스 도이칠란트 게엠베하 (Osmonics Deutschland GmbH)로부터 입수한 나노여과막 데잘 5 DK를 사용하였다. 상기 용액을 사용한 실험 전, 실험 동안 및 실험 후에, 막 통합성을 시험하기 위해, MgSO4용액 (2000 중량ppm)을 사용하여 배제 시험을 실시하였다.
배제율 Ri을 표 3의 오른쪽 2개의 칼럼에 나열하였다. 여기에서, 배제율은 하기와 같이 정의된다: Ri= 1 - ci,투과액/ci,보유액(여기서, Ri은 성분 i의 배제율이고, ci,투과액은 투과액 중 성분 i의 농도이고, ci,보유액은 보유액 중 성분 i의 농도임).
농도는 비정상 상태 실험에서 지정된 시점에 순간적으로 성립된 농도를 의미하며, 실험의 종료 후에 생성된 분획 중의 농도는 아니다. 배제율 Ri는 이상적인 경우 농도와 독립적이며, 이것은 또한 분획 중 농도로부터 보고된 수치를 계산하는 기준으로서 사용되었다.
표 3으로부터 Ca2+및 판토테네이트가 각각 84％ 및 99％의 배제율을 가지며, 따라서 보유액 중에 존재한다는 것이 도출된다.
<실시예 5>
Na 판토테네이트의 수용액 (0.2 몰/L)의 후처리에서, 실시예 4와 유사한 조건 하에, 나노여과에 의한 농축을 실시하였다. 표 4는 판토테네이트의 배제율이 80％라는 것을 나타낸다.
<실시예 6>
실시예 4와 유사한 조건 하에서의 NaCl/CaCl2의 등몰 용액의 농축을 표 5에 요약하였다. 여기에서, 41％ 및 42％의 Ca2+에 대한 막의 배제율은 판토테네이트와 조합된 칼슘의 높은 배제율 (실시예 5)에 비해 상대적으로 낮다는 것을 알 수 있다.
<도면 및 표에 대한 설명>
도 1: 공극 너비가 50 nm 및 20 kD인 막을 사용한 농축 인자 MK의 함수로서 나타낸, 한외여과 동안 발효 배출물의 막횡단 유량 (투과액 유량)의 그래프 표시.
도 2: 공극 너비가 50 nm 및 20 kD인 막을 사용한 농축 인자 MK의 함수로서나타낸, 한외여과 동안 원심분리된 발효 배출물의 막횡단 유량 (투과액 유량)의 그래프 표시.
표 1: 용액 중에 침전 분리된 성분 또는 세포 덩어리의 분리 제거를 위해 비대칭적으로 구조화된 막의 개관.
표 2: 용액 중에 침전 분리된 성분 또는 세포 덩어리의 분리 제거를 위한 막 및 그의 특성의 개관.
표 3: 특히 Ca 판토테네이트 0.1 몰/kg 및 NaCl 0.2 몰/kg을 함유하는 수용액 중 칼슘 이온 및 판토테네이트의 배제율에 관한 나노여과의 분석 수치의 개관.
표 4: 특히 Ca 판토테네이트 0.2 몰/kg 및 NaCl 0.1 몰/kg을 함유하는 수용액 중 칼슘 이온 및 판토테네이트의 배제율에 관한 나노여과의 분석 수치의 개관.
표 5: 특히 등몰량의 NaCl 및 CaCl2를 함유하는 수용액 중 칼슘 이온의 배제율에 관한 나노여과의 분석 수치의 개관.

Claims (26)

  1. a) D-판토텐산을 생성하고 판토텐산 (pan) 및(또는) 이소루이신/발린 (ilv)의 생합성이 탈조절 (deregulation)되어 있는 하나 이상의 유기체를 0 내지 20 g/L의 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 공급한 배양 배지 중에서 발효시켜, 배양 배지에 2 g/L 이상의 D-판토텐산 염을 형성하는 단계,
    b) 형성된 D-판토테네이트에 다가 양이온을 함유하는 염을 공급하여, D-판토텐산의 다가 염을 형성하는 단계,
    c) D-판토텐산의 다가 염을 함유하는 용액을 나노여과로 후처리하여, D-판토텐산의 다가 염을 농축하는 단계, 및
    d) D-판토텐산의 다가 염을 함유하는 나노여과 보유액 (retentate)을 건조 및(또는) 제형화하는 단계를 포함하는,
    D-판토텐산 및(또는) 그의 염의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염이 배양 배지에 공급되지 않는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 사용되는 D-판토텐산 생성 유기체가 세균, 효모 또는 진균인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 사용되는 미생물이 바실라시애 (Bacillaceae) 과의 세균인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바실러스 (Bacillus) 속의 세균, 바람직하게는 바실러스 섭틸리스 (B. subtilis), 바실러스 리케니포르미스 (B. licheniformis) 또는 바실러스 아밀로리케파시엔스 (B. amyloliquefaciens) 종이 사용되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 배양 배지 1 L 당 D-판토텐산 및(또는) 그의 염이 10 g 이상, 바람직하게는 20 g 이상, 특히 바람직하게는 40 g 이상, 매우 특히 바람직하게는 60 g 이상의 양으로 형성되는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 중에 침전 분리된 성분 또는 세포 덩어리를 단계 c)의 나노여과 전에 분리 제거하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 분리가 경사분리 (decanting) 또는 막 여과, 바람직하게는 한외여과에 의해 실시되는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 막 여과가 투석여과로 실시되는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 다가 양이온을 함유하는 염을 단계 a)의 발효 동안, 바람직하게는 단계 a)의 발효의 끝 또는 그 후, 또는 D-판토테네이트 함유 용액의 막 여과 동안 또는 그 후에 고체 형태 또는 수용액으로 첨가하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 다가 양이온을 함유하는 염을 나노여과 동안 고체 형태 또는 수용액으로 첨가하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 다가 양이온을 함유하는 수용액을 연속적으로 공급하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 다가 양이온을 칼슘 및(또는) 마그네슘의 클로라이드, 니트레이트, 히드록사이드, 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 글리시네이트 및(또는) 락테이트로서 첨가하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 공급되는 다가 양이온이 D-판토테네이트 1 몰 당 0.05 내지 50 몰, 바람직하게는 D-판토네이트 1 몰 당 0.2 내지 2 몰 농도의 Ca2+인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)의 나노여과에서, 5 내지 100 bar, 바람직하게는 20 내지 80 bar, 특히 바람직하게는 40 내지 70 bar의 막횡단 압력의 차이가 조성되는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)의 나노여과에서 1가 양이온, 바람직하게는 암모늄, 칼륨 및(또는) 나트륨 이온의 함량이 용액 1 kg 당 5 g 이하의 농도로 감소되는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)로부터의 투과액 또는 그의 일부가 단계 a)의 발효로 재순환되는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 투과액 또는 그의 일부가 연속적으로 재순환되는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, c)로부터의 보유액이 D-판토텐산의 다가 염을 함유하는 현탁액인 방법.
  20. a) D-판토텐산을 생성하고 판토텐산 (pan) 및(또는) 이소루이신/발린 (ilv)의 생합성이 탈조절 (deregulation)되어 있는 하나 이상의 유기체를 0 내지 20 g/L, 바람직하게는 0 g/L의 유리 β-알라닌 및(또는) β-알라닌 염을 공급한 배양배지 중에서 발효시켜, 배양 배지에 2 g/L 이상의 D-판토텐산 염을 형성하는 단계, b) 형성된 D-판토테네이트에 다가 양이온을 함유하는 염을 공급하여 D-판토텐산의 다가 염을 생성하는 단계, c) D-판토텐산의 다가 염을 함유하는 용액을 나노여과로 후처리하여 D-판토텐산의 다가 염을 농축하는 단계, 및 d) D-판토텐산의 다가 염을 함유하는 나노여과 보유액을 건조 및(또는) 제형화하는 단계로 제조할 수 있는, 동물 사료 첨가제 및(또는) 동물 사료 보조제로서 사용하기 위한 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 단계 c) 전에 용액 중에 침전 분리된 성분 또는 세포 덩어리를 바람직하게는 막 여과, 특히 바람직하게는 한외여과, 매우 특히 바람직하게는 투석여과에 의해 분리 제거함으로써 제조할 수 있는 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 용액 중에 침전 분리된 성분 또는 세포 덩어리를 제거하는 동안 또는 제거한 후에, 다가 양이온을 함유하는 염을 공급하는 조성물.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 나노여과 전 또는 나노여과 동안, 다가 양이온을 함유하는 염을 공급하는 조성물.
  24. 제20항 내지 제23 중 어느 한 항에 있어서, 2가 양이온 형태의 D-판토텐산 염, 바람직하게는 칼슘 D-판토테네이트 및(또는) 마그네슘 D-판토테네이트를 포함하는 조성물.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, D-판토텐산 염을 1 내지 100 중량％, 바람직하게는 20 내지 100 중량％, 특히 바람직하게는 50 중량％ 이상의 농도로 포함하는 조성물.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 1가 양이온 형태의 D-판토텐산 염의 함량이 5 g/kg 이하인 조성물.
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