SK10432003A3 - Príprava kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí ako prísad do krmív - Google Patents

Príprava kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí ako prísad do krmív Download PDF

Info

Publication number
SK10432003A3
SK10432003A3 SK1043-2003A SK10432003A SK10432003A3 SK 10432003 A3 SK10432003 A3 SK 10432003A3 SK 10432003 A SK10432003 A SK 10432003A SK 10432003 A3 SK10432003 A3 SK 10432003A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
salts
pantothenic acid
polyvalent
process according
nanofiltration
Prior art date
Application number
SK1043-2003A
Other languages
English (en)
Inventor
Christine Beck
Hans-Peter Harz
Daniela Klein
Martin Leemann
Markus Lohscheidt
Stefan Bitterlich
Hartwig Voss
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Publication of SK10432003A3 publication Critical patent/SK10432003A3/sk

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23KFODDER
    • A23K10/00Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/12Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes by fermentation of natural products, e.g. of vegetable material, animal waste material or biomass
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23KFODDER
    • A23K20/00Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10Organic substances
    • A23K20/174Vitamins
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82NANOTECHNOLOGY
    • B82BNANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
    • B82B3/00Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Príprava kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí ako prísad do krmív
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka zlepšeného postupu na prípravu kyseliny Dpantoténovej a/alebo jej solí a ich použitia ako prísad do krmív.
D-pantotenát je široko rozšírený vo flóre a faune ako východisková látka na biosyntézu koenzýmu A. Na rozdiel od ľudí, ktorí konzumujú dostatočné množstvá kyseliny pantoténovej v potrave, symptómy nedostatku D-pantotenátu sú často opisované nielen pre rastliny ale aj pre zvieratá. Dostupnosť D-pantotenátu je preto ekonomicky veľmi zaujímavá, najmä v odvetví živočíšnych krmív.
Doterajší stav techniky
D-pantotenát sa konvenčné pripravuje chemickou syntézou z D-pantolaktónu a β-alaninátu vápenatého (Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6. vydanie, 1999, elektronická verzia, kapitola „Vitamins“). Príprava D-pantolaktónu vyžaduje zložitú klasickú separáciu racemátu cez diastereomérne soli. Komerčným produktom chemickej syntézy je zvyčajne vápenatá soľ kyseliny D-pantoténovej, D-pantotenát vápenatý.
V porovnaní s chemickou syntézou je výhodou biotechnologických výrobných procesov použitím mikroorganizmov selektívna (enantiomérne čistá) produkcia D formy kyseliny pantoténovej, ktorú môžu využívať vyššie organizmy. Zložitá separácia racemátu, ktorú vyžaduje chemická syntéza, takto nie je potrebná.
Fermentačné postupy na prípravu kyseliny D-pantoténovej použitím mikroorganizmov boli publikované vo veľkom počte, okrem iných aj v EP590 857, WO 96/33283, US 6,013,492, WO 97/10340, DE 198 46 499, EP 1 001 027, EP 1 006 189, EP 1 006 192 a EP 1 006 193.
EP 1 006 189 a EP 1 001 027 opisujú postupy na prípravu pantotenátu, v ktorom sa dosahuje obsah najviac 1 g/l kyseliny D-pantoténovej vo fermentačnom
roztoku. Taký nízky obsah kyseliny pantoténovej vo fermentačnom roztoku, teda menej ako 10 % hmotnostných vzhľadom na obsah tuhých látok, je však nevhodný na hospodárnu výrobu krmivových doplnkov obsahujúcich kyselinu D-pantoténovú. Ďalšou nevýhodou doposiaľ opísaných postupov je, že izolovanie produktu z fermentačného média vyžaduje početné spracovacie kroky. Ekonomický postup výroby v priemyselnom meradle nebol publikovaný.
V nemeckej prihláške vyloženej na verejné nahliadnutie DE 100 16 321 je opísaný fermentačný postup na prípravu krmivového doplnku obsahujúceho kyselinu D-pantoténovú. Významnou nevýhodou tohto postupu ako aj vyššie citovaných fermentačných postupov na výrobu kyseliny D-pantoténovej však je, že prekurzor kyseliny pantoténovej, β-alanín, sa musí dodávať mikroorganizmu prostredníctvom fermentačného média, aby sa získali ekonomické výťažky požadovaného produktu.
Okrem toho US 6,013,492 a WO 96/332839 opisujú spracovanie kyseliny Dpantoténovej z fermentačného roztoku odfiltrovaním nerozpustných zložiek (napríklad bunkového materiálu), adsorbovaním filtrátu na aktívne uhlie, následne elúciou kyseliny D-pantoténovej organickým rozpúšťadlom, s výhodou metanolom, neutralizovaním eluentu hydroxidom vápenatým a nakoniec vykryštalizovaním Dpantotenátu vápenatého. Významnými nevýhodami sú straty hodnotného produktu, ku ktorým dochádza počas kryštalizácie, a použitie organického rozpúšťadla, ktoré možno z produktu odstrániť len s ťažkosťami a ktoré vyžaduje zložitý krok regenerácie rozpúšťadla.
EP 0 590 857 opisuje fermentačný postup na produkciu kyseliny Dpantoténovej, pri ktorom kultivovanie mikroorganizmu vyžaduje prísun β-alanínu. Fermentačný roztok sa prefiltruje, aby sa oddelila biomasa, potom prejde cez katiónomenič a potom cez aniónomenič, neutralizuje sa hydroxidom vápenatým, nakoncentruje odparením, pridá sa aktívne uhlie, prefiltruje sa ešte raz a kryštalizuje sa s prídavkom metanolu a chloridu vápenatého. Výsledný produkt obsahujúci pantotenát popri kyseline D-pantoténovej vo forme vápenatej soli obsahuje aj chlorid vápenatý v molárnom pomere 1:1. Zníženie obsahu chloridu vápenatého vyžaduje elektrodialýzu s následným sušením rozprašovaním. Tento postup má tú nevýhodu, že nie je hospodárny ani ekologický vzhľadom na množstvo zložitých procesných krokov a použitie organických rozpúšťadiel.
Podstata vynálezu
Cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť krmivový doplnok obsahujúci kyselinu D-pantoténovú a/alebo jej soli a jej prípravu zlepšeným postupom na prípravu kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí, ktorý nemá vyššie uvedené nevýhody. V tomto prípade je z ekonomických dôvodov vhodný postup, pri ktorom je prísun βalanínu výrazne znížený, alebo nie je potrebný vôbec. Okrem toho je vhodná príprava kyseliny D-pantoténovej vo forme jej dvojmocných solí a v tomto prípade najmä solí kovov alkalických zemín, keďže dvojmocné soli majú nižšie hygroskopické vlastnosti ako jednomocné soli kyseliny pantoténovej a pri ďalšom použití, napríklad ako krmivový doplnok, majú menej výraznú tendenciu k agregácii.
Zistili sme, že tento cieľ sa s výhodou dosiahne predloženým vynálezom.
Predložený vynález sa týka postupu na prípravu kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí, ktorý zahŕňa
a) použitie aspoň jedného organizmu, ktorý produkuje kyselinu Dpantoténovú a v ktorom je biosyntéza kyseliny pantoténovej (pan) a/alebo izoleucínu/valínu (ilv) deregulovaná a ktorý tvorí aspoň 2 g/l solí kyseliny Dpantoténovej fermentáciou v kultivačnom médiu, pričom sa do kultivačného média dodáva 0-20 g/l voľného β-alanínu a/alebo soli β-alanínu,
b) do vzniknutého D-pantotenátu sa dodávajú soli obsahujúce viacmocné katióny, pričom vznikajú viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej,
c) pričom roztok obsahujúci viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej sa spracúva nanofiltráciou, pričom sa viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej obohacujú, a
d) nanofiltračný retentát obsahujúci viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej sa podrobí sušeniu a/alebo formulácii.
Vo variante postupu podľa vynálezu je retentátom z kroku c) suspenzia obsahujúca viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej.
Okrem toho možno fermentáciu uskutočňovať použitím všeobecne známych postupov v dávkovom, prísunovom dávkovom alebo opakovanom prísunovom dávkovom režime alebo kontinuálnymi procesnými postupmi. Na neutralizáciu získanej kyseliny pantoténovej sa v tomto prípade používajú zvyčajné tlmivé systémy, napríklad fosfátový tlmivý roztok obsahujúci NaOH, KOH alebo amoniak.
V ďalších variantoch postupu podľa vynálezu sa v kultivačnom médiu fermentáciou vytvorí v kroku a) najmenej 10 g/l, s výhodou najmenej 20 g/l, s osobitnou výhodou najmenej 40 g/l, s veľmi osobitnou výhodou najmenej 60 g/l a s najväčšou výhodou najmenej 70 g/l solí kyseliny D-pantoténovej.
Na účely predloženého vynálezu formy slova „produkovať“ znamenajú, že organizmus dokáže syntetizovať väčšie množstvá kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí, ako je potrebné na jeho vlastné metabolické potreby. Vo výhodnom variante vynálezu syntetizované množstvo kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí nie je prítomné vo vnútri bunky, ale organizmus ho ideálne úplne uvoľňuje do kultivačného média. Táto sekrécia môže prebiehať aktívne alebo pasívne pomocou mechanizmov, ktoré sú samy osebe známe.
Podľa vynálezu sú použitými organizmami produkujúcimi kyselinu Dpantoténovú mikroorganizmy. Podľa vynálezu medzi ne patria plesne, kvasinky a/alebo baktérie. Podľa vynálezu je výhodné použitie plesní, napríklad plesne hlavičkatej, alebo kvasiniek, napríklad Saccharomyces alebo Debaromyces, a v tomto prípade sa preferuje použitie Saccharomyces cerevisiae. S výhodou sa podľa vynálezu používajú koryneformné baktérie alebo Bacillaceae. Tie, ktoré sú pokryté vynálezom, sú s výhodou napríklad baktérie rodov Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Arthrobacter, Bevibacterium, Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella, Proteus,
Acinetobacter alebo Rhizobium. Osobitne výhodné sú tu Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium breve alebo Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. lentimorbus, B. lentus, B. firmus, B. pantothenticus, B. circulans, B. coagulans, B. megaterium, B. pumilus, B. thuringiensis, B. brevis, B. stearothermophilus a iné druhy Bacillus skupiny 1, ktoré sú charakterizované svojou 16sRNA, alebo Actinum mycetalis. Tento zoznam slúži na ilustráciu a v žiadnom prípade neobmedzuje predložený vynález.
Predložený vynález ďalej zahŕňa použitie geneticky modifikovaných organizmov na prípravu krmivového doplnku obsahujúceho voľnú kyselinu D-pantoténovú a/alebo jej soli podľa vynálezu. Taký geneticky modifikovaný organizmus možno izolovať napríklad chemickou mutagenézou a následnou selekciou použitím vhodnej „skríningovej metódy“. Vynález zahŕňa aj „produkčné kmene“, ktoré sú vhodné na produkciu produktu v zmysle predloženého vynálezu a majú genetické modifikácie vzhľadom na metabolický tok v smere kyseliny D-pantoténovej, iné modifikácie vzhľadom na sekréciu kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí cez bunkovú membránu. Toto možno dosiahnuť napríklad modifikáciami v kľúčových pozíciách v relevantných metabolických biosyntetických dráhach použitého organizmu.
Je tiež možné použiť transgénne organizmy, ktoré pochádzajú z transferu homologických alebo heterologických nukleotidových sekvencií, ktoré sú potrebné, alebo môžu byť prospešné na syntézu požadovaného produktu. V tomto prípade je možná nadmerná expresia a/alebo deregulácia jedného z viacerých génov jednotlivo a/alebo v kombinácii lokalizovaných v genóme a/alebo na vektore.
Také transgénne organizmy môžu s výhodou obsahovať ďalšie kópie a/alebo geneticky modifikované gény vybrané zo skupiny, ktorú tvorí panB, panC, panD, panE a/alebo ich kombinácie a/alebo dokonca organizačné jednotky, ktoré obsahujú operón panBCD. Okrem toho možno v organizmoch s výhodou manipulovať ďalšie metabolické dráhy, napríklad dráhu biosyntézy izoleucínu-valínu, ako je opísané napríklad v EP 1 006 189, EP 1 006 192, EP 1 006 193 alebo EP 1 001 027. Takto získavajú rozvetvené prekurzorové látky biosyntézy kyseliny pantoténovej vo väčšom množstve. Ak je to vhodné, s výhodou sa gény pre túto biosyntetickú dráhu, teda ilvB, ilvN, ilvC a/alebo ilvD, exprimujú nadmerne.
Okrem toho vynález zahŕňa genetické modifikácie aspartát a-dekarboxylázy (panD), napríklad nadmernou expresiou alebo dereguláciou v použitom organizme produkujúcom kyselinu D-pantoténovú.
Na účely tohto vynálezu výraz „deregulácia“ znamená nasledovné: zmenu alebo modifikáciu aspoň jedného génu, ktorý kóduje jeden enzým v biosyntetickej metabolickej dráhe, takže aktivita enzýmu v mikroorganizme sa zmení alebo modifikuje. Je výhodné, aby sa aspoň jeden gén, ktorý kóduje jeden enzým biosyntetickej metabolickej dráhy, zmenil tak, že génový produkt sa tvorí vo zvýšenej miere, alebo má zvýšenú aktivitu. Pojem „deregulovaná metabolická dráha“ zahŕňa aj biosyntetickú metabolickú dráhu, v ktorej je zmenený alebo modifikovaný viac ako jeden gén, ktorý kóduje viac ako jeden enzým, takým spôsobom, že sa zmení alebo modifikuje aktivita viac ako jedného enzýmu.
Zmeny alebo modifikácie môžu zahŕňať okrem iných nasledujúce: odstránenie endogénneho promótora alebo regulačných prvkov; zavedenie silných promótorov, indukovateľných promótorov alebo viacerých promótorov súčasne; odstránenie regulačných sekvencii tak, že sa zmení expresia génového produktu; zmenenie chromozomálnej pozície génu; zmena DNA sekvencie v blízkosti génu alebo v rámci génu, napríklad ribozomálnych väzobných miest (RBS); zvýšenie počtu kópií génu v genóme alebo zavedením rôzneho počtu kópií plazmidov; modifikovanie proteínov (napr. regulačných proteínov, zoslabovačov, zosilňovačov, transkripčných aktivátorov a podobne), ktoré hrajú úlohu v transkripcii génu a/alebo vtranslácii za vzniku génového produktu. To zahŕňa aj všetky ostatné možnosti deregulácie expresie génov, ktoré patria do doterajšieho stavu techniky, napríklad použitie antisense oligonukleotidov alebo blokovanie represorových proteínov.
Deregulácia môže zahŕňať aj zmeny kódovacieho regiónu génov, ktoré vedú napríklad k odstráneniu spätnoväzobnej regulácie v génovom produkte alebo k vyššej alebo nižšej špecifickej aktivite génového produktu.
Ďalej sú výhodné genetické modifikácie enzýmov podľa vynálezu, ktoré ovplyvňujú výstup prekurzorov kyseliny pantoténovej a/alebo tok kyseliny pantoténovej za vzniku koenzýmu A. Medzi príklady génov kódujúcich také enzýmy patria: alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA, coaX atď. Tento zoznam slúži na ilustráciu a v žiadnom prípade neobmedzuje predložený vynález.
Okrem toho sú výhodné zmeny genetickým inžinieringom, ktoré zabezpečujú bunkovú produkciu kofaktorov (napríklad metyléntetrahydrofolátu, redox ekvivalentov atď.) v množstve, ktoré je optimálne pre produkciu kyseliny pantoténovej.
Takto je β-alanín s výhodou už prítomný v bunkách vo zvýšených koncentráciách v porovnaní so zodpovedajúcimi geneticky nemodifikovanými organizmami, a preto ho netreba pridávať do kultivačného média ako prekurzor, ako je to potrebné napríklad v EP-A -590 857. Výhodné sú mikroorganizmy, v ktorých je biosyntéza kyseliny pantoténovej (pan) a/alebo izoleucín-valínu (ilv) a/alebo asparát-ctdekarboxylázy (panD) deregulovaná. Navyše je výhodná ďalšia nadmerná expresia ketopantoát reduktázy (panE) v mikroorganizmoch.
Ďalej je podľa vynálezu výhodné, ak je to vhodné, aby gén coaA, ktorý je potrebný na syntézu koenzýmu A, mal zníženú aktivitu, alebo bol úplne vypnutý (napríklad v druhoch Bacillus). Je to preto, lebo Bacillus popri coaA obsahuje ďalší gén na túto enzymatickú funkciu (= coaX). Aktivita tohto génu coaX alebo zodpovedajúceho enzýmu môže byť tiež zmenená, s výhodou znížená alebo dokonca odstránená za predpokladu, že coaA samotný ešte má dostatočnú enzýmovú aktivitu, hoci zníženú enzýmovú aktivitu, teda enzýmová aktivita coaA sa nestratí úplne. Popri nadmernej expresii rôznych génov je výhodná aj genetická manipulácia promótorových regiónov týchto génov za predpokladu, že táto manipulácia vedie k nadmernej expresii génových produktov.
V uskutočnení predloženého vynálezu sú použité bakteriálne kmene opísané podľa prílohy (PCT/US prihláška 0025993), napríklad Bacillus subtilis PA824 a/alebo ich deriváty. V ďalšom uskutočnení vynálezu je použitý mikroorganizmus Bacillus subtílis PA668 podľa opisu v prílohe (US č. 60/262,995). Tieto kmene Bacillus subtilis PA824 a PA668 boli pripravené nasledovne:
Vychádzajúc z kmeňa Bacillus subtilis 168 (kmeň Marburg ATCC 6051), ktorý má genotyp trpC2 (Trp ), kmeň PY79 bol pripravený transdukciou Trp+ markera (z Bacillus subtilis štandardného typu W23). Mutácie ApanB a ApanEI do kmeňa PY79 sa zaviedli klasickými metódami genetického inžinieringu (opísanými napríklad v monografii Harwood, C. R. a Cutting, S. M. (editors), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, England).
Výsledný kmeň bol transformovaný použitím genomickej DNA kmeňa Bacillus subtilis PA221 (genotyp P2epanBCD, trpC2 (Trp )) a genomickej DNA kmeňa Bacillus subtilis PA303 (genotyp P26panE1). Výsledný kmeň PA327 má genotyp P26panBCD, P2GpanE1 a je tryptofánovým auxotrofom (Trp ). Titre kyseliny pantoténovej až do 3,0 g/l (24 h) sa dosiahli použitím kmeňa Bacillus subtilis PA327 v 10 ml kultúrach obsahujúcich médium SVY (25 g/l Difco Veal Infusion Broth, 5 g/l Difco Yeast Extract, 5 g/l glutamátu sodného, 2,7 g/l síranu amónneho v 740 ml vody, autoklávov, pridať 200 ml 1 M fosforečnanu draselného s pH 7,0 a 60 ml 50 % sterilného roztoku glukózy), ktoré bolo suplementované 5 g/l β-alanínu a 5 g/l a-ketoizovalerátu.
Príprava kmeňa Bacillus subtilis PA221 (genotyp P2epanBCD, trpC2 (Trp )) je opísaná v nasledujúcej časti:
Klasické metódy genetického inžinieringu sa použili na klonovanie operónu panBCD pre Bacillus s pomocou sekvenčnej informácie operónu panBCD pre E. coli (pozrite Merkel et al., FEMS Microbiol. Lett., 143, 1996:247-252) vychádzajúc z plazmidovej knižnice Bacillus subtilis GP275. Pri klonovaní sa použil kmeň E. coli BM4062 (birts) a informácia, že operón Bacillus je v blízkosti génu birA. Operón panBCD sa zaviedol do plazmidu, ktorý sa môže replikovať v E. coli. Aby sa zlepšila expresia operónu panBCD, použili sa silné konštitutívne promótory fágov Bacillus subtilis SP01 (P26) a ribozómové väzobné miesto (=RBS) pred génom panB bolo nahradené umelým RBS. DNA fragment, ktorý je bezprostredne upstream od natívneho génu panB v Bacillus, bol ligovaný pred kazetu P2QpanBCD na plazmide.
Tento plazmid bol transformovaný na kmeň Bacillus subtilis RL-1 (derivát Bacillus subtilis 168 získaný klasickou mutagenézou (kmeň Marburg ATCC 6051), genotyp trpC2 (Trp')), a homologickou rekombináciou bol natívny operón panBCD nahradený operónom p26panBCD. Výsledný kmeň sa nazýva PA221 a má genotyp P26panBCD, trpC2 (Trp ).
Titer kyseliny pantoténovej až do 0,92 g/l (24 h) sa dosiahol použitím kmeňa Bacillus subtilis PA221 v 10 ml kultúr obsahujúcich médium SVY, ktoré bolo suplementované 5 g/l β-alanínu a 5 g/l a-ketoizovalerátu.
Produkcia kmeňa Bacillus subtilis PA303 (genotyp P26panE1) je opísaná v nasledujúcej časti:
Použitím génovej sekvencie E. coli panE sa klonovala sekvencia Bacillus panE analógiou. Zistilo sa, že v B. subtilis existujú dva homológy génu E. coli panE, ktoré boli označené panE1 a panE2. Analýzami deléciou sa zistilo, že gén panE1 je zodpovedný za 90 % produkcie kyseliny pantoténovej, zatiaľ čo delécia génu panE2 nemala žiadny významný efekt na produkciu kyseliny pantoténovej. Aj tu, podobne ako pri klonovaní operónu panBCD, sa promótor nahradil silným konštitutívnym promótorom P26 a ribozómové väzobné miesto pred génom panE1 sa nahradilo umelým väzobným miestom. Fragment P2epanE1 sa klonoval do vektoru, ktorý bol konštruovaný tak, že fragment P26panE1 sa mohol integrovať do pôvodného lokusu panE 1 v genóme Bacillus subtilis. Kmeň získaný po transformácii a homologickej rekombinácii sa označuje PA303 a má genotyp P2GpanE1.
Titer kyseliny pantoténovej až do 1,66 g/l (24 h) sa dosiahol použitím kmeňa Bacillus subtilis PA303 v 10 ml kultúr použitím média SVY, ktoré bolo suplementované 5 g/l β-alanínu a 5 g/l a-ketoizovalerátu.
Kmeň bol d’alej konštruovaný transformovaním PA327 plazmidom, ktorý obsahoval operón P2eilvBNC a markerový gén pre spektinomycín. Operón P26ilvBNC sa integroval do lokusu amyE, čo bolo demonštrované pomocou PCR. Jeden transformant bol označený PA340 (genotyp P2epanBCD, P26panE1, P26ÍlvBNC, specR, trpC2 (Trp)).
Titer kyseliny pantoténovej až do 3,6 g/l (24 h) sa dosiahol použitím kmeňa Bacillus subtilis PA340 v 10 ml kultúrach obsahujúcich médium SVY, ktoré bolo suplementované len 5 g/l β-alanínu; v 10 ml kultúrach obsahujúcich médium SVY, ktoré bolo suplementované 5 g/l β-alanínu a 5 g/l α-ketoizovalerátu, sa dosiahol titer kyseliny pantoténovej až do 4,1 g/l (24 h).
Okrem toho sa zaviedla deregulovaná kazeta ilvD do kmeňa PA340. S týmto cieľom sa plazmid obsahujúci gén ilvD pod kontrolou promótora P26 obsahujúceho umelý RBS2, transformoval do PA340. V tomto prípade bol gén P26//vD integrovaný do pôvodného lokusu ilvD homologickou rekombináciou. Výsledný kmeň PA374 má genotyp P26panBCD, P2&panE1, P26ilvBNC, P26ilvD, specR a trpC2 (Trp').
Titer kyseliny pantoténovej až do 2,99 g/l (24 h) sa dosiahol použitím kmeňa Bacillus subtilis PA374 v 10 ml kultúr použitím média SVY, ktoré bolo suplementované len 5 g/l β-alanínu.
Aby sa produkovala kyselina pantoténová použitím kmeňa PA374 bez prísunu β-alanínu, do kmeňa PA374 sa zaviedli ďalšie kópie génu panD kódujúceho aspartátctrdekarboxylázu. S týmto cieľom sa chromozomálna DNA kmeňa PA401 transformovala do PA374. Kmeň PA377 sa získal selekciou na tetracyklín.
Výsledný kmeň PA377 má genotyp P2GpanBCD, P26panE1, P26ilvBNC, P26ilvD, specR, tetR a trpC2 (Trp).
Titre kyseliny pantoténovej bez prísunu prekurzorov až do 1,3 g/l (24 h) sa dosiahli použitím kmeňa Bacillus subtilis PA377 v 10 ml kultúr použitím média SVY.
Príprava kmeňa Bacillus subtilis PA401 (genotyp P2QpanD) je opísaná v nasledujúcej časti:
Gén Bacillus subtilis panD bol klonovaný z operónu panBCD do vektora, ktorý prenáša teracyklínový markerový gén. Promótor P26 a vyššie opísané RBS boli klonované pred gén panD. Reštrikčnou digesciou sa získal fragment, ktorý obsahoval tetracyklínový markerový gén a gén P2spanD. Tento fragment bol religovaný a transformovaný do vyššie opísaného kmeňa PA221. Fragment sa integroval do genómu kmeňa PA211. Výsledný kmeň PA401 má genotyp P26panBCD, P2&panD, tetR a trpC2 (Trp').
Titre kyseliny pantoténovej až do 0,3 g/l (24 h) sa dosiahli použitím kmeňa Bacillus subtilis PA401 v 10 ml kultúr v médiu SVY, ktoré bolo suplementované 5 g/l ctketoizovalerátu. V 10 ml kultúrach obsahujúcich médium SVY, ktoré bolo suplementované 5 g/l kyseliny D-pantoovej a 10 g/l L-aspartátu, sa získali titre kyseliny pantoténovej až do 2,2 g/l (24 h).
Vychádzajúc z kmeňa PA377 sa generoval tryptofán-prototrofický kmeň transformáciou chromozomálnou DNA z kmeňa PY79. Tento kmeň PA824 má genotyp P2GpanBCD, P2epanE1, P2gÍIvBNC, P2gÍIvD, specR, tetR a Trp+.
Titre kyseliny pantoténovej bez prísunu prekurzorov až do 4,9 g/l (48 h) sa dosiahli použitím kmeňa Bacillus subtilis PA824 v 10 ml kultúrach v médiu SVY (kontrola PA377: do 3,6 g/l za 48 h). Presná konštrukcia kmeňov je daná podľa prílohy prihlášky PCT/US 0025993.
Príprava PA668 je opísaná v nasledujúcej časti:
Gén Bacillus panB bol klonovaný z operónu panBCD štandardného typu a vložený do vektora, ktorý popri géne chloramfenikolovej rezistencie obsahuje aj sekvencie B. subtilis pre lokus vpr.
Silný konštitutívny promótor P26 bol zavedený pred koniec 5’ génu panB. Fragment, ktorý obsahuje gén P26pa/7fi, markerový gén pre chloramfenikolovú rezistenciu a sekvencie Bacillus subtilis vpr, bol získaný reštrikčnou digesciou. Izolovaný fragment bol religovaný a použitý na tansformovanie kmeňa PA824.
Výsledný kmeň bol označený PA668. Genotyp PA668 je: P2epanBCD, P26panE1, P2qíIvBNC, P2qíIvD, P26panB, specR, tetR, CmR a Trp+.
Boli izolované dve kolónie PA668 a označené PA668-2A a druhá PA668-24.
Použitím kmeňa S. subtilis PA668-2A sa dosahujú titre kyseliny pantoténovej
1,5 g/l za 48 h v 10 ml kultúrach v médiu SVY bez prísunu prekurzorov. V 10 ml kultúrach suplementovaných 10 g/l aspartátu sa dosahujú titre až do 5 g/l.
Použitím kmeňa B. subtilis PA668-24 sa dosahujú titre kyseliny pantoténovej
1,8 g/l za 48 h v 10 ml kultúrach v médiu SVY bez prísunu prekurzorov. V 10 ml kultúrach suplementovaných 10 g/l L-aspartátu sa dosahujú titre až do 4,9 g/l.
Presná konštrukcia kmeňa je daná podľa príloh prihlášky PCT/US 0025993 a US č. 60/262,995.
Použitím vyššie opísaného kmeňa PA377 v glukózovo obmedzenej fermentácii v médiu SVY (25 g/l Difco Veal Infusion Broth, 5 g/l Difco Yeast Extract, 5 g/l tryptofánu, 5 g/l glutamátu sodného, 2 g/l (NH4)2SO4, 10 g/l KH2PO4, 20 g/l K2HPO4, 0,1 g/l CaCb, 1 g/l MgSO4, 1 g/l citrátu sodného, 0,01 g/l FeSO4 · 7 Η2Ο a 1 ml/l roztoku stopových solí s nasledujúcim zložením: 0,15 g Na2MoO4 2 H2O, 2,5 g H3BO3, 0,7 g C0CI2 · 6 H2O, 0,25 g CuSO4 · 5 H2O, 1,6 g MnCI2 · 4 H2O, 0,3 g ZnSO4 · 7 H2O, doplnené do 1 I vodou)) v 10 I škále s kontinuálnym prísunom glukózového roztoku sa získajú koncentrácie kyseliny pantoténovej vo fermentačnej zmesi 18-19 g/l 22-125 g/l) za 36 h (48 h).
Pri glukózovo obmedzenej fermentácii PA824, tryptofán-prototrofného derivátu PA377, v médiu kvasnicového extraktu (10 g/l Difco Yeast Extract, 5 g/l glutamátu sodného, 8 g/l (NH4)2SO4, 10 g/l KH2PO4, 20 g/l K2HPO4, 0,1 g/l CaCI2, 1 g/l MgSO4, 1 g/l citrátu sodného, 0,01 g/l FeSO4 7 H2O a 1 ml/l vyššie opísaného roztoku stopových solí) sa získajú nasledujúce koncentrácie kyseliny pantoténovej vo fermentačných zmesiach za 36 h, 48 h a 72 h: 20 g/l, 28 g/l a 36 g/l v škále 10 I s kontinuálnym prísunom glukózového roztoku.
Ďalšou optimalizáciou média použitím kmeňa PA824 v glukózovo obmedzenej fermentácii v médiu obsahujúcom 10 g/l Difco Yeast Extract, 10 g/l NZ amínu A (Quest International GmbH, Erftstadt), 10 g/l glutamátu sodného, 4 g/l (NH4)2SO4, 10 g/l KH2PO4, 20 g/l K2HPO4, 0,1 g/l CaCb, 1 g/l MgSO4, 1 g/l citrátu sodného, 0,01 g/l FeSO4 · 7 H2O a 1 ml/l vyššie opísaného roztoku stopových solí sa získali koncentrácie kyseliny pantoténovej 37 g/l (48 g/l) vo fermentačných zmesiach za 36 h (48 h) v škále 10 I s kontinuálnym prísunom glukózového roztoku.
Ďalšie zvýšenia koncentrácie kyseliny pantoténovej vo fermentačnej zmesi možno dosiahnuť ďalšou optimalizáciou média, zvýšením fermentačného času, vylepšením postupu a kmeňa a kombináciou jednotlivých krokov. Vyššie uvedené koncentrácie kyseliny pantoténovej možno dosiahnuť aj fermentáciou kmeňov, ktoré sú derivátmi vyššie uvedeného PA824. Deriváty možno pripraviť klasickým vývojom kmeňov a ďalšími manipuláciami genetického inžinieringu. Vývojom média, kmeňa a fermentačných procesov možno zvýšiť titre kyseliny pantoténovej vo fermentačných zmesiach na viac ako 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 a > 90 g/l.
Významnou výhodou postupu podľa vynálezu je, že fermentácia sa uskutočňuje v kultivačnom médiu, ktoré okrem aspoň jedného zdroja uhlíka a zdroja dusíka neobsahuje ako východiskové zlúčeniny žiadne iné prekurzory. To znamená, že biosyntéza kyseliny D-pantoténovej je nezávislá od prísunu ďalších prekurzorov. Na účely predloženého vynálezu sú takými prekurzormi látky ako β-alanín a/alebo Laspartát a/alebo L-valín a/alebo α-ketoizovalerát a/alebo ich kombinácie.
Vo výhodnom variante postupu podľa vynálezu sa fermentácia organizmu produkujúceho kyselinu D-pantoténovú uskutočňuje v kultivačnom médiu, ktoré obsahuje zdroj uhlíka a zdroj dusíka, ale do ktorého sa nepridáva ani nedodáva v priebehu fermentácie žiadny voľný β-alanín a/alebo soli β-alanínu. To znamená, že na produkciu kyseliny D-pantoténovej v rozmedziach aspoň 10 g/l kultivačného média, s výhodou najmenej 20 g/l, s osobitnou výhodou najmenej 40 g/l, s veľmi osobitnou výhodou najmenej 60 g/l a s najväčšou výhodou najmenej 70 g/l nie je podľa vynálezu potrebný žiadny prísun voľného β-alanínu a/alebo solí β-alanínu.
Nezávislosť od prísunu prekurzorov je osobitne významnou ekonomickou výhodou postupu podľa vynálezu v porovnaní so známymi procesmi, keďže mnoho prekurzorov je veľmi drahých.
Vynález však nevylučuje pridávanie β-alanínu a/alebo solí β-alanínu, takže výťažok kyseliny D-pantoténovej možno ďalej zvýšiť pridaním β-alanínu a/alebo solí βalanínu. Ak sa napríklad predpokladá, že všetky potrebné prekurzory kyseliny pantoténovej sú prítomné v dostatočnom množstve, ďalšie zvýšenie produkcie kyseliny pantoténovej limituje len aktivita génu panD, potom výťažok kyseliny pantoténovej možno zvýšiť napríklad o ďalších 50 % pridaním voľného β-alanínu a/alebo solí βalanínu.
Vo výhodnom variante predloženého vynálezu možno do kultivačného média pridať až 20 g/l voľného β-alanínu a/alebo solí β-alanínu, aby sa výťažok kyseliny pantoténovej ďalej zvýšil o viac ako 50%. Uprednostňuje sa pridanie približne 15 g/l voľného β-alanínu a/alebo solí β-alanínu do kultivačného média.
Príkladmi zdrojov uhlíka, ktoré sú vhodné podľa vynálezu na použitie v kultivačnom médiu na fermentáciu vyššie uvedených organizmov, sú cukry, napríklad škrobové hydrolyzáty (mono-, di-, oligosacharidy), s výhodou glukóza alebo sacharóza, a tiež repné alebo trstinové cukrové melasy, proteíny, proteínové hydrolyzáty, sójová múka, kukuričný výluh, tuky, voľné mastné kyseliny, recirkulované bunky z predchádzajúcich fermentácií alebo ich hydrolyzáty, a tiež kvasnicový extrakt. Tieto zoznamy neobmedzujú predložený vynález.
Okrem toho sa tento vynález s výhodou vyznačuje tým, že celkový obsah cukru sa do konca fermentácie zníži na minimum, keďže inak by sa sťažilo neskoršie sušenie a/alebo formulácia fermentačného roztoku v dôsledku lepenia. Toto možno podľa vynálezu dosiahnuť pokračovaním fermentácie určitý dodatočný čas po spotrebovaní zdroja uhlíka (v prípade dávkovej kultúry) alebo po prerušení alebo regulovaní prísunu uhlíka (v prípade procesného postupu v prísunovom dávkovom alebo opakovanom prísunovom dávkovom režime) tak, že koncentrácia zdroja uhlíka bude prakticky nulová (v prípade prísunového dávkového, opakovaného dávkového alebo kontinuálneho procesného postupu).
Toto sa podľa vynálezu dosahuje tak, že po prerušení pridávania zdroja uhlíka (napríklad roztoku cukru) fermentácia pokračuje, kým sa nedosiahne koncentrácia rozpusteného kyslíka (pO2) vo fermentačnom roztoku najmenej 80 %, s výhodou 90% a s osobitnou výhodou 95 % hodnoty nasýtenia.
Príkladmi zdrojov dusíka, ktoré sú vhodné podľa vynálezu, sú amoniak, síran amónny, močovina, proteíny, proteínové hydrolyzáty alebo kvasnicový extrakt. Tento zoznam neobmedzuje predložený vynález.
Okrem toho fermentačné médium obsahuje minerálne soli a/alebo stopové prvky, napríklad aminokyseliny a vitamíny. Presné zloženia vhodných fermentačných médií sú všeobecne známe a dostupné odborníkom v danej oblasti.
Po naočkovaní fermentačného média vhodným organizmom produkujúcim kyselinu D-pantoténovú (v bunkových hustotách známych odborníkom v danej oblasti), v prípade potreby s prídavkom odpeňovača, sa tento organizmus kultivuje. Akúkoľvek potrebnú reguláciu pH média možno uskutočniť použitím rôznych anorganických alebo organických zásad alebo kyselín, napríklad NaOH, KOH, amoniaku, kyseliny fosforečnej, kyseliny sírovej, kyseliny chlorovodíkovej, kyseliny mravčej, kyseliny jantárovej, kyseliny citrónovej a podobne.
Vzhľadom na tlmivé systémy používané pri fermentácii, ktorými môžu byť, ako je opísané vyššie, napríklad NaOH, KOH, amoniak, kyselina fosforečná, kyselina sírová, kyselina chlorovodíková, kyselina mravčia, kyselina jantárová, kyselina citrónová a podobne, vytvorená kyselina D-pantoténová je prítomná vo fermentačnom roztoku v závislosti od použitého tlmivého systému vo forme príslušných solí. Keďže v tomto prípade sú najmä soli kyseliny D-pantoténovej vo forme svojich jednomocných katiónov nevýhodné, fermentačný roztok sa podľa vynálezu spracuje nanofiltráciou.
S týmto cieľom sa do vzniknutého D-pantotenátu najprv dodávajú soli obsahujúce viacmocné katióny, pričom vznikajú viacmocné soli kyseliny D16 pantoténovej. Podľa vynálezu soli obsahujúce viacmocné katióny možno pridať v tuhej forme alebo vo vodnom roztoku počas, s výhodou na konci alebo po fermentácii v kroku a). Vodný roztok obsahujúci viacmocné katióny možno dodávať napríklad kontinuálne.
Okrem toho v niektorom kroku pred nanofiltráciou, teda pred nanofiltráciou v kroku c) postupu podľa vynálezu, možno oddeliť bunkovú masu komponentov vyzrážaných v roztoku. V tomto prípade možno separáciu uskutočniť dekantáciou alebo membránovou filtráciou, s výhodou ultrafiltráciou. Vo variante postupu podľa vynálezu sa membránová filtrácia uskutočňuje ako diafiltrácia. Aj tu podľa vynálezu soli obsahujúce viacmocné katióny možno pridať v tuhej forme alebo vo vodnom roztoku počas membránovej filtrácie roztoku obsahujúceho D-pantotenát alebo po nej. Napríklad vodný roztok obsahujúci viacmocné katióny možno dodávať kontinuálne.
Pri separácii bunkovej masy a/alebo komponentov vyzrážaných z roztoku, napríklad slabo rozpustných alebo nerozpustných fosforečnanových solí alebo síranových solí, enzýmov, hormónov, proteínov, antibiotík, pyrogénov, vírusov, polysacharidov, koloidov, tenzidov, pesticídov alebo iných anorganických látok, možno použiť separáciu na báze využitia gravitácie, odstredivej sily, tlaku alebo vákua. Medzi príklady procesov patria okrem iných: dekantácia, elutriácia, osievanie, triedenie prúdom vzduchu, triedenie, filtrácia, dialýza, sedimentácia, mikrofiltrácia, ultrafiltrácia, flotácia, frakcionácia peny, separácia plavením/ponorením, čírenie, centrifugovanie alebo separácia. Membránové separačné procesy, napríklad mikrofiltrácia alebo ultrafiltrácia, uskutočňované na základe tlakového rozdielu medzi stranou suroviny a stranou permeátu, sa súhrnne označujú ako membránová filtrácia. Procesy sa líšia napríklad svojimi limitmi separácie. V prípade ultrafiltrácie limit nie je založený na veľkosti častíc, napríklad ako v prípade mikrofiltrácie, ale na mólovej hmotnosti, ktorá je v rozmedzí od približne 103 do 2 χ 106 Da. Pri ultrafiltrácii sa popri filtráte (permeáte) produkuje aj koncentrát (retentát).
Na separovanie tuhých látok alebo obohatenie alebo ochudobnenie rozpustených strednomolekulových a vysokomolekulových látok sa s výhodou používajú asymetricky štruktúrované porézne membrány.
Membrány používané podľa vynálezu môžu vo výhodnom variante pozostávať zo separačnej vrstvy, ktorá uskutočňuje vlastnú separáciu, a jednej vrstvy alebo viacvrstvovej nosnej vrstvy, ktorá nesie separačnú vrstvu a má hrubšie póry ako separačná vrstva. Separačné vrstvy a nosná vrstva môžu pozostávať z organických alebo anorganických polymérov, keramiky, kovu alebo uhlíka a musia byť stabilné v reakčnom médiu a pri teplote procesu. Ich príklady sú uvedené v tabuľke 1, ale neobmedzujú predložený vynález:
Membrány možno použiť vo forme ohybných rúrok, rúrok, kapilár, dutých vláken alebo plochých membrán v plochom, rúrkovom, viackanálovom prvku, kapilárnych alebo cievkových moduloch, ktoré sú samy osebe známe.
Optimálne transmembránové tlaky medzi retentátom a permeátom sú v zásade od 1 do 40 barov v závislosti od priemeru pórov membrány alebo limitu (vyjadreného v jednotkách molekulovej hmotnosti), mechanickej stability membrány a typu membrány. Vyššie transmembránové tlaky vo všeobecnosti vedú k vyšším tokom permeátu. V prípade, v ktorom privádzaná surovina (roztok, ktorý sa má spracovať) je privádzaná pri nadmernom tlaku, transmembránový tlak možno prispôsobiť zvýšením tlaku permeátu.
Prevádzková teplota závisí od stability produktu a stability membrány. Je od približne 20 do 90 °C, s výhodou od približne 40 do 70 °C. Vyššie teploty vedú k vyšším tokom permeátu. Možno použiť napríklad membrány podľa tabuľky 2, ale tieto neobmedzujú predložený vynález.
Oddelenie buniek možno podľa vynálezu s výhodou uskutočniť špeciálnym typom membránovej filtrácie, teda diafiltráciou.
Diafiltrácia môže prebiehať dávkovo prechodom roztoku obsahujúceho viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej cez okruh zahŕňajúci nádobu, čerpadlo a jeden alebo viacero membránových modulov a nastavením tlaku v membránových moduloch tak, aby sa získaval permeát. Kontinuálne alebo v istých časoch sa pridáva voda alebo vodný roztok, ktorý neobsahuje produkt, ktorý sa má oddeliť, alebo ho obsahuje v nižšej koncentrácii ako v čase pridania do separačného okruhu. Podľa vynálezu vodný roztok môže obsahovať soľ viacmocných katiónov, napríklad halogenidy vápenaté alebo horečnaté alebo ich kombinácie, s výhodou chlorid vápenatý a/alebo chlorid horečnatý.
Odstraňovanie buniek pomocou diafiltrácie možno podľa vynálezu uskutočňovať aj kontinuálne, s výhodou pomocou viacerých membránových modulov zapojených do série, alebo v každom prípade jedného alebo viacerých membránových modulov obsahujúcich čerpadlové okruhy zapojených do série. Pred, medzi alebo za membránovými modulmi alebo čerpadlovými okruhmi možno pridávať vodu alebo vodný roztok, ktorý neobsahuje odstraňovaný produkt, alebo ho obsahuje pri nižšej koncentrácii ako pri vstrekovaní, kedy ako v dávkovom variante môže vodný roztok obsahovať soli viacmocných katiónov, napríklad halogenidy vápenaté alebo horečnaté alebo ich kombinácie, s výhodou chlorid vápenatý a/alebo chlorid horečnatý.
Podľa vynálezu možno ultrafiltráciu alebo diafiltráciu uskutočňovať priamo použitím fermentačného výstupu alebo po spracovaní fermentačného výstupu napríklad centrifúgovaním, dekantáciou alebo podobným postupom.
Ak sa podľa vynálezu bunková hmota alebo komponenty vyzrážané v roztoku odstránia, pridanie solí obsahujúcich viacmocné katióny podľa kroku b) postupu podľa vynálezu sa môže uskutočniť počas ultrafiltrácie alebo diafiltrácie alebo po nej. Vo variantoch postupu podľa vynálezu sú pridávanými viacmocnými katiónmi napríklad chlorid, dusičnan, hydroxid, mravčan, octan, propionát, glycinát a/alebo laktát vápenatý a/alebo horečnatý. V tomto prípade možno viacmocný katión, napríklad Ca2+, dodávať v koncentrácii 0,05 - 50 mol Ca2+/mol D-pantotenátu, s výhodou 0,2 - 2 mol Ca2+/mol D-pantotenátu.
V kroku c) postupu podľa vynálezu sa roztok obsahujúci viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej spracúva nanofiltráciou, pričom sa viacmocné soli kyseliny D19 pantoténovej obohacujú a súčasne nežiaduce jednomocné ióny, s výhodou jednomocné katióny, napríklad amónne, sodné alebo draselné ióny, sa ochudobňujú. Podľa vynálezu je obsah jednomocných katiónov, s výhodou amónnych, draselných a/alebo sodných iónov, znížený na koncentráciu s 5 g/kg roztoku.
Predložený vynález zahŕňa všetky komerčne dostupné nanofiltračné systémy. Separácia sa s výhodou uskutočňuje na asymetricky štruktúrovaných poréznych membránach. Vo výhodnom variante predloženého postupu sa na to používajú membrány, ktoré sú vyrobené zo separačnej vrstvy, ktorá vykonáva vlastnú separáciu, a jedno- alebo viacvrstvovej nosnej vrstvy, ktorá nesie separačnú vrstvu a má hrubšie póry ako separačná vrstva. Separačné vrstvy a nosná vrstva môžu pozostávať z organických polymérov, keramiky, kovu alebo uhlíka a musia byť stabilné v reakčnom médiu a pri teplote procesu. Výhodnými materiálmi na separačnú vrstvu sú polyamidy, polyimidy alebo polypiperazíny. Separačné vrstvy môžu tiež mať kladný alebo záporný povrchový náboj. Príkladom anionicky funkcionalizovanej nanofiltračnej membrány je membrána DESAL 5 DK, ale predložený vynález nie je obmedzený na výlučné použitie tejto membrány.
Membrány možno použiť vo forme ohybných rúrok, kapilár, dutých vláken alebo plochých membrán v plochom, rúrkovom, viackanálovom prvku, kapilárnych alebo cievkových moduloch, ktoré sú samy osebe známe.
Vo výhodných variantoch postupu podľa vynálezu je v nanofiltračnom kroku c) tlakový rozdiel na membráne v rozmedzí 5 - 100 barov, s výhodou 20 - 80 barov a s osobitnou výhodou 40 - 70 barov.
Procesná teplota je s výhodou od 20 do 80 °C, s výhodou od 30 do 60 °C. Okrem toho nanofiltráciu možno uskutočniť spôsobom známym odborníkom v danej oblasti kontinuálne alebo dávkovo v jednom alebo viacerých krokoch.
Vo výhodnom variante v každom prípade pred jedným alebo viacerými nanofiltračnými krokmi sa pridá soľ obsahujúca viacmocné katióny v tuhej forme alebo vo vodnom roztoku. Podľa vynálezu sa viacmocné katióny pridávajú vo forme chloridu, dusičnanu, hydroxidu, mravčanu, octanu, propionátu, glycinátu a/alebo laktátu vápenatého a/alebo horečnatého. V tomto prípade možno viacmocný katión Ca2+, dodávať v koncentrácii 0,05 - 50 mol Ca2+/mol D-pantotenátu, s výhodou 0,2 - 2 mol Ca2+/mol D-pantotenátu (vzhľadom na stav po zmiešaní).
Podľa vynálezu sa soli obsahujúce viacmocné katióny pridávajú v tuhej forme alebo vo vodnom roztoku počas, s výhodou na konci alebo po fermentácii v kroku a) alebo počas separácie buniek alebo po nej.
Okrem toho môže byť podľa vynálezu výhodné pridávanie solí obsahujúcich viacmocné katióny počas kroku nanofiltrácie. Okrem toho možno vodný roztok obsahujúci viacmocné katióny dodávať kontinuálne.
V ďalšom variante predloženého procesu je možné, že sa v jednom alebo viacerých procesných krokoch pre nanofiltráciou budú získavať roztoky s líšiacimi sa koncentráciami produktu. Tieto roztoky možno ďalej spracúvať nanofiltráciou tak, že roztoky sa dodávajú v postupných krokoch nanofiltrácie v poradí stúpajúcich koncentrácií produktu.
Podľa vynálezu sa v dôsledku vyššie opísaného postupu v retentáte nanofiltrácie obohatia predovšetkým viacmocné soli kyseliny pantoténovej. Keď sa použije anionicky funkcionalizovaná nanofiltračná membárna, v roztoku permeátu sa obohatia predovšetkým jednomocné ióny. Obsah jednomocných katiónov, s výhodou amónnych, draselných a/alebo sodných iónov v rententáte možno v tomto prípade znížiť na koncentráciu s 5 g/kg roztoku.
Podľa vynálezu permeát nanofiltrácie alebo jeho časť možno recirkulovať do fermentácie v kroku a) postupu podľa vynálezu. Táto recirkulácia permeátu alebo jeho častí sa môže uskutočňovať kontinuálne. Vyššie opísané procesné kroky uskutočňované popri nanofiltrácii slúžia na predbežné nakoncentrovanie alebo ďalšie nakoncentrovanie D-pantotenátu vo forme viacmocných solí.
Ďalšou výhodou nanofiltrácie používanej podľa vynálezu je, že zníženie jednomocných katiónov (v roztoku retentátu) môže byť sprevádzané súčasne zmenšením objemu retentátu. Spracovanie fermentačného roztoku obsahujúceho Dpantotenát nanofíltráciou možno takto použiť podľa vynálezu ako iónovýmenný a koncentračný proces na prípravu D-pantotenátu.
Toto s výhodou vedie k zjednodušeniu a súčasne zvýšenej efektívnosti následných procesných krokov. Napríklad spotrebu energie pri sušení možno vďaka nakoncentrovaniu výrazne znížiť.
Vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu sa fermentačný roztok zbavi bunkovej masy centrifugovaním a/alebo dekantáciou a/alebo ultrafiltráciou. Po pridaní 0,05 až 50 mol (Ca2+) iónov/mol pantotenátových iónov, s výhodou 0,2-2 mol Ca2+ iónov/mol pantotenátových iónov, ktoré sa s výhodou pridávajú vo forme zriedeného roztoku s 0,01 - 10 mol Ca2+/I, sa získaný roztok zavádza do nanofiltračného modulu. Tlakový rozdiel na membráne je v rozmedzí približne 5-100 barov, s výhodou približne 20 - 80 barov, s osobitnou výhodou približne 40 - 70 barov. Pred nanofíltráciou alebo počas nej možno vodný roztok obsahujúci ióny Ca2+ pridať do roztoku prúdiaceho cez membránu na strane nástreku. Retentát má objem 30 200 % východiskového roztoku. Okrem toho sa odstráni približne 5-99 %, s výhodou 30 - 80 % prítomných jednomocných katiónov.
Retentát s výhodou obsahujúci D-pantotenát vápenatý, D-pantotenát horečnatý alebo ich zmes sa potom podrobí sušeniu a/alebo formulácii. Sušenie a/alebo formulácia roztoku obsahujúceho D-pantotenát vápenatý a/alebo horečnatý sa uskutoční pomocou všeobecne známych metód, napríklad sušením rozprašovaním, granuláciou rozprašovaním, sušením vo fluidnej vrstve, granuláciou vo fluidnej vrstve, bubnovým sušením alebo spin-flash sušením (Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6. vydanie, 1999, elektronická verzia, kapitola „Drying of Solid Materials“). Vstupná teplota plynu pri konvekčnom sušení je v rozmedzí 100 - 280 °C, s výhodou 120-210 °C. Výstupná teplota plynu je 50 - 180 °C, s výhodou 60- 150 °C. Aby sa dosiahla požadovaná distribúcia veľkosti častíc a súvisiace vlastnosti produktu, jemné častice možno oddeľovať a recirkulovať. Okrem toho hrubý materiál možno mlieť v mlyne a rovnako potom recirkulovať.
Postup podľa vynálezu má tie výhody, že nežiaduce katióny sa účinne a prakticky úplne odstránia a súčasne prebehne zníženie objemu, čo zjednodušuje alebo zefektívňuje následné procesné kroky, najmä sušenie a/alebo formuláciu. Okrem toho nedochádza k žiadnemu rozkladu produktu, alebo len v mimoriadne malom rozsahu, a súčasne sa získava vysoký výťažok. Privádzaním soľných roztokov viacmocných katiónov počas fermentácie alebo na jej konci alebo počas ultrafiltrácie alebo diafiltrácie alebo na ich konci, alebo počas kroku nanofiltrácie a/alebo recirkuláciou permeátu do fermentačného roztoku sa ďalej zvyšujú výťažky Dpantotenátu vo forme viacmocných, s výhodou dvojmocných iónov, napríklad vápenatých alebo horečnatých.
Vo vyššie opísanom procese okrem toho je podľa vynálezu výhodné zníženie počtu zložitých krokov spracovania, najmä vynechanie použitia organických rozpúšťadiel so súčasným získaním požadovaného produktu dobrej biologickej hodnoty. Okrem toho sa podľa vynálezu významne znižuje množstvo produkovanej odpadovej vody. To vedie k ďalším úsporám v zložitých zariadeniach na spracovanie a manipuláciu. Postup podľa vynálezu sa teda s výhodou vyznačuje tým, že je jednoduchší, menej citlivý na chyby, menej časovo náročný, výrazne menej drahý a teda hospodárnejší ako konvenčné procesy.
To však nevylučuje, aby sa postup podľa vynálezu mohol meniť. Skôr opísané kroky postupu možno doplniť jedným alebo viacerými z nasledujúcich procesných krokov, ktoré sú samy osebe známe odborníkom v danej oblasti. V tomto prípade sú všetky predstaviteľné kombinácie nasledujúcich procesných krokov s procesnými krokmi známymi doposiaľ zahrnuté vo vynáleze.
Roztoky pochádzajúce z postupu podľa vynálezu možno dezinfikovať, napríklad zahriatím (sterilizáciou) alebo inými metódami, napríklad pasterizáciou alebo sterilnou filtráciou.
V ďalších variantoch postupu podľa vynálezu pred vysušením a/alebo formuláciou retentátu možno uskutočniť aspoň jeden krok a/alebo kombinácie z nasledujúcich krokov: lýza a/alebo sterilizovanie biomasy a/alebo oddelenie biomasy od fermentačného roztoku a/alebo pridanie ďalších prísad a/alebo nakoncentrovanie fermentačného roztoku, s výhodou odstránením vody.
Predložený vynález sa teda týka aj postupu, pri ktorom sa lýza a/alebo sterilizácia biomasy uskutoční ešte vo fermentačnom roztoku alebo nie až po odseparovaní biomasy od fermentačného roztoku. Toto možno uskutočniť napríklad tepelným spracovaním, s výhodou pri 80 - 200 °C a/alebo spracovaním kyselinou, s výhodou kyselinou sírovou alebo kyselinou chlorovodíkovou, a/alebo enzymaticky, s výhodou lyzozýmom.
Je tiež možné, aby bola prítomná bunková masa odstránená priamo nanofiltráciou, teda súčasne s výmenou jednomocných katiónov oproti viacmocným katiónom.
Roztok získaný spracovaním nanofiltráciou možno pred vysušením a/alebo formuláciou nakoncentrovať pomocou vhodnej odparky, napríklad odparky s klesajúcim filmom, odparky s tenkým filmom alebo rotačnej odparky. Také odparky vyrábajú napríklad firmy GIG (4800 Affnang Puchheim, Rakúsko), GEA Canzler (52303 Duren, Nemecko), Diessel (31103 Hildesheim, Nemecko) a Pitton (35274 Kirchhain, Nemecko).
Na zlepšenie farebných vlastností koncového produktu možno uskutočniť dodatočný krok filtrácie, pri ktorom sa do roztokov získaných počas postupu pridá troška aktívneho uhlia a táto suspenzia sa potom prefiltruje. Alternatívne možno roztoky získané počas fermentácie prefiltrovať cez malú vrstvu aktívneho uhlia. Použité množstvá aktívneho uhlia, ktoré sú na to potrebné, sú v rozmedzí niekoľkých hmotnostných percent roztoku a dokáže ich určiť odborník v danej oblasti na základe vedomostí a úsudku.
Tieto filtrácie možno zjednodušiť pridaním komerčného flokulačného činidla do príslušného roztoku pred filtráciou (napríklad Sedipur CF 902 alebo Sedipur CL 930 od BASF AG, Ludwigshafen).
Vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu sa fermentačný výstup (fermentačná zmes) sterilizuje zahrievaním a potom sa oddelí od bunkovej masy centrifúgovaním, filtráciou, ultrafiltráciou alebo dekantáciou. Po pridaní 50 - 1 000 mg/kg, s výhodou 100 - 200 mg/kg komerčne konvenčného flokulačného činidla vzhľadom na fermentačný výstup sa suspenzia prefiltruje cez malú vrstvu aktívneho uhlia a piesku, aby sa získal roztok bez biomasy s vysokým obsahom kyseliny Dpantoténovej. Takto spracovaný roztok sa potom spracuje nanofiltráciou.
Tento roztok možno potom vysušiť, napríklad sušením rozprašovaním. Toto možno uskutočniť v súbežnom, protiprúdovom alebo zmiešanom toku. Na atomizáciu možno použiť všetky známe atomizátory, najmä centrifugálne atomizátory (atomizátorový disk), jednotekutinovú hubicu alebo dvojtekutinovú hubicu. Výhodné teplotné podmienky pri sušení sú 150 - 250 °C vstupná teplota veže a 70 - 130 °C výstupná teplota veže. Sušenie však možno uskutočniť aj pri vyšších alebo nižších teplotách. Aby sa dosiahla veľmi nízka zvyšková vlhkosť, v rámci ďalších krokov možno poskytnúť ďalší krok sušenia vo fluidnej vrstve.
Sušenie rozprašovaním možno uskutočniť aj v FSD alebo SBD sušičke (FSD: fluidized spray dryer; SBD: spray bed dryer), ktoré vyrábajú firmy Niro (Kodaň, Dánsko) a APV-Anhydro (Kodaň, Dánsko), ktoré sú kombináciou rozprašovacej sušičky a fluidnej sušičky.
Pri sušení rozprašovaním možno pridať prostriedok proti spekaniu. Toto môže znížiť nanášanie materiálu na steny sušičky a zlepšiť správanie toku najmä v prípade jemnozrnných práškov. Prostriedky proti spekaniu, ktoré možno použiť, sú najmä silikáty, stearáty, fosfáty a kukuričný škrob.
Sušenie môže v zásade prebiehať aj v rozprašovanej fluidnej vrstve, kedy sušenie možno uskutočňovať nielen kontinuálne ale aj dávkovo. Roztok možno rozprašovať nielen zhora (horné rozprašovanie) a zospodu (dolné rozprašovanie), ale aj zboku (bočné rozprašovanie).
Predložený vynález sa ďalej týka kompozície na použitie ako krmivovej prísady a/alebo krmivového doplnku, kedy túto možno pripraviť nasledujúcimi krokmi:
a) použitie aspoň jedného organizmu, ktorý produkuje kyselinu Dpantoténovú a v ktorom je biosyntéza kyseliny pantoténovej (pan) a/alebo izoleucínu/valínu (ilv) deregulovaná a ktorý tvorí aspoň 2 g/l solí kyseliny Dpantoténovej fermentáciou v kultivačnom médiu, pričom sa do kultivačného média dodáva 0 -20 g/l, s výhodou 0 g/l voľného β-alanínu a/alebo soli β-alanínu,
b) privádzanie solí obsahujúcich viacmocné katióny do vzniknutého Dpantotenátu, pričom vznikajú viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej,
c) spracovanie fermentačného roztoku obsahujúceho D-pantotenát nanofiltráciou, pričom sa obohacujú viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej,
d) podrobenie nanofiltračného retentátu obsahujúceho viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej sušeniu a/alebo formulácii.
Vo variante predloženého vynálezu je zahrnutá kompozícia, ktorú možno pripraviť odstránením bunkovej masy alebo vyzrážaných zložiek pred nanofiltráciou v kroku c), s výhodou membránovou filtráciou, s osobitnou výhodou ultrafiltráciou a s veľmi osobitnou výhodou diafiltráciou. Predložený vynález sa ďalej týka kompozície, ktorú možno pripraviť privádzaním solí (v tuhej forme alebo ako vodný roztok) obsahujúcej viacmocné katióny počas odstránenia bunkovej masy alebo z roztoku vyzrážaných zložiek alebo po ňom. Okrem toho možno v ďalšom variante tieto soli dodávať aj počas nanofiltrácie.
Podľa vynálezu sa kompozícia ďalej vyznačuje tým, že obsahuje soli kyseliny D-pantoténovej v koncentrácii najmenej 1 - 100% hmotnostných, s výhodou 20 100% hmotnostných a s osobitnou výhodou najmenej 50% hmotnostných. Predložený vynález sa týka kompozície, ktorá obsahuje soli kyseliny D-pantoténovej vo forme dvojmocných katiónov, s výhodou D-pantotenát vápenatý a/alebo Dpantotenát horečnatý. Podľa vynálezu je výhodná kompozícia, ktorá sa vyznačuje tým, že obsah solí kyseliny D-pantoténovej vo forme jednomocných katiónov je <; 5 g/kg.
Podľa vynálezu sa pomocou vyššie opísaného postupu získa D-pantotenát vápenatý alebo D-pantotenát horečnatý, ktorý vyhovuje požiadavkám na krmivové prísady. Tieto požiadavky sú napríklad pomerne vysoký obsah D-pantotenátu a vysoká kompatibilita s cieľovým organizmom a biologická hodnota v zmysle „vitamínovej aktivity“ produktu podľa vynálezu.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1: Grafické znázornenie transmembránových tokov (tokov permeátu) fermentačného výstupu počas ultrafiltrácie ako funkcia koncentračného faktora MK použitím membrán so šírkou pórov 50 nm a 20 kD.
Obr. 2: Grafické znázornenie transmembránových tokov (tokov permeátu) centrifugovaného fermentačného výstupu počas ultrafiltrácie ako funkcia koncentračného faktora MK použitím membrány so šírkou pórov 20 kD.
Tabuľka 1: Náčrt asymetricky štruktúrovaných membrán na oddeľovanie bunkovej masy alebo zložiek vyzrážaných z roztoku.
Tabuľka 2: Náčrt membrán a ich vlastností na oddeľovanie bunkovej masy alebo zložiek vyzrážaných z roztoku.
Tabuľka 3: Náčrt analytických hodnôt nanofiltrácie, najmä s ohľadom na mieru rejekcie vápenatých iónov a pantotenátu vo vodnom roztoku obsahujúcom 0,1 mol/kg pantotenátu vápenatého a 0,2 mol/kg NaCl.
Tabuľka 4: Náčrt analytických hodnôt nanofiltrácie, najmä s ohľadom na mieru rejekcie vápenatých iónov a pantotenátu vo vodnom roztoku obsahujúcom 0,2 mol/l pantotenátu sodného a 0,1 mol/l CaCLTabuľka 5: Náčrt analytických hodnôt nanofiltrácie, najmä s ohľadom na mieru rejekcie vápenatých iónov vo vodnom roztoku obsahujúcom ekvimolárne množstvá NaCl a CaCb.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Predložený vynález je opísaný podrobnejšie na nasledujúcich príkladoch, ktoré však neobmedzujú rozsah vynálezu:
Príklad 1:
Do laboratórneho fermentora vybaveného miešadlom a zariadenie na prívod plynu s objemom 14 I sa dá fermentačné médium s nasledujúcim zložením:
Východisková látka Koncentrácia [g/l]
Kvasnicový extrakt 5
Sójová múka 40
Glutamát sodný H2O 5
Síran amónny 8
KH2PO4 5
k2hpo4 10
NaH2PO4 2 H2O 6,15
NaH2PO4 · 2 H2O 12
Po sterilizácii sa pridali nasledujúce sterilné zložky média:
Východisková látka Koncentrácia [g/l]
Glukóza · H2O 20
Síran vápenatý 0,1
Síran horečnatý 1
Citrát sodný 1
FeSO4 · 7 H2O 0,01
Roztok stopových solí 1 ml
Roztok stopových solí mal nasledujúce zloženie:
0,15 g Na2MoO4 2 H2O, 2,5 g H3BO3l 0,7 g CoCI2- 6 H2O, 0,25 g CuSO4 · 5 H2O, 1,6 g MnCI2 · 4 H2O, 0,3 g ZnSO4 7 H2O sa doplnili do 1 I vodou. Roztok stopových solí sa pridal sterilnou filtráciou. Počiatočný objem kvapaliny bol 5 I. Vyššie uvedené obsahy sú založené na tejto hodnote.
Do tohto roztoku sa pridalo 100 ml očkovacej kultúry (OD = 10) Bacillus subtilis PA668 a naočkovaná kultúra sa fermentovala pri 43 °C s intenzívnym miešaním pri rýchlosti zavádzania plynu 12 l/min. Tento kmeň je opísaný podľa prílohy prihlášky USA č. 60/262,995.
V priebehu 47 h sa pridalo 2,1 I sterilného vodného roztoku. Zloženie bolo:
Východisková látka Koncentrácia [g/l]
Glukóza 800
Chlorid vápenatý 0,6
Glutamát sodný · H2O 5
Citrát sodný 2
FeSO4 · 7 H2O 0,2
Roztok stopových solí 6 ml
V priebehu fermentácie sa pH udržiavalo na hodnote 7,2 pridávaním 25 % roztoku amoniaku alebo 20 % kyseliny fosforečnej. Amoniak pôsobil súčasne ako zdroj dusíka pre fermentáciu. Rýchlosť rotácie miešacieho prvku sa regulovala tak, aby sa obsah rozpusteného kyslíka udržiaval na 30 % hodnoty nasýtenia. Po zastavení pridávania zdroja uhlíka fermentácia pokračovala, kým obsah rozpusteného kyslíka (pO2) nedosiahol hodnotu 95 % hodnoty nasýtenia. Koncentrácia D-pantotenátu pri zastavení po 48 h bola 22,8 g/l.
Podobne možno pripraviť fermentačné zmesi, ktoré majú titre kyseliny pantoténovej bez prísunu β-alanínu vyššie ako 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 a > 90 g/l.
Príklad 2:
000 ml výstupu fermentácie pripraveného podľa príkladu 1 sa podrobilo ultracentrifugovaniu, pričom sa použil keramický jednokanálový rúrkový modul (od firmy Atech, Gladbeck, Nemecko). V tomto prípade sa najprv použila membrána so šírkou pórov 20 kD (10 nm) a potom membrána so šírkou pórov 50 nm.
Teplota pri experimentoch bola 40 °C, rýchlosť prietoku bola 4 m/s a transmembránový tlak (TMP = [p(prísun) + p(retentát)]/2 - p(permeát)), ak nie je uvedené inak, bol 1 bar.
Na obr. 1 sú vynesené transmembránové toky (toky permeátu) ako funkcia koncentračného faktora M K (MK(t) = mprísun/mretentát (t)).
Je zrejmé, že membrána s nižšou šírkou pórov (20 kD) vykazuje výrazne vyššie toky ako membrána s väčšou šírkou pórov (50 nm).
Príklad 3:
000 ml výstupu fermentácie pripraveného podľa príkladu 1 sa podrobilo ultrafiltrácii podobne ako v príklade 2, pričom použitá membrána mala šírku pórov 20 kD.
Obrázok 2 ukazuje, že koncentrácia pri použití fermentačného výstupu, ktorý bol už centrifugovaný, je výrazne vyššia ako v príklade 2.
Príklad 4:
000 ml vodného roztoku obsahujúceho pantotenát vápenatý (podľa tabuľky 3, stĺpec „prísun retentátu“) sa dalo do miešanej tlakovej bunky s maximálnou prevádzkovou kapacitou približne 1,5 1. Tlak „nástreku“ sa v tejto bunke vytvára pretlakom dusíka a prietok membránou bol zabezpečený miešaním použitím kotvového miešadla poháňaného magneticky.
Použila sa nanofiltračné membrána DESAL 5 DK od firmy Osmonics Deutschland GmbH in Moers.
Pred experimentmi s vyššie uvedeným roztokom, v ich priebehu a po nich sa integrita membrány testovala rejekčnými testami roztokom MgSO4 (2 000 ppm hmotnostných).
Miera rejekcie Rje uvedená v dvoch stĺpcoch na pravej strane tabuľky 3. Miera rejekcie je tu definovaná nasledovne: Rj = 1 - Ci,permeát/Ci,retentáb kde R, = miera rejekcie pre zložku i, CiiPernieát = koncentrácia zložky i v permeáte, Cj,retentát = koncentrácia zložky i v retentáte.
Koncentrácie znamenajú koncentrácie okamžite dosiahnuté v experimente s neustáleným stavom v definovanom časovom bode, ale nie koncentráciu vo frakciách získaných po skončení experimentu. Miera rejekcie R, je v ideálnom prípade nezávislá od koncentrácie, čo sa použilo ako základ pri výpočte udávaných hodnôt z koncentrácií vo frakciách.
Z tabuľky 3 vyplýva, že Ca2+ a pantotenát majú miery rejekcie 84 % a 99 %, teda sú prítomné v retentáte.
Príklad 5:
Pri spracovaní vodného roztoku pantotenátu sodného (0,2 mol/l) za podobných podmienok ako v príklade 4 sa uskutočnilo nakoncentrovanie nanofiltráciou. Tabuľka 4 ukazuje, že miera rejekcie pantotenátu je 80 %.
Príklad 6:
Nakoncentrovanie ekvimolárneho roztoku NaCI/CaCb za podobných podmienok ako v príklade 4 je zhrnuté v tabuľke 5. Tu možno vidieť, že miera rejekcie membrány pre Ca2+ v hodnote 41 % alebo 42 % je relatívne nízka v porovnaní s vysokou mierou rejekcie vápnika v kombinácii s pantotenátom (príklad 5).

Claims (26)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Postup na prípravu kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa
    a) použitie aspoň jedného organizmu, ktorý produkuje kyselinu Dpantoténovú a v ktorom je biosyntéza kyseliny pantoténovej (pan) a/alebo izoleucínu/valínu (ilv) deregulovaná a ktorý tvorí aspoň 2 g/l solí kyseliny Dpantoténovej fermentáciou v kultivačnom médiu, pričom sa do kultivačného média dodáva 0-20 g/l voľného β-alanínu a/alebo soli β-alanínu,
    b) do vzniknutého D-pantotenátu sa dodávajú soli obsahujúce viacmocné katióny, pričom vznikajú viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej,
    c) pričom roztok obsahujúci viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej sa spracúva nanofiltráciou, pričom sa viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej obohacujú, a
    d) nanofiltračný retentát obsahujúci viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej sa podrobí sušeniu a/alebo formulácii.
  2. 2. Postup podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že do kultivačného média sa nedodáva žiadny voľný β-alanín a/alebo soľ β-alanínu.
  3. 3. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že použitým organizmom produkujúcim kyselinu D-pantoténovú je baktéria, kvasinka alebo pleseň.
  4. 4. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že použitým mikroorganizmom je baktéria z čeľade Bacillaceae.
  5. 5. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že sa používa baktéria rodu Bacillus a s výhodou druhy B. subtils, B. licheniformis alebo B. amyloliquefaciens.
  6. 6. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že v kroku a) sa vytvorí obsah kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí najmenej 10 g/l kultivačného média, s výhodou najmenej 20 g/l, s osobitnou výhodou najmenej 40 g/l a s najväčšou výhodou najmenej 60 g/l kultivačného média.
  7. 7. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že bunková masa alebo zložky vyzrážané z roztoku sa oddelia pred nanofiltráciou v kroku c).
  8. 8. Postup podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že separácia sa uskutoční dekantáciou alebo membránovou filtráciou, s výhodou ultrafiltráciou.
  9. 9. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 alebo 8, vyznačujúci sa tým, že membránová filtrácia sa uskutoční ako diafiltrácia.
  10. 10. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že soli obsahujúce viacmocné katióny sa pridávajú v tuhej forme alebo vo vodnom roztoku počas, s výhodou na konci alebo po fermentácii v kroku a) alebo počas membránovej filtrácie roztoku obsahujúceho D-pantotenát alebo po nej.
  11. 11. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že počas nanofiltrácie sa pridajú soli obsahujúce viacmocné katióny v tuhej forme alebo vo vodnom roztoku.
  12. 12. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11, vyznačujúci sa tým, že vodný roztok obsahujúci viacmocné katióny sa dodáva kontinuálne.
  13. 13. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa tým, že viacmocné katióny sa pridávajú vo forme chloridu, dusičnanu, hydroxidu, mravčanu, octanu, propionátu, glycinátu a/alebo laktátu vápenatého a/alebo horečnatého.
  14. 14. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 13, vyznačujúci sa tým, že dodávaným viacmocným katiónom je Ca2+ v koncentrácii 0,05 až 50 mol Ca2+/mol D-pantotenátu, s výhodou 0,2 až 2 mol Ca2+/mol D-pantotenátu.
  15. 15. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 14, vyznačujúci sa tým, že v nanofiltračnom kroku c) je tlakový rozdiel na membráne v rozmedzí 5 až 100 barov, s výhodou 20 až 80 barov a s osobitnou výhodou 40 až 70 barov.
  16. 16. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15, vyznačujúci sa tým, že nanofiltrácia v kroku c) znižuje obsah jednomocných katiónov, s výhodou amónnych, draselných a/alebo sodných iónov, na koncentráciu s 5 g/kg roztoku.
  17. 17. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16, vyznačujúci sa tým, že permeát z kroku c) alebo jeho časť sa recirkuluje do fermentácie v kroku a).
  18. 18. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 17, vyznačujúci sa tým, že permeát alebo jeho časti sa recirkulujú kontinuálne.
  19. 19. Postup podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 18, vyznačujúci sa tým, že retentátom z kroku c) je suspenzia obsahujúca viacmocné soli kyseliny Dpantoténovej.
  20. 20. Kompozícia na použitie ako krmivová prísada a/alebo krmivový doplnok, vyznačujúca sa tým, že ju možno pripraviť nasledujúcimi krokmi:
    a) použitie aspoň jedného organizmu, ktorý produkuje kyselinu Dpantoténovú a v ktorom je biosyntéza kyseliny pantoténovej (pan) a/alebo izoleucínu/valínu (ilv) deregulovaná a ktorý tvorí aspoň 2 g/l solí kyseliny Dpantoténovej fermentáciou v kultivačnom médiu, pričom sa do kultivačného média dodáva 0-20 g/l, s výhodou 0 g/l voľného β-alanínu a/alebo soli βalanínu,
    b) do vzniknutého D-pantotenátu sa dodávajú soli obsahujúce viacmocné katióny, pričom vznikajú viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej,
    c) pričom roztok obsahujúci viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej sa spracúva nanofiltráciou, pričom sa viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej obohacujú, a
    d) nanofiltračný retentát obsahujúci viacmocné soli kyseliny D-pantoténovej sa podrobí sušeniu a/alebo formulácii.
  21. 21. Kompozícia podľa nároku 20, vyznačujúca sa tým, že ju možno pripraviť pred krokom c) odstránením bunkovej masy alebo vyzrážaných zložiek, s výhodou membránovou filtráciou, s osobitnou výhodou ultrafiltráciou a s veľmi osobitnou výhodou diafiltráciou.
  22. 22. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 alebo 21, vyznačujúca sa tým, že počas separácie bunkovej masy alebo zložiek vyzrážaných z roztoku alebo po nej sa dodávajú soli obsahujúce viacmocné katióny.
  23. 23. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 22, vyznačujúca sa tým, že pred nanofiltráciou alebo počas nej sa dodávajú soli obsahujúce viacmocné katióny.
  24. 24. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 23, vyznačujúca sa tým, že obsahuje soli kyseliny D-pantoténovej vo forme dvojmocných katiónov, s výhodou D-pantotenát vápenatý a/alebo D-pantotenát horečnatý.
  25. 25. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 24, vyznačujúca sa tým, že obsahuje soli kyseliny D-pantoténovej v koncentrácii 1 až 100% hmotnostných, s výhodou 20 až 100 % hmotnostných a s osobitnou výhodou najmenej 50 % hmotnostných.
  26. 26. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 25, vyznačujúca sa tým, že obsah solí kyseliny D-pantoténovej vo forme jednomocných katiónov je =s 5 g/kg.
    Opísaný postup na prípravu kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí je založený na použití mikroorganizmu, ktorý produkuje kyselinu D-pantoténovú v množstve 2 g/1, má deregulovanú biosyntézu kyseliny pantoténovej a/alebo izoleucínu alebo valínu, pričom sa počas kultivácie pridáva do média 0 až 20 g/1 β-alanínu a/alebo jeho solí. Ďalej sa do vzniknutého Dpantotenátu pridávajú viacmocné soli, potom sa roztok obsahujúci viacmocné soli kyseliny Dpantoténovej spracúva nanofíltráciou a retentát obsahujúci uvedené soli sa podrobí sušeniu a formulácií. Je uvedené tiež použitie takto pripravenej kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí ako prísad do krmív.
SK1043-2003A 2001-02-21 2002-02-20 Príprava kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí ako prísad do krmív SK10432003A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10108226 2001-02-21
PCT/EP2002/001754 WO2002066664A2 (de) 2001-02-21 2002-02-20 Verfahren zur herstellung von d-pantothensäure und/oder salze als zusatz zu tierfuttermitteln

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK10432003A3 true SK10432003A3 (sk) 2004-02-03

Family

ID=7674923

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1043-2003A SK10432003A3 (sk) 2001-02-21 2002-02-20 Príprava kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí ako prísad do krmív

Country Status (22)

Country Link
US (1) US7611872B2 (sk)
EP (1) EP1385975B1 (sk)
JP (1) JP2004524028A (sk)
KR (1) KR20030075205A (sk)
CN (1) CN1294271C (sk)
AT (1) ATE350483T1 (sk)
AU (1) AU2002308290A1 (sk)
BR (1) BRPI0207477B1 (sk)
CA (1) CA2438945A1 (sk)
CZ (1) CZ20032245A3 (sk)
DE (1) DE50209165D1 (sk)
EE (1) EE200300407A (sk)
ES (1) ES2278929T3 (sk)
HU (1) HU230180B1 (sk)
IL (1) IL157495A0 (sk)
IN (1) IN2003CH01314A (sk)
MX (1) MXPA03007455A (sk)
NO (1) NO20033705L (sk)
PL (1) PL364087A1 (sk)
RU (1) RU2003128533A (sk)
SK (1) SK10432003A3 (sk)
WO (1) WO2002066664A2 (sk)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10344200A1 (de) * 2003-09-22 2005-05-04 Basf Ag Verfahren zur Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement
FI120590B (fi) * 2005-10-28 2009-12-15 Danisco Sweeteners Oy Erotusmenetelmä
JP4615470B2 (ja) * 2006-03-29 2011-01-19 卓郎 簑和田 大脳の認知力を用いた疾患治療・予防の方法および医薬
DE102008031579A1 (de) * 2008-07-03 2010-01-07 Bayer Materialscience Ag Ein hocheffizientes Gasphasenverfahren zur Modifizierung und Funktionalisierung von Kohlenstoff-Nanofasern mit Salpetersäuredampf
KR200449818Y1 (ko) * 2008-07-11 2010-08-12 (주)디에스피 의자용 허리받침대
KR101105780B1 (ko) * 2009-09-07 2012-01-17 김선환 요추받이가 구비된 의자용 등받이
MY186792A (en) 2016-02-04 2021-08-20 Ind Tech Res Inst Method for separating hydrolysis product of biomass
US10428357B2 (en) * 2017-04-04 2019-10-01 NNB Nutrition USA, LLC Preparation of (R)-3-hydroxybutyric acid or its salts by one-step fermentation
CN112592290B (zh) * 2020-12-14 2023-08-11 广安摩珈生物科技有限公司 泛酸钙粗品纯化方法

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB526267A (en) 1938-04-01 1940-09-13 Goldschmidt Ag Th Process of applying coatings of non-ferrous metals to cast iron
GB562267A (en) * 1941-08-08 1944-06-26 Hoffmann La Roche Process for the manufacture of a crystallised, non-hygroscopic calcium salt of d-pantothenic acid
US4891208A (en) * 1985-04-10 1990-01-02 The Liposome Company, Inc. Steroidal liposomes
ATE45744T1 (de) * 1984-07-25 1989-09-15 Ciba Geigy Ag Phosphatidylverbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung.
US5993823A (en) * 1990-12-18 1999-11-30 Institut Pasteur De Lille Cytotoxic T lymphocyte-inducing lipopeptides and methods of use
EP0493060A3 (en) 1990-12-25 1993-04-14 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production method of d-pantothenic acid and plasmids and microorganisms thereof
JP3710497B2 (ja) * 1992-09-25 2005-10-26 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト D−パント酸、d−パントテン酸およびそれらの塩の製造法
JPH06114948A (ja) 1992-10-01 1994-04-26 Shiimetsuto Kk 未硬化液排出口付光硬化造形物とその造形法
EP0748332B1 (de) * 1994-12-28 1999-11-10 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin Neues cholesterolderivat für den liposomalen gentransfer
KR100282076B1 (ko) * 1995-04-21 2001-02-15 다께다 구니오 디-판토텐산 칼슘의 제조 방법
DE69632199T2 (de) 1995-09-13 2005-04-21 Basf Ag Verfahren zur herstellung von d-pantoinsäure und d-pantothensäure oder deren salze
US6063428A (en) * 1996-02-26 2000-05-16 The Procter & Gamble Company Green tea extract subjected to cation exchange treatment and nanofiltration to improve clarity and color
US5814498A (en) * 1996-04-29 1998-09-29 Archer Daniels Midland Company Process for the recovery of organic acids and ammonia from their salts
TW391881B (en) * 1996-09-25 2000-06-01 Baxter Int Method and apparatus for filtering suspensions of medical and biological fluids or the like
DE59812638D1 (de) 1997-10-04 2005-04-14 Degussa Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aminosäuren der aspartat- und/oder glutamatfamilie und im verfahren einsetzbare mittel
WO1999027124A1 (en) 1997-11-26 1999-06-03 Novo Nordisk A/S Enzymatic starch saccharification including a membrane separation step
AT407050B (de) 1997-12-29 2000-11-27 Chemie Linz Gmbh Verfahren zur herstellung von l-asparaginsäure
DE19846499A1 (de) 1998-10-09 2000-04-20 Degussa Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure durch Verstärkung von für Ketopantoat-Reduktase kodierenden Nukleotidsequenzen
DE19855313A1 (de) 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen
JP3236828B2 (ja) * 1999-01-27 2001-12-10 雪印乳業株式会社 乳カルシウム組成物
FR2791701B1 (fr) 1999-04-02 2003-05-23 Roquette Freres Procede de fabrication d'un hydrolysat d'amidon a haute teneur en dextrose
ATE227938T1 (de) * 1999-05-05 2002-12-15 Degussa D-pantothensäure und/oder eines ihrer salze enthaltende futtermittel-additive und verfahren zu deren herstellung
JP5392957B2 (ja) * 1999-09-21 2014-01-22 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア パント−化合物を産生するための方法および微生物
WO2002005747A2 (en) 2000-07-14 2002-01-24 Cadila Pharmaceuticals Limited The process of manufacturing pharmaceutical grade tannates
IL154824A0 (en) 2000-09-20 2003-10-31 Basf Ag Animal feed supplement containing d-pantothenic acid and/or its salts, improved method for the production thereof, and its use
EP1390519B1 (en) 2001-01-19 2006-12-06 BASF Aktiengesellschaft Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate
CZ20032410A3 (cs) * 2001-03-09 2004-02-18 Basf Aktiengesellschaft Způsoby pro zvýšenou produkci pantothenátu

Also Published As

Publication number Publication date
US20040053374A1 (en) 2004-03-18
CN1492933A (zh) 2004-04-28
DE50209165D1 (de) 2007-02-15
JP2004524028A (ja) 2004-08-12
ATE350483T1 (de) 2007-01-15
NO20033705L (no) 2003-10-16
EP1385975B1 (de) 2007-01-03
EE200300407A (et) 2003-12-15
CA2438945A1 (en) 2002-08-29
CN1294271C (zh) 2007-01-10
BR0207477A (pt) 2004-08-10
RU2003128533A (ru) 2005-04-10
ES2278929T3 (es) 2007-08-16
WO2002066664A2 (de) 2002-08-29
PL364087A1 (en) 2004-12-13
WO2002066664A3 (de) 2003-12-04
AU2002308290A1 (en) 2002-09-04
HUP0303299A3 (en) 2007-09-28
CZ20032245A3 (cs) 2003-11-12
BRPI0207477B1 (pt) 2015-05-26
MXPA03007455A (es) 2004-07-30
EP1385975A2 (de) 2004-02-04
IN2003CH01314A (en) 2005-11-25
KR20030075205A (ko) 2003-09-22
IL157495A0 (en) 2004-03-28
HUP0303299A2 (hu) 2004-01-28
US7611872B2 (en) 2009-11-03
HU230180B1 (hu) 2015-09-28
NO20033705D0 (no) 2003-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK10432003A3 (sk) Príprava kyseliny D-pantoténovej a/alebo jej solí ako prísad do krmív
US7781192B2 (en) Method for producing D-pantothenic acid and/or a salt thereof via purification by cation exchange as additive for animal food
US20040050335A1 (en) Animal feed supplement containing d-pantothenic acid and/or its salts, improved method for the production thereof, and its use
US7727748B2 (en) Method for producing D-pantothenic acid and/or salts thereof via purification by anion exchange as an additive for animal feed
US7824891B2 (en) Method for producing D-pantothenic acid and/or salts thereof via purification by electrodialysis as an additive for animal feed
JP2004529632A (ja) パントテン酸塩の改良された製造方法