JP2521706B2 - プロテア−ゼの製造方法 - Google Patents
プロテア−ゼの製造方法Info
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- JP2521706B2 JP2521706B2 JP60267326A JP26732685A JP2521706B2 JP 2521706 B2 JP2521706 B2 JP 2521706B2 JP 60267326 A JP60267326 A JP 60267326A JP 26732685 A JP26732685 A JP 26732685A JP 2521706 B2 JP2521706 B2 JP 2521706B2
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- protease
- culture
- producing
- nitrogen
- growth
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はプロテアーゼ生産能を有する糸状菌を用いて
プロテアーゼを効率的に製造する方法に関するものであ
る。
プロテアーゼを効率的に製造する方法に関するものであ
る。
プロテアーゼは蛋白質またはその部分加水分解物に作
用してペプチド結合を分解する加水分解酵素であつて、
医薬や味噌，醤油，酒などの食品、洗剤などに広範囲に
利用されている。
用してペプチド結合を分解する加水分解酵素であつて、
医薬や味噌，醤油，酒などの食品、洗剤などに広範囲に
利用されている。
従来、微生物によるプロテアーゼの生産に関する研究
は、活性の高い微生物のスクリーニング、及びその育種
に主眼が置かれていた。また、培養条件に関する研究
も、多くは培地の組成、特に無機塩添加の効果（特公昭
50−22111号公報など）や窒素源の種類（特開昭51−951
80号公報など）、炭素源の種類（特公昭52−12797号公
報など）などに限られていた。
は、活性の高い微生物のスクリーニング、及びその育種
に主眼が置かれていた。また、培養条件に関する研究
も、多くは培地の組成、特に無機塩添加の効果（特公昭
50−22111号公報など）や窒素源の種類（特開昭51−951
80号公報など）、炭素源の種類（特公昭52−12797号公
報など）などに限られていた。
これら従来の提案方法では、特定の化合物を要する上
に、いずれも高いプロテアーゼ力価が得られない。
に、いずれも高いプロテアーゼ力価が得られない。
さらに従来の方法は、いずれも回分式の培養方法に関
するものであり、連続培養方法に関しては全く提案され
ていないという問題点があつた。
するものであり、連続培養方法に関しては全く提案され
ていないという問題点があつた。
本発明は、これら従来方法の問題点を解決するために
成されたものであつて、培養条件を最適化してプロテア
ーゼ力価を高めることを意図し、さらに連続培養法でも
実施できるようにしたものである。
成されたものであつて、培養条件を最適化してプロテア
ーゼ力価を高めることを意図し、さらに連続培養法でも
実施できるようにしたものである。
即ち、本発明はプロテアーゼ生産能を有する糸状菌を
液体培地に培養してプロテアーゼを製造する方法におい
て、増殖末期以降における培養液中の窒素濃度を500mg/
以下に維持しつつ培養することを特徴とするプロテア
ーゼの製造方法である。
液体培地に培養してプロテアーゼを製造する方法におい
て、増殖末期以降における培養液中の窒素濃度を500mg/
以下に維持しつつ培養することを特徴とするプロテア
ーゼの製造方法である。
本発明において用いられる微生物は、アスペルギルス
属、ペニシリウム属、ムコール属、またはリゾプス属等
に属するプロテアーゼ生産能を有する糸状菌であり、具
体的にはアスペルギルス・ソーヤ（IAM2703）、アスペ
ルギルス・ソーヤ（IAM2631）、アスペルギルス・オリ
ゼー（IAM2609）、アスペルギルス・オリゼー（IFO417
6）、アスペルギルス・タマリ（IAM2156）、ペニシリウ
ム・クリソゲナム（HUT4019）、ペニシリウム・ルテウ
ム（AHU8022）、ムコール・ラセモサス（AHU6002）、ム
コール・ヒエマリス（HUT1131）、リゾープス・フオル
モサエンシス（IFO4732）、リゾープス・ジヤバニカス
（IFO5441）などが挙げられる。
属、ペニシリウム属、ムコール属、またはリゾプス属等
に属するプロテアーゼ生産能を有する糸状菌であり、具
体的にはアスペルギルス・ソーヤ（IAM2703）、アスペ
ルギルス・ソーヤ（IAM2631）、アスペルギルス・オリ
ゼー（IAM2609）、アスペルギルス・オリゼー（IFO417
6）、アスペルギルス・タマリ（IAM2156）、ペニシリウ
ム・クリソゲナム（HUT4019）、ペニシリウム・ルテウ
ム（AHU8022）、ムコール・ラセモサス（AHU6002）、ム
コール・ヒエマリス（HUT1131）、リゾープス・フオル
モサエンシス（IFO4732）、リゾープス・ジヤバニカス
（IFO5441）などが挙げられる。
本発明に用いられるプロテアーゼ生産能を有する糸状
菌は雑菌汚染防止の観点から耐塩性を有するものである
ことが望ましい（耐塩性の目安としては食塩５％以上、
好ましくは食塩10％以上である）。
菌は雑菌汚染防止の観点から耐塩性を有するものである
ことが望ましい（耐塩性の目安としては食塩５％以上、
好ましくは食塩10％以上である）。
本発明に用いられる糸状菌を培養するための液体培地
は、従来法で用いられるものを使用することができる。
たとえば炭素源としては、グルコース、可溶性でんぷ
ん、サツカロース、デキストリン、セルロース、グリセ
リン、フスマなど、窒素源としては、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、大豆粉、ぬか、カゼイン、ポリペプト
ン、グルテン、硝酸塩などが用いられる。また無機塩と
しては、各種リン酸塩や硫酸塩、塩酸塩などが用いられ
る。さらに、菌の生育を促進するためにビタミン類や核
酸などを用いてもよい。
は、従来法で用いられるものを使用することができる。
たとえば炭素源としては、グルコース、可溶性でんぷ
ん、サツカロース、デキストリン、セルロース、グリセ
リン、フスマなど、窒素源としては、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、大豆粉、ぬか、カゼイン、ポリペプト
ン、グルテン、硝酸塩などが用いられる。また無機塩と
しては、各種リン酸塩や硫酸塩、塩酸塩などが用いられ
る。さらに、菌の生育を促進するためにビタミン類や核
酸などを用いてもよい。
本発明においては、先ず、前記液体培地にプロテアー
ゼ生産能を有する糸状菌を接種し、液体培養する。この
ときの培養温度、培地のpH、通気量などの培養条件は使
用する菌株、培地組成などによつて変わるが、通常、培
地温度は25〜40℃、培地のpHは３〜８、通気量は0.1〜2
V.V.M程度である。
ゼ生産能を有する糸状菌を接種し、液体培養する。この
ときの培養温度、培地のpH、通気量などの培養条件は使
用する菌株、培地組成などによつて変わるが、通常、培
地温度は25〜40℃、培地のpHは３〜８、通気量は0.1〜2
V.V.M程度である。
培養初期の誘導期を経て、増殖期になると菌はさかん
に増殖する。通常、培養開始１〜４日程度で増殖は止ま
り、以降は、ほとんど変わらないか、又は漸減気味とな
る定常期に移行する。本発明においては、増殖末期以
降、即ち増殖末期から主として始まる酵素産生期に、培
養液中の窒素濃度を500mg/以下に制御することによつ
て、生産されるプロテアーゼの力価を従来法と比較して
著しく高めることに成功したものである。
に増殖する。通常、培養開始１〜４日程度で増殖は止ま
り、以降は、ほとんど変わらないか、又は漸減気味とな
る定常期に移行する。本発明においては、増殖末期以
降、即ち増殖末期から主として始まる酵素産生期に、培
養液中の窒素濃度を500mg/以下に制御することによつ
て、生産されるプロテアーゼの力価を従来法と比較して
著しく高めることに成功したものである。
即ち、増殖末期以降における培養液中の窒素濃度が50
0mg/よりも大であると、プロテアーゼ生産能を有する
糸状菌が通常の状態以上にプロテアーゼを生産しなくと
も、液中に窒素成分が含まれていることにより、糸状菌
はこれを摂取して増殖するため、高いプロテアーゼ力価
が得られない。
0mg/よりも大であると、プロテアーゼ生産能を有する
糸状菌が通常の状態以上にプロテアーゼを生産しなくと
も、液中に窒素成分が含まれていることにより、糸状菌
はこれを摂取して増殖するため、高いプロテアーゼ力価
が得られない。
そして増殖末期以降において、培養液中の窒素濃度を
500mg/以下に維持する方法としては、予じめ培養液中
の窒素成分含有量を制御しておく方法、および増殖末期
以降における培養液中の窒素成分を制御する方法などが
挙げられる。
500mg/以下に維持する方法としては、予じめ培養液中
の窒素成分含有量を制御しておく方法、および増殖末期
以降における培養液中の窒素成分を制御する方法などが
挙げられる。
このうち、前者の培養液中に窒素成分含有量を予め制
御する方法としては、菌体自身の炭素、窒素およびリン
の組成を考慮して、培養液中の窒素成分の含有割合を炭
素やリンと比べて低くする方法がある。
御する方法としては、菌体自身の炭素、窒素およびリン
の組成を考慮して、培養液中の窒素成分の含有割合を炭
素やリンと比べて低くする方法がある。
例えばアスペルギルス・オリーゼの場合、菌体の乾燥
重量の約60％が炭素、約５％が窒素、約１％がリンから
構成されているので、可溶性でんぷん3.5％、ポリペプ
トン0.4％、酵母エキス0.03％、硫酸マグネシウム0.05
％、リン酸１カリウム0.5％を含む液体培地で培養する
と、培養液中の窒素成分であるポリペプトン量は他の栄
養源の量に比較して少ないため、最初に消費しつくされ
る。そしてその時点で菌の増殖は停止し、定常期に入い
ることになる。この状態は窒素源が律速となつて菌の増
殖が制限されたと解され、同時に高力価のプロテアーゼ
を生産するようになる。
重量の約60％が炭素、約５％が窒素、約１％がリンから
構成されているので、可溶性でんぷん3.5％、ポリペプ
トン0.4％、酵母エキス0.03％、硫酸マグネシウム0.05
％、リン酸１カリウム0.5％を含む液体培地で培養する
と、培養液中の窒素成分であるポリペプトン量は他の栄
養源の量に比較して少ないため、最初に消費しつくされ
る。そしてその時点で菌の増殖は停止し、定常期に入い
ることになる。この状態は窒素源が律速となつて菌の増
殖が制限されたと解され、同時に高力価のプロテアーゼ
を生産するようになる。
一方、増殖末期以降における培養液中の窒素成分を制
御する方法は、増殖末期に、炭素源を含む培地を添加し
て菌体をさらに増殖させ、培養液中の窒素源が500mg/
以下となるまで消費させる方法や、培養液から人為的に
窒素成分を除去する方法、例えばゼオライトやイオン交
換樹脂を用いて窒素源を吸着除去する方法などが挙げら
れる。
御する方法は、増殖末期に、炭素源を含む培地を添加し
て菌体をさらに増殖させ、培養液中の窒素源が500mg/
以下となるまで消費させる方法や、培養液から人為的に
窒素成分を除去する方法、例えばゼオライトやイオン交
換樹脂を用いて窒素源を吸着除去する方法などが挙げら
れる。
回分式培養法においては、上記のいずれかの方法を採
用すればよいが、培養液中の窒素成分の量を予め制御す
る方法の方が簡単であり、好ましい。
用すればよいが、培養液中の窒素成分の量を予め制御す
る方法の方が簡単であり、好ましい。
特に、本発明を連続式培養法に適用する場合には、最
初から窒素成分を制御した液体培地で培養し、窒素成分
が消費しつくされる増殖末期から、同様に窒素成分が50
0mg/以下となるように制御された量の窒素成分を含む
基質を連続供給してやればよく、極めて容易に糸状菌の
連続培養が可能となる。このとき、培養液中の窒素濃度
を常時モニタリングしておき、この量が常に500mg/以
下となるように自動的に基質中の窒素成分量を制御する
ようにしてもよい。
初から窒素成分を制御した液体培地で培養し、窒素成分
が消費しつくされる増殖末期から、同様に窒素成分が50
0mg/以下となるように制御された量の窒素成分を含む
基質を連続供給してやればよく、極めて容易に糸状菌の
連続培養が可能となる。このとき、培養液中の窒素濃度
を常時モニタリングしておき、この量が常に500mg/以
下となるように自動的に基質中の窒素成分量を制御する
ようにしてもよい。
こうして、回分培養や連続培養方式により、高力価プ
ロテアーゼを含む培養液が得られる。この培養液からプ
ロテアーゼを回収する手段としては、特に制限されず、
例えば過により菌体を分離し、必要に応じ透析や塩
析、イオン交換樹脂処理、ゲル過などによりプロテア
ーゼを採取、精製する方法が挙げられる。
ロテアーゼを含む培養液が得られる。この培養液からプ
ロテアーゼを回収する手段としては、特に制限されず、
例えば過により菌体を分離し、必要に応じ透析や塩
析、イオン交換樹脂処理、ゲル過などによりプロテア
ーゼを採取、精製する方法が挙げられる。
本発明方法では、糸状菌の増殖末期以降において培養
液中の窒素成分量を500mg/以下という窒素欠乏状態と
することにより、プロテアーゼ生産能を有する糸状菌が
増殖、生育に必要な窒素源をより摂取しようとしてプロ
テアーゼを一層産生するものと推定される。
液中の窒素成分量を500mg/以下という窒素欠乏状態と
することにより、プロテアーゼ生産能を有する糸状菌が
増殖、生育に必要な窒素源をより摂取しようとしてプロ
テアーゼを一層産生するものと推定される。
以下に本発明の実施例および比較例を示す。
実施例 １ 2.5容ミニジヤーフアメンタを用い、液体培地の仕
込液量1.5、温度30℃の条件下に菌を培養した。用い
た菌株はアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus soja
e）IAM2703であつた。
込液量1.5、温度30℃の条件下に菌を培養した。用い
た菌株はアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus soja
e）IAM2703であつた。
液体培地の組成は可溶性でんぷん56g/、ポリペプト
ン5g/、MgSO4・7H2O2g/、K2HPO43.8g/、KH2PO41.
2g/、NaCl100g/とした。
ン5g/、MgSO4・7H2O2g/、K2HPO43.8g/、KH2PO41.
2g/、NaCl100g/とした。
培養は胞子を106コ/mlの濃度となるように上記液体培
地に接種して開始し、pHは6.5〜7.5に、DO（容存酸素）
は3mg/以上に調節した。
地に接種して開始し、pHは6.5〜7.5に、DO（容存酸素）
は3mg/以上に調節した。
その培養経過を第１図に示す。
第１図から、菌体濃度（DW）は培養開始から３日後に
約14g/となり、増殖末期にあることがわかる。このと
き培養液中の窒素濃度は280mg/であつた。またプロテ
アーゼは菌の増殖からやや遅れて生産され、４日後には
500PU/mlに達したことがわかる。ここにPU/mlは１分間
に１μＭのチロシンを遊離する活性を１単位としたもの
で、アンソン−萩原変法〔Agri.Biol.Chem.,37巻,2703
頁（1973）〕により測定したプロテアーゼ力価である。
約14g/となり、増殖末期にあることがわかる。このと
き培養液中の窒素濃度は280mg/であつた。またプロテ
アーゼは菌の増殖からやや遅れて生産され、４日後には
500PU/mlに達したことがわかる。ここにPU/mlは１分間
に１μＭのチロシンを遊離する活性を１単位としたもの
で、アンソン−萩原変法〔Agri.Biol.Chem.,37巻,2703
頁（1973）〕により測定したプロテアーゼ力価である。
比較例 １ 実施例１において、液体培地の可溶性でんぷん濃度を
35g/、ポリペプトン濃度を20g/とした他は、実施例
１と同様に操作した。
35g/、ポリペプトン濃度を20g/とした他は、実施例
１と同様に操作した。
その培養経過を第２図に示す。
第２図から、菌体濃度は、培養開始３日後には約12g/
となり、増殖末期となつたが、プロテアーゼ活性は低
く、４日後に約150PU/mlに達したに過ぎなかつた（３日
後の培養液中の窒素濃度は2500mg/であつた）。
となり、増殖末期となつたが、プロテアーゼ活性は低
く、４日後に約150PU/mlに達したに過ぎなかつた（３日
後の培養液中の窒素濃度は2500mg/であつた）。
実施例 ２ 実施例１と同様の装置を用いて連続培養を行なつた。
先ず、実施例１と同じ液体培地を用いて２〜３日間培養
して増殖末期に至つた後、可溶性でんぷん濃度56g/、
ポリペプトン5g/に調節した液体培地を連続的に供給
した（希釈率は0.015〜0.020の範囲とした）。そして培
養液を同量ひきぬいた。
先ず、実施例１と同じ液体培地を用いて２〜３日間培養
して増殖末期に至つた後、可溶性でんぷん濃度56g/、
ポリペプトン5g/に調節した液体培地を連続的に供給
した（希釈率は0.015〜0.020の範囲とした）。そして培
養液を同量ひきぬいた。
その培養経過を第３図に示す。
第３図からわかるように、15日間の連続培養期間中、
菌体濃度は８〜14g/の範囲に維持されていた。一方、
プロテアーゼ活性も400〜500PU/mlの範囲で安定してい
た。そして連続培養期間中、要培液中の窒素濃度は250
〜300ml/に維持された。
菌体濃度は８〜14g/の範囲に維持されていた。一方、
プロテアーゼ活性も400〜500PU/mlの範囲で安定してい
た。そして連続培養期間中、要培液中の窒素濃度は250
〜300ml/に維持された。
比較例 ２ 実施例２において、連続的に供給する培地中の可溶性
でんぷん濃度を35g/、ポリペプトン濃度を20g/とし
た以外は、実施例２と同様の操作を行なつた。
でんぷん濃度を35g/、ポリペプトン濃度を20g/とし
た以外は、実施例２と同様の操作を行なつた。
その培養経過を第４図に示す。
第４図からわかるように、11日間の培養期間中、最高
でも15PU/mlのプロテアーゼ活性しか検出されなかつ
た。この場合、連続培養期間中、培養液の窒素濃度は12
00〜1600mg/であつた。
でも15PU/mlのプロテアーゼ活性しか検出されなかつ
た。この場合、連続培養期間中、培養液の窒素濃度は12
00〜1600mg/であつた。
本発明方法においては、500PU/mlという、従来法で得
られない高力価プロテアーゼを製造することができる。
られない高力価プロテアーゼを製造することができる。
しかも、従来、提案されていなかつたプロテアーゼ生
産能を有するアスペルギルス属等に属する糸状菌を連続
培養することもでき、長期間にわたつて安定して高力価
プロテアーゼを製造することができる。
産能を有するアスペルギルス属等に属する糸状菌を連続
培養することもでき、長期間にわたつて安定して高力価
プロテアーゼを製造することができる。
第１図は実施例１の培養経過を示す図であり、第２図は
比較例１の培養経過を示す図であり、第３図は実施例２
の培養経過を示す図であり、第４図は比較例２の培養経
過を示す図である。
比較例１の培養経過を示す図であり、第３図は実施例２
の培養経過を示す図であり、第４図は比較例２の培養経
過を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/62 (Ｃ１２Ｎ 9/62 Ｃ１２Ｒ 1:785） Ｃ１２Ｒ 1:785） (Ｃ１２Ｎ 9/62 (Ｃ１２Ｎ 9/62 Ｃ１２Ｒ 1:845） Ｃ１２Ｒ 1:845） (72)発明者 茂田井 宏 野田市野田399番地 キツコーマン株式 会社醸造科学研究所内 (72)発明者 福島 弥一 野田市野田399番地 キツコーマン株式 会社醸造科学研究所内 (56)参考文献 特公 昭39−12287（ＪＰ，Ｂ２) 特公 昭39−29814（ＪＰ，Ｂ２)
Claims (4)
- 【請求項１】プロテアーゼ生産能を有する糸状菌を液体
培地に培養してプロテアーゼを製造する方法において、
増殖末期以降における培養液中の窒素濃度を500mg/以
下に維持しつつ培養することを特徴とするプロテアーゼ
の製造方法。 - 【請求項２】培養が連続培養法で行なわれる特許請求の
範囲第１項記載の製造方法。 - 【請求項３】プロテアーゼ生産能を有する糸状菌が耐塩
性菌である特許請求の範囲第１項または第２項記載の製
造方法。 - 【請求項４】プロテアーゼ生産能を有する糸状菌がアス
ペルギルス属に属する菌である特許請求の範囲第１項な
いし第３項のいずれかに記載の製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60267326A JP2521706B2 (ja) | 1985-11-29 | 1985-11-29 | プロテア−ゼの製造方法 |
| US06/933,177 US4879235A (en) | 1985-11-29 | 1986-11-21 | Process for producing protease by cultivating a protease-producing mold in a liquid medium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60267326A JP2521706B2 (ja) | 1985-11-29 | 1985-11-29 | プロテア−ゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62126975A JPS62126975A (ja) | 1987-06-09 |
| JP2521706B2 true JP2521706B2 (ja) | 1996-08-07 |
Family
ID=17443264
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60267326A Expired - Lifetime JP2521706B2 (ja) | 1985-11-29 | 1985-11-29 | プロテア−ゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2521706B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2220176B1 (es) * | 2002-05-27 | 2006-02-16 | Universidad De Extremadura | Nuevo enzima protelotico, procedimiento para su obtencion y aplicaciones. |
-
1985
- 1985-11-29 JP JP60267326A patent/JP2521706B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62126975A (ja) | 1987-06-09 |
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