JPS62126975A - プロテア−ゼの製造方法 - Google Patents
プロテア−ゼの製造方法Info
- Publication number
- JPS62126975A JPS62126975A JP26732685A JP26732685A JPS62126975A JP S62126975 A JPS62126975 A JP S62126975A JP 26732685 A JP26732685 A JP 26732685A JP 26732685 A JP26732685 A JP 26732685A JP S62126975 A JPS62126975 A JP S62126975A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protease
- culture
- nitrogen
- growth
- culture fluid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はプロテアーゼ生産能を有する糸状菌を用いてプ
ロテアーゼを効率的に製造する方のに関するものである
。
ロテアーゼを効率的に製造する方のに関するものである
。
プロテアーゼは蛋白質またはその部分加水分解物に作用
してペプチド結合を分解する刀口水分解酵素であって、
医薬や味噌、醤油、酒などの食品２洗剤などに広範囲に
利用されている。
してペプチド結合を分解する刀口水分解酵素であって、
医薬や味噌、醤油、酒などの食品２洗剤などに広範囲に
利用されている。
従来、微生物によるプロテアーゼの生産に関する研究は
、活性の高い微生物のスクリーニング。
、活性の高い微生物のスクリーニング。
及びその育種に王眼が置かれていた。また、培養条件に
関する研究も、多（は培地の組成、特に無機塩添加の効
果（特公昭６０−２２ ／ ／ ７号公報など）や窒素
源の種類（特開昭ｊ／−９６／♂０号公報など）、炭素
源の種類（特公昭６２−１２７９７号公報など）などに
限られていた。
関する研究も、多（は培地の組成、特に無機塩添加の効
果（特公昭６０−２２ ／ ／ ７号公報など）や窒素
源の種類（特開昭ｊ／−９６／♂０号公報など）、炭素
源の種類（特公昭６２−１２７９７号公報など）などに
限られていた。
これら従来の提案方のでは、特定の化合物を要する上に
、いずれも高いプロテアーゼカ価が得られない。
、いずれも高いプロテアーゼカ価が得られない。
さらに従来の方法は、いずれも回分式の培彦万法に関−
［るものであり、連続培信方唐に関しては全（提案され
ていないという問題点があった。
［るものであり、連続培信方唐に関しては全（提案され
ていないという問題点があった。
本発明は、これら従来方法の問題点を解決するために成
されたものであって、培養条件を最適化Ｌ −Ｃフロテ
了−ゼカ価を高めることを意図し、さらに連続培普広で
も実施できるようにしたものである。
されたものであって、培養条件を最適化Ｌ −Ｃフロテ
了−ゼカ価を高めることを意図し、さらに連続培普広で
も実施できるようにしたものである。
即ち一本発明はグロテアーゼ生産能を百する糸状菌を液
体培地に培養してプロテアーゼを製造する方法において
、増殖末期以降における培養液中の窒素濃度を３００
ｍｇ ／ Ａ以下に維持しつつ培養することを特徴とす
るプロテアーゼの製造方法である。
体培地に培養してプロテアーゼを製造する方法において
、増殖末期以降における培養液中の窒素濃度を３００
ｍｇ ／ Ａ以下に維持しつつ培養することを特徴とす
るプロテアーゼの製造方法である。
本発明において用いられろ微生物は、アスペルギルス属
、ペニシリウム属−ムコール属−またはリゾプス属等に
属するプロテアーゼ生産能を有する糸状菌であり、具体
的にはアスペルギルス・ソーヤ（ＩＡＭ ａ ７ ｏ
３）、アスペルギルス−ソーヤ（ＩＡＭ ２ ｔ
３ ／ ）、アスペルギルスｅオリゼ−（Ｉ ＡＭ
２乙０９）、アスペルギルス−オリゼ−（ＩＦＯ４ｔ１
２６）＋アスペルギルスータマリ（ＩＡＭ ２１５≦
）、ペニシリウム・クリソゲナム（ＨＵＴ ９０）９）
＋ペニシリウム・ルテウム〔ＡＩＩＵ、１１′０ココ〕
、ムコール・ラセモサス〔ＡＩＩＵｔｏｏａ〕、ムコー
ル−ヒエマリス（Ｉ（ＵＴ ／ｉ ３／ ）−リゾーブ
ス・フォルモサエンシス（Ｉ ＰＱ ＜ｚ２３ｒ ）。
、ペニシリウム属−ムコール属−またはリゾプス属等に
属するプロテアーゼ生産能を有する糸状菌であり、具体
的にはアスペルギルス・ソーヤ（ＩＡＭ ａ ７ ｏ
３）、アスペルギルス−ソーヤ（ＩＡＭ ２ ｔ
３ ／ ）、アスペルギルスｅオリゼ−（Ｉ ＡＭ
２乙０９）、アスペルギルス−オリゼ−（ＩＦＯ４ｔ１
２６）＋アスペルギルスータマリ（ＩＡＭ ２１５≦
）、ペニシリウム・クリソゲナム（ＨＵＴ ９０）９）
＋ペニシリウム・ルテウム〔ＡＩＩＵ、１１′０ココ〕
、ムコール・ラセモサス〔ＡＩＩＵｔｏｏａ〕、ムコー
ル−ヒエマリス（Ｉ（ＵＴ ／ｉ ３／ ）−リゾーブ
ス・フォルモサエンシス（Ｉ ＰＱ ＜ｚ２３ｒ ）。
リソーフス・ジャバニカスｒＩＦｏ ｓｕ ｙ ／）
などが挙げられろ。
などが挙げられろ。
本発明に用いられるグロテアーゼ生産能をｎする糸状菌
は雑菌汚染防止の観点から耐塩性を、１′Ｔ−ｆるもの
であることが望ましい（耐塩性の目安としては食塩！％
以上、好ましくは食塩７０％以上である）。
は雑菌汚染防止の観点から耐塩性を、１′Ｔ−ｆるもの
であることが望ましい（耐塩性の目安としては食塩！％
以上、好ましくは食塩７０％以上である）。
本発明に用いられろ糸状菌を培養するための液体培地は
、従来法で用いられるものを使用することカテきる。た
とえば炭素源としては、グルコース、可溶性でんぷん、
サッカロース、デキストリン、セルロース、グリセリン
、フスマなど、窒素源としては、ペプトン、肉エキス、
酵母エキス。
、従来法で用いられるものを使用することカテきる。た
とえば炭素源としては、グルコース、可溶性でんぷん、
サッカロース、デキストリン、セルロース、グリセリン
、フスマなど、窒素源としては、ペプトン、肉エキス、
酵母エキス。
大豆粉、ぬか、カゼイン、ポリペプトン、グルテン、硝
酸塩などが用いられろ。また無機塩としては、＠種すン
酸塩や硫酸塩、塩酸塩などが用いられる。さらに、菌の
生育を促進するためにビタミン類や核酸などを用いても
よい０ 本発明においては２先ず、前記液体培地にグロテアーゼ
生産能を有する糸状菌を接種し、液体培書する。このと
きの培養温度、培地のｐＨ１通気量などの培養条件は使
用する菌株、培地組成などによって夏わるが、通常、培
地温度はλ！〜り０℃。
酸塩などが用いられろ。また無機塩としては、＠種すン
酸塩や硫酸塩、塩酸塩などが用いられる。さらに、菌の
生育を促進するためにビタミン類や核酸などを用いても
よい０ 本発明においては２先ず、前記液体培地にグロテアーゼ
生産能を有する糸状菌を接種し、液体培書する。このと
きの培養温度、培地のｐＨ１通気量などの培養条件は使
用する菌株、培地組成などによって夏わるが、通常、培
地温度はλ！〜り０℃。
培地のｐＨは３〜♂、通気墳は０．／〜ユＶ、Ｖ、Ｍ程
度である。
度である。
培碧初期の誘導期を経て、増殖期になると菌はさかんに
増殖する。通常、培養開始７〜グ日程度で増殖は止まり
、以降は、はとんど変わらないか−又は漸減気味となる
定常期に移行する。本発明においては、増殖末期以降−
即ち増殖末期から王として始まる酵素産生期に、培養液
中の窒素濃度をｓｏｏｍり／Ｌ以Ｆに開園することによ
って、生産されるプロテアーゼの力価を従来法と比較し
て著しく高めろことに成功したものである。
増殖する。通常、培養開始７〜グ日程度で増殖は止まり
、以降は、はとんど変わらないか−又は漸減気味となる
定常期に移行する。本発明においては、増殖末期以降−
即ち増殖末期から王として始まる酵素産生期に、培養液
中の窒素濃度をｓｏｏｍり／Ｌ以Ｆに開園することによ
って、生産されるプロテアーゼの力価を従来法と比較し
て著しく高めろことに成功したものである。
即ち、増殖末期以降におけろ培養液中の窒素濃度が１０
０ｍり／！よりも大であると、グロテアーゼ生産能を仔
する糸状菌が通常の状態以上にプロテアーゼを生産しな
（とも、液中に窒素取分が含まれていることにより、糸
状菌はこれを摂取して増殖するため、高いプロテアーゼ
力価が得られない０ そして増殖末期以降において、培養液中の窒素＃度を１
００ｍり／！以下に維持する方法としては。
０ｍり／！よりも大であると、グロテアーゼ生産能を仔
する糸状菌が通常の状態以上にプロテアーゼを生産しな
（とも、液中に窒素取分が含まれていることにより、糸
状菌はこれを摂取して増殖するため、高いプロテアーゼ
力価が得られない０ そして増殖末期以降において、培養液中の窒素＃度を１
００ｍり／！以下に維持する方法としては。
予じめ培養液中の窒素成分含有量を制御しておく方法、
および増殖末期以降ておけろ培養液中の窒素取分を制御
する方法などが挙げられろ。
および増殖末期以降ておけろ培養液中の窒素取分を制御
する方法などが挙げられろ。
このうち、前者の培養液中の窒素成分含有量を予め制御
する方法としては、菌体自身の炭素、窒素およびリンの
組成を考慮して、培ｉｉ中の窒素成分の含有割合を炭素
やリンと比べて低（ｆる方法がある。
する方法としては、菌体自身の炭素、窒素およびリンの
組成を考慮して、培ｉｉ中の窒素成分の含有割合を炭素
やリンと比べて低（ｆる方法がある。
例工ばアスペルギルス−オリーゼの場合２国体の乾燥重
量の約１０％が炭素、約ｊ％が窒素、約７％がリンから
構成されているので、可溶性でんぷん３．！％、ポリペ
プトンＯ，グ％、酵母エキス０．０３％、硫酸マグネシ
ウム０．０Ｉ％−リン酸１カリウムＯ０！係を含む液体
ｊ音地で培養すると、培養液中の窒素取分であるポリペ
プトン量は他の栄養源の量に比較して少ないため、最初
に消費しつ（されろ。そしてその時点で菌の増殖は停止
し、定常期に入いることになる。この状態は窒素源が律
速となって菌の増殖が制限されたと解され、同時に高力
価のプロテアーゼを生産するようになる。
量の約１０％が炭素、約ｊ％が窒素、約７％がリンから
構成されているので、可溶性でんぷん３．！％、ポリペ
プトンＯ，グ％、酵母エキス０．０３％、硫酸マグネシ
ウム０．０Ｉ％−リン酸１カリウムＯ０！係を含む液体
ｊ音地で培養すると、培養液中の窒素取分であるポリペ
プトン量は他の栄養源の量に比較して少ないため、最初
に消費しつ（されろ。そしてその時点で菌の増殖は停止
し、定常期に入いることになる。この状態は窒素源が律
速となって菌の増殖が制限されたと解され、同時に高力
価のプロテアーゼを生産するようになる。
一方、増殖末期以降における培養液中の窒素取分を制御
する方法は、増殖末期に、炭素源を含む培地を添加して
菌体なさらに増殖させ、培養液中の窒素源が！θＯｍ９
７）以下となるまで消費させる方法や、培養液から人為
的に窒素成分を除去する方法１例えばゼオライトやイオ
ン交換樹脂を用いて窒素源を吸着除去する方ｅなどが、
挙げられる。
する方法は、増殖末期に、炭素源を含む培地を添加して
菌体なさらに増殖させ、培養液中の窒素源が！θＯｍ９
７）以下となるまで消費させる方法や、培養液から人為
的に窒素成分を除去する方法１例えばゼオライトやイオ
ン交換樹脂を用いて窒素源を吸着除去する方ｅなどが、
挙げられる。
回分式培養広においては、上記のいずれかの方法を採用
すればよいが一培養液中の窒素取分の量を予め制菌する
万去の方が簡単であり、好まし・ハ。
すればよいが一培養液中の窒素取分の量を予め制菌する
万去の方が簡単であり、好まし・ハ。
特に１本発明を連続式培蓚伍に適用する場合１こは、最
初から窒素成分を制御した液体培地で培養し、窒素成分
が消費しつぐされる増殖末期つ・ら。
初から窒素成分を制御した液体培地で培養し、窒素成分
が消費しつぐされる増殖末期つ・ら。
同様に窒素成分が！；００ｍ９７Ａ以下となるように制
御された量の窒素成分を含む基質を連続供給してやれば
よ（、極めて容易に糸状菌の連続店番が可能となる。こ
のとき、培養液中の窒素濃度を常時モニタリングしてお
き、この量が常に！； ００ ｍ９７）以下となるよう
に自動的に基質中の窒素成分量を制御するようにしても
よい。
御された量の窒素成分を含む基質を連続供給してやれば
よ（、極めて容易に糸状菌の連続店番が可能となる。こ
のとき、培養液中の窒素濃度を常時モニタリングしてお
き、この量が常に！； ００ ｍ９７）以下となるよう
に自動的に基質中の窒素成分量を制御するようにしても
よい。
こうして１回分培養や連続培養方式により一高力価プロ
テアーゼを含む培養液が得られる。この培養液からプロ
テアーゼを回収する手段としては−特に限定されず１例
えば濾過により菌体を分難し。
テアーゼを含む培養液が得られる。この培養液からプロ
テアーゼを回収する手段としては−特に限定されず１例
えば濾過により菌体を分難し。
必要に応じ透析や塩析、イオン交換樹脂処理、ゲル濾過
などによりプロテアーゼを採取、精製する方法が挙げら
れろ。
などによりプロテアーゼを採取、精製する方法が挙げら
れろ。
本発明方法では、糸状菌の増殖末期以降において培養液
中の窒素取分量をｊ ００ ｍ９ ／ Ａ以下という窒
素欠乏状態とすることにより、プロテアーゼ生産能を有
する糸状菌が増殖、生育に必要な窒素源をより摂取しよ
うとしてプロテアーゼを一層産生ずるものと推定される
。
中の窒素取分量をｊ ００ ｍ９ ／ Ａ以下という窒
素欠乏状態とすることにより、プロテアーゼ生産能を有
する糸状菌が増殖、生育に必要な窒素源をより摂取しよ
うとしてプロテアーゼを一層産生ずるものと推定される
。
実施例 １
ユ、！！容ミニジャーファメンタを用い、液体培地の仕
込液量／、ｊｐ一温度３０°Ｃの条件下に菌を培養した
。用いた菌株はアスペルギルス・ソーヤＣＡｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ５ｏｊａｅ ） Ｉ Ａ Ｍ ２７０３で
あった。
込液量／、ｊｐ一温度３０°Ｃの条件下に菌を培養した
。用いた菌株はアスペルギルス・ソーヤＣＡｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ５ｏｊａｅ ） Ｉ Ａ Ｍ ２７０３で
あった。
液体培地の組成は可溶性でんぷん５６ノ／！−ポリペプ
トンｓ ９ ／ Ａ −Ｍｇ５Ｏ＋・２Ｉ−Ｉ２０ コ
ｔ／！。
トンｓ ９ ／ Ａ −Ｍｇ５Ｏ＋・２Ｉ−Ｉ２０ コ
ｔ／！。
Ｋ、Ｉ（Ｐｏ、 ３ 、Ｉ９ ／ Ａ−Ｉ（Ｉ−Ｉ２Ｐ
Ｏ４／ 、２ ｆ ／ Ａ、ＮａＣ１１ｏｏ？／Ｌとし
た。
Ｏ４／ 、２ ｆ ／ Ａ、ＮａＣ１１ｏｏ？／Ｌとし
た。
培養は胞子を／ ０”コ／ ｍｅの濃度となるように上
記液体培地に接種して開始し−ｐＨは６．ｊ〜？、ｊＫ
−Ｄｏ（溶存酸素）は３ｍり７１以上に調節した。
記液体培地に接種して開始し−ｐＨは６．ｊ〜？、ｊＫ
−Ｄｏ（溶存酸素）は３ｍり７１以上に調節した。
その培養経過を第１図に示す。
第７図から、菌体濃度（ＤＷ）は培養開始から３日後に
約／４ｔノ／！となり、増殖末期にあることがわかる。
約／４ｔノ／！となり、増殖末期にあることがわかる。
このとき培養液中の窒素ａ度はコ♂Ｏｍ９／！であった
。またプロテアーゼは菌の増殖からやや遅れて生産され
、ｌＬｔ日後には５ｏｏＰＵ／酎に達したことがわかる
。ここにｐ （Ｊ ／ ｍｔは７分間にｌμＭのチロシ
ンを遊離する活性を７単位としたもので、アンソン−萩
原変法（Ａｇｒｉ、 Ｂｉｏｌ。
。またプロテアーゼは菌の増殖からやや遅れて生産され
、ｌＬｔ日後には５ｏｏＰＵ／酎に達したことがわかる
。ここにｐ （Ｊ ／ ｍｔは７分間にｌμＭのチロシ
ンを遊離する活性を７単位としたもので、アンソン−萩
原変法（Ａｇｒｉ、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、＋ ３ ’巻、２２θ３頁Ｃ／９７３）〕に
より測定したプロテアーゼ力価である。
より測定したプロテアーゼ力価である。
比較例 １
実施例１において、液体培地の可Ｇ注でんぷん６度を３
ｊノ／！、ポリペプトン濃度を２０９７！とした他は、
実施例１と同様に操作した。
ｊノ／！、ポリペプトン濃度を２０９７！とした他は、
実施例１と同様に操作した。
その培養経過を第２図に示す。
第２図から、菌体ｅ度は、層養開始３日後には約／コｆ
／Ａとなり、増殖末期となったが、プロ５−−ｙ−ゼ活
性は低（，４を日後に約／５ｏＰＵ／ｍｌに達したに過
ぎなかった（３日後の培養液中の窒素儂ては、２ ！
００ ｍｔｙ ／ ｐであった）。
／Ａとなり、増殖末期となったが、プロ５−−ｙ−ゼ活
性は低（，４を日後に約／５ｏＰＵ／ｍｌに達したに過
ぎなかった（３日後の培養液中の窒素儂ては、２ ！
００ ｍｔｙ ／ ｐであった）。
実施例 ２
実施ｆＰＩＪ ｌと同様の装置を用いて連続培養を行な
った。先ず、実施例１と同じ液体培地を用いて一〜３日
間坩養して増殖末期に至った後、可溶性でんぷん濃度！
乙ノ／！、ポリペプトン！ノ／！に調節した液体培地を
連続的に供給した〔希釈率は０．０／ｊ〜０．０２０の
範囲とした）。そして培養液を同量ひきぬいた。
った。先ず、実施例１と同じ液体培地を用いて一〜３日
間坩養して増殖末期に至った後、可溶性でんぷん濃度！
乙ノ／！、ポリペプトン！ノ／！に調節した液体培地を
連続的に供給した〔希釈率は０．０／ｊ〜０．０２０の
範囲とした）。そして培養液を同量ひきぬいた。
その培養経過を第３図に示す。
第３図かられかるように、７５日間の連続培養期間中、
菌体濃度は♂〜／グツ／！の範囲に維持され−（イた。
菌体濃度は♂〜／グツ／！の範囲に維持され−（イた。
一方、プロテアーゼ活性もグＯＯ〜ｓ ｏ ｏ Ｐ Ｕ
／ｍｌの範囲で安定していた。そして連続培養期間中、
培養液中の窒素濃度は２ｊθ〜３００ｍり／ｐに維持さ
れた。
／ｍｌの範囲で安定していた。そして連続培養期間中、
培養液中の窒素濃度は２ｊθ〜３００ｍり／ｐに維持さ
れた。
比較ガ ２
実施例２において、連続的に供給する培地中の可溶性で
んぷん濃度を３ ｊ ９ ／ Ｂ、ポリペプトン濃度を
λＯｆ／１３とした以外は、実施例２と同様の操作を行
なった。
んぷん濃度を３ ｊ ９ ／ Ｂ、ポリペプトン濃度を
λＯｆ／１３とした以外は、実施例２と同様の操作を行
なった。
その培養経過を第９図に示す。
第９図から・ｂかろように、／／日日間瑠養期間中、最
高でも／ｓＰＵ／”εのプロテアーゼ活性りか検出され
なかった。この１合、連続培養期間中２培養液の窒素７
０度は７２００〜／乙００ｍ９７）であった。
高でも／ｓＰＵ／”εのプロテアーゼ活性りか検出され
なかった。この１合、連続培養期間中２培養液の窒素７
０度は７２００〜／乙００ｍ９７）であった。
本発明方法においては−ｊ００ＰＵ／ｒｍｔという。
従来法では得られない高力価グロテ了−ゼを製造するこ
とができる。
とができる。
しかも、従来、提案されていなかったプロテアーゼ生産
能を有するアスペルギルス属等に属する糸状菌を連続培
養することもでき、長期間にわたって安定して高力価プ
ロテアーゼを製造することができる。
能を有するアスペルギルス属等に属する糸状菌を連続培
養することもでき、長期間にわたって安定して高力価プ
ロテアーゼを製造することができる。
第１図は実施例１の培養経過を示す図であり。
第２図は比較例１の培養経過を示す図であり、第３図は
実施例２の培養経過を示す図であり、第９図は比較例２
の培養経過を示す図である。
実施例２の培養経過を示す図であり、第９図は比較例２
の培養経過を示す図である。
Claims (4)
- （１）プロテアーゼ生産能を有する糸状菌を液体培地に
培養してプロテアーゼを製造する方法において、増殖末
期以降における培養液中の窒素濃度を５００ｍｇ／ｌ以
下に維持しつつ培養することを特徴とするプロテアーゼ
の製造方法。 - （２）培養が連続培養法で行なわれる特許請求の範囲第
１項記載の製造方法。 - （３）プロテアーゼ生産能を有する糸状菌が耐塩性菌で
ある特許請求の範囲第１項または第２項記載の製造方法
。 - （４）プロテアーゼ生産能を何する糸状菌がアスペルギ
ルス属に属する菌である特許請求の範囲第１項ないし第
３項のいずれかに記載の製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60267326A JP2521706B2 (ja) | 1985-11-29 | 1985-11-29 | プロテア−ゼの製造方法 |
| US06/933,177 US4879235A (en) | 1985-11-29 | 1986-11-21 | Process for producing protease by cultivating a protease-producing mold in a liquid medium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60267326A JP2521706B2 (ja) | 1985-11-29 | 1985-11-29 | プロテア−ゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62126975A true JPS62126975A (ja) | 1987-06-09 |
| JP2521706B2 JP2521706B2 (ja) | 1996-08-07 |
Family
ID=17443264
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60267326A Expired - Lifetime JP2521706B2 (ja) | 1985-11-29 | 1985-11-29 | プロテア−ゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2521706B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2220176A1 (es) * | 2002-05-27 | 2004-12-01 | Universidad De Extremadura | Nuevo enzima protelotico, procedimiento para su obtencion y aplicaciones. |
-
1985
- 1985-11-29 JP JP60267326A patent/JP2521706B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2220176A1 (es) * | 2002-05-27 | 2004-12-01 | Universidad De Extremadura | Nuevo enzima protelotico, procedimiento para su obtencion y aplicaciones. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2521706B2 (ja) | 1996-08-07 |
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