JPH0646941B2 - 微生物の培養法 - Google Patents

微生物の培養法

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JPH0646941B2
JPH0646941B2 JP62313444A JP31344487A JPH0646941B2 JP H0646941 B2 JPH0646941 B2 JP H0646941B2 JP 62313444 A JP62313444 A JP 62313444A JP 31344487 A JP31344487 A JP 31344487A JP H0646941 B2 JPH0646941 B2 JP H0646941B2
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文彬 石崎
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サントール株式会社
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【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物の培養法に関する。
〔従来の技術とその解決すべき課題〕
天然ゴムの樹液からラテックスを分離した残りの母液
(以下Natural Rubber Serum 略してNRSと呼ぶ)
は、いわば天然ゴム生産における産業廃棄物であり、天
然ゴム生産国におけるこれの放置は環境保全上看過でき
なくなりつつある。まして、NRSは、多量のタンパク
質を含み、有機酸、糖類、及びその誘導体をふくんでい
るので、微生物にとっては富栄養価をもつものと考えら
れ、放置すれば、大きな環境汚染を引き起こすことにな
りかねないが、反面、資源化できれば新しい大きなバイ
オマスとなりうる可能性もひめている。
〔課題を解決するための手段〕
本願発明は、イ)天然ゴムの樹液からラテックスを分離
して得られた、高タンパク質と有機酸、糖類、及びその
誘導体を含む残りの母液を濃縮し、もしくはスプレード
ライ法によって粉末化し、ロ)この濃縮化もしくは粉末
化したものを、そのまま発酵培地とし、または発酵培地
にその一部を添加し、ハ)同発酵培地に、放線菌を含む
細菌や酵母または糸状菌を含む真菌を接種して増殖さ
せ、菌体を生産させ、及び/または特定の発酵生産物を
蓄積させることを特徴とする微生物の培養法に係るもの
である。
本発明者は、東南アジアのラテックス工場で排出するN
RSを原料としてこれを濃縮し、あるいは粉末のNRS
としたものを用いて実験し、このような液状あるいは粉
末のNRSには色々な微生物に対する生育促進効果や、
生育必須因子を含んでいることを見いだした。
一般に、微生物はその生育に色々な栄養因子を要求する
ことが多く、それらは、アミノ酸、ビタミン、ミネラル
など多様であり、また、必ずしも一つだけでなく、複数
の栄養因子を要求することも多い。従って、発酵用の培
地には、複数の栄養因子を供給する目的で、有機窒素源
などの天然の有機栄養が用いられる。これらには、脱脂
大豆加水分解液(HVP) 、Corn Steep Liquor(CSL)、綿実
ミール、ピーナッツミール、pharmamedia 、distillers
soluble、家畜血液、屠殺廃液、カゼイン水解物など多
種多様である。しかも、これらを工業生産の発酵原料と
する場合には、コストが安価なこと、季節的、突発的で
はなく安定的に供給できること、品質が安定しているこ
となどが必須である上に、色々な微生物に広く効果のあ
る、普遍的なものでることが望ましい。このような条件
を満足するのは、上記の多数の天然有機栄養源のなかで
も、HVP、CSL、酵母エキスなどに限られるが、H
VPやCSLはそれぞれ食品工業の副産物として製造さ
れている為に、最近では製法の転換とともにコスト高に
なったり、供給量が減少しており、酵母エキスはコスト
高で工業原料としては難点が多い。
粉末NRSの一般的性状は、元素分析値では C 22 % H 5.5 % N 9.5 % Ash 18.5 % であるが、この内、有機Nのバランスをみると、不溶性
窒素化合物が 6 %、不溶性無窒素化合物が 1.5 %、可溶
性有機窒素化合物が 16.5 % 、可溶性無窒素化合物が 2
8 % その他、硫酸アンモニウム 28 % 、灰分 18 % 、水
分 2 % となっている。可溶性無窒素化合物 28 % 中発
酵原料となりそうな有機酸や還元糖の含量は小量であ
り、NRSは発酵のC源とはなりにくいと考られるが、
単純な有機窒素源であるとも言えない。
実験結果によれば、NRSは、その形態が液体であれ、
粉末であれ、細菌、酵母において広く生育促進効果を示
し、培地有機窒素源に酵母エキス、HVP、CSL等を
用いる発酵ではこれらをNRSに置き換えて十分発酵生
産の目的を達することが明らかとなった。また、その効
果は、細菌の場合は、好気性菌でも、嫌気性菌でも同様
であった。さらに、一部の微生物では、NRSを培地に
添加する前に、予めプロテアーゼ処理によって加水分解
しておいても、加水分解せずにそのまま培地に添加して
も同様の効果が見られた。
このような実験事実を考えると、NRSの微生物に対す
る効果は、含まれるタンパク質やそれが分解して生ずる
アミノ酸の効果だけによるものではなく、NRSの中に
含まれる未同定の物質や、それとタンパクとの複合効果
によるものと考えられる。
〔実施例〕
以下実施例をもって、本発明を説明する。
(第1実施例) グルコース10g 、MgSO・7HO 34mg、NaH PO・12
H O 77mg、KCI 10mg に、NRSのプロテアーゼ分解
液(NRS 20gをM/30リン酸バッファーpH7.0 1に添
加し、不溶性物質はそのままにして、これにプロナーゼ
200mg を添加し、30℃ 12hr 反応させたもの。タンパク
質の分解率は約94 %である)をNRS換算で2 g 相当量
を添加し、pHを7.0 に調整したのち、純水で1に希釈
する。
一方、グルコース10g 、MgSO・7HO 34mg、NaH PO
・12H O 77mg、KCl 10mg に、酵母エキス(オリエ
ンタル酵母社製)5 g とボリペプトン(大五栄養製)5
g を加えpH調整後純水によって1としたものを対照と
した。
これら両培地に、TGC液体培地に30℃で一夜培養した
Streptococcus lactis(ATCC 19435) を20ml接種し、30
℃で静置培養した。培養12時間後の菌体量を乾燥菌体重
量法により、生成した乳酸量をHPLCによって定着した。
NRSを含む培地においては、乾燥菌体重1.28g/、乳
酸生成量 9.2g/であった。一方、酵母エキス、ポリペ
プトンを含む対照培地では、乾燥菌体重量 1.25g/ 、
乳酸生成量 9.0g/が得られた。
(第2実施例) キャッサバ澱粉の酵素糖化液(キャッサバ澱粉100gを50
0ml の純水に溶解の後、α−アミラーゼ600mg を添加し
て70℃に加温して30分間保持し、液化を行う。しかるの
ち、40℃に冷却し、グルコアミラーゼを添加して、ゆっ
くり振とうしながら24時間反応させた糖化液をグルコー
ス10g 相当量計算し、これに酵母エキス0.3g、ペプトン
0.5gを添加し、PH 6.2に調整の後純粋で100ml に稀釈し
ものを基準培地とした。
一方、キャッサバ澱粉の酵素糖化液をグルコース10g 相
当量計算し、これにNRS粉末(プロテアーゼ処理しな
いもの)0.3gとペプトン0.5gを添加し、pH6.2 に調整の
後、純水で100ml に希釈したものを検討培地とした。
また、キャッサバ澱粉の酵素糖化液をグルコース10g 相
当量計算し、ペプトン0.5gを添加し、pH6.2 に調整の後
純水で100ml に希釈したもの、および、キャッサバ澱粉
の酵素糖化液をグルコース10g 相当量計算し、あとは何
も加えない培地を比較培地とした。
これら4種類の培地をmeissel に入れて殺菌し、YM(D
ifco) 液体培地で30℃、2日培養したZymomonas mobili
s NRRL B14023 を 5ml 接種後2日培養し、乾燥菌体重
量と生成したエタノールを測定した。
糖液に酵母エキス、ペプトンを加えた培地では、乾燥菌
体重量2.05mg/ml とエタノール5.22mlがえられ、NRS
を用いた培地では、菌体重量1.61mg/ml とエタノール5.
01mlがえられた。一方、糖液にペプトンだけ加えた培地
では、菌体重量0.84mg/mlとエタノール3.85mlがえられ
たが、糖液だけの培地では菌の生育、エタノールの生成
共全く認められなかった。
(第3実施例) 第2実施例で用いたと全く同じ糖液を、グルコース10g
相当量計算し、これに酵母エキス0.3g、マルトエキス0.
3g、ペプトン0.5gを添加し、pH6.2 に調整の後純水で10
0ml に希釈したものを基準培地とした。
一方、糖液をグルコース10g 相当量計算し、これにNR
S粉末(プロテアーゼ処理しないもの)0.3gとペプトン
0.5gを添加し、pH6.2 に調整の後、純水で100ml に希釈
したものを検討培地とした。
また、糖液をグルコース10g 相当量計算し、ペプトン0.
5gを添加し、pH6.2 に調整の後純水で100ml に希釈した
もの、および、糖液をグルコース10g 相当量計算し、あ
とは何も加えない培地を比較培地とした。
これら4種類の培地をmeissel に入れて殺菌し、グルコ
ース10g/l 酵母エキス3g/l、マルトエキス3g/l、ペプト
ン5g/l(pH6.2) からなる前培養地で30℃、2日培養した
Saccharomyces uraurm IFO 0565 を5ml 接種後2日培
養し、乾燥菌体重量と生成したエタノールを測定した。
糖液に酵母エキス、マルトエキス、ペプトンを加えた培
地では、乾燥菌体重量4.90mg/ml とエタノール4.89mlが
得られ、NRSを用いた培地では、菌体重量4.04mg/ml
とエタノール4.58mlがえられた。一方、糖液にペプトン
だけを加えた培地では、菌体重量0.64mg/ml とエタノー
ル1.99mlがえられた。また、糖液だけの培地でも菌体重
量0.33mg/ml とエタノール0.84mlがえられた。
(第4実施例) グルコース 1.0 % 、ヘキサメタリン酸ソーダ 0.17 %
、KCl 0.1 % 、 MgSO・7HO 0.04 %からなる培地
(pH 7.0)基本とし、 他にはなにも加えないもの 脱脂大豆塩酸加水分解物(HVP)を0.5ml/dlの濃
度なるよう添加したもの 酵母エキス 0.25 % を添加したもの NRS粉末 0.25 % を添加したもの の4種の培地を作成し、これを 500 ml 振とうフラスコ
に 20 mlづつ分注し殺菌の後、グルコース 1.0 %、酵母
エキス 1.0 %、ポリペプトン 1.0 %、NaCl 0.5 %からな
る前培養培地(pH 7.0)にPseudomonas aeruginosa KYU-1
(FERM P 0701) を接種し、30℃一夜振とう培養したプロ
スを100 μl 添加して、30℃で3日間振とう培養を行
い、生成した乾燥菌体重量を測定した。培地では、菌
の生育は全く認められなかった。培地では乾燥菌体重
量は2.3mg/mlに、培地では乾燥菌体体重量は2.9mg/ml
に、培地では乾燥菌体重量は3.1mg/mlは、それぞれ達
した。
(第5実施例) グルコース 10 % 、KHPO 0.1 %、MGSO・7HO 0.
24 % 、FeSO・7HO 0.01 %、MnSO・4H2O 0.001 %
、ビタミン B 100r/l 、ビオチン3r/lからなる培地
に、液状NRSを1.0ml/dlの濃度で添加し、pHを7.0
に調整の後殺菌し、全容1のミニジャーファーメンタ
ーに300ml を張り込んだ。
一方NRS以外は全く同じ組成の培地に、NRSの替わ
りに、第4実施例で用いた脱脂大豆塩酸加水分解物を0.
75ml/dl の濃度なるよう添加したのを、先と同様pHを7.
0 に調整の後殺菌し、全容1のミニジャーファーメン
ターに300ml を張り込み対照とした。この両ジャーに、
グルコース 1.0 %、酵母エキス 1.0 %、ポリペプトン
1.0 %、NaCl 0.5 %からなる前培養培地(pH 7.0)にBrevi
bacterium flavum ATCC 14067を接種し、30℃一夜振と
う培養したブロスを15ml添加して、温度34℃、通気攪は
んは1/2 VVM 、1200rpm 、pH制御はアモニア水をフィー
ドしながらpHを7.5 に制御する方法で培養した。30時間
培養の後、脱脂大豆塩酸加水分解物を用いた培養液には
対糖46.5% のグルタミン酸が蓄積し、液状NRSを用い
た培養液には対糖 48.2 % のグルタミン酸が蓄積してい
た。
〔発明の効果〕
1. 東南アジアのラテックス工場等で排出するNRSを
培地用原料として用いることができ、NRSの有効利用
を図ることができる。
またNRSの有効利用によって、環状汚染の必要がな
い。
2. NRSは色々微生物に対する生育促進効果を含んで
いるので、微生物の生育を促進しすることができる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:385) (C12N 1/20 C12R 1:13) (C12N 1/14 C12R 1:85)

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】イ)天然ゴムの樹液からラテックスを分離
    して得られた、高タンパク質と有機酸、糖類、及びその
    誘導体を含む残りの母液を濃縮し、もしくはスプレード
    ライ法によって粉末化し、 ロ)この濃縮化もしくは粉末化したものを、そのまま発
    酵培地とし、または発酵培地にその一部を添加し、 ハ)同発酵培地に、放線菌を含む細菌や酵母または糸状
    菌を含む真菌を接種して増殖させ、菌体を生産させ、及
    び/または特定の発酵生産物を蓄積させることを特徴と
    する 微生物の培養法。
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