CN100357448C - 伊枯草菌素a及其同系物的产生方法 - Google Patents

伊枯草菌素a及其同系物的产生方法 Download PDF

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Abstract

提供了(1)用于通过在培养基中培养能产生伊枯草菌素A及其同系物的芽孢杆菌属微生物产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，该培养基包含2%或更大质量百分数的大豆粉或其提取物作为氮源以允许微生物在培养基中以1.5克/升或更大浓度累积伊枯草菌素A及其同系物，(2)通过该方法累积的包含伊枯草菌素A及其同系物的培养物，(3)获自培养物的固体物质和(4)使用培养物或其固体物质的方法。

Description

伊枯草菌素A及其同系物的产生方法
相关申请的交互参考：
本申请根据35 U.S.C.第111(a)节的法规，要求在35 U.S.C.第111(b)节条款下的于2002年9月27日申请的美国临时申请系列号60/413,755的权利，其遵循35 U.S.C.第119(e)(1)节。
技术领域
本发明涉及通过在液体培养基中培养属于芽孢杆菌属的微生物产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，所述液体培养基包含大豆或其提取物作为氮源以在液体培养基中累积高浓度的伊枯草菌素A及其同系物。本发明还涉及包含伊枯草菌素A及其同系物的培养物，涉及通过干燥该培养物获得的包含伊枯草菌素A及其同系物的固体物质，并涉及它们的应用方法。
背景技术
按常规已知属于芽孢杆菌属的微生物特别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产生伊枯草菌素A及其同系物(参见，例如Besson等，Journal of Antibiotics，1978年，31卷，284-288页)。
伊枯草菌素A及其同系物指具有下面所示式1代表的结构并具有抗真菌特别是抗植物病原微生物活性的一组化合物，所以它们已经作为防止植物病害的优良组分引起了人们的注意。
Figure C0382270700041
(R代表具有3至10个碳原子的直链或支链烷基)。
用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法的例子包括那些描述在JP-A-59-212416、JP-A-7-143897(美国专利号5,470,827和5,494,809)等中的方法。
然而，芽孢杆菌属微生物产生伊枯草菌素A及其同系物的产量太低以致于不能应用于工业规模的生产。因此，许多研究者致力于提高所产生的伊枯草菌素A及同系物的产量。
Hatada等公开了用于通过在营养培养基(JP-B-63-20519)中好气培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NA-apb-1菌株产生基于伊枯草菌素A的物质的方法。在该公开中给出了氮源、蛋白胨、肉膏、酵母提取物、酪蛋白水解物、玉米浆、谷蛋白粉和无机氮源且描述了通过在包含蛋白胨、肉膏和酵母提取物的培养基中培养该菌株获得的30升培养滤液中获得270毫克伊枯草菌素A。Sandrin等公开了可在含有脯氨酸作为氮源的人工培养基中获得480毫克/升伊枯草菌素A及其同系物(Biotechnology and Applied Biochemistry，1990年，12卷，370-375页)。
Hbid等公开了在包含蛋白胨的培养基中获得伊枯草菌素A及其同系物产量达1,388毫克/升的方法(Applied Biochemistry andBiotechnology，1996年，57/58卷，571-579页)。Phae等公开了获得伊枯草菌素A及其同系物产量达620毫克/升的方法(Journal ofFermentation and Bioengineering，1991年71卷，118-121页)。
另一方面，本发明的发明者公开了枯草菌表面活性剂的产生方法(JP-A-2002-176993)作为用于在包含大豆粉或其提取物的液体培养基中培养芽孢杆菌属微生物的方法。然而，该专利未公开关于伊枯草菌素A及其同系物。另外，JP-A-59-212416公开了在包含1％大豆粉的培养基中进行培养以从16升培养液中获得300毫克伊枯草菌素A及其同系物。然而，该法获得的伊枯草菌素A的量并不比通过已知培养方法获得的量多。
培养具有在包含2％(质量百分数)或更多大豆粉或其提取物的液体培养基中产生伊枯草菌素A及其同系物能力的芽孢杆菌属微生物使得伊枯草菌素A及其同系物能在该培养基中累积至1.5克/升或更多，这一点以前是未知的。
本发明的公开
常规获得伊枯草菌素A及其同系物的产量不足以用于工业应用而需要可提高产量的产生方法。
因此，本发明的目标之一是提供通过培养产生伊枯草菌素A及其同系物的芽孢杆菌属微生物从而产生伊枯草菌素A及其同系物并使得该微生物在培养液中高浓度累积伊枯草菌素A及其同系物的方法。
本发明的另一个目标是提供包含伊枯草菌素A及其同系物的培养产物，它的固体产品和使用它们的方法。
为达到上述目标，本发明的发明者对培养基中的各种组分进行了大量的研究。结果，他们发现在包含2％(质量百分数)或更多大豆粉或其提取物作为氮源的培养基中培养产生伊枯草菌素A及其同系物的芽孢杆菌属微生物导致伊枯草菌素A及其同系物在培养液中的高浓度累积，从而完成本发明。
即本发明涉及下述用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，涉及包含伊枯草菌素A及其同系物的培养物，并涉及包含伊枯草菌素A及其类似物的固体物质。
1.用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，其包括在包含2％(质量百分数)或更多大豆粉或其提取物的液体培养基中培养具有产生伊枯草菌素A及其同系物的芽孢杆菌属微生物使得该微生物在该培养基中累积1.5克/升或更大浓度的伊枯草菌素A及其同系物。
2.根据上述1项的用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，其中，具有产生伊枯草菌素A及其同系物能力的芽孢杆菌属微生物是能在包含1.5克/升或更多伊枯草菌素A及其同系物的培养基中生长的芽孢杆菌属微生物。
3.根据上述1或2项的用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，其中，具有产生伊枯草菌素A及其同系物能力的芽孢杆菌属微生物是基本上不能产生枯草菌表面活性剂的芽孢杆菌属微生物。
4.根据上述1项的用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，其中，将就K2HPO4而论为0至3％(质量百分数)的磷酸盐，加入液体培养基中。
5.根据上述1至3任一项的用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，其中，微生物是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
6.根据上述1至3任一项的用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，其中，微生物是枯草芽孢杆菌SD142(FERM BP-08427)。
7.根据上述1至3任一项的用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，其中，微生物是枯草芽孢杆菌SD142(FERM BP-08427)的突变株。
8.根据上述1项的用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，其中，包含2％(质量百分数)或更多大豆粉或其提取物的液体培养基至少包含选自于麦芽糖、淀粉浆、可溶性淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖和果糖中的一种。
9.包含通过根据上述1至8任一项的方法获得的伊枯草菌素A及其同系物的培养物，其中，伊枯草菌素A及其同系物累积于培养基中。
10.包含伊枯草菌素A及其同系物的固体物质，其通过干燥上述9项的培养物得到。
11.用于防止植物病害的试剂，其包含上述9或10项的含有伊枯草菌素A及其同系物的培养物或其固体物质。
12.用于防止植物病害的方法，其包括未纯化形式的上述9或10的包含伊枯草菌素A及其同系物的培养物或其固体物质。
发明详述
在下文中将详细描述本发明。
在本发明中，伊枯草菌素A及其同系物意指由下式(1)代表的衍生物，包括相关的化合物。
Figure C0382270700081
(R代表具有3至10个碳原子的直链或支链烷基)。
根据本发明，在添加2％(质量百分数)或更多的大豆粉或其提取物作为氮源的培养基中对产生伊枯草菌素A及其同系物的微生物进行培养使伊枯草菌素A及其类似物在该培养基中高浓度累积。就本发明者所知，在包含大豆粉或其提取物作为氮源的培养基中培养芽孢杆菌属微生物的技术是常规已知的。然而，发明者最先发现在包含2％(质量百分数)或更多大豆粉或其提取物作为氮源的培养基中培养产生伊枯草菌素A及其同系物的微生物以在该培养基中高浓度累积伊枯草菌素A及其同系物的新技术。
对用于本发明的芽孢杆菌属微生物不作特别限定，只要它能产生伊枯草菌素A及其同系物即可。因为伊枯草菌素A及其同系物在培养基中高浓度累积，微生物需要能在高浓度的伊枯草菌素存在下生长。
因此，芽孢杆菌属微生物优选具有产生伊枯草菌素A及其同系物的能力并能在含有1.5克/升伊枯草菌素A及其同系物的培养基中生长的芽孢杆菌属微生物。另外，作为另一个优选例子，芽孢杆菌属微生物优选具有产生伊枯草菌素A及其同系物的能力但基本上不具有产生枯草菌表面活性剂的能力的芽孢杆菌属微生物。“基本上不具有产生枯草菌表面活性剂的能力”在这里意指当在包含大豆粉或其提取物作为氮源的培养基中培养微生物时，枯草菌表面活性剂的累积量为50ppm或更少。具有产生伊枯草菌A及其同系物能力和能在含有1.5克/升或更多伊枯草菌素及其同系物的培养基中生长的芽孢杆菌属微生物的优选例子包括枯草芽孢杆菌SD142(FERM BP-08427)。
从堆肥中分离出的枯草芽孢杆菌SD142(FERM BP-08427)，具有下列细菌学特性。
细菌学特性
(a)形态学  (1)细菌的外形：杆状，
(2)细菌的大小：0.7至0.9×1.5至3.0微米，
(3)多形性：无
(4)运动性：有
(5)孢子：存在，
孢子形状：椭圆或圆柱状
(6)革兰氏染色：阳性
(7)耐酸性：阴性
(b)在肉汁琼脂平板培养基上的生长情况：
直径为1至2毫米的环形菌落，具有波形周边，粘滞的，无光泽；
(c)生理学特性
(1)硝酸盐还原：阳性
(2)VP试验：阳性
(3)吲哚的产生：阴性
(4)柠檬酸的利用：阳性
(5)琥珀酸的利用：阴性
(6)丙酸的利用：阴性
(7)酒石酸的利用：阴性
(8)脲酶：阴性
(9)氧化酶：阳性
(10)过氧化氢酶：阳性
(11)生长范围：pH5至9，
温度20至50℃
(12)10％NaCl培养基：生长
(13)厌气培养：阴性
(14)卵黄反应：阴性
(15)淀粉水解：阳性
(16)精氨酸分解：阳性
(17)酪氨酸分解：阴性
(18)明胶液化：阳性
(19)七叶苷分解：阳性
(20)OF测试：氧化的
(21)利用葡萄糖产酸：阴性
枯草芽孢杆菌SD142(FERM BP-08427)被保藏在独立行政法人产业技术综合研究所，AIST筑波市中央第6东1-丁目1-1，筑波市Ibaraki-ken，日本(邮编：305-8566)(保藏号FERM P-19032)，并于2003年7月10日被从原保藏转为国际保藏(No.FERM BP-08427)。
另外，在本发明中，也可优选使用由枯草芽孢杆菌SD142的自发突变获得的突变株。作为自发突变的突变株的获得可通过选择那些在平板培养基上具有改变了菌落形态的菌株或者通过将化学或物理突变诱发因子与枯草芽孢杆菌SD142反应产生一批具有不同伊枯草菌素A及其同系物产量的菌株并从中分离具有产量增加的菌落。
可使用例如EMS(甲磺酸乙酯)、硫酸二乙酯或NTG(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)作为化学突变诱发因子。作为物理突变诱发因子，紫外线、γ射线、X射线等可以诱发突变所需要的量使用。
用于产生一批突变株的方法的例子之一是这样一种方法，其中，将在比如NB(营养肉汤；由Difco Laboratories，Inc.生产)等营养培养基中生长至对数期的枯草芽孢杆菌细胞收集并在洗后将其悬浮于生理盐水中，将突变诱发量的NTG加入细胞中以诱发突变，然后再次收集细胞，洗除NTG并在比如NB(营养肉汤；由Difco Laboratories，Inc.生产)这样的营养培养基中培养以产生一批突变株。
用于分离具有产量增加的菌落的方法的例子包括这样一种方法，其中，涂布适当稀释的一些突变体以在平板培养基上培养枯草芽孢杆菌细胞，该平板培养基是通过向加入了绵羊血的比如TBAB(胰蛋白胨血琼脂培养基；由Difco Laboratories，Inc.生产)培养基中添加琼脂制得，分离在菌落周围比其它菌落具有更大亮区的菌落以选择能产生高浓度伊枯草菌素A及其同系物的突变株。
随后，被分离的枯草芽孢杆菌突变株的伊枯草菌素A及其同系物的产量可通过在试管中培养枯草芽孢杆菌SD142作为对照证实。
在下文中将描述根据本发明用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法。根据本发明用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法例如可如下最便利地施行。枯草芽孢杆菌SD142在比如L培养基的营养培养基中在25至42℃，优选28至38℃培养约5至约24小时，将所获得的培养液以0.1至10％(质量百分数)，优选0.5至7％(质量百分数)，更优选1至5％(质量百分数)的量接种于包含大豆粉或其提取物作为氮源的培养基中。在25至42℃，优选28至35℃的温度下培养约30至约150小时。温度在上述温度范围之外的情况下，伊枯草菌素A及其同系物的产生非期望地显著降低。
在本发明中，“大豆粉或其提取物”意指通过研磨大豆或脱脂大豆获得的粒状大豆粉、通过将大豆研磨成细粉获得的粉碎大豆粉、它们的提取物(例如热水提取物)、水解产物(例如酸水解产物、酶水解产物)等等。大豆粉或其提取物的浓度期望是2％(质量百分数)或更大。然而，另一方面，因为过高浓度的大豆粉或其提取物可能引起不充分的灭菌，期望大豆粉或其提取物的浓度应不超过20％(质量百分数)。因此，用于获得高产量的大豆粉或其提取物的浓度是2至20％(质量百分数)，优选3至17％(质量百分数)，更优选4至14％(质量百分数)。
用于本发明的培养基除了大豆粉或其提取物之外，通常可包含使用的可代谢的碳源、氮源和无机盐等。另外，如果需要，可加入氨基酸和/或维生素等。
可代谢的碳源的例子包括葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖，可溶淀粉、淀粉浆、糊精、糖蜜、马铃薯提取物、麦芽、泥炭、甜菜、植物油、玉米浆、果糖、糖浆、糖、液体糖、转化糖、醇类、有机酸、有机酸的盐、烷烃或其它常规碳源。这些碳源可被单独或联合使用。其中，优选麦芽糖、可溶淀粉、淀粉浆和糊精。这些碳源可以通常为约0.01至约50％(质量百分数)，优选约1至约40％(质量百分数)的浓度使用。
另外，可使用那些包含无机或有机氮比如硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、醋酸铵、碳酸铵和碳酸氢铵的铵盐、氨、硝酸钠、硝酸钾、谷氨酸钠、尿素、蛋白胨、肉膏、玉米浆、酪蛋白水解物、禽肉粉(feather meal)和酵母提取物作为可代谢氮源。这些氮源可被单独或联合使用。它们可有利地以通常约0.01至30％(质量百分数)，优选0.1至10％(质量百分数)的浓度使用。
另外，可添加阳离子或者阴离子比如钾离子、钠离子、镁离子、磷酸根、铁离子、锰离子、钙离子、锌离子、钴离子、镍离子、铜离子、钼离子、硫酸根、氯离子或硝酸根作为无机组分。添加的无机组分的量可根据培养条件改变。通常，镁盐被添加至约10ppm至约2％(质量百分数)的浓度，而磷酸盐之外的盐被添加至约0.1ppm至约1,000ppm的浓度。可添加磷酸根离子作为磷酸盐。如果添加的磷酸盐就K2HPO4而论浓度高于3％(质量百分数)，则累积的伊枯草菌素A及其同系物量减少。因此，期望磷酸盐被添加至3％(质量百分数)或更低的浓度。更优选地，不添加磷酸根的培养基是更可取的。
被添加的氨基酸的例子包括L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-半胱氨酸、胱氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-赖氨酸、D-缬氨酸、D-异亮氨酸等。可添加其中的一种或多种。氨基酸被添加至约0.001至约5％(质量百分数)，优选约0.01至约1％(质量百分数)的浓度。
可添加维生素H、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醛、肌醇、胆碱、叶酸、钴胺素、氰钴胺素等中的一种或多种作为维生素。维生素被添加至0.1至100ppm，优选1至50ppm的浓度。
在根据本发明的培养中，将上述培养基装于比如试管、烧瓶或发酵罐的容器中和在强力通气下进行培养。
在使用比如试管或烧瓶的容器培养的情况下，通过剧烈摇动进行通气，并将培养基的初始pH调为6.5至8.0。在使用比如发酵罐的容器进行高浓度产生的情况下，培养在无菌气流、搅拌下进行。在发生起泡致使培养难以进行的情况下，可加入通常使用的常见防沫剂。
将培养基的pH维持在6.0至9.0，优选6.5至8.0，更优选6.8至7.3。通过添加比如氨水溶液、氢氧化钾水溶液，碳酸钠水溶液或碳酸钾水溶液等碱性水溶液进行pH的调节。其中，优选使用氨水溶液。氨水溶液的浓度有利地是约8至约25％(质量百分数)。通过在优选条件下进行这样的培养，可在30至150小时内获得包含1.5克/升或更大浓度的伊枯草菌素A及其同系物的培养物。
通过用已知方法如冷冻干燥或喷雾干燥法干燥上述培养物，可获得包含伊枯草菌素A及其同系物的固体物质。包含伊枯草菌素A及其同系物的培养物或包含伊枯草菌素A及其同系物的固体物质是有用的，其被应用于农田土壤或作物的叶时表现出防止植物病害的效能。本发明也涉及包含伊枯草菌素A及其同系物的培养物和包含伊枯草菌素A及其同系物的固体物质。
另外，可从包含伊枯草菌素A及其同系物的培养物中回收伊枯草菌素A及其同系物并纯化。可用已知方法进行纯化，例如通过添加硫酸、盐酸、硝酸等使培养物酸化以沉淀伊枯草菌素A及其同系物，然后将沉淀物用有机溶剂比如甲醇、乙醇或氯仿进行萃取处理，用活性炭处理，结晶化处理和/或类似处理的方法。
根据本发明获得的伊枯草菌素A及其同系物不仅可被用作防止植物病害的试剂而且可被用作清洁剂、乳化剂、增湿剂、分散剂、增溶剂、抗静电剂、防雾剂、润滑剂等。根据本发明获得的伊枯草菌素A及其同系物作为化妆品、食品、医药品、农用化学品等的组成成分是有用的。
实施本发明的最佳方式
在下文中将通过实施例更详细地描述本发明。然而，不应认为本发明局限于这些实施例。
用于获得枯草芽孢杆菌SD142的突变株的制备实施例1
将枯草芽孢杆菌SD142接种于5毫升L培养基(10克蛋白胨，5克酵母提取物，5克氯化钠，加水至1升)中并在35℃以300转/分钟孵育16小时。然后，获得的培养物以1％(v/v)接种于5毫升同样的培养基中，并在35℃以300转/分钟孵育直到OD660达到0.2。其后，通过离心回收细胞。弃去上清液。用5毫升PBS缓冲液(0.8％(w/v)NaCl、0.02％(w/v)KCl、0.144％(w/v)Na2HPO4和0.024％(w/v)KH2PO4，用HCl将pH调至7.4)洗涤回收的细胞三次然后将其悬浮于0.5毫升同样的缓冲液中。
将0.05毫升2,000ppm的N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍水溶液加入悬浮液并将该混合物在30℃静置10分钟。离心悬浮液，弃去上清液，用5毫升同样的缓冲液洗涤细胞三次然后再次将其悬浮于1毫升新鲜的L培养基中。将悬浮液加入4毫升L培养基中，在35℃生长一夜。然后，将2.5毫升50％(质量百分数)甘油水溶液加入悬浮液，将它等分装入小瓶中低温贮藏并于-135℃冻结保存转化体。
然后，将用无菌水稀释的所保存转化体以浓度为50,000/平板置于琼脂平板培养基上，每个琼脂平板培养基包含5％(w/v)绵羊血、4％(w/v)葡萄糖和0.1％(w/v)NB(由Difco Laboratories，Inc.生产)和0.1％(w/v)酵母提取物(Applied Environmental Microbiology，42期：408-412页(1981年))以便于获得大约200个菌落/平板。在35℃孵育20至48小时后，观察到在生长菌落周围形成的亮区和选择形成大亮区的50,000个菌落。
将枯草芽孢杆菌SD142和获得的50,000个菌落在L平板培养基上划线，并在35℃生长一夜。将具有下面组分A的1毫升等分培养基分装入试管，向每一试管中各接种一菌环量的L平板培养基并在35℃孵育72小时。
<组分A>      (质量％)
大豆粉        8
K2HPO4        0.5
MgSO4·7H2O   0.05
FeSO4·7H2O   0.0025
MnSO4·5H2O   0.0022
CaCl2         0.0184
麦芽糖        6.7
离子交换水    平衡
将培养物离心，并在下列条件下通过HPLC方法检测含于上清液中的伊枯草菌素A及其同系物。
样本量：10微升
柱：Shodex Silica C18P4E，4.6毫米×250毫米，由Showa Denko K.K.生产
柱温：40℃
洗脱液：乙腈∶10mM醋酸铵水溶液＝35∶75(体积/体积)
流速：1.5毫升/分钟
检测器：紫外检测器
波长：205纳米
通过使用伊枯草菌素A及其同系物的标准样本(由Sigma-AldrichCo.生产)绘制标准曲线进行测定。
获得以高产量产生伊枯草菌素A及其同系物的突变株(突变株1)，其与枯草芽孢杆菌SD142的原始菌株相比表现出增高的伊枯草菌素A及其同系物累积浓度。
用于获得枯草芽孢杆菌SD142的突变株的制备实施例2
在制备实施例1中的培养物的上清液中枯草菌表面活性剂的浓度在下列条件下通过HPLC方法测定。
样本量：20微升
体积：Shodex Silica C18P4E，4.6毫米×250毫米，由Showa DenkoK.K.生产
柱温：40℃
洗脱液：乙腈∶19mM三氟乙酸溶液＝80∶20(体积/体积)
流速：1.0毫升/分钟
检测器：紫外检测器
波长：205纳米
通过使用枯草菌表面活性剂的标准样本(由Sigma-Aldrich Co.生产)绘制标准曲线进行测定。
获得基本上不产生枯草菌表面活性剂、具有50ppm或更小浓度的累积枯草菌表面活性剂的突变株(突变株2)。
实施例1：在试管培养中氮源对产生伊枯草菌素A及其同系物的影响
将枯草芽孢杆菌SD142菌在L平板培养基上划线，并在35℃生长一夜。将1毫升等分的具有下面组分B的培养基分装入试管，向每一试管接种一菌环L平板培养基并在35℃孵育72小时。
<组分B>        (质量％)
K2HPO4          0.5
MgSO4·7H2O     0.05
FeSO4·7H2O     0.0025
MnSO4·5H2O     0.0022
CaCl2           0.0184
麦芽糖          6.7
氮源*          2.0
离子交换水    平衡
*氮源选自于大豆粉、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、尿素、谷氨酸钠和蛋白胨。
将培养物离心，并用HPLC方法测定包含于上清液中的伊枯草菌素A及其同系物的浓度。
在使用每种氮源情况下累积的伊枯草菌素A及其同系物浓度如下。
使用的氮源    伊枯草菌素A及其同系物的浓度
大豆粉        1.5克/升
硝酸钾        0.03克/升
硝酸铵        0.03克/升
硫酸铵        0.03克/升
尿素          0.03克/升
谷氨酸钠      0.1克/升
蛋白胨        0.15克/升
实施例2：在试管培养中大豆粉浓度对产生伊枯草菌素A及其同系物的影响
将枯草芽孢杆菌SD142菌株在L平板培养基上划线，并在35℃生长一夜。将1毫升等分的分别具有下面组分C、D、E的培养基分装入试管，向每一试管接种一菌环L平板培养基并在35℃孵育72小时。
<组分C>         (质量％)
大豆粉          1
K2HPO4          0.5
MgSO4·7H2O     0.05
FeSO4·7H2O     0.0025
MnSO4·5H2O     0.0022
CaCl2           0.0184
麦芽糖        6.7
离子交换水    平衡
<组分D>       (质量％)
大豆粉        2
K2HPO4        0.5
MgSO4·7H2O   0.05
FeSO4·7H2O   0.0025
MnSO4·5H2O   0.0022
CaCl2         0.0184
麦芽糖        6.7
离子交换水    平衡
<组分E>       (质量％)
大豆粉        8
K2HPO4        0.5
MgSO4·7H2O   0.05
FeSO4·7H2O   0.0025
MnSO4·5H2O   0.0022
CaCl2         0.0184
麦芽糖        6.7
离子交换水    平衡
将培养物离心，并用HPLC方法测定包含于上清液中的伊枯草菌素A及其同系物的浓度。
在使用每种培养基情况下累积的伊枯草菌素A及其同系物的浓度如下。
使用的培养基   伊枯草菌素A及其同系物的浓度
组分C：        0.3克/升
组分D：        1.5克/升
组分E：        3.8克/升
实施例3：在试管培养中碳源对产生伊枯草菌素A及其同系物的影响
将枯草芽孢杆菌SD142菌株在L平板培养基上划线，并在35℃生长一夜。将1毫升等分的被加入下列碳源的、具有下面组分F的培养基分装入试管中，向每一试管接种一菌环L平板培养基并在35℃孵育72小时。
<组分F>       (质量％)
大豆粉        8
K2HPO4        0.5
MgSO4·7H2O   0.05
FeSO4·7H2O   0.0025
MnSO4·5H2O   0.0022
CaCl2         0.0184
碳源**        6.7
离子交换水    平衡
**碳源选自于麦芽糖、可溶淀粉、淀粉浆、糊精、葡萄糖、蔗糖和果糖。
将培养物离心，并用HPLC方法测定含于上清液中的伊枯草菌素A及其同系物的累积浓度。在使用每种碳源情况下的伊枯草菌素A及其同系物的累积浓度如下。
麦芽糖      3.8克/升
可溶淀粉    3.8克/升
淀粉浆      3.8克/升
糊精        3.8克/升
葡萄糖      2.8克/升
蔗糖        2.2克/升
果糖        2.3克/升
实施例4：在试管培养中磷酸盐对产生伊枯草菌素A及其同系物的影响
将枯草芽孢杆菌SD142菌株在L平板培养基上划线，并在35℃生长一夜。将1毫升等分的被加入(1)至(6)浓度的K2HPO4的、具有下面组分G的培养基分装入试管中，向每一试管接种一菌环L平板培养基并在35℃孵育72小时。
<组分G>       (质量％)
大豆粉        8
MgSO4·7H2O   0.05
FeSO4·7H2O   0.0025
MnSO4·5H2O   0.0022
CaCl2         0.0184
麦芽糖        6.7
K2HPO4的浓度
(1)0质量％(未添加)
(2)0.1质量％
(3)0.5质量％
(4)1.5质量％
(5)3.0质量％
(6)4.5质量％
离子交换水    平衡
在用碳酸钠将pH调至7后，将培养物离心，并用HPLC方法测定含于上清液中的伊枯草菌素A及其同系物的累积浓度。在具有每一种浓度的K2HPO4被加入到培养基的每一种情况下伊枯草菌素A及其同系物的累积浓度如下。
K2HPO4的浓度  伊枯草菌素A和同系物的浓度
(1)0质量％         3.8克/升
(2)0.1质量％       3.6克/升
(3)0.5质量％       3.5克/升
(4)1.5质量％         3.0克/升
(5)3.0质量％         2.2克/升
(6)4.5质量％         1.5克/升
实施例5：在发酵罐中产生伊枯草菌素A及其同系物
将枯草芽孢杆菌SD142、突变株1和突变株2在L平板培养基上划线并在35℃生长一夜。向加入了50毫升L培养基的带挡板摇瓶中接种一菌环每种培养基并在35℃以150转/分钟孵育8小时。在5升发酵罐中制备具有下列组分H的培养基并向其中加入L平板培养基的每种培养物。当用20％氨水将pH调为6.5至7.5时，在35℃孵育150小时。
<组分H>
大豆粉         160克
MgSO4·7H2O    5克
FeSO4·7H2O    0.25克
MnSO4·5H2O    0.22克
CaCl2          1.84克
淀粉浆         450克
离子交换水     1,383克
将培养物离心，并用HPLC方法测定含于上清液中的伊枯草菌素A及其同系物。伊枯草菌素A及其同系物的量如下。
枯草芽孢杆菌SD142  3.8克/升
突变株1            6.7克/升
突变株2            6.7克/升
从这些结果中明显看出这些菌株中的每一种都能在1.5克/升或更多伊枯草菌素A存在下生长。
工业适用性
根据本发明，在多种工业领域比如医药品、农用化学品、食品、化妆品和化学品中都有用的伊枯草菌素A及其同系物可通过使用便宜的培养基原料生产，与传统方法相比具有大幅度提高的浓度。
另外，根据能高浓度产生伊枯草菌素A及其同系物的本发明，在农用化学品和植物病害防止领域中，该培养物原样即可被应用，而常规的培养物本身由于不充足的浓度不能以培养物本身应用。

Claims (8)

1.用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，其包括在包含2％或更大质量百分数的大豆粉或其提取物的液体培养基中培养具有产生伊枯草菌素A及其同系物的能力的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FERMBP-08427，以使该微生物在培养基中累积1.5克/升或更大浓度的伊枯草菌素A及其同系物，其中所述枯草芽孢杆菌累积的枯草菌表面活性剂的量为50ppm或更少。
2.如权利要求1所述的用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，其中，将就K2HPO4而论为0至3％质量百分数的磷酸盐加入液体培养基中。
3.如权利要求1或2所述的用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，其中，枯草芽孢杆菌FERM BP-08427还包含其突变株，所述突变株在包含5％w/v绵羊血、4％w/v葡萄糖和0.1％w/v NB和0.1％w/v酵母提取物的琼脂平板培养基上培养后，在生长菌落周围形成大的亮区，并且在包含2％或更大质量百分数的大豆粉或其提取物的液体培养基中培养后，通过HPLC法检测到与作为对照的枯草芽孢杆菌FERMBP-08427相比较，培养基中的伊枯草菌素A及其同系物具有更高的累积浓度。
4.如权利要求1所述的用于产生伊枯草菌素A及其同系物的方法，其中，包含2％或更大质量百分数的大豆粉或其提取物的液体培养基包含选自麦芽糖、淀粉浆、可溶淀粉、糊精、葡萄糖、蔗糖和果糖中的至少一种。
5.包含通过如权利要求1至4中任一项所述的方法获得的含有伊枯草菌素A及其同系物的培养物，其中，伊枯草菌素A及其同系物在培养基中累积。
6.包含伊枯草菌素A及其同系物的固体物质，其通过干燥如权利要求5所述的培养物而获得。
7.用于防止植物病害的试剂，所述试剂包含如权利要求5或6所述的含有伊枯草菌素A及其同系物的培养物或该培养物的固体物质。
8.用于防止植物病害的方法，其包括以未纯化形式使用如权利要求5或6所述的含有伊枯草菌素A及其同系物的培养物或该培养物的固体物质。
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