KR100640548B1 - 폐백토를 이용한 비타민 ｂ2의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아시비아 고시피 (Ashbya gossypii)를 배양하여 비타민 B2를 생산하는 방법에 있어서, 배양 배지의 탄소원으로 pH 6 내지 9가 되도록 전처리한 폐백토를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법 및 이의 부산물을 포함하는 사료 보조 및 토양 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생산 방법은 폐기시 환경오염을 유발하는 폐백토를 이용하여 사료 보조제로서 유용한 비타민 B2를 생산함으로써 폐기물의 자원화에 기여할 뿐 아니라, 비타민 B2를 생산하고 남은 부산물은 질소, 인산 및 가리 (칼륨) 등의 성분을 함유하고 있어 사료 보조 및 토양 개선용 조성물로 매우 유용하다.

Description

폐백토를 이용한 비타민 Ｂ2의 생산 방법 {METHOD FOR PRODUCING VITAMIN B2 USING SPENT BLEACHING EARTH}

도 1은 아시비아 고시피 (Ashbya gossypii)의 배양시 발효조 내의 발효 양상을 나타낸 그래프이며,

도 2는 처리백토와 폐백토를 노지에 시비하여 배추의 생장을 비교한 사진이다.

본 발명은 폐백토를 이용한 비타민 B2의 생산 방법 및 이의 부산물을 포함하는 사료 보조 및 토양 개선용 조성물에 관한 것이다.

동물 사료보조제로 사용되는 비타민 B2는 화학 합성법과 발효법으로 생산되고 있다. 화학 합성법은 글루코스 (glucose)로부터 라이보스 (ribose), 리바민 (ribamine) 등을 거쳐 비타민 B2가 합성되는 복잡한 과정을 거치는 반면에, 발효법은 미생물 균주에 의해 글루코스를 거치지 않고 바로 비타민 B2로 변환시킬 수 있 어 매우 유용하다.

발효법에 사용되는 대표적인 비타민 B2 생산 미생물로, 곰팡이로는 에레모테시움 아시비 (Eremothecium ashbyii) 또는 아시비아 고시피 (Ashbya gossypii), 효모로는 칸디다 파마타 (Candida famata) 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 및 세균으로는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 등이 사용되고 있다. 또한, 발효 원료로는 당밀, 포도당을 영양원으로 사용하고 있으며, 일부 유지가 보조 영양원으로 이용되고 있다.

한편, 폐백토는 식용 유지 (대두유, 미강유, 옥수수유 등)의 제조 공정 중 유지의 탈색 및 탈취에 사용되는 활성백토의 폐기물로, 유지 함유량이 과다하여 매립 처리시 유지의 용출 등으로 폐기물 처리에 어려움이 있을 뿐 아니라, 식물에 유해한 물질이 함유 (R. Capasso et al, Phytochemistry, 31, 4125, 1992)되어 있어 식물의 생장이 저해되는 등의 심각한 환경오염원이 되고 있다.

폐백토의 원물질인 활성백토는 벤토나이트라는 광물성분으로, 비료로 이용될 뿐만 아니라 흡착성이 있어 사료에 첨가할 경우 소화과정에서 생성된 암모늄 또는 황 함유 유해물질 및 독소와 방사성 물질과 같은 대사저해물질을 부착시켜 그 양을 감소시킬 수 있으며, 최근에는 벤토나이트에 생물 독소로 알려진 아플라톡신 (aflatoxin)도 부착된다고 보고된 바 있다. 또한, 벤토나이트는 팽윤성이 있어 수분을 흡수하여 자체 부피의 몇 배나 되는 양으로 불어나 가축의 장 내용물의 부피를 효과적으로 증가시켜 위장관 내 영양소의 체류시간을 연장하여 효소에 의한 소화시간 개선 및 영양소 소화를 촉진시킬 뿐 아니라, 높은 완충능을 지니고 있어 과 산증 예방제 역할을 한다.

하지만, 아직까지 폐백토를 영양원으로 사용하여 미생물을 이용한 환경친화적인 발효법으로 동물 사료 보조제용 비타민 B2를 합성한 예는 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 폐백토를 영양원으로 이용하여 경제적 및 환경친화적으로 비타민 B2를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 비타민 B2 생산 과정에서 발생하는 부산물을 포함하는 사료 보조 및 토양 개선제용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 아시비아 고시피 (Ashbya gossypii)를 배양하여 비타민 B2를 생산하는 방법에 있어서, 배양 배지의 탄소원으로 pH 6 내지 9가 되도록 전처리한 폐백토를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 생산 방법에서 비타민 B2의 정제 후에 남은 부산물을 포함하는, 사료 보조 및 토양 개선용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 방법은 아시비아 고시피를 이용한 발효법으로 비타민 B2를 생산하 는 데에 있어서, 발효 배지의 탄소원으로 당밀, 포도당 및 일부 유지를 사용하는 기존 방법과 달리, 미생물이 이용하기 쉽도록 전처리된 폐백토를 탄소원으로 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일태양에 따른 비타민 B2의 생산 방법은, 폐백토를 전처리하는 단계, 폐백토가 첨가된 배지를 이용하여 균주를 활성화시키는 단계, 및 전처리된 폐백토 및 효소처리된 질소원을 포함하는 배양액에서 미생물을 배양하여 비타민 B2를 생산하는 단계를 포함할 수 있으며, 각 단계를 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

1) 폐백토 전처리 단계

본 발명에서는, 폐백토를 미생물이 이용하기 쉽도록 하기와 같이 전처리한다.

폐백토는 유분을 함유하고 있으므로, 물에 잘 풀어질 수 있도록 폐백토를 눈의 크기가 0.8 내지 2 mm, 바람직하게는 1 mm인 체로 거른 후, 물에 2 내지 30%의 농도가 되도록 현탁시킨다. pH가 약 pH 3.5인 현탁액의 pH를 pH 6 내지 9가 되도록 조절하면서 60 내지 100℃에서 30 분 내지 2 시간 동안 교반한다.

상기와 같이 전처리된 폐백토액을 상온에 방치하여 온도를 20 내지 40℃로 낮춘 후, 트윈 80 (Tween 80) 또는 레시틴 (lecithin)과 같은 유화제를 첨가하여 잘 혼합한다. 유화제는 폐백토에 흡착되어 있는 유분에 대한 미생물의 이용성을 증가시키기 위해 사용되며, 폐백토액에 0.5 내지 2 중량%로 첨가하는 것이 바람직하다.

2) 균주의 활성화

배양시 비타민 B2의 생산성을 증가시키기 위하여, 비타민 생산 균주인 아시비아 고시피 (Ashbya gossypii)를 미리 활성화시키는 것이 바람직하다.

균주를 활성화시키기 위하여, 본 발명에서는 통상의 배양 배지 또는 상기 1)에서 전처리된 폐백토를 3 내지 5 중량% 정도 함유하는 고체 배지에 동결 보관된 균주를 선상 도말 (streaking) 하거나 희석한 후 접종하여 24 내지 32℃에서 3 내지 4일간 배양한다.

3) 비타민 B2의 생산

본 발명에서 아시비아 고시피를 배양하여 비타민 B2를 생산하는 데 있어서, 통상적으로 사용되는 배양 배지에서 탄소원을 폐백토로 대체하여 사용한다. 폐백토는 배지 총중량에 대하여 1 내지 10 중량%, 바람직하게는 3 내지 5 중량%의 양으로 사용될 수 있다. 상기 배지는 또한 질소원인 젤라틴 및 CSL (corn steep liquor), 대두유, 및 유화제를 포함할 수 있다. 균주의 이용성을 높이기 위해 질소원을 미리 프로테아제로 처리하는 것이 바람직하며, 이때 프로테아제는 약 60℃에서 약 1 시간 동안 처리하는 것이 바람직하다.

상기와 같이 준비된 배지에 균주를 3 내지 10 부피%, 바람직하게는 5 부피%가 되도록 접종하고 24 내지 32℃, 바람직하게는 24 내지 28℃에서 140 내지 240 시간, 바람직하게는 160 내지 240 시간 동안 배양한다. 배양 중 배양액 내 유분 함 량이 1% 미만이 되면 전처리된 폐백토를 첨가하여 유분 함량을 1% 이상으로 유지시킴으로써 탄소원의 결핍을 예방하는 것이 바람직하다.

또한, 비타민 B2의 생산성을 증가시키기 위하여 상기의 발효 단계 전에 1차 전배양 및 2차 전배양을 수행하는 것이 바람직하다.

1차 전배양은 통상적으로 사용하는 YPD, YM 또는 트립틱 소이 배지에 비타민 생산 균주인 아시비아 고시피, 바람직하게는 상기 2)에서 활성화시킨 균주의 콜로니 중 크기가 크고 노란색을 띠는 균주를 1 루프 또는 1 ㎖ 정도 접종하여 24 내지 28℃에서 36 내지 48 시간 동안 수행한다.

또한, 2차 전배양은 효모 추출물, 프로테아제 처리된 CSL 및 대두유를 포함하는 배지에 1차 전배양된 균주를 5 내지 10 부피%로 접종하여 24 내지 28℃에서 24 내지 48 시간 동안 수행한다.

상기에서 비타민 B2의 생산을 위해 배양된 배양액으로부터 알칼리 용액과 산성 용액을 순차적으로 이용하여 비타민 B2를 정제하고, 그 외의 부산물은 따로 건조하거나, 추출과정 없이 전체 배양액을 건조하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 비타민 B2의 생산 방법은 폐기되는 폐백토를 영양원으로 이용하여 수입에 의존하던 사료 보조제인 비타민 B2를 생산하므로, 매우 경제적이고 환경친화적이다.

또한, 본 발명에서는 상기 비타민 B2의 생산 과정에서 발생하는 부산물을 포함하는 사료 보조제 및 토양 개선용 조성물을 제공한다.

비타민의 발효 생산 후 발생되는 백토가 포함된 부산물 (이하, "처리백토"라 함)은 유기물을 20 내지 35%로 함유하고 있으며, 특히 비타민 B2의 발효 정제 전의 폐백토에 비해 질소, 인산, 가리 및 각종 무기물의 함량이 높고 양이온 교환능도 우수하여 사료 보조제 및 토양 개선제로서 매우 유용하다.

구체적으로, 사료 보조제로 사용시 사료 1 kg당 0.1 내지 1 중량%의 처리백토를 첨가하고, 토양 개선제로 사용시 노지 1 ㎡당 2 내지 4 kg의 처리백토를 첨가하는 것이 바람직하다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

(단계 1) 폐백토의 전처리

폐백토의 입자를 고르게 하기 위해 폐백토를 1 mm 체로 걸러 체를 통과한 폐백토를 모아 20% 농도가 되도록 물에 첨가하였다. 이를 교반과 동시에 70℃로 열처리하면서 10% KOH와 인산을 가하여 pH 7.2가 되도록 조절하였다. 상기 혼합액을 상온에 방치하여 약 30℃로 식힌 후, 유화제로 레시틴 (lecithin)을 1%가 되도록 첨가하여 혼합하였다.

(단계 2) 균주의 활성화

동결건조된 아시비아 고시피 (Ashbya gossypii, ATCC 10895)를 영양배지 (ℓ당 효모추출물 10 g, 글루코스 10 g, 글리신 3 g 및 한천 20 g)에 선상도말 (streaking)하고 28℃에서 4일간 배양하여 균주를 활성화시켰다.

(단계 3) 비타민 B2의 생산

YPD 배지 (ℓ당 효모추출물 2 g, 펩톤 20 g, 마이오-이노시톨 0.6 g 및 글루코스 10 g)에 단계 2에서 활성화시킨 균주의 콜로니 중 크기가 크고 노란색을 띠는 균주를 1 루프 또는 1 ㎖ 정도 접종하여 28℃, 200 rpm에서 48 시간 동안 1차 전배양을 수행하였다. 이어서, 2차 전배양 배지 (ℓ당 효모추출물 9 g, 프로테아제 처리된 CSL 30 g 및 대두유 15 g)에 1차 전배양된 균주를 5 부피%가 되도록 접종하여 28℃, 200 rpm에서 48 시간 동안 2차 전배양을 수행하였다.

폐백토가 3 중량%로 첨가된 비타민 생산배지 (ℓ당 젤라틴 30 g 및 CSL 60 g, 글리신 1.5 g, KH₂PO₄ 1.5 g, CoCl₂ 0.002 g, MnCl₂ 0.005 g, ZnSO₄ 0.01 g, MgSO₄ 0.001 g, 대두유 50 g 및 전처리된 폐백토 30 g)를 121℃에서 30 분 동안 습식 멸균한 후 2차 전배양된 균주를 5 부피%가 되도록 접종하고 28℃, 200 rpm 또는 40%의 용존 산소가 유지되는 조건에서 168 시간 동안 배양하여 비타민 B2를 생산하였다.

(단계 4) 비타민 B2의 정제

상기 단계 3에서 생산된 비타민 B2를 정제하기 위하여, pH 변화에 따른 비타민 B2의 용해도 변화를 이용하였다.

먼저, 단계 3의 배양액 370 ℓ에 50% KOH용액을 가하여 pH를 13으로 조절한 후, 원심분리기 (Westfalia 사, HFG5016HK)를 이용하여 1차 원심분리하여 상등액만 따로 모으고, 침전물에는 다시 물 300 ℓ를 첨가한 뒤 50% KOH 용액으로 pH 13으로 조절하여 2차 원심분리한 후 상층액만을 모았다. 이렇게 하여 모은 1, 2차 상층액에 인산을 첨가하여 pH를 3으로 낮춤으로써 비타민 B2가 침전되도록 하였으며, 3차 원심분리하여 침전물만을 회수하고, 이를 분무건조기 (삼영화학)를 이용하여 유입온도 190℃, 배출온도 90℃ 조건에서 건조하여, 비타민 B2 정제품을 얻었다.

한편, 상기 2차 원심분리 후 얻어진 침전물에 물 100 ℓ를 첨가한 다음, 인산으로 pH 7.0으로 조절하고 분무건조기 (Westfalia 사, HFG5016HK)를 이용하여 유입온도 190℃, 배출온도 90℃ 조건에서 건조하여 처리백토를 얻었다.

실시예 2 및 3

상기 실시예 1의 단계 1에서, pH를 8로 조절하고 각각 70℃ 및 100℃에서 열처리하면서 pH를 6.8로 조절한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 비타민 B2 및 처리백토를 생산하였다.

시험예 1: 폐백토의 전처리 유무에 따른 비타민 B2의 생산량 비교

폐백토의 전처리 유무에 따른 비타민 B2의 생산량을 비교해 보기 위해, 상기 실시예 2의 전처리 조건으로 전처리된 폐백토와 전처리되지 않은 폐백토를 실시예 1의 단계 3과 동일한 조성 (폐백토 및 대두유 제외)의 비타민 생산 배지에 각각 10 중량%씩 첨가한 다음, 활성화시키지 않은 동결보관 균주를 1 ㎖정도 접종하여 24℃에서 240시간 동안 배양하였다. 균체량 (PMV, packed mycellium volume)을 측정하기 위하여, 상기 배양액 10 ㎖을 취하여 원심분리기로 3,000 rpm으로 10 분간 원심분리한 후 침강된 펠렛의 양을 측정하였으며, 비타민 B2의 생산량을 측정하기 위하여, 상기 배양액 내의 비타민 B2의 양을 HPLC (Agilent사 1100 시리즈)를 이용하여 측정하고 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

컬럼: X-terra C18 (Waters사, 150 mm×4.6 mm)

용리액: 5 mM 1-헥산설포네이트 함유 인산 나트륨 완충용액 (10 mM, pH 2.6)/아세토나이트릴 = 9/1 (v/v)

유속: 1 ㎖/분

주입량: 10 ㎕

파장: 270 nm

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 폐백토를 본 발명에 따른 방법으로 전처리하지 않으면 폐백토가 첨가된 배양액의 pH가 낮아지고, 유분이 함유되어 있는 폐백토가 배양액 내에서 잘 풀어지지 않고 작은 덩어리들로 뭉쳐있어 균주가 폐백토 내의 유분을 탄소원으로 사용하기 어려워지므로, 균체량이 낮아지게 되고, 따라서 비타민 B2의 생산량도 낮아지게 된다.

시험예 2: 폐백토의 전처리 방법에 따른 비타민 B2의 생산량 비교

폐백토의 전처리 방법에 따른 비타민 B2의 생산량을 비교해 보기 위해, 상기 실시예 1 내지 3에서 제조된 배양액 내의 비타민 B2의 양을 상기 시험예 1과 동일한 방법으로 측정하고 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 열처리 전의 pH가 높고, 열처리 온도가 높을수록 비타민 B2의 생산량이 다소 감소하였다.

실시예 4

상기 실시예 1의 단계 2에서, 폐백토가 3%로 첨가된 영양배지 (ℓ당 효모추출물 10 g, 글루코스 10 g, 글리신 3 g 및 한천 20 g)에서 균주를 활성화시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 비타민 B2 및 처리백토를 생산하였다.

비교예 1

활성화시키지 않은 동결보관 균주를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 비타민 B2를 생산하였다.

시험예 3

균주의 활성화 방법에 따른 비타민 B2의 생산량을 비교하기 위해, 상기 실시예 1, 실시예 4 및 비교예 1에서 제조된 비타민 B2의 양을 측정하여 하기 표 3에 나타내었다.

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 폐백토 첨가 배지에서 활성화된 균주가 가장 높은 비타민 생산량을 보임을 알 수 있다.

실시예 5 및 6

상기 실시예 1의 단계 3에서, 비타민 생산배지에 레시틴 및 트윈 80을 각각 1%로 추가로 첨가한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 비타민 B2 및 처리백토를 생산하였다.

시험예 4

유화제 첨가 유무에 따른 비타민 B2의 생산량을 비교해 보기 위해, 상기 실시예 4 내지 6에서 제조된 비타민 B2의 양을 측정하여 하기 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 유화제를 첨가한 경우가 첨가하지 않은 경우보다 비타민 B2의 생산량 우수하며, 특히 유화제로 레시틴을 첨가한 경우, 비타민 B2의 생산량이 레시틴을 첨가하지 않은 경우보다 약 20% 증가함을 알 수 있다.

실시예 7

비타민 생산배지에 알칼리성 프로테아제로 처리된 젤라틴 및 CSL을 각각 30 g 및 60 g씩 추가로 첨가한 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 방법으로 비타민 B2 및 처리백토를 생산하였으며, 상기 알칼리성 프로테아제 처리는 젤라틴과 CSL이 각각 15% 및 30%의 농도가 되도록 물을 첨가한 후 알칼리성 프로테아제를 가하여 60℃에서 1 시간 반응시켜 수행하였다.

비교예 2

알칼리성 프로테아제 대신 HCl 및 NaOH로 pH 2, 상온에서 1 시간 동안 각각 처리하여 분해시킨 CSL 및 젤라틴, 및 상업용으로 시판되고 있는, 젤라틴을 트립신으로 처리한 펩톤 G (아큐메디아 사)와 CSL 및 콩가루를 트립신으로 처리한 소이톤 (디프코 사)과 젤라틴을 각각 사용한 것을 제외하고는 실시예 7과 동일한 방법으로 비타민 B2를 생산하였다.

시험예 5

질소원의 효소처리 유무에 따른 비타민 B2의 생산량을 비교해 보기 위해, 상기 실시예 5, 실시예 7 및 비교예 2에서 제조된 비타민 B2의 양을 측정하여 하기 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 질소원으로 사용되는 CSL 및 젤라틴을 화학적 처리 방법인 HCl과 NaOH로 각각 처리한 경우, 및 시판되는 펩톤 G 및 소이톤을 사용한 경우 모두, 아무것도 처리하지 않은 질소원을 사용한 경우보다도 비타민 B2의 생산이 낮았다. 그러나, 질소원을 프로테아제로 처리한 경우는 아무것도 처리하지 않은 경우보다 비타민 B2의 생산량이 16% 정도 상승한 것을 알 수 있다.

실시예 8 내지 11

폐백토를 각각 1%, 5%, 7% 또는 10%로 첨가한 것을 제외하고는 실시예 7과 동일한 방법으로 비타민 B2를 생산하였다.

시험예 6

발효시 첨가되는 폐백토의 농도에 따른 비타민 B2의 생산량을 비교해 보기 위해, 상기 실시예 7 내지 11에서 제조된 비타민 B2의 양을 측정하여 하기 표 6에 나타내었다.

상기 표 6에 나타난 바와 같이, 폐백토의 농도가 1에서 3%로 증가할수록 비타민 B2의 생산도 증가하였으며, 이는 폐백토의 양이 증가함에 따라 폐백토에 흡착되어 있는 유지의 양도 증가되어 비타민 B2의 생산이 증가한 것으로 사료된다. 그러나 그 이상의 농도에서는 농도가 높아질수록 생산량이 약간 감소하였다.

실시예 12

비타민 B2의 생산을 위한 배양 중 유분 함량을 수시로 측정하여 배양액 내 유분의 함량이 1% 미만이 되면 전처리된 폐백토를 다시 첨가하여 유분 함량을 1% 이상으로 유지시킴으로써 탄소원의 결핍을 예방한 것을 제외하고는 실시예 7과 동일한 방법으로 비타민 B2 및 처리백토를 생산하였다.

시험예 7

실시예 12의 배양 중의 배양액 내에서의 시간에 따른 pH, 비타민 B2의 양, 유분의 함량 및 균체량을 측정하여 도 1에 나타내었다.

이때, pH는 F54-BW (호리바 사)를 이용하여 측정하였고, 유분의 함량은 배양액 5 ㎖을 헥산 20 ㎖과 혼합하여 20 분간 혼합하고 원심분리기 (비젼과학, VS-5500N)를 이용하여 3,000 rpm으로 10 분간 원심분리한 후, 미리 무게를 잰 알루미늄 디쉬에 상층액 10 ㎖을 취한 다음, 80℃에서 3 시간 동안 건조한 건조물의 무게로 측정하였다. 균체량은 시험예 1과 동일한 방법을 사용하여 측정하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 발효 후 85 내지 90 시간 사이에 유분의 함량이 1% 미만이 되고, 다시 폐백토를 첨가하여 유분을 보충해주면 비타민 B2의 생산량이 증가됨을 알 수 있다. 또한, 비타민 B2는 발효 후 89 시간에 0.3 g/ℓ가 생산되기 시작하여 최종 4.4 g/ℓ가 생산되었다.

시험예 8

발효 후 폐백토 내 성분의 변화를 발효 전의 성분과 비교해 보기 위해, 상기 실시예 1에서 사용한 전처리 전 폐백토 및 실시예 12에서 비타민 정제 후 얻어진 처리백토의 성분 및 양이온 교환능 (cation exchange capacity (CEC))을 각각 환경부고시 제2003-2143호 및 농림부고시 제2003-42호의 방법에 따라 측정하여 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

상기 표 7에 나타난 바와 같이, 비타민 B2의 발효 정제 후 얻어진 처리백토에는 질소, 인산 및 가리 성분의 함량이 각각 10.4, 380 및 46 배 증가하였으며, 양이온 교환능은 약 2.2배 높아졌음을 알 수 있다.

시험예 9

처리백토의 토양 개선제로서의 효과를 알아보기 위해 노지 재배 실험을 수행하였다. 각 구획은 1 ㎡로 하고, 고랑은 30 cm로 하여 실시예 12에서 비타민 정제 후 얻어진 처리백토 4 kg 및 2 kg, 폐백토 4 kg 및 2 kg 및 시판되는 아미노산 발효 부산비료인 입상 유기질 비료 (새천년, (주)해강바이오) 500 g을 각각 뿌리고 잘 섞어주었다. 상기 토양에 배추의 모종을 이식한 후, 아침, 저녁으로 물을 주었으며 기타 다른 비료성분 및 농약은 처리하지 않았다. 모종을 이식한 날, 이식 후 19일 및 37일에 각각의 생장을 비교하였으며, 시료 및 비료를 처리하지 않은 것을 블랭크로, 비료만 처리한 것을 대조군으로 하여, 각 처리군별로 4개체의 배추를 이식하여 상기와 동일한 방법으로 실험을 수행하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.

또한, 최종 49일 재배 후 각 구획별로 배추를 수확하고 처리군별로 가장 작은 개체 1개를 제외하여 나머지 3개체의 평균 무게를 측정하고 그 결과를 표 8에 나타내었다.

도 2 및 표 8에 나타난 바와 같이, 폐백토를 2 kg 및 4 kg 처리한 경우 모두 시료를 처리하지 않은 경우보다 배추의 성장이 좋지 않으며, 이는 폐백토 내에 식물 독성 물질이 함유되어 있기 때문임을 알 수 있다. 그러나, 처리백토를 2 kg 및 4 kg 처리한 경우에는 시판용 비료에 못지 않게 성장이 우수하므로, 처리백토는 폐백토 내에 함유되어 있던 식물 독성 물질이 제거되었을 뿐 아니라, 토양 개선제로서도 매우 우수함을 알 수 있다.

시험예 10

처리백토의 사료 보조제로서의 효과를 알아보기 위해, 60 주령의 로만 (Lohmann) 실용 갈색계 240 수를 총 4개의 처리군에 10 수씩 6번의 실험에 완전임의 배치하여 시판 일반 산란계 전용사료 급여 대조군, 및 전용사료에 폐백토, 실시예 12에서 비타민 정제 후 얻어진 처리백토 및 상기 처리백토에 비타민 B2를 1%로 첨가한 처리백토를 각각 1%로 첨가하는 3개의 처리군으로 나누어 총 8주간 급여실험을 실시하였다.

상기 실험 중에 주 단위로 산란율, 난중 및 사료섭취량을 조사하였고, 생산된 계란의 내부 난질과 난각질을 측정하였다. 실험 최종일에 처리군 당 8 수씩 체중이 유사한 개체를 선발하여 채혈하였으며, 간 등 필요 장기를 얻기 위해 희생시켰다.

난각 강도는 난각 강도계 (FHK 난각강도계, 부토평공업주식회사, 일본)를 이용하여 계란의 둔단부를 위로하고 수직으로 고정한 후 압력을 가하여 파각되는 순간의 압력을 측정하였다. 난각 강도 측정 후 난각 두께는 계란 중앙부의 난각 파편을 채취하여 난각 후도계 (FHK 피코크, 부토평공업주식회사, 일본)를 통해 측정한 두께의 평균치로 하였다.

또한, 폐백토 및 처리백토의 간독성을 비교하기 위하여, GOT (glutamate oxaloacetate transaminase) 및 GPT (glutamate pyruvate transaminase)의 활성을 GOT-GPT 킷트 (BC101-O, GOT 와 BC101-P, 및 GPT, 영동제약)를 사용하여 비색방법으로 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다 (P<0.05).

상기 표 9에 나타난 바와 같이, 폐백토를 처리한 경우 처리백토 및 비타민 B2를 함유한 처리백토를 처리한 경우보다 산란율, 일산란량 및 난각 강도가 좋지 않으며, GOT 및GPT의 활성을 비교 결과 폐백토에서 GPT의 수준이 높게 나타냈다. 또한, 처리백토 또는 비타민 B2를 함유한 처리백토를 처리한 경우에는 시판용 사료보다 산란율, 일산란량 및 난각 강도가 우수하므로, 처리백토는 사료 보조용 조성물로도 매우 우수함을 알 수 있다.

본 발명에 따른 비타민 B2의 생산 방법은 폐기시 환경오염문제를 일으키는 폐백토를 이용하여 사료 보조제에 유용한 비타민 B2를 생산함으로써 폐기물의 자원화에 기여할 뿐 아니라, 이로부터 발생되는 부산물을 사료 보조제 및 토양 개선제로 이용함으로써, 더 이상의 폐기물이 발생되지 않으므로 환경 개선의 효과를 기대할 수 있다.

Claims (9)

1. 아시비아 고시피 (Ashbya gossypii)를 배양하여 비타민 B2를 생산하는 방법에 있어서, 배양 배지의 탄소원으로 pH 6 내지 9가 되도록 전처리한 폐백토를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   전처리는 0.8 내지 2 mm의 체에 거른 폐백토를 2 내지 30%의 농도가 되도록 물에 현탁시킨 후 현탁액의 pH를 6 내지 9로 조절하면서 60 내지 100℃에서 30 분 내지 2 시간 동안 교반하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서,

   교반된 현탁액에 유화제로서 트윈 80 (Tween 80) 또는 레시틴 (lecithin)을 0.5 내지 2 중량%의 양으로 추가로 처리함을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서,

   배양 배지에 1 내지 10 중량%의 폐백토를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서,

   배양 배지에 젤라틴 및 CSL(corn steep liquor), 프로테아제 처리된 젤라틴 및 CSL, 대두유, 및 유화제로 이루어진 군에서 선택된 성분을 추가하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서,

   아시비아 고시피는 3 내지 5 중량%의 폐백토가 첨가된 배지에서 24 내지 32℃에서 3 내지 4일 동안 배양되어 활성화된 것임을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서,

   아시비아 고시피를 24 내지 32℃에서 140 내지 240 시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서,

   배양시 배지 내 유분 함량이 1% 미만이면, 폐백토를 추가로 첨가하여 유분을 보충하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항의 방법으로 얻어진 배양물로부터 비타민 B2를 정제한 후에 남은 부산물을 포함하는, 사료 보조 및 토양 개선용 조성물.

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