CN101724014B - 内生枯草芽孢杆菌抗菌脂肽及分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
内生枯草芽孢杆菌抗菌脂肽及分离纯化方法。本发明涉及植物内生枯草芽孢杆菌Jaas ed1的胞外抗菌脂肽及其分离纯化方法。胞外抗菌脂肽分子量分布范围主要为1000-2200Da，包含包含有Iturin同系物、Fengycin同系物和Surfactin-like Compound同系物，是一组由单个菌株产生的不寻常的抗菌脂肽混合物。其分离纯化方法是：从内生枯草芽孢杆菌Jaas ed1的发酵液中用硫酸铵盐析获得抗菌脂肽粗提物后，先后经Sephedex G-25分子筛层析、Cellulose DEAE-52阴离子交换层析和FPLC300SB-C18柱层析，其中34-37min的收集峰具有抑菌活性，经浓缩后用Tricine-SDS-PAGE检测，只有1个条带，达到电泳纯，即为纯化的胞外抗菌脂肽。该抗菌脂肽对于开发广谱抗真菌药物具有极高的研究和应用价值，对于保护作物天然品质、减少农药残留具有广泛的应用前景。
Description
技术领域：
本发明涉及植物内生枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Jaas ed1的胞外抗菌脂肽及其分离纯化方法。
背景技术：
由于内生菌长期生活在植物体内微环境中，并与宿主植物协同进化，在演化过程中二者形成了互惠关系。内生菌不仅能够参与植物次生成分的合成，或对植物次生代谢产物进行转化，而且还能够独立产生丰富的次生代谢产物，是天然产物的重要来源。有些内生细菌在植物体内可以产生一些抗菌物质对病原菌有拮抗作用。芽孢杆菌产生的拮抗物质，除少数例外，都属于一个单一的类群，即多肽类，主要抑制革兰氏阳性菌；有些细菌能抑制革兰氏阴性菌、酵母；有的还表现出抗病毒、抗肿瘤和支原体、抗真菌的生物活性。产生的抗菌物质分核糖体合成和非核糖体合成两类，近几年有关非核糖体肽的研究已成为热点。
非核糖体肽是一类主要由氨基酸和特殊的或修饰过的氨基酸组成的小分子化合物，不是在核糖体上合成的，而是通过所谓的“硫模板多聚酶机制”的多功能酶复合系统合成的一类肽类次级代谢产物。芽孢杆菌非核糖体肽是芽孢杆菌产生抗菌作用的一个重要因素，按照非核糖体肽中氨基酸的排列方式可以分为线状肽、环状肽与线环状肽；按分子中存在的氨基酸以外的成分与非肽键等情况又可以将其分为脂肽抗生素、多肽抗生素和次生代谢产生的其它抗菌物质，如挥发性抗菌物质和脂肪氨基酸氮氧衍生物等。芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素主要有表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(inturins)和丰原素(fengycin)3大类。Surfactin是高活性的生物表面活性剂，还具有抗真菌、抗病毒、抗癌、降低胆固醇等作用，在制药工业、农业和环境应用方面将大有发展前途。Inturin和Fengycin都是一类对真菌具有强烈拮抗作用的脂肽抗生素。
芽孢杆菌非核糖体肽类次级代谢产物与其它抗菌物质相比表现出其自身的多样性、统一性和稳定性。芽孢杆菌非核糖体肽特殊的生物合成机制决定了其具有氨基酸组成和分子形式的多样性特点。芽孢杆菌多肽合成酶基因表现出较高的同源性，有的芽孢杆菌产生的非核糖体肽的氨基酸序列表现出高度的相似性。生防芽孢杆菌往往可以产生多种对特定病原菌具有很高活性的抗生素或一族结构相似的化合物，这体现了非核糖体肽作为次级代谢产物的共性。非核糖体肽的理化性质稳定，如：热稳定性好，有的甚至121℃高压灭菌30min，活性仍能保持在95％以上；对胰蛋白酶、蛋白酶K等多种蛋白酶不敏感；对氯仿等有机溶剂有一定的 耐受性，抗紫外照射。非核糖体肽具有如此高的稳定性，可能与抗菌肽分子量小和它的特殊环状结构有关。
目前生防芽孢杆菌发酵液、无细胞培养液、产抗生素缺失突变株的综合防病试验已经系统证明了抗生素是芽孢杆菌抗菌防病作用的重要机制。利用产抗生素菌株防治植物病害研究已有很多成功报道，在实际应用中取得了可喜的进展，无细胞培养物或抗生素粗提物平板抑菌试验和田间防病试验都能直接反映抗生素对芽孢杆菌生防作用的贡献。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Jaas ed1是一株从茄子组织中分离获得的植物内生细菌，已于2005年12月12日在位于北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1564。该菌株可在较低的菌液浓度下进入多种作物体内定殖；而且，该菌株能够促进茄苗生长、有效防治茄子黄萎病。但是对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Jaas ed1产生的胞外抗菌脂肽还没有深入研究，也未见有相关的报道。
发明内容：
本发明目的在于：提供一组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis胞外抗菌脂肽，以及一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis胞外抗菌脂肽的分离纯化方法。
本发明的目的是这样实现的：一组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis胞外抗菌脂肽，其特征在于：从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis胞外产物中分离纯化后获得；通过混合型串联傅立叶质谱Q-FT-MS和电喷雾四极杆飞行时间串联质谱Q-TOF2测定，分子量分布范围主要为1000-2200Da，包含有分子量为1042.5、1056.5和1070.5等相差一个亚甲基(-CH2)的Iturin同系物，1434.8、1448.8、1462.8等相差一个亚甲基(-CH2)的Fengycin同系物和1442.7、1456.7、1470.8、1484.8等相差一个亚甲基(-CH2)的surfactin-like compound同系物。
一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis胞外抗菌脂肽的分离纯化方法，其特征在于：
a、将保藏号为CGMCC No.1564的内生枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Jaas ed1转接到NB培养液中，在30℃、120r/min条件下振荡培养48h，发酵液离心除菌，收集上清液。加入45-55％饱和度的硫酸铵，4℃过夜后，10000r/min离心18min，取沉淀溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)中，即为抗菌脂肽粗提物；
b、将粗提物上样于Sephedex G-25分子筛层析柱，用0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)洗脱，在紫外光OD 280nm处检测，有I、II两个吸收峰，其中峰I具有抑菌活性；
c、将峰I收集液浓缩上样于Cellulose DEAE-52阴离子交换柱，分别用含0mol/L、0.1mol/L、0.4mol/L、1.0mol/L NaCl的0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)进行梯度洗脱， 在紫外光OD 280nm处检测，分别在0.1mol/L、0.4mol/L、1.0mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱浓度下各出现吸收峰，其中在0.4mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱下来的峰物质具有抑菌活性；
d、再将在0.4mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱下来的峰物质收集液浓缩上样于FPLC300SB-C18反相半制备柱，采用梯度洗脱：0-15min 5％乙腈，15-45min 40％乙腈，45-75min 80％乙腈，75-90min 95％乙腈，在紫外光OD 280nm处检测，其中34-37min的收集液具有抑菌活性，经浓缩后用Tricine-SDS-PAGE检测，已经达到电泳纯，即只有1个条带；34-37min的收集液即为纯化获得的保藏号为CGMCCNo.1564的内生枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Jaas ed1的胞外抗菌脂肽。
本发明的优点在于：本发明是一种从植物内生枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Jaas ed1中分离纯化获得的新的一组胞外抗菌脂肽，包含有Iturin同系物、Fengycin同系物和Surfactin-likeCompound同系物，这是一组由单个菌株产生的不寻常的抗菌脂肽混合物。具有抑菌谱广、热稳定性好、对蛋白酶不敏感、对高压和有机溶剂都具有一定的耐受性的特点，对于开发广谱抗真菌药物具有极高的研究和应用价值，对于保护作物天然品质、减少农药残留具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是抗菌脂肽Tricine-SDS-PAGE电泳图
图2是利用生物自显影技术寻找抗菌脂肽目的条带
图3是混合型串联傅立叶质谱Q-FT-MS对抗菌脂肽中包含有Iturin同系物的解析图
图4是电喷雾四极杆飞行时间串联质谱Q-TOF2对抗菌脂肽中包含有Fengycin同系物和Surfactin-like Compound同系物的解析图
具体实施方式：
下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1抗菌脂肽粗提物的获得
将植物内生枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Jaas ed1转接到NB培养液中(所述的NB培养液为牛肉浸膏0.3％，酵母膏0.1％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，pH 6.8-7.0)，在30℃、120r/min条件下振荡培养48h，4℃，10000r/min，离心10min，除去菌体，收集上清液，再一边用磁棒搅拌，一边将硫酸铵固体分批加入，4℃静置过夜后，10000r/min，离心18min，得到的沉淀溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)中。按上述方法，对上清液进行硫酸铵分段 盐析，分别收集硫酸铵饱和度在0-30％，30-40％，40-50％，50-60％，60-70％的沉淀物，溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)中。检测以上硫酸铵沉淀组分以及70％硫酸铵饱和度的上清液对茄子黄萎病菌的抑菌活性，结果40-50％和50-60％硫酸铵饱和度的沉淀物抑菌活性最强，0-30％和70％饱和度的上清液没有抑菌活性，故确定用45-55％的硫酸铵饱和度盐析获得抗菌脂肽粗提物。
实施例2抗菌脂肽的分离纯化
将抗菌脂肽粗提物上样于Sephedex G-25分子筛层析柱，用0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)洗脱，流速1ml/min，在紫外光OD 280nm处检测，有I、II两个吸收峰，收集各峰组分，并检测对茄子黄萎病菌的抑菌活性，其中峰I具有抑菌活性。将分子筛层析得到的峰I收集液进行浓缩，上样于Cellulose DEAE-52阴离子交换柱，分别用含0mol/L、0.1mol/L、0.4mol/L、1.0mol/L NaCl的0.05mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)进行梯度洗脱，流速为1ml/min，在紫外光OD 280nm处检测，分别在0.1mol/L、0.4mol/L、1.0mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱浓度下各出现吸收峰，收集各峰物质，检测对茄子黄萎病菌的活性，其中在0.4mol/L的NaCl浓度下洗脱下来的峰物质为抑菌活性物质。再将阴离子交换柱在0.4mol/L的NaCl浓度下洗脱下来的峰物质收集液浓缩上样于C18反相半制备柱(300SB-C18Semi-Prep FPLC Col9.4×250mm)，采用梯度洗脱：0-15min 5％乙腈，15-45min 40％乙腈，45-75min 80％乙腈，75-90min 95％乙腈，流速1.5ml/min，在紫外光OD 280nm处检测，收集各峰物质，冻干浓缩后，检测各峰物质对茄子黄萎病菌的抑菌活性，其中34-37min的收集液具有抑菌活性。用Tricine-SDS-PAGE检测，已经达到电泳纯，即只有1个条带(见图1，图中：1为标准分子量的蛋白质，2为本抗菌脂肽)。
实施例3利用生物自显影技术寻找抗菌脂肽目的条带
通过Tricine-SDS-PAGE凝胶原位检测抗菌脂肽粗提物经Sephedex G-25分子筛层析柱和Cellulose DEAE-52阴离子交换柱层析后的抑菌活性峰物质收集液的抑菌活性，即利用生物自显影技术寻找抗菌脂肽目的条带。Tricine-SDS-PAGE中分离胶浓度为16.5％，夹层胶浓度为10％，浓缩胶浓度为4％，将抗菌脂肽粗提物经Sephedex G-25分子筛层析柱和CelluloseDEAE-52阴离子交换柱层析后的抑菌活性峰物质收集液浓缩后，平行上样于凝胶中两个加样孔，电泳结束后，将凝胶切成2半，一半用于硝酸银染色，另一半用0.1％的Triton 100洗掉与凝胶中蛋白质结合的SDS，然后用无菌水冲洗两遍后，放入表面涂布有200μL茄子黄萎病菌孢子悬浮液(2-4×106孢子/mL)的PDA平板上，置于25℃恒温培养48h后观察抑菌情况。样品经电泳后，硝酸银染色呈现2个条带，其中A条带分子量45KD左右，B条带则远小于6.5KD。凝胶原位检测抑菌活性显示抑菌活性物质为B条带(见图2，图中：1为 Tricine-SDS-PAGE电泳后凝胶原位检测对茄子黄萎病菌的抑菌活性；2a和2b为Tricine-SDS-PAGE电泳后凝胶进行硝酸银染色，2a为抗菌脂肽粗提物经Sephedex G-25分子筛层析柱和Cellulose DEAE-52阴离子交换柱层析后的抑菌活性峰物质，2b为标准分子量的蛋白质)。通过Tricine-SDS-PAGE凝胶原位检测抗菌脂肽抑菌活性的生物自显影技术确定B条带为目的条带，所需分离的抗菌脂肽的分子量远小于6.5KD。
实施例4抗菌脂肽的质谱分析
将分离纯化后的抗菌脂肽冻干浓缩后，由中国人民解放军军事医学科学院国家生物医学分析中心进行质谱分析。通过混合型串联傅立叶质谱Q-FT-MS和电喷雾四极杆飞行时间串联质谱Q-TOF2测定，分子量分布范围主要为1000-2200Da。其中经混合型串联傅立叶质谱Q-FT-MS(德国Bruker公司)，在正离子方式下测定，结果显示抗菌脂肽包含有3个主要的质荷比峰(m/z)，即1043.5、1057.5、1071.5(图3)，这样它们是分子量为1042.5、1056.5和1070.5等相差一个亚甲基(-CH2)的Iturin同系物。用电喷雾四极杆飞行时间串联质谱Q-TOF2(英国Micromass公司)，在正离子方式下测定双电荷离子对应肽段分子量，结果表明抗菌脂肽包含有质荷比峰(m/z，双电荷离子)718.4、725.4、732.4，即分子量分别为1434.8、1448.8、1462.8等相差一个亚甲基(-CH2)的Fengycin同系物和质荷比峰(m/z，双电荷离子)722.4、729.4、736.4、743.4，即分子量分别为1442.7、1456.7、1470.8、1484.8等相差一个亚甲基(-CH2)的surfactin-like compound同系物。进一步对质荷比峰(m/z，双电荷离子)为718.4的组分用四极杆飞行时间串联质谱Q-TOF2(英国Micromass公司)进行串联质谱测序，进一步确认该荷质比峰物质为C-14fengycin A(图4)。
Claims (1)
1.一组枯草芽孢杆菌胞外抗菌脂肽，其特征在于：从保藏号为CGMCC No.1564的内生枯草芽孢杆菌Jaas ed1胞外产物中分离纯化后获得，所用分离纯化方法为：
a、将保藏号为CGMCC No.1564的内生枯草芽孢杆菌Jaas ed1转接到NB培养液中，在30℃、120r/min条件下振荡培养48h，4℃、10000r/min、离心10min，除去菌体，收集上清液，再一边用磁棒搅拌，一边将硫酸铵固体分批加入，使得硫酸铵饱和度在45-55％之间，4℃静置过夜后，10000r/min离心18min，得到的沉淀溶解于pH为7.0的0.05mol/L磷酸缓冲液中，即为抗菌脂肽粗提物；
b、将粗提物上样于Sephedex G-25分子筛层析柱，用pH为7.0的0.05mol/L磷酸缓冲液洗脱，流速1ml/min，在紫外光OD 280nm处检测，有I、II两个吸收峰，其中峰I具有抑菌活性；
c、将峰I收集液浓缩上样于Cellulose DEAE-52阴离子交换柱，分别用含0mol/L、0.1mol/L、0.4mol/L、1.0mol/L NaCl的pH为7.0的0.05mol/L磷酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为1ml/min，在紫外光OD 280nm处检测，分别在0.1mol/L、0.4mol/L、1.0mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱浓度下各出现吸收峰，其中在0.4mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱下来的峰物质具有抑菌活性；
d、再将在0.4mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱下来的峰物质收集液浓缩上样于FPLC300SB-C18反相半制备柱，采用梯度洗脱：0-15min 5％乙腈，15-45min 40％乙腈，45-75min 80％乙腈，75-90min 95％乙腈，流速1.5ml/min，在紫外光OD 280nm处检测，其中34-37min的收集液具有抑菌活性，经浓缩后用Tricine-SDS-PAGE检测，已经达到电泳纯，即只有1个条带；34-37min的收集液即为纯化获得的保藏号为CGMCC No.1564的内生枯草芽孢杆菌Jaas ed1的胞外抗菌脂肽。
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