CN104322562B

CN104322562B - 一种脂肽‑高岭土复合生防制剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104322562B
Application number: CN201410473482.2A
Authority: CN
Inventors: 吴彥良; 冉炜; 朱震; 孙立飞; 余光辉; 沈其荣
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2014-09-16
Filing date: 2014-09-16
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2034-09-16
Also published as: CN104322562A

Abstract

本发明属于微生物源农药制备领域，提供一种脂肽‑高岭土复合生防制剂及其制备方法和应用。该复合生防制剂由脂肽、剥片高岭土和水组成，其中，脂肽和剥片高岭土的质量百分比分别为0.1％、2％。该脂肽‑高岭土复合生防制剂的制备过程包括：(1)脂肽粉末制备(2)剥片高岭土制备(3)脂肽‑高岭土复合生防制剂获得。本发明提供的脂肽‑高岭土复合生防制剂中，剥片高岭土与脂肽的结合提高了脂肽的稳定性，延长了脂肽的作用时间，有效地提高防治番茄青枯病的防治效果，促进了番茄植株生长。解决了现有技术中脂肽生产成本高、产量低、稳定性差、发挥效果时间短，其有效开发利用受限制等问题，提高了由生物复合材料制成的番茄青枯病防治剂效果。

Description

一种脂肽-高岭土复合生防制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物源农药制备领域，涉及一种脂肽-高岭土复合生防制剂及其制备方法和应用。

背景技术

番茄青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种全世界广泛分布的细菌性土传病害。发病初期，植株下部叶片的叶柄出现下垂，而后叶片渐次枯萎，同时茎部出现不定根，植株快速萎蔫并逐渐枯死。轻则减产20％～40％，严重时达60％以上甚至绝收。茄科雷尔氏菌存在较大的遗传变异，目前尚无有效的化学防治方法。常用的防治措施如抗性育种、田间清除、作物轮作、综合管理等由于青枯病病害系统的复杂性而成效甚微。

芽孢杆菌(Bacillus spp.)具有复杂的生理学性质多样性和底物多样性，能够产生高耐性芽孢和各种抑菌物质如多肽类和脂肽类及细菌素类抗生素。脂肽类表面活性剂作为一种生物表面活性剂(biosurfactant)，能够改变细胞膜通透性，具有广谱的抗真菌和抑制部分细菌的活性，研究表明，某些脂肽类物质对立枯丝核菌和青枯菌表现出很好的拮抗活性，可以利用其防治青枯病，但是其化学不稳定性，物理和酶不稳定性，限制了脂肽类表面活性剂相关产品的开发和应用。同时，较高的生产成本和较低的产量也限制了脂肽的工业化生产。

近年来，生物材料与有机膜、有机颗粒、无机粘土材料之间相互作用制备复合材料，在学术界已经引起了相当大的兴趣，特别是无机纳米亚微米级材料结构丰富新颖、热稳定性优良、表面活性可调节、价格低廉，生物材料和无机纳米材料的有效复合，能够很好维持生物大分子的结构，并且有可能会赋予生物物质新的优异特性。高岭土属于1∶1型的硅铝酸盐粘土矿物，其晶架结构都有一层硅氧片和一层水铝片重叠而成，高岭土可用作化肥、农药、杀虫剂的载体，因为其颗粒表面具有微细孔隙，有一定的吸附性。但是，普通高岭土的比表面积不够大，虽具有粘土矿物特有吸附性、分散性、流变性、多孔性和表面酸性，但没有纳米亚微米级材料的表面效应，活性中心不够多，相应的吸附性、分散性、流变性会差很多，因此，与生物材料不能有效复合，形成的复合材料效果会大打折扣。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中脂肽生产成本高、产量低、稳定性差、发挥效果时间短，其有效开发利用受到限制的问题，同时，也是为了解决生物复合材料复合程度不高，由生物复合材料制成的番茄青枯病防治剂效果不好的问题，提供一种通过农业废弃物固体变温发酵生产脂肽，以剥片高岭土为无机载体，开发研制出一种防治番茄青枯病的新型生防制剂的制备方法及该种生防制剂。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

1.本发明提供一种脂肽-高岭土复合生防制剂，该生防制剂由脂肽、剥片高岭土和水组成。

2.上述1提供的脂肽-高岭土复合生防制剂，该生防制剂中脂肽的质量百分比为0.1％、剥片高岭土的质量百分比为2％，其余为水。

3.上述2提供的脂肽-高岭土复合生防制剂，其中，脂肽由农业废弃物固体变温发酵所得，对番茄青枯病病原菌具有抑制作用。

4.上述3提供的脂肽-高岭土复合生防制剂，其中，所述农业废弃物为黄豆粉和秸秆。

5.本发明还提供上述1-4任一项提供脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(1)脂肽粉末制备：发酵种子液制备；发酵基质准备；接种发酵种子液；发酵；从发酵后基质中获得脂肽粉末；(2)剥片高岭土制备：高岭土与水、尿素混合，加热同时快速搅拌，得处理好的高岭土-尿素插层复合物；将高岭土-尿素插层复合物加入稀硫酸溶液中，混合均匀后进行超声处理，离心分离后用无水乙醇清洗，干燥，研磨得剥片高岭土；(3)脂肽-高岭土复合生防制剂获得：将上述获得的脂肽粉末和剥片高岭土进行混合均匀，摇床振荡，得到脂肽-高岭土复合生防制剂。

6.上述5提供的脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法，具体包括如下步骤(1)脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株XZ-173(保藏号CGMCC NO.4160)划线于LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，扩大培养，获得发酵种子液；称取4.5～6kg黄豆粉，3～4.5kg秸秆，0.15～0.2kg淀粉和0.15～0.2kg酵母提取物，放入发酵罐中，加入1～2L无机盐溶液，调节

基质pH为7～8，保证含水率为40％～60％，充分混匀基质，灭菌待用；待发酵罐内温度冷却并保持稳定后，在无菌条件下按5％～25％(v/w)的量接入种子液，搅拌均匀，调节罐内相对湿度大于80％，通气量0.1～0.5vvm和罐压0.01～0.05Mpa，前24h温度设为25～40℃进行发酵，24h后将温度设为28～40℃发酵16～24h；称取发酵后的基质与水混合，室温振荡1～2h，离心去除不溶物质，调节上清液pH为1～3，出现白色絮状沉淀，低温静置过夜，然后离心收集沉淀，沉淀用有机溶剂进行抽提，旋转蒸发去除有机溶剂，残留物用水溶解并调pH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；

(2)剥片高岭土制备：将过200目筛的高岭土分别加入其重量4％～15％的水和其重量4％～15％的尿素，然后在90～100℃下加热同时快速搅拌1～24h，获得高岭土-尿素插层复合物；取处理好的高岭土-尿素插层复合物按0.25％～4％(w/v)的量加到稀硫酸溶液中，混合均匀后用超声波清洗器进行超声处理，处理过程温度为60～80℃，持续时间为10～30min，离心后沉淀用无水乙醇清洗数遍，干燥后研磨即得剥片高岭土；

(3)脂肽-高岭土复合生防制剂获得：向水中依次加入脂肽和剥片高岭土，搅拌摇匀后在摇床上以20～40℃，150～250rpm振荡10～30h，即得到脂肽-高岭土复合生防制剂。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株XZ-173，在2010年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC 4160，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

7.进一步地，上述6提供的脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法，该制备方法具体包括如下步骤(1)脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株XZ-173划线于LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，在30℃，170rpm的条件下培养24h，获得发酵种子液；称取5.67kg黄豆粉，3.67kg秸秆，0.17kg淀粉和0.18kg酵母提取物，放入50L发酵罐中，加入1L无机盐溶液，调节基质pH为7.5，保证含水率为55％，将转速设为50～70rpm搅拌60～80min充分混匀基质，灭菌；其中，无机盐溶液包括(g/L)：KH₂PO₄ 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.5，KCl 0.5，L-苯丙氨酸2×10^-3，MnSO₄5×10^-3，CuSO₄ 0.16×10^-3，FeSO₄ 0.15×10^-3；待发酵罐内温度冷却并保持稳定后，在无菌条件下按10％(v/w)的量接入种子液，搅拌均匀，调节罐内相对湿度大于80％，通气量0.1～0.5vvm和罐压0.01～0.05Mpa，前24h温度设为30℃进行发酵，24h后将温度设为37℃发酵20h；称取一定量发酵后的基质与水按1∶10(w/v)的比例混合，室温振荡1h，离心去除不溶物质，在上清液中添加HCl至pH为2.0，出现白色絮状沉淀，4℃静置过夜，再以10000rpm离心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烷进行抽提，旋转蒸发去除有机溶剂，残留物用水溶解并调pH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；

(2)剥片高岭土制备：将过200目筛的高岭土分别加入其重量10％的水和其重量10％的尿素，然后在95℃下加热同时快速搅拌1h，获得高岭土-尿素插层复合物；取处理好的高岭土-尿素插层复合物1g加入100ml 1mol/L的硫酸溶液中，混合均匀后用超声波清洗器进行超声处理，处理过程温度为80℃，持续时间为15min，离心后沉淀用无水乙醇清洗2～3遍，60℃干燥后，研磨即得剥片高岭土；

(3)脂肽-高岭土复合生防制剂获得：向水中依次加入脂肽和剥片高岭土，搅拌摇匀后在摇床上以30℃，170rpm振荡24h，即得到脂肽-高岭土复合生防制剂。

8.本发明还提供上述1-4任一项提供的脂肽-高岭土复合生防制剂在防治番茄青枯病上的应用。

9.本发明还提供一种防治番茄青枯病的防治剂，包括上述1-4任一项提供的脂肽-高岭土复合生防制剂。

10.本发明还提供由上述5-7任一项所述方法制备的脂肽-高岭土复合生防制剂在防治番茄青枯病上的应用。

本发明的有益效果：

1.本发明制备脂肽-高岭土复合生防制剂的原料之一，即剥片高岭土是将高岭土经过插层剥离后形成的，其比表面积增大，既具有粘土矿物特有吸附性、分散性、流变性、多孔性和表面酸性，又具有纳米亚微米级材料的表面效应，出现许多活性中心。经过红外光谱检测，剥片高岭土与脂肽有效结合在一起，很好地维持了脂肽结构，并且更好地发挥了脂肽的生物特性。经过试验，本发明提供的脂肽-高岭土复合生防制剂对番茄青枯病的防治效果均明显高于单独使用脂肽溶液或者高岭土-脂肽复合液，说明脂肽-高岭土复合生防制剂中剥片高岭土与脂肽的结合能够更好地提高脂肽的稳定性，延长脂肽的作用时间，该脂肽-高岭土复合生防制剂能有效地提高番茄青枯病的防治效果。

2.本发明制备的脂肽-高岭土复合生防制剂经过试验，可以促进番茄植株地上部和地下部的生长，与未经处理的对照组CK相比具有显著差异，说明该脂肽-高岭土复合生防制剂在防治番茄青枯病的同时能够促进番茄植株生长。

3.本发明制备脂肽-高岭土复合生防制剂原料之一脂肽类物质是利用固体发酵农业废弃物来生产的，本发明采用黄豆粉和秸秆混合物作为主要固体发酵基质，有效提高了脂肽类物质的产量，节约了生产成本，降低了环境压力并提高了资源的利用率。

4.本发明生产的脂肽-高岭土复合生防制剂具有环境污染小，低毒、安全，生产成本低，防治效果好的优点，适合番茄种植区域大面积使用。

附图说明

图1高岭土扫描电镜(SEM)图

图2剥片高岭土扫描电镜(SEM)图

图3样品红外光谱(FT-IR)图，图中a代表脂肽-高岭土复合生防制剂离心干燥后的粉末，b代表剥片高岭土粉末

图4脂肽-高岭土复合生防制剂对番茄青枯病病原菌的抑菌效果图

图5温室防治试验各处理病情指数(DI)变化图

图6温室防治试验各处理植株株高，不同小写字母表示显著差异(p＜0.05)

图7温室防治试验各处理地上部鲜重，不同小写字母表示显著差异(p＜0.05)

图8温室防治试验各处理地下部鲜重，不同小写字母表示显著差异(p＜0.05)

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

黄豆粉和秸秆，先在60℃烘箱中烘12h去除大部分水分，磨样、粉碎，过20目筛，过筛后的样品再放入烘相中60℃烘48h至恒重，保存待用。

实施例1

脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法：(1)脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株XZ-173(保藏号CGMCCNO.4160)划线于LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，在30℃，170rpm的条件下培养24h，获得发酵种子液；称取4.5kg黄豆粉，3kg秸秆，0.15kg淀粉和0.15kg酵母提取物，放入50L发酵罐中，加入1L无机盐溶液，调节基质pH为7，保证含水率为40％，将转速设为50rpm搅拌60min充分混匀基质，灭菌；其中，无机盐溶液包括(g/L)：KH₂PO₄ 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.5，KCl 0.5，L-苯丙氨酸2×10^-3，MnSO₄ 5×10^-3，CuSO₄ 0.16×10^-3，FeSO₄ 0.15×10^-3；待发酵罐内温度冷却并保持稳定后，在无菌条件下按5％(v/w)的量接入种子液，搅拌均匀，调节罐内相对湿度大于80％，通气量0.1vvm和罐压0.01Mpa，前24h温度设为25℃进行发酵，24h后将温度设为28℃发酵16h；称取发酵后的基质与水按1∶10(w/v)的比例混合，室温振荡1h，离心去除不溶物质，在上清液中添加HCl至pH为1，出现白色絮状沉淀，低温静置过夜，再以10000rpm离心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烷进行抽提，旋转蒸发去除有机溶剂，残留物用水溶解并调pH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；

(2)剥片高岭土制备：将过200目筛的高岭土分别加入其重量4％的水和其重量4％的尿素，然后在90℃下加热同时快速搅拌1h，获得高岭土-尿素插层复合物；取处理好的高岭土-尿素插层复合物按0.25％(w/v)的量加到稀硫酸溶液中，混合均匀后用超声波清洗器进行超声处理，处理过程温度为60℃，持续时间为10min，离心后沉淀用无水乙醇清洗数遍，60℃干燥后，研磨即得剥片高岭土；

(3)脂肽-高岭土复合生防制剂获得：向水中依次加入脂肽和剥片高岭土，搅拌摇匀后在摇床上以20℃，150rpm振荡10h，即得到脂肽-高岭土复合生防制剂。

实施例2

脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法：(1)脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株XZ-173划线于LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，在30℃，170rpm的条

件下培养24h，获得发酵种子液；称取6kg黄豆粉，4.5kg秸秆，0.2kg淀粉和0.2kg酵母提取物，放入50L发酵罐中，加入2L无机盐溶液，调节基质pH为8，含水率为60％，将转速设为70rpm搅拌80min充分混匀基质，灭菌；其中，无机盐溶液包括(g/L)：KH₂PO₄ 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.5，KCl 0.5，L-苯丙氨酸2×10^-3，MnSO₄ 5×10^-3，CuSO₄0.16×10^-3，FeSO₄ 0.15×10^-3；待发酵罐内温度冷却并保持稳定后，在无菌条件下按25％(v/w)的量接入种子液，搅拌均匀，调节罐内相对湿度大于80％，通气量0.5vvm和罐压0.05Mpa，温度设为40℃发酵48h；称取发酵后的基质与水按1∶10(w/v)的比例混合，室温振荡2h，离心去除不溶物质，在上清液中添加HCl至pH为3，出现白色絮状沉淀，低温静置过夜，再以10000rpm离心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烷进行抽提，旋转蒸发去除有机溶剂，残留物用水溶解并调pH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；

(2)剥片高岭土制备：将过200目筛的高岭土分别加入其重量15％的水和其重量15％的尿素，然后在100℃下加热同时快速搅拌24h，获得高岭土-尿素插层复合物；取处理好的高岭土-尿素插层复合物按4％(w/v)的量加到稀硫酸溶液中，混合均匀后用超声波清洗器进行超声处理，处理过程温度为80℃，持续时间为30min，离心后沉淀用无水乙醇清洗数遍，60℃干燥后，研磨即得剥片高岭土；

(3)脂肽-高岭土复合生防制剂获得：向水中依次加入脂肽和剥片高岭土，搅拌摇匀后在摇床上以40℃，250rpm振荡30h，即得到脂肽-高岭土复合生防制剂。

实施例3

脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法：(1)脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株XZ-173划线于LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，在30℃，170rpm的条件下培养24h，作为发酵种子液；称取5.67kg黄豆粉，3.67kg秸秆，0.17kg淀粉和0.18kg酵母提取物，放入50L发酵罐中，加入1L无机盐溶液，调节基质pH为7.5，含水率为55％，将转速设为70rpm搅拌60min充分混匀基质，灭菌；其中，无机盐溶液包括(g/L)：KH₂PO₄ 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.5，KCl 0.5，L-苯丙氨酸2×10^-3，MnSO₄ 5×10^-3，CuSO₄ 0.16×10^-3，FeSO₄ 0.15×10^-3；待发酵罐内温度冷却并保持稳定后，在无菌条件下按10％(v/w)的量接入种子液，搅拌均匀，调节罐内相对湿度大于80％，通气量0.3vvm和罐压0.03Mpa，前24h温度设为30℃进行发酵，24h后将温度设为37℃发酵20h；称取发酵后的基质与水按1∶10(w/v)的比例混合，室温振荡1h，离心去除不溶物质，在上清液中添加HCl至pH为2.0，出现白色絮状沉淀，4℃静置过夜，再以10000rpm离心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烷进行抽提，旋转蒸发去除有机溶剂，残留物用水溶解并调pH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；

(2)剥片高岭土制备：将过200目筛的高岭土分别加入其重量10％的水和其重量10％的尿素，然后在95℃下加热同时快速搅拌1h，获得高岭土-尿素插层复合物；取处理好的高岭土-尿素插层复合物1g加入100ml 1mol/L的硫酸溶液中，混合均匀后用超声波清洗器进行超声处理，处理过程温度为80℃，持续时间为15min，离心后沉淀用无水乙醇清洗3遍，60℃干燥后，研磨即得剥片高岭土；

实施例4

采用超纯水、高岭土(化学纯)、尿素(分析纯)按照实施例3的制备方法得到脂肽、剥片高岭土和脂肽-高岭土复合生防制剂。

1、结构表征

1.1扫描电子显微镜(SEM)分析

高岭土、剥片高岭土取少量待测粉末样品喷金处理后使用日本日立公司S-4800场发射扫描电子显微镜观察样品的形貌尺寸。如图1、图2所示，高岭土颗粒堆垛现象严重，片层较厚，经过插层剥离之后形成的剥片高岭土，颗粒堆垛现象没那么严重，小颗粒增多，片层变薄，而且剥片高岭土的片层结构依然完好。

1.2红外光谱(FT-IR)分析

脂肽-高岭土复合生防制剂离心分离后，用超纯水洗涤沉淀数次，直至洗出的溶液中用HPLC未检测到脂肽，然后在60℃下干燥，研磨后将粉末及剥片高岭土粉末用KBr压片，采用Thermo Fisher IS10红外光谱仪分析主要官能团的变化，波数范围500～4000cm^-1。如图3所示，曲线(a)和(b)比较可知，脂肽-高岭土复合生防制剂经过处理之后得到的粉末在1455cm^-1、1540cm^-1、1678cm^-1、1740cm^-1、3567cm^-1处出现了一些新的小峰，分别为脂肪酸链中C-H、N-H、酰胺结构中C＝O、羧酸中C＝O、氢键连接的O-H的特征吸收，表明脂肽-高岭土复合生防制剂处理后得到的粉末为脂肽与剥片高岭土复合物，进一步表明脂肽-高岭土复合生防制剂中脂肽与剥片高岭土结合在一起。

2、脂肽-高岭土复合生防制剂对番茄青枯病病原菌的抑制活性检测

2.1番茄青枯病病原菌菌液制备

在TTC平板上挑取病原菌菌株，接入液体NA培养基中，30℃，170rpm摇床培养至对数期，用无菌水将菌悬液稀释至10⁶～10⁷cfu/ml，即制得试验用病原菌菌悬液。

2.2抑制活性检测

将剥片高岭土121℃，20min灭菌，脂肽溶液过0.22μm滤膜除菌后，加入无菌水在无菌条件下制备脂肽-高岭土复合生防制剂。将病原菌菌悬液200μl均匀涂布于NA培养基平板上，然后吸取100μl生防制剂注入平板上牛津杯中，30℃培养24h，观察抑菌状况并测量抑菌圈大小，重复3次，测定抑菌圈大小均在16.37±0.72(mm)范围内。如图4所示，该脂肽-高岭土复合生防制剂对番茄青枯病病原菌具有较强的抑制效果，抑菌圈明显，初步说明该脂肽-高岭土复合生防制剂可以用来防治番茄青枯病。

实施例5

按照实施例3的制备方法得到脂肽、剥片高岭土和脂肽-高岭土复合生防制剂。

1、高岭土-脂肽复合液的制备

向水中依次加入脂肽和高岭土，搅拌摇匀后在摇床上以30℃，170rpm振荡24h，即得到高岭土-脂肽复合液。该复合液中脂肽的质量百分比为0.1％、高岭土的质量百分比为2％，其余为水。

2、脂肽-高岭土复合生防制剂对番茄青枯病的温室防治试验

防治试验在江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室温室大棚内进行，实验设7个处理，方案如下：(1)CK，番茄幼苗不做任何处理，作为对照；(2)A1，取1mg/mL的脂肽溶液均匀喷施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部，整个处理共喷施300mL；(3)A2，取10mL 1mg/mL的脂肽溶液灌入每株番茄幼苗根部；(4)B1，取高岭土-脂肽复合液均匀喷施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部，整个处理共喷施300mL；(5)B2，取10mL高岭土-脂肽复合液灌入每株番茄幼苗根部；(6)C1，取脂肽-高岭土复合生防制剂均匀喷施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部，整个处理共喷施300mL；(7)C2，取10mL脂肽-高岭土复合生防制剂灌入每株番茄幼苗根部。每个处理30盆，每盆装2kg土，施入等量氮、磷、钾化肥(包括：尿素、过磷酸钙、氯化钾)，每盆移栽1株番茄幼苗，

移栽7天后在土中灌入番茄青枯病病原菌菌悬液，使病原菌浓度达到10⁶cfu/g土以上，灌菌24h后对番茄幼苗按上述7个处理方案进行处理1次。

在处理后第10天、20天、30天、40天按病情分级标准，记录发病情况，统计各处理病情指数(DI)和防治效果，并统计处理40天后各处理植株株高和地上部地下部鲜重。

病情分级标准及病情指数计算方法如下：

0级：植株正常；

1级：植株25％以下的叶片表现为萎蔫症状；

2级：植株26％～50％的叶片表现为萎蔫症状；

3级：植株51％～75％的叶片表现为萎蔫症状；

4级：植株76％以上叶片表现为萎蔫症状或植株死亡。

病情指数(DI)＝[∑(各病级植株数×各级代表数值)]/(调查总株数×最高级别数值)×100％

防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

3、结果与分析：

如表1和图5所示，随着番茄植株的生长，与CK相比，其他各处理的病情指数都有所降低，说明脂肽是防治番茄青枯病的良好物质。处理后第40天采取喷施和灌施脂肽-高岭土复合生防制剂的病情指数很低，相对防治效果分别为87.76％和82.32％，相较于其他处理的防治效果具有显著差异，说明脂肽-高岭土复合生防制剂中剥片高岭土与脂肽的结合能够更好地提高脂肽的稳定性，延长脂肽的作用时间，该脂肽-高岭土复合生防制剂能有效地防治番茄青枯病。

如图6、7和8所示，处理40天后，采取喷施和灌施脂肽-高岭土复合生防制剂的植株株高，地上部和地下部鲜重均比其他处理高，且与CK相比具有显著差异，说明该脂肽-高岭土复合生防制剂在防治番茄青枯病的同时能够促进番茄植株生长。

表1不同处理对番茄青枯病的温室防治效果

注：不同小写字母表示显著差异(p＜0.05)

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims

1.脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法，其特征在于：该方法具体包括如下步骤（1）脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株XZ-173划线于LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，扩大培养，获得发酵种子液；称取4.5~6 kg黄豆粉，3~4.5 kg秸秆，0.15~0.2 kg淀粉和0.15~0.2 kg酵母提取物，放入发酵罐中，加入1~2 L无机盐溶液，调节基质pH为7~8，保证含水率为40%~60%，充分混匀基质，灭菌待用；待发酵罐内温度冷却并保持稳定后，在无菌条件下按体积/质量为5%~25%的量接入种子液，搅拌均匀，调节罐内相对湿度大于80%，通气量0.1~0.5 vvm和罐压0.01~0.05 Mpa，前24 h温度设为25~40 ℃进行发酵，24 h后将温度设为28~40 ℃发酵16~24 h；称取发酵后的基质与水混合，室温振荡1~2 h，离心去除不溶物质，调节上清液pH为1~3，出现白色絮状沉淀，4 ℃静置过夜，然后离心收集沉淀，沉淀用有机溶剂进行抽提，旋转蒸发去除有机溶剂，残留物用水溶解并调pH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；

（2）剥片高岭土制备：将过200目筛的高岭土分别加入其重量4%~15%的水和其重量4%~15%的尿素，然后在90~100 ℃下加热同时快速搅拌1~24 h，获得高岭土-尿素插层复合物；取处理好的高岭土-尿素插层复合物按质量/体积为0.25%~4%的量加到稀硫酸溶液中，混合均匀后用超声波清洗器进行超声处理，处理过程温度为60~80 ℃，持续时间为10~30 min，离心后沉淀用无水乙醇清洗2~3遍，干燥后研磨即得剥片高岭土；

（3）脂肽-高岭土复合生防制剂获得：向水中依次加入脂肽和剥片高岭土，搅拌摇匀后在摇床上以20~40 ℃，150~250 rpm振荡10~30 h，即得到脂肽-高岭土复合生防制剂；

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株XZ-173，在2010年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC 4160，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2.权利要求1所述的脂肽-高岭土复合生防制剂的制备方法，其特征在于：该制备方法具体包括如下步骤（1）脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）菌株XZ-173划线于LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，在30 ℃，170 rpm的条件下培养24 h，获得发酵种子液；称取5.67 kg黄豆粉，3.67 kg秸秆，0.17 kg淀粉和0.18 kg酵母提取物，放入50 L发酵罐中，加入1 L无机盐溶液，调节基质pH为7.5，保证含水率为55%，将转速设为50~70 rpm搅拌60~80 min充分混匀基质，灭菌；其中，无机盐溶液包括：KH₂PO₄ 1.0 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，L-苯丙氨酸 2×10^-3 g/L，MnSO₄ 5×10^-3 g/L，CuSO₄ 0.16×10^-3 g/L，FeSO₄ 0.15×10^-3 g/L；待发酵罐内温度冷却并保持稳定后，在无菌条件下按体积/质量为10%的量接入种子液，搅拌均匀，调节罐内相对湿度大于80%，通气量0.1~0.5 vvm和罐压0.01~0.05 Mpa，前24 h温度设为30 ℃进行发酵，24 h后将温度设为37 ℃发酵20 h；称取一定量发酵后的基质与水按质量/体积为1:10的比例混合，室温振荡1 h，离心去除不溶物质，在上清液中添加HCl至pH为2.0，出现白色絮状沉淀，4 ℃静置过夜，再以10000 rpm离心20 min收集沉淀，沉淀用二氯甲烷进行抽提，旋转蒸发去除有机溶剂，残留物用水溶解并调pH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；

（2）剥片高岭土制备：将过200目筛的高岭土分别加入其重量10%的水和其重量10%的尿素，然后在95 ℃下加热同时快速搅拌1 h，获得高岭土-尿素插层复合物；取处理好的高岭土-尿素插层复合物1 g加入100 ml 1 mol/L的硫酸溶液中，混合均匀后用超声波清洗器进行超声处理，处理过程温度为80 ℃，持续时间为15 min，离心后沉淀用无水乙醇清洗2~3遍，60 ℃干燥后，研磨即得剥片高岭土；

（3）脂肽-高岭土复合生防制剂获得：向水中依次加入脂肽和剥片高岭土，搅拌摇匀后在摇床上以30 ℃，170 rpm振荡24 h，即得到脂肽-高岭土复合生防制剂。

3.采用权利要求1-2任一项所述方法制备的脂肽-高岭土复合生防制剂在防治番茄青枯病上的应用。