KR100325633B1

KR100325633B1 - 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 가지는 미생물, 이를함유하는 항진균성 미생물 농약제 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100325633B1
Application number: KR1020010008095A
Authority: KR
Inventors: 이기성; 정종상; 고동규; 김용욱; 이영근
Original assignee: 우종일; 동부한농화학 주식회사; 이기성
Priority date: 2001-02-19
Filing date: 2001-02-19
Publication date: 2002-02-25
Also published as: KR20010072767A

Abstract

본 발명은 항진균 활성을 가지는 미생물, 이로부터 생산된 새로운 항진균성 화합물 및 이들을 함유하는 미생물 농약제에 관한 것으로서, 상세하게는 식물 병원성 진균인Mucorspp.(부패병),Pyricularia oryzae(벼도열병),Pythium ultimum(입고병),Rhizoctonia solani(벼문고병),Botryoshaeria dothidea(사과부패병),Bipolaris sorokniana(깨씨무늬병),Botrytis cinerea(잿빛곰팡이병),Colletotrichum gloeosporioides(고추탄저병),Pyricularia grisea(벼도열병),Mycosphaerella melonis(수박덩굴마름병),Phytophthora capsici(고추역병),Alternaria solani(토마토 겹둥근무늬병),Fusarium oxysporum(입고병, 근부병) 또는Sclerotinia sclerotiorum(균핵병) 그리고 동물 병원성 진균인Candida albicans(칸디다증) 등에 특이적으로 항진균 활성 스펙트럼을 가지는 미생물, 그 최적 배양방법 및 이를 함유하는 병원성 진균 방제용 바이오 매트릭스 (bio-matrix) 그리고 상기 미생물로부터 생산되는 다양한 분자량의 항진균성 화합물 또는 폴리펩타이드, 그의 제조방법 및 그의 용도로 구성되며, 상기 미생물은 항진균 활성에 더하여 유기물 분해능, 농약 내성 및 농약 분해능을 지니고 있어 환경 보전 및 정화 작용이 있는 다기능적 농약제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

병원성 진균에 대한 항진균 활성을 가지는 미생물, 이를 함유하는 항진균성 미생물 농약제 및 그의 제조방법{Antifungal microorganism specific for pathogenic fungi, agricultural chemicals containing the same and a process for preparation thereof}

본 발명은 식물 병원성 및 동물 병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 미생물, 이로부터 생산된 항진균 활성물질 및 이들을 함유하는 농약제에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 유기물 분해능, 농약 내성 및 농약 분해능이 있는 항진균 활성을 가지는 미생물, 그 최적 배양방법 및 이를 함유하는 병원성 진균 방제용 바이오 매트릭스 (bio-matrix) 그리고 상기 미생물로부터 생산되는 항진균성 화합물 (화학물질 및 폴리펩타이드) 및 그 제조방법에 관한 것이다.

최근 세계 최대의 농약회사인 몬산토 (Monsanto)사가 화학유기 합성농약의 생산을 중단한다고 선언함으로써 농업분야에 기여할 수 있는 생물공학적 신기술의 개발이 필요하게 되었다. 따라서 농업 생산의 안정성 향상, 환경 보전, 농업 생산물의 부가가치 증진 등 양적, 질적 생산성을 향상시키기 위하여 저공해 천연 생물농약의 개발, 농산물의 안정적 생산 및 쾌적한 환경 보존을 위한 병충해 저항성 작물의 육종, 그리고 농산물 가공 및 이용 기술의 연구 등을 통하여 고부가 가치의 식품 및 의약품 소재를 개발하려는 연구들이 이루어지고 있다.

특히, 환경 보호와 생태계 보전에 관한 그린 라운드 (Green Round) 협약이 국제적 관심의 대상이 되면서, 과다한 농약 등의 남용이 심각한 문제로 대두되고 이를 대체하는 식물 방제용 무공해 농약 (biocide)의 개발이 국제적으로 경쟁이 치열한 핵심 분야로 등장하고 있다. 기존 농약에 의한 환경오염 문제를 극복하기 위하여 생산, 저장 및 적용이 용이하고 병원균을 효과적으로 억제하는 길항 미생물을 선발하고 생물 활성물질을 분리하는 것은 매우 시급한 과제이다. 특히 항진균 활성 물질은 포유동물에 대하여 독성이 기존 농약보다 낮고, 식물에 약해가 없으면서, 활성은 탁월하고 잔류성은 적어서 윤작에도 영향이 없으며 지하수, 토양, 하천수 등을 오염시키지 말아야 한다.

지금까지 개발된 항진균제는 크게 살리실산 (salicilic acid), 알루미늄 염 (aluminum salt), 아연 염 (zinc salt), 요오드, 에탄올, 유기산 (benzoic acid, propionic acid 등)과 같이 표면 감염부위에 직접 작용하는 국소성 제제(nonsystemic agent)와 조직과 기관에 흡수되어 작용하는 전신성 제제 (systemic agent)로 구별된다.

현재 사용되는 전신성 항진균제 계열을 살펴보면, (1) 페놀-에테르 화합물인 그리소풀빈 (griseofulvin,Penicilliumsp.), (2) 폴리엔 계열인 암포테리신 B(amphotericin B, Am B;Streptomyces nodosus), 하마이신 (hamycin,Streptomyces pimprina), 니스타틴 (nystatin,Streptomyces noursei), 나타마이신 (natamycin), (3) 피리미딘 계열인 플루사이토신 (flucytosine, 5FC), (4) 아졸 유도체인 미코나졸 (miconazole, MON), 케토코나졸 (ketoconazole, KET), 플루코나졸 (fluconazole, FLU), 제나코나졸 (genaconazole, GEN), 이트라코나졸 (itraconazole, ITR), 사퍼코나졸 (saperconazole, SAP), (5) 펩타이드 계열인 실로펀진 (cilofungin, CIL), 사라마이세틴 (saramycetin,Streptomices saraceticus), (6) 아릴아민 계열인 터비나핀 (terbinafine, TER), 나프티핀 (naftifine), (7) 몰포린 (morpholines) 계열인 펜프로피모프 (fenpropimorph) 등이 대표적이라 할 수 있다. 그러나 전신성 항진균제는 많은 종류가 보고되고 미생물로부터 생산도 가능하며 그 유도체가 활용되고 있음에도 불구하고, 항진균 활성 스펙트럼 및 독성 등의 많은 문제점이 있다. 따라서 농작물에 가장 큰 폐해를 가져다 주는 식물 병원성 진균류의 방제 뿐 아니라, 의학적으로 진균 감염증 치료에 실용화할 수 있는 저독성, 특이성, 속효성 항진균제의 개발은 무엇보다 시급하다. .

한편, 생물학적 제어 (biological control) 방법을 통하여 질병 억제에 관여하는 미생물 대사산물은 항진균제를 포함하여 시더로포아 (siderophore), NH₃효소, 하이드로겐 사아니드 (hydrogen cyanide) 등을 들 수 있고 이들은 길항적 활성을 보인다. 지금까지 진균류에 대한 생물학적 제어에 활용되는 세균들로는 시더로포아를 생성하는Pseudomonas fluorescens, 균사 성장을 억제하고 암모니아를 발생시키는Enterobacter cloacae,P. ultimum, 뿌리에 감염되어 병원성 진균류를 제어하는P. putida, 잎에 적용되는 길항 세균인P. syringae등이 알려져 있고, 실제로 항진균 활성을 나타내는 천연 항진균제 및 이들 항진균제를 생산하는 세균류들을 생물학적 제어자로서 활용하는 것에 대하여 농약, 약학, 의학 등의 제분야에서 관심이 집중되고 있다.

이에 본 발명자들은 새로운 미생물 농약제제를 개발하기 위하여, 병원성 진균에 항진균 활성을 가지는 미생물을 선별하여 동정하고 그들의 항균 스펙트럼과 이들이 생산하는 항진균 활성물질의 특성을 조사하며, 이를 함유하는 바이오 매트릭스 형태의 미생물 농약제를 제조하여 이들이 유기물 분해능, 농약 내성 및 농약 분해능을 가지므로 환경친화적인 다기능적 농약으로 유용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 가지는 미생물, 이로부터 정제된 항진균성 화합물 및 이를 함유하는 환경친화적인 진균 방제제를 제공함에 그 목적이 있다.

도 1은 본 발명의 항진균 활성 (AF) 세균을 함유하는 바이오 매트릭스 (bio-matrix complex)를 도시화하여 나타낸 것이고,

도 2는 본 발명의Alcaligenes faecalisKL1179 (KCTC 8914P) 균주의 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 나타낸 것이고,

A :Rhizoctonia solani(벼문고병), B :Candida albicans(칸디다증)

도 3은 본 발명의 항진균 활성 세균의 주사전사현미경 사진을 나타낸 것이고,

A :Bacillus subtilisvar.amyloliquefacienceKL1114 (KCTC 8913P);

B :Alcaligenes faecalisKL1179 (KCTC 8914P)

도 4는 본 발명의Bacillus subtilisvar.amyloliquefacienceKL1114 균주가 생성하는 분자량이 530 인 항진균 활성 화합물의 박편 크로마토그램을 나타낸 것이고,

도 5는 상기 KL1114 균주가 생성하는 분자량 5 kDa 인 항진균성 폴리펩타이드의 정제 과정 (A, B) 및 그의 항진균 활성 (C)을 나타낸 것이고,

도 6은 상기 KL1114 균주가 생성하는 분자량 41 kDa 인 항진균성 폴리펩타이드의 정제 과정 (A) 및 그의 항진균 활성 (B)을 나타낸 것이고,

도 7은 다양한 고체 배지에서 유기물 분해능을 나타내는 항진균 활성 세균의 세포외 효소 활성을 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 병원성 진균에 특이적인 항진균활성을 가지는 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물을 탄소원, 질소원 및 인산원을 조절하면서 아미노산 및 비타민을 첨가하여 배양하고, 이로부터 배양 상등액을 얻어 유기용매 추출법과 단백질 침전법 그리고 젤 침투 크로마토그래피 등을 수행함으로써 제조되는, 상기 미생물이 생산하는 항진균 활성을 가지는 화합물을 제공한다. 구체적으로 상기 항진균성 활성물질은 분자량이 530 인 화합물과 3 kDa, 5 kDa, 41 kDa 및 20 kDa 인 항진균성 폴리펩타이드를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 항진균성 화합물을 유효성분으로 하는 병원성 진균을 제어하는 항진균제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물을 함유하는 병원성 진균 방제용 바이오 매트릭스를 제공한다. 구체적으로 병원성 진균 방제용 바이오 매트릭스는 미생물 이외에 식물자원 고분자 재료, 생체고분자 합성 미생물 (biogel), 생체 고분자 (microgel) 및 계면활성제 등으로 구성된다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 가지는 환경친화적인 다양한 미생물을 선별한다.

본 발명은 API 키트 및 다양한 생리생화학적 실험 등을 통하여 최종적으로 16개 균주를 분리하고 국제공인 동정기관에 의뢰하여 균주를 동정한다. 구체적으로Bacillus subtilisvar. amyloliquefaciens로 동정된 KL1114, KL1143, KL1367균주와Alcaligenes faecalis로 동정된 KL1136, KL1137, KL1178, KL1179, KL1188 균주 그리고Pseudomonas aurantiaca로 동정된 KL1314, KL1326 균주는 지금까지 보고되지 않은 새로운 항진균 활성 균주로 확인되었다. 또한, 상기 세균을 대상으로 항진균 활성 스펙트럼을 조사하여 활성 스펙트럼에 따라 균주를 구별한다.

본 발명에서는 이러한 상기 항진균 활성이 탁월한 균주로Bacillus subtilisvaramyloliquefaciensKL1114 (수탁번호 : KCTC 8913P),Alcaligenes faecalisKL1179 (수탁번호 : KCTC 8914P),Pseudomonas aeruginosaKL1121 (수탁번호 : KCTC 8915P) 및Pseudomonas aurantiacaKL1326 (수탁번호 : KCTC 8916P) 등을 선별하여 제공한다.

상기에서 병원성 진균은Mucorspp.(부패병),Pyricularia oryzae(벼도열병),Pythium ultimum(입고병),Rhizoctonia solani(벼문고병),Botryoshaeria dothidea(사과부패병),Bipolaris sorokniana(깨씨무늬병),Botrytis cinerea(잿빛곰팡이병),Colletotrichum gloeosporioides(고추탄저병),Pyricularia grisea(벼도열병),Mycosphaerella melonis(수박덩굴마름병),Phytophthora capsici(고추역병),Alternaria solani(토마토 겹둥근무늬병),Fusarium oxysporum(입고병, 근부병) 또는Sclerotinia sclerotiorum(균핵병) 등을 포함하는 식물 병원성 진균; 및Candida albicans(칸디다증) 등과 같은 동물 병원성 진균을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 항진균 활성 세균이 환경 정화능력이 있는지 알아보기위하여, 유기물 분해능, 농약 분해능 및 농약 내성 등도 조사한다. 그 결과, 상기 항진균 활성 세균은 모두 유기물 분해능이 탁월하고, 특히 상기 KL1114 균주는 글루칸, 전분, 단백질, 셀룰로오즈, 리그닌 분해능력이 다른 균주에 비하여 3배 이상 높으며, KL1105, KL1326 균주는 키틴 분해능과 지질 분해능이 강한 것으로 확인되었다. 또한, 상기 항진균 활성 세균은 제초제, 살균제 및 살충제를 포함한 23종 이상의 농약에 대하여 내성이 있고, 농약을 분해함으로써 여러 종류의 농약에 대하여 저항성을 나타내게 된다. 따라서 본 발명의 항진균 활성 세균은 환경 보전 및 정화에 유용한 환경친화적인 다기능적 항진균제로 이용될 수 있다.

즉 본 발명의 미생물은 항진균 활성에 더하여 유기물 분해능, 농약 내성 및 농약 분해능 등을 가짐으로 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 등의 유효성분으로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 미생물로부터 항진균 활성을 가지는 화합물을 분리한다. 본 발명은 액체질소 트랩법, 분획법, 가스 크로마토그래피 (GC), TIC 및 질량 분석법 (mass spectroscopy) 등으로 항진균 활성이 있는 분자량이 530 인 화합물을 확인하고, 젤 침투 칼럼으로는 분자량이 약 3kDa, 5kDa, 41kDa 및 20 kDa 인 항진균성 폴리펩타이드 등을 정제한다.

또한, 본 발명은 상기 항진균성 폴리펩타이드의 전체 또는 일부 아미노산 서열을 제공하는데, 구체적으로 분자량이 3 kDa인 폴리펩타이드는 서열 1의 아미노산 서열을 포함하고, 분자량이 5 kDa인 폴리펩타이드는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하며, 분자량이 41 kDa인 폴리펩타이드는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하고, 분자량이 20 kDa인 폴리펩타이드는 서열 4의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 폴리펩타이드를 이용하여 펩타이드 시퀀싱 (peptide sequencing)을 한 결과, KL1114 균주에서 발견되는 약 3kDa 폴리펩타이드는Nicotiana,Solanum등에서 생성되는 오스모틴 유사단백질 (Osmotin-like protein, PR-5d)과Citrus의 염기성 키티나제/라이소자임 (basic chitanase/lysozyme) 등과 유사하고, 5kDa 폴리펩타이드는 리보좀 단백질과 상동성을 나타내며, 41kDa 단백질은 플라젤린 (flagellin)의 N-말단과 상동성을 가진다. 또한, KL1326 균주의 20kDa 폴리펩타이드는Pseudomonas syringae의 주요 분비단백질인 오토라이신 (autolysin) 또는 DNase 와 상동성을 가진다.

또한, 상기 항진균성 폴리펩타이드의 일부 아미노산 서열을 이용하여 그 유전자를 분리하고 이를 이용하여 재조합 식물체를 제조하면 항진균성 형질전환 식물체도 제조할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 항진균 활성 미생물 및 항진균성 화합물을 대량 생산하기 위하여, 미생물 배지 조성 중 탄소원, 질소원, 인산원 및 첨가 비타민 등을 조절하면서 상기 균주를 배양하여 항진균 활성물질이 생산되는 최적 조건을 조사한다. 포도당을 제외한 탄소원으로 KL1114 균주의 경우는 락토스와 만니톨을 사용하는 것이 바람직하고, KL1326 균주의 경우는 과당, 갈락토스, 글리세롤을 사용하는 것이 바람직하며, 질소원으로는 펩톤과 이스트 추출물을 사용하는 것이 바람직하고, 특히 KL1114 균주의 경우는 트립톤을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 인산원의 경우는 농도에 따라 균주 성장이 비례하기는 하지만 0.5mM 이상의 농도에서는 성장에 따라 차이가 없고, 다만 아미노산으로 아르기닌, 라이신을 사용하는 것이 항진균 활성물질을 높게 생산하는데 바람직하다.

또한, 본 발명의 항진균 활성 균주는 식물체의 성장에 영향을 주지 않는 것을 종자발아율을 측정하여 조사한다. 상기 항진균 활성 세균은 식물종자 발아율을 전혀 저해하지 않는 것으로 나타나 미생물 농약제로 뿐만 아니라 종자 피막화로 저장 및 보존에도 유용하다.

또한, 본 발명은 식물자원 고분자 재료, 미생물 기원 생체고분자 (microgel), 생체고분자 합성 미생물의 세포 자체 등을 적절히 혼합하여 이루어지는 병원성 진균 방제용 바이오 매트릭스를 제공한다.

이 때 식물자원 고분자 재료로는 시금치가루, 양배추가루, 생현미, 도토리묵가루, 알파콘, 미역가루, 신선초가루, 쑥가루, 생율무가루, 다시마가루, 녹두가루, 마가루, 팥가루, 밤가루, 미숫가루, 솔잎검정콩가루 또는 당근가루 등을 사용하고, 생체 고분자는 뮤코폴리사카라이드 (mucopoly-saccharide) 또는 폴리-베타-하이드록시알카노에이트 등을 사용하며, 미생물로는 질소 고정 세균인Rhizobium loti, Rhizobium meliloti, Rhizobium japonicum또는 남조류 (cyanobacteria) 등을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 바이오 매트릭스는 상기 조성에 더하여 질석, 진흙, 알긴산, 키틴, 굴조개껍질, 과일껍질건조분말, 옥수수대/왕겨/톱밥 태운 가루 등, 각종 추출물, 펩톤, 트립톤, 당류, 무기염류, 비타민, 아미노산 또는 플라보노이드 (flavonoid) 등을 더 포함할 수 있다.

상기 바이오 매트릭스에서 플라보노이드는 항진균 활성 증진보조제로서 사용된다 (Letters in Applied Microbiology. 26: 363-366, 1998).

또한, 상기 바이오매트릭스는 항진균 활성 세균을 식물잎에 잘 부착되거나 토양에서 잘 분해되게 하는 코팅 응집물질을 사용한다. 구체적으로 항진균 활성 세균의 코팅 응집물질로는 남조류 (cyanobacteria)가 수생 환경으로 방출하는 응집물질 (bioflocculants) 등을 사용하는 것이 바람직하고, 특히Anabaenasp. PC-1 과Anabaenasp. N-1444 균주를 사용하는 것이 응집활성이 강한 세포외 (extracellular) 응집물질을 얻는데 유리하다.

상기 바이오 매트릭스는 항진균 활성 세균의 생존유지기간, 생존발아율, 항진균 활성 유지, 항진균 물질생성능력이 우수하여 모든 항진균 활성 세균에 적용하여 미생물 농약, 미생물 제제의 피막화 물질, 미생물 담체 및 종자 코팅제 등으로 유용하게 사용될 수 있다. 이 외에도 상기 바이오 매트릭스는 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 항진균성 화합물이 농약제로 이용되기 위해서 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체 (carrier), 부형제 (forming agent), 희석제 (diluent) 등과 혼합하여 다양한 제형으로 제조되어 사용될 수 있다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 항진균 활성 균주의 선별

본 발명은 식물 병원성 진균에 강한 항진균 활성을 나타내는 113개 균주를 우선 분리하고 이중 52개 균주를 다시 API 키트 등을 사용하여 22개 균주로 선별한 다음 이들 균주를 이용하여 추가적으로 약 80여가지 이상의 생리생화학적 실험을 수행하고 최종적으로 16개 균주 (KL1112, 1114, 1121, 1136, 1137, 1143, 1178, 1179, 1188, 1314, 1321, 1326, 1330, 1367, 1105, KLP21)에 대한 동정을 국제공인 동정기관인 네덜란드의 클루이베르 실험실 (Kluyver laboratory, Faculty of Chemical Technology and Material Science)에 의뢰하였다.

그 결과, 이들 균주들 중B. subtilisvar.amyloliquefaciens로 동정된 KL1114, KL1143, KL1367 균주와A. faecalis로 동정된 KL1136, KL1137, KL1178, KL1179, KL1188 균주 그리고P. aurantiaca로 동정된 KL1314, 1326 균주는 현재까지 국내외적으로 보고된 바가 전혀 없는 항진균 활성을 가지는 새로운 균주로 확인되었다.

이들 균주는 ATCC, KCTC 공시 균주들과 균주특성에 있어 여러 가지 형질이달랐을 뿐아니라, 항진균 활성이 전혀 다르게 나타났다. 즉, 공시 균주들은 항진균활성이 없었다. 따라서 현재 이들 16개 균주들 중 항진균 활성과 항진균 활성의 특이성 그리고 균주의 특성을 고려하여 새로운 4개의 균주 KL1114, KL1179, KL1121, 및 KL1326 를 선별하였다.

항진균 활성을 가지는 균주의 동정 결과 및 기탁번호

균주	과학적 명명법	기탁번호 (KCTC)
KL1112	Bacillus cereus
KL1114	Bacillus subtilisvaramyloliquefaciens	KCTC 8913P
KL1121	Pseudomonas aeruginosa	KCTC 8915P
KL1136	Alcaligenes faecalis
KL1137	Alcaligenes faecalis
KL1143	Bacillus subtilisvaramyloliquefaciens
KL1178	Alcaligenes faecalis
KL1179	Alcaligenes faecalis	KCTC 8914P
KL1188	Alcaligenes faecalis
KL1105	Serratia marcescens
KLP21	Serratia marcescens
KL1314	Pseudomonas aurantiaca
KL1321	Bacillus subtilis	KCTC 8916P
KL1326	Pseudomonas aurantiaca
KL1330	Bacillus subtilis
KL1367	Bacillus amyloliquefaciens

<실시예 2> 항진균 활성 균주의 활성 분석

상기 실시예 1 에서 분리, 동정된 항진균 활성 세균들은 동일한 학명일지라도 균주간에 콜로니 형태, 색소형성 유무, 유기물 분해능, 농약 분해능, 항진균 활성 스펙트럼 등에 있어서 상당한 차이가 있었다.

(2-1) 항진균 활성 스펙트럼

우선 식물 병원성 진균류 6종Mucor sp., Fusarium oxysporum cucumerium, Rhizoctonia solani, Botrys cinerea, Collectotrichum gloeosporiodes, Pyricularis oryzae등과 동물 병원성 균주Candida albicans에 대한 항진균 활성은 진균류가 도말된 PDA (Dipco Co.) 배지에 종이 디스크 (직경 6mm)을 이용하여 영양 배지에서 전배양된 세포 배양액을 접종하고 30℃에서 2∼3일간 배양함으로 조사하였다. 상기에서 선별한 세균을 대상으로 항진균 활성 스펙트럼을 조사하여 다시 많은 공시 식물 병원성 진균류를 대상으로 항진균 활성 스펙트럼을 분석한 결과, 광범위 활성 스펙트럼을 보인 KL1114, KL1143, KL1367 균주와 특이적인 좁은 범위의 활성 스펙트럼을 보인 세균군이 확실하게 구별됨을 확인하였다.

항진균 활성 세균의 항진균 활성 스펙트럼

항진균 활성

C.A

M.S

P.O

P.U

R.S

B.D

B.S

B.C

C.G

P.G

M.M

P.C

A.S

F.O

S.S

KL1112

○

●

○

KL1114

◎

●

◎

●

KL1121

◎

●

KL1136

○

KL1137

●

◎

○

KL1143

◎

●

KL1178

●

○

◎

KL1179

●

○

●

○

KL1188

●

KL1314

○

●

◎

●

○

●

◎

KL1321

○

◎

●

○

◎

●

KL1326

○

◎

●

◎

●

KL1330

○

◎

●

KL1367

○

◎

●

○

●

◎

●

KL1105

◎

○

◎

○

◎

KLP21

○

●

○

● : 매우 우수 ; ◎ : 우수 ; ○ : 약간C. A :Candida albicans, M. S :Mucorspp.(부패병),P. O :Pyricularia oryzae(벼도열병), P. U :Pythium ultimum(입고병),R. S :Rhizoctonia solani(벼문고병), B. D :Botryoshaeria dothidea(사과부패병),B. S :Bipolaris sorokniana(깨씨무늬병), B. C :Botrytis cinerea(잿빛곰팡이병),C. G :Colletotrichum gloeosporioides(고추탄저병),P. G :Pyricularia grisea(벼도열병), M. M :Mycosphaerella melonis(수박덩굴마름병),P. C :Phytophthora capsici(고추역병),A. S :Alternaria solani(토마토 겹둥근무늬병),F. O :Fusarium oxysporum(입고병, 근부병), S. S :Sclerotinia sclerotiorum(균핵병)

특히 KL1114 균주의 경우 일정한 성장 시기에 도달하면 라이시스 (lysis)되고 일부 세포가 다시 성장을 재개하는 것이 관찰되었는데, 투사 전자현미경 (TEM)으로 촬영한 결과에서 바이러스 입자가 발견됨으로 KL1114 균주는 바이러스에 감염된 세포 (lyogenized cell) 상태로 존재함을 확인하였다. 실제로 상기 KL1114 균주는 동일한 학명의 KL1143, KL1367 균주에 비하여 항진균 활성과 항진균 스펙트럼이 월등히 우수한 것으로 나타나는데, 이는 바이러스에 의하여 라이시스가 일어날 때 세포 안에서 합성이 진행되거나 미처 분비되지 못한 항진균 활성물질이 한꺼번에용출될 수 있기 때문인 것으로 사료된다. 이와 같이 KL1114, KL1121, KL1326, KL1143, KL1179 균주 등은 월등히 높은 항진균 활성과 넓은 항진균 활성 스펙트럼을 나타내었다.

본 발명은 상기 균주 중에서B. subtilisvar.amyloliquefaciensKL1114 균주 (수탁번호 : KCTC 8913P),Alcaligenes faecalisKL1179 균주 (수탁번호 : KCTC 8914P),Pseudomonas aeruginosaKL1121 균주 (수탁번호 : KCTC 8915P) 및Pseudomonas aurantiacaKL1326 균주 (수탁번호 : KCTC 8916P)를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 11월 27일자로 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 8913P).

(2-2) 항진균 활성 세균의 작용 기작

6종의 병원성 진균 및 15종의 공시 병원성 진균류를 대상으로 주사 전자현미경 (SEM) 및 간섭현미경 등을 이용하여 항진균 활성의 작용기작을 분석한 결과, 상기 균주는 균사 형성 억제, 포자 생성 유도 및 억제, 영양균 사용해 등의 형태로 병원균을 성장 억제하거나 사멸시킴을 확인하였다.

<실시예 3> 항진균 활성 세균의 최적 배양 조건 조사

상기 실시예에서 선별한 세균을 대량 생산하기 위하여, 항진균 활성이 우수한 새로운 균주 KL1114, KL1121, KL1326, KL1179, KL1143, KLP21 을 대상으로 항진균 활성물질이 생성되는 최적 조건을 조사하였다. 실험에 사용한 배지 조성 중 탄소원, 질소원 및 인산원에 대한 것은 표 3 에 나타낸 바와 같고 이러한 조성을 이용한 성장 효과는 미생물의 성장곡선을 48시간 동안 620 또는 630㎚ 에서의 흡광도로 측정하여 확인하였다.

미생물 배지 조성

배 지	종류
Glu-MOPS 배지의 인산 농도(mM)	0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0
질소원	비프 추출물, 카사미노산, 말트 추출물,펩톤, 트립톤, 우레아, 이스트 추출물
탄소원	과당, 갈락토스, 글리세롤, 락토스,말토스, 만니톨, 슈크로스

(3-1) 탄소원 종류에 따른 성장량

GM63 배지에 질소원으로 펩톤 (0.5%)을 고정양으로 넣어주고 각각의 탄소원을 0.5%씩 첨가하여 조사하였다. 포도당을 제외한 7가지 탄소원 중 KL1114 균주는 락토스와 만니톨이 탄소원으로 효과적이고, KL1326 균주는 과당, 갈락토스, 글리세롤이 성장을 위한 탄소원으로 매우 효과적이었다.

(3-2) 질소원 종류에 따른 성장량

GM63 배지에 각각의 질소원을 0.5%로 첨가한 것을 이용하여 측정하였다. 항진균 활성 균주의 성장을 위한 질소원으로 펩톤과 이스트 추출물이 가장 좋았고, 우레아를 사용한 경우 성장률이 가장 낮았다. KL1114 균주는 특이하게 트립톤이 질소원으로 가장 좋았다.

(3-3) 인산원 농도에 따른 성장량

인산원은 Glu-MOPS 배지의 인산 농도를 달리하여 항진균 활성 균주의 성장 정도를 측정하였다. 인산 농도에 따라 성장률은 정확히 비례하였고, 0.5mM 이상의 농도에서는 성장량에 차이가 없었다.

(3-4) 탄소원, 질소원 종류 및 인산원 농도에 따른 항진균 활성 조사

KL1179 와 KLP21 균주를 제외한 항진균 활성 균주로부터 배양시간 (6, 12, 24시간)에 따라 배양액을 취하고 이를 원심분리하여 미생물을 제거한 다음 상등액에 동량의 부탄올을 사용하여 항진균 활성물질을 추출하였다. 이 중 1㎖ 만을 농축하여C. albicans(KLP21 균주의 경우Fusarium)에 대한 항진균 활성도를 측정하였다. KL1179 와 KLP21 균주는 디스크 (disk)를 이용하여 활성도를 조사하는데, 활성도는C. albicans또는Fusarium이 성장하지 못하는 억제환 (inhibition zone)의 직경 (cm 단위)으로 측정하였다. 그 결과 KL1114 와 KL1143 균주의 경우 배지 조성에 영향을 받지 않고 높은 활성도를 보였고, 나머지 미생물들은 Glu-MOPS 배지보다는 질소원 배지에서, 질소원 배지보다는 탄소원 배지에서 높은 활성도를 나타내었다.

(3-5) 아미노산, 비타민 첨가 및 pH 변화에 따른 항진균 활성 조사

항진균 활성물질을 생산하는 균주 (KL1114, 1121, 1143, 1179, 1326, KLP21)를 대상으로 환경요인에 따른 항진균 활성물질의 생성능을 비교하기 위하여, 온도, pH, 비타민 (B1, B2, B12) 및 첨가 아미노산 등을 달리하면서 배양하였다. 각 구간에서 배양된 배양액의 상등액을 동량의 부탄올로 추출하여 감압 농축하고, 농축액으로부터 항진균 활성물질을 측정한 결과, 항진균 활성 균주의 성장률 및 배지내 pH 변화는 균주간에 거의 유사한 양상을 나타냈다. 그러나 항진균 활성물질의 생성능은 균주간에 차이가 있어 KL1114, 1179, 1326 균주는 비타민 B1, KL1121 균주는 비타민 B2, KL1143 균주는 비타민 B12가 첨가될 때 항진균 활성물질을 최대로 생산하였다. 아미노산은 아르기닌, 라이신을 처리한 경우 항진균 활성물질의 생성능이 높았다.

(3-6) 온도에 따른 항진균 활성물질 생성능

배양 온도를 15, 25, 30, 37℃ 구간에서 3일간 배양하여 항진균 활성도를 측정한 결과, 균주간에 다소 차이는 있지만 전체적으로 30∼37℃ 온도 구간에서 항진균물질 생성능이 우수하였다.

<실시예 4> 미생물이 식물 종자 발아율에 미치는 영향 조사

항진균 활성 균주가 아무리 우수한 항진균 활성을 가지고 있더라도 식물체의 성장을 저해한다면 항진균 활성 균주로서 가치가 없을 것이므로 항진균 활성 세균을 대상으로 종자발아율을 측정하는 것은 매우 중요하다. 불암조생 풋호박 종자의발아율은 KL1179 균주를 제외한 모든 균주에서 100%의 발아율을 나타내고, 오리엔탈 피망글로리의 경우, 모든 균주가 기준군과 유사한 발아율을 보였다.

이와 같이 상기 항진균 활성 세균들은 식물종자 발아율을 저해시키지 않으므로 포장에서 쓰이는 미생물 농약제제로 뿐만아니라, 종자 수준에서 피막화시킬 경우 종자 저장 및 보존에도 대단히 유용할 것이다.

<실시예 5> 항진균 활성 세균을 이용한 바이오 매트릭스의 제조

항진균 활성 세균이 자연 환경생태계 또는 식물체에서 생존을 유지하면서 항진균 생리활성물질을 생산하기 위해서는 영양분 공급 (단기적, 중장기간 이용가능한 영양분), 항진균 세균의 보호, 발아율 증진, 장단기적 생장 등을 유지하는 것이 필요하다. 따라서 이와 같은 작용을 가지는 바이오 매트릭스 (bio-matrix)를 개발하고자 하였다.

구체적으로 식물자원 고분자 재료 (biogel), 미생물기원 생체고분자 (microgel), 생체고분자 합성미생물의 세포 자체 또는 기타 재료 등을 적절히 혼합하여 20여종의 바이오 매트릭스를 제조하였다. 이 때 식물자원 고분자 재료로는 시금치가루, 양배추가루, 생현미, 도토리묵가루, 알파콘, 미역가루, 신선초가루, 쑥가루, 생율무가루, 다시마가루, 녹두가루, 마가루, 팥가루, 밤가루, 미숫가루, 솔잎검정콩가루 또는 당근가루 등을 사용하고, 이외에 기타 재료로 질석, 진흙, 알긴산, 키틴, 굴조개껍질, 과일껍질건조분말, 옥수수대/왕겨/톱밥 태운 가루 등, 각종 추출물, 펩톤, 트립톤, 당류, 무기염류, 비타민, 아미노산 또는 플라보노이드(flavonoid) 등을 적절히 첨가하여 사용하였다. 또한, 미생물기원 생체고분자로는 뮤코폴리사카라이드 (MPS) 또는 폴리-베타-하이드록시알카노에이트를 사용하고, 뮤코폴리사카라이드는 질소고정세균인Rhizobium. loti, R. meliloti, R. japonicum또는 남조균 (cyanobacteria)로부터 유래하는 것을 사용하였다.

바이오 매트릭스의 고분자 재료 성분

성 분	첨가량( g/ℓ)
솔잎콩가루 ＋ 감자가루	280 ＋ 120
전분	400
전분 ＋ 당근가루	280 ＋ 120
콩가루 ＋ 양배추가루	280 ＋ 120
콩가루 ＋ 미역가루	280 ＋ 120
시금치가루	400
당근가루	400
미역가루	400

바이오 매트릭스 내 고분자 재료 성분

성 분	첨가량
고분자 재료	400g (표 4)
포도당	2g
펩톤	2g
MgCl₂	0.04g
CaCO₃	2g
FeSO₄·7H₂O	120mg
MnCl₂·4H₂O	20mg
KH₂PO₄	0.1g
질석	40g
H₂O	1ℓ

상기 바이오 매트릭스를 영양원으로 주고 항진균 활성 세균의 생존유지기간,생존발아율, 항진균 활성 유지, 항진균 물질생성능력을 측정한 결과, 상기 바이오 매트릭스는 모든 항진균 활성 세균에 적용할 수 있고, 미생물 농약 및 미생물 제제의 피막화와 미생물 담체로서 역할이 매우 탁월하였다.

<실시예 6> 세균 흡착을 증강시키는 생분해성 코팅 응집물질의 선별

식물 병원성 진균을 방제하는 살균제로 본 발명의 미생물이 이용되기 위하여, 우선 길항균이 장기간 실온에서도 길항 활성을 유지할 뿐만 아니라 식물잎에 잘 부착되거나 토양에서 잘 분해되는 코팅 응집물질이 필요하다. 본 발명은 상기에서 얻은 항진균 활성 세균과 함께 남조류 (cyanobacteria)가 수생 환경으로 방출하는 응집물질 (bioflocculants)을 추출하고 그 특성을 분석하였다. 여러 종의 남조류 균주중 카올린 진흙 (kaolin clay) 분석 및 알시안 블루 결합 분석 (Alcian blue binding assay)을 통하여 선발한Anabaenasp. PC-1 과Anabaenasp. N-1444 균주가 응집활성이 강한 세포외 (extracellular) 응집물질을 풍부하게 분비하는 것으로 조사되었다. 이 응집물질의 특성을 이해하기 위하여,Anabaenasp. PC-1을 6주간 배양하면서 각 주별로 성장곡선과 카올린 응집활성을 조사한 결과, 성장이 정체기에 이르는 4주경에 응집활성이 가장 강하게 나타났으며, 4주간 배양한 균주로부터 핫 페놀 (hot phenol)을 이용하여 응집물질을 추출하고 CTAB 및 에탄올 침전법을 이용하여 부분 정제한 다음 세파크릴 S-200 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 순수 정제하였다. 이 응집물질은 고분자성 다당류 (macromolecular polysaccharides)로서 전체 분자량의 63%는 중성 슈가, 5%는 우론산 (uronicacids), 12%는 단백질로 조성되어 있으나, 케토산, 헥소사민 (hexosamines), 지방산 (fatty acids)은 거의 존재하지 않았다.

또한, 정제된 응집물질은 양이온 염료 (cationic dye)인 알시안 블루에 강한 친화성을 가지므로 폴리음이온 설페이트 (polyanionic/sulfated) 다당류로 사료되고, 이 물질의 응집활성은 강한 산성 조건에서 더 강하고 (acid-dependent), 100^oC에서 7분간 가열해도 응집활성이 40% 증가하는 것으로 보아 온도 안정성이 있는 것으로 확인되었다. 또한 NaCl, NaNO₃, MgSO₄, ZnSO₄와 같은 염이나 금속을 첨가하였을 때 그 활성이 증가되고 용액 상에서 활성 탄소, 실리카, 산화알루미늄, 벤토나이트, 키틴, 키토산, 분말성 아가, 셀룰로스, DEAE, Dowex-50W, 세파덱스와 같은 유기/무기물질과도 어느 정도 응집하였다.

또한 항진균 활성 세균 중 KL1321, 1143, 1330, 1367 균주는 응집활성이 서서히 증가하는 다른 균주와 달리 배양 1일부터 pH 2∼4 사이에서 강한 응집활성을 나타내므로 환경친화형 응집제로서 항진균 활성 세균으로부터 합성되는 것을 직접 이용할 수 있다.

<실시예 7> 항진균 활성물질의 활성증진 보조제 선별

미생물보다는 식물에 다량 분포하는 천연산물인 플라보노이드 계통의 화합물을 배지에 첨가할 경우 항진균활성의 상승효과 가능성이 있는가를 조사하기 위하여, 또는 항진균활성이 뛰어나지만 세포 독성이 있는 금속성분과 같은 물질이 플라보노이드와의 상호작용을 통해서 진균의 성장에 어떤 효과를 미치는가를 검정하기 위하여 아연과 퀴어세틴 (Quercetin) 및 구리와 퀴어세틴의 상호 작용에 의한 진균성장의 억제 효과를 관찰하였다. 이를 통하여 플라보노이드는 항진균 활성 증진보조제로서 사용될 수 있음을 확인하였다 (Letters in Applied Microbiology. 26: 363-366, 1998).

<실시예 8> 항진균 활성 세균을 함유하는 바이오 매트릭스 농약의 제조

(8-1) 제조 과정

1차적으로 조제된 바이오 매트릭스를 멸균한 후, 50℃정도에서 냉각. 농축된 항진균 활성 세균을 먼저 질소 고정 세균이 분비하는 뮤코폴리사카라이드 (mucopolysaccharide, MPS)로 피막화하고, 상기 바이오 매트릭스와 혼화하여 고분자 재료 그람당 세포 수가 10⁸-10⁹정도 되도록 조제한 다음, 호모지나이저 (homogenizer)속에서 균일하게 섞어 미생물들이 골고루 막속에 2차적으로 고정되도록 하였다. 이렇게 고정된 미생물, 뮤코폴리사카라이드과 고분자의 바이오 매트릭스 복합체는 건조하여 적당한 크기의 분말로 제조되었다.

항진균 활성 세균을 함유하는 바이오 매트릭스 복합체 농약에 대한 개요도를도 1에 나타내었다. 구체적으로 본 발명의 미생물 농약은 5가지 형태로 피막화되도록 제조되었다.

<실시예 9> 항진균 활성물질의 정제 및 분석

(9-1) 저비등점 (휘발성) 항진균 활성물질의 분석

KL1136, KL1137, KL1179, KL1187 균주가 생산하는 휘발성 항진균 활성물질을 액체질소 트랩법, 분획법, 가스 크로마토그래피 (GC), TIC 및 질량 분석법 (mass spectroscopy) 등으로 그 특성을 확인하고, NMR 등으로 그 구조를 분석하였다. 상기 균주는Rhizoctonia solani는 물론이고 특히 잔디브라운패치병에 방제 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있어 이 과정으로 얻은 항진균 물질은 특정 병원균 방제에 유용하다.

(9-2) 저분자량의 (500∼1,000 정도) 항진균 활성물질 분석

KL1114, KL1326, KL1330, KL1143, KL1121 균주가 생산하는 항진균 활성물질을 상기 (9-1) 과정과 동일하게 분석하였다. 특히 KL1114 균주는 4 종류의 항진균 활성물질을 생산하는데, 이를 TLC, 역상 TLC, HPLC 등으로 확인하고 이들 중 비교적 분자량이 작은 물질을 대상으로 XAD-4, HP20, G-10 컬럼, TLC, 프렙 HPLC 등으로 다시 분리, 정제하여¹H NMR, C-NMR, 질량 분석 스펙트럼 등을 수행하였다. 또한, FAB-MS 스펙트럼에서 m/z 531 {M+H}⁺의 분자 이온 피크 (molecular ion peak)가 관찰되어 분자량은 530 (KLMBF-①)으로 추정되고 있으며 이외의 다른 항진균 활성물질은 말디 MS 스펙트럼 (Maldi MS spectrum)에서 분자량이 1045 (KLMBF-②), 1058 (KLMBF-③), 1074 (KLMBF-④)로 나타났다. 특히 분자량이 530인 항진균 활성물질은 여태까지 전혀 데이터 베이스에 보고된 바 없는 새로운 화합물이다.

(9-3) 폴리펩타이드성 항진균 활성물질의 정제

KL1114 균주의 배양 상등액을 (NH₄)₂SO₄70% 로 포화시키고 세파덱스 G-50 (50 by 2.5㎝) 컬럼으로 젤 침투 (gel filtration)를 실시한 다음 디스크 젤 전기영동, 젤 용출 시스템 (gel eluter system)과 로터퍼 시스템 (Rotoper system)을 이용하여 항진균 단백질을 분리, 정제하였다. 정제된 단백질을 PAGE 또는 배지상에서 분석한 결과, 분자량이 약 3kDa 및 5kDa인 항진균 활성 단백질을 확인하였다.

또한, 완전히 라이시스가 일어난 KL1114 균주의 배양 상등액을 PEG 로 침전시키고 세파덱스 G-100 (30 by 1.5㎝) 컬럼으로 젤 침투를 실시한 다음 상기와 같이 항진균 단백질을 분리, 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE 상에서 SDS 를 제거하고 항진균 활성을 분석한 결과, 분자량이 약 41kDa 인 항진균 활성 단백질을 확인하였다.

이외에도 KL1326 균주의 배양 상등액을 (NH₄)₂SO₄70% 로 포화시키고 세파덱스 G-50 (50 by 2.5㎝) 컬럼으로 젤 침투를 실시한 다음 상기와 같이 항진균 활성 단백질을 분리, 정제하여 분석한 결과, 분자량이 약 20kDa인 항진균 활성 단백질을 확인하였다.

(9-4) 폴리펩타이드성 항진균 활성물질의 구조 분석

KL1114 와 KL1326 균주에서 항진균성 세포외 분비단백질 분획을 SDS-PAGE 젤로부터 분리하여 N-말단의 펩타이드 시퀀싱 (peptide sequencing)을 수행하였다. 다음 N-말단 아미노산 서열로 BLAST 분석을 수행한 결과, KL1114 균주의 약 3kDa 단백질은Nicotiana,Solanum등에서 생성되는 오스모틴 유사단백질 (Osmotin-like protein, PR-5d)과Citrus의 염기성 키티나제/라이소자임 (basic chitanase/lysozyme) 등과 상동성을 나타내었다. 상기 3kDa 폴리펩타이드가 식물에서 기원되는 항진균활성 단백질인 오스모틴 (24 kDa)과 일부 도메인에서 상동성을 보이는 것은 처음 보고되는 주목할 만한 것이다.

또한 강력한 항진균 활성을 나타내는 KL1114 균주의 5kDa 단백질은 리보좀 단백질과 상동성을 나타내는데, 이는 리보좀 단백질이 종양 억제 활성 (tumor suppressor activity)를 증가시키는 생물학적 기능을 고려할 때 의미가 있고, 한편 KL1114 균주의 41kDa 단백질의 N-말단은 플라젤린 (flagellin)의 N-말단과 상동성이 있고, KL1326 균주의 20kDa 단백질의 N-말단은Pseudomonas syringae의 주요 분비단백질인 오토라이신 (autolysin) 또는 DNase 인 것으로 밝혀졌다. 이와 같이3kDa, 5kDa, 41kDa, 20kDa 폴리펩타이드는 현재까지 보고된 바 없는 새로운 세균 유래의 항진균 활성 단백질이다.

<실험예 1> 미생물 농약의 안정성 및 성능 조사

(1-1) 미생물 농약의 안정성

미생물 농약은 약효 수명이 최소한 1∼2년 정도 유지되는 것이 중요하므로상기 미생물 농약을 0개월, 3개월, 6개월, 9개월, 12개월을 방치한 다음 회생되는 살아있는 미생물 수를 조사하였다. 구체적으로 농축된 항진균 활성 세균을 실험 구간을 설정하여 각각의 시료를 NA 평판배지 상에 도말한 다음 30℃에서 24시간 배양하고, 처음에 넣어준 미생물 수와 회생된 미생물 수를 비교하여 안정성을 측정하였다. 그 결과, 대조군에 비하여 피막화되어 건조된 농약은 균주에 따라 다소 차이는 있지만 12개월 저장기간 동안 아무런 변화없이 안정하였다.

회생된 항진균 활성 세균의 항진균 활성을 분석하기 위하여, 회생된 AF^＋세균을 임의로 50개씩 선별하여 AF 실험을 수행한 결과, 모두 AF^＋길항성을 보유하고 있어 회생된 균주들은 모두 생물학적인 항진균 활성을 그대로 유지함을 확인하였다.

(1-2) 피막화된 미생물 농약 내에서 항진균 활성 세균의 엽면, 토양생존률 조사

KL1114, 1121, 1179, KLP21 등 4가지 균주에 대하여 오이엽면, 오이근권토양, 일반토양에서 1주후, 2주후의 생존률을 조사한 결과, KLP21 (50% 정도 감소)를 제외하고 모든 균주들이 초기의 생존률에 비하여 오히려 2∼20배까지 증가하였다.

(1-3) 미생물 농약의 살포 활성 조사

KL1114, KL1121, KL1143, KL1326, KL1179, KLP21 균주를 피막화시켜 살포한 경우 KL1114 (Tech) 시제품 (5,000ppm, 10⁷cfu/㎖)은 대조약제 플루아지아남(Fluazianam, 200ppm)에 비하여 오이잿빛곰팡이에 대한 방제 효과가 오히려 높았다(KL1114 (Tech): 83%, Fluazianam: 74%).

(1-4) 미생물 농약의 코팅종자 발아율 조사

6가지 미생물 농약 (KL1114, 1121, 1179, KLP21, 1143, 1326)을 각각 피막화시켜 오이, 토마토, 고추의 종자들 100개씩을 대상으로 코팅하였을 때, 코팅 종자의 발아율은 무처리구와 차이가 없거나 오히려 증가하는 효과가 나타났다.

(1-5) 미생물 농약의 UV 저항성 조사

햇볕에 5시간 노출시킨 KL1114 균주는 단순히 증량제만 배합하여도 생존률은 감소되지 않았다. 그러나 KL1114 균주는 증량제, MPS, UV 차단제, 미역가루, 야채가루, 영양분 등을 적절히 배합하여 제제화하는 경우 생존 균체수가 약간 증가하였다.

(1-6) 환경 보전 및 정화 능력

항진균 활성 세균이 생물 폐자원을 이용하여 고부가가치의 미생물 농약 제제 및 항진균제 생산은 물론이고, 환경정화능력이 있는지 여부를 가리기 위해 세포외효소의 활성을 액체 상태와 고체배지 상태로 나누어 조사하였다. 그 결과, 16종의 항진균 활성 세균 모두 유기물 분해능력이 뛰어났다. 특히 KL1114 균주는 글루칸, 전분, 단백질, 셀룰로오즈, 리그닌 분해능력이 다른 균주에 비하여 3배 이상 높았고, KL1105, 1326 균주는 키틴분해능과 지질분해능이 매우 강하였다.

(1-7) 농약 내성 및 분해능

항진균 활성 세균의 농약에 대한 저항성을 분석하기 위하여 NA 배지에 23종의 농약, 살균제로는 베노밀 (Benomyl), 플루실라졸 (Flusilazole), 테부코나졸 (Tebuconazole), 옥사디실 (Oxadixyl), 에디펜포스 (Edifenphos), 트리사이클라졸 (Tricyclazole), 만코젭 (Mancozeb), 클로로타로닐 (Chlorothalonil), 디클로프루아니드 (Dichlofluanide), 펜사이쿠론 (Pencycuron), 아족시스트로빈 (Azoxystrobin), 수산화구리 (Copper hydroxide), 이소프로티오란 (Isoprothiorane), 이프로벤포스 (Iprobenphos), 살충제로는 클로르페나피르 (Chlorfenapyr), 이미다클로프리드 (Imidacloprid), 카보퓨란 (Carbofuran), 펜파이옥시메이트 (Fenpyroximate), 클로르피리포스 (Chlorpyrifos), BPMC, 디아지논 (Diazinon), 제초제로는 부타클로르 (Butachlor), 글리포세이트 (Glyphosate)를 각각 첨가하여 30℃에서 2일간 배양하여 성장 여부를 관찰하였다.

농약 분해능의 분석을 위해서는 탄소원으로 포도당 대신에 농약를 첨가한 GM63 액체 배지와, 유일한 인(P)원으로 농약를 첨가한 Glu-MOPS 액체 배지에 균주를 30℃에서 3일간 배양하여 성장 여부 및 분해능을 UV 스펙트럼과 TLC 방법 등으로 조사하였다. 대조군 (control)으로는 탄소원으로 포도당이 첨가된 GM63 액체 배지와 역시 원래의 인원인 인산을 첨가한 Glu-MOPS 0.1mM Pi 액체 배지에 균주를 배양하여 동일한 방법으로 조사하였다.

그 결과, 상기 항진균 활성 균주들은 대부분이 여러 종류의 농약에 대하여 저항성을 갖고 분해능은 균주별, 농약별로 차이를 나타내었다. 독성이 강하고 환경오염물질로 작용하는 대부분의 유기화학농약에 대하여 본 발명의 항진균 활성 세균이 저항성과 분해능을 가지고 있기 때문에 환경 보전 및 정화에 매우 유용한 환경친화적인 다기능적 미생물 제제 (농약)으로 이용될 수 있다.

<실험예 2> 항진균 활성 세균 및 항진균제의 독성 조사

항진균 활성 세균 및 항진균 활성물질 (KL1114 균주의 분자량 3, 5, 41kDa 의 항진균성 폴리펩타이드, KL1326 균주의 20kDa 폴리펩타이드, 항진균 활성 세포벽분해효소) 그리고 시제품화한 미생물농약제제를 대상으로 세포독성실험, 피부자극실험 및 급성독성실험을 수행하였다. KL1114, KL1121, KL1179, KL1121, KL1143, KN1326 등의 항진균 세균들과 미생물 농약 시제품을 이용하여 모두 마우스를 대상으로 경구 투입에 의한 급성독성실험을 수행한 결과, 일반농약투입 기준보다 높은2,000mg/kg 을 투여하여도 전혀 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라 오히려 대조구에 비하여 체중이 증가하는 효과도 나타냈다.

<실험예 3> 온실 및 포장 활성실험

경북 상주에 위치한 오이 비닐하우스 온실재배 농가에서 자연적으로 발생되는 오이 흰가루병, 노균병, 흑성병의 제어하기 위하여, 본 발명의 22개 균주를 희석하여 병징이 심하게 나타난 엽면에 1주일 간격으로 2회 직접 분무하여 길항능력을 시험하였다.

그 결과, 길항균주 KL1136 은 흰가루병, 노균병, 흑성병의 병징 및 병반의 확산을 억제시키는 것이 관찰되었다. 또한 상기 길항균을 직접 식물에 접종할 경우 식물 병원성 진균의 생장이 저해되거나 발병이 억제되는가를 조사하기 위하여 온실에서 길항 미생물을 직접 처리한 결과 지속적인 방제 효과가 나타났다. 따라서, 길항 미생물로서 뛰어난 항진균 활성을 가지는 KL1114, KL1121, KL1367 균주를 2-3일간 NB 혹은 TSB 배지에 배양하고 원심분리하여 침전시킨 다음 멸균 증류수로 현탁하고 고추에 직접 병원균과 동시에 접종하여 발병 억제 작용 또는 병반 발달의 지연을 지속적으로 수행하는가를 조사하였다. 이들 균주는 고추 생산에 심각한 경제적 손실을 주는 고추 탄저병 (Anthracnose)균인Colletotrichum gloeosporioides의 병반 발생을 억제하였고, KL1143, KL1314, KL1321, KL1326, KL1330, KL1411 균주는 병원균과 동시에 처리하는 경우 병반 발생을 지연시키는 효과를 나타내었다. 또한 배양된 길항균의 배양여액을 부탄올로 추출하고 농축하여Colletotrichum gloeosporioides가 접종된 고추열매에 동시 처리한 결과 KL1114 와 KL1367 균주의 추출액이 지속적으로 강한 억제 효과를 나타내었다. 따라서 본 발명의 균주는 생물학적인 제어제 (biological controller)로서 역할을 잘 수행하는 것으로 판명되었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 항진균 활성을 가지는 미생물은 항진균 활성에 더하여 유기물 분해능, 농약내성 및 농약 분해능을 지니고 있어 환경 보전 및 정화 작용이 있는 다기능적 농약제로서 환경친화형 토양개량제, 퇴비부숙제, 환경정화제 등에도 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항진균성 화합물은 세균 유래의 폴리펩타이드로 판명되어 그 아미노산 서열을 결정하면 유전자의 클로닝 및 발현을 통하여 항진균 활성이 증진된 변형 폴리펩타이드도 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 진균 방제용 바이오 매트릭스는 우리나라에서 자생하는 미생물을 이용하여 경제적인 대체 효과가 크고 고성능을 가지므로 농업 인력도 획기적으로 줄일 수 있다.

Claims

병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 미생물Pseudomonas aeruginosaKL1121 (수탁번호: KCTC 8915P).
제 1항에 있어서, 병원성 진균은Mucorspp.(부패병),Pythium ultimum(입고병),Rhizoctonia solani(벼문고병),Botryoshaeria dothidea(사과부패병) 및Candida albicans(칸디다증)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
제 1항에 있어서, 미생물은 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제의 유효성분으로 이용되는 것을 특징으로 하는 미생물
제 1항의 미생물, 식물자원 고분자 재료, 생체고분자 합성 미생물 (biogel), 생체 고분자 (microgel) 및 계면활성제를 혼합하여, 종자 코팅제, 미생물 농약, 미생물 제제의 피막화 물질, 미생물 담체, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제로 이용될 수 있는 병원성 진균 방제용 바이오 매트릭스.