ES2220176B1

ES2220176B1 - Nuevo enzima protelotico, procedimiento para su obtencion y aplicaciones.

Info

Publication number: ES2220176B1
Application number: ES200201211A
Authority: ES
Inventors: Maria Jose Benito Bernaldez; Mar Rodriguez Jovita; Felix Nuñez Breña; Elena Bermudez Polo; Miguel Angel Asensio Perez; Juan Jose Cordoba Ramos
Original assignee: Universidad de Extremadura
Current assignee: Universidad de Extremadura
Priority date: 2002-05-27
Filing date: 2002-05-27
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2022-05-27
Also published as: ES2220176A1

Abstract

Nuevo enzima proteolitico, procedimiento para su obtención y aplicaciones. Dicho enzima, que tiene un peso molecular de aproximadamente 35 kDa, se obtiene mediante cultivo de la cepa P Chrysogenum Pg222, en un medio de cultivo adecuado para incluir la producción de enzimas proteolítica extracelulares, seguido de aislamiento y purificación del enzima proteolítico más activo. Aplicación en el sector cárnico.

Description

Nuevo enzima proteolítico, procedimiento para su obtención y aplicaciones.

Campo técnico de la invención

La presente invención se encuadra dentro del sector de la industria cárnica.

Más específicamente, la presente invención proporciona un nuevo enzima con elevada actividad proteolítica, útil en la maduración de productos cárnicos y en la mejora de la textura de ciertas carnes de bajo valor comercial.

Estado de la técnica anterior a la invención

Durante el proceso de maduración de los productos cárnicos curados hay una hidrólisis parcial de las proteínas cárnicas, que repercute en la acumulación de péptidos y aminoácidos libres [(1) Córdoba, J.J., Antequera, T., García, C., Ventanas, J., López-Bote, C. y Asensio, M.A. (1994). Evolution of free amino acids and amines during ripening of Iberian cured ham. Journal of Agricultural and Food Chemistry 42, 2296-230; y (2) Martín A., J.J. Córdoba, Rodríguez M.M., Núñez F. y Asensio M.A. (2001) Evaluation of microbial proteolysis in meat products by Capillary Electrophoresis. Journal of Applied Microbiology 90, 163-171]. Si bien las proteínas no presentan sabor ni aroma, los compuestos derivados de ellas por acción de la proteolisis (péptidos y aminoácidos libres) sí lo tienen y, por tanto condicionan el sabor del producto acabado [(3) Toldrá, F. (1998). Proteolysis and lipolysis in flavour development of dry-cured meat products. Meat Science 49, 5101-S110)]. Además, los aminoácidos libres entran en rutas degradativas como la degradación de Strecker o la reacción de Maillard generando aldehídos, cetonas, etc., de marcada influencia en el aroma de los productos acabados. [(4) Ventanas, J., Córdoba, J.J. Antequera, T. García, C., López-Bote, C. y Asensio M.A. (1992). Hydrolysis and Maillard reactions during ripening of Iberian ham Journal of Food Science 57,813-815].

Así mismo, la hidrólisis de las proteínas cárnicas, especialmente de las proteínas miofibrilares genera un ablandamiento de la carne [(5) Yu, L.P. y Lee, B. (1986). Effects of postmortem pH and temperature on bobine muscle structure and meat tenderness. Journal of Food Science 51, 774-780]. Si bien este aspecto tiene menor interés en productos cárnicos madurados, es de extraordinaria importancia para mejorar la textura de carnes más duras de bajo valor comercial (algunas piezas cárnicas de vacuno, recortes de carne de caza, etc.).

La actividad proteolítica que tiene lugar en carne o en productos cárnicos crudos curados es debida en parte a la acción de los enzimas tisulares como calpaínas y fundamentalmente catepsinas [(6) Toldrá, F. y Etherington D.J. 1988. Examination of cathepsins B.D. H and L activities in dry-cured hams. Meat Science 23, 1-7; y (7) Virgili, R. Schivazappa, C., Parolari, G. Bordini, C.S. y Degni, M. (1998). Proteases in fresh pork muscle and their influence on bitter taste formation in dry-cured ham. Journal of Food Biochemistry 22, 53-63]. Las calpainas se inactivan pasados pocos días (aproximadamente de 1 a 5 días) después de la obtención de la carne y las catepsinas pierden su actividad de forma intensa durante los primeros meses de maduración, debido al efecto de la sal, descenso de la actividad del agua y a la reducción del pH [(8) Rico, E., Toldrá, F. y Flores, J. (1991). Effect of dry-curing process parameters on pork muscle cathepsin B. H and L activity. Lebensmitel Untersuchung un Forschung 193, 541-544]. Dada la importancia que la proteolisis parece tener en la génesis del sabor y el aroma de los productos cárnicos crudos curados, mantener la actividad proteolítica durante todo el proceso de maduración o incluso incrementar dicha actividad puede ser fundamental para la obtención de productos cárnicos de elevada calidad sensorial. Para incrementar la actividad proteolítica durante la maduración podría pensarse en la utilización de microorganismos como cultivos iniciadores, dado que éstos tienen enzimas capaces de hidrolizar las proteínas de la carne. No obstante, los microorganismos que presentan mayor actividad proteolítica por sus potentes equipos enzimáticos son los mohos, cuyo crecimiento y, por tanto, actividad está limitada a la superficie del producto. [(9) Núñez, F., Rodríguez M.M., Bermúdez M.E., Córdoba J.J., y Asensio M.A. (1996) Composition and toxigenic potential of the mould population on dry-cured Iberian ham. International Journal of Food Microbiology 32, 185-197)]. Sin embargo, los enzimas aislados y purificados de estos mohos y adicionados al producto cárnico, al menos en los picados, se reparten por toda la masa facilitando su actividad.

Se dispone de enzimas proteolíticos obtenidos de mohos, como por ejemplo un enzima de Aspergillus oryzae si bien no se trata de mohos aislados de productos cárnicos. La utilización de enzimas aislados de productos cárnicos respecto a los obtenidos de otros tipos de mohos, debería presentar una serie de ventajas como el que los enzimas sean más activos sobre las proteínas cárnicas. Así mismo y dado que se trata de productos con especiales peculiaridades como concentraciones del NaCl del 2-4%, importante reducción del contenido acuoso hasta valores 40-60% y actividad del agua de 0,80-0,90 (1), los enzimas de los mohos que se desarrollan en ellos deben ser activos en estas condiciones y por tanto mantener su actividad durante gran parte del proceso de maduración.

En trabajos experimentales previos realizados por el solicitante (9), se han aislado mohos no toxigénicos de jamón curado que han mostrado intensa actividad proteolítica en ensayos con miosina en caldo nutritivo y en carne estéril [(10) Rodríguez, M.M., Núñez F., Córdoba J.J. Bermúdez E. y Asensio M.A. (1998). Evaluation of proteolytic activity of microorganisms isolated from dry cured ham. Journal of Applied Microbiology 85, 905-912]. Un aislamiento de Penicillium chrysogenum, Pg222, mostró elevada capacidad de hidrólisis de proteínas miofibrilares de carne (2). La obtención y purificación de un enzima proteolítico de este aislamiento podría ser de interés para incrementar la proteolisis en carne y productos cárnicos. Su utilización podría presentar un beneficio no sólo por su posible repercusión en el sabor y aroma de los productos cárnicos crudos-curados, sino que incluso podría ser de utilidad para el ablandamiento de carnes con mayor dureza.

De aquí que el solicitante haya dirigido sus esfuerzos investigadores a conseguir dicha obtención y purificación de tal enzima con elevada actividad proteolítica como uno de los principales objetivos de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención, tal y como se indica en su enunciado, se refiere a un nuevo enzima proteolítico, al procedimiento para su obtención y a sus aplicaciones.

El enzima de la presente invención, que de ahora en adelante se denominará EPg222, se obtiene a partir de Penicillium chrysogenum Pg222 aislado de jamón curado. Dicho enzima EPg222, una vez aislado y purificado, se caracteriza por tener un peso molecular de aproximadamente 35 kDa (véase figura 1) y una secuencia amino terminal constituida por Glu-Asn-Pro-Leu-Gln-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Trp.

Además dicho enzima se caracteriza por tener una elevada actividad proteolítica, lo que le hace especialmente útil en la maduración de productos cárnicos así como en la mejora de la textura de carnes duras de escaso valor comercial, posibilitando su revalorización.

Por lo tanto, el enzima objeto de la presente invención es un producto con una importante aplicabilidad dentro del sector de la industria cárnica y relacionadas.

El procedimiento desarrollado por la presente invención para la obtención de dicho enzima se caracteriza porque comprende esencialmente las siguientes fases operativas:

a) cultivo de la cepa de P. chrysogenum Pg222, en un medio pobre en nutrientes y en presencia de proteínas miofibrilares extraídas de carne estéril para inducir la producción de enzimas proteolíticos extracelulares por parte de dicha cepa;

b) aislamiento y purificación del enzima proteolítico más activo procedente de la fase anterior, separando el micelio del caldo de cultivo mediante filtración y posterior tratamiento del filtrado mediante una secuencia de etapas de fraccionamiento de proteínas y evaluación de la actividad de las diferentes fracciones, hasta conseguir el pretendido enzima proteolítico más activo, objeto de la presente invención.

En una realización preferida de la invención, la primera fase del procedimiento, o fase (a), se lleva a cabo en un medio pobre en nutrientes que incluye tan sólo 0,05-0,15% en peso de caldo nutritivo, en presencia de 1-2 mg/ml de las citadas proteínas miofibrilares 4-6% de cloruro sódico, a una temperatura de cultivo de 23-27ºC durante 3-5 días con agitación.

Normalmente, el caldo nutritivo empleado es un caldo de cultivo comercial apto para la finalidad preferida. Es especialmente preferido en esta invención el caldo nutritivo comercial de la firma Oxoid.

Por su parte, dicha segunda fase del procedimiento o fase (b), comprende una sucesión de etapas operativas de aislamiento, purificación y determinación de la actividad proteolítica de las diferentes fracciones proteínicas que se van aislando en cada una de dichas etapas. Así, una secuencia de etapas operativas especialmente adecuada para la obtención del enzima de la presente invención es la siguiente:

- Etapa 1

Tratamiento del filtrado conforme al protocolo descrito por Lee y Col. [(11) Lee, J.K., Kim, H.K.; Park, Y.S. y Oh, T.K. (1996). Purification and characterization of a thermostable alkaline protease from Thermactinomyces sp. E79 and the DNA sequence of the encoding gene. Bioscience Biotechnology Biochemistry 60, 840-846] para aislar una fracción proteínica que muestra una pluralidad de bandas por análisis SDS-PAGE (véase Figura 1).

- Etapa 2

Separación de las fracciones del extracto dializado obtenido en la etapa 1, empleando columnas DEAE de sefarosa, separándose la fracción que muestra mayor actividad proteolítica frente a proteínas miofibrilares para someterle a la siguiente etapa 3.

- Etapa 3

Ultrafiltración de la fracción seleccionada en la etapa anterior escogiéndose la de 8-50kDa (figura 1), que es la que muestra una intensa actividad proteolítica, para la siguiente etapa 4.

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- Etapa 4

Separación por HPLC de la fracción seleccionada en la etapa anterior, eligiendo la fracción correspondiente al pico que muestra la actividad más intensa, para someterla a un control de pureza en la siguiente etapa 5.

- Etapa 5

Electroforesis de la fracción procedente de la etapa anterior de acuerdo con el protocolo de Laemli [(12) Laemli, U.K. 1970), Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685], comprobándose que la fracción era pura ya que mostró una única banda.

La fracción pura así obtenida se sometió a una sexta etapa, para analizar su secuencia aminoterminal.

- Etapa 6

Transferencia de la fracción pura procedente de la etapa 5 a una membrana adecuada, preferentemente de PVDF y determinación de su secuencia aminoterminal, la cual se ha indicado anteriormente.

Dicha fracción pura constituye el enzima de la presente invención, el cual se sometió a ensayos de actividad sobre proteínas miofibrilares, sobre colágeno y sobre carne.

El enzima de la invención EPg222 mostró una actividad claramente superior (véase Figura 5) a la de otros enzimas proteolíticos (tripsina, papaína, proteasa de Aspergillus oryzae), en sus condiciones óptimas de actividad.

En cuanto a la actividad del enzima EPg222 sobre la carne pudo comprobarse que la misma experimenta una elevada proteólisis y una disminución de la dureza de la carne. Evidentemente, como resultado de esta actividad, el enzima puede afectar, o afecta, a las características sensoriales y organolépticas de la carne.

Lo anterior pone de evidencia la importante aplicabilidad del enzima de la invención en el sector cárnico, tanto para potenciar el sabor y aroma de los productos como para reducir la dureza de determinadas piezas cárnicas de escaso valor comercial.

Para conseguir estos resultados, el enzima se aplica al producto cárnico en forma de disolución acuosa.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Resultados del análisis en SDS-PAGE de los distintos pasos de purificación del enzima EPg222; línea 1, después de precipitación con sulfato amónico; línea 2, separación con columnas DEAE de sefarosa; línea 3, ultrafiltración con filtros Centricón plus 20 y línea 4, purificación HPLC. Líneas M, marcador de pesos moleculares (Sigma).

Figura 2: Resultados de SDS-PAGE con proteínas miofibrilares incubadas a diferentes temperaturas con el enzima EPg222 purificado. Línea B son las proteínas incubadas sin el enzima (controles) y líneas S son las proteínas incubadas con el enzima EPg222. Líneas 1 a 10ºC; lineas 2 a 20ºC; líneas 3 a 30ºC; líneas 4 a 40ºC; líneas 5 a 45ºC; líneas 6, a 50ºC; líneas 7 a 55ºC y líneas 8 a 60ºC. Líneas M, marcador de pesos moleculares (Sigma).

Figura 3: Resultados de SDS-PAGE con proteínas miofibrilares incubadas a diferentes pHs con el enzima EPg222 purificado. Líneas B son las proteínas incubadas sin el enzima (controles) y líneas S son las proteínas incubadas con el enzima. Líneas 1, pH 4,5; líneas 2, pH 5; Líneas 3, pH 5,5, Líneas 4, pH 6; Líneas 5, pH 6,5, Líneas 6, pH 7. Líneas M, marcador de pesos moleculares (Sigma).

Figura 4: Resultados de SDS-PAGE con proteínas miofibrilares incubadas a diferentes concentraciones de sal con el enzima EPg222 purificado. Líneas B son las proteínas incubadas sin el enzima (controles) y Líneas S son las proteínas incubadas con el enzima. Líneas 1, 0 M NaCl; líneas 2, 0,25M NaCl; líneas 3, 0,5M NaCl; líneas 4, 1M NaCl; líneas 5, 1,5M NaCl, líneas 6, 2M NaCl y lineas 7, 3M NaCl. Líneas M, marcador de pesos moleculares (Sigma).

Figura 5: Resultados de SDS-PAGE con proteínas miofibrilares incubadas con diferentes enzimas proteolíticos y con EPg222, Líneas B son las proteínas incubadas sin enzimas (controles). Línea 1, EPg222; línea 2, papaína; línea 3, tripsina y línea 4, proteasa de Aspergillus oryzae. Líneas M, marcador de pesos moleculares (Sigma).

Figura 6: Resultados de la acción del enzima sobre las proteínas miofibrilares de la superficie de carne estéril después de 24 días de incubación. En las líneas 1, 2,3 se presentan las muestras de carne sin adición del enzima (controles), y en las líneas 4, 5 y 6 las muestras de carne inoculadas con el enzima. Líneas M, marcador de pesos moleculares (Sigma).

Figura 7: Resultados de la acción del enzima sobre las proteínas miofibrilares de profundidad de carne estéril después de 24 días de incubación. En las líneas 1, 2, 3 se presentan las muestras de carne sin adición del enzima (controles), y en las líneas 4, 5 y 6 las muestras de carne inoculadas con el enzima. Líneas M, marcador de pesos moleculares (Sigma).

Figura 8: Representación gráfica de la fuerza de compresión (kg/cm^{2}) necesaria para provocar deformación en un ensayo con carne estéril adicionada del enzima y carne sin enzima utilizada como control, a distintos tiempos de maduración (3, 5, 10, 17, 24 y 32 días).

Modos de realización de la invención

La presente invención, se ilustra adicionalmente mediante el siguiente ejemplo concreto de obtención del enzima EPg222, y los siguientes ensayos efectuados con el mismo. En ningún caso, esta información debe considerarse limitativa del alcance de la invención, el cual está definido única y exclusivamente por la nota reivindicatoria adjunta.

Ejemplo

En este Ejemplo se ilustra un caso concreto de preparación de la proteína EPg222 de la invención a partir de P. chrysogenum, siguiendo las mismas fases y etapas operativas que se expusieron en la parte descriptiva de la presente memoria.

Fase 1

Cultivo de P.chrysogenum

P.chrysogenum Pg222 fue cultivado en un medio pobre en nutrientes (0,1% de caldo nutritivo Oxoid) adicionado de 1,6 mg/ml de proteínas miofibrilares extraídas de carne estéril y 5% de cloruro sódico, para facilitar la producción de enzimas proteolíticos extracelulares por parte del moho. El medio inoculado fue cultivado a 25ºC durante 4 días en agitación (200 rpm).

Fase 2

Purificación del enzima extracelular más activo

Transcurrido el tiempo indicado de incubación se separó el medio de cultivo por filtración y el filtrado obtenido fue tratado de acuerdo con las etapas que a continuación se detallan. Las fracciones o compuestos que se fueron obteniendo en estas etapas fueron probadas frente a proteínas miofibrilares extraídas de carne estéril con el objetivo de seleccionar las que presentaran mayor actividad proteolítica.

Etapa 1

Se tomaron 250 ml de filtrado, se saturó con sulfato amónico al 80% (11) y posteriormente se centrifugó a 9.000 xg durante 15 minutos. El precipitado obtenido fue disuelto en 50 ml de tampón fosfato potásico, pH 7,2 y seguidamente se dializó frente al tampón anterior toda la noche a 4ºC. El análisis de esta fracción en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) muestra gran cantidad de bandas correspondientes a diferentes proteínas entre las que deben estar los enzimas responsables de la actividad proteolítica (Figura 1).

Etapa 2

A partir del extracto dializado se obtuvieron diferentes fracciones tras ser separado en columnas DEAE de sefarosa (Amershan-Pharmacia-Biotech, Uppsala, Suecia), utilizando como eluyente NaCl en gradiente lineal de 0 a 1,5 M. La fracción que eluyó con OM de NaCl fue la que mostró mayor actividad proteolítica frente a proteínas miofibrilares, siendo la fracción seleccionada para la etapa 3.

Etapa 3

La fracción que eluyó con OM de NaCl fue sometida a ultrafiltración con filtros centricón Plus-20 de Millipore (USA), obteniéndose varias fracciones de distintos pesos moleculares (menos de 8 kDa, entre 8 y 50 kDa y más de 50 kDa). La fracción de 8 a 50 kDa (Figura 1) mostró intensa actividad proteolítica siendo seleccionada para análisis por HPLC.

Etapa 4

La fracción entre 8 y 50 kDa fue analizada por HPLC en columna de intercambio fónico Shodex IEC DEAE-825 (Phenomenex, Madrid). La elución fue realizada con tampón tris-HC1 pH 8,2 a un flujo de 1 ml/min con un gradiente lineal de 0 a 0,5M de NaCl. Los picos fueron detectados a 280 nm de longitud de onda y recolectados en un colector de fracciones, ensayándose posteriormente su actividad proteolítica frente a proteínas miofibrilares. Solo el pico eluido a los 11 minutos mostró intensa actividad.

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Etapa 5

El pico eluido a los 11 minutos fue analizado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y no desnaturalizante (Laemmli, 1970) para determinar su pureza, mostrando una única banda de aproximadamente 35 kDa de peso molecular (Figura 1).

Etapa 6

La banda fue transferida a una membrana de difluoruro de polivilideno (PVDF) y analizada la secuencia amino terminal, que resultó ser:

Glu-Asn-Pro-Leu-Gln-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Trp.

Ensayos 1.- Actividad del enzima sobre proteínas miofibrilares y colágeno

Los ensayos realizados sobre proteínas miofibrilares durante 12 horas muestran que el enzima posee elevada actividad a valores de temperatura que oscilan entre 10 y 60ºC, concentración de NaCl de 0 a 3 M y en un rango de pH de 5 a 7, siendo los valores óptimos 451ºC, 0,25 M de NaCl y pH 6 (figuras 2, 3 y 4). El enzima muestra también actividad relevante a temperatura tan baja como 4ºC (dato no mostrado).

Los resultados de los ensayos de actividad del enzima durante 4 y 8 horas sobre un sustrato coloreado de colágeno (colágeno impregnado de un colorante azo) muestran que el enzima posee actividad colagenolítica en los dos tiempos probados, dado que respecto al control sin enzima se produce liberación de colorante. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 1:

TABLA 1 Actividad del enzima EPg222 sobre colágeno

Absorbancia del colorante liberado del colágeno impregnado de colorante azo después de incubar con el enzima durante 4 y 8 horas. Esta absorbancia está calculada respecto a una muestra control incubada sin el enzima.

Tiempo de incubación (en horas)	absorbancia
4	1,33\pm0,021
8	1,88\pm0,040

Por otra parte, cuando se compara la actividad del enzima EPg222 con la de otros enzimas proteolíticos, como tripsina, papaína y proteasa de Aspergillus oryzae, sobre proteínas miofibrilares y en condiciones óptimas de cada enzima se observa que EPg222 tiene la actividad más alta (Figura 5).

2. Actividad del enzima en carne

El efecto del enzima fue probado en trozos de carne de 4 cm de lado obtenida en condiciones estériles, adicionada de 5% de NaCl a 20ºC durante 32 días, intentando simular un proceso de maduración de productos cárnicos. En las mismas condiciones que la carne adicionada con el enzima, se maduró un control de carne sin enzima. Se tomaron muestras a los 0, 5, 10, 17, 24 y 32 días de incubación y se evaluaron tanto en superficie cómo en profundidad las modificaciones en proteínas miofibrilares y sarcoplásmicas, el nitrógeno no protéico y el nitrógeno aminoacídico. Así mismo se evaluaron modificaciones en la textura de la muestra completa de carne en un texturómetro (XTRA dimensión, Stable Micro System, Reino Unido). Se comprobó que en la carne adicionada con el enzima hay una hidrólisis más intensa de las proteínas miofibrilares que en la carne control (Figuras 6 y 7), y concentraciones más altas, respecto al control, de nitrógeno no protéico y nitrógeno aminoacídico. Estas diferencias se observaron tanto en la superficie de la carne como en la parte más interna. Los resultados de las determinaciones de fuerza de compresión de la carne medida en el texturómetro indican que las muestras adicionadas con el enzima presentan una textura más blanda que la carne control (Figura 8).

En conclusión, hay mayor proteolisis en la carne adicionada con el enzima, lo que repercute en la presencia de un contenido mayor de aminoácidos libres y otros compuestos nitrogenados solubles que influyen en el sabor y aroma de los productos cárnicos. Además, se produce una disminución de la dureza de la carne. Todo esto demuestra que el enzima puede afectar a las características sensoriales de carne y productos cárnicos. La utilización de este enzima por tanto, es de gran utilidad, tanto para facilitar la generación de compuestos saborizantes y aromatizantes de los productos cárnicos, como para disminuir la dureza de la carne, especialmente en piezas cárnicas de menor valor comercial.

3. Método de aplicación del enzima

El enzima se adiciona a la carne o productos cárnicos disuelto en agua. La concentración efectiva según los ensayos realizados es de 1,5 mg por Kilo de carne.

En la preparación de productos cárnicos crudos-curados no picados se adiciona el enzima disuelto en agua en la concentración arriba indicada a la superficie del producto. En productos cárnicos crudos-curados picados, la solución acuosa con el enzima se añade en las proporciones indicadas a la masa obtenida antes de embutir. Posteriormente los productos se maduran de acuerdo con el procedimiento habitualmente seguido.

Para el ablandamiento de carne de bajo valor comercial, el enzima se añade a una concentración de 3 mg/Kg de carne disuelto en agua y se mantiene en maceración a temperatura de refrigeración durante 1-3 días.

Claims

1. Nuevo enzima proteolítico, denominado EPg222, caracterizado porque tiene un peso molecular de aproximadamente 35kDa y una secuencia amino terminal constituida por:

Glu-Asn-Pro-Leu-Gln-Pro-Asn-Ala-Pro-Ser-Trp.

2. Procedimiento de obtención de un nuevo enzima proteolítico como se ha definido en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende esencialmente las siguientes fases operativas:

a) cultivo de la cepa de P. chrysogenum Pg222, en un medio pobre en nutrientes y en presencia de proteínas miofibrilares extraídas de carne estéril y de cloruro sódico para inducir la producción de enzimas proteolíticas extracelulares por parte de dicha cepa;

b) aislamiento y purificación del enzima proteolítico más activo procedente de la fase anterior, separando el micelio del caldo de cultivo mediante filtración y posterior tratamiento del filtrado mediante una secuencia de etapas de fraccionamiento de proteínas y evaluación de la actividad de las diferentes fracciones, hasta conseguir el pretendido enzima de alta actividad proteolítica.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha fase (a) se lleva a cabo en un medio pobre en nutrientes que incluye 0,05-0,15% en peso de caldo nutritivo, en presencia de 1-2 mg/ml de las citadas proteínas miofibrilares y de 4-6% de cloruro sódico, a una temperatura de cultivo de 23-27ºC, durante 3-5 días de agitación.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque se utiliza un 0,1% de dicho caldo nutritivo.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque se emplean 1,6 mg/ml de proteínas miofibrilares extraídas de carne estéril.

6. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque se emplea un 5% de cloruro sódico.

7. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque el cultivo se lleva a cabo a 25ºC durante 4 días con agitación.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque la agitación es de 200 rpm.

9. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha fase (b) comprende la siguiente secuencia de etapas de aislamiento y purificación de material proteínico:

-: etapa 1: tratamiento de dicho filtrado con sulfato amónico y posterior centrifugación para aislar un material sólido que se disuelve en tampón fosfato pH 7,2 y posterior diálisis, para aislar una fracción proteínica que muestra una pluralidad de bandas por análisis SDS-PAGE;

-: etapa 2: separación de las fracciones del extracto dializado obtenido en la etapa 1, empleando columnas DEAE de sefarosa, separándose la fracción que muestra mayor actividad proteolítica frente a proteínas miofibrilares para someterla a la siguiente etapa 3;

-: etapa 3: ultrafiltración de la fracción seleccionada en la etapa anterior escogiéndose la de 8-50kDa, que es la que muestra una intensa actividad proteolítica, para someterle a la siguiente etapa 4;

-: etapa 4: separación por HPLC de la fracción seleccionada en la etapa anterior, eligiendo la fracción correspondiente al pico que muestra la actividad más intensa, para someterla a un control de pureza en la siguiente etapa 5;

-: etapa 5: electroforesis de la fracción procedente de la etapa anterior para comprobar su pureza.

10. Aplicación del nuevo enzima proteolítico definido en la reivindicación 1, en los procesos de maduración de los productos cárnicos por su actividad proteolítica y colagenolitica, para mejorar sus propiedades sensoriales y organolépticas.

11. Aplicación del nuevo enzima proteolítico definido en la reivindicación 1, en los procesos de ablandamiento de piezas de carne especialmente duras, de escaso valor comercial, para mejorar su textura.