JPS5842758B2 - ベ−タ− ガラクトシダ−ゼノ セイゾウホウ - Google Patents
ベ−タ− ガラクトシダ−ゼノ セイゾウホウInfo
- Publication number
- JPS5842758B2 JPS5842758B2 JP6658975A JP6658975A JPS5842758B2 JP S5842758 B2 JPS5842758 B2 JP S5842758B2 JP 6658975 A JP6658975 A JP 6658975A JP 6658975 A JP6658975 A JP 6658975A JP S5842758 B2 JPS5842758 B2 JP S5842758B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- galactosidase
- penicillium
- seizouhou
- galactocider
- zeno
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はβ−ガラクトシダーゼの製造法、特に微生物に
よるβ−ガラクトシダーゼの製造法に関するものである
。
よるβ−ガラクトシダーゼの製造法に関するものである
。
乳糖は哨乳動物の乳汁中に含有される糖で、通常小腸に
存在するβ−ガラクトシダーゼの1種であるラクターゼ
により加水分解され吸収代謝される。
存在するβ−ガラクトシダーゼの1種であるラクターゼ
により加水分解され吸収代謝される。
しかしながら、摂取した乳糖の量にくらべて小腸のラク
ターゼ活性が低い場合は、乳糖の消化不良が生ずる。
ターゼ活性が低い場合は、乳糖の消化不良が生ずる。
そして日本人の場合、平均して4人に1人は牛乳の消化
が十分に出来ない人がいると言われている。
が十分に出来ない人がいると言われている。
この乳糖の消化不良は乳製品の利用拡大に伴って問題化
しており、又乳糖の晶析は乳製品の加工上、利用上での
問題点となっている。
しており、又乳糖の晶析は乳製品の加工上、利用上での
問題点となっている。
これらの問題点を解消し、乳製品の利用及び用途拡大の
ためにβ−ガラクトシダーゼの普及化が望まれている。
ためにβ−ガラクトシダーゼの普及化が望まれている。
ところでβ−ガラクトシダーゼを生産する微生物として
は、ある種の酵母(サツカロマイセス・フラジリス、ト
ルラ・タレモリス)、細菌(大腸菌、乳酸菌)、糸状菌
(アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニゲル)
等が現在までに知られているが、これらの微生物の生産
するβ−ガラクトシダーゼは菌体内酵素であったり、作
用pHが低かったり、また微生物の酵素生産力が低かっ
たりしてその採取、利用が限定されている。
は、ある種の酵母(サツカロマイセス・フラジリス、ト
ルラ・タレモリス)、細菌(大腸菌、乳酸菌)、糸状菌
(アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニゲル)
等が現在までに知られているが、これらの微生物の生産
するβ−ガラクトシダーゼは菌体内酵素であったり、作
用pHが低かったり、また微生物の酵素生産力が低かっ
たりしてその採取、利用が限定されている。
そこで本発明者等は、微生物によるβ−ガラクトシダー
ゼの生産について種々研究した結果、ペニシリウム属の
菌株が極めて有効に上記した問題点を解決する強力なる
β−ガラクトシダーゼを分泌性で生産するとの新知見を
得、本発明を完成するに到った。
ゼの生産について種々研究した結果、ペニシリウム属の
菌株が極めて有効に上記した問題点を解決する強力なる
β−ガラクトシダーゼを分泌性で生産するとの新知見を
得、本発明を完成するに到った。
即ち、本発明はペニシリウム(Penic i l j
i um)属に属するβ−ガラクトシダーゼ生産菌を培
地に培養し、培養物よりβ−ガラクトシダーゼを採取す
ることを特徴とするβ−ガラクトシダーゼの製造法であ
って、乳製品の利用及び用途拡大上有用なβ−ガラクト
シダーゼを容易に製造する方法を提供することを目的と
するものである。
i um)属に属するβ−ガラクトシダーゼ生産菌を培
地に培養し、培養物よりβ−ガラクトシダーゼを採取す
ることを特徴とするβ−ガラクトシダーゼの製造法であ
って、乳製品の利用及び用途拡大上有用なβ−ガラクト
シダーゼを容易に製造する方法を提供することを目的と
するものである。
本発明において使用するペニシリウム属のβガラクトシ
ダーゼ生産菌の具体例としては、例えば■ペニシリウム
・フレクエンタンス・ウェストリング(Pen、fre
quentans westling)(微工研菌寄第
3085号(FERM−P/I63085 ) )■ペ
ニシリウム・ルテウム・ソオプ(Pen、Luteum
SoppX微工研菌寄第3091号(FERM−PA3
091))、■ペニシリウム・シトリナムATCC98
49(Pen、citrinumATCC9849)〔
微工研菌寄第3086号(FERM−P43086))
、■ペニシリウム・グラカム・リンク(Pen。
ダーゼ生産菌の具体例としては、例えば■ペニシリウム
・フレクエンタンス・ウェストリング(Pen、fre
quentans westling)(微工研菌寄第
3085号(FERM−P/I63085 ) )■ペ
ニシリウム・ルテウム・ソオプ(Pen、Luteum
SoppX微工研菌寄第3091号(FERM−PA3
091))、■ペニシリウム・シトリナムATCC98
49(Pen、citrinumATCC9849)〔
微工研菌寄第3086号(FERM−P43086))
、■ペニシリウム・グラカム・リンク(Pen。
glaucum Link)(微工研菌寄第3090号
(FERM−P/%3090))、ペニシリウム・クリ
ソゲナム・トムI F D 4626 (Pen 、
chrysogenumThomIFD4626)(微
工研菌寄第3088号(FERM−P/163088
) ) 、■ペニシリウム・ロクエフォルテイ(Pen
、roqueforti)(微工研菌寄第3089号(
FERM−PA3089 ) )、■ペニシリウム・ツ
タタム・ウェストリング(Pen、notatumWe
stli ng)(微工研菌寄第3087号(FERM
−PA3087 ) )−上記菌はいずれも工業技術院
微生物工業技術研究所に上記番号のもとに寄託されてい
る−等を挙げることが出来る。
(FERM−P/%3090))、ペニシリウム・クリ
ソゲナム・トムI F D 4626 (Pen 、
chrysogenumThomIFD4626)(微
工研菌寄第3088号(FERM−P/163088
) ) 、■ペニシリウム・ロクエフォルテイ(Pen
、roqueforti)(微工研菌寄第3089号(
FERM−PA3089 ) )、■ペニシリウム・ツ
タタム・ウェストリング(Pen、notatumWe
stli ng)(微工研菌寄第3087号(FERM
−PA3087 ) )−上記菌はいずれも工業技術院
微生物工業技術研究所に上記番号のもとに寄託されてい
る−等を挙げることが出来る。
上記菌株のβ−ガラクトシダーゼ生産性、得られたβ−
ガラクトシダーゼの至適pH1安定pHを示すと、第1
表の通りである。
ガラクトシダーゼの至適pH1安定pHを示すと、第1
表の通りである。
第1表中、菌株の欄の■〜■の番号は上記した番号に該
当する菌株を表わす。
当する菌株を表わす。
またβ−ガラクトシダーゼ生産能の欄の記号は次の意味
を表わす。
を表わす。
++++ :麹1g当り100単位以上
+++:麹1g当り100〜60単位
++:麹1g当り60〜40単位
+:麹1g当り40〜20単位
以上の他にもペニシリウム・オランチオービオラセム(
Pen、aurantio−violaceum)、ペ
ニシリウム0モシタネンス(Pen montanen
se )等に属する菌株もβ−ガラクトシダーゼ生産能
のあることが認められる。
Pen、aurantio−violaceum)、ペ
ニシリウム0モシタネンス(Pen montanen
se )等に属する菌株もβ−ガラクトシダーゼ生産能
のあることが認められる。
本発明の実施に当っては、ペニシリウム属に属するβ−
ガラクトシダーゼ生産菌を固体又は液体培地に好気的に
培養する。
ガラクトシダーゼ生産菌を固体又は液体培地に好気的に
培養する。
本発明において、培地としては、麩、米ヌカ等の天然物
、もしくはその抽出液、さらにこれらに各種糖類等の炭
素源、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、アミノ酸類、
蛋白質、アンモニウム塩、硝酸塩等の窒素源、カリウム
、リン、マグネシウム、鉄等のミネラル物質、ビタミン
類などを適当に選択して添加したものが利用できる。
、もしくはその抽出液、さらにこれらに各種糖類等の炭
素源、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、アミノ酸類、
蛋白質、アンモニウム塩、硝酸塩等の窒素源、カリウム
、リン、マグネシウム、鉄等のミネラル物質、ビタミン
類などを適当に選択して添加したものが利用できる。
また上記した炭素源、窒素源、ミネラル物質、ビタミン
類を適当に含有する培地も用いることができる。
類を適当に含有する培地も用いることができる。
さらに必要に応じてこれら培地にβ−ガラクトシダーゼ
生産に効果的な各種の誘導、分泌性物質を添加すること
も可能である。
生産に効果的な各種の誘導、分泌性物質を添加すること
も可能である。
培養は通常、温度15〜45℃、pH3,5〜8.0の
範囲内で好気条件下で行われ、培養時間は通常16〜1
20時間である。
範囲内で好気条件下で行われ、培養時間は通常16〜1
20時間である。
培養物よりβ−ガラクトシダーゼの採取は、酵素の採取
の常法にしたがって行うことができ、例えば固体培養物
の抽出液又は液体培養ブロスから、硫安等による塩析、
アルコール、アセトン等の有機爵媒による沈澱法、タン
ニン酸等の蛋白沈澱剤による方法などにより、β−ガラ
クトシダーゼを分離採取することができる。
の常法にしたがって行うことができ、例えば固体培養物
の抽出液又は液体培養ブロスから、硫安等による塩析、
アルコール、アセトン等の有機爵媒による沈澱法、タン
ニン酸等の蛋白沈澱剤による方法などにより、β−ガラ
クトシダーゼを分離採取することができる。
更に例えばイオン交換樹脂処理、ゲル濾過、限外が過等
の一般的酵素精製法を使用することにより、このβ−ガ
ラクトシダーゼを精製することができる。
の一般的酵素精製法を使用することにより、このβ−ガ
ラクトシダーゼを精製することができる。
ここで、β−カラクトシダーゼ精製の具体例を挙げると
、本発明にしたがいペニシリウム属のβ−ガラクトシダ
ーゼ生産菌、例えばペニシリウム・シトリナムATCC
9849FERM−PA3086を培養して得た麹の水
抽出液に硫酸アンモニウムを添加し、0、6−0.9飽
和区分を集め、溶解後pHを3.8に酢酸緩衝液で調整
する。
、本発明にしたがいペニシリウム属のβ−ガラクトシダ
ーゼ生産菌、例えばペニシリウム・シトリナムATCC
9849FERM−PA3086を培養して得た麹の水
抽出液に硫酸アンモニウムを添加し、0、6−0.9飽
和区分を集め、溶解後pHを3.8に酢酸緩衝液で調整
する。
次いでこれをDEAE−セファデックスカラムを通過さ
せ、未吸着区分をとり、更にこれをSP−セファデック
スカラムを通過させ、吸着区分を食塩(NaC1)で濃
度0.1モルから1.0モルまで直線的に増加させる濃
度勾配法で溶出するβ−ガラクトシダーゼ区分を集める
。
せ、未吸着区分をとり、更にこれをSP−セファデック
スカラムを通過させ、吸着区分を食塩(NaC1)で濃
度0.1モルから1.0モルまで直線的に増加させる濃
度勾配法で溶出するβ−ガラクトシダーゼ区分を集める
。
更に、セファデックスG−200カラムでゲル濾過を2
回繰返し、活性区分を集めることにより、精製β−ガラ
クトシダーゼを得る。
回繰返し、活性区分を集めることにより、精製β−ガラ
クトシダーゼを得る。
この精製により、β−ガラクトシダーゼを単一蛋白質に
まで精製でき、純度を抽出液の1ooo倍まであげるこ
とができる。
まで精製でき、純度を抽出液の1ooo倍まであげるこ
とができる。
酵素収率は約10俤である。なお上述した抽出液、分離
酵素、精製酵素のいずれも、凍結真空乾燥等の乾燥によ
り粉末化が可能である。
酵素、精製酵素のいずれも、凍結真空乾燥等の乾燥によ
り粉末化が可能である。
本発明で製造されるβ−ガラクトシダーゼの物理化学的
性質を挙げると次の如くである。
性質を挙げると次の如くである。
(1)基質特異性
種々のグリコシドに作用させた結果は第2表に示す通り
である。
である。
第2表
グリコシド 活性(俤)乳糖
100 0−ニトロフェニル−β/Dガラクト ピラノシド 398p
−ニトロフエーレーβ−Dガラクト ピラノシド 288フ
ェニル−β−D−ガラクトピラノシド 243フェニル
−β−D−グルコヒラノシトO p−ニトロフェニル−α−Dガラクトピラノシド
Oフェニル−α−
D−グルコピラノシド 0フェニル−α−D−マ
ンノピラノシド Oフェニル−β−D−アラビノ
シト 0フェニル−β−D−キシロピラノシ
ド 0(2)至適pH1作用pH 至適pHは4〜5であり、pH3,5〜8の間で作用す
る。
100 0−ニトロフェニル−β/Dガラクト ピラノシド 398p
−ニトロフエーレーβ−Dガラクト ピラノシド 288フ
ェニル−β−D−ガラクトピラノシド 243フェニル
−β−D−グルコヒラノシトO p−ニトロフェニル−α−Dガラクトピラノシド
Oフェニル−α−
D−グルコピラノシド 0フェニル−α−D−マ
ンノピラノシド Oフェニル−β−D−アラビノ
シト 0フェニル−β−D−キシロピラノシ
ド 0(2)至適pH1作用pH 至適pHは4〜5であり、pH3,5〜8の間で作用す
る。
(3)至適温度、作用温度
至適温度は50℃であり、60℃未満で作用する。
(4) pH安定性
pH3,5〜8の間で安定である(但し4℃、24時間
)。
)。
(5)温度安定性
55℃まで安定(但しpH6,15分)、65°C以上
では殆んど失活する。
では殆んど失活する。
(6)NaC1,KClの影響
NaC1,KCIとも1モル濃度まで影響なし。
(7)金属イオンの影響
10−3モル濃度で銅イオンにより失活が著しく、マグ
ネシウム、マンガン、鉄、カルシウム、バリウム等のイ
オンでは殆んど影響を受けない。
ネシウム、マンガン、鉄、カルシウム、バリウム等のイ
オンでは殆んど影響を受けない。
(8)分子量
約10万(但しセファデックスゲル沢過法)。
次に本発明の実施例を示すが、本発明はこれにより制限
されるものでない。
されるものでない。
実施例 1
麩20.!9に水16扉lを加え、120℃、20分オ
ートクレーブで殺菌した三角フラスコに、あらかじめ同
一培地で4日間27℃にて培養したペニシリウム・シト
リナムATCO9849(FERM−PA3086 )
の種菌を接種し、4日間、27℃にて固体培養を行う。
ートクレーブで殺菌した三角フラスコに、あらかじめ同
一培地で4日間27℃にて培養したペニシリウム・シト
リナムATCO9849(FERM−PA3086 )
の種菌を接種し、4日間、27℃にて固体培養を行う。
この麩麹を5倍量の水で抽出し、遠心分離後、アルコー
ル60%になるように冷却低温下で除々にアルコールを
滴下し、沈澱物を分離乾燥し、β−ガラクトシダーゼ粉
末800■(1,2μ/■)を得た。
ル60%になるように冷却低温下で除々にアルコールを
滴下し、沈澱物を分離乾燥し、β−ガラクトシダーゼ粉
末800■(1,2μ/■)を得た。
実施例 2
麩2,5g、米ヌカ1.0g、NaNO30,2g、K
H2PO40,I N、 KCl O,05g、MgS
O47H2Q0.05gを含有する100rrLlの液
体培地(pH5,5)を入れた坂ロフラスコ(500m
l)を10本用意し、オートクレーブで殺菌後、これに
あらかじめ同一培地で48時間27℃にて培養したペニ
シリウム・クリソゲナム・トムIFD4626(FER
M−P/163088)の種菌液を接種し、27℃にて
72時間往復振盪培養を行う。
H2PO40,I N、 KCl O,05g、MgS
O47H2Q0.05gを含有する100rrLlの液
体培地(pH5,5)を入れた坂ロフラスコ(500m
l)を10本用意し、オートクレーブで殺菌後、これに
あらかじめ同一培地で48時間27℃にて培養したペニ
シリウム・クリソゲナム・トムIFD4626(FER
M−P/163088)の種菌液を接種し、27℃にて
72時間往復振盪培養を行う。
培養後、菌体等の固型物を分離し、限外濾過にて200
1rLlに濃縮し、これに硫安を添加し0.6−0.9
飽和区分を分画する。
1rLlに濃縮し、これに硫安を添加し0.6−0.9
飽和区分を分画する。
この分画区分を水に溶解し、セファデックスG−25カ
ラムに通し、脱塩後、凍結真空乾燥してβ−ガラクトシ
ダーゼ粉末70■(5,3μ/■)を得た。
ラムに通し、脱塩後、凍結真空乾燥してβ−ガラクトシ
ダーゼ粉末70■(5,3μ/■)を得た。
実施例 3
麩ioo部、米ヌカ20部、水100部を均一に混合殺
菌後、その500gをアルミ製バットに広げ、これに実
施例2に記載したと同様組成培地であらかじめ培養した
ペニシリウム・シトリナムATCC9849(FERM
−P屑3086)液体種菌50rILlを接種し、27
℃にて4日間培養を行う。
菌後、その500gをアルミ製バットに広げ、これに実
施例2に記載したと同様組成培地であらかじめ培養した
ペニシリウム・シトリナムATCC9849(FERM
−P屑3086)液体種菌50rILlを接種し、27
℃にて4日間培養を行う。
このようにして得た麩麹50kyを5倍量の水で抽出し
、限外濾過にて501に濃縮後、低温下(5°C)でア
セトンを加え、アセトン45〜70φ沈澱区分を分離す
る。
、限外濾過にて501に濃縮後、低温下(5°C)でア
セトンを加え、アセトン45〜70φ沈澱区分を分離す
る。
次いでこの沈澱を低アセトンで洗浄し、回転式真空乾燥
にて乾燥してβ−ガラクトシダーゼ粉末350g(2,
5μ/m9)を得た。
にて乾燥してβ−ガラクトシダーゼ粉末350g(2,
5μ/m9)を得た。
実施例 4
実施例3で得たβ−ガラクトシダーゼ粉末100gを2
71!の水に廖解し、これに硫酸アンモニウムを添加し
硫酸アンモニウム0.6−0.9飽和分画を集め、これ
をpH3,8の酢酸緩衝液11に晦解し、DEAE−セ
ファデックスカラムを通過後、これをSP−セファデッ
クスカラムに吸着させ、食塩水にて0.1モルより直線
的に1.0モルまで増加させて、晦出する活性区分を集
め、セファデックスG−200カラムでゲル済過を2回
繰返すと、精製β−ガラクトシダーゼ230■(130
μ/■)が得られた。
71!の水に廖解し、これに硫酸アンモニウムを添加し
硫酸アンモニウム0.6−0.9飽和分画を集め、これ
をpH3,8の酢酸緩衝液11に晦解し、DEAE−セ
ファデックスカラムを通過後、これをSP−セファデッ
クスカラムに吸着させ、食塩水にて0.1モルより直線
的に1.0モルまで増加させて、晦出する活性区分を集
め、セファデックスG−200カラムでゲル済過を2回
繰返すと、精製β−ガラクトシダーゼ230■(130
μ/■)が得られた。
このようにして得た精製β−ガラクトシダーゼを市販牛
乳100m1に1000単位及び5000単位加えて5
0°Cにて反応させた。
乳100m1に1000単位及び5000単位加えて5
0°Cにて反応させた。
5000単位添加牛乳では、反応開始後30分で90%
以上の乳糖が、1時間ではほぼ100%の乳糖が分解さ
れた。
以上の乳糖が、1時間ではほぼ100%の乳糖が分解さ
れた。
また1000単位添加牛乳では、3時間後で約80%の
乳糖が分解された。
乳糖が分解された。
Claims (1)
- 1 ペニシリウム(Penicillium )属に属
するβ−ガラクトシダーゼ生産菌を培地に培養し、培養
物よりβ−ガラクトシダーゼを採取することを特徴とす
るβ−ガラクトシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6658975A JPS5842758B2 (ja) | 1975-06-04 | 1975-06-04 | ベ−タ− ガラクトシダ−ゼノ セイゾウホウ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6658975A JPS5842758B2 (ja) | 1975-06-04 | 1975-06-04 | ベ−タ− ガラクトシダ−ゼノ セイゾウホウ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS51142593A JPS51142593A (en) | 1976-12-08 |
JPS5842758B2 true JPS5842758B2 (ja) | 1983-09-21 |
Family
ID=13320265
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6658975A Expired JPS5842758B2 (ja) | 1975-06-04 | 1975-06-04 | ベ−タ− ガラクトシダ−ゼノ セイゾウホウ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5842758B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06100612B2 (ja) * | 1986-02-06 | 1994-12-12 | 日本電装株式会社 | 風向検出装置及び風向検出装置取り付け方法 |
-
1975
- 1975-06-04 JP JP6658975A patent/JPS5842758B2/ja not_active Expired
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06100612B2 (ja) * | 1986-02-06 | 1994-12-12 | 日本電装株式会社 | 風向検出装置及び風向検出装置取り付け方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS51142593A (en) | 1976-12-08 |
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