KR100282278B1

KR100282278B1 - D-판토산 및 d-판토텐산의 제조방법

Info

Publication number: KR100282278B1
Application number: KR1019930019662A
Authority: KR
Inventors: 히끼찌유이찌; 모리야다께오; 미끼히로시; 야마구찌다까마사; 노가미이꾸오
Original assignee: 다께다 구니오; 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
Priority date: 1992-09-25
Filing date: 1993-09-24
Publication date: 2001-02-15
Also published as: EP0590857A2; CN1225358A; CN1095105A; ATE254174T1; CN1225394A; KR940007186A; CN100392069C; CN1097039C; CN1225388A; CN1225392A; DE69333295D1; DE69333295T2; EP0590857A3; EP0590857B1; JP3710497B2; CN1124344C; US5518906A; CN1056192C; CN1114697C; JPH06261772A

Abstract

살리실산 내성을 가지며 β-알라닌의 존재하에 D-판토텐산을 생성할 수 있는 엔테로박테리오새아애과에 속하는 미생물을 β-알라닌과 접속시킴을 특징으로 하는, D-판토텐산 또는 그의 염의 제조방법. 좀 더 바람직한 D-판토텐산 또는 그의 염의 제조방법에서는, α-케토이소발레르산 및/또는 α-케토부티르산, 및/또는 α-아미노부티르산 및/또는 β-히드록시-아스파르트산 및/또는 O-메틸트레오닌에 대한 내성을 갖는 미생물 또는 판토텐산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자 부위 또는 그 부위의 일부를 갖는 플라스미드 DNA로 형질전환된 미생물이 사용된다.

D-판토산 또는 그의 염을 제조하는 방법은, 살리실산, α-케토이소 발레르산 및/또는 α-케토부티르산 및/또는 α-아미노부티르산 및/또는 β-히드록시-아스파르트산 및/또는 O-메틸트레오닌에 내성이며 D-판토산을 생성할 수 있는 미생물을 배양하여 D-판토산 또는 그의 염을 축적한 다음 이를 수득함을 특징으로 한다.

D-판토텐산, D-판토산 또는 그의 염은 출발물질로서 DL-판토산, DL-판토락톤 등을 사용하지 않고 미생물학적 및 효율적으로 직접 수득될 수 있다.

Description

D-판토산 및 D-판토텐산의 제조방법

제1도는 실시예 3에서 수득된 플라스미드 pEV31의 제한효소지도를 나타낸다. 제1도에서 E는 EcoRI을 나타내고; EV는 EcoRV를 나타내고; P는 PvuⅡ를 나타내고; B는 BalⅡ를 나타낸다.

본 발명은 D-판토산 및/또는 D-판토텐산(또는 그의 염)의 신규 제조방법 및 정제방법, 그를 생성할 수 있는 미생물, 및 판토텐산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자 부위 또는 그 부위의 일부를 갖는 플라스미드 DNA에 관한 것이다. 판토텐산은 유용한 비타민 물질이다. D-판토산은 판토텐산 및 CoA의 합성에 중요한 중간체로서 유용한 물질이다.

중요한 비타민 물질인 D-판토텐산(또는 그의 염)의 통상적인 제조방법에는 (1) DL-판토락톤의 광학적 분해에 의해 수득된 D-판토락톤 및 β-알라닌(또는 그의 염)을 메탄올 중에서 화학적으로 축합하는 방법, (2) D-판토텐산 에스테르를 D-판토텐산으로 가수분해하는 방법, 또는 DL-판토텐산 에스테르의 D-배위를 D-판토텐산으로 선택적 가수분해하는 방법(두 방법은 미생물 또는 효소를 사용함)(일본국 특허 공개 제228487/1989 및 228488/1989호), (3) 판토산 칼륨, β-알라닌 및 ATP를 트리스 완충액 내에서 휴면 세포 또는 미생물 효소와 접촉시켜 판토텐산을 수득하는 방법[문헌 Journal of Biological Chemistry, Vol. 198, page 23 (1952), the Abstracts of Papers presented at te 176th American Chemical Society national Meeting, Division of Microbial and Biochemical Technology, No. 48(1978) 및 그 외의 문헌에 기재되어 있음]이 포함된다.

D-판토산 및/또는 D-판토락톤의 통상적인 제조방법에는 (4)퀴닌 또는 브루신과 같은 분해제를 광학적 분해에 사용하는 방법, (5) 특정 미생물을 이용하여 DL-판토락톤 중의 L-판토락톤을 분해하여 D-판토락톤을 단독으로 수득하는 방법(일본국 특허 공고 제19745/1972), (6) 특정 미생물을 이용하여 DL-판토락톤 중의 L-판토락톤만을 케토판토락톤으로 산화시킨 다음, D-판토락톤으로 비대칭 환원시키는 방법(일본국 특허 공고 제293386/1986호), (7) 특정 미생물을 이용하여, 화학적으로 합성된 케토판토락톤을 D-판토락톤으로 비대칭 환원시키는 방법(일본국 특허 공고 제14797/1986호), (8) 특정 미생물을 이용하여, DL-판토락톤 중의 L-배위를 L-판토산으로 선택적으로 비대칭 가수분해시키는 방법(일본국 특허 공개 제152895/1982호 및 제294092/1987호) 및 (9) 특정 미생물을 이용하여, DL-판토락톤 중의 D-배위를 D-판토산으로 선택적으로 비대칭 가수분해시키는 방법(일본국 특허 공고 제65198/1991호)이 포함된다.

판토텐산의 염을 수거하는 방법에 관해서는, 결정화하기 전에 염화 칼슘을 첨가하여 고수율 및 고순도의 판토텐산 칼슘 및 염화 칼슘의 착염을 결정화하는 방법이 공지되어 있다(Jonathan O. Brooks에 의해 1960년 10월 18일에 출원된 미합중국 특허 제2,957,025호, 일본국 특허 공고 제49571/1972호 등). 하지만, 상기와 같이 수득된 착염으로부터 염화 칼슘을 제거하여 고수율의 판토텐산 칼슘을 수득하는 방법은 공지되어 있지 않으며, 현재는 상기 착염이 최종 생성물로서 취급된다.

D-판토텐산(그의 염을 포함;이하 동일하게 적용됨)의 공업적 제조에 있어서, 방법(1)은 출발물질 DL-판토락톤을 합성하기 위한 복합체 공정 뿐만 아니라 그의 광학적 분해를 위한 곤란하고 어려운 공정을 필요로 한다. 방법(2)는 DL-판토락톤으로부터 D-판토텐산 에스테르 또는 DL-판토텐산 에스테르를 제조하는 공정을 필요로 하는 결점을 갖는다. 방법 (3)은 값비싼 ATP 및 트리스 완충액을 사용해야 하며, 미량의 판토텐산만이 수득된다는 점에서 불리하며, 출발물질로서 비싼 D-판토산(또는 그의 염)을 사용할 경우 비실용적이다.

또한, 대부분의 D-판토산 및/또는 D-판토락톤 제조방법은, 출발물질로서, 어려운 합성 공정을 필요로 하는 DL-판토락톤을 이용한다는 점이 결점이다. 또한, 방법(4)는 비싼 분해제의 사용 및 D-판토락톤 회수의 어려움 등과 같은 결점을 가지며, 방법(5)는 제조된 DL-판토락톤의 절반량이 손실되는 결점을 갖는다. 방법 (6), (7), (8) 및 (9)에서는, 사용된 미생물의 성질 또는 판토락톤(또는 판토산)의 성질 때문에, 배양액 내에서 100% 광학순도의 D-배위만을 제조하는 것이 매우 어렵다. 또한, 방법 (4), (8) 및 (9)는 잔류하는 L-배위가 회수, 라세미화 및 재사용되기 때문에 추가의 어려운 공정이 수반된다.

공업적으로 유리하고 좀 더 효율적인 D-판토텐산의 제조방법을 집중적으로 연구한 결과, 본 발명자들은 β-알라닌이 보충된 배지내에서 미생물을 배양하면 D-판토텐산이 생성된다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한, 살리실산 내성 균주를 배양함으로써 D-판토산이 축적될 수 있으며, β-알라닌이 보충된 배지내에서 살리실산 내성 균주를 배양함으로써 D-판토텐산이 더 고농도로 제조될 수 있으며, α-케토이소발레르산, α-케토부티르산, α-아미노부티르산, β-히드록시아스파르트산 및/또는 O-메틸트레오닌에 대한 내성이 부여된 균주를 사용함으로써 D-판토산 및/또는 D-판토텐산의 생성량이 증가됨을 발견하였다. 한편, 본 발명자들은 균주 증식에 유전자 재조합 기술을 적용하는 것을 연구하여, 판토텐산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자를 갖는 플라스미드로 형질전환된 균주가 배지내에서 보다 고농도로 D-판토텐산 또는 D-판토산(및/또는 D-판토락톤)을 축적하는 것을 발견하였다. 이 발견을 기초로 본 발명자들은 추가로 연구하였으며, 본 발명을 발전시켰다.

따라서, 본 발명은

[Ⅰ] 살리실산 내성을 가지며 D-판토산을 생성할 수 있는 엔테로박테리아새아애(Enterobacteriaceae)과에 속하는 미생물을 배양하고, D-판토산 또는 그의 염을 축적한 다음, 축적된 D-판토산 또는 그의 염을 수득함을 특징으로 하는 D-판토산 또는 그의 염의 제조방법;

[Ⅱ] α-케토이소발레르산 내성, α-케토부티르산 내성, α-아미노부티르산 내성, β-히드록시아스파르트산 내성 및 O-메틸트레오닌 내성 중에서 선택된 1종 이상의 내성을 갖는 미생물을 이용한 [Ⅰ]의 제조방법;

[Ⅲ] 실리실산 내성을 가지며 D- 판토텐산을 생성할 수 있는 엔테로박테리아새아애과에 속하는 미생물을 β-알라닌과 접촉시킴을 특징으로 하는, D-판토텐산 또는 그의 염의 제조방법.

[Ⅳ] α-케토이소발레르산 내성, α-케토부티르산 내성, α-아미노부티르산 내성, β-히드록시아스파르트산 내성 및 O-메틸트레오닌 내성 중에서 선택된 1종 이상의 내성을 갖는 미생물을 이용한 [Ⅲ]의 제조방법, 및

[Ⅴ] 상기 미생물이, 판토텐산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자 부위 또는 그 부위의 일부를 갖는 플라스미드 DNA로 형질전환된 미생물인 [Ⅰ]-[Ⅳ]의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 제조방법에 사용된 형질전환 미생물 및 상기 제조방법에 사용된 그와 같은 미생물을 수득하기 위한 플라스미드, 및 목적 화합물을 정제 및 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은, 출발물질로서 DL-판토산, 판토락톤 등을 사용할 필요가 없으며, 100% 광학 순도의 D-배위 화합물을 수득할 수 있고, L-배위 화합물의 회수 공정 및 수득된 라세믹 화합물의 재사용을 위한 L-배위 화합물의 라세미화 공정이 불필요하다는 점에서 많은 잇점을 갖는다.

본 발명을 이후에 상세히 기재한다.

본 발명에서 D-판토산, D-판토텐산 및 β-알라닌은 그의 염일 수 있다. 본 명세서에서 D-판토산, D-판토텐산 및 β-알라닌이 언급될 경우, 유리 형태 뿐만 아니라 그의 염도 포함된다. D-판토산, D-판토텐산 및 β-알라닌의 염에는 알칼리 금속 및 알칼리 토금속과의 염이 포함된다. 모든 경우에, 칼슘염, 나트륨염 및 칼륨염이 바람직하다.

본 발명의 D-판토텐산 및 D-판토산의 합성방법은 판토텐산 및 D-판토산을 생성할 수 있는 미생물을 배양하여 글루코스와 같은 각종 탄소 공급원으로부터 미생물학적으로 D-판토산을 제조하고, 이 D-판토산을 배지내에 축적시키거나, 예를들어 배지에 β-알라닌을 첨가하여 미생물을 β-알라닌과 접촉시킴으로써 D-판토산을 β-알라닌으로 축합하여 D-판토텐산을 제조한다. β-알라닌의 존재하에 D-판토텐산 또는 D-판토산을 생성할 수 있는 미생물을 본 발명에 사용할 수 있다. 특히, 바람직한 것은 시트로박터(Citrobacter) 속, 시겔라(Shigella)속, 클렙시엘라(Klebsiella)속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 살모넬라(Salmonella) 속 및 에스케리키아(Escherichia)속에 속하는 미생물과 같은 엔테로박테리아새아애과에 속하는 미생물이다. 좀 더 바람직하게는, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) K-12(IFO 3301) 및 에스케리키아 콜리 IFO 3547과 같이, 문헌 [List of Cultures, 8th edition, 1988, 발효 연구소 출판]에 기재된 공지된 에스케리키아 콜리의 균주를 포함하여, 에스케리키아 속에 속하는 미생물 및 그로 부터 유래된 미생물이 본 발명에 사용된다.

에스케리키아 속 및 그외의 속의 미생물을 이용하여 당과 같은 탄소원으로부터의 새로운 합성에 의한 보다 효율적이고 경제적인 D-판토산의 제조방법을 개발하기 위한 시도로서, 본 발명자들은 연구를 수행하였으며, 인위적으로 살리실산 내성이 되게 했을 경우 다량의 D-판토산을 생성할 수 있는 균주를 발견하였다. 본 발명자들은 또한 상기와 같은 미생물을 탄소 공급원을 함유하는 배지내에서 β-알라닌과 접촉시킴으로써 다량의 D-판토텐산을 축적할 수 있음을 발견하였다.

또한, 본 발명자들은, 상기 살리실산 내성 균주에 α-케노이소발레르산 내성, α-케토부티르산 내성, α-아미노부티르산 내성, β-히드록시아스파르트산 내성 및/또는 O-메틸트레오닌 내성을 부여함으로써 D-판토텐산을 보다 고농도로 제조할 수 있음을 발견하였다.

본 발명의 방법에 사용되는 돌연변이체에는 D-판토산 또는 D-판토텐산을 생성할 수 있는 엔테로박테리아새아애과, 특히 에스케리키아 속에 속하는 미생물이 포함된다. 구체적으로, 상기 돌연변이체는 살리실산 내성인 에스케리키아 콜리 FV 5714(IFO 15368), 살리실산 및 α-케토이소발레르산 모두에 내성인 에스케리키아 콜리 FV 525(IFO 15369), 살리실산, α-케토이소발레르산 및 α케토부티르산 내성인 에스케리키아 콜리 FV 814(IFO 15370), 살리실산, α-케토이소발레르산, α-케토부티르산 및 α-아미노부티르산 내성인 에스케리키아 콜리 FV 521, 살리실산, α-케토이소발레르산, α-케토부티르산 및 β-히드록시아스파르트산 내성인 에스케리키아 콜리 FV 221, 살리실산, α-케토이소발레르산, α-케토부티르산, β-히드록시아스파르트산 및 O-메틸트레오닌 내성인 에스케리키아 콜리 FV 6051 및 에스케리키아 콜리 FV 5069에 의해 예시된다.

본 발명을 위한 돌연변이체 FV 5714는, 모균주로서 에스케리키아 콜리 IFO 3547에 UV 조사와 같은 고유 돌연변이 처리 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘과 같은 화학제제 처리를 수행한 다음, 이를 모균주가 증식할 수 없을 정도의 농도의 살리실산을 함유하는 한천 플레이트 배지상에 배양하고 플레이트 배지상에서 증식하는 콜로니를 분리함으로써 수득된다. 유사하게. FV 525는 모균주가 증식할 수 없을 정도의 농도의 α-케토이소발레르산을 함유하는 한천 플레이트 배지상에서 모균주로서 FV 5714를 배양한 다음, 플레이트 배지상에서 증식하는 콜로니를 분리함으로써 수득된다. FV 814는 모균주가 증식할 수 없을 정도의 농도의 α-케토 부티르산을 함유하는 한천 플레이트 배지상에서 모균주로서 FV 525를 배양한 다음, 플레이트 배지상에서 증식하는 콜로니를 분리함으로써 수득된다. FV 521는 모균주가 증식할 수 없을 정도의 농도의 α-아미노부티르산을 함유하는 한천 플레이트 배지상에서 모균주로서 FV 814를 배양한 다음, 플레이트 배지상에서 증식하는 콜로니를 분리함으로써 수득된다. FV 221는 모균주가 증식할 수 없을 정도의 농도는 β-히드록시아스파르트산을 함유하는 한천 플레이트 배지상에서 모균주로서 FV 814를 배양한 다음, 플레이트 배지상에서 증식하는 콜로니를 분리함으로써 수득된다. FV 6051은 모균주가 증식할 수 없을 정도의 농도의 O-메틸트레오닌을 함유하는 한천 플레이트 배지상에서 모균주로서 FV 221를 배양한 다음, 플레이트 배지상에서 증식하는 콜로니를 분리함으로써 수득된다. FV 5069는 모균주가 증식할 수 없을 정도의 농도의 α-케토 부티르산을 함유하는 한천 플레이트 배지상에서 모균주로서 FV 6051를 배양한 다음, 플레이트 배지상에서 증식하는 콜로니를 분리함으로써 수득된다.

본 발명의 목적에 기여하는 균주를 최종적으로 수득하는데 있어서, 살리실산, α-케토이소발레르산, α-케토부티르산, α-아미노부티르산, β-히드록시아스파르트산 및 O-메틸트레오닌과 같은 약제에 대한 내성을 순서에 상관없이 균주에 부여할 수 있다. 또한 α-케토이소발레르산, α-아미노부티르산 및 O-메틸트레오닌을 4-아자루이신, 4-티아이소루이신 및 노르발린과 같은 공지의 측쇄 아미노산 동족체로 대체할 수 있다.

살리실산, α-케토이소발레르산, α-케토부티르산, α-아미노부티르산, β-히드록시아스파르트산 또는 O-메틸트레오닌에 대한 상술한 균주의 내성도를 하기 시험예에 나타낸다.

[시험예]

표 1에 나타낸 조성이 배지(이후 특별한 언급이 없으면 "%"는 "w/v %"를 의미함)를 121℃에서 10분간 가열멸균한 후, 멸균하기 위해 예비 여과된 살리실산 또는 α-케토이소발레르산, α-케토부티르산, α-아미부티르산, β-히드록시아스파르트산 또는 O-메틸트레오닌을 표 2에 나타낸 농도로 첨가한다. 다음, 배지를 직경이 9㎝인 멸균 패트리 디쉬에 분배한다. 각각의 상기 한천 배지에 표 2에 구체화한 것과 같은 에스케리키아콜리 IFO 3547, FV 5714, FV 525, FV 814, FV 521, FV 221, FV 6051 및 FV 5069로부터 선택된 균주의 배양액 0.1ml를 첨가하고, 최소 배지에서 24시간 동안 배양한 다음 30시간 동안 배양한다. 증식정도를 표 2에 나타낸다.

표 2에서, 부호는 하기의 의미를 갖는다:

++:증식 매우 양호, +:증식 양호, ±:증식 빈약, -:증식하지 않음.

한편, 상술한 D-판토텐산의 제조방법을 바탕으로, 본 발명자들은 특정 과의 미생물의 염색체로부터 유래된, 판토텐산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자 부위 또는 그 부위의 일부를 갖는 벡터를 함유하는 미생물 과가 고농도의 D-판토텐산 및/또는 D-판토산을 축적함을 발견하였다.

본 명세서에 서술된 판토텐산 생합성에 관련된 유전자는 각각 케토판토 산염 히드록시메틸전이효소, 판토텐산염 합성효소 및 아스파르트산염-α-탈카르복실화 효소와 같은 효소에 상응하는 panB, panC 또는 panD이다.

그러한 DNA의 공여체 미생물에는 상술한 미생물, 바람직하게는 판토텐산을 생성할 수 있는 에스케리키아 미생물이 포함된다. 구체적으로, 이들은 에스케리키아 콜리 K-12(IFO 3301) 및 에스케리키아 콜리 IFO 3547과 같이 문헌[List of Cultures, 8th edition, 1988, 오오사까 발효 연구소 출판]에 기재된 공지 균주에 의해 예시된다. 에스케리키아 콜리 FV 5714, FV 525, FV 814, FV 521, FV 221, FV 6051 및 FV 5069와 같은 상술한 돌연변이체를 사용하는 것이 보다 효과적이다.

판토텐산 또는 그의 염을 생합성하는데 관련된 유전자를 함유하는 DNA 단편을 제조하는 방법에는, 먼저 문헌 「H. Saito and K. Miura in Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)」에 기재된 것과 같은 공지의 방법 또는 그와 유사한 방법에 의해 염색체 DNA를 공여체 미생물로부터 추출한 다음, 이를 제한 효소 EcoRI로 절단하는 방법이 포함된다. 다음, 판토텐산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자를 함유하는 상기와 같이 수득된 염색체 DNA 단편을 벡터 DNA로 삽입한다.

본 발명에 사용되는 벡터 DNA는 수용체 미생물 내에서 증식할 수 있는 것으로 부터 적절하게 선택될 수 있다. 수용체 미생물 내에서 증식할 수 있는 플라스미드에는, 이에 제한되지는 않지만 pSC 101 [Proceedings of the national Academy of Sciences of the USA, 70, 3240(1973)] 및 pBR 322[Gene, 4, 121, (1978)]이 포함되며; 본 발명의 목적을 달성할 수 있기만 하면 새로이 분리 또는 합성된 벡터 DNA류를 사용할 수 있다.

판토텐산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자를 함유하는 DNA 단편을 상기 플라스미드 벡터에 삽입하는 것은 문헌 [T. Maniatis et al. in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, University of Tokyo Press, 1982]에 기재된 공지의 방법, 또는 이를 바탕으로 한 방법에 의해 달성될 수 있다.

판토텐산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자를 갖는 플라스미드 벡터를 수용체 미생물로 도입하기 위해서, 문헌 [Journal of Molecular Biology, 53, 159(1979)]에 기재된 것과 같은 공지의 형질전환 방법 또는 이를 바탕으로 한 방법을 사용할 수 있다. 수용체 박테리아의 예에는 에스케리키아 콜리 C600균주[Bacteriology Review, 36, 525(1972)]와 같은 공지의 균주가 포함된다.

판토텐산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자를 갖는 플라스미드를 함유하는 형질전환체는 DNA 수용체로서의 판토텐산 영양 요구성 변이체를 형질전환시키고, 형질전환의 결과로서 무-판토텐산 배지에서 증식할 수 있게 된 균주를 선택함으로써, 형질전환체 중에서 선택할 수 있다. 이 선택은 플라스미드 DNA 마커로서 작용하는 균주를 선택하도록 하는 배지를 이용했을 경우 촉진된다. 판토텐산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자를 갖는 상기와 같이 수득된 벡터 DNA를 사용하여, 재조합 DNA를 갖는 균주로부터 재조합 DNA를 추출하고 이를 다른 수용체 미생물로 도입하거나, 추출된 재조합 DNA로부터, 판토텐산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자를 함유하는 DNA단편을 제조하여 이를 다른 벡터 플라스미드와 결찰시킬 수 있다.

상기와 같이 수득된 형질전환체의 예에는 하기가 포함된다:

에스케리키아 콜리 3547/pFV 31 균주(IFO 15371)

에스케리키아 콜리 5714/pFV 31 균주(IFO 15372)

에스케리키아 콜리 525/pFV 31 균주(IFO 15373)

에스케리키아 콜리 814/pFV 31 균주(IFO 15374) (FERM BP 4401)

에스케리키아 콜리 521/pFV 31 균주

에스케리키아 콜리 221/pFV 31 균주(IFO 15524)

에스케리키아 콜리 6051/pFV 31 균주(IFO 15525), 및

에스케리키아 콜리 5069/pFV 31 균주(IFO 15526) (FERM BP 4395).

상기 에스케리키아 콜리 3457/pFV 31 균주는, 판토텐산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자를 갖는, 에스케리키아 콜리 FV 525 유래의 플라스미드 pFV 31을 IFO 3547 균주에 도입함으로써 수득되며, 에스케리키아 콜리 FV 5714/pFV 31 균주는 pFV 31을 FV 5714 균주에 도입함으로써 수득되고, 에스케리키아 콜리 525/pFV 31 균주는 pFV 31을 FV 525 균주에 도입함으로써 수득되고, 에스케리키아 콜리 814/pFV 31 균주는 pFV 31을 FV 814 균주에 도입함으로써 수득되고, 에스케리키아 콜리 52/pFV 31 균주는 pFV 31을 FV 221 균주에 도입함으로써 수득되고, 에스케리키아 콜리 6051/pFV 31 균주는 pFV 31을 FV 6051 균주에 도입함으로써 수득되고, 에스케리키아 콜리 6051/pFV 31 균주는 pFV 31을 FV 6051 균주에 수득되며, 에스케리아 콜리 5069/pFV 31 균주는 pFV 31을 FV 5069균주에 도입함으로써 수득된다.

본 명세서에서, IFO 번호는 오오사까 발효연구소(일본 오오사까시 요도가와꾸 쥬소 혼마찌 2-17-85)의 수탁 번호를 나타내고, FERM BP 번호는 공업 과학 기술원 발효 연구소(일본국 이바라끼 쯔꾸바시 히가시 1-1-3)의 부다페스트 조약하의 수탁번호를 나타낸다.

상기와 같이 수득된 균주는 고정 배양, 진탕 배양(회전 진탕 배양 등) 및 통기 스피너(spinner) 배양과 같은 통상적인 배양법에 의해 연속적 또는 간헐적으로 배양할 수 있다. 사용된 배지는 사용된 미생물의 증식을 허용하는 통상의 조성일 수 있다. 미생물이 축적할 수 있는 탄소공급원은 탄화수소, 유지, 지방산, 유기산 및 알콜로 부터 적절히 선택되며 이들은 단독으로 또는 배합하여 사용된다. 질소 공급원에는 예를들어 펩톤, 콩가루, 면실가루, 옥수수 침지액, 이스트 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물 및 요소와 같은 유기 질소 공급원, 및 황산 암모늄, 염화 암모늄, 질산 암모늄 및 인산 암모늄과 같은 무기 질소 공급원이 포함되며, 이들은 필요에 따라 단독으로 또는 배합하여 사용된다. 또한, 인산 공급원으로서는 모노포타슘 포스페이트 또는 디포타슘 포스페이트를 사용하는 것이 유리하다. 배지에는 통상적으로, 증식에 필요한 금속염(예:황산 마그네슘), 및 아미노산 및 비타민과 같은 필수 증식 인자 및 증식 촉진제 뿐만 아니라 탄소 공급원, 질소 공급원 및 인산 공급원을 보충할 수 있다. 배양 pH 및 기포 발생을 조절하기 위해서, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 및 탄산칼슘과 같은 염기성 물질을 적절하게 첨가할 수 있으며, 소포제를 첨가하는 것이 효과적이다. 상기 물질들은 배양도증 필요에 따라 첨가될 수 있다. 산소 살포도 또한 호기성 조건하의 환경을 유지하는데 효과적이다. 통상적으로 15~45℃의 범위, 바람직하게는 25~40℃의 범위 이내의 배양 온도를 유지하는 것이 유리하다. 배양은 축적된 판토텐산 및/또는 판토산의 양이 실질적으로 최대에 다할때까지 계속하며; 본 발명의 목적은 보통 6~120시간이내에 달성될 수 있다.

D-판토텐산 제조시, 균주 배양 개시 전 또는 도중의 적당한 때에 출발물질을 첨가하거나, 적당한 때에 출발물질을 처리 세포에 첨가함으로써 출발물질 β-알라닌을 세포와 접촉시킬 수 있다. 상술한 처리 세포에는 세척된 세포 배양물, 및 아세톤 분말, 폴리아크릴아미드겔 또는 K-카라기난에 포함 및 고정된 세포가 포함된다. 물과 같은 적절한 용매 중의 용액 또는 현탁액의 형태 또는 분말의 형태인 출발물질을 한꺼번에, 또는 주어진 시간에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 첨가한다.

첨가된 β-알라닌의 농도는 배지에 첨가시 바람직하게는 미생물의 생산성과 일치하며; 경제성을 고려하여 0.1~5w/v%, 더 바람직하게는 0.5~3w/v%의 농도의 β-알라닌을 첨가하는 것이 바람직하다.

상술한 배양물 또는 반응 생성물로부터 D-판토텐산 또는 그의 염을 분리할 경우, 통상적인 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를들어, D-판토텐산 또는 그의 염은 배양액으로부터 세포를 제거한 다음, 이온 교환 수지 처리, 활성화 챠콜 등을 이용한 흡착제 처리, 결정화, 염석 및 전기 투석과 같은 1종 이상의 공지 방법을 수행함으로써 분리될 수 있다.

상기 반응에 의해 수득된 D-판토텐산의 유리 형태는 통상적인 방법에 의해 염으로 전환될 수 있으며; 반응에 의해 수득된 D-판토텐산의 염은 통상적인 방법에 의해 유리 형태로 변환될 수 있다.

예를들어, 판토텐산 칼슘은 하기와 같이 분리될 수 있다.

판토텐산 또는 그의 염을 함유하는 배양액으로부터 세포를 제거한다. 이 액을 양이온 교환 수지 컬럼(예:DIAION PK-216(H형) 또는 PK-228(H형), 모두 Mitsubishi Chemical Industries제)에 통과시켜 양이온을 제거한 다음, 음이온 교환 수지 컬럼(예:DIAION PA-412(OH형) 또는 WA-30(OH형), 모두 Mitsubishi Chemical Industries제)에 통과시켜 무기 음이온 및 판토텐산 보다 더 산성인 유기산을 제거한다. 수산화 칼슘을 첨가함으로써 유출액(pH 3±1)을 거의 중성 pH(pH 7±2)로 조정한 후, 활성화 챠콜(예:시라사기 A, Takeda Chemical Industries 제)을 첨가한 다음, 여과한다. 생성된 여액을 농축하고 저급 알콜(예:메탄올, 에탄올, 이소프로판올)의 적절한 양을 첨가한 후, 씨 결정을 첨가하여 D-판토텐산 칼슘을 결정화하고, 생성된 D-판토텐산 칼슘 결정을 분리 및 건조한다.이 D-판토텐산 칼슘 결정의 수율이 불충분할 경우, 미합중국 특허 제2,957,025호(Jonathan O. Brooks에 의해 1960년 10월 18일에 출원) 및 일본국 특허 공고 제49571/1972호에 기재된 방법에 따라, 결정화전에 염화 칼슘을 적절히 첨가함으로써 D-판토텐산 칼슘 및 염화 칼슘의 착염을 고수율 및 고순도로 결정화할 수 있다.

상기 목적으로 첨가된 염화칼슘은 무수염, 2수화염 또는 6수화염의 결정일 수 있지만, 바람직한 것은 무수염 또는 2 수화염이다. 첨가된 염화 칼슘의 양은 보통 판토텐산 칼슘의 0.5~5배 몰비, 바람직하게는 1~3배 몰비이다. 판토텐산 칼슘 및 염화 칼슘의 상기 착염에 관해서는, 미합중국 특허 제2,957,025호(Jonathan O. Brooks에 의해 1960년 10월 18일에 출원 됨)에 비흡습성이고 동물 사료 첨가제로서 유효함이 기재되어 있으며; 영국 특허 제933,699호에 정제내에서 판토텐산 칼슘보다 안정함이 기재되어 있다.

상기와 같이 수득된 D-판토텐산 칼슘 및 염화 칼슘의 착염으로부터 염화 칼슘을 제거하여 고수율의 D-판토텐산 칼슘을 수득하는 방법에 관한 보고는 없었다. 본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위한 각종 방법을 집중적으로 연구한 결과, 매우 효과적인 전기 투석법을 개발했다. 구체적으로, 본 발명자들은 염소 이온은 통과시키나 판토텐산은 통과시키지 않는 음이온 투과성 막(예:1가 이온 선택적 투과성 막 Neocepter ACS, Tokuyama Soda 제), 및 전극액으로서 질산칼슘 수용액을 이용하여 전기투석함으로써 D-판토텐산 칼슘 및 염화 칼슘의 착염 수용액으로부터 염화 칼슘을 효과적으로 제거할 수 있음을 발견하였다. 수용액 중 상기 착염의 농도는 임의적이기는 하지만, 통상적으로 1~60%(w/v), 바람직하게는 4~40%(w/v)의 농도 범위 이내에서 용해된다. 상기 전기 투석 처리에 의해 수득된 D-판토텐산 칼슘의 수용액에 분무건조와 같은 통상적인 처리를 수행하여 D-판토텐산 칼슘의 분말을 수득한다

D-판토텐산 칼슘은 상기와 같이 배양액으로부터 효율적으로 분리될 수 있다.

D-판토산은 배양액으로 부터 세포를 제거하고, 황산 또는 염산을 이용하여 액체의 pH를 1~2로 조정하고, 판토락톤으로 유도하고, 판토산의 유도체를 고리화하고, 이를 용매(예:이소프로필 아세테이트, 에틸 아세테이트)를 이용하여 추출한 다음 농축 및 결정화를 수행하여 결정을 수득함으로써 분리될 수 있다. 상기와 같이 수득된 판토락톤은 수산화 나트륨 등의 첨가에 의해 판토산으로 용이하게 복귀될 수 있다.

본 발명을 이후에 본 발명의 유일한 구현예인 하기 실시예에 의해 보다 상세하게 기재하며, 이는 본 발명의 범위를 결코 제한하지 않는다.

D-판토텐산은 고성능 액체 크로마토그래피[컬럼:시마쯔 SCR 101 H(7.9㎜직경×30㎝):이동상:0.008N 황산;흐름속도:0.8ml/분;검출기:차동 굴절계] 및/또는 미생물학적 분석[지시 균주:락토바실루스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) IFO 3070; 배지:시판되는 판토텐산 분석 배지(DIFCO 제)]에 의해 정량화된다. 판토산의 정량적 측정 및 광학순도 측정은, 원심분리에 의해 배양액으로 부터 세포를 제거하고 상청액에 6N 염산을 첨가한 다음 80℃의 물증탕에서 15분간 가열한 후(이 공정에 의해 평형상태의 판토산이 판토락톤으로 변환됨), 에틸 아세테이트 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피[컬럼:SUMICHIRAL OA-1200;이동상:n-헥산/1, 2-디클로로에탄/에탄올=90/8/2;흐름속도:1.0ml/분;검출기:UV]함으로써 수행된다.

[실시예 1]

표 3에 나타낸 조성의 1차 멸균 종자 배지 20ml를 함유하는 200ml 원뿔형 플라스크에 사면 배지 유래의, 1 백금륜의 에스케리키아 콜리 IFO 3547 균주, FV 5714(IFO 15368)균주, FV 525(IFO 15369)균주, FV 814(IFO 15370)균주 또는 FV 521 균주를 접종시킨 다음, 220rpm으로 30℃에서 20시간 동안 회전 진탕 배양한다. 이 1차 종자 배양물 1ml씩을, 표 4에 나타낸 조성의 멸균 배지 20ml를 함유하는 200ml 이랑무늬 원뿔형 플라스크에 옮긴 다음, 38℃에서 20시간 동안 배양한 직후에, 각 플라스크에 2.5ml의 54% 글루코스 수용액을 첨가하여 24시간 이상 배양한다. 배양 완료후, 생성된 판토산의 양 및 광학 순도, 및 축적된 판토텐산의 양을 표 5에 나타낸다.

[실시예 2]

표 3에 나타낸 조성의 1차 멸균 종자 배지 20ml를 함유하는 200ml 원뿔형 플라스크에 각각 사면 배지 유래인 1 백금륜의 에스케리키아 콜리 FV 221 균주, FV 6051 균주 또는 FV 5079 균주를 접종시킨 다음, 220rpm으로 30℃에서 20시간 동안 회전 진탕 배양한다. 상기 1차 종자 배양물 1ml씩을, 표 6에 나타낸 조성의 멸균 배지 40ml를 함유하는 200ml이랑 무늬 원뿔형 플라스크에 옮기고, 38℃에서 20시간 동안 배양한 직후, 각 플라스크에 54% 글루코스 수용액 5ml를 첨가한 다음 24시간 이상 배양한다. 배양 완료후, 생성된 판토산의 양 및 광학순도, 및 축적된 판토텐산의 양을 표 7에 나타낸다.

[실시예 3]

ⅰ) 염색체 DNA의 제조

D- 판토텐산을 생성할 수 있는 에스케리키아 콜리 FV 525 균주를 1ℓ의 L배지(1.0% 박토트립톤, 0.5% 이스트 추출물, 0.5% 염화 나트륨)에 접종시킨 다음, 37℃에서 하룻밤 배양한다. 최종적으로, 페놀을 이용하여 사이또등(Saito et al.)의 방법[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)]에 의해 세포로부터 염색체 DNA 3.3㎎을 수득한다.

ⅱ) 염색체 DNA의 벡터 플라스미드 pMW 118로의 삽입

하기 실험 공정들은 특별한 언급이 없으면 문헌[T. Maniatis et al. in Molecular Cloning, University of Tokyo Press 출판, 1982]에 기재된 방법에 따른다.

상기 i)에서 수득된 염색체 DNA 10㎍ 및 pMW118(Nippon Gene 제)을 각각 제한 효소 EcoRI(Nippon Gene 제)로 절단한 다음, T4 파지-유래 DNA 리가아제(Nippon Gene 제)의 존재하에 혼합 및 결찰한다.

ⅲ) 판토텐산 생합성계 유전자의 클로닝

감응 세포(competent cell) 방법에 의해 형질전환을 수행한다. 구체적으로, 에스케리키아 콜리 C600 균주로부터 니트로소구아니딘 돌연변이 유발에 의해 유래된 D-판토텐산 영양 요구성 변이주 A4C(IFO 15251, FERM BP-3677)를 이용하여 감응 세포를 제조한다. 이 현탁액에, 상기 ⅱ)에서 제조된 플라스미드 DNA를 첨가하여 형질전한을 위해 이를 혼입한다. 다음, 이 형질전환체를 함유하는 현탁액을 암피실린의 나트륨염 50㎍/ml으로 보충된 M-9 한천배지(0.6% 디소듐 히드로겐 포스페이트, 0.3% 포타슘 디히드로겐 포스페이트, 0.1% 염화 암모늄, 0.05% 염화 나트륨, 1mW 황산 마그네슘, 0.1mM 염화 칼슘, 0.5% 글루코스, 10㎍/ml 비타민 B₁, 50㎍/ml 트레오닌, 50㎍/ml 루이신, 1.5% 한천, pH 7.2)의 배양 플레이트상에 얇게 펼친 다음, 37℃에서 2일간 배양한다.

플레이트 배지상에서 증식하는 콜로니로 부터, 암피실린 내성이고 D-판토텐산을 생성할 수 있는 형질전환체를 수득한다. 에스케리키아 콜리 FV 525의 염색체 DNA 유래의 삽입 부위를 갖는 플라스미드를 이용하여 상기와 같이 형질전환된 A4C 균주를 A4C/pFV 31 균주(IFO 15367)라 명명한다.

ⅳ) 형질전환체로 부터 플라스미드의 추출

최종적으로, 형질전환체 에스케리키아 콜리 A4C/pFV 31 균주의 배양액 1ℓ로부터 600㎍의 플라스미드를 수득하여 pFV 31로 명명한다.

ⅴ) 플라스미드 pFV 31의 분석

각종 제한 효소를 이용하여 pFV 31을 절단하고 아가로스 겔 전기영동을 수행한다. 전기 영동 패턴으로부터, 람다 파지 DNA(Nippon Gene 제) Hind Ⅲ 절단 생성물의 분자량을 기준으로 제1도에 나타낸 제한 효소 지도를 작성한다. pFV 31은 pMW 118의 EcoRI 부위에 약 2.5kb DNA 단편을 갖는 재조합 플라스미드인 것으로 밝혀졌다.

ⅵ) 재-형질전환

pFV 31 상에서 판토렌산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자의 존재를 확인하기 위해, 모두 에스케리키아 콜리 C 600 균주로부터의 니트로소구아니딘 돌연변이 유발에 의해 유래된, α-케토판토산 영양 요구성 변이주 AIB, β-알라닌 영양 요구성 변이주 A170 및 판토텐산 영양 요구성 변이주 A4C를 상기 플라스미드 DNA를 이용하여 재-형질전환한다. 생성된 모든 형질전환체는 상기 M-9 한천 배지상에서 증식될 수 있으며, 이는 pFV 31상에서 케토판토산염 히드록시메틸전이효소, 아스파르트산염-α-칼카르복실화 효소 및 판토텐산 합성 효소 유전자의 존재를 입증한다.

또한, 형질 전환체의 판토텐산 생성 능력에 대한 영향을 확인하기 위해, 에스케리키아 콜리 IFO 3547 균주, FV 5714, FV 525, FV 814, FV 521, FV 221, FV 6051 및 FV 5069를 pFV 31을 사용하여 형질전환시킨다. 상기와 같이 수득된 형질전환체를 각각 에스케리키아 콜리 3547/pFV 31 균주, 5714/pFV 31 균주, 525/pFV 31 균주, 814/pFV 31 균주, 521/pFV31 균주, 221/pFV 31 균주, 6051/pFV 31 균주 및 5069/pFV 31 균주로 명명한다.

[실시예 4]

표 3에 나타낸 조성의 액체 배지를 121℃의 오토클레이브에서 15분간 가열살균한 다음, 플라스크당 20ml 씩 200ml 원뿔형 플라스크에 분배한다. 각 플라스크에 사면 배지로부터 실시예 3의 ⅵ)에서 수득된 1 백금륜의 에스케리키아 콜리 3547/pFV 31 균주, 5714/pFV 31 균주, 525/pFV 31 균주, 814/pFV 31 균주 또는 521/pFV 31 균주를 접종시킨 다음, 220rpm으로 30℃에서 20시간 동안 회전 진탕 배양한다. 이 종자 배양물 1ml씩을, 표 4에 나타낸 조성의 배지 20ml에 옮긴 다음, 200ml이랑무늬 원뿔형 플라스크에서 38℃로 20시간 동안 배양한 직 후, 각 플라스크에 54% 클루코스 수용액 2.5ml를 첨가한 다음 24시간 이상 동안 배양한다. 배양완료후, 생성된 판토산의 양 및 광학순도, 및 축적된 판토텐산의 양을 표 8에 나타낸다.

[실시예 5]

표 3에 나타낸 조성의 액체 배지를 121℃의 오토클레이브에서 15분간 가열살균한 다음, 플라스크당 20ml씩 200ml 원뿔형 플라스크에 분배한다. 각 플라스크에 사면 배지로부터 실시예 3의 ⅵ)에서 수득된 1 백금륜의 에스케리키아 콜리 221/pFV 31 균주, 6051/pFV 31 균주 또는 5069/pFV 31 균주를 접종시킨 다음, 220rpm으로 30℃에서 20시간 동안 회전 진탕 배양한다. 이 종자 배양물 2ml씩을 표 6에 나타낸 조성의 배지 40ml에 옮긴 다음, 200ml이랑무늬 원뿔형 플라스크에서 38℃로 24시간 동안 배양한 직 후, 각 플라스크에 54% 클루코스 수용액 5ml를 첨가한 다음 24시간 더 배양한다. 배양완료후 생성된 판토산의 양 및 광학순도, 및 축적된 판토텐산의 양을 표 9에 나타낸다.

[실시예 6]

표 3에 나타낸 조성의 1차 멸균 종자 배지 20ml를 함유하는 200ml 원뿔형 플라스크에, 사면 배지로 부터 1 백금륜의 에스케리키아 콜리 814/pFV 31균주를 첨가한 다음, 220rpm으로 30℃에서 24시간 동안 회전 진탕 배양한다. 이1차 종자 배양물 20ml씩을, 동일한 조성의 2차 멸균 종자 배지 200ml를 함유하는 1000ml 원뿔형 플라스크로 옮긴 다음, 220rpm으로 30℃에서 24시간 동안 회전 진탕 배양한다. 이 2차 종자 배양물 125ml 씩을, 250g의 글루코스, 12.5g의 옥수수 침지액, 37.5g의 황산 암모늄, 1.25g의 모노포타슘 포스페이트, 2.5g의 디포타슘 포스페이트, 0.5g의 황산 마그네슘, 75g의 탄산 칼슘 및 33g의 β-알라닌(pH 7.0)을 함유하는 멸균 배지 2.3ℓ를 함유하는 5ℓ쟈 발효기로 옮긴 다음, 통기 (0.8 vol/vol/분) 및 교반(800rpm) 하면서 38℃에서 배양한다. 배양 개시후 16~62시간동안에 걸쳐서 글루코스를 연속적으로 첨가하여 그의 농도를 2%~3%로 유지시킨다. 68시간 동안 배양 후, 최종 액체 부피는 2.5ℓ이고 생성된 D-판토텐산의 양은 38.5g/ℓ이다.

[실시예 7]

실시예 6에서 수득된 발효액 2.0ℓ씩(77.0g의 D-판토텐산 함유)을 가열(80℃, 10분) 한 다음 여과하여 세포 및 불용성 물질을 제거한다. 여액을 세척액과 합하여 2.4ℓ의 액체를 수득하고, 이를 600ml의 DIAION PK-216(H형)으로 충진된 컬럼에 통과시킨 다음, 340ml의 DIAION PA 412(OH형)으로 충진된 컬럼에 통과시켜 물 유출액과 합하여 총 4.1ℓ인 처리액(pH 3.2)을 수득한다. 이 처리액에 수산화 칼슘을 첨가하여 pH 6.8로 조정한 다음, 5g의 활성화 챠콜(시라사기 A)를 첨가하고 여과한다. 여액 및 세척액을 합하여, 75.1g의 D-판토텐산을 함유하는 액체 4.2ℓ를 수득하고, 이로 부터 계산하여 D-판토텐산 칼슘 함량은 82.0g이다. 이 액체는 결정화용 출발 액체로서 사용된다.

상기와 같이 수득된 출발물질 결정액 4.2ℓ의 2.1ℓ씩(41.0g의 D-판토텐산 칼슘을 함유)을 D-판토텐산 칼슘의 최종 농도가 약 43%(w/w)가 되도록 감압 농축한다. 이 농축액에 410ml의 메탄올을 첨가하고 0.5g의 씨 결정을 첨가한 다음, 30℃에서 5시간 동안 점진적으로 교반한다. 다음, 액체를 5℃에서 14시간 동안 방치한 후, 여과에 의해 결정을 분리하고 건조시킨다. 수득된 결정의 중량은 6.3g이고 순도는 98.5%이다.

[실시예 8]

실시예 7에서 수득된 출발 물질 결정액 4.2ℓ의 2.1ℓ씩(41.0g의 D-판토텐산칼슘을 함유)을 D-판토텐산 칼슘 최종 농도가 약 43%(w/w)가 되도록 감압 농축한다. 이 농축액에 100ml의 메탄올을 첨가한다. 완전히 혼합한 후, 염화 칼슘 2 수화물 37.94g의 메탄올 용액 310ml를 첨가하고 0.5g의 씨 결정을 첨가한 다음, 50℃에서 5시간 동안 점진적으로 교반한다. 여과에 의해 결정을 수거하고 건조시킨다. 수득된 결정의 중량은 41.95g이고 조성은 74.3%(w/w)D-판토텐산, 13.6%(w/w) Ca 및 12.1%(w/w) Cl이다. 이 발견으로 부터, 상기 결정이 D-판토텐산 및 염화 칼슘의 몰비 1:1의 착염임이 입증된다.

상기 착염 40g의 약 2ℓ의 물에 용해시키고, 전기투석기[TS-2-10 모델(Tokuyama Soda);양이온 투과성막:Neocepter CM-1;음이온 투과성막:Neocepter ACS;전극액:0.2N 질산 칼슘 수용액;흐름속도:0.3ℓ/분;전압:10V]를 이용하여 전기 투석을 수행한다. 그 결과, 염화 칼슘은 계 외로 제거되고, 몰비 2:1의 D-판토텐산 및 칼슘을 함유하는 D-판토텐산 칼슘 수용액(pH 7.0)을 수득한다. 이 D-판토텐산 칼슘 수용액을 약 50%(w/w)의 농도로 감압농축시킨 다음, 분무 건조기를 이용하여 분무건조기켜 34.0g의 D-판토텐산 칼슘 분말을 수득한다. 이 분말의 D-판토텐산 칼슘순도는 99.8%(w/w)([α]_D=+28.1(c=5, H₂O))이다.

[실시예 9]

표 3에 나타낸 조성의 1차 멸균 종자 배지 20ml를 함유하는 200ml 원뿔형 플라스크에, 사면 배지로 부터 1 백금륜의 에스케리키아 콜리 5069/pFV 31균주를 첨가한 다음, 220rpm으로 30℃에서 24시간 동안 회전 진탕 배양한다. 이 1차 종자 배양물 20ml씩을, 동일한 조성의 2차 멸균 종자 배지 200ml를 함유하는 1000ml 원뿔형 플라스크로 옮긴 다음, 30℃에서 24시간 동안 회전 진탕 배양한다. 이 2차 종자 배양물 75ml 씩을, 75g의 글루코스, 30g의 옥수수 침지액, 22.5g의 황산 암모늄, 0.75g의 모노포타슘 포스페이트, 1.5g의 디포타슘 포스페이트, 0.3g의 황산 마그네슘, 45g의 탄산 칼슘 및 0.75㎎의 비타민 B₁및 15g의 β-알라닌을 함유하는 멸균 배지(pH 7.0) 1.35ℓ를 함유하는 3ℓ쟈 발효기로 옮긴 다음, 통기(0.8 vol/vol/분) 및 교반(700rpm) 하면서 38℃에서 배양한다. 글루코스를 배양 개시후 15시간, 27시간 및 38.5 시간후에 간헐적으로 첨가하여 5% 농도를 유지한다. 또한 배양 개시후 27시간 및 46.5시간 후에 β-알라닌을 1% 농도로 첨가하고 배양 개시후 30시간 및 50시간 후에 비타민 B₁, 0.75mg을 첨가한다. 배양 한지 72시간 후에, 최종 액체 부피는 1.58ℓ이고 D-판토텐산의 양은 65.4g/ℓ이다.

Claims

살리실산 내성이며 D-판토산을 생성할 수 있는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물을 배양하여, D-판토산 또는 그의 염을 축적시킨 다음, 축적된 D-판토산 또는 그의 염을 수득함을 특징으로 하는, D-판토산 또는 그의 염의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물이 추가로 α-케토이소발레르산 내성, α-케토부티르산 내성, α-아미노부티르산 내성, β-히드록시아스파르트산 내성 및 O-메틸트레오닌 내성 중에서 선택된 1종 이상의 내성을 갖는 제조방법.
살리실산 내성을 가지며 D-판토산을 생성할 수 있는 에스케리키아 속에 속하는 미생물을 β-알라닌과 접촉시킴을 특징으로 하는 D-판토텐산 또는 그의 염의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 미생물이 추가로 α-케토이소발레르산 내성, α-케토부티르산 내성, α-아미노부티르산 내성, β-히드록시아스파르트산 내성 및 O-메틸트레오닌 내성 중에서 선택된 1종 이상의 내성을 갖는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물이 판토텐산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자 부위 또는 그 부위의 일부를 갖는 플라스미드 DNA로 형질전환된 미생물인 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 미생물이 판토텐산 또는 그의 염의 생합성에 관련된 유전자 부위 또는 그 부위의 일부를 갖는 플라스미드 DNA로 형질전환된 미생물인 제조방법.
살리실산 내성이며, 유전자 panB, panC 및 panD를 함유하는 플라스미드 DNA로 형질전환된, 에스케리키아 속에 속하는 D-판토텐산을 생성할 수 있는 미생물(FERM BP-4401).
유전자 panB, panC 및 panD를 함유하는 플라스미드 pFV31.
제3항에 있어서, 염소이온은 통과시키거나 판토텐산염 이온은 통과시키지 않는 음이온 투과성막 및 전극액으로서 질산 칼슘 수용액을 이용하여 D-판토텐산 칼슘 및 염화 칼슘의 착염의 수용액을 전기 투석함으로써 수득된 D-판토텐산을 D-판토텐산 칼슘 형태로 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
살리실산 내성이며, 유전자 panB, panC 및 panD를 함유하는 플라스미드 DNA로 형질전환된, 에스케리키아 속에 속하는 D-판토텐산을 생성할 수 있는 미생물(FERM BP-4395).