JP4372266B2 - Ｓ，ｓ−エチレンジアミン−ｎ，ｎ’−ジコハク酸製造反応の制御法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物由来のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼの作用によりフマル酸とエチレンジアミンからＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する方法に関し、より詳しくは、電気伝導率計を使用した同製造反応の制御方法に関する。
Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸は生分解性キレート剤として写真、洗剤および製紙等の分野で使用される有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者らは、先に、フマル酸とエチレンジアミンをＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＳＳ−ＥＤＤＳ）に変換する微生物の新規なリアーゼ活性を見い出し（以下、本リアーゼをエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼと呼び、ＥＤＤＳアーゼと略記する）、本触媒作用を利用したフマル酸と各種アミンからの効率的な光学活性アミノポリカルボン酸の製造方法を提案している〔特開平９−１４０３９０号公報参照〕。
しかしながら、ＥＤＤＳアーゼによるＳＳ−ＥＤＤＳ等の光学活性アミノポリカルボン酸生産反応は副反応が極めて少ないものの、平衡反応であるために未反応原料が残存してしまうことが課題であった。これに対し、本発明者らは、反応液に金属イオンを共存させると反応平衡が生産物側に傾き、反応をほぼ完結し得ることを見い出した〔特開平１０−５２２９２号および同１０−２７１９９９号各公報参照〕。
【０００３】
一方、微生物反応の制御に電気伝導率計を使用した報告として、フマル酸とアンモニアのみの原料からアスパルターゼの作用によりアスパラギン酸の製造に適用した例が知られている〔ソビエト連邦特許８５７１１５号公報参照〕。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
酵素は最適基質濃度を持つ場合が多く、また、基質阻害、生成物阻害がある場合もあり、十分な反応速度を得るためには、基質、生成物濃度を最適に保つ必要がある。
また、ＳＳ−ＥＤＤＳ塩は原料であるフマル酸塩よりも一般に溶解度が高く、フマル酸またはその塩をその飽和溶解度以上、すなわちスラリー状態で反応液に存在させても、反応の進行とともにＳＳ−ＥＤＤＳに変換され溶解する現象を確認しており、装置容積に対して効率的なＳＳ−ＥＤＤＳの高濃度蓄積反応が可能である。しかし、スラリー状態の原料は撹拌や連続反応時の障害となる場合がありフマル酸またはその塩を逐次添加する方が好ましいが、フマル酸を常に溶解した状態にするためには、反応液中の原料、生成物濃度を常に把握しなければならない。
【０００５】
一方、回分反応を行う場合には、原料液を反応槽内に添加し、目的とする基質、または生成物濃度に達した時点で反応終了液を回収するが、そのためには反応液組成を迅速に把握する手段を持たなければ、結果として操作時間の延長を招くことになる。
また、この原料添加、反応液回収を同時かつ連続的に行うことで効率的な連続反応とすることができるが、このような操作により目的とする基質、生成物濃度の反応終了液を得るためには、原料添加および反応液回収速度を常に調節しなければならない。
【０００６】
しかしながら、反応液中のＳＳ−ＥＤＤＳの定量は、反応液の一部を分取し液体クロマトグラフィー等により行われるが、このような方法では反応液の状態、すなわち、基質、生成物の濃度を迅速に把握し、随時、反応を操作あるいは制御することは難しく、また、多大な労力を必要とするという問題があった。
【０００７】
さらに、本発明のＳＳ−ＥＤＤＳの製法においては、十分な収率を得るためには大量の金属イオンを添加しなければならず、またｐＨを一定の範囲に維持するために相当量のアルカリまたは酸を必要とし、例えばマグネシウムを添加しＮａＯＨにて反応中のｐＨを維持する場合は、添加したマグネシウムと等モル近いＮａＯＨが必要である。
【０００８】
したがって、本発明は、上述のような複雑な反応系において、随時、反応の操作あるいは制御に連動させるべく、基質、生成物の濃度を如何にして迅速に把握し得るか、その手段を見いだすことを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、前記、微生物法におけるＳＳ−ＥＤＤＳ製造反応において、生成物／基質比および反応液電気伝導率の両者が高い相関性を示し、電気伝導率計を用いることにより反応の進行状態を瞬時かつ連続的に把握できることを見い出した。さらに、電気伝導率計と原料供給および／または反応液回収を連動させることにより、反応系内の原料および生成物を任意の濃度で制御できることを見い出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼ活性を有する微生物またはその調製物の作用により、フマル酸とエチレンジアミンからＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する方法において、反応系内に電気伝導率計を設置し、検知した電気伝導率の変化に基づいて原料供給および／または反応液回収を行い反応を制御することを特徴とするＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸製造反応の制御法である。
【００１１】
上記反応の好ましい態様においては、反応系内にアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、アルミニウム、チタニウムおよびマンガンからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属イオンを存在させる。また、反応に伴うｐＨの変化に対して、反応系内にアルカリまたは酸を添加してｐＨ７〜１０の範囲から選ばれる一定の値にｐＨを保持する。該アルカリとしてはアルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、アンモニアまたはその水酸化物およびエチレンジアミンから選ばれる少なくとも１種であり、該酸としては硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、フマル酸、マレイン酸および Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸から選ばれる少なくとも１種である。
【００１２】
本発明は、反応の進行と共に電気伝導率が有意に低下すること、さらに高濃度の金属イオン存在下に、相当量のアルカリまたは酸を添加して反応中のｐＨを一定に維持する高イオン濃度の反応系においても、驚くべきことに電気伝導率の低下がさらに顕著になることを見い出したことによる。したがって、予め電気伝導率と生成物／基質比の相関データを取得することにより、それに基づいて原料供給および／または反応液回収を操作することで容易に原料、生成物濃度を制御することができる。電気伝導率計は通常、副反応等の影響を大きく受けるため厳密な制御には適用できないが、本発明によるところの微生物反応は極めて副反応が少なく、かつ反応進行とともに十分な電気伝導率変化を示すため、精度の高い制御が可能である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の対象となる微生物は後記のとおりである。
本発明で使用される微生物の培地には何ら特別の制限がなく、資化しうる炭素源、窒素源、無機塩、更に微量の有機栄養物などを適当に含有するものであれば合成培地、天然培地のいずれを用いることもできる。また、培地へのエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、エチレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンなどのアミノ酸やフマル酸等の添加は、目的とする活性の高い菌体が得られることがあり好ましい。培養条件は菌体や培地により異なるが、培地のｐＨは４〜１０、好ましくは６〜９の範囲、培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２５〜３５℃の範囲で、活性が最大となるまで１〜１０日間好気的に培養すればよい。
【００１４】
微生物に存在するフマラーゼ活性は、特願平９−３１１０４６号明細書記載の方法により除去するのが好ましい。除去処理は、菌体または該菌体処理物に対して、ｐＨは８〜１０．５、好ましくは８．５〜１０の範囲、温度は、通常、氷結温度〜５５℃の範囲で、処理時間に制限なく行うことができる。
【００１５】
一般に、ＳＳ−ＥＤＤＳの生産反応はフマル酸とエチレンジアミン、および必要に応じて、アルカリ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、アルミニウム、チタニウムおよびマンガン等の金属イオンを含む水溶液中で、前記微生物またはその調製物、例えば、菌体または該菌体処理物（菌体破砕物、菌体抽出液、抽出した粗・精製酵素、固定化した菌体または酵素、薬剤処理（安定化処理等）した菌体または酵素）を接触させることにより行われるが、菌体培養液にフマル酸とエチレンジアミンおよび該金属化合物を直接添加しても行うこともできる。
【００１６】
本発明における金属イオンは、例えば、Ｍｇ(II)、Ｃａ(II)、Ｓｒ(II)、Ｂａ(II)、Ｆｅ(II)、Ｆｅ(III) 、Ｚｎ(II)）、Ｃｕ(II)、Ｎｉ(II)、Ａｌ(III) 、Ｔｉ(IV)およびＭｎ(II)イオンならびにこれらの各種錯イオンを挙げることができる。
【００１７】
これら金属イオン源としては、金属の水酸化物、酸化物ならびに硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、炭酸および酢酸等の無機または有機酸塩、さらにこれら金属化合物を含む鉱物や本発明の基質であるフマル酸やエチレンジアミンとの化合物等を挙げることができる。これらの化合物は２種以上混合して用いることも可能である。
【００１８】
また、これらの金属化合物中には、水に対し溶解度の低いものあるいは難溶性のものもあるが、これらを飽和濃度以上に、例えば、懸濁状態として存在させた場合でも、ＳＳ−ＥＤＤＳの配位能により相当量が可溶化されるため使用可能である。
【００１９】
反応は、通常、０〜６０℃、好ましくは２０〜４５℃の範囲で行う。ｐＨは、通常、４〜１１、好ましくはｐＨ７〜１０の範囲である。反応で用いるフマル酸の濃度は反応温度やｐＨにより異なるが、通常、０．０１〜３Ｍであり、反応液中に飽和溶解度以上の沈殿物として存在させても反応の進行と共に溶解するため差し支えない。エチレンジアミンの濃度は、通常、０．０１〜２Ｍである。反応液中への金属化合物添加量は生成するＳＳ−ＥＤＤＳに対して、通常、０．０１〜２倍モルである。微生物などの使用量は基質に対する乾燥菌体換算で、通常、０．０１〜５重量％である。
また、原料がいずれかに関わらず、エチレンジアミン、フマル酸を他の化合物から合成し得る反応系を本反応系と共存させたとしても、本発明の効果が得られる限り差し支えない。
【００２０】
電気伝導率計の方式には、交流２電極方式、交流４電極方式、電磁誘導方式等があるが、本発明の効果が得られる限りいずれも使用可能である。電気伝導率計の設定はあらかじめ一定濃度の反応液でのＳＳ−ＥＤＤＳ生成量と検出器の表示値との相関関係を示す検量線を作成しておき、検出器の表示値が所定の幅となるようにすればよい。
【００２１】
原料供給および／または反応液回収の制御は、電気伝導率検出器（通常、電極あるいはセルと呼ばれる）を反応液中に接触させ、その電気信号を増幅器、変換器、リレー等を内蔵する調節器に送り自動で行うか、あるいは電気伝導率を随時モニターしながら手動で行う。回分反応では、目的の基質、生成物に相当する電気伝導率となった時点で反応液を回収すればよいし、また、反応槽内の電気伝導率が一定となるように原料添加と反応液回収を同時に行えば、連続反応とすることができる。連続反応は、反応槽を連結して多槽で行うことも可能である。
【００２２】
反応に当たっては菌体あたりの生産性や活性等を判断して温度、ｐＨ条件を選択して行えばよいが、電気伝導率はｐＨ、温度の影響を受け易いので、反応時にｐＨや温度の変化がある場合にはｐＨ、温度により電気伝導率がどのように変化するかを把握しておく必要がある。より好ましくは適当な酸、またはアルカリ溶液によりｐＨ調節および温度調節を行う。ｐＨ調節を行う場合、金属イオンを添加しないときおよびアルカリ土類金属を添加したときにはｐＨが低下するので、アルカリ金属の水酸化物、エチレンジアミン、ＳＳ−ＥＤＤＳのアルカリ金属やアンモニウム塩等のアルカリによって行い、アルカリ土類金属以外の金属イオンを添加する場合は、通常、ｐＨが上昇するので硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、フマル酸、マレイン酸、ＳＳ−ＥＤＤＳ等の酸によって行う。
これらの反応、回収は、回分、連続のいずれの方法でも行うことができる。
【００２３】
本発明で使用される微生物としてはＥＤＤＳアーゼ活性を有する微生物であればいずれも対象となる。
例えば、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属およびブレブンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属に属する細菌、さらに宿主としてエシェリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌を用い、これにＥＤＤＳアーゼをコードする遺伝子ＤＮＡを導入した形質転換体などを例として挙げることができる。
具体的には、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＫＫ−５株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１２〕、同ＫＫ−９株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１３〕、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｓｐ．ＴＮ−５１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１６〕、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＴＮ−１３１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１８〕、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＫ−６株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１５〕、同ＴＮＯ−５株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−６５４７〕、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＴＮ−２８株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１９〕、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｓｐ．ＴＮ−３０株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１７〕および同ＴＮ−３株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５８８６〕、さらに、宿主として大腸菌ＪＭ１０９株〔Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ５３３２３株〕またはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１７８９５株を用いた形質転換体を挙げることができる。
上記微生物のうち、ＫＫ−５株、ＫＫ−９株、ＴＮ−５１株、ＴＮ−１３１株、ＫＫ−６株、ＴＮ−２８株、ＴＮ−３０株、ＴＮ−３株は、本発明者らにより自然界から新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、これらの菌株の菌学的性質は、前記特開平９−１４０３９０号公報、特開平１０−５２２９２号公報等に記載されている。
また、ＴＮＯ−５株も、本発明者らにより自然界から新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。本菌の菌学的性質は以下に示す通りである。
【００２４】
【００２５】
上記菌学的性質を、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol.9(1990)により分類するとＴＮＯ−５株はパラコッカス（Paracoccus）属に属する細菌と同定された。尚、ＴＮ−３株はディミヌタ（diminuta) 種であることが確認されている。
【００２６】
大腸菌 JM109株（Esherichia coli ATCC53323 株）、Rhodococcus rhodochrous ATCC17895 株は公知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から容易に入手することができる。これらの菌株を宿主として、ＴＮ−３株のＥＤＤＳアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡを含むプラスミド pEDS020および pSE001 を導入した形質転換体が、E. coli JM109/pEDS020(FERM BP-6161) および Rhodococcus rhodochrous ATCC17895/pSE001(FERM BP-6548) として、それぞれ通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
なお、これら形質転換体の作成方法は、本出願人の出願に係る特開平１０−２１０９８４号公報に記載されている。
【００２７】
【実施例】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００２８】
（１）ＳＳ−ＥＤＤＳ、フマル酸濃度の測定
反応液中の不溶物を１５，０００ｒｐｍ、５℃、５分間の遠心分離にて除去した後、液体クロマトグラフィーにてＳＳ−ＥＤＤＳを定量した。定量用カラムとしては WAKOSIL 5C8（和光純薬）〔溶出液；１０ｍＭ 水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムと０．４ｍＭ ＣｕＳＯ４ を含む５０ｍＭリン酸、ｐＨ２〕を、また光学分割カラムとして MCI GEL CRS 10W（三菱化学社製）〔溶出液；１０ｍＭ ＣｕＳＯ４〕を使用した。
【００２９】
（２）電気伝導率の測定
交流２電極式電気伝導率指示調節計（東亜電波工業；ＣＤＩＣ−７型）および電気伝導率セル（同；ＣＧＳ−３５１１型）をＫＣｌ水溶液を標準として校正し使用した。
【００３０】
参考例１
（１）菌体触媒の調製
Esherichia coli JM109/pEDS020を斜面培地から１白金耳とり、５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ）に接種して３７℃にて８時間振とう培養した。これを、ＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌアンピシリン、１ｍＭ isopropyl-b-galactosideを含有）に、２．５％量接種し、３７℃、３０時間、好気的に振とう培養した。
培養液１Lから、菌体を遠心分離（７，０００ｒｐｍ,２０分）により集菌し、１００ｍＭ １，４−ジアミノブタンを含む５０ｍＭほう酸緩衝液ｐＨ７．７５、５００ｍＬで１回洗浄した。５００ｍＬの同様の緩衝液に菌体を再懸濁した後、氷中において２５％グルタルアルデヒドを２５ｍＭとなるように徐々に添加した。ｐＨが低下するので６Ｎ ＮａＯＨにてｐＨ７．７５に調整した後、撹拌しながら２時間放置した。エチレンジアミンを５０ｍＭとなるように添加し、６ＮＮａＯＨでｐＨ９．０とした後、２時間放置した。次に水素化ほう素ナトリウムを２５ｍＭとなるように添加して撹拌しながら更に２時間放置した。さらに、６Ｎ ＮａＯＨにてｐＨ９．２に調整した後、水浴中で４５℃、４時間、加熱処理を行い、フマラーゼ活性を除去した。
【００３１】
（２）反応液の調製と反応
反応液組成は最終濃度換算で、１Ｋｇあたりフマル酸１．０２７モル、エチレンジアミン０．５１３モル、水酸化マグネシウム０．５１３モル、ＮａＯＨ０．５１３モル、菌体５０ｇ（乾燥重量換算）であり、水、フマル酸、水酸化マグネシウムを透明となるまで激しく撹拌したあと、２４ｗｔ％ＮａＯＨ、エチレンジアミンの順に加え、透明となるまで撹拌し、４０℃にて菌体を添加することにより反応を開始し、２４時間、４０℃にて反応を行った。
菌体添加前のｐＨは約８．５であったが、反応中ｐＨが低下するので、２４ｗｔ％ＮａＯＨによりｐＨを８．５に保った。
反応中の電気伝導率変化と反応液組成を表１に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
実施例１
（１）菌体触媒の調製
参考例１と同様。
【００３４】
（２）反応液の調製と反応
参考例１と同様に反応を行い、電気伝導率が３６．０ｍＳ／ｃｍとなった時点で反応液を回収し分析した。ＳＳ−ＥＤＤＳ濃度は４４８ｍＭ、フマル酸は４０ｍＭであった。
【００３５】
実施例２
（１）菌体触媒の調製
参考例１と同様。
【００３６】
（２）反応液の調製と反応
参考例１と同様に反応を行い、電気伝導率が３６．０ｍＳ／ｃｍとなった時でチューブポンプで同じ組成の反応液を定速で供給、同時に反応液の一部を回収することにより、電気伝導率を３５．８〜３６．２ｍＳ／ｃｍの幅に保った。この回収の際、ギアポンプと中空糸膜［クラレ；ＳＦ−８１０２（孔径０．１μｍ、内径×長さ＝１．２×３５０ｍｍ）］を用いることで、菌体は反応槽に戻し、ろ液のみを回収できる様にした。
４８時間操作を行い、この間のＳＳ−ＥＤＤＳ濃度は、４４２〜４５０ｍＭ、フマル酸濃度は、３８〜４１ｍＭであった。
【００３７】
参考例２
（１）菌体触媒の調製
参考例１と同様。
【００３８】
（２）反応液の調製と反応
反応液組成は最終濃度換算で、１Ｋｇあたりフマル酸１．０２７モル、エチレンジアミン０．５１３モル、ＮａＯＨ１．０２７モル、菌体５０ｇ（乾燥重量換算）であり、水、フマル酸、２４ｗｔ％ＮａＯＨ、エチレンジアミンの順に加え、透明となるまで撹拌し、４０℃にて菌体を添加することにより反応を開始し、４０℃で４８時間反応を行った。
菌体添加前のｐHは約８．８であり、反応中ｐＨが低下したが、ｐHを一定に保つためのアルカリは添加しなかった。
反応中の電気伝導率変化と反応液組成を表２に示す。
【００３９】
【表２】
実施例３
（１）菌体触媒の調製
参考例１と同様。
【００４０】
（２）反応液の調製と反応
参考例２と同様に反応を行い、電気伝導率が５１．８ｍＳ／ｃｍとなった時点で反応液を回収し分析した。ＳＳ−ＥＤＤＳ濃度は２２０ｍＭ、フマル酸は６５６ｍＭであった。
【００４１】
【発明の効果】
予め電気伝導率と生成物／基質比の相関データを取得することにより、それに基づいて原料供給および／または反応液回収を操作することで容易に原料、生成物濃度を制御することができる。電気伝導率計は通常、副反応等の影響を大きく受けるため厳密な制御には適用できないが、本発明によるところの微生物反応は極めて副反応が少なく、かつ反応進行とともに十分な電気伝導率変化を示すため、精度の高い制御が可能である。
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物由来のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼの作用によりフマル酸とエチレンジアミンからＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する方法に関し、より詳しくは、電気伝導率計を使用した同製造反応の制御方法に関する。
Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸は生分解性キレート剤として写真、洗剤および製紙等の分野で使用される有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者らは、先に、フマル酸とエチレンジアミンをＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（ＳＳ−ＥＤＤＳ）に変換する微生物の新規なリアーゼ活性を見い出し（以下、本リアーゼをエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼと呼び、ＥＤＤＳアーゼと略記する）、本触媒作用を利用したフマル酸と各種アミンからの効率的な光学活性アミノポリカルボン酸の製造方法を提案している〔特開平９−１４０３９０号公報参照〕。
しかしながら、ＥＤＤＳアーゼによるＳＳ−ＥＤＤＳ等の光学活性アミノポリカルボン酸生産反応は副反応が極めて少ないものの、平衡反応であるために未反応原料が残存してしまうことが課題であった。これに対し、本発明者らは、反応液に金属イオンを共存させると反応平衡が生産物側に傾き、反応をほぼ完結し得ることを見い出した〔特開平１０−５２２９２号および同１０−２７１９９９号各公報参照〕。
【０００３】
一方、微生物反応の制御に電気伝導率計を使用した報告として、フマル酸とアンモニアのみの原料からアスパルターゼの作用によりアスパラギン酸の製造に適用した例が知られている〔ソビエト連邦特許８５７１１５号公報参照〕。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
酵素は最適基質濃度を持つ場合が多く、また、基質阻害、生成物阻害がある場合もあり、十分な反応速度を得るためには、基質、生成物濃度を最適に保つ必要がある。
また、ＳＳ−ＥＤＤＳ塩は原料であるフマル酸塩よりも一般に溶解度が高く、フマル酸またはその塩をその飽和溶解度以上、すなわちスラリー状態で反応液に存在させても、反応の進行とともにＳＳ−ＥＤＤＳに変換され溶解する現象を確認しており、装置容積に対して効率的なＳＳ−ＥＤＤＳの高濃度蓄積反応が可能である。しかし、スラリー状態の原料は撹拌や連続反応時の障害となる場合がありフマル酸またはその塩を逐次添加する方が好ましいが、フマル酸を常に溶解した状態にするためには、反応液中の原料、生成物濃度を常に把握しなければならない。
【０００５】
一方、回分反応を行う場合には、原料液を反応槽内に添加し、目的とする基質、または生成物濃度に達した時点で反応終了液を回収するが、そのためには反応液組成を迅速に把握する手段を持たなければ、結果として操作時間の延長を招くことになる。
また、この原料添加、反応液回収を同時かつ連続的に行うことで効率的な連続反応とすることができるが、このような操作により目的とする基質、生成物濃度の反応終了液を得るためには、原料添加および反応液回収速度を常に調節しなければならない。
【０００６】
しかしながら、反応液中のＳＳ−ＥＤＤＳの定量は、反応液の一部を分取し液体クロマトグラフィー等により行われるが、このような方法では反応液の状態、すなわち、基質、生成物の濃度を迅速に把握し、随時、反応を操作あるいは制御することは難しく、また、多大な労力を必要とするという問題があった。
【０００７】
さらに、本発明のＳＳ−ＥＤＤＳの製法においては、十分な収率を得るためには大量の金属イオンを添加しなければならず、またｐＨを一定の範囲に維持するために相当量のアルカリまたは酸を必要とし、例えばマグネシウムを添加しＮａＯＨにて反応中のｐＨを維持する場合は、添加したマグネシウムと等モル近いＮａＯＨが必要である。
【０００８】
したがって、本発明は、上述のような複雑な反応系において、随時、反応の操作あるいは制御に連動させるべく、基質、生成物の濃度を如何にして迅速に把握し得るか、その手段を見いだすことを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、前記、微生物法におけるＳＳ−ＥＤＤＳ製造反応において、生成物／基質比および反応液電気伝導率の両者が高い相関性を示し、電気伝導率計を用いることにより反応の進行状態を瞬時かつ連続的に把握できることを見い出した。さらに、電気伝導率計と原料供給および／または反応液回収を連動させることにより、反応系内の原料および生成物を任意の濃度で制御できることを見い出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼ活性を有する微生物またはその調製物の作用により、フマル酸とエチレンジアミンからＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する方法において、反応系内に電気伝導率計を設置し、検知した電気伝導率の変化に基づいて原料供給および／または反応液回収を行い反応を制御することを特徴とするＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸製造反応の制御法である。
【００１１】
上記反応の好ましい態様においては、反応系内にアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、アルミニウム、チタニウムおよびマンガンからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属イオンを存在させる。また、反応に伴うｐＨの変化に対して、反応系内にアルカリまたは酸を添加してｐＨ７〜１０の範囲から選ばれる一定の値にｐＨを保持する。該アルカリとしてはアルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、アンモニアまたはその水酸化物およびエチレンジアミンから選ばれる少なくとも１種であり、該酸としては硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、フマル酸、マレイン酸および Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸から選ばれる少なくとも１種である。
【００１２】
本発明は、反応の進行と共に電気伝導率が有意に低下すること、さらに高濃度の金属イオン存在下に、相当量のアルカリまたは酸を添加して反応中のｐＨを一定に維持する高イオン濃度の反応系においても、驚くべきことに電気伝導率の低下がさらに顕著になることを見い出したことによる。したがって、予め電気伝導率と生成物／基質比の相関データを取得することにより、それに基づいて原料供給および／または反応液回収を操作することで容易に原料、生成物濃度を制御することができる。電気伝導率計は通常、副反応等の影響を大きく受けるため厳密な制御には適用できないが、本発明によるところの微生物反応は極めて副反応が少なく、かつ反応進行とともに十分な電気伝導率変化を示すため、精度の高い制御が可能である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の対象となる微生物は後記のとおりである。
本発明で使用される微生物の培地には何ら特別の制限がなく、資化しうる炭素源、窒素源、無機塩、更に微量の有機栄養物などを適当に含有するものであれば合成培地、天然培地のいずれを用いることもできる。また、培地へのエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸、エチレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンなどのアミノ酸やフマル酸等の添加は、目的とする活性の高い菌体が得られることがあり好ましい。培養条件は菌体や培地により異なるが、培地のｐＨは４〜１０、好ましくは６〜９の範囲、培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２５〜３５℃の範囲で、活性が最大となるまで１〜１０日間好気的に培養すればよい。
【００１４】
微生物に存在するフマラーゼ活性は、特願平９−３１１０４６号明細書記載の方法により除去するのが好ましい。除去処理は、菌体または該菌体処理物に対して、ｐＨは８〜１０．５、好ましくは８．５〜１０の範囲、温度は、通常、氷結温度〜５５℃の範囲で、処理時間に制限なく行うことができる。
【００１５】
一般に、ＳＳ−ＥＤＤＳの生産反応はフマル酸とエチレンジアミン、および必要に応じて、アルカリ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、アルミニウム、チタニウムおよびマンガン等の金属イオンを含む水溶液中で、前記微生物またはその調製物、例えば、菌体または該菌体処理物（菌体破砕物、菌体抽出液、抽出した粗・精製酵素、固定化した菌体または酵素、薬剤処理（安定化処理等）した菌体または酵素）を接触させることにより行われるが、菌体培養液にフマル酸とエチレンジアミンおよび該金属化合物を直接添加しても行うこともできる。
【００１６】
本発明における金属イオンは、例えば、Ｍｇ(II)、Ｃａ(II)、Ｓｒ(II)、Ｂａ(II)、Ｆｅ(II)、Ｆｅ(III) 、Ｚｎ(II)）、Ｃｕ(II)、Ｎｉ(II)、Ａｌ(III) 、Ｔｉ(IV)およびＭｎ(II)イオンならびにこれらの各種錯イオンを挙げることができる。
【００１７】
これら金属イオン源としては、金属の水酸化物、酸化物ならびに硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、炭酸および酢酸等の無機または有機酸塩、さらにこれら金属化合物を含む鉱物や本発明の基質であるフマル酸やエチレンジアミンとの化合物等を挙げることができる。これらの化合物は２種以上混合して用いることも可能である。
【００１８】
また、これらの金属化合物中には、水に対し溶解度の低いものあるいは難溶性のものもあるが、これらを飽和濃度以上に、例えば、懸濁状態として存在させた場合でも、ＳＳ−ＥＤＤＳの配位能により相当量が可溶化されるため使用可能である。
【００１９】
反応は、通常、０〜６０℃、好ましくは２０〜４５℃の範囲で行う。ｐＨは、通常、４〜１１、好ましくはｐＨ７〜１０の範囲である。反応で用いるフマル酸の濃度は反応温度やｐＨにより異なるが、通常、０．０１〜３Ｍであり、反応液中に飽和溶解度以上の沈殿物として存在させても反応の進行と共に溶解するため差し支えない。エチレンジアミンの濃度は、通常、０．０１〜２Ｍである。反応液中への金属化合物添加量は生成するＳＳ−ＥＤＤＳに対して、通常、０．０１〜２倍モルである。微生物などの使用量は基質に対する乾燥菌体換算で、通常、０．０１〜５重量％である。
また、原料がいずれかに関わらず、エチレンジアミン、フマル酸を他の化合物から合成し得る反応系を本反応系と共存させたとしても、本発明の効果が得られる限り差し支えない。
【００２０】
電気伝導率計の方式には、交流２電極方式、交流４電極方式、電磁誘導方式等があるが、本発明の効果が得られる限りいずれも使用可能である。電気伝導率計の設定はあらかじめ一定濃度の反応液でのＳＳ−ＥＤＤＳ生成量と検出器の表示値との相関関係を示す検量線を作成しておき、検出器の表示値が所定の幅となるようにすればよい。
【００２１】
原料供給および／または反応液回収の制御は、電気伝導率検出器（通常、電極あるいはセルと呼ばれる）を反応液中に接触させ、その電気信号を増幅器、変換器、リレー等を内蔵する調節器に送り自動で行うか、あるいは電気伝導率を随時モニターしながら手動で行う。回分反応では、目的の基質、生成物に相当する電気伝導率となった時点で反応液を回収すればよいし、また、反応槽内の電気伝導率が一定となるように原料添加と反応液回収を同時に行えば、連続反応とすることができる。連続反応は、反応槽を連結して多槽で行うことも可能である。
【００２２】
反応に当たっては菌体あたりの生産性や活性等を判断して温度、ｐＨ条件を選択して行えばよいが、電気伝導率はｐＨ、温度の影響を受け易いので、反応時にｐＨや温度の変化がある場合にはｐＨ、温度により電気伝導率がどのように変化するかを把握しておく必要がある。より好ましくは適当な酸、またはアルカリ溶液によりｐＨ調節および温度調節を行う。ｐＨ調節を行う場合、金属イオンを添加しないときおよびアルカリ土類金属を添加したときにはｐＨが低下するので、アルカリ金属の水酸化物、エチレンジアミン、ＳＳ−ＥＤＤＳのアルカリ金属やアンモニウム塩等のアルカリによって行い、アルカリ土類金属以外の金属イオンを添加する場合は、通常、ｐＨが上昇するので硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、フマル酸、マレイン酸、ＳＳ−ＥＤＤＳ等の酸によって行う。
これらの反応、回収は、回分、連続のいずれの方法でも行うことができる。
【００２３】
本発明で使用される微生物としてはＥＤＤＳアーゼ活性を有する微生物であればいずれも対象となる。
例えば、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属およびブレブンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属に属する細菌、さらに宿主としてエシェリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌を用い、これにＥＤＤＳアーゼをコードする遺伝子ＤＮＡを導入した形質転換体などを例として挙げることができる。
具体的には、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．ＫＫ−５株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１２〕、同ＫＫ−９株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１３〕、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｓｐ．ＴＮ−５１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１６〕、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＴＮ−１３１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１８〕、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＫ−６株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１５〕、同ＴＮＯ−５株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−６５４７〕、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＴＮ−２８株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１９〕、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｓｐ．ＴＮ−３０株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１７〕および同ＴＮ−３株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５８８６〕、さらに、宿主として大腸菌ＪＭ１０９株〔Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ５３３２３株〕またはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１７８９５株を用いた形質転換体を挙げることができる。
上記微生物のうち、ＫＫ−５株、ＫＫ−９株、ＴＮ−５１株、ＴＮ−１３１株、ＫＫ−６株、ＴＮ−２８株、ＴＮ−３０株、ＴＮ−３株は、本発明者らにより自然界から新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、これらの菌株の菌学的性質は、前記特開平９−１４０３９０号公報、特開平１０−５２２９２号公報等に記載されている。
また、ＴＮＯ−５株も、本発明者らにより自然界から新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。本菌の菌学的性質は以下に示す通りである。
【００２４】
上記菌学的性質を、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol.9(1990)により分類するとＴＮＯ−５株はパラコッカス（Paracoccus）属に属する細菌と同定された。尚、ＴＮ−３株はディミヌタ（diminuta) 種であることが確認されている。
【００２６】
大腸菌 JM109株（Esherichia coli ATCC53323 株）、Rhodococcus rhodochrous ATCC17895 株は公知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から容易に入手することができる。これらの菌株を宿主として、ＴＮ−３株のＥＤＤＳアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡを含むプラスミド pEDS020および pSE001 を導入した形質転換体が、E. coli JM109/pEDS020(FERM BP-6161) および Rhodococcus rhodochrous ATCC17895/pSE001(FERM BP-6548) として、それぞれ通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
なお、これら形質転換体の作成方法は、本出願人の出願に係る特開平１０−２１０９８４号公報に記載されている。
【００２７】
【実施例】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００２８】
（１）ＳＳ−ＥＤＤＳ、フマル酸濃度の測定
反応液中の不溶物を１５，０００ｒｐｍ、５℃、５分間の遠心分離にて除去した後、液体クロマトグラフィーにてＳＳ−ＥＤＤＳを定量した。定量用カラムとしては WAKOSIL 5C8（和光純薬）〔溶出液；１０ｍＭ 水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムと０．４ｍＭ ＣｕＳＯ４ を含む５０ｍＭリン酸、ｐＨ２〕を、また光学分割カラムとして MCI GEL CRS 10W（三菱化学社製）〔溶出液；１０ｍＭ ＣｕＳＯ４〕を使用した。
【００２９】
（２）電気伝導率の測定
交流２電極式電気伝導率指示調節計（東亜電波工業；ＣＤＩＣ−７型）および電気伝導率セル（同；ＣＧＳ−３５１１型）をＫＣｌ水溶液を標準として校正し使用した。
【００３０】
参考例１
（１）菌体触媒の調製
Esherichia coli JM109/pEDS020を斜面培地から１白金耳とり、５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ）に接種して３７℃にて８時間振とう培養した。これを、ＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌアンピシリン、１ｍＭ isopropyl-b-galactosideを含有）に、２．５％量接種し、３７℃、３０時間、好気的に振とう培養した。
培養液１Lから、菌体を遠心分離（７，０００ｒｐｍ,２０分）により集菌し、１００ｍＭ １，４−ジアミノブタンを含む５０ｍＭほう酸緩衝液ｐＨ７．７５、５００ｍＬで１回洗浄した。５００ｍＬの同様の緩衝液に菌体を再懸濁した後、氷中において２５％グルタルアルデヒドを２５ｍＭとなるように徐々に添加した。ｐＨが低下するので６Ｎ ＮａＯＨにてｐＨ７．７５に調整した後、撹拌しながら２時間放置した。エチレンジアミンを５０ｍＭとなるように添加し、６ＮＮａＯＨでｐＨ９．０とした後、２時間放置した。次に水素化ほう素ナトリウムを２５ｍＭとなるように添加して撹拌しながら更に２時間放置した。さらに、６Ｎ ＮａＯＨにてｐＨ９．２に調整した後、水浴中で４５℃、４時間、加熱処理を行い、フマラーゼ活性を除去した。
【００３１】
（２）反応液の調製と反応
反応液組成は最終濃度換算で、１Ｋｇあたりフマル酸１．０２７モル、エチレンジアミン０．５１３モル、水酸化マグネシウム０．５１３モル、ＮａＯＨ０．５１３モル、菌体５０ｇ（乾燥重量換算）であり、水、フマル酸、水酸化マグネシウムを透明となるまで激しく撹拌したあと、２４ｗｔ％ＮａＯＨ、エチレンジアミンの順に加え、透明となるまで撹拌し、４０℃にて菌体を添加することにより反応を開始し、２４時間、４０℃にて反応を行った。
菌体添加前のｐＨは約８．５であったが、反応中ｐＨが低下するので、２４ｗｔ％ＮａＯＨによりｐＨを８．５に保った。
反応中の電気伝導率変化と反応液組成を表１に示す。
【００３２】
【表１】
実施例１
（１）菌体触媒の調製
参考例１と同様。
【００３４】
（２）反応液の調製と反応
参考例１と同様に反応を行い、電気伝導率が３６．０ｍＳ／ｃｍとなった時点で反応液を回収し分析した。ＳＳ−ＥＤＤＳ濃度は４４８ｍＭ、フマル酸は４０ｍＭであった。
【００３５】
実施例２
（１）菌体触媒の調製
参考例１と同様。
【００３６】
（２）反応液の調製と反応
参考例１と同様に反応を行い、電気伝導率が３６．０ｍＳ／ｃｍとなった時でチューブポンプで同じ組成の反応液を定速で供給、同時に反応液の一部を回収することにより、電気伝導率を３５．８〜３６．２ｍＳ／ｃｍの幅に保った。この回収の際、ギアポンプと中空糸膜［クラレ；ＳＦ−８１０２（孔径０．１μｍ、内径×長さ＝１．２×３５０ｍｍ）］を用いることで、菌体は反応槽に戻し、ろ液のみを回収できる様にした。
４８時間操作を行い、この間のＳＳ−ＥＤＤＳ濃度は、４４２〜４５０ｍＭ、フマル酸濃度は、３８〜４１ｍＭであった。
【００３７】
参考例２
（１）菌体触媒の調製
参考例１と同様。
【００３８】
（２）反応液の調製と反応
反応液組成は最終濃度換算で、１Ｋｇあたりフマル酸１．０２７モル、エチレンジアミン０．５１３モル、ＮａＯＨ１．０２７モル、菌体５０ｇ（乾燥重量換算）であり、水、フマル酸、２４ｗｔ％ＮａＯＨ、エチレンジアミンの順に加え、透明となるまで撹拌し、４０℃にて菌体を添加することにより反応を開始し、４０℃で４８時間反応を行った。
菌体添加前のｐHは約８．８であり、反応中ｐＨが低下したが、ｐHを一定に保つためのアルカリは添加しなかった。
反応中の電気伝導率変化と反応液組成を表２に示す。
【００３９】
【表２】
（１）菌体触媒の調製
参考例１と同様。
【００４０】
（２）反応液の調製と反応
参考例２と同様に反応を行い、電気伝導率が５１．８ｍＳ／ｃｍとなった時点で反応液を回収し分析した。ＳＳ−ＥＤＤＳ濃度は２２０ｍＭ、フマル酸は６５６ｍＭであった。
【００４１】
【発明の効果】
予め電気伝導率と生成物／基質比の相関データを取得することにより、それに基づいて原料供給および／または反応液回収を操作することで容易に原料、生成物濃度を制御することができる。電気伝導率計は通常、副反応等の影響を大きく受けるため厳密な制御には適用できないが、本発明によるところの微生物反応は極めて副反応が少なく、かつ反応進行とともに十分な電気伝導率変化を示すため、精度の高い制御が可能である。
Claims (3)
- アルカリ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、アルミニウム、チタニウムおよびマンガンからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属イオンの存在下に、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼ活性を有する微生物またはその調製物の作用により、フマル酸とエチレンジアミンからＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する方法において、反応系内に電気伝導率計を設置し、検知した電気伝導率の変化に基づいて原料供給および／または反応液回収を行い反応を制御することを特徴とするＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸製造反応の制御法。
- 反応に伴うｐＨの変化に対して、反応系内にアルカリまたは酸を添加してｐＨ７〜１０の範囲から選ばれる一定の値にｐＨを保持する請求項１記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸製造反応の制御法。
- アルカリがアルカリ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、アンモニアまたはその水酸化物およびエチレンジアミンから選ばれる少なくとも１種であり、酸が硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、フマル酸、マレイン酸およびＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸から選ばれる少なくとも１種である請求項２記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸製造反応の制御法。
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