JP2000354497A - Ｓ，ｓ−エチレンジアミン−ｎ，ｎ’−ジコハク酸製造反応の制御法 - Google Patents
Ｓ，ｓ−エチレンジアミン−ｎ，ｎ’−ジコハク酸製造反応の制御法Info
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- JP2000354497A JP2000354497A JP11167518A JP16751899A JP2000354497A JP 2000354497 A JP2000354497 A JP 2000354497A JP 11167518 A JP11167518 A JP 11167518A JP 16751899 A JP16751899 A JP 16751899A JP 2000354497 A JP2000354497 A JP 2000354497A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エ
チレンジアミンリアーゼ活性を有する微生物の作用によ
りフマル酸とエチレンジアミンからＳ，Ｓ−エチレンジ
アミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する方法におい
て、随時、反応の操作あるいは制御に連動させるべく、
基質、生成物の濃度を迅速に把握し得る手段の提供。 【解決手段】 反応系内に電気伝導率計を設置し、検知
した電気伝導率の変化に基づいて原料供給および／また
は反応液回収を行い反応を制御する。
チレンジアミンリアーゼ活性を有する微生物の作用によ
りフマル酸とエチレンジアミンからＳ，Ｓ−エチレンジ
アミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する方法におい
て、随時、反応の操作あるいは制御に連動させるべく、
基質、生成物の濃度を迅速に把握し得る手段の提供。 【解決手段】 反応系内に電気伝導率計を設置し、検知
した電気伝導率の変化に基づいて原料供給および／また
は反応液回収を行い反応を制御する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は微生物由来のエチレ
ンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリ
アーゼの作用によりフマル酸とエチレンジアミンから
Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製
造する方法に関し、より詳しくは、電気伝導率計を使用
した同製造反応の制御方法に関する。Ｓ，Ｓ−エチレン
ジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸は生分解性キレート剤
として写真、洗剤および製紙等の分野で使用される有用
な化合物である。
ンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリ
アーゼの作用によりフマル酸とエチレンジアミンから
Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製
造する方法に関し、より詳しくは、電気伝導率計を使用
した同製造反応の制御方法に関する。Ｓ，Ｓ−エチレン
ジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸は生分解性キレート剤
として写真、洗剤および製紙等の分野で使用される有用
な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】 本発明者らは、先に、フマル酸とエチ
レンジアミンをＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−
ジコハク酸（ＳＳ−ＥＤＤＳ）に変換する微生物の新規
なリアーゼ活性を見い出し（以下、本リアーゼをエチレ
ンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリ
アーゼと呼び、ＥＤＤＳアーゼと略記する）、本触媒作
用を利用したフマル酸と各種アミンからの効率的な光学
活性アミノポリカルボン酸の製造方法を提案している
〔特開平９−１４０３９０号公報参照〕。しかしなが
ら、ＥＤＤＳアーゼによるＳＳ−ＥＤＤＳ等の光学活性
アミノポリカルボン酸生産反応は副反応が極めて少ない
ものの、平衡反応であるために未反応原料が残存してし
まうことが課題であった。これに対し、本発明者らは、
反応液に金属イオンを共存させると反応平衡が生産物側
に傾き、反応をほぼ完結し得ることを見い出した〔特開
平１０−５２２９２号および同１０−２７１９９９号各
公報参照〕。
レンジアミンをＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−
ジコハク酸（ＳＳ−ＥＤＤＳ）に変換する微生物の新規
なリアーゼ活性を見い出し（以下、本リアーゼをエチレ
ンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリ
アーゼと呼び、ＥＤＤＳアーゼと略記する）、本触媒作
用を利用したフマル酸と各種アミンからの効率的な光学
活性アミノポリカルボン酸の製造方法を提案している
〔特開平９−１４０３９０号公報参照〕。しかしなが
ら、ＥＤＤＳアーゼによるＳＳ−ＥＤＤＳ等の光学活性
アミノポリカルボン酸生産反応は副反応が極めて少ない
ものの、平衡反応であるために未反応原料が残存してし
まうことが課題であった。これに対し、本発明者らは、
反応液に金属イオンを共存させると反応平衡が生産物側
に傾き、反応をほぼ完結し得ることを見い出した〔特開
平１０−５２２９２号および同１０−２７１９９９号各
公報参照〕。
【０００３】一方、微生物反応の制御に電気伝導率計を
使用した報告として、フマル酸とアンモニアのみの原料
からアスパルターゼの作用によりアスパラギン酸の製造
に適用した例が知られている〔ソビエト連邦特許８５７
１１５号公報参照〕。
使用した報告として、フマル酸とアンモニアのみの原料
からアスパルターゼの作用によりアスパラギン酸の製造
に適用した例が知られている〔ソビエト連邦特許８５７
１１５号公報参照〕。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】酵素は最適基質濃度を
持つ場合が多く、また、基質阻害、生成物阻害がある場
合もあり、十分な反応速度を得るためには、基質、生成
物濃度を最適に保つ必要がある。また、ＳＳ−ＥＤＤＳ
塩は原料であるフマル酸塩よりも一般に溶解度が高く、
フマル酸またはその塩をその飽和溶解度以上、すなわち
スラリー状態で反応液に存在させても、反応の進行とと
もにＳＳ−ＥＤＤＳに変換され溶解する現象を確認して
おり、装置容積に対して効率的なＳＳ−ＥＤＤＳの高濃
度蓄積反応が可能である。しかし、スラリー状態の原料
は撹拌や連続反応時の障害となる場合がありフマル酸ま
たはその塩を逐次添加する方が好ましいが、フマル酸を
常に溶解した状態にするためには、反応液中の原料、生
成物濃度を常に把握しなければならない。
持つ場合が多く、また、基質阻害、生成物阻害がある場
合もあり、十分な反応速度を得るためには、基質、生成
物濃度を最適に保つ必要がある。また、ＳＳ−ＥＤＤＳ
塩は原料であるフマル酸塩よりも一般に溶解度が高く、
フマル酸またはその塩をその飽和溶解度以上、すなわち
スラリー状態で反応液に存在させても、反応の進行とと
もにＳＳ−ＥＤＤＳに変換され溶解する現象を確認して
おり、装置容積に対して効率的なＳＳ−ＥＤＤＳの高濃
度蓄積反応が可能である。しかし、スラリー状態の原料
は撹拌や連続反応時の障害となる場合がありフマル酸ま
たはその塩を逐次添加する方が好ましいが、フマル酸を
常に溶解した状態にするためには、反応液中の原料、生
成物濃度を常に把握しなければならない。
【０００５】一方、回分反応を行う場合には、原料液を
反応槽内に添加し、目的とする基質、または生成物濃度
に達した時点で反応終了液を回収するが、そのためには
反応液組成を迅速に把握する手段を持たなければ、結果
として操作時間の延長を招くことになる。また、この原
料添加、反応液回収を同時かつ連続的に行うことで効率
的な連続反応とすることができるが、このような操作に
より目的とする基質、生成物濃度の反応終了液を得るた
めには、原料添加および反応液回収速度を常に調節しな
ければならない。
反応槽内に添加し、目的とする基質、または生成物濃度
に達した時点で反応終了液を回収するが、そのためには
反応液組成を迅速に把握する手段を持たなければ、結果
として操作時間の延長を招くことになる。また、この原
料添加、反応液回収を同時かつ連続的に行うことで効率
的な連続反応とすることができるが、このような操作に
より目的とする基質、生成物濃度の反応終了液を得るた
めには、原料添加および反応液回収速度を常に調節しな
ければならない。
【０００６】しかしながら、反応液中のＳＳ−ＥＤＤＳ
の定量は、反応液の一部を分取し液体クロマトグラフィ
ー等により行われるが、このような方法では反応液の状
態、すなわち、基質、生成物の濃度を迅速に把握し、随
時、反応を操作あるいは制御することは難しく、また、
多大な労力を必要とするという問題があった。
の定量は、反応液の一部を分取し液体クロマトグラフィ
ー等により行われるが、このような方法では反応液の状
態、すなわち、基質、生成物の濃度を迅速に把握し、随
時、反応を操作あるいは制御することは難しく、また、
多大な労力を必要とするという問題があった。
【０００７】さらに、本発明のＳＳ−ＥＤＤＳの製法に
おいては、十分な収率を得るためには大量の金属イオン
を添加しなければならず、またｐＨを一定の範囲に維持
するために相当量のアルカリまたは酸を必要とし、例え
ばマグネシウムを添加しＮａＯＨにて反応中のｐＨを維
持する場合は、添加したマグネシウムと等モル近いＮａ
ＯＨが必要である。
おいては、十分な収率を得るためには大量の金属イオン
を添加しなければならず、またｐＨを一定の範囲に維持
するために相当量のアルカリまたは酸を必要とし、例え
ばマグネシウムを添加しＮａＯＨにて反応中のｐＨを維
持する場合は、添加したマグネシウムと等モル近いＮａ
ＯＨが必要である。
【０００８】したがって、本発明は、上述のような複雑
な反応系において、随時、反応の操作あるいは制御に連
動させるべく、基質、生成物の濃度を如何にして迅速に
把握し得るか、その手段を見いだすことを課題とする。
な反応系において、随時、反応の操作あるいは制御に連
動させるべく、基質、生成物の濃度を如何にして迅速に
把握し得るか、その手段を見いだすことを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意検討を行った結果、前記、微生物法にお
けるＳＳ−ＥＤＤＳ製造反応において、生成物／基質比
および反応液電気伝導率の両者が高い相関性を示し、電
気伝導率計を用いることにより反応の進行状態を瞬時か
つ連続的に把握できることを見い出した。さらに、電気
伝導率計と原料供給および／または反応液回収を連動さ
せることにより、反応系内の原料および生成物を任意の
濃度で制御できることを見い出し、本発明を完成した。
解決すべく鋭意検討を行った結果、前記、微生物法にお
けるＳＳ−ＥＤＤＳ製造反応において、生成物／基質比
および反応液電気伝導率の両者が高い相関性を示し、電
気伝導率計を用いることにより反応の進行状態を瞬時か
つ連続的に把握できることを見い出した。さらに、電気
伝導率計と原料供給および／または反応液回収を連動さ
せることにより、反応系内の原料および生成物を任意の
濃度で制御できることを見い出し、本発明を完成した。
【００１０】すなわち、本発明は、エチレンジアミン−
Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼ活性を
有する微生物またはその調製物の作用により、フマル酸
とエチレンジアミンからＳ，Ｓ−エチレンジアミン−
Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する方法において、反応系
内に電気伝導率計を設置し、検知した電気伝導率の変化
に基づいて原料供給および／または反応液回収を行い反
応を制御することを特徴とするＳ，Ｓ−エチレンジアミ
ン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸製造反応の制御法である。
Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼ活性を
有する微生物またはその調製物の作用により、フマル酸
とエチレンジアミンからＳ，Ｓ−エチレンジアミン−
Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する方法において、反応系
内に電気伝導率計を設置し、検知した電気伝導率の変化
に基づいて原料供給および／または反応液回収を行い反
応を制御することを特徴とするＳ，Ｓ−エチレンジアミ
ン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸製造反応の制御法である。
【００１１】上記反応の好ましい態様においては、反応
系内にアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、ア
ルミニウム、チタニウムおよびマンガンからなる群から
選ばれる少なくとも１種の金属イオンを存在させる。ま
た、反応に伴うｐＨの変化に対して、反応系内にアルカ
リまたは酸を添加してｐＨ７〜１０の範囲から選ばれる
一定の値にｐＨを保持する。該アルカリとしてはアルカ
リ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、アン
モニアまたはその水酸化物およびエチレンジアミンから
選ばれる少なくとも１種であり、該酸としては硫酸、塩
酸、硝酸、リン酸、フマル酸、マレイン酸および Ｓ，
Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸から選ば
れる少なくとも１種である。
系内にアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、ア
ルミニウム、チタニウムおよびマンガンからなる群から
選ばれる少なくとも１種の金属イオンを存在させる。ま
た、反応に伴うｐＨの変化に対して、反応系内にアルカ
リまたは酸を添加してｐＨ７〜１０の範囲から選ばれる
一定の値にｐＨを保持する。該アルカリとしてはアルカ
リ金属の水酸化物、アルカリ土類金属の水酸化物、アン
モニアまたはその水酸化物およびエチレンジアミンから
選ばれる少なくとも１種であり、該酸としては硫酸、塩
酸、硝酸、リン酸、フマル酸、マレイン酸および Ｓ，
Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸から選ば
れる少なくとも１種である。
【００１２】本発明は、反応の進行と共に電気伝導率が
有意に低下すること、さらに高濃度の金属イオン存在下
に、相当量のアルカリまたは酸を添加して反応中のｐＨ
を一定に維持する高イオン濃度の反応系においても、驚
くべきことに電気伝導率の低下がさらに顕著になること
を見い出したことによる。したがって、予め電気伝導率
と生成物／基質比の相関データを取得することにより、
それに基づいて原料供給および／または反応液回収を操
作することで容易に原料、生成物濃度を制御することが
できる。電気伝導率計は通常、副反応等の影響を大きく
受けるため厳密な制御には適用できないが、本発明によ
るところの微生物反応は極めて副反応が少なく、かつ反
応進行とともに十分な電気伝導率変化を示すため、精度
の高い制御が可能である。
有意に低下すること、さらに高濃度の金属イオン存在下
に、相当量のアルカリまたは酸を添加して反応中のｐＨ
を一定に維持する高イオン濃度の反応系においても、驚
くべきことに電気伝導率の低下がさらに顕著になること
を見い出したことによる。したがって、予め電気伝導率
と生成物／基質比の相関データを取得することにより、
それに基づいて原料供給および／または反応液回収を操
作することで容易に原料、生成物濃度を制御することが
できる。電気伝導率計は通常、副反応等の影響を大きく
受けるため厳密な制御には適用できないが、本発明によ
るところの微生物反応は極めて副反応が少なく、かつ反
応進行とともに十分な電気伝導率変化を示すため、精度
の高い制御が可能である。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の対象となる微生物は後記
のとおりである。本発明で使用される微生物の培地には
何ら特別の制限がなく、資化しうる炭素源、窒素源、無
機塩、更に微量の有機栄養物などを適当に含有するもの
であれば合成培地、天然培地のいずれを用いることもで
きる。また、培地へのエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジ
コハク酸、エチレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸、アス
パラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンなどのアミノ酸
やフマル酸等の添加は、目的とする活性の高い菌体が得
られることがあり好ましい。培養条件は菌体や培地によ
り異なるが、培地のｐＨは４〜１０、好ましくは６〜９
の範囲、培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２５〜３
５℃の範囲で、活性が最大となるまで１〜１０日間好気
的に培養すればよい。
のとおりである。本発明で使用される微生物の培地には
何ら特別の制限がなく、資化しうる炭素源、窒素源、無
機塩、更に微量の有機栄養物などを適当に含有するもの
であれば合成培地、天然培地のいずれを用いることもで
きる。また、培地へのエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジ
コハク酸、エチレンジアミン−Ｎ−モノコハク酸、アス
パラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンなどのアミノ酸
やフマル酸等の添加は、目的とする活性の高い菌体が得
られることがあり好ましい。培養条件は菌体や培地によ
り異なるが、培地のｐＨは４〜１０、好ましくは６〜９
の範囲、培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２５〜３
５℃の範囲で、活性が最大となるまで１〜１０日間好気
的に培養すればよい。
【００１４】微生物に存在するフマラーゼ活性は、特願
平９−３１１０４６号明細書記載の方法により除去する
のが好ましい。除去処理は、菌体または該菌体処理物に
対して、ｐＨは８〜１０．５、好ましくは８．５〜１０
の範囲、温度は、通常、氷結温度〜５５℃の範囲で、処
理時間に制限なく行うことができる。
平９−３１１０４６号明細書記載の方法により除去する
のが好ましい。除去処理は、菌体または該菌体処理物に
対して、ｐＨは８〜１０．５、好ましくは８．５〜１０
の範囲、温度は、通常、氷結温度〜５５℃の範囲で、処
理時間に制限なく行うことができる。
【００１５】一般に、ＳＳ−ＥＤＤＳの生産反応はフマ
ル酸とエチレンジアミン、および必要に応じて、アルカ
リ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、アルミニウム、
チタニウムおよびマンガン等の金属イオンを含む水溶液
中で、前記微生物またはその調製物、例えば、菌体また
は該菌体処理物（菌体破砕物、菌体抽出液、抽出した粗
・精製酵素、固定化した菌体または酵素、薬剤処理（安
定化処理等）した菌体または酵素）を接触させることに
より行われるが、菌体培養液にフマル酸とエチレンジア
ミンおよび該金属化合物を直接添加しても行うこともで
きる。
ル酸とエチレンジアミン、および必要に応じて、アルカ
リ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッケル、アルミニウム、
チタニウムおよびマンガン等の金属イオンを含む水溶液
中で、前記微生物またはその調製物、例えば、菌体また
は該菌体処理物（菌体破砕物、菌体抽出液、抽出した粗
・精製酵素、固定化した菌体または酵素、薬剤処理（安
定化処理等）した菌体または酵素）を接触させることに
より行われるが、菌体培養液にフマル酸とエチレンジア
ミンおよび該金属化合物を直接添加しても行うこともで
きる。
【００１６】本発明における金属イオンは、例えば、Ｍ
ｇ(II)、Ｃａ(II)、Ｓｒ(II)、Ｂａ(II)、Ｆｅ(II)、Ｆ
ｅ(III) 、Ｚｎ(II)）、Ｃｕ(II)、Ｎｉ(II)、Ａｌ(II
I) 、Ｔｉ(IV)およびＭｎ(II)イオンならびにこれらの
各種錯イオンを挙げることができる。
ｇ(II)、Ｃａ(II)、Ｓｒ(II)、Ｂａ(II)、Ｆｅ(II)、Ｆ
ｅ(III) 、Ｚｎ(II)）、Ｃｕ(II)、Ｎｉ(II)、Ａｌ(II
I) 、Ｔｉ(IV)およびＭｎ(II)イオンならびにこれらの
各種錯イオンを挙げることができる。
【００１７】これら金属イオン源としては、金属の水酸
化物、酸化物ならびに硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、炭酸
および酢酸等の無機または有機酸塩、さらにこれら金属
化合物を含む鉱物や本発明の基質であるフマル酸やエチ
レンジアミンとの化合物等を挙げることができる。これ
らの化合物は２種以上混合して用いることも可能であ
る。
化物、酸化物ならびに硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、炭酸
および酢酸等の無機または有機酸塩、さらにこれら金属
化合物を含む鉱物や本発明の基質であるフマル酸やエチ
レンジアミンとの化合物等を挙げることができる。これ
らの化合物は２種以上混合して用いることも可能であ
る。
【００１８】また、これらの金属化合物中には、水に対
し溶解度の低いものあるいは難溶性のものもあるが、こ
れらを飽和濃度以上に、例えば、懸濁状態として存在さ
せた場合でも、ＳＳ−ＥＤＤＳの配位能により相当量が
可溶化されるため使用可能である。
し溶解度の低いものあるいは難溶性のものもあるが、こ
れらを飽和濃度以上に、例えば、懸濁状態として存在さ
せた場合でも、ＳＳ−ＥＤＤＳの配位能により相当量が
可溶化されるため使用可能である。
【００１９】反応は、通常、０〜６０℃、好ましくは２
０〜４５℃の範囲で行う。ｐＨは、通常、４〜１１、好
ましくはｐＨ７〜１０の範囲である。反応で用いるフマ
ル酸の濃度は反応温度やｐＨにより異なるが、通常、
０．０１〜３Ｍであり、反応液中に飽和溶解度以上の沈
殿物として存在させても反応の進行と共に溶解するため
差し支えない。エチレンジアミンの濃度は、通常、０．
０１〜２Ｍである。反応液中への金属化合物添加量は生
成するＳＳ−ＥＤＤＳに対して、通常、０．０１〜２倍
モルである。微生物などの使用量は基質に対する乾燥菌
体換算で、通常、０．０１〜５重量％である。また、原
料がいずれかに関わらず、エチレンジアミン、フマル酸
を他の化合物から合成し得る反応系を本反応系と共存さ
せたとしても、本発明の効果が得られる限り差し支えな
い。
０〜４５℃の範囲で行う。ｐＨは、通常、４〜１１、好
ましくはｐＨ７〜１０の範囲である。反応で用いるフマ
ル酸の濃度は反応温度やｐＨにより異なるが、通常、
０．０１〜３Ｍであり、反応液中に飽和溶解度以上の沈
殿物として存在させても反応の進行と共に溶解するため
差し支えない。エチレンジアミンの濃度は、通常、０．
０１〜２Ｍである。反応液中への金属化合物添加量は生
成するＳＳ−ＥＤＤＳに対して、通常、０．０１〜２倍
モルである。微生物などの使用量は基質に対する乾燥菌
体換算で、通常、０．０１〜５重量％である。また、原
料がいずれかに関わらず、エチレンジアミン、フマル酸
を他の化合物から合成し得る反応系を本反応系と共存さ
せたとしても、本発明の効果が得られる限り差し支えな
い。
【００２０】電気伝導率計の方式には、交流２電極方
式、交流４電極方式、電磁誘導方式等があるが、本発明
の効果が得られる限りいずれも使用可能である。電気伝
導率計の設定はあらかじめ一定濃度の反応液でのＳＳ−
ＥＤＤＳ生成量と検出器の表示値との相関関係を示す検
量線を作成しておき、検出器の表示値が所定の幅となる
ようにすればよい。
式、交流４電極方式、電磁誘導方式等があるが、本発明
の効果が得られる限りいずれも使用可能である。電気伝
導率計の設定はあらかじめ一定濃度の反応液でのＳＳ−
ＥＤＤＳ生成量と検出器の表示値との相関関係を示す検
量線を作成しておき、検出器の表示値が所定の幅となる
ようにすればよい。
【００２１】原料供給および／または反応液回収の制御
は、電気伝導率検出器（通常、電極あるいはセルと呼ば
れる）を反応液中に接触させ、その電気信号を増幅器、
変換器、リレー等を内蔵する調節器に送り自動で行う
か、あるいは電気伝導率を随時モニターしながら手動で
行う。回分反応では、目的の基質、生成物に相当する電
気伝導率となった時点で反応液を回収すればよいし、ま
た、反応槽内の電気伝導率が一定となるように原料添加
と反応液回収を同時に行えば、連続反応とすることがで
きる。連続反応は、反応槽を連結して多槽で行うことも
可能である。
は、電気伝導率検出器（通常、電極あるいはセルと呼ば
れる）を反応液中に接触させ、その電気信号を増幅器、
変換器、リレー等を内蔵する調節器に送り自動で行う
か、あるいは電気伝導率を随時モニターしながら手動で
行う。回分反応では、目的の基質、生成物に相当する電
気伝導率となった時点で反応液を回収すればよいし、ま
た、反応槽内の電気伝導率が一定となるように原料添加
と反応液回収を同時に行えば、連続反応とすることがで
きる。連続反応は、反応槽を連結して多槽で行うことも
可能である。
【００２２】反応に当たっては菌体あたりの生産性や活
性等を判断して温度、ｐＨ条件を選択して行えばよい
が、電気伝導率はｐＨ、温度の影響を受け易いので、反
応時にｐＨや温度の変化がある場合にはｐＨ、温度によ
り電気伝導率がどのように変化するかを把握しておく必
要がある。より好ましくは適当な酸、またはアルカリ溶
液によりｐＨ調節および温度調節を行う。ｐＨ調節を行
う場合、金属イオンを添加しないときおよびアルカリ土
類金属を添加したときにはｐＨが低下するので、アルカ
リ金属の水酸化物、エチレンジアミン、ＳＳ−ＥＤＤＳ
のアルカリ金属やアンモニウム塩等のアルカリによって
行い、アルカリ土類金属以外の金属イオンを添加する場
合は、通常、ｐＨが上昇するので硫酸、塩酸、硝酸、リ
ン酸、フマル酸、マレイン酸、ＳＳ−ＥＤＤＳ等の酸に
よって行う。これらの反応、回収は、回分、連続のいず
れの方法でも行うことができる。
性等を判断して温度、ｐＨ条件を選択して行えばよい
が、電気伝導率はｐＨ、温度の影響を受け易いので、反
応時にｐＨや温度の変化がある場合にはｐＨ、温度によ
り電気伝導率がどのように変化するかを把握しておく必
要がある。より好ましくは適当な酸、またはアルカリ溶
液によりｐＨ調節および温度調節を行う。ｐＨ調節を行
う場合、金属イオンを添加しないときおよびアルカリ土
類金属を添加したときにはｐＨが低下するので、アルカ
リ金属の水酸化物、エチレンジアミン、ＳＳ−ＥＤＤＳ
のアルカリ金属やアンモニウム塩等のアルカリによって
行い、アルカリ土類金属以外の金属イオンを添加する場
合は、通常、ｐＨが上昇するので硫酸、塩酸、硝酸、リ
ン酸、フマル酸、マレイン酸、ＳＳ−ＥＤＤＳ等の酸に
よって行う。これらの反応、回収は、回分、連続のいず
れの方法でも行うことができる。
【００２３】本発明で使用される微生物としてはＥＤＤ
Ｓアーゼ活性を有する微生物であればいずれも対象とな
る。例えば、バークホルデリア（Burkholderia）属、ア
シドボラックス（Acidovorax）属、シュードモナス（Ps
eudomonas)属、パラコッカス（Paracoccus）属、スフィ
ンゴモナス（Sphingomonas）属およびブレブンジモナス
（Brevundimonas)属に属する細菌、さらに宿主としてエ
シェリヒア（Esherichia）属またはロドコッカス（Rhod
ococcus)属に属する細菌を用い、これにＥＤＤＳアーゼ
をコードする遺伝子ＤＮＡを導入した形質転換体などを
例として挙げることができる。具体的には、Burkholder
ia sp.ＫＫ−５株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１２〕、同Ｋ
Ｋ−９株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１３〕、Acidovorax s
p.ＴＮ−５１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１６〕、Pseudo
monas sp. ＴＮ−１３１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１
８〕、Paracoccus sp.ＫＫ−６株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５
４１５〕、同ＴＮＯ−５株〔FERM P-16435〕、Sphingom
onas sp.ＴＮ−２８株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１９〕、
Brevundimonas sp. ＴＮ−３０株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５
４１７〕および同ＴＮ−３株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５８８
６〕、さらに、宿主として大腸菌JM109 株〔Esherichia
coli ATCC53323株〕またはRhodococcus rhodochrous A
TCC17895 株を用いた形質転換体を挙げることができ
る。上記微生物のうち、ＫＫ−５株、ＫＫ−９株、ＴＮ
−５１株、ＴＮ−１３１株、ＫＫ−６株、ＴＮ−２８
株、ＴＮ−３０株、ＴＮ−３株は、本発明者らにより自
然界から新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されており、これらの
菌株の菌学的性質は、前記特開平９−１４０３９０号公
報、特開平１０−５２２９２号公報等に記載されてい
る。また、ＴＮＯ−５株も、本発明者らにより自然界か
ら新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている。本菌の菌学的性
質は以下に示す通りである。
Ｓアーゼ活性を有する微生物であればいずれも対象とな
る。例えば、バークホルデリア（Burkholderia）属、ア
シドボラックス（Acidovorax）属、シュードモナス（Ps
eudomonas)属、パラコッカス（Paracoccus）属、スフィ
ンゴモナス（Sphingomonas）属およびブレブンジモナス
（Brevundimonas)属に属する細菌、さらに宿主としてエ
シェリヒア（Esherichia）属またはロドコッカス（Rhod
ococcus)属に属する細菌を用い、これにＥＤＤＳアーゼ
をコードする遺伝子ＤＮＡを導入した形質転換体などを
例として挙げることができる。具体的には、Burkholder
ia sp.ＫＫ−５株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１２〕、同Ｋ
Ｋ−９株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１３〕、Acidovorax s
p.ＴＮ−５１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１６〕、Pseudo
monas sp. ＴＮ−１３１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１
８〕、Paracoccus sp.ＫＫ−６株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５
４１５〕、同ＴＮＯ−５株〔FERM P-16435〕、Sphingom
onas sp.ＴＮ−２８株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１９〕、
Brevundimonas sp. ＴＮ−３０株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５
４１７〕および同ＴＮ−３株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５８８
６〕、さらに、宿主として大腸菌JM109 株〔Esherichia
coli ATCC53323株〕またはRhodococcus rhodochrous A
TCC17895 株を用いた形質転換体を挙げることができ
る。上記微生物のうち、ＫＫ−５株、ＫＫ−９株、ＴＮ
−５１株、ＴＮ−１３１株、ＫＫ−６株、ＴＮ−２８
株、ＴＮ−３０株、ＴＮ−３株は、本発明者らにより自
然界から新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されており、これらの
菌株の菌学的性質は、前記特開平９−１４０３９０号公
報、特開平１０−５２２９２号公報等に記載されてい
る。また、ＴＮＯ−５株も、本発明者らにより自然界か
ら新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている。本菌の菌学的性
質は以下に示す通りである。
【００２４】
【００２５】上記菌学的性質を、Bergey's Manual of S
ystematic Bacteriology Vol.9(1990)により分類すると
ＴＮＯ−５株はパラコッカス（Paracoccus）属に属する
細菌と同定された。尚、ＴＮ−３株はディミヌタ（dimi
nuta) 種であることが確認されている。
ystematic Bacteriology Vol.9(1990)により分類すると
ＴＮＯ−５株はパラコッカス（Paracoccus）属に属する
細菌と同定された。尚、ＴＮ−３株はディミヌタ（dimi
nuta) 種であることが確認されている。
【００２６】大腸菌 JM109株（Esherichia coli ATCC53
323 株）、Rhodococcus rhodochrous ATCC17895 株は公
知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション
（ATCC）から容易に入手することができる。これらの菌
株を宿主として、ＴＮ−３株のＥＤＤＳアーゼ活性を有
するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡを含むプラス
ミド pEDS020および pSE001 を導入した形質転換体が、
E. coli JM109/pEDS020(FERM BP-6161) および Rhodoco
ccus rhodochrous ATCC17895/pSE001(FERM BP-6548) と
して、それぞれ通産省工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されている。なお、これら形質転換体の作成方
法は、本出願人の出願に係る特開平１０−２１０９８４
号公報に記載されている。
323 株）、Rhodococcus rhodochrous ATCC17895 株は公
知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション
（ATCC）から容易に入手することができる。これらの菌
株を宿主として、ＴＮ−３株のＥＤＤＳアーゼ活性を有
するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡを含むプラス
ミド pEDS020および pSE001 を導入した形質転換体が、
E. coli JM109/pEDS020(FERM BP-6161) および Rhodoco
ccus rhodochrous ATCC17895/pSE001(FERM BP-6548) と
して、それぞれ通産省工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託されている。なお、これら形質転換体の作成方
法は、本出願人の出願に係る特開平１０−２１０９８４
号公報に記載されている。
【００２７】
【実施例】次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。
る。
【００２８】（１）ＳＳ−ＥＤＤＳ、フマル酸濃度の測
定 反応液中の不溶物を１５，０００ｒｐｍ、５℃、５分間
の遠心分離にて除去した後、液体クロマトグラフィーに
てＳＳ−ＥＤＤＳを定量した。定量用カラムとしては W
AKOSIL 5C8（和光純薬）〔溶出液；１０ｍＭ 水酸化テ
トラ−ｎ−ブチルアンモニウムと０．４ｍＭ ＣｕＳＯ
４ を含む５０ｍＭリン酸、ｐＨ２〕を、また光学分割
カラムとして MCI GEL CRS 10W（三菱化学社製）〔溶出
液；１０ｍＭ ＣｕＳＯ４〕を使用した。
定 反応液中の不溶物を１５，０００ｒｐｍ、５℃、５分間
の遠心分離にて除去した後、液体クロマトグラフィーに
てＳＳ−ＥＤＤＳを定量した。定量用カラムとしては W
AKOSIL 5C8（和光純薬）〔溶出液；１０ｍＭ 水酸化テ
トラ−ｎ−ブチルアンモニウムと０．４ｍＭ ＣｕＳＯ
４ を含む５０ｍＭリン酸、ｐＨ２〕を、また光学分割
カラムとして MCI GEL CRS 10W（三菱化学社製）〔溶出
液；１０ｍＭ ＣｕＳＯ４〕を使用した。
【００２９】（２）電気伝導率の測定 交流２電極式電気伝導率指示調節計（東亜電波工業；Ｃ
ＤＩＣ−７型）および電気伝導率セル（同；ＣＧＳ−３
５１１型）をＫＣｌ水溶液を標準として校正し使用し
た。
ＤＩＣ−７型）および電気伝導率セル（同；ＣＧＳ−３
５１１型）をＫＣｌ水溶液を標準として校正し使用し
た。
【００３０】参考例１ （１）菌体触媒の調製 Esherichia coli JM109/pEDS020を斜面培地から１白金
耳とり、５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地
（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキ
ス、０．５％ＮａＣｌ）に接種して３７℃にて８時間振
とう培養した。これを、ＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌアンピ
シリン、１ｍＭ isopropyl-b-galactosideを含有）に、
２．５％量接種し、３７℃、３０時間、好気的に振とう
培養した。培養液１Lから、菌体を遠心分離（７，００
０ｒｐｍ,２０分）により集菌し、１００ｍＭ １，４−
ジアミノブタンを含む５０ｍＭほう酸緩衝液ｐＨ７．７
５、５００ｍＬで１回洗浄した。５００ｍＬの同様の緩
衝液に菌体を再懸濁した後、氷中において２５％グルタ
ルアルデヒドを２５ｍＭとなるように徐々に添加した。
ｐＨが低下するので６Ｎ ＮａＯＨにてｐＨ７．７５に
調整した後、撹拌しながら２時間放置した。エチレンジ
アミンを５０ｍＭとなるように添加し、６ＮＮａＯＨで
ｐＨ９．０とした後、２時間放置した。次に水素化ほう
素ナトリウムを２５ｍＭとなるように添加して撹拌しな
がら更に２時間放置した。さらに、６Ｎ ＮａＯＨにて
ｐＨ９．２に調整した後、水浴中で４５℃、４時間、加
熱処理を行い、フマラーゼ活性を除去した。
耳とり、５０ｍｇ／Ｌアンピシリンを含有するＬＢ培地
（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキ
ス、０．５％ＮａＣｌ）に接種して３７℃にて８時間振
とう培養した。これを、ＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌアンピ
シリン、１ｍＭ isopropyl-b-galactosideを含有）に、
２．５％量接種し、３７℃、３０時間、好気的に振とう
培養した。培養液１Lから、菌体を遠心分離（７，００
０ｒｐｍ,２０分）により集菌し、１００ｍＭ １，４−
ジアミノブタンを含む５０ｍＭほう酸緩衝液ｐＨ７．７
５、５００ｍＬで１回洗浄した。５００ｍＬの同様の緩
衝液に菌体を再懸濁した後、氷中において２５％グルタ
ルアルデヒドを２５ｍＭとなるように徐々に添加した。
ｐＨが低下するので６Ｎ ＮａＯＨにてｐＨ７．７５に
調整した後、撹拌しながら２時間放置した。エチレンジ
アミンを５０ｍＭとなるように添加し、６ＮＮａＯＨで
ｐＨ９．０とした後、２時間放置した。次に水素化ほう
素ナトリウムを２５ｍＭとなるように添加して撹拌しな
がら更に２時間放置した。さらに、６Ｎ ＮａＯＨにて
ｐＨ９．２に調整した後、水浴中で４５℃、４時間、加
熱処理を行い、フマラーゼ活性を除去した。
【００３１】（２）反応液の調製と反応 反応液組成は最終濃度換算で、１Ｋｇあたりフマル酸
１．０２７モル、エチレンジアミン０．５１３モル、水
酸化マグネシウム０．５１３モル、ＮａＯＨ０．５１３
モル、菌体５０ｇ（乾燥重量換算）であり、水、フマル
酸、水酸化マグネシウムを透明となるまで激しく撹拌し
たあと、２４ｗｔ％ＮａＯＨ、エチレンジアミンの順に
加え、透明となるまで撹拌し、４０℃にて菌体を添加す
ることにより反応を開始し、２４時間、４０℃にて反応
を行った。菌体添加前のｐＨは約８．５であったが、反
応中ｐＨが低下するので、２４ｗｔ％ＮａＯＨによりｐ
Ｈを８．５に保った。反応中の電気伝導率変化と反応液
組成を表１に示す。
１．０２７モル、エチレンジアミン０．５１３モル、水
酸化マグネシウム０．５１３モル、ＮａＯＨ０．５１３
モル、菌体５０ｇ（乾燥重量換算）であり、水、フマル
酸、水酸化マグネシウムを透明となるまで激しく撹拌し
たあと、２４ｗｔ％ＮａＯＨ、エチレンジアミンの順に
加え、透明となるまで撹拌し、４０℃にて菌体を添加す
ることにより反応を開始し、２４時間、４０℃にて反応
を行った。菌体添加前のｐＨは約８．５であったが、反
応中ｐＨが低下するので、２４ｗｔ％ＮａＯＨによりｐ
Ｈを８．５に保った。反応中の電気伝導率変化と反応液
組成を表１に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】実施例１ （１）菌体触媒の調製 参考例１と同様。
【００３４】（２）反応液の調製と反応 参考例１と同様に反応を行い、電気伝導率が３６．０ｍ
Ｓ／ｃｍとなった時点で反応液を回収し分析した。ＳＳ
−ＥＤＤＳ濃度は４４８ｍＭ、フマル酸は４０ｍＭであ
った。
Ｓ／ｃｍとなった時点で反応液を回収し分析した。ＳＳ
−ＥＤＤＳ濃度は４４８ｍＭ、フマル酸は４０ｍＭであ
った。
【００３５】実施例２ （１）菌体触媒の調製 参考例１と同様。
【００３６】（２）反応液の調製と反応 参考例１と同様に反応を行い、電気伝導率が３６．０ｍ
Ｓ／ｃｍとなった時でチューブポンプで同じ組成の反応
液を定速で供給、同時に反応液の一部を回収することに
より、電気伝導率を３５．８〜３６．２ｍＳ／ｃｍの幅
に保った。この回収の際、ギアポンプと中空糸膜［クラ
レ；ＳＦ−８１０２（孔径０．１μｍ、内径×長さ＝
１．２×３５０ｍｍ）］を用いることで、菌体は反応槽
に戻し、ろ液のみを回収できる様にした。４８時間操作
を行い、この間のＳＳ−ＥＤＤＳ濃度は、４４２〜４５
０ｍＭ、フマル酸濃度は、３８〜４１ｍＭであった。
Ｓ／ｃｍとなった時でチューブポンプで同じ組成の反応
液を定速で供給、同時に反応液の一部を回収することに
より、電気伝導率を３５．８〜３６．２ｍＳ／ｃｍの幅
に保った。この回収の際、ギアポンプと中空糸膜［クラ
レ；ＳＦ−８１０２（孔径０．１μｍ、内径×長さ＝
１．２×３５０ｍｍ）］を用いることで、菌体は反応槽
に戻し、ろ液のみを回収できる様にした。４８時間操作
を行い、この間のＳＳ−ＥＤＤＳ濃度は、４４２〜４５
０ｍＭ、フマル酸濃度は、３８〜４１ｍＭであった。
【００３７】参考例２ （１）菌体触媒の調製 参考例１と同様。
【００３８】（２）反応液の調製と反応 反応液組成は最終濃度換算で、１Ｋｇあたりフマル酸
１．０２７モル、エチレンジアミン０．５１３モル、Ｎ
ａＯＨ１．０２７モル、菌体５０ｇ（乾燥重量換算）で
あり、水、フマル酸、２４ｗｔ％ＮａＯＨ、エチレンジ
アミンの順に加え、透明となるまで撹拌し、４０℃にて
菌体を添加することにより反応を開始し、４０℃で４８
時間反応を行った。菌体添加前のｐHは約８．８であ
り、反応中ｐＨが低下したが、ｐHを一定に保つための
アルカリは添加しなかった。反応中の電気伝導率変化と
反応液組成を表２に示す。
１．０２７モル、エチレンジアミン０．５１３モル、Ｎ
ａＯＨ１．０２７モル、菌体５０ｇ（乾燥重量換算）で
あり、水、フマル酸、２４ｗｔ％ＮａＯＨ、エチレンジ
アミンの順に加え、透明となるまで撹拌し、４０℃にて
菌体を添加することにより反応を開始し、４０℃で４８
時間反応を行った。菌体添加前のｐHは約８．８であ
り、反応中ｐＨが低下したが、ｐHを一定に保つための
アルカリは添加しなかった。反応中の電気伝導率変化と
反応液組成を表２に示す。
【００３９】
【表２】 実施例３ （１）菌体触媒の調製 参考例１と同様。
【００４０】（２）反応液の調製と反応 参考例２と同様に反応を行い、電気伝導率が５１．８ｍ
Ｓ／ｃｍとなった時点で反応液を回収し分析した。ＳＳ
−ＥＤＤＳ濃度は２２０ｍＭ、フマル酸は６５６ｍＭで
あった。
Ｓ／ｃｍとなった時点で反応液を回収し分析した。ＳＳ
−ＥＤＤＳ濃度は２２０ｍＭ、フマル酸は６５６ｍＭで
あった。
【００４１】
【発明の効果】予め電気伝導率と生成物／基質比の相関
データを取得することにより、それに基づいて原料供給
および／または反応液回収を操作することで容易に原
料、生成物濃度を制御することができる。電気伝導率計
は通常、副反応等の影響を大きく受けるため厳密な制御
には適用できないが、本発明によるところの微生物反応
は極めて副反応が少なく、かつ反応進行とともに十分な
電気伝導率変化を示すため、精度の高い制御が可能であ
る。
データを取得することにより、それに基づいて原料供給
および／または反応液回収を操作することで容易に原
料、生成物濃度を制御することができる。電気伝導率計
は通常、副反応等の影響を大きく受けるため厳密な制御
には適用できないが、本発明によるところの微生物反応
は極めて副反応が少なく、かつ反応進行とともに十分な
電気伝導率変化を示すため、精度の高い制御が可能であ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年１２月１７日（１９９９．１２．
１７）
１７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】本発明で使用される微生物としてはＥＤＤ
Ｓアーゼ活性を有する微生物であればいずれも対象とな
る。例えば、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
ｉａ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）
属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、パ
ラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモ
ナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属およびブレブンジ
モナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属に属する細
菌、さらに宿主としてエシェリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈ
ｉａ）属またはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属に属する細菌を用い、これにＥＤＤＳアーゼをコ
ードする遺伝子ＤＮＡを導入した形質転換体などを例と
して挙げることができる。具体的には、Ｂｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒｉａ ｓｐ．ＫＫ−５株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４
１２〕、同ＫＫ−９株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１３〕、
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｓｐ．ＴＮ−５１株〔ＦＥＲＭ
ＢＰ−５４１６〕、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．
ＴＮ−１３１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１８〕、Ｐａｒ
ａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＫ−６株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−
５４１５〕、同ＴＮＯ−５株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−６５４
７〕、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＴＮ−２８株
〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１９〕、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏ
ｎａｓ ｓｐ．ＴＮ−３０株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１
７〕および同ＴＮ−３株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５８８
６〕、さらに、宿主として大腸菌ＪＭ１０９株〔Ｅｓｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＡＴＣＣ５３３２３株〕また
はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ
ＡＴＣＣ１７８９５株を用いた形質転換体を挙げること
ができる。上記微生物のうち、ＫＫ−５株、ＫＫ−９
株、ＴＮ−５１株、ＴＮ−１３１株、ＫＫ−６株、ＴＮ
−２８株、ＴＮ−３０株、ＴＮ−３株は、本発明者らに
より自然界から新たに分離され、上記番号にて通産省工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、こ
れらの菌株の菌学的性質は、前記特開平９−１４０３９
０号公報、特開平１０−５２２９２号公報等に記載され
ている。また、ＴＮＯ−５株も、本発明者らにより自然
界から新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託されている。本菌の菌学
Ｓアーゼ活性を有する微生物であればいずれも対象とな
る。例えば、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
ｉａ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）
属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、パ
ラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモ
ナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属およびブレブンジ
モナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属に属する細
菌、さらに宿主としてエシェリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈ
ｉａ）属またはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属に属する細菌を用い、これにＥＤＤＳアーゼをコ
ードする遺伝子ＤＮＡを導入した形質転換体などを例と
して挙げることができる。具体的には、Ｂｕｒｋｈｏｌ
ｄｅｒｉａ ｓｐ．ＫＫ−５株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４
１２〕、同ＫＫ−９株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１３〕、
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｓｐ．ＴＮ−５１株〔ＦＥＲＭ
ＢＰ−５４１６〕、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．
ＴＮ−１３１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１８〕、Ｐａｒ
ａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＫ−６株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−
５４１５〕、同ＴＮＯ−５株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−６５４
７〕、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＴＮ−２８株
〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１９〕、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏ
ｎａｓ ｓｐ．ＴＮ−３０株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１
７〕および同ＴＮ−３株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５８８
６〕、さらに、宿主として大腸菌ＪＭ１０９株〔Ｅｓｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＡＴＣＣ５３３２３株〕また
はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ
ＡＴＣＣ１７８９５株を用いた形質転換体を挙げること
ができる。上記微生物のうち、ＫＫ−５株、ＫＫ−９
株、ＴＮ−５１株、ＴＮ−１３１株、ＫＫ−６株、ＴＮ
−２８株、ＴＮ−３０株、ＴＮ−３株は、本発明者らに
より自然界から新たに分離され、上記番号にて通産省工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、こ
れらの菌株の菌学的性質は、前記特開平９−１４０３９
０号公報、特開平１０−５２２９２号公報等に記載され
ている。また、ＴＮＯ−５株も、本発明者らにより自然
界から新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託されている。本菌の菌学
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成１１年１２月１７日（１９９９．１
２．１７）
２．１７）
【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所
究所
【旧受託番号】 微工研菌寄第１６４３５号
【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所
究所
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−６５４７
Claims (4)
- 【請求項１】 エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク
酸エチレンジアミンリアーゼ活性を有する微生物または
その調製物の作用により、フマル酸とエチレンジアミン
からＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸
を製造する方法において、反応系内に電気伝導率計を設
置し、検知した電気伝導率の変化に基づいて原料供給お
よび／または反応液回収を行い反応を制御することを特
徴とするＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハ
ク酸製造反応の制御法。 - 【請求項２】 反応系内に、アルカリ土類金属、鉄、亜
鉛、銅、ニッケル、アルミニウム、チタニウムおよびマ
ンガンからなる群から選ばれる少なくとも１種の金属イ
オンを存在させる請求項１に記載のＳ，Ｓ−エチレンジ
アミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸製造反応の制御法。 - 【請求項３】 反応に伴うｐＨの変化に対して、反応系
内にアルカリまたは酸を添加してｐＨ７〜１０の範囲か
ら選ばれる一定の値にｐＨを保持する請求項１または２
記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク
酸製造反応の制御法。 - 【請求項４】 アルカリがアルカリ金属の水酸化物、ア
ルカリ土類金属の水酸化物、アンモニアまたはその水酸
化物およびエチレンジアミンから選ばれる少なくとも１
種であり、酸が硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、フマル酸、
マレイン酸および Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，
Ｎ’−ジコハク酸から選ばれる少なくとも１種である請
求項３記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジ
コハク酸製造反応の制御法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16751899A JP4372266B2 (ja) | 1999-06-14 | 1999-06-14 | Ｓ，ｓ−エチレンジアミン−ｎ，ｎ’−ジコハク酸製造反応の制御法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16751899A JP4372266B2 (ja) | 1999-06-14 | 1999-06-14 | Ｓ，ｓ−エチレンジアミン−ｎ，ｎ’−ジコハク酸製造反応の制御法 |
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-
1999
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