JP3526443B2 - ［ｓ，ｓ］−エチレンジアミン−ｎ，ｎ’−ジコハク酸の製造法 - Google Patents
［ｓ，ｓ］−エチレンジアミン−ｎ，ｎ’−ジコハク酸の製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の技術分野
本発明は、[S,S]-エチレンジアミン-N,N'-ジコハク酸
〔以下、[S,S]-ＥＤＤＳと略記する〕の製法に関する。
具体的には、本発明は、マレイン酸、無水マレイン酸も
しくはマレイン酸塩とエチレンジアミンから微生物また
は酵素の作用によって[S,S]-ＥＤＤＳを製造する方法に
関する。
〔以下、[S,S]-ＥＤＤＳと略記する〕の製法に関する。
具体的には、本発明は、マレイン酸、無水マレイン酸も
しくはマレイン酸塩とエチレンジアミンから微生物また
は酵素の作用によって[S,S]-ＥＤＤＳを製造する方法に
関する。
関連技術の開示
[S,S]-ＥＤＤＳは重金属捕捉能が高く、且つ自然界に
放出されると容易に生分解される性質があるため、写真
用漂白剤、無電解メッキ薬、洗剤用ビルダーなどの用途
が期待されている。
放出されると容易に生分解される性質があるため、写真
用漂白剤、無電解メッキ薬、洗剤用ビルダーなどの用途
が期待されている。
本発明者らは、先に、微生物による[S,S]-ＥＤＤＳの
製造法として、(1)フマル酸とエチレンジアミンから製
造する方法（日本国特許出願公開第9-140390号、米国特
許第5707836号、欧州特許出願公開第0731171号）および
(2)マレイン酸とエチレンジアミンから製造する方法
（日本国特許出願公開第9-289895号）、さらに上記(1)
を金属イオンの存在下に行う方法（欧州特許出願公開第
0805211号、日本国特許出願公開第10-52292号）を提案
している。
製造法として、(1)フマル酸とエチレンジアミンから製
造する方法（日本国特許出願公開第9-140390号、米国特
許第5707836号、欧州特許出願公開第0731171号）および
(2)マレイン酸とエチレンジアミンから製造する方法
（日本国特許出願公開第9-289895号）、さらに上記(1)
を金属イオンの存在下に行う方法（欧州特許出願公開第
0805211号、日本国特許出願公開第10-52292号）を提案
している。
フマル酸はマレイン酸から化学的方法（米国特許第28
16923号、同2955136号、同2332992号）による異性化工
程を経て工業的に生産されているため、上記(2)の方法
は、より安価な[S,S]-ＥＤＤＳの製造法として原料面で
有利である。
16923号、同2955136号、同2332992号）による異性化工
程を経て工業的に生産されているため、上記(2)の方法
は、より安価な[S,S]-ＥＤＤＳの製造法として原料面で
有利である。
なお、上記日本国特許出願公開第9-289895号の方法
は、基質としてマレイン酸とエチレンジアミンを用いる
方法であるが、収率が低く満足し得るものではない。
は、基質としてマレイン酸とエチレンジアミンを用いる
方法であるが、収率が低く満足し得るものではない。
したがって、本発明は、マレイン酸を原料として高収
率で[S,S]-ＥＤＤＳを得ることを目的とする。
率で[S,S]-ＥＤＤＳを得ることを目的とする。
本発明者らは生化学的知見〔W.ScherらJ.Biol.Chem.,
244,1878-1882(1969),Y.TakamuraらAgr.Biol.Chem.,33,
718-728(1969),T.KimuraらAgr.Biol.Chem.,50,89-94(19
86),T.Nakajima-KambeらJ.Ferment.Bioeng.,84,165-168
(1997)〕が多く、またアスパラギン酸製造への応用も提
案されているマレイン酸イソメラーゼ（日本国特許第26
64648号、日本国特許出願公開第8-51989号、欧州特許出
願公開第693557号）を[S,S]-ＥＤＤＳの生産にも応用す
べく鋭意検討を行った。
244,1878-1882(1969),Y.TakamuraらAgr.Biol.Chem.,33,
718-728(1969),T.KimuraらAgr.Biol.Chem.,50,89-94(19
86),T.Nakajima-KambeらJ.Ferment.Bioeng.,84,165-168
(1997)〕が多く、またアスパラギン酸製造への応用も提
案されているマレイン酸イソメラーゼ（日本国特許第26
64648号、日本国特許出願公開第8-51989号、欧州特許出
願公開第693557号）を[S,S]-ＥＤＤＳの生産にも応用す
べく鋭意検討を行った。
その結果、単にマレイン酸とエチレンジアミン溶液に
マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物とエチレン
ジアミン-N,N'-ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼ
〔以下、ＥＤＤＳアーゼと略記する〕活性を有する微生
物とを添加しただけでは、[S,S]-ＥＤＤＳへの変換率が
低いこと、しかし、これにアルカリ土類金属等の金属イ
オンを存在させることにより初めて、マレイン酸の[S,
S]-ＥＤＤＳへの変換率が大幅に上昇することなどを見
出し本発明に到達した。
マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物とエチレン
ジアミン-N,N'-ジコハク酸エチレンジアミンリアーゼ
〔以下、ＥＤＤＳアーゼと略記する〕活性を有する微生
物とを添加しただけでは、[S,S]-ＥＤＤＳへの変換率が
低いこと、しかし、これにアルカリ土類金属等の金属イ
オンを存在させることにより初めて、マレイン酸の[S,
S]-ＥＤＤＳへの変換率が大幅に上昇することなどを見
出し本発明に到達した。
発明の概要
すなわち、本発明は、アルカリ土類金属、鉄、亜鉛、
銅、ニッケル、アルミニウム、チタニウムおよびマンガ
ンからなる群から選ばれる少なくとも一種の金属イオン
の存在下、マレイン酸、無水マレイン酸またはマレイン
酸塩とエチレンジアミンとを含有する基質溶液に、マレ
イン酸イソメラーゼ活性を有する微生物またはその処理
物とエチレンジアミン-N,N'-ジコハク酸エチレンジアミ
ンリアーゼ活性を有する微生物またはその処理物とを作
用せしめ、[S,S]-エチレンジアミン-N,N'-ジコハク酸を
得ることを特徴とする[S,S]-エチレンジアミン-N,N'-ジ
コハク酸の製造法を提供する。
銅、ニッケル、アルミニウム、チタニウムおよびマンガ
ンからなる群から選ばれる少なくとも一種の金属イオン
の存在下、マレイン酸、無水マレイン酸またはマレイン
酸塩とエチレンジアミンとを含有する基質溶液に、マレ
イン酸イソメラーゼ活性を有する微生物またはその処理
物とエチレンジアミン-N,N'-ジコハク酸エチレンジアミ
ンリアーゼ活性を有する微生物またはその処理物とを作
用せしめ、[S,S]-エチレンジアミン-N,N'-ジコハク酸を
得ることを特徴とする[S,S]-エチレンジアミン-N,N'-ジ
コハク酸の製造法を提供する。
本発明においては、マレイン酸をフマル酸に変換する
酵素およびフマル酸を[S,S]-ＥＤＤＳに変換する酵素の
両方が、各々の酵素の由来には関係なく、可逆的な平衡
反応を触媒するので、単に両酵素を存在させるだけでは
高収率で[S,S]-ＥＤＤＳを得ることは不可能であるとこ
ろ、アルカリ土類金属等のイオンを存在させて生成する
[S,S]-ＥＤＤＳを金属錯体と成し両酵素の反応系外にも
っていくことで反応平衡を生成側へ移動させ、これによ
り高収率、且つ高濃度で[S,S]-ＥＤＤＳを反応系内に蓄
積させることが可能になるものと推察される。
酵素およびフマル酸を[S,S]-ＥＤＤＳに変換する酵素の
両方が、各々の酵素の由来には関係なく、可逆的な平衡
反応を触媒するので、単に両酵素を存在させるだけでは
高収率で[S,S]-ＥＤＤＳを得ることは不可能であるとこ
ろ、アルカリ土類金属等のイオンを存在させて生成する
[S,S]-ＥＤＤＳを金属錯体と成し両酵素の反応系外にも
っていくことで反応平衡を生成側へ移動させ、これによ
り高収率、且つ高濃度で[S,S]-ＥＤＤＳを反応系内に蓄
積させることが可能になるものと推察される。
さらに、マレイン酸からフマル酸、およびフマル酸か
ら[S,S]-ＥＤＤＳへの変換反応は弱い発熱反応であり、
熱力学的には反応温度が低いほど生成物側（フマル酸生
成側）に平衡が傾くので、上記金属イオン非存在下の反
応では、収率向上を目的として反応後期に反応温度を下
げるなどの操作を行う必要があった。しかし、該金属イ
オン存在下では温度を下げるなどの操作を行わなくても
高い変換収率が得られる。
ら[S,S]-ＥＤＤＳへの変換反応は弱い発熱反応であり、
熱力学的には反応温度が低いほど生成物側（フマル酸生
成側）に平衡が傾くので、上記金属イオン非存在下の反
応では、収率向上を目的として反応後期に反応温度を下
げるなどの操作を行う必要があった。しかし、該金属イ
オン存在下では温度を下げるなどの操作を行わなくても
高い変換収率が得られる。
なお、本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特
許出願第9−364798号（1997年12月22日出願）の明細書
に記載される内容の全部または一部を包含する。
許出願第9−364798号（1997年12月22日出願）の明細書
に記載される内容の全部または一部を包含する。
発明の詳細な説明
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における金属のイオンは、アルカリ土類金属、
鉄、亜鉛、銅、ニッケル、アルミニウム、チタニウムお
よびマンガンのイオンであり、例えば、Ｍｇ(II)、Ｃａ
(II)、Ｓｒ(II)、Ｂａ(II)、Ｆｅ(II)、Ｆｅ(III)、Ｚ
ｎ(II)、Ｃｕ(II)、Ｎｉ(II)、Ａｌ(III)、Ｔｉ(IV)お
よびＭｎ(II)イオンならびにこれらの各種錯イオンを挙
げることができる。
鉄、亜鉛、銅、ニッケル、アルミニウム、チタニウムお
よびマンガンのイオンであり、例えば、Ｍｇ(II)、Ｃａ
(II)、Ｓｒ(II)、Ｂａ(II)、Ｆｅ(II)、Ｆｅ(III)、Ｚ
ｎ(II)、Ｃｕ(II)、Ｎｉ(II)、Ａｌ(III)、Ｔｉ(IV)お
よびＭｎ(II)イオンならびにこれらの各種錯イオンを挙
げることができる。
これら金属のイオン源としては、これら金属の水酸化
物、酸化物ならびに硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、炭酸お
よび酢酸等の無機または有機酸塩、さらにこれら金属化
合物を含む鉱物や本発明の基質であるマレイン酸やエチ
レンジアミンとの化合物等を挙げることができる。これ
らの化合物は２種以上混合して用いることも可能であ
る。
物、酸化物ならびに硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、炭酸お
よび酢酸等の無機または有機酸塩、さらにこれら金属化
合物を含む鉱物や本発明の基質であるマレイン酸やエチ
レンジアミンとの化合物等を挙げることができる。これ
らの化合物は２種以上混合して用いることも可能であ
る。
また、これらの金属化合物中には、水に対し溶解度の
低いものあるいは難溶性のものもあるが、これらを飽和
濃度以上に、例えば、懸濁状態として存在させた場合で
も、[S,S]-ＥＤＤＳの配位能により相当量が可溶化され
るため使用可能である。すなわち、本発明の「金属イオ
ン」源としての化合物は、金属のイオンが[S,S]-ＥＤＤ
Ｓと配位し、本発明の効果が得られるものである限り使
用できる。
低いものあるいは難溶性のものもあるが、これらを飽和
濃度以上に、例えば、懸濁状態として存在させた場合で
も、[S,S]-ＥＤＤＳの配位能により相当量が可溶化され
るため使用可能である。すなわち、本発明の「金属イオ
ン」源としての化合物は、金属のイオンが[S,S]-ＥＤＤ
Ｓと配位し、本発明の効果が得られるものである限り使
用できる。
本発明に使用されるマレイン酸イソメラーゼ活性を有
する微生物としては、マレイン酸を異性化してフマル酸
に変換する微生物であれば特に制限はなく、例えば、ア
ルカリゲネス（Alcaligenes）属、シュードモナス（Pse
udomonas）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、バ
チルス（Bacillus）属に属する微生物を挙げることがで
きる。さらに、これらの微生物に由来するマレイン酸イ
ソメラーゼ遺伝子を組換えた遺伝子操作微生物も用いる
ことができる。
する微生物としては、マレイン酸を異性化してフマル酸
に変換する微生物であれば特に制限はなく、例えば、ア
ルカリゲネス（Alcaligenes）属、シュードモナス（Pse
udomonas）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、バ
チルス（Bacillus）属に属する微生物を挙げることがで
きる。さらに、これらの微生物に由来するマレイン酸イ
ソメラーゼ遺伝子を組換えた遺伝子操作微生物も用いる
ことができる。
具体的な菌株としては、アルカリゲネス フェカリス
（Alcaligenes faecalis）IFO 12669、同IFO 13111、同
IAM 1473、アルカリゲネス ユートロファス（Alcalige
nes eutrophus）IAM 12305、シュードモナス フルオレ
ッセンス（Pseudomonas fluolescens）ATCC 23728、キ
サントモナス マルトフィリア（Xanthomonas maltophi
lia）ATCC 13270、バチルスsp.MI105（FERM BP-516
4）、バチルス ステアロサーモフィラス（Bacillus st
earothermophirus）MI101（FERM BP-5160）、同MI102
（FERM BP-5161）、バチルス ブレビス（Bacillus bre
vis）MI103（FERM BP-5162）、同MI104（FERM BP-516
3）、等を例示することができるが、これらに限定され
ない。
（Alcaligenes faecalis）IFO 12669、同IFO 13111、同
IAM 1473、アルカリゲネス ユートロファス（Alcalige
nes eutrophus）IAM 12305、シュードモナス フルオレ
ッセンス（Pseudomonas fluolescens）ATCC 23728、キ
サントモナス マルトフィリア（Xanthomonas maltophi
lia）ATCC 13270、バチルスsp.MI105（FERM BP-516
4）、バチルス ステアロサーモフィラス（Bacillus st
earothermophirus）MI101（FERM BP-5160）、同MI102
（FERM BP-5161）、バチルス ブレビス（Bacillus bre
vis）MI103（FERM BP-5162）、同MI104（FERM BP-516
3）、等を例示することができるが、これらに限定され
ない。
これらの微生物は、財団法人醗酵研究所（ＩＦＯ）
（日本）、東京大学分子細胞生物学研究所細胞・機能高
分子総合センターＩＡＭカルチャーコレクション（日
本）、およびアメリカン・タイプカルチャー・コレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）（米国）より容易に入手可能である。
（日本）、東京大学分子細胞生物学研究所細胞・機能高
分子総合センターＩＡＭカルチャーコレクション（日
本）、およびアメリカン・タイプカルチャー・コレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）（米国）より容易に入手可能である。
また、本発明に用いられるＥＤＤＳアーゼ活性を有す
る微生物としては、フマル酸とエチレンジアミンから
[S,S]-ＥＤＤＳを生成せしめる微生物であれば特に制限
は無く、例えば、ブレブンディモナス（Brevundimona
s）属、パラコッカス（Paracoccus）属、スフィンゴモ
ナス（Sphingomonas）属、アシドボラックス（Acidovor
ax）属、シュードモナス（Peudomonas）属、バークホル
デリア（Burkholderia）属に属する微生物を挙げること
ができる。また、これらの微生物に由来するＥＤＤＳア
ーゼ遺伝子を組換えた遺伝子操作微生物も用いることが
できる。
る微生物としては、フマル酸とエチレンジアミンから
[S,S]-ＥＤＤＳを生成せしめる微生物であれば特に制限
は無く、例えば、ブレブンディモナス（Brevundimona
s）属、パラコッカス（Paracoccus）属、スフィンゴモ
ナス（Sphingomonas）属、アシドボラックス（Acidovor
ax）属、シュードモナス（Peudomonas）属、バークホル
デリア（Burkholderia）属に属する微生物を挙げること
ができる。また、これらの微生物に由来するＥＤＤＳア
ーゼ遺伝子を組換えた遺伝子操作微生物も用いることが
できる。
これらの具体的な菌株としてはブレブンディモナスs
p.TN-3（FERM BP-5886）、同TN-30（FERM BP-5417）、
パラコッカスsp.KK-6（FERM BP-5415）、スフィンゴモ
ナスsp.TN-28（FERM BP-5419）、アシドボラックスsp.T
N-51（FERM BP-5416）、シュードモナスsp.TN-131（FER
M BP-5418）、バークホルデリアsp.KK-5（FERM BP-541
2）、同KK-9（FERM BP-5413）等を、また、遺伝子操作
微生物として、上記ブレブンディモナスsp.TN-3由来の
ＥＤＤＳアーゼをコードする遺伝子ＤＮＡを大腸菌JM10
9(Esherichia coli ATCC 53323)、Rhodococcus rhodochr
ous ATCC 17895等に導入した形質転換体、E.coli JM109
/pEDS020（FERM BP-6161）、Rhodococcus rhodochrous
ATCC 17895/pSE001（FERM BP-6548）等を例示すること
ができるが、これらに限定されない。
p.TN-3（FERM BP-5886）、同TN-30（FERM BP-5417）、
パラコッカスsp.KK-6（FERM BP-5415）、スフィンゴモ
ナスsp.TN-28（FERM BP-5419）、アシドボラックスsp.T
N-51（FERM BP-5416）、シュードモナスsp.TN-131（FER
M BP-5418）、バークホルデリアsp.KK-5（FERM BP-541
2）、同KK-9（FERM BP-5413）等を、また、遺伝子操作
微生物として、上記ブレブンディモナスsp.TN-3由来の
ＥＤＤＳアーゼをコードする遺伝子ＤＮＡを大腸菌JM10
9(Esherichia coli ATCC 53323)、Rhodococcus rhodochr
ous ATCC 17895等に導入した形質転換体、E.coli JM109
/pEDS020（FERM BP-6161）、Rhodococcus rhodochrous
ATCC 17895/pSE001（FERM BP-6548）等を例示すること
ができるが、これらに限定されない。
上記のＥＤＤＳアーゼ活性を有する微生物は上記受託
番号にて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（日
本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されてい
る。その菌学的性質は日本国特許出願公開第9-140390
号、欧州特許出願公開第0805211号等に記載されている
し、また形質転換体の製法は日本国特許出願公開第10-2
10984号および日本国特許出願第9-311046号明細書に記
載されており、これらの文献に開示の方法によって目的
の形質転換体を得ることができる。
番号にて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（日
本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されてい
る。その菌学的性質は日本国特許出願公開第9-140390
号、欧州特許出願公開第0805211号等に記載されている
し、また形質転換体の製法は日本国特許出願公開第10-2
10984号および日本国特許出願第9-311046号明細書に記
載されており、これらの文献に開示の方法によって目的
の形質転換体を得ることができる。
本発明に使用される微生物の培養は、資化し得る炭素
源（グリセロール、グルコース、サッカロース等）、窒
素源（無機のアンモニウム塩や硝酸塩、カザミノ酸、肉
エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等）、各
微生物の生育に必須の無機塩（塩化マグネシウム、塩化
カルシウム、硫酸マンガン、塩化鉄、硫酸亜鉛等）、ビ
タミン、核酸などを含有した通常の培地を用いて行うこ
とができる。また、培地中にマレイン酸および[S,S]-Ｅ
ＤＤＳを添加することは、それぞれ、より高いマレイン
酸イソメラーゼ活性およびＥＤＤＳアーゼ活性が得られ
ることがあり好ましい。
源（グリセロール、グルコース、サッカロース等）、窒
素源（無機のアンモニウム塩や硝酸塩、カザミノ酸、肉
エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等）、各
微生物の生育に必須の無機塩（塩化マグネシウム、塩化
カルシウム、硫酸マンガン、塩化鉄、硫酸亜鉛等）、ビ
タミン、核酸などを含有した通常の培地を用いて行うこ
とができる。また、培地中にマレイン酸および[S,S]-Ｅ
ＤＤＳを添加することは、それぞれ、より高いマレイン
酸イソメラーゼ活性およびＥＤＤＳアーゼ活性が得られ
ることがあり好ましい。
培養は、培養液のｐＨ４〜１０、好ましくは６〜９、
培養温度２０〜９０℃、好ましくは２５〜８０℃の範囲
で、１〜１４日間好気的に行うことができる。
培養温度２０〜９０℃、好ましくは２５〜８０℃の範囲
で、１〜１４日間好気的に行うことができる。
[S,S]-ＥＤＤＳ生産反応は、マレイン酸、無水マレイ
ン酸またはマレイン酸塩を０．０１Ｍから飽和濃度、好
ましくは０．０２〜１．２Ｍ、およびエチレンジアミン
を０．０１〜２Ｍ、好ましくは０．０１５〜１Ｍを含有
するｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０の水性媒体
に対し、フマラーゼ等の副反応に関与する酵素活性を除
去したマレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物（菌
体）またはその処理物（すなわち、菌体破砕物、粗酵素
液、精製酵素液、固定化菌体、固定化酵素、等）、およ
びＥＤＤＳアーゼ活性を有する微生物（菌体）またはそ
の処理物（すなわち、菌体破砕物、粗酵素液、精製酵素
液、固定化菌体、固定化酵素、等）を各々０．０１〜５
重量％、好ましくは０．１〜２重量％添加し、さらに前
記の金属化合物を、生成する[S,S]-ＥＤＤＳの理論量に
対して、通常、金属として０．０１〜２倍モルを添加し
て、反応温度５〜６０℃、好ましくは１０〜５５℃で
０．５〜４８時間反応させることができる。
ン酸またはマレイン酸塩を０．０１Ｍから飽和濃度、好
ましくは０．０２〜１．２Ｍ、およびエチレンジアミン
を０．０１〜２Ｍ、好ましくは０．０１５〜１Ｍを含有
するｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０の水性媒体
に対し、フマラーゼ等の副反応に関与する酵素活性を除
去したマレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物（菌
体）またはその処理物（すなわち、菌体破砕物、粗酵素
液、精製酵素液、固定化菌体、固定化酵素、等）、およ
びＥＤＤＳアーゼ活性を有する微生物（菌体）またはそ
の処理物（すなわち、菌体破砕物、粗酵素液、精製酵素
液、固定化菌体、固定化酵素、等）を各々０．０１〜５
重量％、好ましくは０．１〜２重量％添加し、さらに前
記の金属化合物を、生成する[S,S]-ＥＤＤＳの理論量に
対して、通常、金属として０．０１〜２倍モルを添加し
て、反応温度５〜６０℃、好ましくは１０〜５５℃で
０．５〜４８時間反応させることができる。
反応終了液から[S,S]-ＥＤＤＳの金属錯体を回収する
場合には、所定の金属のイオンの存在下で反応を行った
後、ｐＨ調整、濃縮、その他の操作により目的化合物を
直接得ることができる。
場合には、所定の金属のイオンの存在下で反応を行った
後、ｐＨ調整、濃縮、その他の操作により目的化合物を
直接得ることができる。
一方、反応終了液から[S,S]-ＥＤＤＳを採取するに
は、通常、鉱酸による酸析が行われる。しかしながら、
鉄等の重金属のイオンの存在下に反応を行った場合のよ
うに、酸析のｐＨで安定な錯体を形成している系におい
ては、酸析以前に該金属のイオンを除去する操作が必要
である。したがって、[S,S]-ＥＤＤＳを必要とする場合
には、酸析に際し上記のような除去操作を省略できるマ
グネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属のイオン
の存在下に反応を行うことが効率的である。
は、通常、鉱酸による酸析が行われる。しかしながら、
鉄等の重金属のイオンの存在下に反応を行った場合のよ
うに、酸析のｐＨで安定な錯体を形成している系におい
ては、酸析以前に該金属のイオンを除去する操作が必要
である。したがって、[S,S]-ＥＤＤＳを必要とする場合
には、酸析に際し上記のような除去操作を省略できるマ
グネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属のイオン
の存在下に反応を行うことが効率的である。
次に、本発明を以下の実施例により具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
実施例
実施例１
（１）マレイン酸イソメラーゼ活性を有する微生物菌体
の調製 アルカリゲネス フェカリスIFO 12669、同IFO 1311
1、同IAM 1473、アルカリゲネス ユートロファスIAM 1
2305およびシュードモナス フルオレッセンスATCC 237
28株をマレイン酸を含む培地（１Ｌ当たり；マレイン酸
ナトリウム５ｇ、肉エキス１０ｇ、酵母エキス５ｇ、金
属塩混合物溶液５ｍｌ、５０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７．
０）１Ｌを用い３０℃、２〜３日間振とう培養した。菌
体を遠心分離（10,000rpm、20分）し、１Ｌの５０ｍＭ
燐酸緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した後、同緩衝液で１
００ｍｌの菌体懸濁液を調製した。金属塩混合物溶液は
以下の組成を有する。
の調製 アルカリゲネス フェカリスIFO 12669、同IFO 1311
1、同IAM 1473、アルカリゲネス ユートロファスIAM 1
2305およびシュードモナス フルオレッセンスATCC 237
28株をマレイン酸を含む培地（１Ｌ当たり；マレイン酸
ナトリウム５ｇ、肉エキス１０ｇ、酵母エキス５ｇ、金
属塩混合物溶液５ｍｌ、５０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７．
０）１Ｌを用い３０℃、２〜３日間振とう培養した。菌
体を遠心分離（10,000rpm、20分）し、１Ｌの５０ｍＭ
燐酸緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した後、同緩衝液で１
００ｍｌの菌体懸濁液を調製した。金属塩混合物溶液は
以下の組成を有する。
金属塩混合物溶液（１００ｍｌ当たり）：
塩化マグネシウム・６Ｈ2 Ｏ ８ｇ
塩化カルシウム ０．８ｇ
硫酸マンガン・６Ｈ2 Ｏ ０．６ｇ
塩化第二鉄・６Ｈ2 Ｏ ０．１２ｇ
硫酸亜鉛 ０．０６ｇ
（２）ＥＤＤＳアーゼ活性を有する微生物菌体の調製
ブレブンディモナスsp.TN-3を[S,S]-ＥＤＤＳを含む
培地（１Ｌ当たり；[S,S]-ＥＤＤＳ２ｇ、グルコース２
ｇ、酵母エキス１ｇ、ポリペプトン０．５ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７Ｈ2 Ｏ １ｇ、硫酸ナトリウム０．２８
ｇ、金属塩混合物溶液０．５ｍｌ、燐酸緩衝液２５ｍ
Ｍ、ｐＨ７．５）２Ｌを用いて３０℃、３日間振とう培
養した。菌体を遠心分離（10,000rpm、20分）し、５０
０ｍｌの１００ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ９．２）に懸濁
した後、４５℃の水浴中に４時間放置して熱処理を行っ
た。遠心分離（10,000rpm、20分）により集菌し、５０
０ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．５）で１回洗浄
した後、同緩衝液で１００ｍｌの菌体懸濁液を調製し
た。
培地（１Ｌ当たり；[S,S]-ＥＤＤＳ２ｇ、グルコース２
ｇ、酵母エキス１ｇ、ポリペプトン０．５ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７Ｈ2 Ｏ １ｇ、硫酸ナトリウム０．２８
ｇ、金属塩混合物溶液０．５ｍｌ、燐酸緩衝液２５ｍ
Ｍ、ｐＨ７．５）２Ｌを用いて３０℃、３日間振とう培
養した。菌体を遠心分離（10,000rpm、20分）し、５０
０ｍｌの１００ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ９．２）に懸濁
した後、４５℃の水浴中に４時間放置して熱処理を行っ
た。遠心分離（10,000rpm、20分）により集菌し、５０
０ｍｌの５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ８．５）で１回洗浄
した後、同緩衝液で１００ｍｌの菌体懸濁液を調製し
た。
（３）[S,S]-ＥＤＤＳ生産反応
３００ｍＭマレイン酸、１００ｍＭエチレンジアミ
ン、１５０ｍＭ水酸化マグネシウムを含む１００ｍｌの
基質溶液（ｐＨ８．５）に対し、マレイン酸イソメラー
ゼ活性を有する微生物の菌体懸濁液５ｍｌ、およびＥＤ
ＤＳリアーゼ活性を有する微生物の菌体懸濁液５ｍｌを
添加し、３５℃、１４〜２０日間、[S,S]-ＥＤＤＳの生
成が停止するまで反応を継続した。比較として、水酸化
マグネシウムを含まない基質溶液による同様の実験も行
った。
ン、１５０ｍＭ水酸化マグネシウムを含む１００ｍｌの
基質溶液（ｐＨ８．５）に対し、マレイン酸イソメラー
ゼ活性を有する微生物の菌体懸濁液５ｍｌ、およびＥＤ
ＤＳリアーゼ活性を有する微生物の菌体懸濁液５ｍｌを
添加し、３５℃、１４〜２０日間、[S,S]-ＥＤＤＳの生
成が停止するまで反応を継続した。比較として、水酸化
マグネシウムを含まない基質溶液による同様の実験も行
った。
なお、水酸化マグネシウム存在下での[S,S]-ＥＤＤＳ
生産反応は反応液のｐＨ低下を伴うので、水酸化ナトリ
ウムを使用しｐＨコントローラーによりｐＨ８．３〜
８．８に調節した。
生産反応は反応液のｐＨ低下を伴うので、水酸化ナトリ
ウムを使用しｐＨコントローラーによりｐＨ８．３〜
８．８に調節した。
（４）[S,S]-ＥＤＤＳの定量および光学純度の分析
反応終了液中の不溶物を15,000rpm、５℃、５分間の
遠心分離で除去した後、液体クロマトグラフィー〔カラ
ム；WAKOSIL 5C8（和光純薬）、溶出液；10mM水酸化テ
トラ−ｎ−ブチルアンモニウム、0.4mM CuSO4 、50mM
燐酸、pH2）で定量し、光学純度の分析も液体クロマト
グラフィー〔カラム；MCl GEL CRS 10W（三菱化学）、
溶出液；10mM硫酸銅〕により行った。また、金属錯塩の
定量は不溶物を除去した反応終了液に、終濃度１．５％
の水酸化ナトリウムを添加し室温に３０分放置後、遠心
分離で不溶性水酸化物を除去し、燐酸でｐＨ７．５とし
てから定量、および光学純度の分析を行った。
遠心分離で除去した後、液体クロマトグラフィー〔カラ
ム；WAKOSIL 5C8（和光純薬）、溶出液；10mM水酸化テ
トラ−ｎ−ブチルアンモニウム、0.4mM CuSO4 、50mM
燐酸、pH2）で定量し、光学純度の分析も液体クロマト
グラフィー〔カラム；MCl GEL CRS 10W（三菱化学）、
溶出液；10mM硫酸銅〕により行った。また、金属錯塩の
定量は不溶物を除去した反応終了液に、終濃度１．５％
の水酸化ナトリウムを添加し室温に３０分放置後、遠心
分離で不溶性水酸化物を除去し、燐酸でｐＨ７．５とし
てから定量、および光学純度の分析を行った。
（５）結果
¶[S,S]-ＥＤＤＳ生産量はアルカリ添加および燐酸
添加による反応液希釈分の補正値を示した。
実施例２
（１）微生物菌体の調製
実施例１と同様にマレイン酸イソメラーゼ含有微生物
であるAlcaligenes faecalis IFO 12669およびＥＤＤＳ
アーゼ活性を有する微生物であるバークホルデリアsp.K
K-5、パラコッカスsp.KK-6、ブレブンディモナスsp.TN-
3、スフィンゴモナスsp.TN-28、アシドボラックスsp.TN
-51およびシュードモナスsp.TN-131株を各々培養し菌体
懸濁液を調製した。
であるAlcaligenes faecalis IFO 12669およびＥＤＤＳ
アーゼ活性を有する微生物であるバークホルデリアsp.K
K-5、パラコッカスsp.KK-6、ブレブンディモナスsp.TN-
3、スフィンゴモナスsp.TN-28、アシドボラックスsp.TN
-51およびシュードモナスsp.TN-131株を各々培養し菌体
懸濁液を調製した。
（２）[S,S]-ＥＤＤＳ生産反応
実施例１と同様の基質溶液（３００ｍＭマレイン酸、
１００ｍＭエチレンジアミン、１５０ｍＭ水酸化マグネ
シウム、ｐＨ８．５）１００ｍｌに対し５ｍｌのマレイ
ン酸イソメラーゼ活性を有する微生物（IFO 12669）お
よび５ｍｌのＥＤＤＳアーゼ含有微生物（KK-5、KK-6、
TN-3、TN-28、TN-51またはTN-131）の懸濁液を添加し、
３５℃、１４〜２０日間、[S,S]-ＥＤＤＳの生成が停止
するまで反応を継続した。比較として、水酸化マグネシ
ウムを含まない基質溶液による同様の実験も行った。
１００ｍＭエチレンジアミン、１５０ｍＭ水酸化マグネ
シウム、ｐＨ８．５）１００ｍｌに対し５ｍｌのマレイ
ン酸イソメラーゼ活性を有する微生物（IFO 12669）お
よび５ｍｌのＥＤＤＳアーゼ含有微生物（KK-5、KK-6、
TN-3、TN-28、TN-51またはTN-131）の懸濁液を添加し、
３５℃、１４〜２０日間、[S,S]-ＥＤＤＳの生成が停止
するまで反応を継続した。比較として、水酸化マグネシ
ウムを含まない基質溶液による同様の実験も行った。
（３）[S,S]-ＥＤＤＳの定量および光学純度の分析
反応終了液中の不溶物を15,000rpm、５℃、５分間の
遠心分離で除去した後、液体クロマトグラフィー〔カラ
ム；WAKOSIL 5C8（和光純薬）、溶出液；10mM水酸化テ
トラ−ｎ−ブチルアンモニウム、0.4mM CuSO4 、50mM
燐酸、pH2）で定量し、光学純度の分析も液体クロマト
グラフィー〔カラム；MCI GEL CRS 10W（三菱化学）、
溶出液；10mM硫酸銅〕により行った。また、金属錯塩の
定量は不溶物を除去した反応終了液に、終濃度１．５％
の水酸化ナトリウムを添加し室温に３０分放置後、遠心
分離で不溶性水酸化物を除去し、燐酸でｐＨ７．５とし
てから定量、および光学純度の分析を行った。
遠心分離で除去した後、液体クロマトグラフィー〔カラ
ム；WAKOSIL 5C8（和光純薬）、溶出液；10mM水酸化テ
トラ−ｎ−ブチルアンモニウム、0.4mM CuSO4 、50mM
燐酸、pH2）で定量し、光学純度の分析も液体クロマト
グラフィー〔カラム；MCI GEL CRS 10W（三菱化学）、
溶出液；10mM硫酸銅〕により行った。また、金属錯塩の
定量は不溶物を除去した反応終了液に、終濃度１．５％
の水酸化ナトリウムを添加し室温に３０分放置後、遠心
分離で不溶性水酸化物を除去し、燐酸でｐＨ７．５とし
てから定量、および光学純度の分析を行った。
（４）結果
¶[S,S]-ＥＤＤＳ生成量はアルカリ添加および燐酸
添加による反応液希釈分の補正値を示した。
実施例３
（１）微生物菌体の調製
実施例１と同様にマレイン酸イソメラーゼ含有微生物
であるAlcaligenes faecalis IFO 12669およびＥＤＤＳ
アーゼ含有微生物であるブレブンディモナスsp.TN-3株
を各々培養し菌体懸濁液を調製した。
であるAlcaligenes faecalis IFO 12669およびＥＤＤＳ
アーゼ含有微生物であるブレブンディモナスsp.TN-3株
を各々培養し菌体懸濁液を調製した。
（２）[S,S]-ＥＤＤＳ生産反応
３００ｍＭマレイン酸、１００ｍＭエチレンジアミン
および１５０ｍＭ水酸化物（水酸化マグネシウム、水酸
化カルシウム、水酸化チタニウム、水酸化マンガン、水
酸化亜鉛、水酸化アルミニウムまたは水酸化第二鉄）を
含む１００ｍｌの基質溶液（ｐＨ８．５、本ｐＨでは水
酸化マグネシウム、水酸化カルシウムは可溶性、他の水
酸化物は不溶性である）に対し、IFO 12669の菌体懸濁
液５ｍｌおよびTN-3の菌体懸濁液５ｍｌを各々添加し、
３５℃、１４〜２０日間、[S,S]-ＥＤＤＳの生成が停止
するまで反応を継続した。比較として、水酸化物を含ま
ない基質溶液による同様の実験も行った。
および１５０ｍＭ水酸化物（水酸化マグネシウム、水酸
化カルシウム、水酸化チタニウム、水酸化マンガン、水
酸化亜鉛、水酸化アルミニウムまたは水酸化第二鉄）を
含む１００ｍｌの基質溶液（ｐＨ８．５、本ｐＨでは水
酸化マグネシウム、水酸化カルシウムは可溶性、他の水
酸化物は不溶性である）に対し、IFO 12669の菌体懸濁
液５ｍｌおよびTN-3の菌体懸濁液５ｍｌを各々添加し、
３５℃、１４〜２０日間、[S,S]-ＥＤＤＳの生成が停止
するまで反応を継続した。比較として、水酸化物を含ま
ない基質溶液による同様の実験も行った。
（３）[S,S]-ＥＤＤＳの定量および光学純度の分析
反応終了液中の不溶物を15,000rpm、５℃、５分間の
遠心分離で除去した後、液体クロマトグラフィー〔カラ
ム；WAKOSIL 5C8（和光純薬）、溶出液；10mM水酸化テ
トラ−ｎ−ブチルアンモニウム、0.4mM CuSO4 、50mM
燐酸、pH2で定量し、光学純度の分析も液体クロマトグ
ラフィー〔カラム；MCI GEL CRS 10W（三菱化学）、溶
出液；10mM硫酸銅〕により行った。また、金属錯塩の定
量は不溶物を除去した反応終了液に、終濃度１．５％の
水酸化ナトリウムを添加し室温に３０分放置後、遠心分
離で不溶性水酸化物を除去し、燐酸でｐＨ７．５として
から定量、および光学純度の分析を行った。
遠心分離で除去した後、液体クロマトグラフィー〔カラ
ム；WAKOSIL 5C8（和光純薬）、溶出液；10mM水酸化テ
トラ−ｎ−ブチルアンモニウム、0.4mM CuSO4 、50mM
燐酸、pH2で定量し、光学純度の分析も液体クロマトグ
ラフィー〔カラム；MCI GEL CRS 10W（三菱化学）、溶
出液；10mM硫酸銅〕により行った。また、金属錯塩の定
量は不溶物を除去した反応終了液に、終濃度１．５％の
水酸化ナトリウムを添加し室温に３０分放置後、遠心分
離で不溶性水酸化物を除去し、燐酸でｐＨ７．５として
から定量、および光学純度の分析を行った。
（４）結果
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出
願のその全体を参考として本明細書にとり入れるものと
する。また、本発明の思想および範囲を逸脱することな
く本発明は種々の変更および変形を含み得ることが当業
者には理解されるべきである。
願のその全体を参考として本明細書にとり入れるものと
する。また、本発明の思想および範囲を逸脱することな
く本発明は種々の変更および変形を含み得ることが当業
者には理解されるべきである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:07 Ｃ１２Ｒ 1:01
1:01） 1:38
(Ｃ１２Ｐ 13/02
Ｃ１２Ｒ 1:38
1:01）
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１８
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１２
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１３
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６１６１
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−６５４８
前置審査
(72)発明者 遠藤 隆一
日本国神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番
１号 三菱レイヨン株式会社 化学品開
発研究所内
(56)参考文献 特開 平９−289895（ＪＰ，Ａ)
特開 平８−51989（ＪＰ，Ａ)
欧州特許出願公開805211（ＥＰ，Ａ
１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12P 13/00 - 13/24
Claims (9)
- 【請求項１】 アルカリ土類金属、鉄、亜鉛、銅、ニッ
ケル、アルミニウム、チタニウムおよびマンガンからな
る群から選ばれる少なくとも一種の金属イオンの存在
下、マレイン酸、無水マレイン酸またはマレイン酸塩と
エチレンジアミンとを含有する基質溶液に、マレイン酸
イソメラーゼ活性を有する微生物またはその処理物とエ
チレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸エチレンジアミ
ンリアーゼ活性を有する微生物またはその処理物とを作
用せしめ、［Ｓ，Ｓ］−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−
ジコハク酸を得ることを特徴とする［Ｓ，Ｓ］−エチレ
ンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。 - 【請求項２】 前記マレイン酸イソメラーゼ活性を有す
る微生物またはその処理物が、アルカリゲネス（Ａｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎ
ａｓ）属およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属す
る微生物、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）
属およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生
物に由来するマレイン酸イソメラーゼ遺伝子を組換えた
遺伝子操作微生物、ならびにそれらの微生物の処理物か
らなる群から選択される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコ
ハク酸エチレンジアミンリアーゼ活性を有する微生物ま
たはその処理物が、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎ
ｄｉｍｏｎａｓ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃ
ｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａ
ｓ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）
属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属およ
びバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属に
属する微生物、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉ
ｍｏｎａｓ）属に属する微生物に由来するＥＤＤＳアー
ゼ遺伝子を組換えた遺伝子操作微生物、ならびにそれら
の微生物の処理物からなる群から選択される、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項４】 前記処理物が、菌体破砕物、粗酵素液、
精製酵素液、固定化菌体および固定化酵素からなる群か
ら選択される請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記マレイン酸、無水マレイン酸または
マレイン酸塩の濃度が、０．０１Ｍから飽和濃度までの
範囲である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 前記エチレンジアミンの濃度が、０．０
１から２Ｍまでの範囲である、請求項１〜４のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項７】 前記金属イオンが、金属化合物を生成す
る［Ｓ，Ｓ］−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク
酸の理論量に対して０．０１〜２倍モル添加される、請
求項１〜４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 反応がｐＨ４〜１１の水性媒体中で行な
われる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 反応温度が５〜６０℃である、請求項１
〜４のいずれかに記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36479897 | 1997-12-22 | ||
| JP9-364798 | 1997-12-22 | ||
| PCT/JP1998/005826 WO1999032650A1 (fr) | 1997-12-22 | 1998-12-22 | Procede de production de [s,s]-ethylenediamine-n,n'-acide disuccinique |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3526443B2 true JP3526443B2 (ja) | 2004-05-17 |
Family
ID=18482692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000525567A Expired - Lifetime JP3526443B2 (ja) | 1997-12-22 | 1998-12-22 | ［ｓ，ｓ］−エチレンジアミン−ｎ，ｎ’−ジコハク酸の製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6261798B1 (ja) |
| EP (1) | EP1043400B1 (ja) |
| JP (1) | JP3526443B2 (ja) |
| DE (1) | DE69835903T2 (ja) |
| WO (1) | WO1999032650A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE60038371T2 (de) * | 1999-04-27 | 2009-04-23 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Verfahren zur herstellung von s,s-2-hydroxypropylendiamin-n,n'-dibernsteinsäure |
| US7674611B2 (en) | 2004-05-20 | 2010-03-09 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd | Modified ethylenediamine-N, N′-disuccinate: ethylenediamine lyase |
| DE102013217543B4 (de) | 2013-09-03 | 2017-07-06 | Eberhard Karls Universität Tübingen | [S,S]-EDDS Biosynthesegene und -proteine und Verfahren zur Biosynthese von [S,S]-EDDS |
| CN111454934B (zh) * | 2020-04-10 | 2021-11-30 | 台州学院 | 一种edds裂合酶固定化酶的制备方法和应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPH0851989A (ja) * | 1994-08-12 | 1996-02-27 | Mitsubishi Chem Corp | マレイン酸の異性化方法 |
| JP3204903B2 (ja) * | 1995-03-10 | 2001-09-04 | 三菱レイヨン株式会社 | 光学活性アミノ酸の製造法 |
| US5707836A (en) * | 1995-03-10 | 1998-01-13 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Production of alkylene or phenylenediamine disuccinic acid from fumaric acid and a diamine using lyase from microbes |
| JPH09289895A (ja) * | 1996-04-25 | 1997-11-11 | Nitto Chem Ind Co Ltd | 光学活性アミノ酸の製造法 |
| EP0805211B1 (en) * | 1996-04-30 | 2002-10-02 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Process for producing optically active aminopolycarboxylic acid |
| US5939296A (en) * | 1996-08-09 | 1999-08-17 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Process for producing L-aspartic acid |
| JPH10259170A (ja) * | 1997-03-17 | 1998-09-29 | Nitto Chem Ind Co Ltd | アミノポリカルボン酸の製造方法 |
| DE69820975T2 (de) * | 1997-10-28 | 2005-01-27 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Verfahren zum Entfernen von Fumarase Aktivität, durch diese Verfahren erhältliche Mikroorganismen und Herstellung von optisch aktiven Aminopolycarbonsäuren mit diesen Mikroorganismen |
-
1998
- 1998-12-22 US US09/582,171 patent/US6261798B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-22 JP JP2000525567A patent/JP3526443B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-22 DE DE69835903T patent/DE69835903T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-22 WO PCT/JP1998/005826 patent/WO1999032650A1/ja active IP Right Grant
- 1998-12-22 EP EP98961492A patent/EP1043400B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69835903T2 (de) | 2007-04-05 |
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