DE69820975T2

DE69820975T2 - Verfahren zum Entfernen von Fumarase Aktivität, durch diese Verfahren erhältliche Mikroorganismen und Herstellung von optisch aktiven Aminopolycarbonsäuren mit diesen Mikroorganismen

Info

Publication number: DE69820975T2
Application number: DE69820975T
Authority: DE
Inventors: Mami Yokohama-shi Kato; Makoto Yokohama-shi Kaneko; Takakazu Yokohama-shi Endo
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 1997-10-28
Filing date: 1998-10-28
Publication date: 2005-01-27
Anticipated expiration: 2018-10-29
Also published as: EP0927762A3; EP0927762B1; EP0927762A2; US6103508A; DE69820975D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung der Fumaraseaktivität aus einem Mikroorganismus mit einer Aktivität für eine Ethylendiamin-N,N'dibernsteinsäure-ethylendiaminlyase; einen Mikroorganismus oder ein Verarbeitungsprodukt eines spezifischen Transformanden mit reduzierter Fumaraseaktivität, erhältlich durch das Verfahren und ein Verfahren zur Erzeugung einer optisch aktiven Aminopolycarbonsäure aus Fumarsäure und einer Verbindung mit einer Aminogruppe in Gegenwart des Mikroorganismus oder dessen Verarbeitungsprodukt mit reduzierter Fumaraseaktivität.
Hintergrund der Erfindung
Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure-ethylendiaminlyase wurde als Katalysator zur Erzeugung einer optisch aktiven Aminopolycarbonsäure aus Fumarsäure und einer Verbindung mit einer Aminogruppe verwendet. Die so erzeugte optisch aktive Aminopolycarbonsäure hat eine spezifische Eigenschaft eines Einfangens von Metallionen, wie z. B. Schwermetallionen. Außerdem ist die optisch aktive Aminopolycarbonsäure gegenüber einem Bioabbau empfänglich und es wird daher erwartet, dass sie z. B. als Chelatbildner, als Gerüststoff für Detergentien und als Bleichmittel für Photographien verwendet werden kann.
Die gegenwärtigen Erfinder haben früher eine neue mikrobielle Lyaseaktivität gefunden, die Fumarsäure und Ethylendiamin in S,S-Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure (hiernach bezeichnet als Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure-ethylendiaminlyase und als EDDSase abgekürzt) umwandelt und ein Verfahren zur Erzeugung von optisch aktiven Aminopolycarbonsäuren in effizienter Weise aus Fumarsäure und unterschiedlichen Aminen unter Verwendung der oben beschriebenen katalytischen Wirkung vorgeschlagen (siehe JP-A-9-140390 oder das US-Patent Nr. 5707836). Die Mikroorganismen, die eine solche EDDSase besitzen, weisen jedoch auch eine Fumarase auf, wobei diese Fumarase in der biologischen Welt weit verbreitet vorliegt und ein Grossteil der Fumarsäure, d. h. eines gemeinsamen Substrats der EDDSase und Fumarase, zu Äpfelsäure hydratisieren kann. Wenn die Fumaraseaktivität nicht aus den Mikroorganismen entfernt ist, ist es schwierig, eine optisch aktive Aminopolycarbonsäure von Interesse mit zufriedenstellendem Ertrag zu erhalten.
Beispiele für bekannte Verfahren zur Entfernung der Fumaraseaktivität sind: ein Verfahren, bei dem ein Mikroorganismus mit Aspartaseaktivität einer Säurebehandlung unterzogen wird (siehe JP-B-3-55103); und ein Verfahren, bei dem ein Mikroorganismus, der zur Gattung Brevibacterium gehört, mit einer Aspartaseaktivität, unter alkalischen Bedingungen in Gegenwart von L-Asparaginsäure und einem Ammoniumion behandelt wird (siehe JP-B-4-80678).
Es wurde jedoch experimentell bestätigt, dass das erstere Verfahren nicht auf einen Mikroorganismus mit einer EDDSase-Aktivität verwendet werden kann, da der Verlust der EDDSase-Aktivität größer war als der Verlust der Fumaraseaktivität während der Behandlung. Das letztere Verfahren ist vorteilhaft, wenn es für die Herstellung von L-Asparaginsäure verwendet wird, wobei der zu behandelnde Mikroorganismus dem Reaktionssystem zugeführt wird, das eine große Menge L-Asparaginsäure enthält, jedoch ist das Verfahren im Hinblick auf eine Ausführbarkeit und ökonomische Gesichtspunkte zur Verwendung bei anderen Reaktionen nicht geeignet.
Da die EDDsase gemäß der vgrliegenden Erfindung ein anderes Enzym als die oben beschriebene Aspartase ist, war es unbekannt, wie die Fumaraseaktivität allein ohne Verlust der EDDSase-Aktivität selektiv entfernt werden kann.
Aus der EP 0 731 171 ist ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven Aminopolycarbonsäureverbindung bekannt, wobei eine Mischung einer Aminogruppenverbindung und Fumarsäure mit einem Mikroorganismus oder Verarbeitungsprodukten davon mit EDDSase-Aktivität kontaktiert wird.
Aus der EP 0 805 211 , die ein Dokument gemäß Artikel 54 (3) EPÜ darstellt, ist ein Verfahren zur Entfernung der Fumaraseaktivität aus einem Zellextrakt durch Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von DEAE-Sephacel und die Verwendung des Extrakts für die Produktion von optisch aktiver Aminopo Lycarbonsäure bekannt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Entfernung der Fumaraseaktivität aus einem Mikroorganismus oder einem Verarbeitungsprodukt davon mit Ethylendiamin-N,N'dibernsteinsäure-ethylendiaminlyase (EDDSase)-Aktivität bereit, ohne Verlust der EDDSase-Aktivität, das die Behandlung des Mikroorganismus oder des Verarbeitungsprodukts davon mit einer wässrigen alkalischen Lösung bei einem pH von 8,0 von 10,5 in Gegenwart von mindestens einem Salz mit einer Konzentration von 5 mM bis 1000 mM umfasst.
Bevorzugte Salze werden aus der Gruppe gewählt, bestehend aus Natrium, Kalium, Ammonium und Aminsalzen der Borsäure, Phosphorsäure, Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Ethylendiamin-N,N'dibernsteinsäure und Mischungen daraus.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Fumaraseaktivität allein aus einem Mikroorganismus mit EDDSase und Fumaraseaktivitäten oder Verarbeitungsprodukten davon ohne Verlust der EDDSase-Aktivität selektiv zu entfernen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Mikroorganismus oder ein Verarbeitungsprodukt eines Transformanden bereit, wobei eine DNA, die ein EDDSase kodiert, in ein Wirtsbakterium eingeführt wurde, das zur Gattung Escherichia oder Rhodococcus mit EDDSase-Aktivität gehört, enthaltend keine Fumaraseaktivität, der durch das oben beschriebene Verfahren erhältlich ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren für die Erzeugung einer optisch aktiven Aminopolycarbonsäure bereit, das die Umsetzung von Fumarsäure mit einer Verbindung mit einer Aminogruppe in Gegenwart eines Mikroorganismus oder Verarbeitungsprodukts davon mit EDDSase-Aktivität umfasst, enthaltend reduzierte Fumaraseaktivität und Isolieren der optisch aktiven Aminopolycarbonsäure.
Die Bezeichnung "reduziert" bedeutet, dass die Fumaraseaktivität vermindert ist oder nicht wesentlich enthalten ist.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Verwendung des Mikroorganismus oder Verarbeitungsprodukts davon bei der Herstellung einer optisch aktiven Aminopolycarbonsäure aus Fumarsäure und einer Verbindung mit einer Aminogruppe bereit.
Diese und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden sich dem Fachmann bei Durchsicht und Verständnis der folgenden detaillierten Beschreibung mit Bezugnahme auf die begleitenden Figuren ergeben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pEDS001.
2 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pEDS002, worin ein ungefähr 3,9 kb Fragment, gespalten aus dem Plasmid pEDS001 mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI in pUC18 inseriert wurde.
3 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pEDS003, worin ein ungefähr 2,6 kb Fragment, gespalten aus dem pEDS001 mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI in pUC18 inseriert wurde.
4 ist eine Restriktionskarte des Plasmids pEDS020, worin ein ungefähr 2,6 kb Fragment, gespalten aus dem pEDS003 mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI in pUC119 inseriert wurde.
5 zeigt die Konstruktion des Plasmids pSE001.
6 zeigt die Konstruktion des Plasmids pSJ034.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Durch ausgedehnte Studien haben die vorliegenden Erfinder nun festgestellt, dass die Fumaraseaktivität selektiv aus einem Mikroorganismus oder Verarbeitungsprodukt davon mit EDDSase-Aktivität ohne Verlust der EDDSase-Aktivität entfernt werden kann durch Behandlung des Mikroorganismus oder Verarbeitungsprodukts davon mit einer wässrigen alkalischen Lösung in Gegenwart von mindestens einem Salz.
Die vorliegende Erfindung zielt auf den Erhalt eines mikrobiellen Katalysators ab, worin die Fumaraseaktivität selektiv entfernt wurde, während die EDDSase-Aktivität erhalten blieb, um unerwünschte Nebenreaktionen während der Erzeugung von optisch aktiven Aminopolycarbonsäuren zu unterdrücken.
Die vorliegende Erfindung kann ihre Vorteile bei der Produktion jeder optisch aktiven Aminopolycarbonsäure bereitstellen, solange der mikrobielle Katalysator zusammen mit Fumarsäure als Rohmaterial verwendet wird.
Ein spezifisches Beispiel, auf das die vorliegende Erfindung angewendet werden kann, ist die Herstellung einer optisch aktiven Aminopolycarbonsäure, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel [1] aus einer Mischung aus Fumarsäure und einer Verbindung mit einer Aminogruppe, dargestellt durch die allgemeine Formel [2]
worin R₁ und R₂, die identisch oder unterschiedlich voneinander sein können, ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Cycloalkylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe bedeuten, mit der Massgabe, dass R₁ und R₂ nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind; wobei der Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Aminogruppe, einer Cyanogruppe, einer Nitrogruppe, Halogen, einer Hydroxylgruppe, einer Carboxylgruppe, einer Ethergruppe und dergleichen, und worin R₃ und R₄ identisch mit R₁ oder R₂ sind oder eine Gruppe darstellen, die die Struktur aufweist, bei der mindestens eine Aminogruppe von R₁ oder R₂ an einen Kohlenstoff der Ethylengruppe von Bernsteinsäure über ein Stickstoffatom der Aminogruppe gebunden ist.
Beispiele der Verbindungen mit einer Aminosäuregruppe, dargestellt durch die allgemeine Formel [2], beinhalten Alkan- und Cycloalkan-diamine mit einer Kohlenstoffzahl von 2 bis 6, wie z. B. Ethylendiamin, 1,3-Propandiamin, 2-Methyl-1,3-propandiamin, 2-Hydroxy-1,3-propandiamin, 1,4-Butandiamin, 1,5-Pentandiamin, 1,6-Hexandiamin, 1,2-Cyclohexandiamin, 1,3-Cyclohexandiamin und 1,4-Cyclohexandiamin; Phenylendiamine wie z. B. 1,2-Phenylendiamin, 1,3-Phenylendiamin und 1,4-Phenylendiamin; und Monoamine wie z. B. Glycin, 3-Aminopropionsäure, 2-Aminopropionsäure, Iminodiessigsäure, 3,3'-Iminodipropionsäure und Glutaminsäure. Die repräsentative Verbindung ist Ethylendiamin.
Beispiele für die optisch aktive Aminopolycarbonsäure, dargestellt durch die allgemeine Formel [1], die durch die vorliegende Erfindung erhalten werden kann, beinhalten (S,S)-Alkandiamin-N,N'-dibernsteinsäuren, (S,S)-Cycloalkandiamin-N,N'-dibernsteinsäuren und (S,S)-Phenylendiamin-N,N'-dibernsteinsäuren, wie z. B. (S,S)-Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure, (S,S)-1,3-Propandiamin-N,N'-dibernsteinsäure, (S,S)-2-Methyl-1,3-propandiamin-N,N'-dibernsteinsäure, (S,S)-2-Hydroxy-l,3-propandiamin-N,N'-dibernsteinsäure, (S, S)-1,4-Butandiamin-N,N'-dibernsteinsäure, (S,S)-1,5-Pentandiamin-N,N'dibernsteinsäure, (S, S)-1,6-Hexandiamin-N,N'dibernsteinsäure, (S,S)-1,2-Cyclohexandiamin-N,N'dibernsteinsäure, (S, S)-1,3-Cyclohexandiamin-N,N'dibernsteinsäure, (S,S)-1,4-Cyclohexandiamin-N,N'dibernsteinsäure, (S,S)-1,2-Phenylendiamin-dibernsteinsäure, (S,S)-1,3-Phenylendiamin-dibernsteinsäure und (S,S)-1,4-Phenylendiamin-dibernsteinsäure; und (S)-Asparaginsäure-N-monoessigsäure, (S)-Asparaginsäure-Nmonopropionsäure, (S)-Asparaginsäure-N-2-propionsäure, (S)-Asparaginsäure-N,N'-diessigsäure, (S)-Asparaginsäure-N,N'-dipropionsäure und (S)-Asparaginsäure-N-2-glutarsäure.
Die typische optisch aktive Aminopolycarbonsäure ist (S,S)-Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure.
Die Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität gemäß der vorliegenden Erfindung wird für Mikroorganismen durchgeführt, die später genauer beschrieben werden und ist auf mikrobielle Zellen oder Verarbeitungsprodukte davon anwendbar (z. B. Abfall von Zellen, Zellextrakte, extrahierte rohe oder gereinigte Enzyme, immobilisierte Zellen oder Enzyme oder Zellen oder Enzyme, die mit einem Mittel (z. B. für die Stabilisierung)) behandelt wurden. Die vorliegende Erfindung kann auch direkt auf mikrobielle Zellen in einer Kulturflüssigkeit, folgend auf die Kultivierung angewandt werden. Weiterhin können gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität optional andere Behandlungen folgen.
Die Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität kann durch Eintauchen der oben beschriebenen Mikroorganismen oder Verarbeitungsprodukte davon in eine wässrige alkalische Lösung in Gegenwart von mindestens einem Salz durchgeführt werden. Die wässrige alkalische Lösung kann ein organisches Lösungsmittel wie z. B. Methanol oder Ethanol, das mit Wasser frei mischbar ist oder ein anderes organisches Lösungsmittel, das mit Wasser mischbar ist, enthalten.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendbare Salz kann entweder organisch oder anorganisch sein, solange es in der wässrigen alkalischen Lösung gelöst werden kann. Zum Beispiel beinhaltet das Salz Natrium, Kalium, Ammonium oder Aminsalze von Borsäure, Phosphorsäure, Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure. Das bevorzugte Amin ist ein C_2-6-Alkandiamin, wie z. B. Ethylendiamin, Propandiamin, Butandiamin und Hexandiamin oder Monoamine, wie z. B. Triethanolamin.
Die Konzentration des Salzes liegt im Bereich von 5 mM bis 1000 mM, vorzugsweise 10 mM bis 500 mM. Das Ergebnis ist unzureichend bei einer Konzentration von weniger als 5 mM und der Ertrag erreicht die oberste Grenze bei einer Konzentration von mehr als 1000 mM.
Die wässrige alkalische Lösung hat einen pH im Bereich von 8 bis 10,5, vorzugsweise 8,5 bis 10, noch bevorzugter 9 bis 9,5. Der pH kann durch Variation des Anteils der oben erwähnten Säuren und Basen eingestellt werden. Insbesondere wird vorzugsweise Borsäure, Phosphorsäure oder Good's Puffer im Hinblick auf die Salzkonzentration und die pH-Einstellung verwendet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Behandlung bei einer Temperatur im Bereich der Gefriertemperatur bis 55°C über eine Zeitspanne von ungefähr 1 min bis ungefähr 1 Monat, abhängig von den Bedingungen, durchgeführt werden. Je höher die Behandlungstemperatur eingestellt wird, desto kürzer kann die Behandlungszeitspanne sein. Alternativ kann die Fumaraseaktivität während der Lagerung in einem Kühlschrank unter den oben beschriebenen Bedingungen entfernt werden, obwohl die Behandlungszeitspanne in diesem Fall verlängert ist.
Die oben beschriebene Behandlung kann entweder in einem chargenweisen Verfahren oder einem kontinuierlichen Verfahren durchgeführt werden.
Jeder Mikroorganismus kann der vorliegenden Erfindung unterzogen werden, solange der Mikroorganismus EDDSase und Fumaraseaktivitäten aufweist. Solche Mikroorganismen beinhalten z. B. Bakterien, die zu den Gattungen Pseudomonas, Paracoccus, Sphingomonas und Brevundimonas gehören und Transformanden, worin eine DNA, die eine EDDSase kodiert, in ein Wirtsbakterium eingeführt wurde, das zur Gattung Escherichia oder Rhodococcus gehört.
Insbesondere sind die Mikroorganismen Pseudomonas sp. Stamm TN-131 (FERM BP-5418), Paracoccus sp. Stamm TNO-5 (FERM BP-6547), Sphingomonas sp. Stamm TN-28 (FERM BP-5419), Brevundimonas sp. Stamm TN-30 (FERM BP-5417) und Brevundimonas sp. Stamm TN-3 (FERM BP-5886) und Transformanden, abgeleitet von den Wirten Escherichia coli Stamm JM109 (ATCC53323) und Rhodococcus rhodochrous ATCC17895.

Unter den oben beschriebenen beispielhaften Mikroorganismen wurden die Stämme TN-131, TNO-5, TN-28, TN-30 und TN-3 aus der Natur von den gegenwärtigen Erfindern neu isoliert und wurden bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology of MITI (Ministry of International Trade and Industry) (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan) hinterlegt, wobei ihnen die oben angegebenen Zugangsnummern zugeteilt wurden. Die bakteriologischen Eigenschaften dieser Stämme sind die folgenden: Stamm TN-131

Morphologie:	Bacillus
Gramfärbung:	–
Sporen:	–
Motilität:	+
Flagellenbildung:	polar
Verhalten gegenüber Sauerstoff:	aerob
Oxidase:	+
Catalase:	+
O-F-Test:	–
Farbton der Kolonien:	gelb
Produktion von fluoreszierendem Pigment:	+
Chinonsystem:	Q-9
Nitratreduktion:	+
Indolproduktion:	–
Glucose-Fermentationsfähigkeit:	–

Arginindihydrolase:	–
Harnstoffabbau:	–
Äsculinabbau:	–
Gelatineverflüssigung:	–
PNPG:	–

Verwertung von:

Glucose	–
L-Arabinose	–
D-Mannose	–
D-Mannit	–
N-Acetyl-D-glucosamin	–
Maltose	–
Kaliumgluconat	–
n-Caprinsäure	+
Adipinsäure	–
d1-Äpfelsäure	+
Zitronensäure	+
Phenylacetat	–

Stamm TNO-5

Morphologie:	Coccobacillus-kurzes Stäbchen
Gramfärbung:	–
Sporen:	–
Motilität:	–
Verhalten gegenüber Sauerstoff:	aerob
Oxidase:	+
Catalase:
	+
O-F-Test:	–
Farbton der Kolonien:	keine charakteristische Farbbildung
PHB-Anhäufung:	+
Nitratreduktion:	–
Nitritreduktion:	–
Chinonsystem:	Q-10
GF-Gehalt der DNA (molk)	65 (gemessen durch HPLC)

Stamm TN-28

Morphologie:	Bacillus
Gramfärbung:	–
Sporen:	–
Motilität:	+
Flagellenbildung:	polar
Verhalten gegenüber Sauerstoff:	aerob
Oxidase:	+
Catalase:	+
O-F-Test:	–
Farbton der Kolonien:	gelb
Erzeugung von fluoreszierendem Pigment:	–
Chinonsystem:	Q-10
Nitratreduktion:	–
Indolproduktion:	–
Glucose-Fermentationsfähigkeit:	–
Arginindihydrolase:	–
Harnstoffabbau:	–
Äsculinabbau:	+
Gelatineverflüssigung:	–
PNPG:	–
Verwertung von:
Glucose	+
L-Arabinose	–
D-Mannose	+
D-Mannit	–
N-Acetyl-D-glucosamin	+
Maltose	+
Kaliumgluconat	–
n-Caprinsäure	–
Adipinsäure	–
d1-Äpfelsäure	+
Zitronensäure	–
Phenylacetat	–

Im Hinblick auf die oben aufgeführten bakteriologischen Eigenschaften gehört der Stamm TN-131 zur Gattung Pseudomonas, wenn er gemäß Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 1 (1984) und Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9. Ausgabe (1994) klassifiziert wird; Der Stamm TNO-5 gehört zur Gattung Paracoccus, wenn er gemäß Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 1 (1984) klassifiziert wird; der Stamm TN-28 gehört zur Gattung Sphingomonas, wenn er gemäß Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9. Ausgabe (1994) und Microbiol. Immunol. 34, 99 (1990) klassifiziert wird und die Stämme TN-30 und TN-3 gehören beide zur Gattung Brevundimonas, wenn sie gemäß Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9. Ausgabe (1994) bzw. Int. J. Syst. Bacteriol. 44, 499 (1994) klassifiziert werden. Zusätzlich wurde der Stamm TN-3 als Art "diminuta" identifiziert.
Der E. coli Stamm JM109 (ATCC53323) und Rhodococcus rhodochrous ATCC17895 sind bekannt und von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich. Zwei Transformanden werden durch Einführung der Plasmide pEDS020 und pSE001 in den oben beschriebenen E. coli Stamm JM109 (ATCC53323) bzw. Rhodococcus rhodochrous Stamm ATCC17895 als Wirte erhalten, wobei die Plasmide jeweils eine DNA enthalten, die ein Protein mit EDDSase-Aktivität des Stamms TN-3 kodiert. Die so erhaltenen Transformanden wurden bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology of MITI (Japan) als E. coli JM109/pEDS020 (FERM P-15961) am 27. November 1996, wobei dies darauffolgend als internationale Hinterlegung als FERM BP-6161 am 10. November 1997 übertragen wurde und Rhodococcus rhodochrous ATCC 17895/pSE001 (FERM P-16436) am 18. September 1997, das darauffolgend in die internationale Hinterlegung als FERM BP-6548 am 15. Oktober 1998 übertragen wurde.
Hiernach wird ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Transformanden beschrieben.
(1) Herstellung chromosomaler DNA vom Stamm TN-3
Der Stamm TN-3 wird einer Schüttelkultur in 100 ml EDDS-Medium (0,2 % Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure, 0,2 % Glucose, 0,1 % Bactohefeextrakt, 0,05 % Polypepton, 0,28 % Natriumsulfat, 0,1 % Magnesiumsulfat•7H₂O, 2,5 % (V/V) Phosphatpuffer (1M, pH 7,0) und 0,5 % (V/V) Lösung von gemischten Metallsalzen (enthaltend 8 g Magnesiumchlorid•6H₂O, 0,8 g Calciumchlorid, 0,6 g Mangansulfat•4H₂O, 0,12 g Eisenchlorid•6H₂O und 0,06 g Zinksulfat pro 100 ml) bei 30°C für 4 Tage unterzogen. Dann werden Zellen geerntet und in 4 ml einer Salz-EDTA-Lösung suspendiert (0,1 M EDTA, 15 M NaCl, pH 8,0), gefolgt von Zugabe von 8 mg Lysozym. Die resultierende Suspension wird bei 37°C 1 h geschüttelt und dann eingefroren. 10 ml einer Tris-SDS-Lösung (1 % SDS, 0,1 M NaCl, 0,1 m Tris, pH 9) wird vorsichtig unter Schütteln zugefügt. Proteinase K (Merck & Co., Inc.) wird weiter zugefügt (endgültige Konzentration: 1 mg) und das Resultat wird 1 h bei 37°C geschüttelt. Ein entsprechendes Volumen TE-gesättigter Phenol (TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8) wird hinzugefügt und gerührt. Nach einer Zentrifugation wird der Überstand wiedergewonnen, wozu zwei Volumen Ethanol zugefügt werden. Die DNA wird um ein Glasstäbchen aufgerollt und der Phenol wird daraus durch sequentielles Waschen mit 90 %, 80 % und 70 % Ethanol entfernt. Die DNA wird in 3 ml TE-Puffer gelöst, wozu eine Ribonuklease A-Lösung (wärmebehandelt bei 100°C für 15 Minuten) mit einer Konzentration von 10 mg/ml zugefügt wurde, gefolgt von Schütteln bei 37°C für 30 min. Die Proteinase K wurde weiter der Lösung zugefügt und die Mischung wird bei 37°C 30 Minuten geschüttelt. Dann wird ein gleiches Volumen TE-gesättigter Phenol zugefügt und zentrifugiert, um die Mischung in obere und untere Schichten zu trennen. Dasselbe Verfahren wird zweimal mit der oberen Schicht wiederholt. Zu der resultierenden Oberschicht wird ein gleiches Volumen einer Chloroformlösung, enthaltend 4 % Isoamylalkohol zugefügt und dieselbe Extraktion wird wiederholt (hiernach wird dieses Verfahren als Phenolbehandlung bezeichnet). Danach werden zwei Volumen Ethanol der oberen Schicht zugefügt, um die DNA durch Aufwickeln um ein Glasstäbchen zu gewinnen, wodurch eine chromosomale DNR-Probe erhalten wird.
(2) Herstellung eines gereinigten Enzyms
Der Stamm TN-3 wird einer Schüttelkultur in 2 l EDDS-Medium bei 30°C für 4 Tage unterzogen, geerntet, in 100 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8, enthaltend 1 mM Dithiothreitol) suspendiert und in einem Ultraschallgerät aufgebrochen. Nach Zentrifugation bei 12.000 Upm für 20 min wird dem Überstand Ammoniumsulfat bis zu 30%iger Sättigung zugefügt und die Mischung wird 30 Minuten bei 4°C gelassen, gefolgt von Zentrifugation. Zu dem resultierenden Überstand wird Ammoniumsulfat zum Erhalt einer 60%igen Sättigung zugefügt und 30 min bei 4°C stehen gelassen. Nach einer Zentrifugation wird das Präzipitat in 10 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8, enthaltend 1 mM Dithiothreitol) gelöst, um eine Lösung eines teilweise gereinigten Enzyms herzustellen.
Diese teilweise gereinigte Enzymlösung wird weiter durch Innenaustausch-Chromatographie gereinigt. Spezifisch wird die teilweise gereinigte Enzymlösung auf eine Säule aufgebracht (⌀ 10 mm × 20 cm) gefüllt mit DEAE-Sephacryl (Pharmacia), äquilibriert mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8), enthaltend 1 mM Dithiothreitol, um eine Harzoption zu ermöglichen. Nach Waschen der Säule mit 40 ml desselben Puffers wird das Enzym mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,6 M KCl zur Fraktionierung in 2 ml Fraktionen eluiert. Fraktionen, die eine EDDSase-Aktivität zeigen, werden als Lösung des gereinigten Enzyms gesammelt. Wenn mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert wird, wird eine im wesentlichen homogene, einzelne Bande des Enzyms bei einem Molekulargewicht von ungefähr 60.000 Dalton nachgewiesen.
(3) Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz und Aminosäuresequenz des inneren Peptids des gereinigten Enzyms
Das in Schritt (2) erhaltene gereinigte Enzym wird einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese direkt oder nach einem Trypsinverdau unterzogen, wodurch die Polypeptide aufgelöst werden. Die Polypeptide auf dem Gel werden dann auf eine PVDF-Membran (Immobilon Psq; Millipore) elektrogeblottet. Die Membran ist mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt. Die gefärbten Banden werden ausgeschnitten und einer Aminosäuresequenzanalyse unter Verwendung eines Shimadzu PSQ.-Aminosäuresequenzierers unterzogen. Die Ergebnisse sind unten dargestellt.

a) N-terminale Aminosäuresequenz des nicht behandelten Enzyms: (Molekulargewicht: ungefähr 60.000); Xaa-Thr-Pro-His-Asn-Pro-Asp-Ala (SEQ ID NO: 6) worin Xaa Met oder eine Deletion bedeutet.
b) Teilweise Trypsin-verdautes Produkt (Molekulargewicht: ungefähr 50.000); Glu-Ile-Gly-Ser-Val-Gly-Lys-Met-Glu-Ile-Gly-Arg-Xaa-Ala-Asn-Asp-Leu-Arg-Asn-Arg (SEQ ID NO:7) worin Xaa einen nicht identifizierten Aminosäurerest bedeutet.
c) Teilweise Trypsin-verdautes Produkt (Molekulargewicht: ungefähr 10.000); Ala-Ser-Gly-Ala-Lys-Ala-Pro-Glu-Phe-Gln-Glu-Leu-Tyr-Asp-Phe-Glu-Ala-Ala-Xaa-Leu-Xaa-Leu (SEQ ID NO: 8) worin Xaa einen nicht identifizierten Aminosäurerest bedeutet.

(4) Herstellung einer Sonde
Basierend auf der in Schritt 3 erhaltenen Aminosäuresequenzinformation werden synthetische DNAs, dargestellt in den Sequenz ID Nrn 4 und 5 als Primer #1 und #2 hergestellt. Eine PCR (Polymerase-Kettenreaktion) wird unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stamms TN-3, erhalten in Schritt (1) als Matrize mit diesen Primern durchgeführt.
Spezifisch werden 1 µl der TN-3-chromosomalen DNA, 10 µl eines 10 X Reaktionspuffers, 4 µl von 10 mM dNTP, 1 µl (korrespondierend zu 100 pmol) von jedem der Primer #1 und #2 und 1 µl ExTaq (Takara Shuzo Co., Ltd.) miteinander vermischt, um ein Gesamtvolumen von 100 µl zu ergeben. Diese Lösung wird sequentiell bei 95°C für 30 sec (Denaturierungsschritt), 30 sec bei 55°C (Klebschritt) und 2 min bei 72°C (Verlängerungsschritt) pro Zyklus für 30 Zyklen inkubiert. Nach Abschluß der Reaktion wird die Reaktionsmischung einer Chloroform-Extraktion (3mal) und dann einer Ethanol-Präzipitation unterzogen, wodurch die vervielfältigte DNA gewonnen wird. Diese DNA wird durch 1,0 % Agarose-Gelelektrophorese zum Erhalt eines DNA-Fragments von ungefähr 300 Bp getrennt, von dem angenommen wird, dass es die EDDSase des Stamms TN-3 kodiert. Das so erhaltene DNA-Fragment wird mit einem DIG DNA-Labeling-Kit (Boehringer Mannheim) zur Herstellung einer Sonde markiert.
(5) Herstellung einer DNA-Bibliothek
Zu 10 µl der TN-3 chromosomalen DNA werden 5 µl eines 10 X Restriktionsenzym-Reaktionspuffers, 33 µl sterilisiertes Wasser und 2 µl des Restriktionsenzyms KpnI zugefügt und man lässt die Mischung 16 h bei 37°C reagieren. Danach werden DNA-Fragmente durch Ethanol-Präzipitation gewonnen und auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. DNA-Fragmente mit Größen im Bereich von 6,5 kb bis 5,5 kb werden aus dem Gel ausgeschnitten, mit DNA PREP (DIA IATRON) gewonnen und in die KpnI-Ste11e des E. coli-Vektors pUC18 unter Verwendung eines Ligationskits inseriert (Takara Shuzo Co., Ltd.), um eine rekombinante DNA-Bibliothek herzustellen.
Das bei der obigen Ligation verwendete pUC18-Fragment wird wie folgt hergestellt. Zu 2 µl einer pUC18-Grundlösung werden 5 µl eines 10 X Restriktionsenzyms-Reaktionspuffers, 40 µl sterilisiertes Wasser und 3 µl des Restriktionsenzyms KpnI zugefügt und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt. Nach einer Phenolbehandlung und Ethanol-Präzipitation wird die resultierende DNA getrocknet und in 50 µl sterilisiertem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wird 1 µl alkalische Phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.), 10 µl 10 X Reaktionspuffer und 39 µl sterilisiertes Wasser zugefügt und man läßt die Mischung bei 65°C reagieren, gefolgt von einer Phenolbehandlung und Ethanol-Präzipitation. Das resultierende DNA-Fragment wird getrocknet und in sterilisiertem Wasser gelöst.
(6) Herstellung eines E. coli Transformanden und Screening der rekombinanten DNA
Der E. coli Stamm JM109 wird in 1 ml LB-Medium (1 % Bacto-Trypton, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 0,5 % NaCl) inokuliert und 5 h bei 37°C unter aeroben Bedingungen präkultiviert. 100 ml dieser Kultur werden zu 40 ml SOB-Medium (2 % Bacto-Trypton, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 1 mM MgCl₂) zugefügt und 20 h bei 18°C kultiviert. Diese Kultur wird zum Ernten von Zellen zentrifugiert. Dann werden 13 ml einer kalten TF-Lösung (20 mM PIPES-KOH (pH 6,0), 200 mM KCl, 10 mM CaCl₂, 40 mM MnCl₂) den Zellen zugefügt und die Mischung wird 10 Minuten bei 0°C stehen gelassen. Nach einer Entfernung des Überstands durch Zentrifugation werden die ausgefällten E. coli-Zellen in 3,2 ml kalter TF-Lösung suspendiert, zu der 0,22 ml Dimethylsulfoxid zugefügt werden und die Suspension wird für 10 min bei 0°C gelassen. Zu 200 µl der so hergestellten kompetenten Zellen werden 10 µl der rekombinanten plasmidhaltigen Lösung (DNA-Bibliothek), wie hergestellt in Schritt (5), zugefügt und die resultierende Mischung wird 30 min bei 0°C stehen gelassen, einem Hitzeschock bei 42°C für 30 sec unterzogen und für 2 min bei 0°C gekühlt. 1 ml SOC-Medium (20 mM Glucose, 2 % Bacto-Trypton, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 1 mM MgCl₂) werden dann zugefügt und die Zellen werden 1 h bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Diese Kultur wird in 200 µl Teilen auf LB-Agarmedien, enthaltend 100 µg/ml Ampicillin ausgesät und bei 37°C kultiviert. Die Transformanden-Kolonien, die auf den Agarmedien gebildet werden, werden im Hinblick auf Transformanden, die das EDDSase-Gen enthalten, durch Kolonie-Hybridisierung überprüft. Spezifisch werden die auf dem Agar gebildeten Transformanden auf eine Nylonmembran (BIODYNE A, Japan Pall) übertragen und lysiert, um sie auf die Membran zu fixieren. Die Membran wird dann mit der Sonde (ungefähr 300 Bp), hergestellt in Schritt 4, behandelt und Kolonien, die die rekombinante DNA von Interesse enthalten, werden unter Verwendung des DIG-Lumineszenz-Detektions-Kits (Boehringer Mannheim) selektiert.
(7) Herstellung des rekombinanten Plasmids
Der in Schritt (6) selektierte Transformand wird in 100 ml LB-Medium über Nacht bei 37°C kultiviert. Die Zellen werden geerntet und mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Zu den Zellen werden 5 ml einer Lösung I (2 mM Glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl (pH 8)) und 25 mg Lysozym zugefügt und die resultierende Mischung wird 30 min bei 0°C stehen gelassen. Nach Zugabe von 10 ml Lösung II (1 N NaOH, 5 % SDS) wird die Mischung für 5 min bei 0°C stehen gelassen, wozu 7,5 ml Lösung III (3 M Natriumacetat (pH 4,8)) zugefügt werden. Man lässt die Mischung 30 min bei 0°C stehen und zentrifugiert zum Erhalt des Überstands, wozu 50 ml Ethanol zugefügt werden. Folgend auf die Entfernung des Überstands durch Zentrifugation werden zu dem Präzipitat 5 ml Lösung IV (10 mM Natriumacetat, 50 mM Tris-HCl (pH 8)) und 2,5 µl Ribonuklease-Lösung A (10 mg/ml) zugefügt und man lässt die Mischung 20 min bei Raumtemperatur stehen. 12 ml Ethanol werden zugefügt, um das Plasmid durch Zentrifugation zu gewinnen, wobei das Plasmid dann mit 70 % Ethanol gespült, getrocknet und in 0,4 ml sterilisiertem Wasser gelöst wird. Das so erhaltne rekombinante Plasmid wird pEDS001 genannt.
(8) Restriktions-Kartierung von pEDS001 und Identifizierung des EDDSase-Gen-Bereichs
Das in Schritt (7) erhaltene Plasmid pEDS001 wird mit verschiedenen Arten von Restriktionsenzymen gespalten, um eine Restriktionskarte zu erstellen (1). Weiterhin wird ein Subklonieren in konventioneller Weise durchgeführt. Spezifisch wird pEDS001 mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI gespalten. Die resultierenden Fragmente werden mit pUC18 ligiert, das mit denselben Restriktionsenzymen gespalten worden war. E. coli Stamm JM109 wird mit den erhaltenen Plasmid-DNAs transformiert, um ein Plasmid mit einem ungefähr 3,9 kb Insert (pEDS002) 2) zu ergeben sowie ein Plasmid mit einem ungefähr 2,6 kb Insert (pEDS003) (3). Jedes dieser Plasmide wird mit den Restriktionsenzymen BamHI, EcoRI, SacI, SacII usw. gespalten und einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Ein Fragment, das mit der Sonde hybridisiert, wird durch Southern-Hybridisierung identifiziert.
(9) Bestimmung der DNA-Sequenz
DNA-Sequenzen um den in Schritt (8) identifizierten Bereich herum werden unter Verwendung eines Pharmacia Fluoreszenz-Sequenzierers, ALFII, bestimmt. Im Ergebnis wird die DNA-Sequenz der SEQ ID NO:2 erhalten und der offene Leserahmen, der für die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:1 kodiert, wird darin aufgefunden. Die Suche gemäß der Aminosäuresequenz-Datenbank NBRF (National Biomedical Research Foundation) ergibt, dass dieses Gen eine 20- bis 30%ige Homologie mit dem Gen für Delta-Kristallin oder Argininosuccinatlyase aufweist. Beide Enzyme sind dafür bekannt, dass sie eine Funktion zur Katalyse einer Kondensation oder einer Abbaureaktion von Fumarsäure und eines Amins (Aminosäure) aufweisen. Die DNA-Sequenz des offenen Leserahmens ist in SEQ ID NO:3 dargestellt.
(10) Herstellung des Plasmids pEDS020 und E. coli Transformanden und EDDSase-Aktivität des Transformanden
Zu 2 µl des rekombinanten Plasmids pEDS003, erhalten in Schritt (8), das das EDDSase-Gen enthält, werden 2 µl eines 10 X Restriktionsenzyms-Reaktionspuffers, 15 µl sterilisiertes Wasser und 1 µl des Restriktionsenzyms KpnI zugefügt und die Mischung wird für 2 h bei 37°C umgesetzt. Das Plasmid wird durch Ethanol-Präzipitation gewonnen und getrocknet. Dann werden 17 µl sterilisiertes Wasser, 2 µl 10 X Restriktionsenzyms-Reaktionspuffer und 1 µl Restriktionsenzym BamHI zugefügt, gefolgt von einer zweistündigen Reaktion bei 37°C. Aus der Reaktionsmischung wird ein ungefähr 2,6 kb Fragment durch Agarose-Gelelektrophorese abgetrennt und in den E. coli Vektor pUC119 inseriert. Unter Verwendung dieser Ligationslösung wird der E. coli Stamm JM109 transformiert um ein Plasmid von Interesse zu ergeben. Das so hergestellte Plasmid und die Transformanden werden pEDS020 bzw. JM109/pEDS020 genannt.
Der Transformand JM109/pEDS020 wird in 1 ml des LB-Mediums, enthaltend 50 mg/ml Ampicillin inokuliert und 8 h bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Dann wird die Gesamtmenge der Zellen in 40 ml LB-Medium (enthaltend 50 mg/l Ampicillin und 1 mM Isopropyl-β-galactosid) bei 37°C für 30 h kultiviert. Die resultierende Kultur wird mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8) gewaschen und dann in 2 ml desselben Puffers suspendiert. Ein Aliquot der resultierenden Zellsuspension wird in 50 ml einer wässrigen Lösung (pH 8) suspendiert, enthaltend 342 mM Fumarsäure und 171 mM Ethylendiamin und die Suspension wird 24 h umgesetzt. Nach Entfernung der Zellen aus der Reaktionsmischung durch Zentrifugation wird Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure durch HPLC (WAKOSIL 5C8, Wako Pure Chemical Industries) (unter Verwendung von 50 mM Phosphorsäurelösung, pH 2, enthaltend 10 mM tetra-n-Butylammoniumhydroxid und 0,4 mM CuS04 als Elutionsmittel) analysiert. Gemäß der Analyse wird die Herstellung von 50 mM (S,S)-Ethylendiamin-N,N'ibernsteinsäure bestätigt.
(11) Herstellung des Plasmids pSE001
Zu 2 µl des in Schritt (10) erhaltenen Plasmids pEDS020 werden 2 µl 10 X Restriktionsenzym-Reaktionspuffer, 15 µl sterilisiertes Wasser, 1 µl des Restriktionsenzyms Xho1 zugefügt und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt. Das Plasmid wird durch Ethanol-Präzipitation gewonnen und getrocknet, wozu 15 µl sterilisiertes Wasser, 2 µl eines 10 X Klenow-Fragment-Puffers, 2 µl einer 10 mM dNTP-Lösung und 1 µl eines Klenow-Fragments zugefügt werden, gefolgt von einer zweistündigen Reaktion bei 37°C. Das DNA-Fragment wird durch Ethanol-Präzipitation gewonnen und getrocknet, wozu 8 µl sterilisiertes Wasser, 1 µl Xba1-Zinkerlösung und 16 µl Lösung A und 4 µl Lösung B, beide aus dem Ligationskit (Takara Shuzo Co., Ltd.) zugefügt werden. Die Mischung wird 4 h bei 16°C umgesetzt. Nach Transformation in JM109 wird ein Plasmid aus dem Transformanden erhalten, wobei das Plasmid eine Veränderung der Xhol-Stelle von pEDS020 zur XbaI-Stelle aufweist. Zu 2 µl des erhaltenen Plasmids werden 2 µl 10 X Restriktionsenzym-Reaktionspuffer zugefügt, sowie 15 µl sterilisiertes Wasser und 1 µlRestriktionsenzym EcoRV und die Mischung wird für 2 h bei 37°C umgesetzt. Das DNA-Fragment wird durch Ethanol-Präzipitation gewonnen und getrocknet. Dann werden 8 µl sterilisiertes Wasser, 1 µl Sse8387I-Linkerlösung und 16 µl Lösung A sowie 4 µl Lösung B, beide aus dem Ligationskit (Takara Shuzo Co., Ltd.) zu der getrockneten DNA zugefügt und die Mischung wird 4 h bei 16°C umgesetzt und in JM109 transformiert. Aus dem Transformanden wird das Plasmid pEDS027 erhalten, das eine Änderung der allgemeinen EcoRV-Stelle zu Sse8378I- Stelle aufweist. Zu 2 µl des so erhaltenen Plasmids werden 2 µl 10 X Restriktionsenzym-Reaktionspuffer, 14 µl sterilisiertes Wasser, 1 µl Restriktionsenzym Xba1 und 1 µl Sse83871 zugefügt und die Mischung wird 2 h bei 37°C umgesetzt. Eine 1,7 Kb Bande wird aus der Reaktionsmischung durch Agarose-Gelelektrophorese abgetrennt, die dann in die Xba1-Sse83871-Stelle des Plasmids pSJ034 mit einer starken Rhodococcus Promotor-Aktivität inseriert wird, wodurch das transformierte Plasmid pSE001 erzeugt wird (5). Das Plasmid pSJ034 wird aus dem Plasmid pSJ023 (japanische Patentanmeldung Nr. 9-65618) durch das in 6 dargestellte Verfahren hergestellt. Das Plasmid pSJ023 wird bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Japan) als Transformand Rhodococcus rhodochrous ATCC12674/pSJ023 (FERM P-16108) am 04. März 1997 hinterlegt, was darauffolgend in die internationale Hinterlegung als FERM BP-6232 am 21. Januar 1998 umgewandelt wird.
(12) Transformation des Bakteriums der Gattung Rhodococcus und EDDSase-Aktivität des Transformanden
Der kultivierte Rhodococcus rhodochorous Stamm ATCC17895 wird in der logarithmischen Wachstumsphase durch Zentrifugation geerntet, mit eiskaltem sterilisiertem Wasser 3mal gewaschen und in sterilisiertem Wasser suspendiert. 1 µl des Plasmids pSE001 und 10 µl der Zellsuspension werden miteinander vermischt und dann auf Eis gekühlt. Die Suspension der DNA und der Zellen wird in eine Küvette gegeben, die dann einer Elektropulsbehandlung auf einem Gene Pulser (BIO RAD) bei 2,0 kV und 2000 HMS unterzogen wird. Die so behandelte Lösung wird 10 min in Eis gelassen und dann einem Hitzeschock bei 37°C für 10 min unterzogen. 500 ml MYK-Medium (0,5 % Polypepton, 0,3 % Bacto-Hefeextrakt, 0,3 % Bacto-Malzextrakt, 0,2 % K₂HPO4 und 0,2 % KH₂PO₄) werden der Lösung zugefügt und 5 h bei 30°C stehen gelassen. Das Ergebnis wird auf MYK-Agarmedium, enthaltend 50 mg/l Kanamycin ausgestrichen, das dann bei 30°C 3 Tage kultiviert wird. Der erhaltene Transformand wird ATCC17895/pSE001 genannt.
Der so hergestellte Transformand wird in 10 ml MYK-Medium (enthaltend 50 mg/l Kanamycin) inokuliert, was einer Kultur unter Schütteln bei 30°C für 72 h unterzogen wird. 1 ml des Ergebnisses wird in 100 ml eines Mediums, enthaltend 1,5 % Glucose, 1 % Natriumglutamat, 0,1 % Bacto-Hefeextrakt, 0,05 % KH₂PO₄, 0,05 % K₂HPO₄, 0,05 % Magnesiumsulfat und 50 mg/l Kanamycin (pH 7,2), inokuliert und die Mischung wird dann 60 h bei 30°C kultiviert. Die erhaltenen Zellen werden verwendet, um die Reaktion und Analyse wie beschrieben in Schritt (10) durchzuführen. Im Ergebnis wird die Herstellung von 36 mM (S,S)-Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure bestätigt.
Die Reaktion zur Erzeugung einer optisch aktiven Aminopolycarbonsäure, dargestellt durch Formel [I], wird durchgeführt, indem entweder Zellen von einem der oben beschriebenen Stämme oder eines Verarbeitungsprodukts davon (z. B. Abfall der Stammzellen, Extrakte der Stammzellen, rohe oder gereinigte Enzyme aus den Stammzellen, immobilisierte Stammzellen oder Enzyme und Stammzellen oder Enzyme, behandelt mit einem Mittel, wie z. B. einem Stabilisierungsmittel) mit einer Mischung aus Fumarsäure und einer Aminogruppen-haltigen Verbindung, dargestellt durch die Formel [2], in Wasser oder einer Pufferlösung in Kontakt gebracht werden, z. B. einem Phosphatpuffer, Carbonatpuffer oder Boratpuffer.
Im allgemeinen wird die Reaktion bei einer Temperatur von 0 bis 50°C durchgeführt, vorzugsweise 5 bis 35°C und einem pH von 5 bis 11, vorzugsweise 6 bis 10. Obwohl die Konzentration der Fumarsäure und der Aminogruppen-haltigen Verbindung, dargestellt durch Formel [2], abhängig von der verwendeten Reaktionstemperatur und dem pH variieren, können sie im Bereich von 0,1 % bis zur Sättigungskonzentration liegen. Die Menge des Mikroorganismus oder dessen Verarbeitungsprodukts, die verwendet wird, beträgt im allgemeinen 0,01 bis 5,0 % pro Trockengewicht, basierend auf der Menge der Substrate. Die Reaktion kann entweder chargenweise oder kontinuierlich durchgeführt werden.
Für die Isolation der erzeugten Aminopolycarbonsäure aus der Reaktionsmischung nach Abschluß der Reaktion können bekannte Verfahren, wie z. B. die Entfernung von Mikroorganismen, Konzentration, Chromatographie (z. B. HPLC) und Kristallisierung verwendet werden.
Die Verfahren zur Erzeugung von Aminopolycarbonsäuren können in ähnlicher Weise wie die in JP-A-9-140390 oder dem US-Patent Nr. 5707836 beschriebenen durchgeführt werden.
Hiernach wird die vorliegende Erfindung im Detail durch nicht begrenzende Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
(1) Kultivierung
Pseudomonas sp. Stamm TN-131, Paracoccus sp. Stamm TNO-5, Sphingomonas sp. Stamm TN-28 und Brevundimonas sp. Stämme TN-30 und TN-3 wurden jeweils in einer Menge von einer Platinschlaufe aus ihrem geneigten Medium entnommen, in das unten dargestellte Medium inokuliert und einer Kultur unter Schütteln bei 30°C für 4 Tage unter aeroben Bedingungen unterzogen.
Zusammensetzung des Mediums (pH 7,5, 100 ml)
(2) Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität
Die Kulturen der Stämme wurden separat in Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 10.000 Upm für 15 min bei 5°C zentrifugiert, um die kultivierten Stämme zu sammeln, die dann zweimal mit 50 mM Boratpuffer (pH 9,2) gewaschen wurden, verdünnt mit demselben Puffer zum Erhalt einer Konzentration von 5 mg Trockenzelle/ml und wurden in einem Wasserbad bei 45°C 6 h behandelt, um die Fumarase-Aktivität zu entfernen. Nach 2 h wurde die Probenahme durchgeführt.
(3) Assays aus EDDSase- und Fumaraseaktivitäten
Die Stämme, die der oben beschriebenen Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität unterzogen worden waren, wurden im Hinblick auf ihre EDDSase- und Fumaraseaktivitäten überprüft. Verbliebene Aktivitäten der Enzyme wurden relativ zu jeweils 100 % Aktivität des nicht behandelten Mikroorganismus bestimmt.
Die EDDSase-Aktivität wurde durch Umsetzung jedes Stamms in einer Reaktionslösung, die 684 mM Fumarsäure, 342 mM Ethylendiamin und 342 mM Magnesiumhydroxid enthielt und mit 6 N NaOH auf einen pH von 8,5 eingestellt worden war, mit einer 1/10-Zellkonzentration der behandelten Flüssigkeit bei 30°C für 1 Tag überprüft und durch Quantifizierung einer Menge der gebildeten (S,S)-Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäure (S,S-EDDS) durch das unten angegebene Verfahren.
Die Fumaraseaktivität wurde durch Umsetzung jedes Stamms in einer Reaktionslösung überprüft, die 68,4 mM Natrium-L-malat und 50 mM Boratpuffer enthielt und einen pH aufwies, der mit 6 N NaOH auf 8,5 eingestellt worden war, bei einer 1/10 Zellkonzentration der behandelten Flüssigkeit bei 30°C für 1 Tag und Quantifizierung einer Menge der gebildeten Fumarsäure durch das unten angegebene Verfahren.
Quantifizierung der Reaktionsprodukte
Die S,S-EDDS, Fumarsäure und L-Äpfelsäure wurden quantitativ durch Flüssig-Chromatographie nach Entfernung unlöslicher Materialien, die in den Reaktionsmischungen enthalten waren, durch Zentrifugation bei 15.000 Upm bei 5°C für 5 min analysiert. WAKOSIL 5C8 (Wako Pure chemical Industries) wurde als Quantifizierungssäule verwendet (Eluat: 50 mM Phosphat (pH 2), enthaltend 10 mM tetra-n-Butylammoniumhydroxid und 0,4 mM CuSO₄) bzw. MCI GEL CRS 10W (hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation) als optische Auflösungssäule (Eluat: 10 mM CuS04).
(4) Ergebnisse
Tabelle 1
Beispiel 2
(1) Kultivierung von Transformanden E. coli JM109/pEDS020
Eine Platinschlaufe E. coli JM109/pEDS020 wurde aus dem geneigten Medium genommen, in LB-Medium (1 % Bactotrypton, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 0,5 % NaCl), enthaltend 50 mg/l Ampicillin inokuliert und einer Schüttelkultur bei 37%C für 8 h unterzogen. 2,5 % (Volumen) der Kultur wurde in LB-Medium (enthaltend 50 mg/l Ampicillin und 1 mM Isopropyl-β-galactosid) inokuliert und einer Schüttelkultur bei 37°C für 30 h unter aeroben Bedingungen unterzogen.
Rhodococcus rhodochrous ATCC17895/pSE001
Eine Platinschlaufe Rhodococcus rhodochrous ATCC17895/pSE001 wurde aus dem geneigten Medium entnommen, in MYK-Medium (0,5 % Polypepton, 0,3 % Bacto-Hefeextrakt, 0,3 % Bacto-Malzextrakt, 0,2 % K₂HPO₄, 0,2 % KH₂PO₄), enthaltend 50 mg/l Kanamycin inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30°C für 72 h unterzogen. 1 % (Volumen) der Kultur wurde in GGY-Medium (1,5 % Glucose, 1 % Natriumglutamat, 0,1 % Bacto-Hefeextrakt, 0,05 % K₂HPO₄, 0,05 % KH₂PO₄, 0,05 % Magnesiumsulfat, 50 mg/l Kanamycin, pH 7,2) inokuliert und einer Schüttelkultur bei 30°C für 60 h unter aeroben Bedingungen unterzogen.
(2) Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität
Die Fumaraseaktivität wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 entfernt.
(3) Assays auf EDDSase und Fumaraseaktivitäten
Die EDDSase und Fumaraseaktivitäten wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 überprüft.
(4) Ergebnisse
Tabelle 2
Beispiel 3
(1) Kultivierung eines Transformanden
E. coli JM109/pEDS020 wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 kultiviert.
(2) Glutaraldehyd-Behandlung und Behandlung zur Entfernung der Fumarase-Aktivität
Die Kultur wurde in ein Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 10.000 Upm bei 5°C 15 min zentrifugiert, um den Transformanden zu sammeln. Nach zweimaligem Waschen mit 50 mM Boratpuffer (pH 9,2) wurde der Transformand in demselben Puffer, enthaltend 1 mM (endgültige Konzentration) Glutaraldehyd bei einer endgültigen Konzentration von 5 mg Trockenzelle/ml bei 4°C für 2 h behandelt, zweimal mit 100 mM Boratpuffer (pH 9,2) gewaschen und mit demselben Puffer auf eine Konzentration von 5 mg Trockenzelle/ml verdünnt. Dieser Glutaraldehydbehandelte Transformand wurde einer Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität in einem Wasserbad bei 45°C für 6 h unterzogen. Der unbehandelte Transformand, verdünnt auf dieselbe Konzentration, wurde als Kontrolle verwendet.
(3) Assay auf EDDSase und Fumaraseaktivitäten
Die EDDSase und Fumaraseaktivität wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 überprüft.
(4) Ergebnisse
Tabelle 3
Beispiel 4
(1) Kultivierung des Transformanden
Der Transformand E. coli JM109/pEDS020 wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 kultiviert.
(2) Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität
Die Kultur wurde in ein Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 10.000 Upm bei 5°C 15 min zentrifugiert, um den Transformanden zu sammeln. Der Transformand wurde dann zweimal mit 50 mM Boratpuffern gewaschen, die auf pH-Werte wie angegeben in Tabelle 4 mit 6 N NaOH oder 5 N Schwefelsäure eingestellt worden waren, verdünnt mit denselben jeweiligen Puffern auf eine Konzentration von 5 mg Trockenzelle/ml und einer Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität in einem Wasserbad bei 45°C für 2 h unterzogen.
(3) Assay auf EDDSase und Fumaraseaktivitäten
Die EDDSase und Fumaraseaktivitäten wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 überprüft.
(4) Ergebnisse
Tabelle 4
Beispiel 5
(1)Kultivierung des Transformanden
Der Transformand E. coli JM109/pEDS020 wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 kultiviert.
(2) Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität
Die Kultur wurde in ein Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 10.000 Upm 15 min bei 5°C zentrifugiert, um den Transformanden zu sammeln, der dann zweimal mit Salzlösungen, wie angegeben in Tabelle 5 (jeweils mit einem pH, der mit 6 N NaOH oder 5 N Schwefelsäure auf 9,2 einstellt worden war) gewaschen, mit denselben Salzlösungen auf eine Konzentration von 5 mg Trockenzelle/ml verdünnt und einer Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität in einem Wasserbad von 45°C für 2 h unterzogen.
(3) Assay auf EDDSase und Fumaraseaktivitäten
EDDSase und Fumaraseaktivitäten wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 überprüft.
(4) Ergebnisse
Tabelle 5
Beispiel 6
(1) Kultivierung des Transformanden
Der Transformand E. coli JM109/pEDS020 wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 kultuviert.
(2) Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität
Die Kultur wurde in ein Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 10.000 Upm bei 5°C 15 min zentrifugiert, um den Transformanden zu sammeln, der dann zweimal mit 100 mM Boratpuffer (pH 9,2) gewaschen wurde, mit demselben Puffer auf eine Konzentration von 5 mg Trockenzelle/ml verdünnt und einer Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität in einem Wasserbad bei den Temperaturen und den Zeitspannen, die jeweils in Tabelle 6 angegeben sind, unterzogen.
(3) Assay auf EDDSase und Fumaraseaktivitäten
Die EDDSase und Fumaraseaktivitäten wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 überprüft.
(4) Ergebnisse
Tabelle 6
Beispiel 7
(1) Kultivierung des Transformanden
Der Transformand E. coli JM109/pEDS020 wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 kultiviert.
(2) Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität
Die Kultur wurde in ein Zentrifugenröhrchen gegeben und bei 10.000 Upm bei 5°C 15 Minuten zentrifugiert, um den Transformanden zu sammeln, der dann zweimal mit 100 mM Boratpuffer (pH 9,2) gewaschen wurde, mit demselben Puffer auf eine Konzentration von 5 mg Trockenzelle/ml verdünnt wurde und einer Behandlung zur Entfernung der Fumaraseaktivität in einem Wasserbad bei 45°C für 4 h unterzogen wurde.
(2) Reaktion
Die Reaktion wurde bei 30°C für 20 Tage unter Verwendung der Reaktionslösung durchgeführt, die 1232 mM Fumarsäure, 616 mM Ethylendiamin, 924 mM Magnesiumhydroxid und 20 mg Trockenzellen/ml des oben beschriebenen behandelten oder nicht behandelten Transformanden enthielt und einen auf 8,5 mit 6 N NaOH eingestellten pH aufwies.
Der pH wurde mit 6 N NaOH bei 8,5 gehalten.
Die Mengen an S,S-EDDS und L-Äpfelsäure in der Reaktionsmischung wurden durch die in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren quantifiziert.
(4) Ergebnisse
Wie sich aus den Ergebnissen der oben beschriebenen Beispiele ablesen lässt, stellt die vorliegende Erfindung einen mikrobiellen Katalysator bereit, worin die Fumaraseaktivität selektiv entfernt werden kann, ohne dass die EDDSase-Aktivität erniedrigt wird und der für die Erzeugung von optisch aktiven Aminopolycarbonsäuren mit weniger Fumarsäureverlust verwendbar ist.
Selbst wenn die EDDSase-Aktivität eines Mikroorganismus oder Verarbeitungsprodukts davon zu einem gewissen Ausmaß aufgrund einer alkalischen Behandlung verloren geht, kann der Mikroorganismus oder das Verarbeitungsprodukt davon in vorteilhafter Weise als Katalysator für die Erzeugung von optisch aktiven Aminopolycarbonsäuren mit weniger Fumarsäureverlust verwendet werden, solange das Verhältnis der entfernten Fumaraseaktivität relativ größer ist als der Verlust der EEDSase-Aktivität.
Verschiedene andere Modifikationen werden sich dem Fachmann einfach darstellen und können von diesem durchgeführt werden, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen, die durch die beigefügten Ansprüche definiert ist.
SEQIIENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Entfernung der Fumaraseaktivität aus einem Mikroorganismus oder einem Verarbeitungsprodukt davon mit einer Ethylendiamin-N,N'-dibernsteinsäureethylendiaminlyase (EDDSase)-Aktivität, ohne Verlust der EDDSase-Aktivität, das die Behandlung des Mikroorganismus oder dessen Verarbeitungsprodukts mit einer wässrigen alkalischen Lösung bei einem pH von 8,0-10,5 in Gegenwart von mindestens einem Salz mit einer Konzentration von 5 bis 1.000 mM umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei das Salz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Natrium, Kalium, Ammonium und Aminsalzen von Borsäure, Phosphorsäure, Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Oxazsäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Ethylendiamin-N,N'dibernsteinsäure und Mischungen davon.
Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus oder dessen Verarbeitungsprodukt ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Bakterien der Gattungen Pseudomonas, Paracoccus, Sphingomonas und Brevundimonas, und Transformanden, bei denen eine DNA, die für eine EDDSase codiert, in ein Wirtsbakterium eingeführt wurde, das zur Gattung Escherichia oder Rhodococcus gehört, oder Verarbeitungsprodukten davon.
Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus oder das Verarbeitungsprodukt davon ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Pseudomonas sp. Stamm TN-131 (FERM BP-5418), Paracoccus sp. Stamm TNO-5 (FERM BP-6547), Sphingomonas sp. Stamm TN-28 (FERM BP-5419), Brevundimonas sp. Stamm TN-30 (FERM BP-5417) und Brevundimonas sp. Stamm TN-3 (FERM BP-5886), und Transformanden, abgeleitet von den Wirten Escherichia coli Stamm JM109 (ATCC 53323) und Rhodococcus rhodochrous (ATCC 17895); oder Verarbeitungsprodukten davon.
Verfahren gemäss Anspruch 1, 3 oder 4, wobei das Verarbeitungsprodukt davon gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Abfall der Mikroorganismen, Extrakten der Mikroorganismen, rohen oder gereinigten Enzymen der Mikroorganismen, immobilisierten Mikroorganismen oder Enzymen und Mikroorganismen oder Enzymen, die mit einem Mittel, wie z.B. einem Stabilisierungsmittel, behandelt wurden.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Konzentration des Salzes im Bereich von 10 bis 500 mM liegt.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der pH der wässrigen alkalischen Lösung im Bereich von 8,5 bis 10, vorzugsweise 9 bis 9,5, liegt.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Behandlung bei einer Temperatur im Bereich von der Gefriertemperatur bis zu 55°C durchgeführt wird.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Behandlung über eine Zeitspanne von etwa 1 Minute bis etwa 1 Monat durchgeführt wird.
Mikroorganismus oder Verarbeitungsprodukt eines Transformanden, bei dem eine DNA, die für eine EDDSase codiert, in ein Wirtsbakterium eingeführt wurde, das zur Gattung Escherichia oder Rhodococcus gehört, erhältlich durch das Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9.
Verwendung des Mikroorganismus oder Verarbeitungsprodukts davon gemäss Anspruch 10, bei der Herstellung einer optisch aktiven Aminopolycarbonsäure aus Fumarsäure und einer Verbindung mit einer Aminogruppe.
Verfahren zur Erzeugung einer optisch aktiven Aminopolycarbonsäure, dargestellt durch die folgende allgemeine Formel (1):
das die Umsetzung von Fumarsäure mit einer Verbindung umfasst, die eine Aminogruppe aufweist, dargestellt durch die allgemeine Formel (2):
worin R₁ und R₂, die identisch oder unterschiedlich voneinander sein können, ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Cycloalkylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe bedeuten, mit der Massgabe, dass R₁ und R₂ nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind; wobei der Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Aminogruppe, einer Cyanogruppe, einer Nitrogruppe, Halogen, einer Hydroxylgruppe, einer Carboxylgruppe, einer Ethergruppe und dergleichen, und worin R₃ und R₄ identisch mit R₁ oder R₂ sind oder eine Gruppe darstellen, die die Struktur aufweist, bei der mindestens eine Aminogruppe von R₁ oder R₂ an einen Kohlenstoff der Ethylengruppe von Bernsteinsäure über ein Stickstoffatom der Aminogruppe gebunden ist, in Gegenwart des Mikroorganismus oder Verarbeitungsprodukts davon als Katalysator gemäss Anspruch 10, und Isolieren der optisch aktiven Aminopolycarbonsäure aus der Reaktionsmischung.
Verfahren gemäss Anspruch 12, wobei die Verbindung mit der Aminogruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkan- und Cycloalkan-diaminen mit einer Kohlenstoffanzahl von 2 bis 6, einschliesslich Ethylendiamin, 1,3-Propandiamin, 2-Methyl-1,3-propandiamin, 2-Hydroxy-1,3-propandiamin, 1,4-Butandiamin, 1,5-Pentandiamin, 1,6-Hexandiamin, 1,2-Cyclohexandiamin, 1,3-Cyclohexandiamin und 1,4-Cyclohexandiamin; Phenylendiaminen, einschliesslich 1,2-Phenylendiamin, 1,3-Phenylendiamin und 1,4-Phenylendiamin; und Monoaminen, einschliesslich Glycin, 3-Aminopropionsäure, 2-pminopropionsäure, Iminodiessigsäure, 3,3'-Iminodipropionsäure und Glutaminsäure.