JPH02470A - アミドの生物学的製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〔発明の背策Ｊ （技術分野） 本発明は、微生物由来のニトリルヒドラターゼの作用に
よってニトリルを水和してこれを対応するアミドに変換
させる方法に関する。さらに具体的には、本発明は、使
用する微生物およびニトリルヒドラターゼの産生方法に
主要な特徴を存するアミドの生物学的製造法に関する。 （先行技術） 低級脂肪族アミド、たとえばアクリルアミド、は対応す
るニトリル、たとえばアクリロニトリルの水相によって
製造されるが、この水和を微生物の産生ずる酵素にトリ
ラーゼあるいはニトリルヒドラターゼ）の作用によって
行なう方法が提案されている（たとえば、特公昭６２−
２１５１９号、特開昭６１−１６２１９３号、特開昭６
２−９１１８９号、特公昭５６−１７９１８号および特
公昭５９−３７９５１号公報参照）。このようなアミド
の生物学的製造法は、工業的にも実施されていて、アク
リルアミドの合判な製造法として注ｌ］されている。 このようなアミドの生物学的製造法に使用されるものと
して既にいくつかの微生物が提案されているのであるが
、本発明者らの知るところでは、これらの微生物は低級
脂肪族ニトリルの水和には有効であっても、芳香族ニト
リルの水和には必ずしも有効ではない。たとえば、３−
シアノピリジンを水和してニコチン酸アミドを製造する
方法は、収率が低くて工業的には実施し難い。 ところで、微生物の培養を鉄イオンあるいはマンガンイ
オンの存在下に行なうことが一般に知られており、アミ
ドの生物学的製造にもこの技術は利用されていて、たと
えばロドコッカス属の微生物の培養を鉄イオンの存在下
に行なう例を特開昭６１−１６２１９３号および特開昭
６２−９１１８９号各公報にみることができる。 本発明者らの検討したところによれば、シュードモナス
属細菌由来のニトリル水和酵素にトリルヒドラターゼ）
、はその活性中心にＦｅ　　　を含んでおり、従ってこ
の微生物の培養には培地中に鉄イオンがｑ在することか
必須であったが、ロドコッカス属の微生物についての前
記の公知例の場合にもその培養の際の培地中の鉄イオン
はニトリル水相酵素産生のために必須のものであると推
定される。 〔発明の概要〕 （要　旨） 本発明は、上記の知見に反して、ロドコッカス属の特定
の菌株、すなわちロドクロウス種のＪ−１株、が鉄イオ
ン含有培地ではニトリルヒドラターゼを産生じないこと
ならびにコバルトイオン含Ｈ培地においてはじめてニト
リルヒドラターゼを産生ずること、ならびにこのように
して産生されたニトリルヒドラターゼは芳香族ニトリル
をも基質としてそれをアミドに変換すること、の発見に
基いてなされたものである。 従って、本発明によるアミドの製造法は、微生物由来の
ニトリルヒドラターゼ酵素の作用によってニトリルを水
和してこれを対応するアミドに変換する方法において、
譲ニトリルヒドラターゼが、ロドコッカス属ロドクロウ
ス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ
　）の微生物をコバルトイオン存在下に培養して得たも
のであること、を特徴とするものである。 （効　果） 本発明によれば、鉄イオン含有培地ではニトリルヒドラ
ターゼ活性がゼロであるのに対して、コバルトイオン含
有培地ではじめてニトリルヒドラターゼ活性が発現する
。ニトリルヒドラターゼ発現についてこの特定の微生物
の金属イオン要求性の臨界性は、全く思いがけなかった
ことと解される。 また、本発明によれば、芳香族ニトリルの水和を有利に
行なうことができる。ビタミン原料等としてのニコチン
酸アミド（すなわち３−シアノピリジンの水和物）ある
いは抗結核薬として有用なピラジンアミド（すなわちシ
アノピラジンの水和物）の重要性からいって、本発明の
この効果は有用なものである。 〔発明の詳細な説明〕 １、アミドの生物学的製造の基本的内容本発明は微生物
由来のニトリルヒドラターゼの作用によってニトリルを
水和してこれをアミドに変換する方法であるが、この方
法は基本的には微生物の培養およびニトリルヒドラター
ゼの誘導ならびに得られたニトリルヒドラターゼの基質
ニトリルに対する作用からなる。 これらは単位操作としてそれ自身公知であって、本発明
でも合口的的な任意の態様を採ることができる。本発明
で「微生物をコバルトイオン存在下に培養して得たもの
である」ということは、ニトリルヒドラターゼの誘導が
行なわれたことを当然の前提とするものである。 本発明が前提とする［微生物由来のニトリルヒドラター
ゼ酵素の作用によってニトリルを水和してこれを対応す
るアミドに変換する方法」は、ニトリルヒドラターゼの
作用のさせ方について合目的的な任意の態様を包含する
ものである。そのような態様の一つとして、微生物に産
生させた酵素を回収して、これを酵素標品として使用す
る方法があるが、このようなふつうの触媒反応のような
場合をも本発明では「生物学的製造法Ｊとして扱うもの
とする。 ２、水和反応の詳細 １）　微生物 本発明で使用する微生物は、ロドコッカス属ロドクロウ
ス種（Ｒｂｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｂｏｄｏｃｂｒｏｕ
ｓ　）のものである。 この種の株の代表的なものは、Ｊ−１株である。 Ｊ−１株の詳細は下記の通りである。 （１）由来および寄：ｅ Ｊ−１株は、本発明者らが京都市左京区の土壌から採取
したものであって、昭和６２年９月１８日に工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されて、ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−１４７８号の受託番号を得ている。 （２）　　菌学的性質 （ａ）形　態 （１）細胞の形および　　　。、９〜１．　　Ｏい３〜
１ｏｕ大きさ （２）細胞の多形性の杓°無　培養初期に長稈状を呈し
、提体状で湾曲なくスナツピングを伴った発育 を示し、のちに短桿菌し、後に断裂 する （３）運動性　　　　　　　な　し く４）胞子の有無　　　　　な　し く５）ダラム染色性　　　　陽　性 （６）抗酸性　　　　　　　陰　性 （７）異染小体　　　　　　認められる（ｂ）各培地に
おける生育状態（３０℃）（１）肉汁寒天゛１′−敗培
養　　直径１１Ｉ１１（４８時間）円形、不規則、平滑
で表面乾き気味、扁・１へ不透明、淡オレンジピンク色 （２）肉１１寒人斜而培養　　糸状、表面平滑、断面は
やや隆起状で乾き気味、淡オレンジピンク色 （３）肉汁液体培養　　　　菌膜を形成し、旺盛に発育
する。生（４）肉１１ゼラチン穿刺 培養 （５）リドマスミルク （ｅ）生理学的性質 （＋）硝酸塩の還元 （２）脱窒反応 （３）ＭＲテスト （４）ＶＰテスト （５）インドールの生成 （６）硫化水素の生成 （７）デンプンの加水分解 （８）クエン酸の利用 （９）無機窒素源の利用 （１０）色素の生成 育するにしたがって、中程度の濁り、 沈澱を生ずる。 表面に良く生育、穿刺部にそってロ ー１・状に発育するが、下層部にはほ とんど発育しない。ゼラチンは、液 化は認められない。 変化しない 陽性 陰性 陰性 陰性 陽性 陽性 陰性 コーサーの培地：陰　性 クリステンセンの培地：陽　性 硝酸塩：陽　性 アンモニウム塩：陽　性 陰性 （１１）ウレアーゼ （１２）オキシダーゼ （１３）カタラーゼ （１４）セルロースの 加水分解 （１５）生育の範囲 （１６）酸素に対する態度 （１７）チロシンの分解 （１８）アデニンの分解 （１９）ホスファターゼ （２０）Ｔｗｅ　ｅ　ｎ８０ 加水分解 （２１）０−Ｆテスト （２２）耐熱性（１０％スキ ムミルク中７２℃、 １５分） （２３）ｖＭから酸および ガスの生成 Ｌ−アラビノース ｐＨ：５〜１０ 温度：１０〜４１℃ 好気性 陽性 陽性 陽性 陽性 ０（弱い） なし 酸の生成　ガスの生成 り−キシロース Ｄ−グルコース Ｄ−マンノース Ｄ−フラクトース 麦芽糖 ショ糖 乳糖 トレハロース Ｄ−ツルビット Ｄ−マンニット グリセリン （２４）単一炭素源としての 生育 イノシトール 麦芽糖 Ｄ−マンニット ラムノース Ｄ−ソルビット ｍ−ハイドロキシ 安息香酸 ＋ ＋ 十 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ アジピン酸ナトリウム 安息香酸ナトリウム クエン酸ナトリウム 乳酸ナトリウム テストテトロン Ｌ−チロシン グリセール（１％）（讐／Ｖ） トレハロース ｐ−ハイドロキシ 安息香酸（１％）（ν／Ｖ） （２５）脂肪酸と細胞壁分析 （＋）弱いが陽性である。 不飽和、飽和直鎖脂肪酸、およびラ ベルクロステアリン酸を含む。ミコ ール酸のＴＬＣは単一スポットを与 える。 以上の菌体的性質をバージ−の細菌分類書（Ｂｃｒｇｙ
’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｒＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｉ３
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）（１９８Ｇ）に基づいて分
類すると、Ｊ−１株は、好気性、グラム陽性、弱抗酸性
、カタラーゼ陽性の内生胞子を生じない桿菌であり、鞭
毛を着生しない。また、発育の初期過程で長桿菌状で菌
糸状を呈し、枝分れ（Ｂｒａｎｃｈｉｎｇ　）を伴なっ
た発育を示し、後に短桿菌状に断裂することよりノカル
デイア型の細菌に属するものと認められる。 脂肪酸組成の分析は、ラベルクロステアリン酸を含む不
飽和、飽和の直鎖脂肪酸を含む。ミコール酸のＴＬＣは
標準画Ｒｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｌ＋ｒｏｕ
ｓ（ＩＦｏ　３３３８）と同じＲｆを示すＩｔ−スポッ
トを与えることから、ＭｙｃｏｂａｃＬｅｒｌｕＩｌ属
とは区別される。 またミコール酸の組成（炭素数）からＮｏｅａｒｄｌａ
属とは区別される。その他生化学的諸性質の検討から、
本菌はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｅｈｏｕｓ
と認められる。 ２）　基質／ニトリル 上記のような微生物の産生ずるニトリルヒドラターゼの
基質となるニトリルは、芳香族および脂肪族のモノニト
リルまたはジニトリル、就中モノニトリル、である。 本発明の特色を最もよく享受するのは、芳香族ニトリル
、特に芳香環を形成する炭素数が４〜１０のもの、であ
る。芳香族ニトリルの具体例のいくつかを例示すれば下
記の通りであって、下記の一般式（１）〜［ＶＩ）で示
される化合物が挙げられる。 例えば、４−１３−１および２−シアノピリジン、がそ
れである。 （ここで、Ｒ１およびＲ−は、それぞれ、ＨｌｃＨＯＨ
，ＯＣＨ３、ＣＩ、Ｆ、ＣＮ。 ３ゝ ＮＨまたはＮＯ２である。） 例えば、ベンゾニトリル、０−５ｍ−およびｐ−クロロ
ベンゾニトリル％　Ｏ−、”−およびｐ−フルオロベン
ゾニトリル、Ｏ−およびｍ−ニトロベンゾニトリル、ｐ
−アミノベンゾニトリル、０−ｌｍ−およびｐｌルニト
リル、４−シアノフェノール、アニソニトリル、フタロ
ニトリル、イソフタロニトリル、テレフタロニトリル、
２゜６−シクロロペンゾニトリル、２．４−ジクロロベ
ンゾニトリル、２，６−シフルオロベンゾニトリル、が
それである。 例えば、α−およびβ−ナフトニトリル、がそれである
。 （ここで、ＸはＳまたは０である） 例えば、２−チオフェンカルボニトリルおよび２−フロ
ニトリル、がそれである。 Ｌ〜 例えば、５−シアノインドール、がそれである。 へ すなわち、シアノピラジンである。 本発明で対象とするニトリルの他の一群は、脂肪族ニト
リルである。炭素数２〜６のモノまたはジニトリル、就
中モノニトリル、が適当である。 生成アミドの有用性からいって、アクリロニトリルが代
表的であり、また生産性も良好である。 これらのニトリルに対応するアミドは、ＣＮ基がＣＯＮ
Ｈ２基に変換されたものであることは（１うまでもない
。なお、ジニトリルの場合はＣＮ基の少なくとも１個が
Ｃ０Ｎ）１　　に変換したものを対応するアミドと考え
るものとする。 ３）　培養／ニトリルヒドラターゼの産生ロドコッカス
属ロドクロウス種の微生物の培養は、培地にコバルトイ
オンが存在、するということを除けば、他の条件に関し
てはそれが合目的的なものである限り制限はない。培地
中に酵素誘導剤（詳細１後記）を存在させておいてニト
リルヒドラターゼを菌体中に蓄積させることがふつうで
あることは前記したところである。 （１）基本培地 適当な培地のいくつかを例示すれば、下記の通りである
。挙示の成分の量を変え、ある成分を他の成分と置きか
え、ある成分を省略し、あるいは池の成分を追加するこ
とは、当業者にとって容易であろう。 （イ）培地Ａ 成　分　　　　　　　　量（培地１ｇ中）ビタミン混合
物”　　　　　　　　　０．１ｍ１Ｋ　２ＨＰ　０４１
３　、４　ｇ Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４６、５ｇ ＮａＣＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．　
　ＯｇＭ　ｇ　Ｓ　０　　・７　Ｈ２００、２ｇ蒸留水
　　　　　　　　　　　残部（ｐＨ７，０）＊１　組成
（溶液ＩＩＩ中） ビオチン　　　　　　　　　　　　　　２μｇパントテ
ン酸カルシウム　　　　０．４ｍｇイノシトール ニコチン酸 塩酸チアミン 塩酸ピリドキシン ｐ−アミノ安息香酸 リボフラビン 葉酸 蒸留水 （ロ）培地Ｂ グリセロール ペプトン モルトエキス イーストエキス 蒸留水 （ハ）培地Ｃ イーストエキス Ｈ２ＰＯ４ に２ＨＰ０４ ＭｇＳＯ４゛７Ｈ２０ 蒸留水 ｍｇ ０．４ｍｇ Ｑ、４ｍｇ ０．４ｍｇ ０．２ｎｇ ０、　２ｍｇ ０．　　Ｏｌｎｇ 残部 ０ｇ ５ｇ ５ｇ ５ｇ 残部（ｐＨ７，２） ５ｇ ０、　５ｇ ０、５ｇ ０、５ｇ 残部（ｐＨ７，２） （２）酵素誘導剤 ロドコッカス属ロドクロウス種の微生物にニトリルヒド
ラターゼを誘導産生させる酵素誘導剤は、合目的的な任
意のものがありうる。 本発明で適当な誘導剤は、ニトリルおよびアミドが代表
的である。 Ｊ−１株についてその効果を確認している酵素誘導剤の
具体例を挙げれば、下記のものがある。 クロトンアミド、アセトニトリル、プロピオニトリル、
ベンズアミド、プロピオンアミド、アセトアミド、イソ
バレロニトリル、

【１−ブチロニトリル、イソブチロニ
トリル、ｎ−カプロニトリル、３−ペンテンニトリル、
ビバロニトリル、ｎ−ブチルアミド、イソブチルアミド
、ｎ−バレルアミド、ローカプロンアミド、メタクリル
アミド、フェニルアセトアミド。 （３）コバルト源 上記のような酵素誘導剤を培地に（ｊ在させてもニトリ
ルヒドラターゼは得られないので、本発明では培地にコ
バルトイオンを存在させることが必須である。 培地が水性であるところより、コバルトイオンは水溶性
コバルト化合物を培地に添加することによって生成させ
ることがふつうである。水溶性のコバルト化合物は化学
辞典類の明らかにするところであり、適当なものを選択
使用することは（場合によっては簡！１１な予６層試験
を行なって）当業者は容易であろう。代表的なコバルト
化合物は、たとえばＣｏ　　またはＣｏ　　　を与える
もの、特にＣｏ　　を与えるもの、であって、具体的に
は塩化コバルト、硫酸コバルト、酢酸コバルト、臭化コ
バルト、硼酸コバルト、その他を例示することがてでき
る。 この他、本発明ではビタミンＢ１゜および金属コバルト
も使用できる。ビタミンＢ１２中にはコバルトが錯体と
して含まれており、培養の際イオン化する。また、金属
コバル１〜は培養中機生物による酸化力でイオン化する
。 （４）培養 ニトリルヒドラターゼを菌体内に産生蓄積させるだめの
培養は、使用微生物たとえばＪ−１株を前記のような培
地で適当な条件で実施すればよい。 酵素誘導剤の使用量は培地１リットル中２〜６ｇ程度で
あり、コバルトイオンの使用量は培地１リットル当りＣ
ｏ　Ｃｌ　２換算で５〜１５ａ＋ｇ程度である。 具体的な培養培地組成を示せば、下記の通りである。 （イ）培地Ａ　　　　　　　　　　１リツトルアセトニ
トリル（、ｉｆ５導剤）　　　　　　２ｇＣｏＣｌ２　
　　　　　　　　１０ｍｇ（ロ）培地８　　　　　　　
　　１リツトルイソバレロニトリル（誘導剤）２ｇ ＣｏＣ１２１０１０１ ｉハ）培地Ｃ１リツトル クロトンアミド（誘導剤）　　　　　　２ｇＣｏＣｌ２
　　　　　　　　　　１０ｍｇこのような培養培地で１
５〜５０℃程度、好ましくは２０〜４５℃程度、特に好
ましくは３０℃前後、ｐＨ７〜９で約３０時間以上、好
ましくは４０時間以上（上限は、たとえば１２０時間）
、Ｊ−１株を振盪１８養すれば、ニトリルヒドラターゼ
を有利に産生させることができる。酵素誘導剤は培養当
初から存在させることが好ましく、特に高活性の菌体を
調製するためには、たとえば２８”Ｃ７６時間振盪培養
するときに、２６時間目および５６時間目にそれぞれ０
．２％（ｗ／ｖ）の濃度となるようにクロトンアミドを
培地に追加添加する方法を採ることが望ましい。 ４）　ニトリルの水和 本発明が前提とする「微生物由来のニトリルヒドラター
ゼ酵素の作用によってニトリルを水和してこれを対応す
るアミドに変換する方法」とは、ニトリルヒドラターゼ
の作用のさせ方について合目的的な種々の態様を包含す
るものであることは前記したところである。 そのような態様の一つは、微生物の培養系に基質のニト
リルを存在させておいて、培地中にアミドを生成させる
ことである。 ニトリルヒドラターゼを作用させる態様の他の一つは、
ニトリルヒドラターゼが蓄積されている培養液に基質ニ
トリルを添加して水和反応を行なわせることである。こ
の態様の改変例として、菌体を破砕した培養液を使用す
る方法が挙げられよう。 ニトリルヒドラターゼを作用させる態様のさらに他の一
つは、ニトリルヒドラターゼを蓄積した菌体を培養液か
ら分離して、好ましくはこれを適当な担体に担持させて
「固定化」して、基質と接触させる方法である。この方
法、特にこの好ましい態様は、上記の第二の態様と並ん
で、あるいは第二の態様以上に、工業的実施に適したも
のということができる。担体の揮類および微生物の担持
方法を含めて、そして所謂バイオリアクターとしての固
定化微生物の利用も含めて、この技術は周知のものであ
る。 ニトリルヒドラターゼを作用させる態様の他の一つは、
ニトリルヒドラターゼ酵素標品を得て、この酵素によっ
ていわば非生物学的にニトリルを水和する方法である。 水和反応は、Ｉ！ＩＦ素活性が失なわれない範囲のｐＨ
および温度条件で行なわれることはいうまでもなく、こ
れらの条件は一般に上記の生物学的手法でのそれと同じ
であるということができる。このような酵素作用時に微
生物が（ｊ在しない態様も本発明では「生物学的製造法
」として取扱うことは前記した通りである。 本発明によるニトリルヒドラターゼは至適ｐＨが７〜９
、最適ｐＨが８．０である。反応液ｐＨが７未満では、
酵素の活性は急激に低ドする傾向がある。従って、反応
液には緩衝剤を添加することが望ましい。緩衝剤がリン
酸カリウムバッフ７トリス／ＭＣＩバッファー、ＨＥＰ
ＥＳ／ＫＯＨバッファーおよびホウ酸ナトリウムバッフ
ァーであっても、ニトリルヒドラターゼの酵素活性に差
は生じない。 培養液ないし水和反応液中の基質濃度は、基質の種類に
よっても異なるが、通常０．５〜１５モル／リットルで
あり、また反応温度は通常１０〜３０℃の範囲である。 ３、実験例 以下の実験例でニトリルヒドラターゼ活性のＡｌｌ定法
および活性の１１１１ｆｉは、下記の通りに定義された
ものである。 （１）ニトリルヒドラターゼ活性の測定法ニトリルヒド
ラターゼ活性は、ベンゾニトリル１０ｍＭ、　リン酸カ
リウムノ〈ツファ−（ｐＨ７，０）３０ｍＭ、および所
定量の菌体（培箆液から分離したもの）を含む反応混合
液２ｍｌにつ０て、１０℃で５分間反応を行なわせてか
ら０．２ｍｌのｌＮＨＣｌを添加して反応を停止させる
ことによってハ１定する。 （２）ユニットの定義 ニトリルヒドラターゼ活性の１ユニ・ソト（Ｕ）は、上
記の条件でベンゾニトリルからベンズアミドを１ｇモル
／分の速度で生成させる酵素の量、として定義されたも
のである。 参考例１ 下記の組成の培地および培養条件でＪ−１株を培養し、
その際にＣｏＣＩつおよび（または）Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏ４
を添加してニトリルヒドラターゼ活性の発現を調べた。 （イ）培地組成 成　分　　　　　　　　量（培地１ｇ中）ビタミン混合
物　　　　　　　　　３ｍ１Ｋ　２ＨＰＯ４０，５ｇ ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ Ｍｇ５０　　・７Ｈ２００，５ｇ プロピオニトリル　　　　　　　　２ｍｌ蒸留水　　　
　　　　　　　残り（ｐＨ７，２）（ロ）培養条件 ２８℃／７０〜８０時ＩＨＩ 得られた結果は、下記の通りであった。 基本培地にＦ　ｅ　Ｓ　Ｏ４を添加してもニトリルヒド
ラターゼ活性は発現しないこと、Ｃｏ　Ｃｌ　２の添加
によってニトリルヒドラターゼ活性が発現すること、な
らびにＣｏ　ＣＩ　２添加系にＦ　ｅ　Ｓ　Ｏ４を添加
しても結果はむしろ悪化すること、が判る。 ｆＦＩ　　菌体ｆｆｉ：　乾物基準 ネ２　Ｕ：　前記の定義による活性単位。菌体量は乾物
基鳴参考例２ Ｊ−１株に対する各種のニトリルまたはアミドの酵素誘
導剤としての効果は、下表に示すとおりである。 下表の結果は、Ｊ−１株を前記の培地Ｂで前培養（２８
℃）し、同法が充分に増殖してから、ニトリルまたはア
ミドを前者については０．　１％（ｖ／、ｖ）、後者に
ついてはＯ９２９６（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、さらに
０．００１％（Ｗ／Ｖ）Ｃｏ　ＣＩ　２を添加した前記
培地Ｃに移し、３６〜４８時間培養を行なったときのも
のである。 比活性 クロトンアミド アセトニトリル プロピオンニトリル ベンズアミド プロピオンアミド アセトアミド ｎ−ブチロニトリル イソブチロニトリル イソバレロニトリル ｎ−カプロニトリル ３−ペンテンニトリル ビハロニトリル ｎ−ブチルアミド イソブチルアミド ｒｌ−バレルアミド 「】−カプロンアミド メタクリルアミド フェニルアセトアミド ２．２２ １．４１ １．３６ ０．８４ ０．７９ ０．７１ １．４０ ０．４１ ０．３４ ０．２８ ０．３２ ０．３５ ０．４３ ０．０９ ０．４４ ０．３０ ０．２０ ０．２９ 全活性 ４．４８ ３．４７ ４．４４ ２．７５ ２．２９ １．５５ ０．３８ １．２４ １．０５ １．０４ １．４２ ０．２４ １．５５ ０．３３ １．０８ １．０６ ０．６２ ０．２８ 菌体量 ２．０２ ２．４６ ３．２６ ３．２６ ２．９０ ２．１８ ３．７０ ３．０６ ３．０７ ３．７１ ４．４９ （１，６９ ３，６２ ３，４８ １，８１ ３、１２ ０，９５ 実施例１ 前記の培地ＣにＣＯＣｌ２　０．Ｃ）１ｇ／リットルお
よびクロトンアミド２ｇ／リットルを添加してなる培地
で培養して得られるＪ−１株の菌体と１５種のニトリル
を基質として用いて反応させた。 反応は、培養液２１より得られる菌体、１０ｍＭのリン
酸カリウムバッファー（ｐＨ８，０）および２［］Ｏｍ
Ｍの基質よりなる反応液（２ｍｌ）を用い、２５℃で７
６時間行なった。反応は０．２ｍｌの＋ＮＨＣｌを加え
て停止りさせ、各基質に対するニトリルヒドラターゼ活
性は反応生成物の生成量または基質の消費をＨＰＬＣで
測定して３−シアノピリジンを基質として用いたときの
ニトリルヒドラターゼ活性に対する比率（モルＭｌ）　
、すなわち比活性（％）、として示した。 結果は、下記の通りであった。 基　　　質　　　　　　　　比活性（％）３−シアノピ
リジン　　　　　　１００アクリロニトリル　　　　　
　　　１０６４−シアノピリジン　　　　　　１２９２
−シアノピリジン ５−シアノインドール ２・チオフェンカルボニトリル ２−フロニトリル ベンゾニトリル ４−シアノフェノール ｐ−アミノベンゾニトリル ｍ−ニトロベンゾニトリル ０−ニトロベンゾニトリル ｍ−クロロベンゾニトリル ｐ４ルニトリル ０−トルニトリル ｍ−）ルニトリル アニソニトリル ０−クロロベンゾニトリル ｐ−クロロベンゾニトリル ２．４−ジクロロベンゾニトリル ２．６−ジクロロベンゾニトリル シアノビラジン 実施例２ 前、；己培１ｊｊｌＣにＣｏ　Ｃｌ　２　０　、　０１
　ｇ　／リットルおよびクロトンアミド２ｇ／リットル
を添加してなる培地４００ｍ１を１リツトルの坂ロフラ
スコ中に入れ、Ｊ−１株を接種し、そして振とう機上で
２８℃で培養した。培養３０時間と６０時間後に、クロ
トンアミドを０．２％（ｗ／ｖ）（８００ａ＋ｇ／４０
０ｍ１）添加して培養を続け、培養開始から８０時間の
時点で培養を終えた。 菌体を遠心分離機（日立５ＣＲ２ＯＢ）で、１２ｔＪＯ
Ｏｇにて１５分間遠心分離することによって採取し、０
，８５％ＮａＣｌで洗浄し、再び遠心分離し、同波の４
０ｍ１中に再び懸濁させた。 その懸濁液の少量の試料を取り、その中の菌体の乾燥！
ｌＩ！瓜を測定するのに用いた。 乾燥菌体２．３３ｍｇ相当を含む該懸濁液を１０ｍ　Ｍ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，０）と４．５７Ｍの濃
度の３−シアノピリジンを含む反応ｒｌ＆（４ｍｌ）に
加え、さらに反応開始３時間および６時間後に、それぞ
れ０．５５Ｍおよび０．４９Ｍの３−シアノピリジンを
添加して、２５℃で一夜反応を行った。ｔ８養開始から
１８時間後の生成ニコチン酸アミドの量は、５．　５８
Ｍであった。従って、転換率は９９．５９６であって、
ｆ３ｉ％３ｔリットル当り６８１ｇのニコチン酸アミド
が＃積されたことに対応する。この濃度では反応混合物
はニコチン酸アミドの析出によって同化した。 なお、生成ニコチン酸アミドの同定は、これを結晶とし
て分離して、元素分析、ＩＲ，ＮＭＲおよび質量分析に
よって行なった。ニコチン酸の生成は検出されなかった
。 実施例３ 実施例２で得た菌体懸濁／＆（乾燥菌体２，３３１１１
ｇ相当）を１０ｍＭリン酸カリウムＲ＆ｊ液（ｐｆ（８
，０）と種々の濃度のシアノピラジンを含む反応液（４
ｍｌ）に加えた。反応は２５℃で行い、６時間の反応で
４Ｍのシアノピラジンが、また９時間の反応で６Ｍのシ
アノピラジンが、１００％の転換率でピラジンアミドに
転換された。一方、前記の２．３３ｆｆｇの代りに乾燥
重量４．６６＋ｎｙに相当する菌体を含む懸ＥＪ液を同
様の反応液（４ｍｌ）に加えた場合は、６時間の反応で
７Ｍのシアノピラジンが、９時間の反応で８Ｍのシアノ
ピラジンが、１００９６の転換率でピラジンアミドに転
換された。 ピラジンカルボン酸の生成は認められなかった。 ピラジンアミドは、それが生成するにつれて溶液から晶
出した。この結晶性沈澱物を直接回収し、メタノールか
ら＋Ｉｒ結晶させた。この結晶は元素分析、ＩＲ，ＮＭ
Ｒおよび質量分析によりピラジンアミドと同定された。 なお、シアノピラジン、ピラジンアミドおよびピラジン
カルボン酸の分Ｉｎは高速液体クロマトグラフィーによ
って行なった。 以下の実施例においても本実施例と５１丹、１ｔに、７
）Ｆｒ′Ｉを行った。 実施例４ 実ｈ＆例２で得た菌体懸濁液（乾燥菌体４．６６ｍｇ相
当）を１１０１１Ｉリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，０
）と３Ｍのメタクリロニトリルを含む反応液（４ｍｌ）
に加え、さらに反応開始１時間および３時間後に、それ
ぞれ３Ｍのメタクリロニトリルを添加し、２５℃で反応
を行なったところ、反応開始１２時間後に９Ｍのメタク
リルアミドが１００％の転換率で生成した。 また、上記反応において、反応開始５時間後にさらにＩ
Ｍのメタクリロニトリルを添加したところ、反応開始２
４時間後に１ＯＮ１のメタクリルアミドが１００％の転
換率で生成した。ＩＯＭ濃度は、反応液１リットル当り
８５１ｇのメタクリルアミドが生成、蓄積されたことに
なる。 この反応液を水で希釈し、遠心分離処理（１２０００Ｆ
ｒ１５分間）により菌体を除去し、エバポレーターで濃
縮、結晶化させ、次いでこの結晶を水に溶解して再結晶
させることによりメタクリルアミドの結晶を得た。 実施例５ 実施例２で１４た菌体懸濁液（乾燥菌体４．６６ｍｇ相
当）を１０１１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐｌ＋８．　
０）とＩＭのクロトンニトリルを含む反応液（４ｍｌ　
）に加え、さらに反応開始後１時間毎にＩＭのクロトン
ニトリル ℃で反応を行なったところ、反応開始６時間後に６Ｍの
クロトンアミドが１００％の転化率で生成した。さらに
、反応開始６時間および１０時間後に、それぞれ１〜１
のクロトンニトリルを添加したところ、反応開始１０時
間および２２時間後に、それぞれ７Ｍおよび８Ｍのクロ
トンアミドが１　Ｆ’）　ｔ−１　９にの転換率で生成
した。８　Ｍ　＞０度は、反応ｉｆｋ　１リツトル当た
り６８１ｇのクロトンアミドが生成、蓄積されたことに
なる。 クロトンアミドの結晶化は実施例４と同様に行った。 実施例６ 実施例２で得た菌体懸濁液（乾燥菌体４．６６ｍｇ　Ｈ
ｊ当）をＩＬｌｄリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．　　
０）と３Ｍのアセトニトリルを含む反応液（４ｍｌ）に
加え、さらに反応開始１１１，１問および３＋１！ｊ間
後にそれぞれ３Ｍ，および反応開始６時間後に５Ｍ１の
アセトニトリルを添加して２５℃で反応を行ったところ
、反応開始１２時間後に１４Ｍのアセトアミドか１００
％の転換率で生成した。 すなわち、反応液１リツトル当たり８２７ｇのアセトア
ミドか生成、蓄積されたことになる。 この反応液を水で希釈し、遠心分離処理して菌体を除き
、その上澄液をエバポレーターにより濃縮、乾固し、こ
れをメタノールに溶解して結晶化させることによりアセ
トアミドの結晶を得た。 実施例７ 実施例２で得た菌体懸濁液（乾燥菌体４．６６ＩＩ１ｇ
相当）を１０１ｍＭリン酸カリウム緩種ｉｌ庄（ｐＨ８
，０）と３〜１の３−ヒドロキンプロピオニトリルを含
む反応液（４ｍｌ）に加え、さらに反応開始後１時間毎
に３Ｍの３−ヒドロキシプロピオニトリルを４回添加し
て２５℃で反応を行ったところ、反応開始５時間後に１
５Ｍの３−ヒドロキシプロピオアミドが１００％の転換
率で生成した。 ここでさらに３Ｍの３−ヒドロキンプロピオニトリルを
添加したところ、反応開始１１時間後に１８Ｍの３−ヒ
ドロキシプロピオアミドが１００９６の転換率で生成し
た。すなわち、反応液１リットル当たり１６００　ｇの
３−ヒドロキシプロピオアミドか／１−成、蓄積された
ことになる。 この反応液を水で希釈し、菌体を遠心分離で除去したの
ち、エバポレーターにより濃縮し、２０℃で結晶化させ
、次いでこの結晶をイソプロパツールに溶解して再結晶
させることにより３−ヒドロキシプロピオアミドの結晶
を得た。 実施例８ 前記培地Ｃ１：ＣｏＣ１っ　０．０１ｇ／リットルおよ
びクロトンアミド２ｇ／リットルを添加してなる培地４
００ｍ１を１リツトルの坂ロフラスコＩＩに入れ、Ｊ−
１株を接種し、そして振とう機上で２８℃で培養した。 培養２６時間と５６時間後に、クロトンアミドを０．２
％（ｗ／ｖ）（８００ｍｇ／　４００ｍ１）添加して培
養を続け、培養開始から７６時間の時点で培養を終えた
。 菌体を遠心分離機（日立５ＣＲ２ＯＢ）で、１０　（１
０（１ｇにて２０分間遠心分離することによって採取し
、０．８５％ＮａＣ１で洗浄し、再び遠心分離し、固液
の４０ｍ１中に再び懸濁させた。 その懸？４液の少量の試ｆ４を取り、その中の菌体の乾
燥重量を測定するのに用いた。 乾燥菌体２．　９６ｍｇｔ１１当を含む該懸濁液を１０
ｍＭリン酸カリウム暖衝液（ｐＨ８，０）と種々の濃度
の３−シアノピリジンを含む反応液（４ｍｌ　）に加え
た。反応は２５℃で行い、９時間の反応で８Ｍの３−シ
アノピリジンが、また２２時間の反応で９Ｍの３−シア
ノピリジンが、１００％の転換率でニコチン酸アミドに
転換された。一方、前記の２．９６ｒＡｇの代りに乾燥
型ｕ５．９２ωｇに相当する菌体を含む＠濁液を同様の
反応液（４ｍｌ　）に加えた場合は、５時間の反応で９
Ｍの３−シアノピリジンが、９時間の反応で１２Ｍの３
−シアノピリジンが、１００％の転換率でニコチン酸ア
ミドに転換された。１２〜１４度は、反応ｌｌｋ　１リ
ットル当り１，４６５ｇニコチン酸アミドが生成蓄積さ
れたことになる。ニコチン酸の生成は認められなかった
。 ニコチン酸アミドは、それが生成するにつれて溶液から
晶出した。この結晶を回収し、メタノールから再結晶さ
せた。 実施例９ 実施例８で得た菌体懸濁液（乾燥菌体５，９２ｍｇ相当
）を１０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，０）と１
Ｍのベンゾニトリルを含む反応液（４ｍｌ　）に加え、
さらに反応開始１．２．３．４．５および７時間後に、
それぞれＩＭのベンゾニトリルを添加し、２５℃で反応
を行なったところ、反応開始２４時間後に７Ｍ　（８４
８ｇ／リットル）のベンズアミドが１００％の転換率で
生成した。 実施例１０ 実施例８で得た菌体懸濁液（乾燥菌体５．９２１１１ｇ
　Ｈｊ当）を１０ｄリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ１８，
０）と０．５Ｍの２，６−シフルオロベンゾニトリルを
含む反応液（４ｍｌ）に加え、さらに反応開始２．４．
６および８時間後に、それぞれ０．５Ｍの２，６−シフ
ルオロペンゾニトリルを添加し、２５℃で反応を行なっ
たところ、反応開始２２時間後に２．５Ｍ　（３９３ｇ
／リットル）の２，６−シフルオロペンズアミドが１０
０　％の転換率で生成した。 実施例１１ 実施例８で得た菌体懸濁液（乾燥菌体５，９２ａｔｇ相
当）を１０ＩＩＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，０）
とＩＭの２−チオフエン力ルボニ］・リルを含む反応液
（４ｍｌ　）に加え、さらに反応開始１時間後に、ＩＭ
の２−チオフェンカルボニトリルを添加し、２５℃で反
応を行なったところ、反応開始５時間後に２Ｍ　（２５
４ｇ／リットル）の２−チオフェンカルボキサミドが１
００％の転換率で生成した。 実施例１２ 実施例８で得た菌体懸濁液（乾燥菌体５．９２ｍｇ相当
）を１０ａ＋Ｍリン酸カリウム緩衝液（ρ１１８．　０
）とＩＭの２−フロニトリルを含む反応液（４ｍｌ）に
加え、さらに反応開始１．２．４．６．８．１１および
２３時間後に、それぞれＩＭの２−フロニトリルを添加
し、２５℃で反応を行なったところ、反応開始３０時間
後に８Ｍ　（８８８ｇ／リットル）の２−フランカルボ
キサミドが１００％の転換率で生成した。 実施例１３ 実施例８で得た菌体懸濁液（乾燥菌体５．９２ｍｇ）Ｉ
ｆ当）を１Ｏｎ＋Ｉ４リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８，
０）と４Ｍの３−インドールアセトニトリルを含む反応
液（４ｍｌ）に加え、２５℃で反応を行なったところ、
反応開始２４時間後に４Ｍ（６９７ｇ／リットル）の３
−インドールアセトアミドが１００％の転換率で生成し
た。 実施例１４ 実施例２で得た菌体懸濁ｉｔ＆′（乾燥菌体４，６６１
１１ｇ相当）を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８
，Ｏ）と３Ｍのアクリロニトリルを含む反応ｉｆｆｌ（
４ｍｌ）に加え、さらに反応開始０，５、ｌおよび２時
間後に、それぞれ２Ｍのアクリロニトリルを添加し、２
５℃で反応を行なったところ、反応開始８時間後に９Ｍ
　（６４０ｇ／リットル）のアクリルアミドが１００９
６の転換率で生成した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微生物由来のニトリルヒドラターゼ酵素の作用によ
   ってニトリルを水和してこれを対応するアミドに変換す
   る方法において、該ニトリルヒドラターゼが、ロドコッ
   カス属ロドクロウス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈ
   ｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）の微生物をコバルトイオン存在下
   に培養して得たものであることを特徴とする、アミドの
   生物学的製造法。 ２、微生物が、ロドコッカス属ロドクロウス種のＪ−１
   株（ＦＥＲＭＢＰ−１４７８号）である、請求項１記載
   のアミドの生物学的製造法。 ３、ニトリルが、芳香環を形成する炭素数が４〜１０の
   芳香族ニトリルである、請求項１〜２のいずれか１項記
   載のアミドの生物学的製造法。 ４、芳香族ニトリルが、下記の一般式〔 I 〕〜〔VI〕
   で示される化合物のいずれかである、請求項３記載のア
   ミドの生物学的製造法。 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔II〕 （ここで、Ｒ＾１およびＲ＾２は、それぞれＨ、ＣＨ＿
   ３、ＯＨ、ＯＣＨ＿３、Ｃｌ、Ｆ、ＣＮ、ＮＨ＿２また
   はＮＯ＿２である） ▲数式、化学式、表等があります▼〔III〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔IV〕 （ここで、ＸはＳまたはＯである） ▲数式、化学式、表等があります▼〔Ｖ〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔VI〕 ５、芳香族ニトリルが２−シアノピリジン、３−シアノ
   ピリジンまたは４−シアノピリジンである、請求項４記
   載のアミドの生物学的製造法。 ６、芳香族ニトリルが３−シアノピリジンである、請求
   項５記載のアミドの生物学的製造法。 ７、芳香族ニトリルがシアノピラジンである、請求項４
   記載のアミドの生物学的製造法。８、ニトリルが、炭素
   数２〜６の脂肪族ニトリルである、請求項１〜２のいず
   れか１項記載のアミドの生物学的製造法。 ９、炭素数２〜６の脂肪族ニトリルが、アクリロニトリ
   ルである、請求項８記載のアミドの生物学的製造法。