JP2005348674A - ロドコッカス属細菌由来トリメトプリム耐性ジヒドロ葉酸還元酵素及びその遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】宿主微生物にトリメトプリム耐性を付与する活性を有するタンパク質または該タンパク質をコードする遺伝子DNA。宿主微生物にトリメトプリム耐性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子DNA。更に、該遺伝子DNAを有する組換えベクター、及び該ベクターを有する形質転換体または形質導入体。
【選択図】なし
Description
このような状況下、本発明者らは、先に、ロドコッカス属の宿主ベクター系の開発を行うべく、あるロドコッカス ロドクロウス種の菌株より潜在性プラスミドを見い出し、複合プラスミドベクターを構築した(特許文献5〜7参照)。セルフクローニング系及びナチュラルオカレンス系プラスミドの構築のために、ロドコッカス属由来のマーカーとなり得る遺伝子が特許文献8、特許文献9および非特許文献1に提案されている。これら文献には、ロドコッカス ロドクロウス種由来のカナマイシン耐性遺伝子、カドミウム耐性遺伝子および砒酸耐性遺伝子について記載されている。しかしながら、ロドコッカス(Rhodococcus) 属細菌由来のトリメトプリム耐性遺伝子についてはこれまで記載がない。
(1)下記の(A)及び(B)から選択されるタンパク質であって、宿主微生物にトリメトプリム耐性を付与する活性を有するタンパク質。
(A)配列番号1または配列番号3記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。(B)配列番号1または配列番号3記載のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。(2)ロドコッカス(Rhodococcus)属細菌由来である(1)記載のタンパク質。(3)(1)または(2)記載のタンパク質をコードする遺伝子DNA。(4)下記の(a)及び(b)から選択されるDNAであって、宿主微生物にトリメトプリム耐性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子DNA。
(a)配列番号2または4記載の塩基配列からなる遺伝子DNA。
(b)配列番号2または4記載の塩基配列からなる遺伝子DNAであってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子DNA。(5)ロドコッカス(Rhodococcus)属細菌由来である(3)または(4)に記載の遺伝子DNA。(6)(3)〜(5)のいずれかに記載の遺伝子DNAを有する組換えベクター。(7)(3)〜(5)のいずれかに記載の遺伝子DNAおよびロドコッカス属細菌で複製増殖可能なDNA領域を有する組換えベクター。(8)(6)〜(7)のいずれかに記載の組換えベクターからロドコッカス属細菌由来DNA以外のDNA領域が除かれたセルフクローニング型プラスミド。(9)(6)〜(8)のいずれかに記載のベクターを有する形質転換体または形質導入体。
トリメトプリムは葉酸のアナログであり、細菌のジヒドロ葉酸還元酵素の拮抗阻害剤として知られている。ロドコッカス属細菌においては、トリメトプリム耐性に関する知見はなく、様々なロドコッカス属細菌を探索した結果、ある種のロドコッカス属細菌に高いトリメトプリム耐性を示すものがあることを見いだした。
ATCC19140 株由来トリメトプリム耐性遺伝子のクローニング
(1) ATCC19140 株染色体DNAの調製とDNAライブラリーの作製
ATCC19140 株を 100mlのMY培地(0.5%ポリペプトン、 0.3%バクトイーストエキス、 0.3%バクトモルトエキス)中、30℃にて振盪培養し、Saito and Miura の方法〔Biochim. Biophys. Acta 72, 619 (1963) 〕により染色体DNAを分離した。この一部を制限酵素EcoRIで分解後、ベクター pUC119の EcoRI部位に挿入し、大腸菌JM109株に導入することによりDNAライブラリーを作製した。DNAの大腸菌JM109株への導入は塩化カルシウム法により行った。
工程(1) で調製したライブラリーより、トリメトプリム耐性を示すようになった大腸菌JM109株形質転換体を選別した。選別は以下のようにして行った。
トリメトプリム塩酸塩(200μg/ml)とIPTG(イソプロピル−β−チオガラクトシド)(1mM)を含むM9-カザミノ酸・チアミン寒天培地(0.6% Na2HPO4、0.3% KH2PO4、0.05% NaCl、0.01% NH4Cl、0.01% MgSO4・7H2O、0.4% グルコース、2μg/ml チアミン、カザミノ酸1.5%寒天)に作製した形質転換体を塗布し、37℃にて一晩培養を行った。出現したコロニーを取り、同寒天培地にストリークし、生育することを確認した。
こうして得られた形質転換体からプラスミドDNAをFlexiPrep Kit(アマシャム・ファルマシア社)で調製し、これをpFY605と名付けた(図1)。pFY605は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1中央第6) に平成16年5月26日付で受領されており、その受領番号はFERM AP-20063である。プラスミドpFY605により形質転換された大腸菌JM109株はIPTG非存在下ではトリメトプリム耐性を示さず、IPTG存在下で耐性を示した。pFY605はATCC19140株由来の約3KbのEcoRI断片を含んでいた。
工程(2) で得られたプラスミドpFY605中のATCC19140株由来約3 KbのDNA断片の塩基配列をABI PRISM 3100を用いて決定した。本断片中に含まれるOpen Reading Frame(ORF)のアミノ酸配列(配列番号1)をGenBankに対してホモロジー検索を行った結果、Mycobacterium tuberculosis由来ジヒドロ葉酸還元酵素と51%一致することがわかった。本断片中に含まれるORFの塩基配列を配列番号2に示す。
ATCC14348 株由来トリメトプリム耐性遺伝子のクローニング
(1) ATCC14348 株染色体DNAの調製とDNAライブラリーの作製
実施例1と同様にして、染色体DNAを調製後、染色体DNAを制限酵素SacIで部分分解し、ベクター pUC119の SacI部位に挿入し、大腸菌JM109株に導入することによりDNAライブラリーを作製した。
実施例1と同様にして、形質転換体を選別し、それから得られたプラスミドをpTP013と名付けた(図2)。pTP013は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1中央第6) に平成16年5月26日付で受領されており、その受領番号はFERM AP-20064である。プラスミドpTP013により形質転換された大腸菌JM109株はIPTG非存在下ではトリメトプリム耐性を示さず、IPTG存在下で耐性を示した。pTP013はATCC14348株由来の約3.4 KbのSacI断片を含んでいた。
工程(2) で得られたプラスミドpTP013中のATCC14348株由来約3KbのDNA断片の塩基配列をABI PRISM 3100を用いて決定した。本断片中に含まれるORFのアミノ酸配列(配列番号3)をGenBankに対してホモロジー検索を行った結果、Neisseria gonorrhoeae由来ジヒドロ葉酸還元酵素と56%一致することがわかった。本断片中に含まれるORFの塩基配列を配列番号4に示す。
ロドコッカス ロドクロウス由来トリメトプリム耐性遺伝子を用いた大腸菌−ロドコッカス属複合プラスミドベクターの作製
本発明者らが先に作製した複合プラスミドベクター pK4〔JM109/pK4は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1中央第6)にFERM BP-3731として寄託:ロドコッカス属プラスミドpRC004と大腸菌ベクターpHSG299 を連結したもの(特開平5-64589 号および同5-68566 号公報参)〕からpRC004領域の全部とpHSG299 の一部を含む3.1kb HindIII 断片を得、これをpPT013のHindIII部位に連結したプラスミドを作製しpTP014、pTP015と命名した(図3)。pTP014は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1中央第6) に平成16年5月26日付で受領されており、その受領番号はFERM AP-20065である。pTP015は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1中央第6) に平成16年5月31日付で受領されており、その受領番号はFERM AP-20069である。
これらのプラスミドはロドコッカス属および大腸菌において機能する二つの複製開始点を有する。これらのプラスミドを用いロドコッカス ロドクロウス ATCC 12674を電気パルス法により形質転換したところ、トリメトプリム(200μg/ml)を含むM9-カザミノ酸・チアミン寒天培地で生育可能な形質転換体が得られた。形質転換体よりプラスミドを調製したところ、導入したものと同様のプラスミドが得られた。ロドコッカス属細菌を宿主とした場合には、トリメトプリム耐性の発現にIPTGを必要としなかった。
セルフクローニング型プラスミドの作製
pTP015を制限酵素EcoRIで切断し、アガロースゲル電気泳動によって約6 Kbのバンドをゲルから回収した。ゲルから回収したDNAにセルフライゲーション反応を行い、ロドコッカスロドクロウスATCC12674に電気パルス法により導入したところ、トリメトプリム(200μg/ml)を含むM9-カザミノ酸・チアミン寒天培地で生育可能な形質転換体が得られた。形質転換体よりプラスミドを調製したところ、pTP015から大腸菌由来ベクター部分が存在しないセルフクローニング型プラスミドが得られた。
Claims (9)
- 下記の(A)及び(B)から選択されるタンパク質であって、宿主微生物にトリメトプリム耐性を付与する活性を有するタンパク質。
(A)配列番号1または配列番号3記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号1または配列番号3記載のアミノ酸配列において1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。 - ロドコッカス(Rhodococcus)属細菌由来である請求項1記載のタンパク質。
- 請求項1または2記載のタンパク質をコードする遺伝子DNA。
- 下記の(a)及び(b)から選択されるDNAであって、宿主微生物にトリメトプリム耐性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子DNA。
(a)配列番号2または4記載の塩基配列からなる遺伝子DNA。
(b)配列番号2または4記載の塩基配列からなる遺伝子DNAであってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子DNA。 - ロドコッカス(Rhodococcus)属細菌由来である請求項3または4に記載の遺伝子DNA。
- 請求項3〜5のいずれかに記載の遺伝子DNAを有する組換えベクター。
- 請求項3〜5のいずれかに記載の遺伝子DNAおよびロドコッカス属細菌で複製増殖可能なDNA領域を有する組換えベクター。
- 請求項6〜7のいずれかに記載の組換えベクターからロドコッカス属細菌由来DNA以外のDNA領域が除かれたセルフクローニング型プラスミド。
- 請求項6〜8のいずれかに記載のベクターを有する形質転換体または形質導入体。
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