JPH04148685A - 環状プラスミド - Google Patents

環状プラスミド

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JPH04148685A
JPH04148685A JP27037790A JP27037790A JPH04148685A JP H04148685 A JPH04148685 A JP H04148685A JP 27037790 A JP27037790 A JP 27037790A JP 27037790 A JP27037790 A JP 27037790A JP H04148685 A JPH04148685 A JP H04148685A
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plasmid
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rhodococcus
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microbes
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Fujio To
不二夫 湯
Yoshihiro Hashimoto
好弘 橋本
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なプラスミドに関し、さらに詳しくはRh
odococcus属に属する微生物に由来する新規な
環状プラスミドに関する。
〔従来の技術と問題点〕
Rhodococcus属に属する微生物は、ニトリル
類を水和して対応するアミド類を生産するための微生物
触媒として知られており、またRhodococeus
rhodochrous種に属する微生物が極めて高性
能のニトリル水和活性を有することが知られている。
このような状況下、Rhodococcus属の宿主−
ベクター系の開発が以前から期待されていた。しかしな
がら、Rhodococcus属に属する菌株について
はこれらの微生物を宿主とするに適したベクターの開発
は遅れており、Rhodococcus属においてプラ
スミドの見いだされた株はRhodococcus s
p、 HI3−^株(J、 Bacteriol、 1
70.683−645 (1988)  )をはしめ僅
か数株にすぎない、そのため、さらに、Rhodoco
ccus属に属する菌株から工業的に利用し得る微生物
を育種、改良するための新しいベクターの開発が強く要
望される。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者らはRhodococcus iiに属する菌
株を用いて工業的に有用な宿主−ベクター系を開発すべ
く鋭意研究を行った結果、該属に属する微生物から工業
的に有用な宿主−ベクター系におけるベクターとして利
用可能な新規な環状プラスミドを見い出し、本発明を完
成した。
すなわち、本発明は、大きさが約2.6kbであり、制
限酵素切断部位数がSacI:2、BamHl:l、P
vuII:1、Sca I : 1,5phI:1およ
びXhol:1であることを特徴とする、Rhodoc
occus属に属する微生物由来の環状プラスミドであ
る。
本発明の環状プラスミドは、具体的には、例えばRho
dococcus rhodochrous ATCC
4276、ATCC14349およびATCC1434
8から得ることができ、いずれも、大きさが約2.6k
bで且つ下記第1表に示す制限酵素に対する分解特性を
有する新規な環状プラスミドである。以下これらのプラ
スミドを、それぞれ、pRcOOl、pRcOO2、p
RC003と称する。
第 1表 次に本発明の実施例を示す。
実施例1 (+)ブースミ′の Rhodococcus rhodochrous A
TCC4276% ATCC14349およびATCC
1434Bを、それぞれ400m1のMY培地(ポリペ
プトン0.5χ、バクトイ−ストエキス0.3χ、マル
ツエキス0.3χ、グルコース1χ)ニテ培養を開始す
ル、 OD660=0.15〜0.2(7)頃にヘニ’
i !77 G 0.50/mlを加える。 0D66
0=1.0まで培養後、遠心により菌体を回収する。菌
体を40m1 T  E  S  (10mM  Tr
is−HCI(pH8)、 10mM  NaC11+
eM EDTA>tSS液液洗浄後、11−1の50m
M Tris−HCI(pH8)/12.52 シェー
クロース/loomM NaC1/1mg/mlリゾチ
ームに懸濁し、37°Cにて3時間振盪する。
これに0.6mlの0.5M EDTA 、 2.4m
l の5M NaCl、4.41の4χ50S−0,7
M NaCl を順次加え、緩やかに混合し氷上で18
時間静置する。4°Cにて65.OOOxgで1時間遠
心し上清を得、これに50χポリエチレングリコール(
MW = 6.000)を4.61加える。氷上で3時
間静置し、1 、 OOOxgで5分遠心する。沈澱物
を51のTBS緩衝液に溶解し、CsC1を7.5g、
1.5 mg/ml 臭化エチジュウムーTBS緩衝液
を2−1加え混合した。この溶液を42時間130. 
OOOxgの密度勾配遠心分離にかけた。
紫外線照射により検出されたプラスミド画分を分取した
後、n−ブタノールで処理し臭化エチジュウムを除いた
。TEIl街液(40+mM Tris−HCI(pH
8)、1mM EDTA)に対して透析後、エタノール
沈澱により精製プラスミド画分を得た。これを0.7χ
アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルを臭化エチジュウ
ムで染色することによりプラスミドの存在を確認した。
(2)ブースミ の 上記のように調製したプラスミドの一部を0.7χアガ
ロースゲル電気泳動に供した。この際、サイズマーカー
として大腸菌プラスミドpUc1B、pUcllB、p
BR322(各々2.69kb、 3.16kb、4.
36kb)を同時に泳動した。Rhodococcus
rhodochrous ATCC4276、ATCC
14349およびATCC14348から得られたプラ
スミドは、それぞれpRCool、pRcOO2および
pRcOO3と命名され、アガロースゲル電気泳動から
求められた大きさは、すべて約2.6kbであった。
(3)       による 上記のように調製したプラスミドの一部を各種制限酵素
と反応させ、反応終了後、反応液を0.7χアガロース
ゲル電気泳動および5χアクリルアミドゲル電気泳動に
より分析した。サイズマーカーとしてはラムダファージ
DNAのHindl[[消化物およびPstl消化物を
用い、プラスミドの各制限酵素断片のサイズを算出した
。pRcOOl、pRcOO2およびpRcOO3は第
2表に示すような同一の制限酵素切断特性を示した。
第2表
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明のプラスミドpRcOO1、pRcO
O2およびpRcOO3の制限酵素切断地図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、大きさが約2.6kbであり、制限酵素切断部位数
    がSac I :2、BamH I :1、PvuII:1、S
    ca I :1、Sph I :1およびXho I :1であ
    ることを特徴とするRhodococcus属に属する
    微生物由来の環状プラスミド。 2、微生物がRhodococcusrhodochr
    ousATCC4276、ATCC14349およびA
    TCC14348である請求項2記載の環状プラスミド
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