CN111110838A

CN111110838A - 一种罗非鱼无乳链球菌疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN111110838A
Application number: CN201911345099.8A
Authority: CN
Inventors: 梁芳; 叶剑敏; 郭政
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2020-05-08

Abstract

本发明涉及一种罗非鱼无乳链球菌疫苗及其制备方法，通过生物信息学原理分析和筛选了无乳链球菌的一个表面锚定蛋白的部分多肽序列作为疫苗制备的抗原，并且利用借助化学合成技术构建碳纳米管载表面蛋白系统，将候选出的多肽抗原与功能化单壁碳纳米结合制备罗非鱼无乳链球菌亚单位疫苗。本发明筛选的多肽抗原可比灭活疫苗更为显著地提高被接种的罗非鱼的抗体水平，并可抵抗高毒力的无乳链球菌攻击。并且，本发明筛选的多肽抗原能够紧密、均匀地连接于功能化修饰的碳纳米管表面，与单独的多肽抗原组对比，能够显著提高罗非鱼的免疫力。

Description

一种罗非鱼无乳链球菌疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及水产疫苗领域，尤其涉及种罗非鱼无乳链球菌疫苗及其制备方法。

背景技术

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)是一种革兰氏阳性球菌，最初常因引起奶牛乳腺炎，造成奶产量下降而引起关注川。随后在许多国家的孕产妇和新生儿中分离到无乳链球菌，常引发新生儿肺炎、脑膜炎和败血症等，严重的导致死亡。随着世界水产养殖业的发展，在水生动物体内也频繁分离到无乳链球菌，尤其是自2007年以来，该菌每年都在我国广东、海南、福建、广西等罗非鱼主要养殖区暴发流行，发病率高达10％-30％，死亡率高达25％-80％,严重威胁着我国罗非鱼产业链的健康发展。

鱼类可能通过养殖环境或鱼体间的直接接触而感染链球菌。链球菌能引起鱼的脑神经受破坏，进而通过血液循环引发肾、肝、脾等器官出血坏死。进入体内的链球菌被吞噬细胞吞噬后，进入免疫生发中心。链球菌的大量繁殖不仅损伤吞噬细胞，而且会摧毁免疫组织、破坏免疫系统，其破坏程度不亚于人类感染艾滋病病毒。

当罗非鱼链球菌病暴发时，抗菌药物治疗是目前用于治疗链球菌感染的常见方法，但由于多数药物的休药期都比较长，可能会出现已经治愈的罗非鱼上市时，鱼体内的抗生素仍可检测到残留成分。同时，从近年对无乳链球菌耐药菌株的分析来看，不少地区的无乳链球菌已对部分抗生素产生耐药性。因此，从罗非鱼链球菌病的防控上来看，罗非鱼无乳链球菌的疫苗开发研究，就显得尤为迫切。

目前，鱼类疫苗一般分为传统疫苗和新型疫苗。传统疫苗是采用病原微生物及其代谢产物，经过人工减毒、脱毒、灭活等方法制成的疫苗。传统疫苗分为灭活疫苗和弱毒疫苗。灭活疫苗是指采用加热或化学制剂(通常是福尔马林)等方法去除强毒病原的感染性，但保留其免疫原性的疫苗。该类疫苗制备简单、成本低廉，但成分较复杂，可能对免疫机体产生较大的应激反应；弱毒疫苗是指用致病性己大为减弱的菌株或变异的弱毒株制备的疫苗，它有较好的免疫原性，可通过类似于自然感染使受免对象产生免疫能力，且免疫剂量小、免疫持续期长，但缺点是存在毒力反强的风险。基因工程疫苗是用分子生物学技术对病原微生物的基因组进行改造，以降低其致病性，提高其免疫原性，或者将病原微生物基因组中的一个或多个对防病、治病有用的基因克隆到无毒的原核或真核表达载体上制成的疫苗，接种动物产生免疫力和对感染性疾病的抵抗力，达到防控疾病的目的。基因工程疫苗是随着DNA重组技术的出现而出现的一类新型疫苗的总称，主要包括有基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗和活载体疫苗等。与传统疫苗相比，基因工程疫苗无致病性，且成本低、可制备多价疫苗、适用于各种病原等多方面的优越性，显示出广阔的开发与应用前景。

亚单位疫苗主要优点有:疫苗只含有病原体一种或几种特定成分，化学性质和免疫特性更稳定；化学结构可知，可以进一步设计和改造以激发特定的免疫反应；感染成分被除去，不存在毒性或残余毒性回复的隐患。亚单位疫苗的研发已经受到水产疾病领域的重视，但其推广因生产成本较高、免疫原性较低及需佐剂配合提高免疫效果等因素而受限，所筛选的抗原种类更是亚单位疫苗免疫效果的重要因素。科研人员还通过调整基因组合、包入脂质体或胶囊微球、加入佐剂等方法增强其免疫原性，以克服比传统亚单位疫苗免疫效果差的缺点，故受到广泛关注和研究。

在水产养殖业中疫苗的免疫方式中主要有注射免疫、口服免疫和浸泡免疫这三种，其中浸泡免疫因成本低且适用于大规模的培养模式而受到格外关注，但由于生物的细胞屏障阻隔药物进入等原因也限制它的应用，因此寻求一种载体可递送药物于鱼类体内发挥药效的方式成为当今研究者的重要方向。

发明内容

针对无乳链球菌对罗非鱼生产危害大、造成的经济损失严重、安全有效疫苗匮乏和防控难度大等问题，本发明的目的在于提供一种在罗非鱼体内具有良好的免疫应答反应和免疫保护作用的罗非鱼无乳链球菌疫苗制备方法及由此制备的疫苗，该疫苗适用于大规模化、产业化应用。

首先，本发明提供了一种罗非鱼无乳链球菌疫苗制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)通过基因工程方法或人工合成方法获得氨基酸序列为SEQ ID NO：1的目的多肽；

(2)将单壁纳米管在450～500℃下加热30～40min，然后放入由浓硫酸和浓硝酸按照体积比3:1构成的混合酸液中，加热酸化处理，将碳纳米管混酸混合物经微孔滤膜抽滤、纯水洗涤至pH不再变化后干燥至恒重，获得氧化单壁碳纳米管；

(3)将所述氧化单壁碳纳米管加入纯净水中，在冰浴条件下超声30～40min，加入植物蛋白粉，冰浴条件下超声40～60min后，离心30～40min，取上层分散液并再冻干，低温保存，得到修饰后的氧化单壁碳纳米管；

(4)将所述目的多肽和步骤(3)所制备的修饰后的氧化单壁碳纳米管于PBS缓冲液中充分混匀，并超声处理，在35～40℃中搅拌；

(5)将步骤(4)所得的搅拌混合物放入100kDa透析袋中透析，离心收集样品，即得到所述罗非鱼无乳链球菌疫苗。

优选地，所述植物蛋白粉采用以下方法制备：

(1)将低温脱脂豆粕粉分散于去离子水中，调pH至7.8～8.0，低速搅拌后离心去除不溶物质；

(2)取上清液并调pH至4.2～4.5，静置后离心，收集沉淀物；

(3)将沉淀物复溶于去离子水中，调pH至7.0，搅拌至沉淀物充分溶解，得到中性蛋白溶液；

(4)中性蛋白溶液透析，干燥，备用。

优选地，步骤(3)中氧化单壁碳纳米管与植物蛋白粉的重量比为1：30。

优选地，所述氨基酸序列为SEQ ID NO：1的目的多肽通过基因工程的方法制备，所采用的引物如下：

正向引物：5’-GGGGGATCCACAAGTGATAAGAATACTGACACGA-3',反向引物：5’-GGGGTCGACACTTA ATG ATAACAGAATAATCCC-3'。

优选地，通过基因工程的方法制备所述氨基酸序列为SEQ ID NO：1的目的多肽时，所采用的重组载体为pET-32a，在大肠杆菌中经IPTG诱导表达。

优选地，经大肠杆菌诱导表达的目的多肽通过以下方式纯化：

(1)将大肠杆菌超声波破碎后，取上清，在12000r/min离心10min；

(2)将离心后的上清用0.22μm的滤膜过滤；

(3)在AKTA蛋白纯化系统上，以2mL/min的流速上样，再用结合缓冲液以3mL/min的流速对未结合到柱子上的杂蛋白进行清洗，最后用洗脱缓冲液以3mL/min流速对目的蛋白进行洗脱，在280nm紫外吸收峰处收集蛋白；

(4)用PBS缓冲液在脱盐柱进行脱盐处理。

另外，本发明还提供了一种罗非鱼无乳链球菌疫苗，其通过上述方法制备。

本发明的技术效果主要体现在：

(1)亚单位疫苗因其免疫原性较低及需佐剂配合提高免疫效果等因素而受限，所筛选的抗原种类更是亚单位疫苗免疫效果的重要因素。本发明通过生物信息学方法确定的氨基酸序列为SEQ ID NO：1的目的多肽能够有效刺激罗非鱼产生特异性抗体并对相应无乳链球菌的感染提供免疫保护。

(2)本发明的氨基酸序列为SEQ ID NO：1的目的多肽在原核表达系统大肠杆菌中表达量高且易于纯化，适于大规模生产。

(3)本发明利用碳纳米管负载疫苗，碳纳米管具有相对惰性、不产生免疫原性、无毒等优点，其负载的亚单位疫苗在机体内能够稳定存在，从而使抗原携带至机体中并发挥其免疫保护作用。而且，碳纳米管可修饰位点等结构特性能够高效地连接本发明的抗原。此外，碳纳米管负载疫苗进入机体后可以增加疫苗的持久性。

(4)由于未处理的碳纳米管难以在水和有机溶剂中稳定的分散，并且容易在水或有机溶剂中极易发生团聚，即使在高功率的超声波中分散，碳纳米管也只能得到短时间的比较均匀的分散，当停止超声几分钟后，碳纳米管将再次聚集并迅速下沉，这极大地限制了它应用。本发明对碳纳米管进行了功能化修饰，提高了其亲水性和分散性。

(5)在水产养殖业中疫苗的免疫方式中主要有注射免疫、口服免疫和浸泡免疫这三种，其中浸泡免疫因成本低且适用于大规模的培养模式而受到格外关注，但由于鱼类的皮肤屏障却限制了其发展。碳纳米管是一种可以穿透皮肤屏障的纳米材料，本发明将碳纳米管的穿膜特性与亚单位疫苗结合起来，可以实现罗非鱼的浸泡免疫。

附图说明

图1是本发明重组载体表达的多肽的纯化图。

图2是本发明纯化后的多肽的western-blotting检测图。

图3是单壁碳纳米管电镜图谱。

图4是经过功能化修饰碳纳米管与本发明的多肽结合后的电镜图谱。

图5是浸泡免疫后的免疫应答统计图。

图6是攻毒后浸泡模式下接种的罗非鱼的累积存活率统计图。

具体实施方式

实施例1：目的多肽的筛选

细胞表面蛋白数量众多，其不但与病原微生物的毒力、致病机制有关，还可组装成包含不同受体和效应蛋白的异质复合物，在细胞间具有传导作用，而且表面蛋白运动性强，更易被相应抗体所凝集。因此，免疫原性好的细胞表面蛋白必将为新型疫苗的研发提供更多、更好的选择。本申请利用生物信息学方法分别对GenBank上公布的被预测为具有免疫功能的无乳链球菌多个表面蛋白基因序列的功能结构位点、抗原表位区域进行分析，包括在http://tools.immuneepitope.org/bcell/在线对多个基因抗原表位的Bepipred线性表位、抗原性、β-Turn、表面可及性、柔韧性和亲水性进行分析，利用Signal P4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析多个基因的信号肽切割序列情况；蛋白功能域和基序分布情况利用NCBI的CDD v3.15在线分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)。

本研究筛选目的片段时，既采用了Bepipred多参数预测法，又进行了基因序列亲水性、可及性、柔韧性、抗原性和β转角等单一参数的预测，综合考量对抗原表位的预测具有积极作用。本申请中目的基因片段选取了Bepipred参数较高、亲水性强、可及性高、具有一定柔韧性、存在于细胞表面、β-Turn集中并去掉信号肽的区域。最终选定1个细胞壁表面锚定蛋白基因序列(GenBank序列号:CP000114.1)作为目标。

蛋白质分子量越大，形成的空间阻位就越多，蛋白质的表达就越难。对基因编码的氨基酸序列进行科学、准确的预测和筛选可大大缩小目的多肽片段的范围，有助于尽快找到具有免疫保护作用的特异性抗原区域，为基因的截短表达提供理论研究，为亚单位疫苗甚至表位疫苗的研制提供理论参考。

该无乳链球菌细胞壁表面锚定蛋白由192aa组成。CDD预测结果显示，其121-149aa属于mttA/Hcf106 family(PRK14859)结构域；158-188aa为LPXTG细胞壁锚定区域，其中159-163aa为该区域基序LPKTG。Bepipred线性表位区(阈值0.991)共4个，分别为27-36aa,54-104aa,108-110aa,128-167aa，抗原性区域(阈值0.991)共10个，分别为5-6aa,8-27aa,36-42aa,46aa,52aa,68aa,86-88aa,112-120aa,156-158aa,167-185aa；β转角区域(阈值为1.093)共10个，分别为20aa,22-36aa,53aa,55-99aa,103-112aa,121aa,126-130aa,138-155aa,161-167aa,183aa；表面可及性区域(阈值为1.000)共12个，分别为3aa,28-34aa,44-48aa,52aa,61-65aa,68-99aa,121aa,129-141aa,144-159aa,162-163aa,166aa,185-189aa；柔韧性区域(阈值为1.050)共5个，分别为4-5aa,29-35aa,44-48aa,52-113aa,128-164aa；亲水性区域(阈值为3.688)共8个，分别为28-36aa,43-45aa,47-48aa,53-105aa,107-111aa,121aa,128-155aa,161-167aa；第28位与29位为信号肽切割位点。根据上述分析，选取各参数较为重叠的29-183aa区间(共计465bp)作为目的多肽的表达区域，其具体氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

实施例2：利用基因工程方法制备目的多肽

2.1基因组DNA的制备

将罗非鱼源无乳链球菌扩增培养后，按照商业化细菌基因组提取试剂盒说明书操作，提取基因组DNA备用。

2.2 PCR的引物设计

根据基因序列抗原表位区预测结果，用primer5.0设计特异性引物，引物序列为:

正向引物：5’-GGGGGATCCACAAGTGATAAGAATACTGACACGA-3'(SEQ ID NO：2)。

反向引物：5’-GGGGTCGACACTTA ATG ATAACAGAATAATCCC-3'(SEQ ID NO：3)。

2.3扩增产物的回收与重组表达载体的构建

PCR扩增后，分离PCR产物，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。利用限制性核酸内切酶BamHI和SalI对PCR扩增基因进行双酶切处理，将其连接在以同样内切酶处理的原核表达质粒pET-32a(+)相应位点上。连接体系16℃恒温连接过夜。

2.4目的多肽表达

将重组菌种接种于琼脂糖平板上，培养过夜，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，180r/min振荡培养培养至OD600＝0.6时，加入IPTG在37℃诱导进行大量表达。超声波破碎后，取上清，在AKTA purifier 100蛋白纯化系统上进行表达蛋白的纯化，步骤如下:首先，将菌体上清12000r/min离心10min，然后再将离心后的上清用0.22μm的滤膜过滤；然后在入AKTA purifier 100蛋白纯化系统上，以2mL/min的流速上样，再用结合缓冲液以3mL/min的流速对未结合到柱子上的杂蛋白进行清洗，最后用洗脱缓冲液以3mL/min流速对目的蛋白进行洗脱，在280nm紫外吸收峰处收集蛋白，并以PBS溶液为缓冲液用脱盐柱进行脱盐处理，存储于-80℃备用。具体纯化结果如图1所示，可见获得了良好的可溶性表达和纯化效果。

2.5 Western blotting分析

纯化后的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，以经1:500稀释的兔抗罗非鱼无乳链球菌高免血清作为一抗，以1:2000稀释的以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体IgG作为二抗，进行Western blotting。

结果显示目的多肽能与抗无乳链球菌高免血清发生特异性结合，具有良好的免疫反应原性，重组蛋白大小分别在36kDa左右，与预测结果一致(结果如图2所示)。

实施例3：单壁碳纳米管的功能化修饰

将单壁碳纳米管样品在450℃加热30～40min，使样品中的无定型碳转变成CO₂。采用混酸氧化法，将上述空气氧化法处理的碳纳米管放入混酸(浓H₂S0₄:浓HNO₃＝3:1(V/V))中60℃加热酸化处理12h。碳纳米管混酸混合物经微孔滤膜抽滤、纯水洗涤至pH不再变化后，置于80℃条件下干燥至恒重，即可获得氧化单壁碳纳米管。

按1:15的料液比将低温脱脂豆粕粉分散于去离子水中，用2M NaOH调pH至8.0，低速搅拌2h后离心(8000g,20min,40℃)去除不溶物质，取上清液并用2M HCl调pH至4.5，静置20min后离心(8000g,20min,40℃)，收集沉淀，并将其复溶于5倍去离子水中，并用2M NaOH调pH至7.0，一直搅拌至沉淀充分溶解。最后将中性的蛋白溶液在40℃透析48小时，然后冷冻干燥，密封保存备用。本实验中制备的植物蛋白粉的蛋白质含量为92％。

将氧化单壁碳纳米管中加入去离子水(具体比例为1mg氧化单壁碳纳米管对应20ml去离子水)，在冰水浴条件下超声40min，加入植物蛋白粉，其中氧化单壁碳纳米管与植物蛋白粉的重量比为1:30，冰水浴超声1h后，以10000r/min速度离心30min，取上层分散液，冻干，保存备用。

经检测发现，未经任何处理的单壁碳纳米管在水体中长时间放置后会发生沉淀。氧化单壁碳纳米管有一部分沉淀在水中，一部分溶解在水中，因为经过酸化处理后，单壁碳纳米管在两端产生一些亲水基团，如羰基、羧基)，从而提高了一部分单壁碳纳米管的溶解性，且单壁碳纳米管中的金属催化剂以及无定形碳等杂质也被除去达到提纯效果。经过本发明的植物蛋白粉进一步修饰的氧化单壁碳纳米管几乎没有发生沉淀，具有良好的亲水性，能够很好地溶解在水中且稳定性良好。推测一方面是本发明植物蛋白粉的氨基酸中含有芳香基团，能够与氧化单壁碳纳米管表面上的C原子通过π-π堆积作用力结合，使得可溶性的天然大分子包覆或吸附在碳纳米管的表面，还修饰方式非但不会对碳纳米管的结构造成损伤，且反应条件温和。另一方面是本发明植物蛋白上的疏水氨基酸不像其他常见蛋白质那样位于蛋白质分子的内部，而是大部分暴露于外部，这使得疏水基团更容易结合到碳纳米管的疏水表面，与氧化单壁碳纳米管疏水表面间生物疏水作用力。

实施例4：疫苗制备

将实施例2制备的目的多肽和实施例3制备的功能性修饰氧化单壁纳米管于PBS(pH＝7.4)缓冲液中充分混匀，并超声处理2h,然后37℃搅拌2天；上述所得搅拌混合物放入100kDa透析袋中透析3天，之后离心收集样品，此产物即本发明的罗非鱼无乳链球菌疫苗。

通过扫描电子显微镜对以单壁碳纳米管为对照，本发明制备的碳纳米管负载的罗非鱼无乳链球菌疫苗样品为实验组，在10.0kV的加速电压下对样品进行成像。具体结构如图3和图4所示，单壁碳纳米管结合目的多肽后表面都比较粗糙且松散，能够明显看到表面有多肽附着在单壁碳纳米管上，进一步佐证本实验中单壁碳纳米管己经和多肽成功连接在一起。

实施例5：罗非鱼免疫

5.1浸泡免疫

(1)罗非鱼随机分成若干组，每组30尾；

(2)以BSA佐剂、氧化单壁碳纳米管作为对照组，实施例3制备的目的多肽样品、以及实施例4制备的碳纳米管负载的罗非鱼无乳链球菌疫苗样品作为实验组对罗非鱼进行浸泡免疫，终浓度为30mg/L；

(3)所述浸泡免疫方式为将疫苗完全分散于水体中，浸泡免疫处理6h后，更换新鲜水体饲养，免疫时间为28天。

5.2免疫相关基因检测

为了研究目的多肽或实施例4制备的碳纳米管负载的罗非鱼无乳链球菌疫苗对罗非鱼的免疫应答反应，浸泡免疫28天后，用qPCR技术检测七种免疫相关基因(Lyz,MHCI,MHCII,IL-1β,IL-8,IL-10和IL-I 5)的转录水平，具体操作方式见qPCR操作手册。目的多肽或实施例4制备的碳纳米管负载的罗非鱼无乳链球菌疫苗对罗非鱼免疫后七种免疫相关基因表达情况如下图5所示。可见，与对照组注射PBS对比，大部分免疫相关基因发生明显上调表达，目的多肽疫苗可使MHCII的转录相对于对照组急剧增加至20.3倍。与目标多肽免疫相比，实施例4制备的碳纳米管负载的罗非鱼无乳链球菌疫苗更显著增加了罗非鱼鱼的免疫反应，表明在本发明修饰后的碳纳米管的负载下，目标多肽在罗非鱼体内抗体应答反应发生增强作用。

5.3攻毒试验

在浸泡免疫后，取无乳链球菌活化且扩增后，用PBS稀释菌液至1×10⁵CFU/mL，此浓度为25倍罗非鱼半数致死量，每尾鱼注射20微升进行攻毒实验，每组鱼为30尾，三次重复。

结果如图6所示，跟对照组相比(最下面两条折线)，目标多肽(第3条折线)单独免疫罗非鱼其相对免疫保护率为55.6％左右，实施例4制备的碳纳米管负载的罗非鱼无乳链球菌疫苗较于单独注射多肽，可以提高其相对免疫保护率，其相对免疫保护率为76.2％左右。结果表明，在浸泡免疫模式下，本发明功能修饰后的碳纳米管作为载体显著提高了目标多肽在罗非鱼中对抗无乳链球菌的免疫保护作用。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110>华南师范大学

<120>一种罗非鱼无乳链球菌疫苗及其制备方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 155

<212> PRT

<213> 无乳链球菌 (streptococcus agalactiae)

<400> 1

Thr Ser Asp Lys Asn Thr Asp Thr Ser Val Val Thr Thr Thr Leu Ser

1 5 10 15

Glu Glu Lys Arg Leu Asp Glu Leu Asp Gln Ser Ser Thr Gly Ser Ser

20 25 30

Ser Glu Asn Glu Ser Ser Ser Ser Ser Glu Pro Glu Thr Asn Pro Ser

35 40 45

Thr Asn Pro Pro Thr Thr Glu Pro Ser Gln Pro Ser Pro Ser Glu Glu

50 55 60

Asn Lys Pro Asp Gly Ser Thr Lys Thr Glu Ile Gly Asn Asn Lys Asp

65 70 75 80

Ile Ser Ser Gly Thr Lys Val Leu Ile Ser Glu Asp Ser Ile Lys Asn

85 90 95

Phe Ser Lys Ala Ser Ser Asp Gln Glu Glu Val Asp Arg Asp Glu Ser

100 105 110

Ser Ser Ser Lys Ala Asn Asp Glu Lys Lys Gly His Ser Lys Pro Lys

115 120 125

Lys Glu Leu Pro Lys Thr Gly Asp Ser His Ser Asp Thr Val Ile Ala

130 135 140

Ser Thr Gly Gly Ile Ile Leu Leu Ser Leu Ser

145 150 155

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 2

gggggatcca caagtgataa gaatactgac acga 34

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 3

ggggtcgaca cttaatgata acagaataat ccc 33

Claims

1.一种罗非鱼无乳链球菌疫苗制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(5)步骤(4)所得的搅拌混合物放入100kDa透析袋中透析，离心收集样品，即得到所述罗非鱼无乳链球菌疫苗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中氧化单壁碳纳米管与植物蛋白粉的重量比为1：30。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述植物蛋白粉采用以下方法制备：

(2)取上清液并调pH至4.2～4.5，静置后离心，收集沉淀物；

(4)中性蛋白溶液透析，干燥，备用。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氨基酸序列为SEQ ID NO：1的目的多肽通过基因工程的方法制备，所采用的引物如下：

正向引物：5’-GGGGGATCCACAAGTGATAAGAATACTGACACGA-3',

反向引物：5’-GGGGTCGACACTTA ATG ATAACAGAATAATCCC-3'。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：通过基因工程的方法制备所述氨基酸序列为SEQ ID NO：1的目的多肽时，所采用的重组载体为pET-32a，在大肠杆菌中经IPTG诱导表达。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：经大肠杆菌诱导表达的目的多肽通过以下方式纯化：

(1)将大肠杆菌超声波破碎后，取上清，在12000r/min离心10min；

(2)将离心后的上清用0.22μm的滤膜过滤；

(4)用PBS缓冲液在脱盐柱进行脱盐处理。

7.一种罗非鱼无乳链球菌疫苗，其特征在于：通过权利要求1～6任一项所述的方法制备。