CN103520737A - 碳纳米管载体免注射疫苗、制备方法及其在制备水产免疫苗种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种碳纳米管载体免注射疫苗、制备方法及其在制备水产免疫苗种中的应用，以草鱼呼肠孤病毒为实例，采用单壁碳纳米管载其抗原VP7蛋白，进行草鱼夏花鱼苗浸浴免疫，结合抗体效价测定、攻毒试验和大规模浸浴免疫，实现免疫鱼苗的生产，达到了注射疫苗的效果，该疫苗生产成本低，使用方法简单，可在鱼、蛙等水产动物的多种细菌性、病毒性、寄生虫等免注射基因工程疫苗的开发应用上。

Description

碳纳米管载体免注射疫苗、制备方法及其在制备水产免疫苗种中的应用

技术领域

本发明涉及材料科学和生物科学领域，尤其涉及应用于水产养殖中的免注射碳纳米管载体疫苗领域。

背景技术

众所周知，疫苗是保障水产养殖健康发展和食品安全的主要手段。然而，渔用疫苗在世界范围内之所以不能实现大规模推广应用的关键技术瓶颈有两点：一是病原的变异；二是免疫途径及效果。前者可以通过基因工程、核酸等疫苗的研究与应用克服病原变异问题；从水产疫苗免疫途径上能够解决大规模、高效免疫的问题是渔用疫苗商业化推广的关键所在，一直以来也是渔用疫苗研究的热点问题。通常渔用疫苗使用有3种途径：注射免疫最好，保护率高达40～80%，其产业化的主要瓶颈一是只适应大规格鱼种，二是注射免疫方法不能满足大规模渔业生产；口服免疫最差，保护率10～50%，最为关键的瓶颈是抗原被酶解消化降低了免疫效果；浸浴免疫虽然适宜小规格鱼种，操作简单、成本低、适用于大规模苗种免疫，但其主要的技术瓶颈就是皮肤保护屏障降低了免疫效果，免疫保护率仅达30～60%。因此，降低成本、操作简单、能实现大规模化、达到注射免疫效果的免疫方法研究对渔业生产中的病害控制、降低生产病害风险具有重要的意义。

碳纳米管（Carbon nanotubes，CNTs）作为一种重要的一维纳米材料，因其独特的管状结构、特殊的物理化学性质、巨大的比表面积、优异的跨膜能力和较多的可修饰位点，在构建靶向缓释系统和长循环药物等生物医药方面具有良好的前景和潜力。

在医药领域，主要集中在碳纳米管载抗肿瘤药物研究方面。碳纳米管载药尚主要在细胞模型、小鼠动物模型研究层次。大量的研究发现，碳纳米管载阿霉素（DOX）、吉他西滨(Gemcitabine)、紫杉醇等能够显著提高杀灭离体培养肿瘤细胞活性和小鼠的抗肿瘤效果，大大降低了药物有效使用剂量。

目前，碳纳米管载药已知的用途有：

1.碳纳米管作为载体在抗癌药物转运中的应用，公开号：CN101209349，申请人：中国科学院大连化学物理研究所，邹汉法等。主要功能是合成的氧化碳纳米管可以键合上不同的抗癌药物转运中的应用。

2.功能化碳纳米管抗癌药物载体的制备和应用，公开号：CN101618221，上海师范大学，贾能勤等，主要用途是功能化碳纳米管喜树碱复合物在体外Hela宫颈癌细胞治疗中的应用。

3.一种反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体，公开号：CN101015696，上海师范大学，贾能勤等，主要应用于肿瘤或基因疾病的治疗。

4.单壁碳纳米管转载抗肿瘤药物技术及其应用，公开（公告）号：CN102370988A，华东理工大学，马兴元等，主要用途是将功能化的单壁碳纳米管与目标分子连接，所述目标分子是指生物大分子抗肿瘤药物，包括核酸药物或者蛋白药物。

以上专利主要是碳纳米管载抗肿瘤药物研究，尚无在水产养殖载体疫苗的研究与应用。

以下是发明人引用的有关参考文献：

[1]Liu Z,Sun X M,Nakayama-Ratchford N,et al.Supramolecular chemistry onwater-soluble carbon nanotubes for drug loading and delivery[J].ACS NANO,2007,l(l):50-56.

[2]X.Zhang,L.Meng,Q.Lu,Z.Fei,P.J.Dyson.Targeted delivery andcontrolled release of doxorubicin to cancer cells using modified single wall carbonnanotubes,Biomaterials,30(2009)6041-6047.

[3]Liu Z,Chen K,Davis C,Sherlock S,Cao Q,Chen X,Dai H.Drug Deliverywith Carbon Nanotubes for in vivo Cancer Treatment.Cancer Res.2008,68,6652-6660.

[4]Yang F,Jin C,Yang D,Jiang Y,Li J,Di Y,Hu J,Wang C,Ni Q,Fu D.Magnetic functionalised carbon nanotubes as drug vehicles for cancer lymph nodemetastasis treatment[J].European Journal of Cancer,2011,47(12):1873-1882.

[5]Meng L,Zhang X,Lu Q,Fei Z,Dyson PJ.Single walled carbon nanotubes asdrug delivery vehicles:targeting doxorubicin to tumors.2012Feb;33(6):1689-98.

发明内容

本发明的目的在于提供一种碳纳米管载体免注射疫苗、制备方法及其在制备水产免疫苗种中的应用。

一种碳纳米管载体免注射疫苗，包括单壁碳纳米管（Single wall carbonnanotubes,SWCNTs）以及连接在单壁碳纳米管上的抗原。

所述抗原为蛋白质。例如，病毒外衣壳蛋白，人工合成或基于基因工程构建的表达系统所获得的蛋白。

所述抗原的质量分数为10-50%。

上述碳纳米管载体免注射疫苗在制备水产免疫苗种中的应用。

将碳纳米管载体免注射疫苗用水直接稀释并搅拌混合均匀，然后泼洒于含有夏花鱼种的池中进行浸浴。

所述含有夏花鱼种的池中抗原的浓度为2.0-5.0mg/L，浸浴时间为1-2h。

一种碳纳米管载体免注射疫苗的制备方法，包括以下步骤：

将单壁碳纳米管进行酸化处理，然后与抗原蛋白连接。

所述抗原蛋白的制备方法包括以下步骤：

第一步，通过PCR扩增获取抗原蛋白对应的目的基因；

第二步，经过第一步后，构建目的基因克隆载体和原核表达载体；

第三步，经过第二步后，构建抗原蛋白原核表达菌株；

第四步，经过第三步后，对表达菌株发酵培养，然后进行抗原蛋白提取、纯化和复性。

所述碳纳米管载体免注射疫苗的制备方法的具体步骤包括：

将单壁碳纳米管加入到硫酸和硝酸组成的混和酸中后于65-75℃水浴中超声（40KHz，500W）处理2-8h，然后用去离子水洗涤所述单壁碳纳米管至pH值不再变化后再用硝酸回流24-36h，回流后用纯水洗涤所述单壁碳纳米管至pH值不再变化，然后离心，将离心得到的黑色固体真空干燥至恒重，得到酸化单壁碳纳米管；

将酸化单壁碳纳米管加入到2-（N-吗非啉）乙磺酸水溶液中后超声（40KHz，500W）处理0.5-2h得混合物，向混合物中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和N-羰基琥珀酸亚胺（酸化单壁碳纳米管:乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺的质量比=1:3～7；酸化单壁碳纳米管:N-羰基琥珀酸亚胺的质量比=1:5～10），然后超声（40KHz，500W）处理2-4h、离心，将离心得到的沉淀加入PBS缓冲液中，向PBS缓冲液中再加入抗原蛋白（酸化单壁碳纳米管:抗原蛋白的质量比=1:1～3），然后超声（40KHz，500W）处理2-4h、室温搅拌48-72h，搅拌后用截留量为10万的透析袋在纯水中透析3-5d，透析后离心、真空干燥，即得碳纳米管载体免注射疫苗。

本发明对已知材料单壁碳纳米管发掘了新的用途，单壁碳纳米管作为一种新型纳米材料，能够在水体中穿透水产动物体表皮肤进入组织、细胞。因此，碳纳米管化学键连接的抗原，通过浸浴（免注射）可大量进入达到注射效果，该方法解决了水产疫苗大规模使用的瓶颈问题，大大降低了成本，使用方法简单，具有巨大的应用潜力，同时对解决早期苗种培育病害防治具有重要的作用，因此，适宜大规模免疫推广应用，克服了注射免疫规模小、要求个体大等诸多问题，是水产疫苗跨越性的技术革命。

本发明将碳纳米管与抗原蛋白通过化学键连接，组成碳纳米管-抗原蛋白复合物，采用浸浴鱼苗等水产动物苗种，借助碳纳米管能够穿透鱼体表，把抗原蛋白带入鱼水产动物体内组织、器官，实现注射免疫的效果，对水产动物大规模免疫具有巨大应用前景。

附图说明

图1为VP7基因的PCR扩增结果，其中，（M）为DM2000DNA相对分子质量标准，（1）为VP7基因的PCR扩增结果。

图2为pMD19T-VP7双酶切鉴定结果，其中，（M）为DM2000DNA相对分子质量标准，（1）为pMD19T-VP7，（2）为EcoRⅠ、HindⅢ双酶切pMD19T-VP7。

图3为pET32a-VP7双酶切鉴定结果，其中，（M）为DM2000DNA相对分子质量标准，（1）为pET32a-VP7重组质粒，（2）为EcoRⅠ、HindⅢ双酶切pET32a-VP7重组质粒。

图4为pET32a-VP7/BL21蛋白表达的SDS-PAGE分析结果，其中，（M）为蛋白质相对分子质量标准，（1）为pET32a-VP7/BL21未诱导；（2）、（3）为IPTG分别诱导pET32a-VP7/BL21后的总蛋白提取物。

图5为pET32a-VP7/BL21蛋白表达的Western Blot分析结果，其中，（M）为蛋白质相对分子质量标准，（1）为目的蛋白VP7。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。

以草鱼出血病具体试验例进一步说明本发明碳纳米管载体免注射疫苗、制备方法和生产免疫苗种的应用。草鱼出血病是一种由草鱼呼肠孤病毒（GCRV）引起的鱼种培育阶段流行地区广泛、流行季节长、发病率高、危害性大的国家二类动物疫病。主要危害对象为全长2.5-15.0厘米的草鱼鱼种。目前，防治该病主要是草鱼出血病灭活疫苗、弱毒疫苗，均在大规格鱼种阶段通过注射免疫途径进行免疫预防。本发明就是在草鱼出血病基因工程疫苗基础上，通过化学合成在碳纳米管上，通过大规模浸浴免疫实现了免注射免疫。以下是碳纳米管载草鱼出血病基因工程疫苗制备、使用效果实例。

试验例1草鱼出血病抗原蛋白VP7的制备

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病毒毒株、菌株和载体

草鱼呼肠孤病毒毒株GCRV873、pET-32a（+）载体为本实验室保存。大肠杆菌TOP10、BL21（DE3）菌株为北京康为世纪生物科技有限公司产品。pMD19-T载体为Takara公司产品。

1.1.2试剂

病毒RNA提取试剂盒、DM2000DNA Marker、PCR扩增试剂盒、显色剂DAB、BCA蛋白含量测定试剂盒为北京康为世纪生物科技有限公司产品。反转录试剂盒、限制性内切酶（EcoRⅠ、HindⅢ）、T4DNA连接酶购自Takara公司。DNA纯化试剂盒购自Axygen公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。蛋白Marker购自天根生化科技（北京）有限公司。鼠源组氨酸单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自Abcam公司。其他常规试剂为国产，分析纯。

1.1.3试验仪器

ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，上海特成机械设备有限公司；H1650-W型台式高速微量离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；SY-360型超声波提取器，上海宁商超声仪器有限公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术（上海）有限公司；超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；DYCP-31CN型琼脂糖水平电泳仪、DYCZ-24DN型迷你双垂直电泳仪、WD-9413A型凝胶成像分析系统购自北京市六一仪器厂；Thermo Multiskan MK3酶标仪，美国热电赛默飞世尔科技公司；伯乐PCR仪，美国伯乐公司。

1.2试验方法

1.2.1PCR扩增获取VP7抗原蛋白目的基因

参照病毒RNA提取试剂盒说明书，提取GCRV873病毒总RNA，并用反转录试剂盒将RNA反转为cDNA。根据GenBank中VP7基因序列（AccessionNo.AF403396）设计引物S1为：

S1F（EcoRⅠ）：5’-GAATTCATGCCACTTCACATGATTCC-3’；

S1R（HindⅢ）：5’-AAGCTTAATCGGATGGCTCCACATG-3’。

PCR扩增反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件：120V恒压20min。电泳产物切胶、回收、经DNA纯化试剂盒纯化DNA产物，纯化产物经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切后与pMD19-T载体连接，将产物命名为pMD19T-VP7。pMD19T-VP7转化至大肠杆菌TOP10感受态中，经蓝白斑筛选获取阳性菌株，并提取pMD19T-VP7质粒进行PCR、双酶切及测序鉴定。

1.2.2构建抗原蛋白原核表达菌株

将重组pMD19T-VP7质粒和pET-32a（+）质粒分别经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切、琼脂糖凝胶电泳、切胶、回收、DNA纯化试剂盒纯化，T4连接酶重组为pET32a-VP7重组质粒，并转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态中，并提取重组质粒，进行PCR、双酶切及测序鉴定。

1.2.3VP7蛋白诱导表达

将含pET32a-VP7重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3），37℃振荡培养1h，涂于LB平板（含氨苄青霉素）培养，37℃过夜，挑取单菌落于LB液体培养基（含氨苄青霉素），37℃振荡培养，过夜，从中另取1%菌液于新培养基中扩大培养，至OD600为0.6时加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷），诱导培养4～6h，离心，弃上清，用1×PBS洗离心沉淀物2次，加入等体积样品缓冲液，混匀，煮沸5min，用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。取纯化的蛋白泳道转硝酸纤维素膜，以鼠源组氨酸单克隆抗体为一抗，以羊抗鼠IgG为二抗进行孵育，洗涤后以DAB显色，进行Western Blot分析。

1.2.4VP7粗蛋白的制备

大量收集诱导表达的菌液，于50mL离心管中12000r/min、4℃离心10min，收集沉淀，以超声破碎缓冲液重悬沉淀，冰浴超声40min，12000r/min离心20min，取沉淀，用去离子水清洗，加入含8mol/L尿素的变性液溶解，于12000r/min、4℃离心10min，取上清，分别于含有6.0、4.0、2.0、1.0mol/L尿素的PBS中透析，最后于1×PBS中透析过夜。收集透析的蛋白液体，冷冻后抽制成冻干粉以便保存。使用时以无菌水溶解，BCA蛋白含量测定试剂盒测定蛋白浓度。

2结果与分析

2.1VP7基因的扩增、克隆与鉴定结果

VP7基因经PCR扩增，得到如图1中约890bp的目的条带。测序结果（图2）显示，目的基因与GenBank参考序列同源性为99%。已将目的基因克隆进pET-32a（+）载体中，获得重组载体pET32a-VP7，经双酶切及PCR鉴定的结果见图3。

2.2VP7蛋白的表达及检测结果

重组表达质粒pET32a-VP7在大肠杆菌BL21中获得表达。在诱导4h后，经SDS-PAGE电泳，表达的融合蛋白相对分子质量约为47.8KDa（图4），与预期结果相符。经BandScan软件分析，蛋白的最高表达量占细菌总蛋白的32.8%；Western Blot分析结果表明，在47.8KDa处有一明显的识别条带（图5），表明产物蛋白能与抗His单克隆抗体识别，证实其具有良好的抗原反应性。

试验例2单壁碳纳米管载VP7蛋白（SWCNT-VP7）的制备

1材料与方法

1.1材料

1.1.1单壁碳纳米管样品

单壁碳纳米管（SWCNTs）样品购自中国科学院成都有机化学研究所。单壁碳纳米管的制备采用化学气相沉积法（CVD），其中的主要杂质为金属催化剂和无定形碳，元素质量分布为（厂家提供）：C=96.3wt%，Al=0.08wt%，Cl=0.41wt%，Co=2.91wt%，S=0.29wt%。

1.1.2试剂

浓硝酸（HNO₃），西安化学试剂厂；浓硫酸（H₂SO₄），国药集团化学试剂有限公司；硼酸，国药集团化学试剂有限公司；2-（N-吗非啉）乙磺酸，Sigma公司；乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDAC），西安化学试剂厂；N-羰基琥珀酸亚胺（NHS），国药集团化学试剂有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司。所有试剂均为分析纯。

1.1.3试验仪器

ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，上海特成机械设备有限公司；H1650-W型台式高速微量离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；1010-3B型电热恒温鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；SY-360型超声波提取器，上海宁商超声仪器有限公司；Thermo Multiskan MK3酶标仪，美国热电赛默飞世尔科技公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术（上海）有限公司。

1.2试验方法

1.2.1单壁碳纳米管的酸化

上述购买的单壁碳纳米管按100mg加30mL混酸的比例加入到98%H₂SO₄和65%HNO₃混酸（3：1，V/V）中，然后于70℃水浴中超声（40KHz，500W）处理4h，然后用去离子水洗涤至pH值不再变化，再按100mg加25mL的比例加入到2.6M稀硝酸中回流24h，回流后用纯水洗涤至pH值不再变化，然后于5000rpm离心，收集离心得到的黑色固体，并于60℃真空干燥至恒重，得到酸化单壁碳纳米管。

1.2.2单壁碳纳米管连接蛋白VP7

取酸化的单壁碳纳米管样品（3.5g）加入到2-（N-吗非啉）乙磺酸水溶液中（0.1M，pH=5.6，2000mL）并超声（40KHz，500W）处理30min得混合物，然后向混合物中加入20g乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺（EDAC）和25g N-羰基琥珀酸亚胺（NHS）并超声（40KHz，500W）处理2h，然后于6000rpm条件下离心5min，去上清，沉淀加入到PBS缓冲液（磷酸缓冲液）中（pH=7.4，2000mL）进行超声（40KHz，500W）混合，均匀后向PBS缓冲液中再加入5gVP7蛋白，先超声（40KHz，500W）处理2h，再室温搅拌48h。搅拌后用截留量为10万的透析袋在纯水中透析3d，透析完的产物于3000rpm离心10min，沉淀即为单壁碳纳米管载VP7抗原蛋白复合物（SWCNT-VP7），于30-45℃下真空干燥后4℃低温保存。

1.2.3合成物效果检测

精确称取1.0g单壁碳纳米管载VP7抗原蛋白复合物（干粉），用纯水稀释至10mL，超声分散均匀，参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，梯度稀释上述溶液，运用Thermo Multiskan MK3酶标仪测定蛋白含量。根据蛋白浓度计算复合物中VP7抗原蛋白的承载量，其中载药量的公式如下：

蛋白承载量=（复合物中蛋白含量/复合物的质量）×100%

2结果与分析

经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定，将上述单壁碳纳米管载VP7抗原蛋白复合物溶液稀释至10^-2可以测定出蛋白浓度在432.7μg/mL，结合稀释倍数，原始单壁碳纳米管载VP7抗原蛋白复合物重量，换算得到单壁碳纳米管载VP7抗原蛋白复合物（SWCNT-VP7）中VP7抗原蛋白的含量为43.27%。

试验例3草鱼出血病碳纳米管载VP7基因工程疫苗（SWCNT-VP7）免疫效果

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1病毒株、试验动物

草鱼呼肠孤病毒株（GCRV-873）由本实验室保种，病毒滴度（TCID₅₀）6.5×10^-6/mL。草鱼夏花鱼种（平均体重：0.23±0.03g，平均体长：2.74±0.16cm），由陕西省水产总站新民国家级家鱼良种场提供。试验所用草鱼夏花鱼种饲养在容积为250L的水族箱中，箱中装有200L充分曝气的自来水，加热棒调节使水温维持在28±0.5℃，充气增氧保持水中溶解氧在6mg/L以上，日光灯调节光照周期为14：10h，每日早、中、晚各投喂1次浮性饵料（北京金御恒润科贸有限公司），每次投饵量约为100g。在晚上投饵1h后，清除缸底杂物，换水1/3，每周清理一次水族箱。驯养14d以后，挑选身体健康、无伤病的草鱼夏花鱼种用于后续免疫和感染攻毒实验。

1.1.2试验试剂

VP7抗原蛋白冻干粉、单壁碳纳米管载VP7抗原蛋白复合物（VP7抗原蛋白承载率43.27%）由本实验室合成保存；NaCl，国药集团化学试剂有限公司；鼠源组氨酸单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自Abcam公司；96孔酶标板，美国康宁公司；Elisa检测试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司；绵羊红细胞；上海源叶生物科技有限公司。其余试剂均为分析纯。

1.1.3试验仪器

ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；冷冻低温离心机，美国Thermo公司；超低温冰箱，美国Thermo公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术(上海)有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；组织捣碎匀浆机，金坛市城东新瑞仪器厂；Thermo Multiskan MK3酶标仪，美国热电赛默飞世尔科技公司。

1.2试验方法

1.2.1夏花鱼种免疫

将生长发育正常、无伤病的草鱼夏花鱼种分成11个组，每组300尾分别饲养于装有3L曝气自来水的塑料盆中，增养泵充氧使其溶解氧达到6.0mg/L以上。VP7蛋白免疫和单壁碳纳米管载VP7抗原蛋白复合物（SWCNT-VP7）免疫分别按照1.0、2.5、5.0、10.0和20.0mg/L（均按照VP7蛋白浓度计算）浓度浸浴，共10组。空白对照组不加处理。浸浴免疫2h以后，将草鱼转至20L的塑料箱中饲养，加热棒调节使水温维持在28±0.5℃，充气增氧保持水中溶解氧在6.0mg/L以上，日光灯调节光照周期为14：10h，每日早、中、晚各投喂1次浮性饵料（北京金御恒润科贸有限公司），投饵率为3%。每天清除缸底粪便、换水1/3。

免疫后第14、21、28、49、70天，每组分别将10尾草鱼剪断脊柱处死，加入2.0mL0.6%生理盐水，组织匀浆机12000rpm匀浆5min，高速冷冻离心机3000rpm离心10min，将上清转入新管中冻存于-80℃保存。抗体检测采用间接凝集法。选用的致敏载体为用戊二醛一步法制备的绵羊红细胞。

1.2.2草鱼呼肠孤病毒株（GCRV-873）对草鱼攻毒试验

取上述免疫21d以后的草鱼夏花鱼种，每小组100尾，将病毒液用含双抗（青霉素和链霉素）的灭菌生理盐水稀释为TCID₅₀的10^1.5倍，按20.0μL/尾剂量，于已免疫草鱼和对照组草鱼的胸鳍基部分别进行注射，控制水温（28±0.5℃），定时检查、记录发病情况，最后计算死亡率和免疫保护力。

免疫保护力=1－免疫组死亡率/对照组死亡率。

2结果与分析

2.1免疫效价测定

VP7蛋白直接免疫组与单壁碳纳米管载VP7抗原蛋白复合物免疫组（SWCNT-VP7）分别在1.0、2.5、5.0、10.0和20.0mg/L浸浴免疫草鱼夏花鱼种，采用间接凝集法测定不同免疫时间抗体效价结果如表1所示。VP7蛋白直接免疫组在低于10.0mg/L时，免疫效价与对照组相比并无差异；在20.0mg/L，第14天时免疫效价也仅能达到1:4-1:8。SWCNT-VP7组在1.0mg/L时，于第14天免疫效价即可达到1:32-1:64，第70天时免疫效价仍能保持在1:2-1:4。在5.0mg/L时，第14天免疫效价可达到1:128-1:256，是比较理想的使用剂量。

表1VP7与SWCNT-VP7免疫草鱼夏花鱼种抗体效价的间接凝集反应检测结果

2.1死亡率与免疫保护率

VP7蛋白直接免疫组与单壁碳纳米管载VP7抗原蛋白复合物（SWCNT-VP7）免疫组分别在1.0、2.5、5.0、10.0和20.0mg/L浸浴免疫草鱼夏花鱼种21d以后病毒攻毒。在攻毒12d的累积死亡率和免疫保护率如表2所示。

表2VP7与SWCNT-VP7分别免疫草鱼夏花鱼种后攻毒的死亡率和免疫保护率

上述结果表明：VP7蛋白直接免疫组在低于10.0mg/L时，浸浴免疫处理不能对草鱼夏花鱼种产生免疫保护效应；SWCNT-VP7在1.0mg/L浸浴免疫后免疫保护率可以达到83%，5.0mg/L浸浴免疫后免疫保护率可以达到100%。

试验例4碳纳米管载VP7基因工程疫苗（SWCNT-VP7）大规模免疫草鱼效果试验

1.1材料

1.1.1试验动物

草鱼夏花鱼种体长1.5-2.9cm，约60000尾，由陕西省新民国家级家鱼良种场提供。

1.1.2试剂

单壁碳纳米管载VP7抗原蛋白复合物（SWCNT-VP7）冻干粉（VP7抗原蛋白承载率36.9%）由本实验室合成保存；NaCl，国药集团化学试剂有限公司；鼠源组氨酸单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自Abcam公司；96孔酶标板，美国康宁公司；Elisa检测试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司；绵羊红细胞；上海源叶生物科技有限公司。其余试剂均为分析纯。

1.1.3试验仪器

冷冻低温离心机，美国Thermo公司；超低温冰箱，美国Thermo公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术(上海)有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；组织捣碎匀浆机，金坛市城东新瑞仪器厂；ThermoMultiskan MK3酶标仪，美国热电赛默飞世尔科技公司。

1.2试验方法

在陕西省水产工作总站隶属的新民国家级家鱼良种场进行大规模夏花鱼种培育20d，捕捞约60000尾。将本实验室制备的SWCNT-VP7（VP7抗原蛋白承载率36.9%）用蒸馏水溶解稀释成悬浊液，按照5.0mg/L免疫浓度，在1m³大小养殖池内、并增氧，每个养殖池放养10000尾，水温控制在27-28℃，浸浴免疫2h。将免疫完成的夏花鱼种养殖在面积10亩的微流水池塘中(新民国家级家鱼良种场)。在免疫后第14、21、28、49、70天随机采样草鱼50尾于实验室检测抗体效价。

将采集的50尾草鱼分5组，每10尾一组设平行重复检测。采用剪断脊柱处死，加入2.0mL0.6%生理盐水，组织匀浆机12000rpm匀浆5min，高速冷冻离心机3000rpm离心10min，将上清转入新管中冻存于-80℃保存。抗体检测采用间接凝集法。选用的致敏载体为用戊二醛一步法制备的绵羊红细胞。

2结果与分析

由表3可以看出，在免疫剂量在5mg/L时，5组鱼抗体效价测定结果显示：均在第14天免疫效价可达到1:128-1:256；第21天时，免疫效价在1:256-1:512，达到峰值；第28天免疫效价还可维持在1:256-1:512峰值水平；第49天免疫效价开始下降在1:64-1:128，但仍处于很强的免疫保护范围内；在第70天时，免疫效价开始下降到1:16-1:32，仍处于很强的免疫保护范围内，在这个时期，草鱼体重达到30-60g。

表3SWCNT-VP7基因工程疫苗免疫草鱼夏花鱼种抗体效价的间接凝集反应检测结果

经过70d的养殖，两个池塘均没有发生病毒性出血病。因此，在夏花时期，采用SWCNT-VP7免疫，不但克服了由注射免疫需要较大规格鱼种（20g以上），降低了免疫成本，提早免疫也大大降低鱼种培育阶段发病损失大的难关，而且从根本上解决了大规模免疫瓶颈问题。本发明利用碳纳米管载细菌、病毒、寄生虫等抗原能够在水体中由鱼等水生动物的体表穿透进入内脏各组织、细胞内，可以通过浸浴免疫代替借助注射免疫鱼类等水产动物，实现小规格鱼苗等（15-20日龄）免疫苗种的生产。本发明可为鱼类、蛙等水产动物进行细菌、病毒、寄生虫等纳米载体疫苗的研究开发应用提供模板，具有广阔的前景。

Claims (9)

1.一种碳纳米管载体免注射疫苗，其特征在于：包括单壁碳纳米管以及连接在单壁碳纳米管上的抗原。

2.根据权利要求1所述一种碳纳米管载体免注射疫苗，其特征在于：所述抗原为蛋白质。

3.根据权利要求1所述一种碳纳米管载体免注射疫苗，其特征在于：所述抗原的质量分数为10-50%。

4.一种如权利要求1所述碳纳米管载体免注射疫苗在制备水产免疫苗种中的应用。

5.根据权利要求4所述碳纳米管载体免注射疫苗在制备水产免疫苗种中的应用，其特征在于：将碳纳米管载体免注射疫苗用水直接稀释并搅拌混合均匀，然后泼洒于含有夏花鱼种的池中进行浸浴。

6.根据权利要求5所述碳纳米管载体免注射疫苗在制备水产免疫苗种中的应用，其特征在于：所述含有夏花鱼种的池中抗原的浓度为2.0-5.0mg/L，浸浴时间为1-2h。

7.一种碳纳米管载体免注射疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

将单壁碳纳米管进行酸化处理，然后与抗原蛋白连接。

8.根据权利要求7所述一种碳纳米管载体免注射疫苗的制备方法，其特征在于：所述抗原蛋白的制备方法包括以下步骤：

第一步，通过PCR扩增获取抗原蛋白对应的目的基因；

第二步，经过第一步后，构建目的基因克隆载体和原核表达载体；

第三步，经过第二步后，构建抗原蛋白原核表达菌株；

第四步，经过第三步后，对表达菌株发酵培养，然后进行抗原蛋白提取、纯化和复性。

9.根据权利要求7所述一种碳纳米管载体免注射疫苗的制备方法，其特征在于：所述碳纳米管载体免注射疫苗的制备方法的具体步骤包括：

将单壁碳纳米管加入到硫酸和硝酸组成的混和酸中后于65-75℃水浴中超声处理2-8h，然后用去离子水洗涤，再用硝酸回流24-36h，回流后用纯水洗涤，然后离心、真空干燥至恒重，得到酸化单壁碳纳米管；

将酸化单壁碳纳米管加入到2-（N-吗非啉）乙磺酸水溶液中后超声处理0.5-2h得混合物，向混合物中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和N-羰基琥珀酸亚胺，然后超声处理2-4h、离心，将离心得到的沉淀加入PBS缓冲液中，向PBS缓冲液中再加入抗原蛋白，然后超声处理2-4h、室温搅拌48-72h，搅拌后在纯水中透析3-5d，透析后离心、真空干燥，即得碳纳米管载体免注射疫苗。

Images