CN101020051A - 海水鱼致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗的制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
一种海水鱼致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗的制备和使用方法，提取下列各弧菌的二种或二种以上菌种的外膜蛋白再加入免疫刺激复合物制成，所述的弧菌菌种包括：溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌和河流弧菌。制备方法为细菌的培养、外膜蛋白的提取及疫苗的制备；本发明海水鱼致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗中含有病原体的一部分，化学性质更确定，免疫特异性更为稳定，感染成分被除去，有关残余毒性或毒性回复的隐患不再存在，其制作和投予方便安全且免疫效果好，能有效防治鱼类的皮肤溃疡、眼球混浊及由该二种病原引起的其它疾病，可广泛用于海水鱼养殖，免疫保护率85－90％。
Description
技术领域：
本发明属于一种海水鱼弧菌病的外膜蛋白亚单位疫苗的制备和使用方法。
背景技术：
近年来，随着海水养殖业的迅速发展，海水鱼网箱养殖规模也不断扩大，由于养殖海区网箱数量增多，养殖密度加大，养殖水域环境逐渐恶化，疾病的发生也越来越频繁，细菌性疾病成为水产养殖中最常见、危害最严重的病害之一，常导致养殖鱼类的大量死亡，其中弧菌病(Vibrosis)又是海水鱼养殖中最常见、危害最大的疾病，给海水鱼养殖业造成巨大的经济损失。
长期以来，传统防治方法一般是使用化学药物和抗生素，大量使用这些药物容易使病原菌产生抗药性，破坏养殖水体的微生态系统，还会造成药物在养殖动物体内的残留，严重影响养殖动物的品质。因此，在现有的技术中，目前只有鳗弧菌菌体疫苗以及最小弧菌偶联亚单位疫苗的生产和应用。鳗弧菌菌体疫苗，由于存在毒力容易反弹、使用剂量大、机体的免疫应答水平较低等原因而导致免疫效果不佳。最小弧菌偶联亚单位疫苗在水产养殖生产中具有较专一的抗弧菌特异性，对其他弧菌致病菌引起的疾病防御作用较差，在生产应用中存在非常明显的局限性。
发明内容
本发明的目的是为了弥补上述现有技术的不足，提供一种海水鱼弧菌病的外膜蛋白亚单位疫苗的制备和使用方法。
为实现上述目的本发明采取的技术方案是：
海水鱼致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗的制备方法，适用作多种海水鱼类提高养殖产量的抗弧菌的疫苗，所用菌种为：溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌和河流弧菌中的二种或二种以上的菌种；该方法为：细菌的培养、外膜蛋白的提取、疫苗的制备。
该海水鱼致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗的制备方法，按以下步骤：
细菌的培养：细菌先采用胰胨大豆胨液体培养基TSB活化，28℃下，150r/min振荡培养18h，然后取1mL菌液涂布于含2％NaCl且起始pH为7.2的胰胨大豆胨琼脂平板培养基TSA，于28℃下静置培养18h；
外膜蛋白Omp的提取：以pH为7.2的0.01mol/L PBS洗下菌落，4℃，7000r/min离心10min，重复洗2次，取菌泥用PBS悬浮，冰浴条件下超声波破碎7min，4℃，7000r/min离心15min，取上清除去大的细菌碎片，4℃，35000r/min离心1h，沉淀溶于十二烷基肌氨酸钠，37℃作用60min后4℃，35000r/min离心1h，用上述PBS收集沉淀即为外膜蛋白提取物，-20℃保存；
疫苗的制备：以蛋白质∶胆固醇+卵磷脂∶佐剂＝1∶1∶5的比例，其中佐剂是Quil-A，按如下方法制备外膜蛋白亚单位疫苗ISCOM-Omp：向1mgOmp中加入100μL 10mg/mL用20％OG配制的胆固醇和卵磷脂的混合物，其中胆固醇和卵磷脂的比例为1∶1，再加入5μL 100mg/mL Quil-A，用缓冲液调节体积至1mL，在旋涡仪上混匀，再置于超声波破碎仪上超声5min，将其置于室温2h后用pH7.2的0.01mol/L PBS透析，6h后移入4℃冰箱，透析3天，每天更换透析液3-4次。
该海水鱼致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗的使用方法：
(1)浸泡法：幼苗期间宜进行浸泡免疫。方法为将需要免疫的鱼放入盛有疫苗的容器里，浸泡时间为一天；
(2)注射法：幼鱼阶段可进行腹腔注射免疫，注射剂量为0.1ml/尾：
(3)口服免疫：幼鱼阶段还可进行口服疫苗，每100千克鱼每天0.05ml拌饲投喂，连喂3天。
本发明的优点和效果：
1.多组分菌苗的免疫效果好于单一组分菌苗；
2.弧菌疫苗中含有病原体的一部分，因而这种疫苗在化学性质上更为确定，免疫特异性更为稳定；
3.海水鱼致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗高效安全，无药物残留污染；
4.感染成分被除去，有关残余毒性或毒性回复的隐患不再存在：
5.海水鱼致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗广谱抵抗各种海水鱼致病弧菌的侵袭感染，其适用对象为各种海水养殖鱼类：
6.使用方便，可以多途径免疫接种，可在幼苗期间进行浸泡免疫，又可在幼鱼阶段进行注射免疫，还可进行口服免疫。
7.本疫苗免疫保护率85-90％，具体保护效果见下表：
表1疫苗在网箱养殖红笛鲷中浸泡免疫的试用效果
| 地点 | 组别 | 实验时间(月) | 实验鱼(尾) | 死亡鱼(尾) | 死亡率(％) | 存活率(％) |
| 雷州湛江 | 免疫组对照组免疫组对照组 | 9999 | 500500500500 | 25353224 | 14.450.610.644.8 | 85.649.489.455.2 |
表2疫苗在网箱养殖石斑鱼中注射免疫的试用效果
| 地点 | 组别 | 实验时间(月) | 实验鱼(尾) | 死亡鱼(尾) | 死亡率(％) | 存活率(％) |
| 阳江海南 | 免疫组对照组免疫组对照组 | 9999 | 500500500500 | 4723856257 | 9.447.611.351.4 | 90.652.488.748.6 |
表3疫苗在网箱养殖紫红笛鲷中口服免疫的试用效果
| 地点 | 组别 | 实验时间(月) | 实验鱼(尾) | 死亡鱼(尾) | 死亡率(％) | 存活率(％) |
| 特呈岛 | 免疫组对照组 | 99 | 500500 | 67248 | 13.449.6 | 86.650.4 |
| 三亚 | 免疫组对照组 | 99 | 500500 | 52228 | 10.454.4 | 89.645.6 |
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明。
实施例1
分别将溶藻弧菌和哈氏弧菌先采用胰胨大豆胨液体培养基(TSB)活化，28℃下，150r/min振荡培养18h，然后取1mL菌液分别涂布于含2％NaCl且起始pH为7.2的胰胨大豆胨琼脂平板培养基(TSA)，于28℃下静置培养18h。然后，分别提取溶藻弧菌和哈氏弧菌外膜蛋白。方法为：以pH为7.2的0.01mol/L PBS分别洗下菌落，4℃，7000r/min离心10min，重复洗2次，取菌泥用PBS悬浮，冰浴条件下超声波破碎7min，4℃，7000r/min离心15min，取上清除去大的细菌碎片，4℃，35000r/min离心1h，沉淀溶于十二烷基肌氨酸钠，37℃作用60min后4℃，35000r/min离心1h，用上述PBS收集沉淀即为外膜蛋白提取物，-20℃保存。接着分别制备溶藻弧菌和哈氏弧菌外膜蛋白亚单位疫苗。方法为：以蛋白质∶(胆固醇+卵磷脂)∶佐剂(Quil-A)＝1∶1∶5的比例，按如下方法制备ISCOM-Omp：取1mg溶藻弧菌和哈氏弧菌的Omp分别加入100μL 10mg/mL用20％OG配制的胆固醇和卵磷脂的混合物(胆固醇和卵磷脂的比例为1∶1)，再加入5μL100mg/mL Quil-A，用缓冲液调节体积至1mL，在旋涡仪上混匀，再置于超声波破碎仪上超声5min，将其置于室温2h后用pH7.2的0.01mol/L PBS透析，6h后移入4℃冰箱，透析3天，每天更换透析液3-4次。最后将制得的溶藻弧菌和哈氏弧菌外膜蛋白亚单位疫苗等比例混合，得到致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗。
实施例2
分别将溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌和鳗弧菌先采用胰胨大豆胨液体培养基(TSB)活化，28℃下，150r/min振荡培养18h，然后取1mL菌液分别涂布于含2％NaCl且起始pH为7.2的胰胨大豆胨琼脂平板培养基(TSA)，于28℃下静置培养18h。然后，分别提取溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌和鳗弧菌外膜蛋白。方法为：以pH为7.2的0.01mol/L PBS分别洗下菌落，4℃，7000r/min离心10min，重复洗2次，取菌泥用PBS悬浮，冰浴条件下超声波破碎7min，4℃，7000r/min离心15min，取上清除去大的细菌碎片，4℃，35000r/min离心1h，沉淀溶于十二烷基肌氨酸钠，37℃作用60min后4℃，35000r/min离心1h，用上述PBS收集沉淀即为外膜蛋白提取物，-20℃保存。接着分别制备溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌和鳗弧菌外膜蛋白亚单位疫苗。方法为：以蛋白质∶(胆固醇+卵磷脂)∶佐剂(Quil-A)＝1∶1∶5的比例，按如下方法制备ISCOM-Omp：取1mg溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌和鳗弧菌的Omp分别加入100μL 10mg/mL用20％OG配制的胆固醇和卵磷脂的混合物(胆固醇和卵磷脂的比例为1∶1)，再加入5μL 100mg/mL Quil-A，用缓冲液调节体积至1mL，在旋涡仪上混匀，再置于超声波破碎仪上超声5min，将其置于室温2h后用pH7.2的0.01mol/L PBS透析，6h后移入4℃冰箱，透析3天，每天更换透析液3-4次。最后将制得的溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌和鳗弧菌外膜蛋白亚单位疫苗等比例混合，得到致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗。
实施例3
分别将溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌先采用胰胨大豆胨液体培养基(TSB)活化，28℃下，150r/min振荡培养18h，然后取1mL菌液分别涂布于含2％NaCl且起始pH为7.2的胰胨大豆胨琼脂平板培养基(TSA)，于28℃下静置培养18h。然后，分别提取溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌外膜蛋白。方法为：以pH为7.2的0.01mol/L PBS分别洗下菌落，4℃，7000r/min离心10min，重复洗2次，取菌泥用PBS悬浮，冰浴条件下超声波破碎7min，4℃，7000r/min离心15min，取上清除去大的细菌碎片，4℃，35000r/min离心1h，沉淀溶于十二烷基肌氨酸钠，37℃作用60min后4℃，35000r/min离心1h，用上述PBS收集沉淀即为外膜蛋白提取物，-20℃保存。接着分别制备溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌外膜蛋白亚单位疫苗。方法为：以蛋白质∶(胆固醇+卵磷脂)∶佐剂(Quil-A)＝1∶1∶5的比例，按如下方法制备ISCOM-Omp：取1mg溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的Omp分别加入100μL10mg/mL用20％OG配制的胆固醇和卵磷脂的混合物(胆固醇和卵磷脂的比例为1∶1)，再加入5μL 100mg/mL Quil-A，用缓冲液调节体积至1mL，在旋涡仪上混匀，再置于超声波破碎仪上超声5min，将其置于室温2h后用pH7.2的0.01mol/L PBS透析，6h后移入4℃冰箱，透析3天，每天更换透析液3-4次。最后将制得的溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌外膜蛋白亚单位疫苗等比例混合，得到致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗。
实施例4
分别将溶藻弧菌、哈氏弧菌和创伤弧菌先采用胰胨大豆胨液体培养基(TSB)活化，28℃下，150r/min振荡培养18h，然后取1mL菌液分别涂布于含2％NaCl且起始pH为7.2的胰胨大豆胨琼脂平板培养基(TSA)，于28℃下静置培养18h。然后，分别提取溶藻弧菌、哈氏弧菌和创伤弧菌外膜蛋白。方法为：以pH为7.2的0.01mol/L PBS分别洗下菌落，4℃，7000r/min离心10min，重复洗2次，取菌泥用PBS悬浮，冰浴条件下超声波破碎7min，4℃，7000r/min离心15min，取上清除去大的细菌碎片，4℃，35000r/min离心1h，沉淀溶于十二烷基肌氨酸钠，37℃作用60min后4℃，35000r/min离心1h，用上述PBS收集沉淀即为外膜蛋白提取物，-20℃保存。接着分别制备溶藻弧菌、哈氏弧菌和创伤弧菌外膜蛋白亚单位疫苗。方法为：以蛋白质∶(胆固醇+卵磷脂)∶佐剂(Quil-A)＝1∶1∶5的比例，按如下方法制备ISCOM-Omp：取1mg溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌的Omp分别加入100μL 10mg/mL用20％OG配制的胆固醇和卵磷脂的混合物(胆固醇和卵磷脂的比例为1∶1)，再加入5μL 100mg/mL Quil-A，用缓冲液调节体积至1mL，在旋涡仪上混匀，再置于超声波破碎仪上超声5min，将其置于室温2h后用pH7.2的0.01mol/L PBS透析，6h后移入4℃冰箱，透析3天，每天更换透析液3-4次。最后将制得的溶藻弧菌、哈氏弧菌和创伤弧菌外膜蛋白亚单位疫苗等比例混合，得到致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗。
实施例5
分别将溶藻弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌先采用胰胨大豆胨液体培养基(TSB)活化，28℃下，150r/min振荡培养18h，然后取1mL菌液分别涂布于含2％NaCl且起始pH为7.2的胰胨大豆胨琼脂平板培养基(TSA)，于28℃下静置培养18h。然后，分别提取溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌外膜蛋白。方法为：以pH为7.2的0.01mol/LPBS分别洗下菌落，4℃，7000r/min离心10min，重复洗2次，取菌泥用PBS悬浮，冰浴条件下超声波破碎7min，4℃，7000r/min离心15min，取上清除去大的细菌碎片，4℃，35000r/min离心1h，沉淀溶于十二烷基肌氨酸钠，37℃作用60min后4℃，35000r/min离心1h，用上述PBS收集沉淀即为外膜蛋白提取物，-20℃保存。接着分别制备溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌外膜蛋白亚单位疫苗。方法为：以蛋白质∶(胆固醇+卵磷脂)∶佐剂(Quil-A)＝1∶1∶5的比例，按如下方法制备ISCOM-Omp：取1mg溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌的Omp分别加入100μL 10mg/mL用20％OG配制的胆固醇和卵磷脂的混合物(胆固醇和卵磷脂的比例为1∶1)，再加入5μL 100mg/mL Quil-A，用缓冲液调节体积至1mL，在旋涡仪上混匀，再置于超声波破碎仪上超声5min，将其置于室温2h后用pH7.2的0.01mol/L PBS透析，6h后移入4℃冰箱，透析3天，每天更换透析液3-4次。最后将制得的溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌外膜蛋白亚单位疫苗等比例混合，得到致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗。
实施例6
分别将溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌和河流弧菌先采用胰胨大豆胨液体培养基(TSB)活化，28℃下，150r/min振荡培养18h，然后取1mL菌液分别涂布于含2％NaCl且起始pH为7.2的胰胨大豆陈琼脂平板培养基(TSA)，于28℃下静置培养18h。然后，分别提取溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌和河流弧菌外膜蛋白。方法为：以pH为7.2的0.01mol/L PBS分别洗下菌落，4℃，7000r/min离心10min，重复洗2次，取菌泥用PBS悬浮，冰浴条件下超声波破碎7min，4℃，7000r/min离心15min，取上清除去大的细菌碎片，4℃，35000r/min离心1h，沉淀溶于十二烷基肌氨酸钠，37℃作用60min后4℃，35000r/min离心1h，用上述PBS收集沉淀即为外膜蛋白提取物，-20℃保存。接着分别制备溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌和河流弧菌外膜蛋白亚单位疫苗。方法为：以蛋白质∶(胆固醇+卵磷脂)∶佐剂(Quil-A)＝1∶1∶5的比例，按如下方法制备ISCOM-Omp：取1mg溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌和河流弧菌的Omp分别加入100μL 10mg/mL用20％OG配制的胆固醇和卵磷脂的混合物(胆固醇和卵磷脂的比例为1∶1)，再加入5μL 100mg/mL Quil-A，用缓冲液调节体积至1mL，在旋涡仪上混匀，再置于超声波破碎仪上超声5min，将其置于室温2h后用pH7.2的0.01mol/L PBS透析，6h后移入4℃冰箱，透析3天，每天更换透析液3-4次。最后将制得的溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌和河流弧菌外膜蛋白亚单位疫苗等比例混合，得到致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗。
Claims (3)
1、一种海水鱼致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗的制备方法，适用作多种海水鱼类提高养殖产量的抗弧菌的疫苗，其特征在于所用菌种为：溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌和河流弧菌中的二种或二种以上的菌种；该方法的步骤为：细菌的培养、外膜蛋白的提取、疫苗的制备。
2、据权利要求1所述海水鱼致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于按以下步骤：
(1)细菌的培养：细菌先采用胰胨大豆胨液体培养基TSB活化，28℃下，150r/min振荡培养18h，然后取1mL菌液涂布于含2％NaCl且起始pH为7.2的胰胨大豆胨琼脂平板培养基TSA，于28℃下静置培养18h；
(2)外膜蛋Omp.的提取：以pH为7.2的0.01mol/L无菌磷酸盐缓冲液PBS洗下菌落，4℃，7000r/min离心10min，重复洗2次，取菌泥用PBS悬浮，冰浴条件下超声波破碎7min，4℃，7000r/min离心15min，取上清除去大的细菌碎片，4℃，35000r/min离心1h，沉淀溶于十二烷基肌氨酸钠，37℃作用60min后4℃，35000r/min离心1h，用上述磷酸盐缓冲液PBS收集沉淀即为外膜蛋白提取物，-20℃保存；
(3)疫苗的制备：以蛋白质∶胆固醇+卵磷脂∶佐剂＝1∶1∶5的比例，其中佐剂是Quil-A，按如下方法制备外膜蛋白亚单位疫苗ISCOM-Omp：向1mg Omp中加入100μL 10mg/mL用2％OG配制的胆固醇和卵磷脂的混合物，其中胆固醇和卵磷脂的比例为1∶1，再加入5μL 100mg/mL Quil-A，用缓冲液调节体积至1mL，在旋涡仪上混匀，再置于超声波破碎仪上超声5min，将其置于室温2h后用pH7.2的0.01mol/L PBS透析，6h后移入4℃冰箱，透析3天，每天更换透析液3-4次。
3、据权利要求1方法制备的海水鱼致病弧菌外膜蛋白亚单位疫苗的使用方法，其特征在于：
(1)浸泡法：幼苗期间宜进行浸泡免疫，方法为将需要免疫的鱼放入盛有疫苗的容器里，浸泡时间为一天；
(2)注射法：幼鱼阶段可进行腹腔注射免疫，注射剂量为0.1ml/尾；
(3)口服免疫：幼鱼阶段还可进行口服疫苗，每100千克鱼每天0.05ml拌饲投喂，连喂3天。
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