CN103408642A

CN103408642A - 哈氏弧菌外膜蛋白及其应用

Info

Publication number: CN103408642A
Application number: CN2013102440001A
Authority: CN
Inventors: 孙黎; 于兰萍; 孙铂光; 胡永华
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2013-06-19
Filing date: 2013-06-19
Publication date: 2013-11-27

Abstract

本发明涉及疫苗学领域，具体的说是两种哈氏弧菌外膜蛋白及其应用。外膜蛋白为序列表SEQ ID No.1和No.2中的氨基酸序列所示。具体为以哈氏弧菌T4为模板，分别以173F/173R和214F/214R为引物分别PCR扩增,所得PCR产物分别与载体pEASY-E2连接，所得连接液分别转化入大肠杆菌DH5α，筛选质粒即为pOMP173和pOMP214；再将质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，表达含OMP173和OMP214如SEQ ID No.1和No.2中序列的重组蛋白。本发明的OMP173或OMP214外膜蛋白作为疫苗对哈氏弧菌的免疫保护效率皆大于70%。

Description

哈氏弧菌外膜蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及疫苗学领域，具体的说是哈氏弧菌外膜蛋白及其应用。

背景技术

哈氏弧菌是一种革兰氏阴性菌，具有发光特性，能运动，短杆状，是世界范围内养殖动物疾病的主要病原菌之一。它可以以游离状态存在于海水中，也可以存在于海洋动物的肠道，能够引起大范围海洋种类致病，包括脊椎动物和无脊椎动物。在鱼类中，哈氏弧菌可以感染大范围的硬骨鱼，包括锯盖鱼、澳洲肺鱼、大菱鲆、遮目鱼、黄花鱼、鲶鱼等。在中国，哈氏弧菌能够引起养殖牙鲆致病并引起严重的死亡。

常见报道的鱼类疫苗有几种，包括灭活疫苗、减毒疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗。亚单位疫苗因其接种剂量小、免疫原性强、抗体出现早、滴度高、持续时间长和毒副作用小等优点而得到关注。外膜蛋白位于病原菌的表面，能够刺激宿主的免疫细胞对其进行识别。重组的外膜蛋白能够保持天然的免疫原性，刺激鱼体后产生特异性抗体，对病原菌的感染产生一定的免疫保护效率，某些还能够显著的增强宿主吞噬细胞的吞噬活性，因此逐步成为鱼类亚单位疫苗研究的热点。

发明内容

本发明目的在于提供哈氏弧菌外膜蛋白及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种哈氏弧菌外膜蛋白，外膜蛋白为序列表SEQ ID No.1或No.2中的氨基酸序列所示。

哈氏弧菌外膜蛋白的制备方法，以哈氏弧菌T4为模板，分别采用173F/173R和214F/214R为引物对进行PCR扩增,PCR产物分别与载体pEASY-E2连接，所得连接液分别转化入大肠杆菌DH5α中，筛选质粒分别为pOMP173和pOMP214；

将上述质粒分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)，表达即为SEQ ID No.1或No.2中的氨基酸序列所示的重组蛋白；

所述引物为173F：5’-GATATCATGCAACTGAACAAGGTTC-3’；173R：5’-GATATCGTATACTAGAACCGCACG-3’；214F：5’-CCCGGGATGAAAAAAACAATCAGCA-3’；214R：5’-CCCGGGGAACTTGTAACCGCCG-3’。

哈氏弧菌外膜蛋白的应用，所述哈氏弧菌外膜蛋白可作为哈氏弧菌疫苗的疫苗蛋白。

所述哈氏弧菌外膜蛋白与佐剂混配可作为哈氏弧菌疫苗。

所述哈氏弧菌外膜蛋白与佐剂按体积比为1:1。

本发明具有如下优点：本发明的哈氏弧菌外膜蛋白作为疫苗对哈氏弧菌的免疫保护效率皆大于70%。

附图说明

图1为本发明实施例提供的纯化的外膜蛋白。泳道1，分子量标准；泳道2,OMP173；泳道3，OMP214。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法（Sambrookand Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring HarborLaboratory Press2001）；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。

实施例1

本发明的外膜蛋白OMP173和OMP214分别为序列表SEQ ID No.1和No.2中的氨基酸序列。

序列表SEQ ID No.1为：

MQLNKVLKGLLIAIPVMAMTACSSSDDAASNTGAETNTGAAETTVVTPIDQNGQLTEQELKEQALRETQTIYFAFDNSTIAGDYEEMLAAHASYLSKNPALKVTIEGHADERGTPEYNIALGERRAEAVSNYLQALGVQADQISIVSYGEEKPLLLGQSEEVYAKNRRAVLVY

（a）序列特征：

●长度：173

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：蛋白质

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：哈氏弧菌T4

结构特点：该蛋白预期含有一个信号肽（氨基酸1-18）和一个类似OmpA结构域（氨基酸72-167）。

序列表SEQ ID No.2为：

MKKTISSLAVVAALVSPSVFAHSEGDFILRVGAASVVPNDSSDKILGSQEELKVDSNTQLGLTFGYMFTDNISLEILAATPFSHDISTDLLGLGDIADTKHLPPTVMLQYYFGDSQSKFRPYVGAGLNYTMFFDEGFNGKAKDVGLTDLKLDDSFGLAANIGVDYMINESWFLNASAWYANIETEATYKFNGAAQKTDVKINPWVFMISGGYKF

（a）序列特征：

●长度：214

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

（b）分子类型：蛋白质

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：哈氏弧菌T4

结构特点：该蛋白预期含有一个信号肽（氨基酸1-21）和一个类似OmpW结构域（氨基酸23-214）。

实施例2哈氏弧菌外膜蛋白OMP173和OMP214表达载体的构建方法：表达OMP173的质粒pOMP173的构建：

以哈氏弧菌T4为模板，采用173F/173R为引物进行PCR扩增哈氏弧菌外膜蛋白OMP173基因。PCR条件为：94°C60s预变性模板DNA,然后94°C40s,50°C60s,72°C60s,5个循环；然后94°C40s,62°C60s,72°C60s,25个循环后再在72°C延伸反应10min。PCR产物用T₄DNA连接酶与载体pEASY-E2(购于TransGen Biotech,北京)在室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素（100ug/ml）的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为质粒pOMP173。

表达OMP214的质粒pOMP214的构建与质粒pOMP173的构建完全相同，不同之处在于以214F/214R为引物进行扩增。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0%蛋白胨,0.5%酵母粉,1.0%氯化钠,97.5％蒸馏水；所述哈氏弧菌T4保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏单位地址为北京市海淀区中关村北一条13号，保藏编号为：CGMCC No.1985，保藏日期2007.3.22，分类命名为哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。

实施例3

外膜蛋白OMP173的诱导表达和纯化：将上述的质粒pOMP173用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)（购自于“天根生化科技有限公司”，北京），在含有氨苄青霉素（100ug/ml）的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取转化子，将其命名为BL21/pOMP173。

将BL21/pOMP173于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,加入100ml新鲜的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37°C下转速200rpm摇动培养至OD₆₀₀为0.6,加入终浓度为0.4mM的IPTG，30℃继续以转速160rpm摇动培养4-5h，而后以5000g，4°C离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4°C离心30min，回收上清。将上清中的蛋白亲和层析柱His Trap HP Columns（购于美国GE Healthcare公司）回收纯化，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测（8v/cm电压下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h），测定其分子量大小（参见图1）。将纯化的蛋白经质谱分析，发现它的蛋白质质量、结构与OMP173相同，证实其为具有OMP173序列的外膜蛋白。所述裂解液为终浓度的10mMNaH₂PO₄、10mM Tris和8M尿素,pH8.0。

外膜蛋白OMP214的诱导表达和纯化同上。

实施例4

外膜蛋白作为疫苗的应用

步骤1）疫苗混合液的制备。

OMP173疫苗混合液制备：将上述实施例纯化的外膜蛋白OMP173在PBS中稀释至200ug/ml。将稀释后的疫苗蛋白与佐剂等体积混合。佐剂的具体制备见已发表论文（Jiao X,Cheng S,Hu Y,Sun L.Comparative study of the effects of aluminumadjuvants and Freund's incomplete adjuvant on the immune response to an Edwardsiella tarda majorantigen.Vaccine.2010;28:1832–1837）。佐剂对照液制备：将PBS与佐剂等体积混合。

OMP173疫苗混合液制备同上。

所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8%NaCl,0.02%KCl,0.358%Na₂HPO₄.12H₂O,0.024%NaH₂PO₄，余量为水。

步骤2）OMP173和OMP214疫苗的免疫应用。将90条牙鲆（每条重约14.2g）随机分为3组，每组30条。将这3组分别命名为A，B和C组。将A组的每条鱼分别腹腔注射100μl上述步骤1）的OMP173疫苗混合液，将B组的每条鱼分别腹腔注射100μl上述步骤1）的OMP214疫苗混合液，将C组的每条鱼分别腹腔注射100μl上述步骤1）的佐剂对照液。

步骤3）哈氏弧菌悬液的制备。在LB培养基中培养哈氏弧菌T4至OD₆₀₀为1,然后离心（5000g，4℃）10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为1x10⁸cfu/ml。

步骤4）疫苗免疫保护效应检测。在步骤2）免疫注射后的第30天，用上述步骤3）的哈氏弧菌悬液腹腔注射步骤2）的3组鱼，每条鱼的注射量为100μl。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目：A组，6条；B组,8条；C组，27条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：

RPS=100x(1－免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)根据此公式算出OMP173的免疫保护效率为77.8％，OMP214的免疫保护效率为70.3％。因此，所得疫苗能够高效地保护牙鲆抵御哈氏弧菌侵染。

Claims

1.一种哈氏弧菌外膜蛋白，其特征在于：外膜蛋白为序列表SEQ ID No.1或No.2中的氨基酸序列所示。

2.一种权利要求1所述的哈氏弧菌外膜蛋白的制备方法，其特征在于：以哈氏弧菌T4为模板，分别采用173F/173R和214F/214R为引物对进行PCR扩增,PCR产物分别与载体pEASY-E2连接，所得连接液分别转化入大肠杆菌DH5α中，筛选质粒分别为pOMP173和pOMP214；

3.一种权利要求1所述的哈氏弧菌外膜蛋白的应用，其特征在于：所述哈氏弧菌外膜蛋白可作为哈氏弧菌疫苗的疫苗蛋白。

4.权利要求3所述的哈氏弧菌外膜蛋白的应用，其特征在于：所述哈氏弧菌外膜蛋白与佐剂混配可作为哈氏弧菌疫苗。