CN101507815A - 哈维氏弧菌重组外膜蛋白Ompk微球疫苗及其制备方法 - Google Patents

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任燕
吴淑勤
李宁求
常藕琴
石存斌
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Abstract

本发明公开一种微球疫苗及其制备方法。该疫苗是将海水养殖鱼类常见病原哈维氏弧菌的重组外膜蛋白Ompk与生物可降解高分子材料通过乳化、干燥制得的微球疫苗。本发明的微球疫苗制备工艺简单，便于工厂化生产，生产稳定可靠，使用安全、方便，产品收率达80％以上。成品具有抗原含量高、缓释时间长、毒副作用小、便于大规模使用等优点。制成的微球疫苗口服免疫后可较长时间刺激免疫系统产生免疫应答，对供试鱼具有较高的相对保护率，可有效预防海水养殖鱼类弧菌病。

Description

哈维氏弧菌重组外膜蛋白Ompk微球疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种微球疫苗。本发明还涉及该微球疫苗的制备方法。
背景技术
弧菌是一类革兰氏阴性、具极生鞭毛、能运动、无芽胞的短杆菌或弧形细菌，是海洋环境中最常见的细菌类群之一，部分种类为海洋生物的病原菌。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi，Vh)是常见的重要致病菌之一，可感染多种养殖动物，带来巨大的经济损失。近年来，海水鱼弧菌疫苗在防治弧菌病方面发挥越来越重要的作用。渔用疫苗的免疫接种途径主要有四种：注射法、喷雾法、浸泡法和口服法，注射法具有用量少和免疫效果好的优点，但较费时、费力、操作不便、易损伤鱼体等缺陷，难以大规模推广。喷雾法虽有较好的试验效果，但需要疫苗喷射器、传送带等专用设备配置，也难以推广使用；而浸泡法和口服法是通过鱼类的黏膜系统如体表、鳃、后肠等对抗原的摄取而进行免疫，免疫手段简单、实用，适合养殖生产中的大规模免疫，其中浸泡法适合于鱼种阶段的免疫，口服法适合于投喂配合饲料的大规模养殖鱼群，不受鱼的大小及时间的限制，对鱼也不产生应激反应，易于多次重复免疫。哈维氏弧菌重组外膜蛋白Ompk具有良好的免疫原性，且与溶藻弧菌、副溶血弧菌19个分离株Ompk基因序列及氨基酸同源性都较高(71％～100％)，有良好的交叉保护性。但蛋白类亚单位疫苗口服使用时易受到免疫动物胃肠道蛋白酶的消化，需要有效的投递载体和制备方法将亚单位疫苗包裹制成粒径在某一范围的微球。将疫苗微球拌饲投喂免疫鱼，既避免蛋白受胃肠道消化酶及酸性环境的影响降解，又使其能够在鱼类后肠被有效吸收利用。
发明内容
本发明的目的是针对现有弧菌病疫苗注射或浸泡免疫存在的缺点，提供一种可口服的弧菌微球疫苗及其制备方法，解决渔用疫苗在生产实践中操作性难的问题。
本发明将海水鱼哈维氏弧菌重组外膜蛋白Ompk微球疫苗与生物可降解高分子材料通过乳化、干燥制得可口服的微球疫苗，生物可降解高分子材料为壳聚糖、海藻酸钠。
微球疫苗的制备方法包括以下步骤：
(1)将携带Ompk基因的pBV220原核表达质粒的大肠杆菌工程菌株接种含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板，置28℃培养18—20h；挑取单菌落接种于LB液体培养基，30℃培养12h，然后按1：100转接于LB液体培养基，30℃培养6h，将温度急剧升到42℃，诱导培养5-7h，离心收集诱导后菌体，超声波破碎，提取包涵体。包涵体溶解复性，过滤除菌，测定重组蛋白浓度，4℃保存备用。
(2)重组蛋白溶液与等体积的2％海藻酸钠溶液混和，4000～6000r/min乳化5～10min。
(3)将上述乳液与等体积2％壳聚糖溶液混和，8000～11000r/min乳化5～10min。
(4)将(3)所得乳液经喷雾干燥仪脱水制成微球疫苗干粉。
本发明方法简单合理，生产稳定可靠，产品收率达80％以上。成品具有抗原含量高、缓释时间长、毒副作用小、便于大规模使用等优点。制成的微球疫苗口服免疫后可较长时间刺激免疫系统产生免疫应答，对供试鱼具有较高的相对保护率，可有效预防海水养殖鱼类弧菌病。
附图说明
图1诱导后的菌体及纯化的重组蛋白Ompk
图2光学显微镜下的微球疫苗图片(400×)
图3扫描电镜下的微球疫苗图片(1000×)
图4口服微球疫苗后斜带石斑鱼血清抗体效价
具体实施方式
以下就本发明的制造、试验例举例说明。
制造例：制备哈维氏弧菌重组外膜蛋白Ompk微球疫苗
将携带Ompk基因的pBV220原核表达质粒的大肠杆菌工程菌株接种含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板，置28℃培养18—20h；挑取单菌落接种于LB液体培养基，30℃培养12h，然后按1：100转接于LB液体培养基，30℃培养6h，将温度急剧升到42℃，诱导培养7h，离心收集诱导后菌体，超声波破碎，提取包涵体，包涵体经2—4M的脲素溶液洗涤后，用8M脲素溶液溶解，经切向流超滤系统透析浓缩，得到纯度较高的重组蛋白(图1)。测定重组蛋白浓度，过滤除菌后，4℃保存备用。在室温下将重组蛋白溶液与等体积的2％海藻酸钠溶液混和，4000～6000r/min乳化5～10min，将得到的乳液与等体积的2％壳聚糖溶液混和，8000～11000r/min再乳化5～10min，再将所得乳液经喷雾干燥器脱水制成微球疫苗干粉。每克微球疫苗含重组蛋白16.7mg，微球疫苗粒径范围0—10μm，见图2、图3。
试验例：哈维氏弧菌重组外膜蛋白Ompk微球疫苗免疫效果
试验1.微球疫苗安全性试验
经口灌喂10尾健康石斑鱼(体重约50g)壳聚糖—海藻酸钠—哈维氏弧菌重组外膜蛋白Ompk微球疫苗，每尾鱼灌喂0.2g，连续观察7d，石斑鱼均无中毒症状及死亡情况发生。
试验2.对照试验
将健康石斑鱼随机分成三组，每组90尾，第一组为口服微球疫苗组，第二组为口服Ompk蛋白组，第三组为对照组。分别将微球疫苗和Ompk蛋白疫苗拌在饲料中，每天按体重的1％投喂饲料，微球疫苗按1.0g/kg鱼体重投喂连续投喂3d，1周后加强免疫一次(连续投喂3d)，剂量与首次免疫相同，对照组投喂不含疫苗的饲料。水温为22-26℃。
试验3.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测石斑鱼血清抗体效价
首次免疫后的第7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d，每组取3尾，每尾静脉取血0.2ml，室温静置2h，4℃过夜，4000r/min离心10min收集血清，-20℃保存备用。96孔ELISA板用含0.05％多聚赖氨酸100μl包被液室温处理1h，低盐洗液洗2次；用PBS调整抗原Ompk浓度，每孔加100μlOmpk，包板4℃过夜，低盐洗液洗3次；加350μl5％脱脂奶粉，22℃包被2h，用低盐洗液洗三次；用PBS两倍稀释血清，22℃包被2h或者4℃过夜，高盐洗液洗五次；加100μl鼠抗斜带石斑鱼IgM单抗室温2h，高盐洗液洗5次；加100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG室温2h，高盐洗液洗5次；加OPD(邻苯二胺)显色10min；2mol/L硫酸终止。酶标仪于波长450nm读数。在加样品同时设PBS为阴性对照，结果S/P≥2.1判为阳性(S表示样品OD值，P表示阴性对照的OD值)。从图4可以看出，首次免疫后微球疫苗组14d抗体效价达27，35d达到峰值210，可维持到42d，至56d效价仍达26；Ompk蛋白组抗体效价不高(峰值24)。微球疫苗组抗体效价(峰值210)显著高于Ompk蛋白溶液组(峰值24)与对照组。
试验4.免疫保护试验
在首次免疫28d和56d各攻毒一批。从各组随机选30尾，用1.0×108CFU/ml的EcGS020802菌株，以0.1ml/尾的剂量腹腔注射感染各组试验鱼。水温22—26℃饲养观察15d，记录各组试验鱼的发病和死亡情况。口服微球疫苗组在首次免疫28d后相对保护率为69.0％(表1)，免疫56d后相对保护率为42.8％(表2)。
表1  首次免疫28d后各组的相对保护率
Figure A200910037786D00081
表2  首次免疫56d后各组的相对保护率
Figure A200910037786D00082

Claims (6)

1.一种哈维氏弧菌重组外膜蛋白Ompk微球疫苗，其特征在于其是由大肠杆菌表达的哈维氏弧菌重组外膜蛋白Ompk与生物可降解高分子材料通过乳化、干燥制得的微球疫苗。
2.权利要求1所述的一种哈维氏弧菌重组外膜蛋白Ompk微球疫苗，其特征在于生物可降解高分子材料优选壳聚糖、海藻酸钠。
3.一种哈维氏弧菌重组外膜蛋白Ompk微球疫苗的制备方法，其特征是包括以下步骤：
(1)将携带Ompk基因的pBV220原核表达质粒的大肠杆菌工程菌株接种含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板，置28℃培养18—20h，挑取单菌落接种于LB液体培养基，30℃培养12h，然后按1：100转接于LB液体培养基，30℃培养6h，将温度急剧升到42℃，诱导培养5-7h，离心收集诱导后菌体，超声波破碎，提取包涵体，包涵体溶解复性，过滤除菌，测定重组蛋白浓度，4℃保存备用；
(2)重组蛋白溶液与等体积的2％海藻酸钠溶液混和，4000～6000r/min乳化5～10min；
(3)将(2)所得乳液与等体积2％壳聚糖溶液混和，8000～11000r/min乳化5～10min；
(4)将(3)所得乳液经喷雾干燥脱水制成微球疫苗干粉。
4.权利要求3所述的一种哈维氏弧菌重组外膜蛋白Ompk微球疫苗的制备方法，其特征是包涵体经2—4M的脲素溶液洗涤后，用8M脲素溶液溶解，经切向流超滤系统透析浓缩，得到纯度较高的重组蛋白。
5.权利要求3所述的一种哈维氏弧菌重组外膜蛋白Ompk微球疫苗的制备方法，其特征在于所述干燥采用喷雾干燥仪。
6.根据权利3所述的哈维氏弧菌重组外膜蛋白Ompk微球疫苗的制备方法，其特征在于制得的微球疫苗粒径范围为0～10μm。
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