CN101934073B

CN101934073B - 牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗及生产方法

Info

Publication number: CN101934073B
Application number: CN2010101207595A
Authority: CN
Inventors: 郜玉钢; 张连学; 臧埔; 李璠瑛; 王南; 李然; 杜锐; 王全凯; 刘佳佳; 于文影; 王亚兴
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2010-03-06
Filing date: 2010-03-06
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2030-03-06
Also published as: CN101934073A

Abstract

牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗及生产方法，用于动物牛病毒性腹泻病防治，克服现有的灭活苗，核酸疫苗免疫原性差、保护力低，活毒疫苗使用不安全的缺点。本发明是以牛病毒性腹泻病毒RNA为模板，用反转录-聚合酶链式反应法获得其E₀基因，再构建其基因E₀重组植物表达载体，然后采用花粉管通道法，得到牛病毒性腹泻病毒E₀基因转化黄芪。通过蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法筛选具有免疫源性的牛病毒性腹泻病毒基因E₀转化的黄芪，得疫苗产品。本发明的有益效果是：将牛病毒性腹泻病毒E₀基因在黄芪中表达，既产生保护性抗原又产生增强免疫作用的佐剂物质，提高了黄芪抗病毒的作用和疫苗的免疫效果。还有易生产、使用方便、稳定性强、无负作用的优点。

Description

牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗及生产方法

技术领域

本发明属于兽药技术或生物技术领域，具体涉及牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗产品及制备方法。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒呈世界性分布，易感动物较多，如鹿、牛、猪、羊等，且它们间可相互传染。该病毒引起的疾病全年均可发生。牛病毒性腹泻病毒可导致动物的病毒性腹泻、粘膜病、流产、死胎、弱胎、畸形胎、持续性感染、免疫耐受、血小板减少和出血性综合症等多种临床症状，还可导致非典型性猪瘟，给鹿业和奶牛业及养猪业造成极大的危害；尤其是在人用的疫苗中发现了该病毒，这对人类是一个潜在的威胁。牛病毒性腹泻病是全球性传染病，具有较高的感染率，流行的范围在不断扩大，阳性率在逐年增高。该病的发生和流行给养殖业造成了重大的经济损失。由于灭活苗，核酸疫苗，亚单位疫苗免疫原性差、保护力低，而活毒疫苗不安全等原因，至今尚无很好的疫苗可供使用，亦无治疗的特效药，因此急需研制有效的疫苗和治疗的特效药。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗，用于动物牛病毒性腹泻病防治，克服现有的灭活苗，核酸疫苗免疫原性差、保护力低，活毒疫苗使用不安全的缺点。

本发明是将牛病毒性腹泻病毒保护性抗原基因在可食性的抗病毒的药用植物黄芪宿主中表达得到的疫苗产品。

本发明的牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗是先以牛病毒性腹泻病毒RNA为模板用反转录-聚合酶链式反应法获得E₀基因，再构建牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体，然后采用花粉管通道法，将牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体溶液滴注在处于半开放的黄芪花的柱头上，待黄芪种子成熟时收获种子，种植所收获的种子得到再生苗，对再生苗分别进行聚合酶链式反应鉴定和反转录-聚合酶链式反应法鉴定及蛋白质电泳法鉴定，得到牛病毒性腹泻病毒E₀基因转化黄芪，再通过蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法筛选具有免疫源性的牛病毒性腹泻病毒基因E₀转化的黄芪，所得到的疫苗产品。

本发明药用植物疫苗的表达宿主还可以选用人参、鱼腥草、莪术、防风、刺五加。

本发明疫苗的制备方法包括以下步骤：

1、牛病毒性腹泻病毒基因E₀基因的获得

以提取RNA常规方法提取的牛病毒性腹泻病毒基因组RNA为模板，用反转录-聚合酶链式反应法扩增E₀基因。扩增所用的引物序列如下：上游：5′-CCGGATCCACCATGGAAAACATAACACAGTGG-3′；下游：5′-GCGAGCTCTTAAGCGTATGCTCCAAACCACGT-3′。反转录-聚合酶链式反应产物经琼脂糖凝胶电泳后，按维特洁DNA回收试剂盒说明书操作，回收目的基因E₀

2、牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体构建

分别用DNA限制性内切酶双酶切经凝胶纯化的目的基因E₀及植物表达载体DNA，用T4 DNA连接酶16℃条件下连接16h，取5μl连接产物转化感受态大肠杆菌工程菌，挑取转化菌单菌落抽提质粒，经聚合酶链式反应鉴定和DNA限制性内切酶双酶切鉴定及序列分析筛选牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体转化的重组工程菌，

3、牛病毒性腹泻病毒基因E₀花粉管通道法转化黄芪

大量培养重组工程菌，用碱裂解法大量制备牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体。选取花多、大而整齐的黄芪，用注射器将1-2ng/μl牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体溶液滴注于半开放的、颜色鲜艳的花的柱头之上，去除已经开放、花色暗淡的花朵以及还未开放的花朵，待种子成熟时收获种子，室温保存。对收获种子种植制备再生苗，对再生苗分别进行聚合酶链式反应鉴定和反转录-聚合酶链式反应法鉴定及蛋白质电泳法鉴定，筛选出牛病毒性腹泻病毒基因E₀转化的黄芪。

4、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗的筛选

对牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪，通过蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法筛选具有免疫源性的牛病毒性腹泻病毒基因E₀转化的黄芪，得本发明疫苗产品，见表1。将牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗，移植大田进行扩繁，九月份收获转基因黄芪。

表1酶联免疫吸附法筛选牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗

组别	牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪	牛病毒性腹泻病毒对照	黄芪对照
				OD值	0.42±0.021	0.43±0.024	0.22±0.018

※：不同字母间表示差异显著(P＜0.05)，相同字母间表示差异不显著(P＞0.05)。

本发明是基于：

1、黄芪，为豆科多年生草本植物膜荚黄芪和蒙古黄芪的干燥根。始载于《神农本草经》，味甘性温，入脾、肺二经，有补气升阳、固表止汗、托毒排脓、利水消肿和生肌等功效。含有多种皂苷类、多糖、黄酮、氨基酸、微量元素等化学物质，具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫、抗衰老、抗氧化、抗辐射和抗应激药理作用。黄芪可提高体液免疫功能，慢性感染性疾病患者注射黄芪20d后，血液中免疫球蛋白IgG、IgA及IgM的含量明显升高，还可使肝炎患者的总补体CH50和分补体C3明显升高。黄芪可提高细胞免疫功能，黄芪多糖对T淋巴细胞体和B淋巴细胞体外增殖均有有明显的促进作用，黄芪多糖还有增强巨噬细胞的吞噬作用，提高自然杀伤细胞NK的活性。本发明充分运用了黄芪抗病毒和免疫增强佐剂的特性。

2、牛病毒性腹泻病毒的结构蛋白E₀和E₂均可诱导机体产生保护反应，但E₂蛋白保守性较低，抗原性变异较大，是导致病毒逃逸率高、疫苗保护率低和持续性感染的主要原因，而E₀蛋白保守性较高，又具有抗原性，更适合研制基因工程苗。

3、植物易于转化并能提供廉价的蛋白质源，并且具有使用安全、生产简单、可直接口服等优点，因此植物疫苗在动物疾病防控方面将有极大的发展空间。花粉管通道法的优点是不依赖组织培养而人工再生植株，操作简单，单胚珠和多胚珠的单双子叶植物均可应用，育种时间短，基因纯合速度快，可直接获得转基因植株，导入的DNA分子整合效率较高，可直接运用到常规育种。

本发明的有益效果是：将牛病毒性腹泻病毒E₀基因在黄芪中表达，既产生保护性抗原又产生增强免疫作用佐剂物质，提高了黄芪抗病毒的作用和疫苗的免疫效果。本发明为疫苗和药用植物联合应用，为研制新型基因疫苗打下坚实的理论基础和提供新的研究思路。与牛病毒性腹泻病毒活毒疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗相比，本发明的牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗还具有容易生产、使用方便、稳定性强、安全，没有负作用的优点。本发明对更有效地控制牛病毒性腹泻病的传播和流行，繁荣畜牧业具有重要的理论意义和应用价值。

本发明的疫苗的用法和用量：

1、预防用法与用量

使用对象为鹿、牛、猪，饲喂时添加牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗(鹿20克/日.只，牛30克/日.只，猪10克/日.只)，连喂3天，隔10天后再同法饲喂3天。

2、治疗用法与用量

使用对象为鹿、牛、猪，饲喂时添加牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗(鹿40克/日.只，牛60克/日.只，猪20克/日.只)，连喂3天。

附图说明

图1牛病毒性腹泻病毒E₀基因反转录-聚合酶链式反应电泳图。

图2牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体聚合酶链式反应电泳图。

图3牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体的酶切鉴定电泳图。

图4牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪聚合酶链式反应鉴定电泳图

图5牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪的反转录-聚合酶链式反应鉴定电泳图

图6牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪蛋白质电泳检测

图7牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪蛋白质印迹法检测

1、本发明动物实验例

实验例1，牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗对鹿的免疫作用

1、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗对鹿的免疫

选24头1月龄健康仔鹿随机分成三组，每组8只，第1组为牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗免疫组，饲喂时添加牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗20克/日.只。第2组为黄芪黄芪对照组，饲喂时添加黄芪20克/日.只。第3组为玉米秸粉对照组，饲喂时添加20克/日.只。连喂3天，隔10天后加强免疫一次，分别再饲喂3天。于初次免疫前当日和末次饲喂后第4周经颈静脉取血，分离血清和淋巴细胞。酶联免疫吸附法检测鹿的特异性体液免疫应答，淋巴细胞转化实验检测细胞免疫水平。

2、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗对鹿的体液特异性免疫应答

将纯化牛病毒性腹泻病毒可溶性全病毒抗原，用pH8.0包被液稀释，每孔加入100μl，包被酶标板4℃过夜。弃去液体，用缓冲液3×3洗涤。用含10％马血清37℃封闭2h。缓冲液洗涤同上。加入200倍稀释的待检鹿血清100μ1，37℃感作1h。缓冲液洗涤同上。加入5000倍稀释的兔抗鹿酶标二抗感作1h。缓冲液洗涤同上，加入底物37℃显色反应15min。每孔加50μl 2M H₂SO₄，终止反应，测定OD₄₉₀值。结果用光密度(OD)的比率来表示，即一个实验样品的OD₄₉₀和0天样品OD₄₉₀间的比率。OD比值＞2时显示为阳性。OD比值在1.5-1.9之间的样品被记为弱阳性。OD比值＜1.5时为阴性。实验结果表明，初次饲喂前当日，各组均为牛病毒性腹泻病毒抗体阴性。牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗组在末次免疫4周后产生显著的IgG应答，而饲喂黄芪组和对照组没有检察到牛病毒性腹泻病毒抗体效价。见表2。

表2牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗诱导鹿体液特异性免疫(OD值)

处理	玉米秸粉对照	黄芪对照	牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗
				免疫前当日	0.211±0.034A	0.203±0.026A	0.212±0.028A
末次免疫后第4周	0.207±0.029A	0.210±0.033A	0.512±0.038B

3、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗诱导鹿细胞免疫应答

将所采的2ml鹿血注入盛有肝素的无菌瓶内(每1ml血加125-250U/ml肝素0.1ml)立即轻轻摇匀，使血液抗凝。再无菌吸入等体积的室温预温的Hank’S液，使血液等倍稀释。吸取2ml淋巴细胞分层液注入6ml离心管中，然后将4ml稀释的血液沿离心管壁缓慢加至分层液顶部，保持界面清晰，勿使血液快速混入分层液内。于20℃，2000rpm/min离心20min，管内液体可分为以下4层，上层为血浆及绝大部分血小板，下层为红细胞及粒细胞，中层为淋巴细胞分层液，分层液与血浆交界部位混浊的灰白层即为单个核细胞层。离心温度为18-20℃。离心速度在2000rpm-2500rpm/min，离心10-15min。将毛细管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞，放入新的离心管中离心，然后用3倍体积的Hank’S液洗涤2次，每次1500rpm/min离心10min，除去大部分混杂的血小板，再用10％犊牛血清1640细胞培养液1ml重悬，每组4管的细胞分离的淋巴细胞可暂时保存在4℃，并在24小时之内使用。用5％台酚蓝染色法检查所分离细胞的存活率，存活率＞95％为合格。取50μl重悬细胞液用450μl的2％冰乙酸溶液混匀，放在细胞计数板上，通过倒置显微镜计数。用加双抗的10％犊牛血清1640细胞培养液调整细胞浓度为5×10⁶个/ml，加入96孔培养板中，每孔100μl细胞悬液。加入最适量的植物血凝素PHA，100μl/孔，同时设只加细胞培养液的阴性对照组，每组设3个重复孔，每孔终体积为200μl。37℃，5％CO₂培养箱内培养6d。在培养的细胞中每孔加入10μl MTT，继续培养4h。小心吸弃上清夜，再加入二甲基亚枫100μl/孔，用移液器吹打数次。在酶标仪上微量震荡后于570nm处测吸光值A。结果表明，BVDV转基因黄芪疫苗组和饲喂黄芪组，鹿血液都对植物血凝素的刺激均产生了强烈的应答，且BVDV转基因黄芪疫苗组显著高于饲喂黄芪组。而饲喂玉米秸粉对照组没有产生T-细胞免疫应答。见表3。

表3牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗诱导鹿细胞免疫应答(OD值)

处理

玉米秸粉对照

黄芪对照

牛病毒性腹泻病毒转

			基因黄芪疫苗
				末次免疫后第4周	0.186±0.011A	0.296±0.033B	0.406±0.039C

实验例2牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗对毒牛的免疫作用

1、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗对牛的免疫

选15头1月龄健康犊牛随机分成三组，每组5只，第1组为牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗免疫组，饲喂时添加BVDV转基因黄芪疫苗30克/日.头。第2组为黄芪对照组，饲喂时添加黄芪30克/日.头。第3组为玉米秸粉对照组，饲喂时添加玉米秸粉30克/日.头。连喂3天，隔10天后强免疫一次，分别再饲喂3天。于初次免疫前当日和末次饲喂后第4周经颈静脉取血，分离血清和淋巴细胞。酶联免疫吸附法检测鹿的特异性体液免疫应答，淋巴细胞转化实验检测细胞免疫水平。

2、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗对牛的体液特异性免疫应答

方法同实施例2(2)，不同的是待检血清为牛血清，酶标二抗是兔抗牛酶标二抗。实验结果表明，初次饲喂前当日，牛病毒性腹泻病毒抗体各组均为阴性。牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗组在末次免疫4周后产生显著的体液特异性免疫应答，而饲喂黄芪组和对照组没有检察到牛病毒性腹泻病毒抗体效价。见表4。

表4 BVDV转基因黄芪疫苗诱导牛体液特异性免疫(OD值)

处理	玉米秸粉对照	黄芪对照	牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗
				免疫前当日	0.186±0.012A	0.195±0.012A	0.189±0.013A
末次免疫后第4周	0.183±0.012A	0.192±0.023A	0.462±0.038B

3、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗诱导牛细胞免疫应答

方法同实施例2(3)。结果表明，牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗组和饲喂黄芪组，牛血液都对植物血凝素的刺激均产生了强烈的应答，且牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗组显著高于饲喂黄芪组。而饲喂玉米秸粉对照组没有产生T-细胞免疫应答。见表5。

表5牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗诱导牛细胞免疫应答(OD值)

处理	玉米秸粉对照	黄芪对照	牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗
				末次免疫后第4周	0.186±0.033A	0.279±0.033B	0.388±0.055C

实验例3：牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗对猪的免疫作用

1、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗对猪的免疫

选30头1月龄健康仔猪随机分成三组，每组10只，第1组为牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗免疫组，饲喂时添加牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗10克/日.只，第2组为黄芪对照组，饲喂时添加黄芪10克/日.只，第3组为玉米秸粉对照组，饲喂时添加玉米秸粉10克/日.只。连喂3天，隔10天后加强免疫一次，分别再饲喂3天。于初次免疫前当日和末次饲喂后第4周经颈静脉取血，分离血清和淋巴细胞。酶联免疫吸附法检测鹿的特异性体液免疫应答，淋巴细胞转化实验检测细胞免疫水平。

2、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗免疫猪后的体液特异性免疫应答

方法同实施例2(2)，不同的是待检血清为猪血清，酶标二抗是兔抗猪酶标二抗。实验结果表明，初次饲喂前当日，牛病毒性腹泻病毒抗体各组均为阴性。牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗组在末次免疫4周后产生显著的IgG应答，而饲喂黄芪组和对照组没有检察到牛病毒性腹泻病毒抗体效价。见表6。

表6牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗诱导猪体液特异性免疫(OD值)

处理	玉米秸粉对照	黄芪对照	牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗
				免疫前当日	0.219±0.021A	0.196±0.026A	0.207±0.019A
末次免疫后第4周	0.215±0.014A	0.210±0.027A	0.445±0.039B

3、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗诱导猪细胞免疫应答

方法同实施例2(3)。结果表明，牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗组和饲喂黄芪组，猪血液都对植物血凝素的刺激均产生了强烈的应答，且牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗组显著高于饲喂黄芪组。而饲喂玉米秸粉对照组没有产生T-细胞免疫应答。见表7。

表7牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗诱导猪细胞免疫应答(OD值)

处理	玉米秸粉对照	黄芪对照	牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗
				末次免疫后第4周	0.184±0.011A	0.289±0.033B	0.415±0.046C

具体实施方式

1、牛病毒性腹泻病毒基因E₀基因的获得

以提取RNA常规方法提取的牛病毒性腹泻病毒基因组RNA为模板，用反转录-聚合酶链式反应法扩增E₀基因。扩增所用的引物序列如下：上游：5′-CCGGATCCACCATGGAAAACATAACACAGTGG-3′；下游：5′-GCGAGCTCTTAAGCGTATGCTCCAAACCACGT-3′。反转录-聚合酶链式反应产物经琼脂糖凝胶电泳后，按维特洁DNA回收试剂盒说明书操作，回收目的基因E₀见图1。

2、牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体构建

分别用DNA限制性内切酶双酶切经凝胶纯化的目的基因E₀及植物表达载体DNA，用T4DNA连接酶16℃条件下连接16h，取5μl连接产物转化感受态大肠杆菌工程菌，挑取转化菌单菌落抽提质粒，经聚合酶链式反应鉴定和DNA限制性内切酶双酶切鉴定及序列分析筛选牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体转化的重组工程菌，见图2，图3及基因序列表。。

3、牛病毒性腹泻病毒基因E₀花粉管通道法转化黄芪

大量培养重组工程菌，用碱裂解法大量制备牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体。7月中旬期间，选取花多、大而整齐的两年生膜荚黄芪，用注射器将1-2ng/μl牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体溶液滴注于半开放的、颜色鲜艳的花的柱头之上，去除已经开放、花色暗淡的花朵以及还未开放的花朵，待种子成熟时收获种子，室温保存。对收获种子种植制备再生苗，对再生苗分别进行聚合酶链式反应鉴定和反转录-聚合酶链式反应法鉴定及蛋白质电泳法鉴定，筛选出牛病毒性腹泻病毒基因E₀转化的黄芪，见图4，图5，图6。

4、牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗的筛选

对牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪，通过蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法筛选具有免疫源性的牛病毒性腹泻病毒基因E₀转化的黄芪，得本发明疫苗产品，见图7和表1。将牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗，移植大田进行扩繁，九月份收获转基因黄芪。

Claims

1.牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗生产方法，其特征是将牛病毒性腹泻病毒保护性抗原基因在可食性的抗病毒的黄芪宿主细胞中表达。

2.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗生产方法，其特征是：先以牛病毒性腹泻病毒RNA为模板用反转录-聚合酶链式反应法获得E₀基因，再构建牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体，然后采用花粉管通道法，将牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体溶液滴注在处于半开放的黄芪花的柱头上，待黄芪种子成熟时收获种子，种植所收获的种子得到再生苗，对再生苗分别进行聚合酶链式反应鉴定和反转录-聚合酶链式反应法鉴定及蛋白质电泳法鉴定，得到牛病毒性腹泻病毒E₀基因转化黄芪，再通过蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法筛选具有免疫源性的牛病毒性腹泻病毒基因E₀转化的黄芪，包括以下步骤：

(1)牛病毒性腹泻病毒基因E₀基因的获得

以提取RNA常规方法提取的牛病毒性腹泻病毒基因组RNA为模板，用反转录-聚合酶链式反应法扩增E₀基因，扩增所用的引物序列如下：上游：5′-CCGGATCCACCATGGAAAACATAACACAGTGG-3′；下游：5′-GCGAGCTCTTAAGCGTATGCTCCAAACCACGT-3′，反转录-聚合酶链式反应产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收得到E₀基因；

(2)牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体构建

将步骤(1)得到的目的基因分别用DNA限制性内切酶双酶切经凝胶纯化的目的基因产物及植物表达载体DNA，用T4 DNA连接酶在16℃条件下连接16h，取适量连接产物转化感受态大肠杆菌工程菌，挑取转化菌单菌落抽提质粒，经聚合酶链式反应鉴定和DNA限制性内切酶双酶切鉴定后，进行牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体序列分析，筛选得到含牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体转化的工程菌，大量培养重组菌株，用碱裂解法大量制备牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体，用缓冲液将其稀释成浓度为1-2ng/μl的牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体；

(3)牛病毒性腹泻病毒基因E₀花粉管通道法转化黄芪

大量培养重组工程菌，用碱裂解法大量制备牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体，7月中旬期间，选取花多、大而整齐的两年生膜荚黄芪，用注射器将步骤(2)得到的1-2ng/μl的牛病毒性腹泻病毒基因E₀重组植物表达载体溶液滴注于半开放的、颜色鲜艳的花的柱头之上，去除已经开放、花色暗淡的花朵以及还未开放的花朵，待种子成熟时收获种子，室温保存，对收获种子种植得再生苗，对再生苗分别进行聚合酶链式反应鉴定和反转录-聚合酶链式反应法鉴定及蛋白质电泳法鉴定，筛选出牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪；

(4)牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪疫苗的筛选

对牛病毒性腹泻病毒转基因黄芪，通过蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法筛选具有免疫源性的牛病毒性腹泻病毒基因E₀转化的黄芪，得疫苗产品。