CN113018454A - 一种纳米纤维素载药/抗原系统及其在水产养殖中的应用 - Google Patents

一种纳米纤维素载药/抗原系统及其在水产养殖中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113018454A
CN113018454A CN202110267411.7A CN202110267411A CN113018454A CN 113018454 A CN113018454 A CN 113018454A CN 202110267411 A CN202110267411 A CN 202110267411A CN 113018454 A CN113018454 A CN 113018454A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cellulose
nano
virus
protein
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110267411.7A
Other languages
English (en)
Inventor
王高学
刘天强
王二龙
李林翰
凌飞
马瑞
朱斌
姜海峰
刘韬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Wankesen Biotechnology Co ltd
Northwest A&F University
Original Assignee
Northwest A&F University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwest A&F University filed Critical Northwest A&F University
Priority to CN202110267411.7A priority Critical patent/CN113018454A/zh
Publication of CN113018454A publication Critical patent/CN113018454A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K61/00—Culture of aquatic animals
    • A01K61/10—Culture of aquatic animals of fish
    • A01K61/13—Prevention or treatment of fish diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种纳米纤维素载药/抗原系统及其在水产养殖中的应用，通过将纳米纤维素载抗病毒药物，或纳米纤维素载抗病毒药物及纳米纤维素载病毒抗原，浸浴处理水产动物苗种，利用纳米纤维素使得抗病毒药物和厚朴酚、病毒抗原蛋白在水体中由鱼、虾、蟹、贝类等水生动物的体表穿透进入个体的细胞、组织内，杀灭并完全清除这些水生动物体内的相应病毒，可以用于在水产养殖过程中生产鱼、虾、蟹、贝类等水产动物无病毒携带苗种。

Description

一种纳米纤维素载药/抗原系统及其在水产养殖中的应用
技术领域
本发明涉及水产养殖中鱼、虾、蟹、贝类等的病毒携带苗种的培育，具体涉及一种纳米纤维素载药/抗原系统的构建及其在水产养殖上的应用。
背景技术
病毒性疾病是鱼、虾、蟹、贝类等水产动物在实际生产中面临的防治难度最大、危害最为严重的病害。其最大特点是发病速度快，一旦爆发常导致毁灭性死亡和重大经济损失。因此，开展疫苗免疫和药物防治病毒性疾病研究已成为水产病害防控和水产养殖业可持续发展的关键。水产动物病毒性疾病的传播途径可分为垂直传播和水平传播两种方式。即使在养殖实践中能彻底隔绝水产养殖动物间的水平传播，但同时存在的垂直传播使得子代仍然携带病毒，一旦水环境恶化或外界养殖环境变化导致水产养殖动物免疫功能下降，病毒性疾病随之爆发性传播，导致大规模死亡。
对水产动物病毒药物和疫苗防治固然受限于病毒变异系数大这一重要因素。但妨碍抗病毒药物防控的难点更在于生物体天然存在的细胞、组织及血脑屏障等系统阻止了药物分子进入病灶及作用于靶点，导致药物分子进入细胞内的剂量受到限制，往往达不到有效抑制或杀灭体内病毒的药物浓度。而阻止渔用疫苗大规模推广应用的关键技术瓶颈是免疫途径及效果。常用渔用疫苗的免疫途径可分为3种。其中，注射免疫途径保护率可以达到40-90％，但只适用于大规格水产养殖动物，不能满足大规模水产动物养殖的防疫需要；口服免疫途径使用的疫苗，其抗原易被消化酶水解，导致免疫效果降低，保护率一般为10-50％；浸浴免疫适合小规格水产养殖动物，操作简单、成本低，适用于大规模免疫，但水产养殖动物的皮肤、粘膜等保护屏障降低了其免疫效果，免疫保护率仅达到30-60％。因此，构建能突破生物体屏障系统的载运药物和疫苗的系统，对于水产养殖动物病毒性疾病的防控和生产水产无特定病毒携带的苗种(即SPF苗种)具有重要意义。
纤维素是由葡萄糖组成的天然高分子聚合物，其来源广泛、资源丰富，价格低廉。天然纤维素经过粉碎、酸碱处理或酶水解等处理可得到微晶纤维素、纳米纤维素等一系列微细化纤维。与粉体纤维和微晶纤维素相比，纳米纤维素所具有的生物相容性、生物可降解性和安全无毒等优点在构建药物及疫苗载运系统、药物缓释和组织工程支架等方面具有良好的应用前景和潜力。在医学领域，纳米纤维素载药和载疫苗方面的研究主要集中在载抗癌药物、水凝胶载药和伤口敷料等方面，在水产动物抗病毒药物特别是在制备水产动物SPF苗种方面还没有报道。
目前，生产实践中通过大量、多代筛选野生无病毒亲本，再通过野生无病毒亲本的数代培育产生子代，并进行病毒检测，最终获得SPF苗种。但是，通过该方法生产水产动物SPF苗种存在生产周期长、成本高、隔断病毒的难度大等缺点，限制了水产动物SPF苗种的生产与推广应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纳米纤维素载药/抗原系统及其在水产养殖中的应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种纳米纤维素载药/抗原系统，该系统包括羧基化修饰的纳米纤维素以及连接在该纳米纤维素上的水产动物抗病毒药物或相应病毒的抗原蛋白，所述抗病毒药物、抗原蛋白分别通过自身氨基与所在系统中的羧基化修饰的纳米纤维素进行化学连接。
优选的，所述抗病毒药物为和厚朴酚。
优选的，所述系统中抗病毒药物的质量分数为10.7％-76.5％。
优选的，所述抗原蛋白包括病毒外衣壳蛋白(例如，弹状病毒G蛋白)，抗原蛋白为人工合成或基于基因工程构建的表达系统制备获得。
优选的，所述抗原蛋白还包括与病毒外衣壳蛋白融合表达的His标签。
优选的，所述系统中抗原蛋白的质量分数为10％-60％。
上述纳米纤维素载药系统的制备方法，包括以下步骤：
1.1)将细菌纤维素进行酸化处理，得到纳米纤维素；
1.2)将酸化处理所得纳米纤维素进行羧基化修饰，然后与抗病毒药物(例如，和厚朴酚)进行化学连接，得到纳米纤维素载抗病毒药物复合物，即纳米纤维素载药系统。
优选的，所述步骤1.1)具体包括以下步骤：将细菌纤维素清洗、干燥及粉粹，然后加入到质量分数40％-80％的硫酸溶液中，并于45-80℃搅拌(600-1000r/min)反应45-240min，其中，细菌纤维素:硫酸(H2SO4)的质量比为1:40-70；反应结束后于水中透析至pH为6.5-8.5；将所得透析液干燥(例如，冷冻干燥)，得到纳米纤维素。
优选的，所述步骤1.2)具体包括以下步骤：将100-500g步骤1.1)得到的纳米纤维素加入到含有150-750mg硼氢化钠的0.6M氢氧化钠溶液中，得混合物，然后在10-20min内将1-3倍氢氧化钠溶液体积的1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入该混合物中，并在20-25℃搅拌反应8-12h，得反应液，将反应液进行固液分离(例如，真空抽滤)，将所得固体物质水洗至pH为6.5-8.5后进行干燥(例如，依次用质量分数为30％、50％、70％、100％的丙酮冲洗滤膜上的固体物质)，得到羧基化修饰的纳米纤维素；将10-100g羧基化修饰的纳米纤维素与1-15g和厚朴酚于0.1M的氢氧化钠溶液中混合，然后于30-40℃搅拌反应12-24h，反应结束后进行固液分离(例如，真空抽滤)，对所得固体物质依次用水、pH为7.5-8的0.1M碳酸钠缓冲液洗涤后进行干燥(例如，冷冻干燥)，得到纳米纤维素载和厚朴酚复合物。
上述纳米纤维素载抗原系统的制备方法，包括以下步骤：
2.1)将细菌纤维素进行酸化处理，得到纳米纤维素；
2.2)将酸化处理所得纳米纤维素进行羧基化修饰，得到羧基化修饰的纳米纤维素；
2.3)将羧基化修饰的纳米纤维素与所述抗原蛋白(例如，弹状病毒重组G蛋白)进行化学连接，得到纳米纤维素载病毒抗原复合物，即纳米纤维素载抗原系统。
优选的，所述步骤2.3)具体包括以下步骤：将羧基化修饰的纳米纤维素加入到pH为5.6-6.2的0.1M 2-吗啉乙磺酸缓冲液中后超声处理0.2-0.5h，得混合物，向该混合物中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和N-羰基琥珀酸亚胺后超声处理1-2h，其中，羧基化修饰的纳米纤维素:乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺的质量比为1:2-7，羧基化修饰的纳米纤维素:N-羰基琥珀酸亚胺的质量比为1:5-10，然后进行固液分离(例如，离心)，并将所得固体物质与pH为7.2-7.4的PBS缓冲液混合，得混合液，向混合液中加入病毒抗原蛋白(例如，弹状病毒重组G蛋白)后于20-25℃搅拌反应6-48h，其中，羧基化修饰的纳米纤维素:病毒抗原蛋白的质量比为1:1-5，反应结束后于水中透析(3-5d)，将所得透析液固液分离(例如，离心)，然后将所得固体物质干燥(例如，冷冻干燥)，得到纳米纤维素载病毒抗原复合物。
优选的，所述病毒抗原蛋白的制备方法包括以下步骤：通过PCR扩增以及目的基因克隆获取病毒抗原蛋白中与病毒蛋白同源部分(例如，弹状病毒G蛋白)的目的基因，构建目的基因的原核表达载体，将所述原核表达载体转化宿主菌，得到病毒抗原蛋白原核表达菌株，对所述原核表达菌株进行诱导培养，然后对存在于培养体系中(胞内和/或胞外)的融合蛋白进行提取、纯化和复性。
上述纳米纤维素载药/抗原系统在制备水产动物无特定病毒携带的苗种(SPF苗种)中的应用。
优选的，所述水产动物的种类为鱼、虾、蟹或贝类。
优选的，所述水产动物无特定病毒携带的苗种的制备中，将纳米纤维素载药/抗原系统用水单独或混合稀释并搅拌混合均匀，然后泼洒于刚孵化出的仔鱼、虾苗、蟹苗或贝类的幼苗池中进行浸浴。
优选的，在幼苗池中，所述抗原蛋白的浓度为2-30mg/L，所述抗病毒药物的浓度为5-40mg/L，浸浴时间为1-5小时。
纳米纤维素在制备外用(例如，通过浸浴)水产动物抗病毒(例如，弹状病毒)药物或免疫保护制剂(例如，疫苗)中的应用。
和厚朴酚在制备水产动物抗病毒药物中的应用，或者病毒重组外衣壳蛋白在制备水产动物免疫保护制剂中的应用。
本发明的有益效果体现在：
本发明对广泛存在的细菌纤维素进行纳米化处理(例如，通过酸化)，制得的纳米纤维素能够在水体中穿透水产动物的体表进入组织、细胞内。因此，通过浸浴可大量将利用其装载(纳米纤维素通过化学键耦连抗病毒药物或病毒抗原蛋白)的药物和/或抗原带入水产动物体内，达到杀灭水产动物体内所含病毒的效果，有效解决了水产动物病毒性疾病垂直传播难以阻断的难题，且成本低、使用方法简单，适宜在水产养殖苗种产业SPF苗种生产实践中推广应用。
附图说明
图1为鲈鱼弹状病毒G蛋白基因的PCR扩增结果，其中泳道M1为DM2000 DNA相对分子质量标准，泳道1为G蛋白基因的PCR扩增产物。
图2为pMD19T-G双酶切鉴定结果，其中泳道M1为DM2000 DNA相对分子质量标准，泳道1为pMD19T-G，泳道2为EcoR I和Hind III双酶切pMD19T-G。
图3为pET32a-G双酶切鉴定结果，其中泳道M1为DM2000 DNA相对分子质量标准，泳道1为pET32a-G，泳道2为EcoR I和Hind III双酶切pET32a-G。
图4为pET32a-G/BL21蛋白表达的SDS-PAGE分析结果，其中泳道M1为蛋白质相对分子质量标准，泳道1为pET32a-G/BL21未诱导；泳道2为IPTG诱导pET32a-G/BL21后的总蛋白提取物。
图5为pET32a-G/BL21蛋白表达的Western Blot分析结果，其中泳道M1为蛋白质相对分子质量标准，泳道1为目的蛋白(融合蛋白)。
图6为酸化所得纳米纤维素AFM(原子力显微镜)图。
图7为氨基化修饰的纳米纤维素AFM(原子力显微镜)图。
图8为羧基化修饰的纳米纤维素AFM(原子力显微镜)图。
图9为原始纤维素、酸化所得纳米纤维素和羧基化修饰的纳米纤维素的傅里叶变换红外吸收光谱图。
图10为罗丹明B标记的纳米纤维素在鲈鱼仔鱼体内的激光共聚焦显微镜图。
图11为罗丹明B标记的纳米纤维素在鲈鱼体内不同组织的激光共聚焦显微镜图。
图12为和厚朴酚标准品液相工作曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
试验例1纳米纤维素穿透鱼体试验
1.1材料
1.1.1细菌纤维素与试验鱼苗种
细菌纤维素样品购自海南亿德食品有限公司；二月龄鲈鱼苗种购自福建三明加州鲈苗种场。
1.1.2试剂
浓硫酸、氢氧化钠、硼氢化钠、碳酸钠，及次氯酸钠购自国药集团化学试剂有限公司；环氧氯丙烷、乙醇、丙酮、一水合氨，及多聚甲醛购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；透析袋(RC膜，14KDa)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；1,4-丁二醇二缩水甘油醚、MES、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，及N-羰基琥珀酸亚胺购自美国sigma公司；异硫氰酸罗丹明B(罗丹明B)购自上海麦克林生化科技有限公司。
1.1.3试验仪器
ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，上海特成机械设备有限公司；H1650-W型台式高速微量离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；1010-3B型电热恒温鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；SY-360型超声波提取器，上海宁商超声仪器有限公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术(上海)有限公司；Veeco MultiMode V原子力显微镜，德国布鲁克公司；傅里叶变换红外光谱仪NicoletiS10，美国赛默飞。
1.2试验方法
1.2.1纳米纤维素制备
将细菌纤维素用双蒸水彻底清洗3遍，烘箱干燥后称重，经搅拌机破碎后加入到质量分数65％的硫酸溶液中(细菌纤维素:硫酸质量比为1:40)，于65℃搅拌(800r/min)反应45min；然后加入10倍体积的预冷(4℃)双蒸水终止反应。然后用14KDa透析袋于双蒸水中透析至pH为中性。将透析液(透析袋内液体)置于冷冻干燥机中干燥，即得到纳米纤维素。
1.2.2纳米纤维素功能化修饰
取上述干燥后的纳米纤维素5g，溶于1M氢氧化钠溶液，然后加入30mmol环氧氯丙烷，于60℃磁力搅拌反应6h。反应后，将反应液置于透析袋中，超纯水透析至pH＝12。然后，将透析液收集在反应瓶中，加入25mL氨水溶液，60℃搅拌反应2h。反应结束后，再次透析至pH＝7，冷冻干燥，即得到氨基化修饰的纳米纤维素。
1.2.3功能化纤维素连接罗丹明B
取干燥的氨基化修饰的纳米纤维素1g，溶于50mL含有EDTA(5mM)、氯化钠(0.15M)和蔗糖(0.3M)的硼酸钠缓冲液(50mM)中，然后加入0.32mmol异硫氰酸罗丹明B。避光、室温搅拌反应过夜。反应结束后，于双蒸水中透析3天。透析结束后，取透析液冰浴超声10min，然后用0.45微米滤膜过滤，最后冷冻干燥，即得到罗丹明B标记的纳米纤维素，即纳米纤维素-罗丹明B复合物。
1.2.4纳米纤维素表征
1)原子力显微镜检测
分别取1.2中不同步骤所得的纳米纤维素，溶于适量水中，超声5min。滴加于新剥离的云母片上，于空气中干燥。置于Veeco MultiMode V原子力显微镜下以tapping mode模式测量其形貌大小。酸化所得纳米纤维素见图6，氨基化修饰的纳米纤维素见图7。由图6、图7可知，酸化所得纳米纤维素呈针状，长度为500-700nm，宽度为15-35nm；氨基化后未明显改变纳米纤维素形貌。
2)傅里叶变换红外检测
原始纤维素(未酸化的细菌纤维素)及酸化所得纳米纤维素(酸化纤维素)经研磨、过200目筛后，使用ATR-FTIR在400cm-1-4500cm-1波数下测量其红外吸收图谱，结果见图9。由图9可知，原始纤维素谱图中3447cm-1附近的吸收峰为OH基团的伸缩振动吸收；2900cm-1处的吸收峰归属为C-H的伸缩振动峰；1375cm-1处的吸收峰为C-H的弯曲振动峰；1335cm-1处的峰是O-H的面内弯曲振动峰；1061cm-1处的强吸收峰为C-O的伸缩振动；993cm-1处的吸收峰为纤维内醚键的特征峰；668cm-1处为羟基-OH面外变形振动。而原始纤维素经酸化后在895cm-1和2380cm-1处产生酸化所得纳米纤维素的相应特征峰。
3)纳米纤维素载罗丹明B效率
根据步骤1.2.3的连接反应，干燥、称量反应前后反应物与产物的质量变化，计算纳米纤维素-罗丹明B复合物载药效率。
载药效率(％)＝100×(罗丹明B标记的纳米纤维素-氨基化修饰的纳米纤维素投入质量)/罗丹明B标记的纳米纤维素。经计算，载药效率为16.2％。
1.2.5纳米纤维素穿透鱼体试验
试验选用20尾二月龄鲈鱼苗种，饲养于100L水族箱中，箱内装有80L充分曝气的自来水，加热棒保持水温为25℃±0.5℃，充气泵保持水中溶解氧为5.5mg/L以上。随机分为2组，每组10尾，分别用罗丹明B浓度为50ppm的纳米纤维素-罗丹明B复合物和50ppm游离的罗丹明B避光浸泡5小时。然后麻醉处死、去离子水反复冲洗三遍，取鲈鱼脑、心脏、肌肉、肠道、脾脏、胃、鳃、肝脏组织浸泡于4％多聚甲醛固定液中，制作石蜡切片。随后，使用激光共聚焦显微镜观察记录各组织荧光强度，结果见图10和图11。由图10和图11可知，纳米纤维素-罗丹明B复合物组浸泡鲈鱼苗种5h时，纳米纤维素即可以大量携带罗丹明B进入鲈鱼仔鱼体内的脑、脾、胃、肌肉等部位。鲈鱼苗种经浸泡处理后，与游离罗丹明B处理组相比，纳米纤维素-罗丹明B复合物处理组鲈鱼仔鱼肠、脾、胃、鳃、肌肉和肝脏等组织呈现极大强度的红色荧光，脑组织也显示出极强的红色荧光，而游离罗丹明B处理组鲈鱼仔鱼则没有显示红色荧光。结果表明：纳米纤维素可以携带罗丹明B穿透鱼体表的皮肤屏障，并进一步载运罗丹明B穿透血脑屏障，将罗丹明B输送到脑组织中。
试验例2纳米纤维素载和厚朴酚复合物的制备及其在鲈鱼仔鱼体内的代谢
1材料和方法
1.1试验材料
1.1.1试验动物
试验鲈鱼苗种同试验例1
1.1.2试验试剂
浓硫酸、氢氧化钠、硼氢化钠、碳酸钠，及氯化钾购自国药集团化学试剂有限公司；TEMPO、乙醇、丙酮，及色谱甲醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,4-丁二醇二缩水甘油醚、MES、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，及N-羰基琥珀酸亚胺购自美国sigma公司。
1.1.3试验仪器
ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，上海特成机械设备有限公司；H1650-W型台式高速微量离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；1010-3B型电热恒温鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；SY-360型超声波提取器，上海宁商超声仪器有限公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术(上海)有限公司；Veeco MultiMode V原子力显微镜，德国布鲁克公司；L-2000型高效液相色谱仪，日本日立公司。
1.2试验方法
根据前期试验结果，发现在GCO细胞(草鱼性腺)中和厚朴酚相比于厚朴酚的抗鲈鱼弹状病毒(MSRV)作用更强。厚朴酚、和厚朴酚对鲈鱼弹状病毒的体外抗病毒活性IC50分别为10.25、2.82μM，故选择和厚朴酚与羧基化修饰的纳米纤维素连接形成复合物。
1.2.1纳米纤维素制备
将细菌纤维素用双蒸水彻底清洗3遍，烘箱干燥后称重，经搅拌机破碎后加入到质量分数65％的硫酸溶液中(细菌纤维素:硫酸质量比为1:40)，于65℃搅拌(800r/min)反应45min；然后加入10倍体积的预冷(4℃)双蒸水终止反应。然后用14KDa透析袋于双蒸水中透析至pH为中性。将透析液置于冷冻干燥机中干燥，即得到纳米纤维素。
1.2.2纳米纤维素连接和厚朴酚
将100g酸化所得纳米纤维素(参见1.2.1)加入到含有150mg硼氢化钠的氢氧化钠溶液(浓度为0.6M，75mL)的圆底烧瓶中，置于冰水中。然后在20分钟内缓慢滴加75mL1,4-丁二醇二缩水甘油醚，并利用冰水吸收反应放热，从而将反应温度维持在25℃。随后在25℃搅拌反应10小时。最后将反应液置于真空抽滤的滤膜上使用至少4倍(例如，4-8倍)反应液体积的双蒸水洗涤至pH为中性，然后依次用质量分数分别为30％、50％、70％、100％的丙酮冲洗滤膜上的固体物质，得到羧基化修饰的纳米纤维素(羧基化纤维素)。向100g羧基化修饰的纳米纤维素中加入100毫升0.1M的氢氧化钠，随后加入15g和厚朴酚。40℃搅拌反应24小时。反应结束后真空抽滤，再用双蒸水抽滤洗涤3次，然后用pH为8的0.1M碳酸钠缓冲液清洗3次，冷冻干燥后即得到纳米纤维素载和厚朴酚复合物。
1.2.3纳米纤维素载和厚朴酚复合物载药效率
步骤1.2.2的连接反应中，干燥、称量反应前后反应物与产物的质量变化，计算纳米纤维素连接和厚朴酚载药效率。
载药效率(％)＝100×(纳米纤维素载和厚朴酚复合物质量-羧基化修饰的纳米纤维素投入质量)/纳米纤维素载和厚朴酚复合物质量。
1.2.4试验鲈鱼苗种处理
将暂养2周的二月龄鲈鱼苗种养殖在含不同浓度和厚朴酚和纳米纤维素载和厚朴酚复合物(以和厚朴酚计算浓度)的曝气自来水中进行浸泡处理，浸泡处理(药物浸浴)8h后，完全更换为曝气的自来水继续养殖。每个处理组含2000尾仔鱼，每个处理3个平行对照。随机从各处理组取100尾仔鱼，麻醉处死，并用去离子水冲洗3遍，提取不同组织用于后续液相样品制备和测定。
1.2.5样品处理
(1)将从每组中收集的组织转入10mL离心管中，加入2mL去离子水和甲醇。电动匀浆机匀浆2min，匀浆后室温静置2h。8000rmp离心15min，取上清液加入10mL离心管中，置于60℃烘箱中，至液体完全挥发，得干燥样品。
(2)将上述干燥样品直接加入800μL流动相(色谱甲醇/水，V/V＝70/30)涡旋振荡30s使其充分溶解，0.22μm滤膜过滤，保存备用。
(3)高效液相色谱条件：所用液相色谱柱为C18硅胶柱；甲醇和水为流动相；流速1mL/min，检测波长为210nm；进样量为20μL，柱温30℃。
2结果与分析
1)羧基化修饰的纳米纤维素参见图8和图9。经计算，纳米纤维素载和厚朴酚复合物载药效率为65.4％。
2)和厚朴酚标准品液相测定工作曲线：工作曲线绘制中共设置6个浓度，进样量为在0.2-30μg范围内根据实验浓度和峰面积进行线性回归拟合，拟合后的标准工作曲线方程为：Y＝0.0223X-0.0124，相关系数R2＝0.9954；其中，Y为峰面积，X为和厚朴酚含量(图12)。
3)游离和厚朴酚和纳米纤维素载和厚朴酚复合物在鲈鱼体内的代谢：用不同浓度游离和厚朴酚和纳米纤维素载和厚朴酚复合物(和厚朴酚浓度为2mg/L和20mg/L)浸泡鲈鱼仔鱼，高效液相色谱法测定浸浴不同时间段的和厚朴酚药物含量。结果显示(表1)，游离和厚朴酚浸泡15min后，仔鱼体内即能够检测到和厚朴酚；浸泡3h时，2mg/L和20mg/L处理组的和厚朴酚浓度分别达到0.57mg/g和4.56mg/g体重；换为曝气自来水后，24h内和厚朴酚完全代谢出体外。用纳米纤维素载和厚朴酚复合物浸浴后，5min即能检测到和厚朴酚；浸泡5h时2mg/L和20mg/L处理组和厚朴酚浓度分别达到1.95和16.24mg/g体重；更换为曝气自来水后，20mg/L纳米纤维素载和厚朴酚复合物处理组在120h后和厚朴酚即能完全代谢出体外。
表1.药物在鲈鱼仔鱼体内的代谢结果
Figure BDA0002972747800000101
为进一步探究和厚朴酚在鱼体各组织的分布，取20mg/L纳米纤维素载和厚朴酚复合物浸泡处理5h仔鱼，解剖获得脑、眼、肾脏、心脏、肝脏和肌肉组织。高效液相色谱法测定其和厚朴酚含量。结果显示(表2)，无论是游离和厚朴酚还是纳米纤维素载和厚朴酚复合物处理组，其在肌肉组织中的含量最高，肾脏次之。值得注意的时是纳米纤维素载和厚朴酚复合物处理组脑内和厚朴酚含量较游离和厚朴酚处理组有明显的提升，这也与试验例1中用纳米纤维素-罗丹明B复合物处理时各组织的荧光强度结果相互印证。
表2.纳米纤维素载和厚朴酚复合物处理组鲈鱼各组织的和厚朴酚含量
Figure BDA0002972747800000102
Figure BDA0002972747800000111
以上结果表明：纳米纤维素载药使得药物和厚朴酚进入仔鱼体内的时间缩短，体内药物含量显著增加，代谢时间延长，从而利于提高药物效果。同时发现，120h后纳米纤维素所载药物能从纳米纤维素中解离下来，并在鱼体内被完全代谢排出体外，表明纳米纤维素载药具有食品安全性。
试验例3鲈鱼弹状病毒抗原蛋白及其与纳米纤维素连接复合物的制备
1材料和方法
1.1材料
1.1.1病毒毒株、菌株和载体
鲈鱼弹状病毒毒株(2019年12月分离于陕西杨凌)、Pet-32a(+)载体(上海联迈生物工程有限公司，货号LM1216)为实验室保存。大肠杆菌感受态菌株TOP10、BL21(DE3)购自北京康为世纪生物科技有限公司，pMD19-T载体为TaKara公司产品。纳米纤维素参照试验例2制备。
1.1.2试剂
病毒RNA提取试剂盒、DM2000 DNA Marker、PCR扩增试剂盒、显色剂DAB、BCA蛋白含量测定试剂盒为北京康为世纪生物科技有限公司产品。反转录试剂盒、限制性内切酶(EcoRI、Hind III)、T4 DNA连接酶购自TaKara公司。DNA纯化试剂盒购自Axygen公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。蛋白Marker购买自天根生化科技(北京)有限公司，鼠源组氨酸单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自Abcam公司。其他常规试剂为分析纯产品。
1.1.3实验仪器
ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，上海特成机械设备有限公司；H1650-W型台式高速微量离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；1010-3B型电热恒温鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂；SY-360型超声波提取器，上海宁商超声仪器有限公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术(上海)有限公司；超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；DYCP-31CN型琼脂糖水平电泳仪，北京市六一仪器厂；Thermo Multiskan MK3酶标仪，美国热电赛默飞世尔科技公司；伯乐PCR仪，美国伯乐公司。
1.2试验方法
1.2.1 PCR扩增获取病毒G蛋白目的基因
参照病毒RNA提取试剂盒说明书，提取鲈鱼弹状病毒总RNA，并用反转录试剂盒将RNA反转为cDNA。
根据GenBank中弹状病毒G蛋白基因序列(Accession no.:KF146308.1)设计引物S1为：
S1F(EcoR I)：5’-GAGCTCCTATGACAAGCGCACTCAGAG-3’
S1R(Hind III)：5’-GAATTCTCAGTGGAATGAGTCGGAGTC-3’
PCR扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃变形30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳条件：120V恒压20min。电泳产物切胶、回收、经DNA纯化试剂盒纯化DNA产物，纯化产物经EcoR I和Hind III双酶切后与pMD19-T载体连接，将产物转化至大肠杆菌TOP10感受态中，经蓝白斑筛选获取阳性菌株，并提取质粒进行PCR及测序鉴定，命名重组质粒为pMD19T-G。
1.2.2构建抗原蛋白原核表达菌株
将重组质粒pMD19T-G和Pet-32a(+)质粒分别经EcoR I和Hind III双酶切、琼脂糖凝胶电泳、切胶、回收、DNA纯化试剂盒纯化，T4连接酶连接，产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，提取质粒，进行PCR及测序鉴定，命名重组质粒为pET32a-G。
1.2.3重组G蛋白诱导表达
将含重组质粒pET32a-G的大肠杆菌BL21(DE3)，于37℃振荡培养1h，涂布于LB平板(含氨苄青霉素)培养，37℃过夜，挑取单菌落于LB液体培养基(含氨苄青霉素)，37℃振荡培养过夜。从中另取1％菌液于新培养基中扩大培养，至0D600为0.6时加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，诱导培养4-6h，得到诱导表达的菌液，经离心弃上清，用1×PBS洗涤离心所得沉淀物2次，加入等体积SDS样品缓冲液，混匀，煮沸5min，进行10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。取纯化的蛋白泳道转移至硝酸纤维素膜，以鼠源组氨酸单克隆抗体为一抗，以羊抗鼠IgG为二抗进行孵育，洗涤后以DAB显色，进行Western Blot分析。
1.2.4病毒重组G蛋白的分离纯化
大量收集诱导表达的菌液，于50mL离心管中12000r/min、4℃离心10min，收集沉淀，以超声破碎缓冲液重悬沉淀，冰浴超声40min，12000r/min、4℃离心20min，收集沉淀，用去离子水清洗，加入含8mol/L尿素的变性液溶解，12000r/min、4℃离心10min，去上清，分别于含有6.0、4.0、2.0、1.0mol/L尿素的PBS中透析，最后于1×PBS中透析过夜，并收集透析液，冷冻干燥后保存备用。使用时以无菌水溶解，BCA蛋白含量测定试剂盒测定病毒重组G蛋白的蛋白浓度。所述病毒重组G蛋白是经诱导表达获得的含有病毒G蛋白氨基酸序列及His标签的融合蛋白。
1.2.5纳米纤维素连接病毒重组G蛋白
取试验例2中制备的羧基化修饰的纳米纤维素(3g)加入到2-吗啉乙磺酸水溶液(0.1M，pH＝5.6，2000mL)中并超声(40KHz，500W)处理30min得到混合物，然后向混合物中加入20g乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDAC)和25g N-羰基琥珀酸亚胺(NHS)并超声(40KHz，500W)处理2h，然后于6000rpm条件下离心5min，去上清，离心所得沉淀加入到PBS缓冲液中(pH＝7.4，2L)进行超声混合，然后向混合液中加入5g病毒重组G蛋白，室温搅拌反应48h。反应结束后使用截流量为100KDa的透析袋在纯水中透析3d，透析液于3000rpm离心10min，沉淀即为纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物(nBC-G)，冷冻干燥后于4℃低温保存。
1.2.6纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物检测
精确称取1.0000g纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物(冻干粉)，用纯水稀释至10mL，超声分散均匀，参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，梯度稀释分散后的溶液，运用Thermo Multiskan MK3酶标仪测定其蛋白含量。根据蛋白浓度计算复合物中病毒重组G蛋白的承载量，其中承载量的计算公式如下：
蛋白承载量＝(复合物中的蛋白质量/复合物的质量)×100％
2结果与分析
2.1病毒G蛋白基因的扩增、克隆与鉴定结果
病毒G蛋白基因经PCR扩增，得到如图1中所示的大小约1100bp的目的条带。测序结果显示，目的基因与GenBank参考序列同源性为99％。将目的基因克隆(图2)后插入pET-32a(+)载体中，获得的重组质粒pET32a-G的双酶切及PCR鉴定结果见图3。
2.2病毒重组G蛋白的表达及检测结果
重组质粒pET32a-G在大肠杆菌BL21中获得表达。在诱导4h后，经SDS-PAGE电泳，结果表明表达的融合蛋白相对分子质量约为51.4KDa(图4)，与预期结果相符。经BandScan软件分析，蛋白的最高表达量占细菌总蛋白的34.8％；Wester Blot分析结果表明，在51.4KDa处有一明显的识别条带(图5)，表明表达的融合蛋白能与抗His标签单克隆抗体识别，证实其具有良好的抗原反应性。
2.3纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物中蛋白承载量计算结果
经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定，将上述纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物溶液稀释至10-2可以测定出蛋白浓度在532.7μg/mL，结合稀释倍数以及原始纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物重量，换算得到纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物中所承载重组G蛋白含量为53.27％。
试验例4纳米纤维素载病毒重组G蛋白作为鲈鱼弹状病毒抗原的免疫效果
1材料和方法
1.1试验材料
1.1.1病毒株和试验动物
鲈鱼弹状病毒毒株由实验室保存，病毒滴度TCID50＝7.5×10-6/mL。鲈鱼夏花苗种(平均体长：5.2±0.2cm)，购自福建省三明加州鲈苗种场。试验所用鲈鱼夏花苗种饲养于容积为250L的水族箱中，箱中装有200L经充分曝气的自来水，加热棒调节水温维持在28±0.5℃，充气增氧保持水中溶解氧含量在6mg/L以上，白/黑光照周期为14/10h，每日早中晚各投喂1次浮性饵料(北京金宇恒润科贸有限公司)，每次投饵量约为100g。在每晚投饵1h后清除缸底残饵，换水1/3，每周清理一次水族箱。驯养14d后，挑选健康无伤病的鲈鱼夏花苗种用于后续免疫和感染攻毒实验。
1.1.2实验试剂
弹状病毒重组G蛋白冻干粉以及纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物均参照以上试验例自制。鼠源组氨酸单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自Abcam公司；96孔酶标板购自美国康宁公司；Elisa检测试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；绵阳红细胞购自上海源叶生物科技有限公司。其他试剂均为分析纯。
1.1.3试验仪器
ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，上海特成机械设备有限公司；H1650-W型台式高速微量离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；1010-3B型电热恒温鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂；SY-360型超声波提取器，上海宁商超声仪器有限公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术(上海)有限公司；超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；DYCP-31CN型琼脂糖水平电泳仪，北京市六一仪器厂；Thermo Multiskan MK3酶标仪，美国热电赛默飞世尔科技公司；伯乐PCR仪，美国伯乐公司。
1.2试验方法
1.2.1鲈鱼夏花苗种免疫
将上述鲈鱼夏花苗种随机分为11个组，每组300尾，分别饲养于装有30L曝气自来水的养殖缸中。采用弹状病毒重组G蛋白和纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物，并分别按照1.0、5.0、10.0、20.0和30.0mg/L(均以蛋白浓度计算)浓度浸浴免疫，共10组。空白对照组不做浸浴处理。浸浴免疫2h后，将鲈鱼转移至另外的30L的养殖缸中饲养，加热棒调节水温维持在28±0.5℃，充气增氧保持水中溶解氧含量在6mg/L以上，白/黑光照周期为14/10h，每日早中晚各投喂1次浮性饵料(北京金宇恒润科贸有限公司)，每次投饵量约为100g。在每晚投饵1h后清除缸底残饵，换水1/3，每周清理一次养殖缸。
免疫后第14、21、28、49、70天，每组分别将10尾鲈鱼剪断脊柱处死，加入2.0mL0.6％生理盐水，组织匀浆机12000rpm匀浆5min，高速冷冻离心机3000rpm离心10min，将上清转移至新管中冷冻保存于-80℃超低温冰箱中。抗体检测采用间接凝集法，选用的致敏载体为用戊二醛一步法制备的绵羊红细胞。
1.2.2鲈鱼弹状病毒感染攻毒实验
取免疫后21天的鲈鱼夏花苗种(每组100尾)，将病毒液用含有双抗(青霉素和链霉素)的0.6％灭菌生理盐水稀释为TCID50的101.5倍，按每尾50μL剂量，于已免疫鲈鱼和对照组鲈鱼的胸鳍基部分别进行注射，控制水温(28±0.5℃)，定时检查、记录发病情况，最后计算死亡率和免疫保护率。
免疫保护率＝1-免疫组死亡率/对照组死亡率。
2结果与分析
2.1免疫效价测定
弹状病毒重组G蛋白直接免疫组和纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物免疫组分别在1.0、5.0、10.0、20.0和30.0mg/L(均以蛋白浓度计算)浓度浸浴免疫鲈鱼夏花苗种，采用间接凝集法测定不同免疫时间抗体效价。结果如表3所示，弹状病毒重组G蛋白直接免疫组在浸浴剂量低于10.0mg/L时，免疫效价与对照组相比并没有显著性差异，在20.0mg/L时，免疫后第14天免疫效价也仅能达到1:4-1:8；纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物组浸浴剂量在1.0mg/L时，免疫后第14天免疫效价即可达到1:32-1:64，免疫后第70天时免疫效价仍能保持在1:2-1:4，在浸浴剂量为5.0mg/L时，免疫后第14天免疫效价可达到1:64-1:128，是比较理想的浸浴剂量。
表3.重组G蛋白与nBC-G免疫鲈鱼夏花苗种抗体效价的间接凝集反应检测结果
Figure BDA0002972747800000161
2.2死亡率与免疫保护率
弹状病毒重组G蛋白直接免疫组与纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物免疫组分别在1.0、5.0、10.0、20.0和30.0mg/L浸浴免疫鲈鱼夏花苗种21d后用鲈鱼弹状病毒攻毒。在攻毒后第12天时的累计死亡率和免疫保护率如表4所示。
表4.重组G抗原蛋白与nBC-G免疫鲈鱼夏花苗种后攻毒死亡率和免疫保护率
Figure BDA0002972747800000162
Figure BDA0002972747800000171
以上结果表明：鲈鱼弹状病毒重组G蛋白直接免疫组在低于10.0mg/mL时，浸浴免疫处理不能对鲈鱼夏花苗种产生免疫保护效果；纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物(nBC-G)在1.0mg/L浸浴免疫后免疫保护率可以达到85％，5.0mg/L浸浴免疫保护率可以达到94％。
试验例5纳米纤维素载和厚朴酚复合物杀灭鲈鱼弹状病毒的效果评价
1试验材料和方法
1.1试验材料
1.1.1病毒和试验动物
鲈鱼弹状病毒毒株由实验室保存，病毒滴度TCID50＝7.5×10-6/mL。鲈鱼水花苗种(平均体长：1.2±0.2cm)购自福建省三明加州鲈苗种场。试验所用鲈鱼水花苗种饲养于容积为250L的水族箱中，箱中装有200L经充分曝气的自来水，加热棒调节水温维持在28±0.5℃，充气增氧保持水中溶解氧含量在6mg/L以上，白/黑光照周期为14/10h，每日早中晚各投喂1次浮性饵料(北京金宇恒润科贸有限公司)，每次投饵量约为100g。在每晚投饵1h后清除缸底残饵，换水1/3，每周清理一次水族箱。驯养14d后，挑选健康无伤病的鲈鱼水花苗种用于后续试验。
1.1.2试验试剂
纳米纤维素载和厚朴酚复合物由实验室合成并保存；琼脂糖(分子级)、焦炭酸二乙酯(DEPC)购自美国Sigma公司；CaCl·2H2O、MgSO4·7H2O、NaHCO3、KCl购自国药集团化学试剂有限公司；氯仿、异丙醇、乙醇购自先化学试剂厂；注射用绒毛促性腺激素(HCG)购自宁波市三生药业有限公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶、cDNA反转录试剂盒、定量PCR试剂盒购自日本Takara公司；DNA marker DL2000购自东盛生物科技有限公司；病毒RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。其余试剂均为分析纯。
1.1.3试验仪器
ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，上海特成机械设备有限公司；H1650-W型台式高速微量离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；1010-3B型电热恒温鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；SY-360型超声波提取器，上海宁商超声仪器有限公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术(上海)有限公司。
1.2试验方法
1.2.1鲈鱼水花苗种弹状病毒感染与纳米纤维素载和厚朴酚复合物的病毒杀灭活性检测
(1)鲈鱼水花苗种病毒感染
将驯养后的鲈鱼浸泡在含有鲈鱼弹状病毒的去离子水稀释液中(病毒滴度6.5×10-6/mL)，28.0±0.5℃感染24h。
(2)纳米纤维素载和厚朴酚复合物杀灭病毒活性检测
对感染病毒的鲈鱼水花苗种分别用浓度为1.0、5.0、10.0、20.0mg/L和厚朴酚、纳米纤维素载和厚朴酚复合物(浓度以和厚朴酚计算)浸浴处理4h，再将鲈鱼转移至不含药物的水中进行养殖，每个处理组400尾。于浸浴处理后的第3、6、9和12天(d)分别随机挑选10尾鲈鱼提取RNA，检测鲈鱼弹状病毒感染情况。同时，每天观察统计鲈鱼的存活情况。
检测鲈鱼弹状病毒感染情况的步骤如下：
A.病毒RNA的提取
采用病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA，详细操作步骤参照试剂盒说明书。
B.提取RNA质量检测和浓度测定
用质量浓度为1％的琼脂糖凝胶检测提取的病毒RNA的完整性，其中电泳条件为：恒压120V、15min，核酸染料为GoldViewTM。电泳结束后，结合DU640型核酸/蛋白质分析仪，检测提取RNA的质量和浓度。
C.RNA的反转
经RNA质量和浓度检测，将调整好浓度的RNA进行反转录，反转录使用cDNA反转录试剂盒，反转录的具体方法参照试剂盒说明书。在DEPC处理过的PCR管中加入反转录反应液，具体成分见表5。
表5.反转录反应液组成
Figure BDA0002972747800000191
反转录条件为：37℃，15min；85℃，5s。
D.定量引物的设计与合成
根据Genbank中的鲈鱼弹状病毒G蛋白cDNA序列，用Primer 5.0软件设计定量PCR引物。引物由上海生工生物科技有限公司合成，引物序列见表6。
表6.鲈鱼弹状病毒基因定量PCR检测引物序列
Figure BDA0002972747800000192
E.定量PCR检测
目的基因的实时定量检测，检测试剂采用Takara的实时定量检测试剂盒，检测仪器为CFX-92Real-Time PCR Detection System。使用SYBR Green II荧光嵌合进行实时定量反应。定量PCR反应液组成见表7。
表7.实时定量PCR反应液组成
Figure BDA0002972747800000193
Figure BDA0002972747800000201
定量PCR反应采用两步法，反应程序为：95℃，30s；40个循环(95℃，5s；60℃，30s)；做熔解曲线，确定引物及反应是否正常。实时定量数据采用2-△△CT法计算，其中目的基因的实验数据采用平均值±标准差表示。
2结果与分析
2.1和厚朴酚及纳米纤维素载和厚朴酚复合物处理感染病毒的鲈鱼水花苗种后的存活数
分别采用不同浓度和厚朴酚及纳米纤维素载和厚朴酚复合物处理感染鲈鱼弹状病毒的鲈鱼水花苗种，对处理后鲈鱼水花苗种存活情况进行统计，结果见表8。
表8.鲈鱼水花苗种存活结果
Figure BDA0002972747800000202
由表8可以看出：病毒感染后使用和厚朴酚杀灭病毒，在处理12d后，0mg/L对照组鲈鱼水花苗种存活数为15尾，存活率为3.75％；1mg/L和厚朴酚处理组存活数为61，存活率为15.25％；当和厚朴酚浓度达到20mg/L时，存活数达到119尾，存活率为29.75％。病毒感染后使用纳米纤维素载和厚朴酚杀灭病毒，在处理12d后，0mg/L对照组鲈鱼水花苗种存活数为17尾，存活率为4.25％；药物浓度1mg/L的纳米纤维素载和厚朴酚处理组存活数为138，存活率为34.5％；当纳米纤维素载和厚朴酚处理组药物浓度达到20mg/L时，存活数达到390尾，存活率为97.5％。
2.2和厚朴酚及纳米纤维素载和厚朴酚复合物处理后鲈鱼水花苗种的感染率
分别采用不同浓度和厚朴酚及纳米纤维素载和厚朴酚复合物处理感染鲈鱼弹状病毒的鲈鱼水花苗种后，通过实时定量PCR法检测鲈鱼体内残存病毒的情况，并统计感染病毒个体的数量，结果见表9。
表9.鲈鱼水花苗种病毒残留结果
Figure BDA0002972747800000211
由表9可知：病毒感染后12d，空白对照组鲈鱼水花苗种病毒感染个体数均为10尾，病毒携带率为100％；1mg/L和厚朴酚处理组的鲈鱼水花苗种病毒感染个体数为9，病毒携带率为90％；当和厚朴酚浓度达到20mg/L时，鲈鱼水花苗种病毒感染个体数为6，病毒携带率为60％，与空白对照组相比病毒携带率降低了40％。药物浓度1mg/L的纳米纤维素载和厚朴酚复合物处理组的鲈鱼水花苗种病毒感染个体数为6，病毒携带率为60％；当纳米纤维素载和厚朴酚复合物处理组的药物浓度达到20mg/L时，鲈鱼水花苗种病毒感染个体数为0，病毒携带率为0，与空白对照组相比病毒携带率降低了100％。
以上结果表明，运用纳米纤维素作为抗病毒药物和厚朴酚载体，使得和厚朴酚的抗病毒效果得到明显提高；纳米纤维素载和厚朴酚复合物(和厚朴酚浓度10mg/L)可以使感染病毒后的鲈鱼水花苗种存活率提高到96.25％，存活于鲈鱼体内的残留弹状病毒(病毒残留量)为0。
试验例6纳米纤维素载和厚朴酚复合物及纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物联合杀灭鲈鱼弹状病毒的效果评价
1试验材料和方法
1.1试验材料
1.1.1病毒和试验动物
鲈鱼弹状病毒毒株由实验室保存，病毒滴度TCID50＝7.5×10-6/mL。鲈鱼夏花苗种(平均体长：5.2±0.2cm)购自福建省三明加州鲈苗种场。试验所用鲈鱼夏花苗种饲养于容积为250L的水族箱中，箱中装有200L经充分曝气的自来水，加热棒调节水温维持在28±0.5℃，充气增氧保持水中溶解氧含量在6mg/L以上，白/黑光照周期为14/10h，每日早中晚各投喂1次浮性饵料(北京金宇恒润科贸有限公司)，每次投饵量约为100g。在每晚投饵1h后清除缸底残饵，换水1/3，每周清理一次水族箱。驯养14d后，挑选健康无伤病的鲈鱼夏花苗种用于后续试验。
1.1.2试验试剂
纳米纤维素载和厚朴酚复合物、纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物由实验室合成并保存；琼脂糖(分子级)、焦炭酸二乙酯(DEPC)购自美国Sigma公司；CaCl·2H2O、MgSO4·7H2O、NaHCO3、KCl购自国药集团化学试剂有限公司；氯仿、异丙醇、乙醇购自先化学试剂厂；注射用绒毛促性腺激素(HCG)购自宁波市三生药业有限公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶、cDNA反转录试剂盒、定量PCR试剂盒购自日本Takara公司；DNA marker DL2000购自东盛生物科技有限公司；病毒RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。其余试剂均为分析纯。
1.1.3试验仪器
ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，上海特成机械设备有限公司；H1650-W型台式高速微量离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；1010-3B型电热恒温鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；SY-360型超声波提取器，上海宁商超声仪器有限公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术(上海)有限公司。
1.2试验方法
1.2.1鲈鱼夏花苗种弹状病毒感染与病毒杀灭活性检测
(1)鲈鱼夏花苗种病毒感染
将驯养后的鲈鱼浸泡在含有鲈鱼弹状病毒的去离子水稀释液中(病毒滴度6.5×10-6/mL)，28.0±0.5℃感染24h。
(2)纳米纤维素载和厚朴酚复合物及纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物联合杀灭病毒的活性检测
对感染鲈鱼夏花苗种用浓度为5.0mg/L(以和厚朴酚浓度计算)纳米纤维素载和厚朴酚复合物及30.0mg/L(以蛋白浓度计算)纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物联合浸浴处理4h，再将鲈鱼转移至不含药物处理的水中进行养殖，每个处理组400尾。于浸浴处理后的第3、6、9和12天(d)分别随机挑选10尾鲈鱼提取RNA，检测鲈鱼弹状病毒感染情况。同时，每天观察统计鲈鱼的存活情况。
检测鲈鱼弹状病毒感染情况的步骤如下：
A.病毒RNA的提取
采用病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA，详细操作步骤参照试剂盒说明书。
B.提取RNA质量检测和浓度测定
用质量浓度为1％的琼脂糖凝胶检测上述提取的病毒RNA的完整性，其中电泳条件为：恒压120V、15min，核酸染料为GoldViewTM，电泳结束后，结合DU640型核酸/蛋白质分析仪，检测提取RNA的质量和浓度。
C.RNA的反转
经RNA质量和浓度检测，将调整好浓度的RNA进行反转录，反转录使用cDNA反转录试剂盒，反转录的具体方法参照试剂盒说明书。在DEPC处理过的PCR管中加入反转录反应液，具体成分参照表5。反转录条件为：37℃，15min；85℃，5s。
D.定量引物的设计与合成
根据Genbank中的鲈鱼弹状病毒G蛋白cDNA序列，用Primer 5.0软件设计定量PCR引物。引物由上海生工生物科技有限公司合成，引物序列参照表6。
E.定量PCR检测
目的基因的实时定量检测，检测试剂采用Takara的实时定量检测试剂盒，检测仪器为CFX-92Real-Time PCR Detection System。使用SYBR Green II荧光嵌合进行实时定量反应。定量PCR反应液组成参照表7。
定量PCR反应采用两步法，反应程序为95℃，30s；40个循环(95℃，5s；60℃，30s)；做熔解曲线，确定引物及反应是否正常。实时定量数据采用2-△△CT法计算，其中目的基因的实验数据采用平均值±标准差表示。
2结果与分析
2.1纳米纤维素载和厚朴酚复合物及纳米纤维素载G病毒重组蛋白复合物联合处理感染病毒的鲈鱼夏花苗种后的存活数
采用一定浓度的纳米纤维素载和厚朴酚复合物及纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物联合处理感染鲈鱼弹状病毒的鲈鱼夏花苗种，对处理后鲈鱼夏花苗种存活情况进行统计，结果见表10。
表10.鲈鱼夏花苗种存活结果
Figure BDA0002972747800000241
由表10可以看出：病毒感染后使用纳米纤维素载和厚朴酚复合物及纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物联合杀灭病毒，在处理12d后，空白对照组鲈鱼夏花苗种存活数为16尾，存活率为4.0％；而联合处理组的鲈鱼夏花苗种存活率为100％。
2.2纳米纤维素载和厚朴酚复合物及纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物联合处理后鲈鱼夏花苗种的感染率
采用一定浓度的纳米纤维素载和厚朴酚复合物及纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物联合处理感染病毒的鲈鱼夏花苗种后，通过实时定量PCR法检测鲈鱼体内残存病毒的情况，并统计感染病毒个体的数量，结果见表11。
表11.鲈鱼夏花苗种病毒残留结果
Figure BDA0002972747800000242
由表11可知：病毒感染后12d，空白对照组鲈鱼夏花苗种病毒感染个体数均为10尾，病毒携带率为100％；而纳米纤维素载和厚朴酚复合物及纳米纤维素载病毒重组G蛋白复合物联合处理组的鲈鱼夏花苗种病毒携带率为0。
以上结果表明，运用纳米纤维素作为抗病毒药物和厚朴酚及病毒抗原重组G蛋白载体，使得相应复合物的抗病毒效果可以得到进一步提高，鲈鱼夏花苗种的存活率可达到100％，存活于鲈鱼体内的残留弹状病毒为0。
总之，本发明通过将纳米纤维素载抗病毒药物，或纳米纤维素载抗病毒药物及纳米纤维素载病毒抗原，浸浴处理水产动物苗种，利用纳米纤维素使得抗病毒药物(例如，和厚朴酚)、病毒抗原(例如，鲈鱼弹状病毒重组G蛋白)在水体中由鱼、虾、蟹、贝类等水生动物的体表穿透进入个体的细胞、组织内，杀灭并完全清除这些水生动物体内的相应病毒，可以用于在水产养殖过程中高效、低成本生产鱼、虾、蟹、贝类等水产动物无病毒携带苗种。
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种纳米纤维素载药/抗原系统及其在水产养殖中的应用
<160> 4
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> S1F
<400> 1
gagctcctat gacaagcgca ctcagag 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> S1R
<400> 2
gaattctcag tggaatgagt cggagtc 27
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Forward Primer
<400> 3
tctaaggatt acgtgcaacg c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Reverse Primer
<400> 4
gatgtttcga gagaccggta c 21

Claims (10)

1.一种纳米纤维素载药/抗原系统，其特征在于：该系统包括羧基化修饰的纳米纤维素以及连接在该纳米纤维素上的水产动物抗病毒药物或相应病毒的抗原蛋白。
2.根据权利要求1所述一种纳米纤维素载药/抗原系统，其特征在于：所述抗病毒药物为和厚朴酚；所述抗原蛋白包括病毒外衣壳蛋白。
3.根据权利要求2所述一种纳米纤维素载药/抗原系统，其特征在于：所述抗原蛋白还包括与病毒外衣壳蛋白融合表达的His标签。
4.根据权利要求1所述一种纳米纤维素载药/抗原系统，其特征在于：所述抗病毒药物的质量分数为10.7％-76.5％；所述抗原蛋白的质量分数为10％-60％。
5.一种纳米纤维素载药/抗原系统的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1.1)将细菌纤维素进行酸化处理，得到纳米纤维素；
1.2)将纳米纤维素进行羧基化修饰，然后与水产动物抗病毒药物进行化学连接，得到纳米纤维素载抗病毒药物复合物，即纳米纤维素载药系统；
或者，
2.1)将细菌纤维素进行酸化处理，得到纳米纤维素；
2.2)将酸化处理所得纳米纤维素进行羧基化修饰，得到羧基化修饰的纳米纤维素；
2.3)将羧基化修饰的纳米纤维素与水产动物所感染病毒的相应病毒抗原蛋白进行化学连接，得到纳米纤维素载病毒抗原复合物，即纳米纤维素载抗原系统。
6.根据权利要求5所述一种纳米纤维素载药/抗原系统的制备方法，其特征在于：
所述步骤1.2)具体包括以下步骤：将100-500g步骤1.1)得到的纳米纤维素加入到含有150-750mg硼氢化钠的0.6M氢氧化钠溶液中，得混合物，然后在10-20min内将1-3倍所述氢氧化钠溶液体积的1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入该混合物中，并在20-25℃反应8-12h，得反应液，将反应液进行固液分离，将所得固体物质水洗至pH为6.5-8.5后进行干燥，得到羧基化修饰的纳米纤维素；将10-100g羧基化修饰的纳米纤维素与1-15g和厚朴酚于0.1M的氢氧化钠溶液中混合，然后于30-40℃反应12-24h，反应结束后进行固液分离，对所得固体物质依次用水、pH为7.5-8的0.1M碳酸钠缓冲液洗涤后进行干燥，得到纳米纤维素载和厚朴酚复合物；
所述步骤2.3)具体包括以下步骤：将羧基化修饰的纳米纤维素加入到pH为5.6-6.2的0.1M 2-吗啉乙磺酸缓冲液中后超声处理0.2-0.5h，得混合物，向该混合物中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和N-羰基琥珀酸亚胺后超声处理1-2h，其中，羧基化修饰的纳米纤维素:乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺的质量比为1:2-7，羧基化修饰的纳米纤维素:N-羰基琥珀酸亚胺的质量比为1:5-10，然后进行固液分离，并将所得固体物质与pH为7.2-7.4的PBS缓冲液混合，得混合液，向该混合液中加入病毒抗原蛋白后于20-25℃反应6-48h，其中，羧基化修饰的纳米纤维素:病毒抗原蛋白的质量比为1:1-5，反应结束后于水中透析，将所得透析液固液分离，然后将所得固体物质干燥，得到纳米纤维素载病毒抗原复合物。
7.如权利要求1所述的纳米纤维素载药/抗原系统在制备水产动物无特定病毒携带的苗种中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：在幼苗池中，所述抗原蛋白的浓度为2-30mg/L，所述抗病毒药物的浓度为5-40mg/L，浸浴时间为1-5小时。
9.纳米纤维素在制备水产动物抗病毒药物或免疫保护制剂中的应用。
10.和厚朴酚在制备水产动物抗病毒药物中的应用，或者病毒重组外衣壳蛋白在制备水产动物免疫保护制剂中的应用，其特征在于：将羧基化修饰的纳米纤维素与游离的水产动物抗病毒药物或相应病毒的重组外衣壳蛋白连接。
CN202110267411.7A 2021-03-11 2021-03-11 一种纳米纤维素载药/抗原系统及其在水产养殖中的应用 Pending CN113018454A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110267411.7A CN113018454A (zh) 2021-03-11 2021-03-11 一种纳米纤维素载药/抗原系统及其在水产养殖中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110267411.7A CN113018454A (zh) 2021-03-11 2021-03-11 一种纳米纤维素载药/抗原系统及其在水产养殖中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113018454A true CN113018454A (zh) 2021-06-25

Family

ID=76469791

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110267411.7A Pending CN113018454A (zh) 2021-03-11 2021-03-11 一种纳米纤维素载药/抗原系统及其在水产养殖中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113018454A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115536755A (zh) * 2022-12-05 2022-12-30 深圳万可森生物科技有限公司 羧基化细菌纳米纤维素的制备与应用
CN116004447A (zh) * 2022-12-01 2023-04-25 南开大学 一种改性细菌纤维素及其培养基和制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103520737A (zh) * 2013-10-15 2014-01-22 西北农林科技大学 碳纳米管载体免注射疫苗、制备方法及其在制备水产免疫苗种中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103520737A (zh) * 2013-10-15 2014-01-22 西北农林科技大学 碳纳米管载体免注射疫苗、制备方法及其在制备水产免疫苗种中的应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116004447A (zh) * 2022-12-01 2023-04-25 南开大学 一种改性细菌纤维素及其培养基和制备方法
CN116004447B (zh) * 2022-12-01 2024-03-05 南开大学 一种改性细菌纤维素及其培养基和制备方法
CN115536755A (zh) * 2022-12-05 2022-12-30 深圳万可森生物科技有限公司 羧基化细菌纳米纤维素的制备与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102166350B (zh) 鲆鲽鱼类五联灭活疫苗及其制备方法
CN113512096B (zh) 一种鲈鱼弹状病毒重组g2蛋白及其应用
EP2482824A1 (en) Piscine reovirus immunogenic compositions
CN104099301B (zh) 柯萨奇病毒a16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法
CN113018454A (zh) 一种纳米纤维素载药/抗原系统及其在水产养殖中的应用
CN103849632B (zh) 鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因及其弱毒株和应用
CN113521265B (zh) 一种鲈鱼弹状病毒亚单位疫苗及其制备方法
WO2010139193A1 (zh) 手足口病疫苗及其制备方法和应用
CN105963692B (zh) 一种预防手足口病的联合疫苗
CN108066755B (zh) 一种抗羊包虫病感染的基因工程亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN101113176A (zh) 鸡传染性法氏囊精制蛋黄冻干抗体的制备方法
CN1206243C (zh) 猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体和抗原及其制备
CN102167735A (zh) 日本血吸虫SjTollip重组抗原蛋白及其制备方法和用途
CN100412092C (zh) 一种抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体及其制备方法与应用
CN105999256B (zh) 一种预防手足口病的联合疫苗
CN103446182B (zh) 高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法
CN103275890A (zh) 一株鳗弧菌（鳗利斯顿氏菌）强毒菌株及其应用
CN113072641B (zh) 一种卵黄抗体的制备方法及卵黄抗体
CN113940993B (zh) 一种鲈鱼弹状病毒g2-2m亚单位疫苗及其制备方法
Afifah et al. Protective effects of immersion immunization of koi with Escherichia coli DH5α carrying DNA vaccine against koi herpesvirus
CN108295053A (zh) 五味子醇甲在增强pedv疫苗免疫应答中的应用
CN101838325B (zh) 猪用抗原呈递蛋白及其编码基因和应用
CA3009349C (en) Igy antibodies for the prevention of sea lice infestation and infection
CN110840841B (zh) 一种大菱鲆油乳化疫苗及其应用
CN115850516B (zh) 鱼类蛋白自组装纳米抗原及其制备的疫苗与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20221208

Address after: 712100 Xianyang city of Shaanxi province Yangling Demonstration Zone No. 3 Tai Road

Applicant after: NORTHWEST A & F University

Applicant after: Shenzhen Wankesen Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 712100 Xianyang city of Shaanxi province Yangling Demonstration Zone No. 3 Tai Road

Applicant before: NORTHWEST A & F University

TA01 Transfer of patent application right
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210625

RJ01 Rejection of invention patent application after publication