CN103446182B

CN103446182B - 高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法

Info

Publication number: CN103446182B
Application number: CN201310338679.0A
Authority: CN
Inventors: 宋勤叶; 袁洪兴; 逯纪成; 陈桂清; 孙泰然
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2013-08-06
Filing date: 2013-08-06
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2033-08-06
Also published as: CN103446182A

Abstract

本发明公开了一种高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法，属于兽药技术领域。其包括下述步骤：（1）无菌采用经过高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原免疫的猪的脾脏，去除被膜和结缔组织，冲洗，剪碎；（2）加入无菌生理盐水，用高速组织捣碎机绞碎，制成匀浆；（3）匀浆反复冻融8次后，于4℃下4000r/min离心15min，收取上清液；（4）将上清液置于透析袋内进行透析，收集透析外液，过滤除菌，加入冷冻保护剂，混合后分装，-20℃保存。本发明能够特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗的免疫效果，改善或增强猪的免疫功能和抗感染能力，具有预防和治疗猪繁殖与呼吸综合症，降低发病率和死亡率的作用。

Description

高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法

技术领域

本发明涉及兽药技术领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合症（porcinereproductiveandrespiratorysyndromes,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）引起猪的一种以繁殖障碍和呼吸道症状为特征的急性接触性传染病，是严重危害我国养猪业的重要疫病之一。PRRSV在体内主要侵害单核/巨噬细胞，引起机体天然和特异性免疫功能抑制，因此PRRSV感染猪容易发生链球菌、猪支原体肺炎、猪圆环病毒2型、猪流感病毒等病原的继发感染，使危害更加严重。2006年以来，疫情在我国各地暴发流行，大量仔猪、母猪发病致死，给养猪行业造成巨大损失，农业部组织专家开展流行病学、病原学等科技攻关，最后证实疫情是由猪繁殖与呼吸综合症病毒变异株引起的一种高致病性传染病。这种高致病性猪繁殖与呼吸综合症发病和死亡率高，仔猪发病率达到100%、死亡率达50%以上，母猪流产率达30%以上，育肥猪死亡率20%～30%。

目前对PRRS没有有效治疗药物，免疫接种是预防该病的主要措施，但疫苗的免疫效果并不理想。因此，研发新的免疫增强剂和防治制剂具有重要意义。转移因子（transferfactor,TF）是由具有免疫活性的T淋巴细胞释放的一类可透析的、分子量为3～5kDa小分子物质，是核酸和多肽相连且不含蛋白质的杂合分子，具有传递免疫信息、调节和增强机体免疫功能等作用，不仅能够提高受体的淋巴细胞转化率，增强白细胞吞噬能力和游走活性，促进抗体产生，而且对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌以及寄生虫等病原有明显抑制作用，已有用TF治疗结核病、疱疹病毒感染、肺包虫病等疾病的实验报道，而且受体在接受TF后能够快速（4～24h）获得相应的细胞免疫功能，并可维持数月或更长时间。TF分子量小，无热原，无抗原性，不引起过敏反应，无明显毒副作用和种属差异，是一种新型、安全的免疫增强剂和免疫治疗制剂。根据免疫特性的不同，TF分为非特异性TF和特异性TF（specificTF,STF）两大类。STF是指采用某种特定抗原免疫或病原感染后的动物，再提取的含该抗原特异活性的转移因子。STF可将特异性免疫信息传递到受体动物，激发其特异性免疫，STF的保护作用高于非特异性TF。目前尚无高致病性PRRS特异性TF（PRRS-STF）供临床需要。

发明内容

本发明提供一种猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法，能够特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗的免疫效果，改善或增强猪的免疫功能和抗感染能力，具有预防和治疗猪繁殖与呼吸综合症，降低发病率和死亡率的作用。

本发明所采取的技术方案是：

一种高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法，包括下述步骤：

（1）无菌采取经过高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原免疫猪的脾脏，去除脾脏的被膜和结缔组织，用生理盐水冲洗，称重，剪碎；

（2）按照其重量加入1.5～3倍的无菌生理盐水，用高速组织捣碎机2500r/min绞碎，制成匀浆；

（3）匀浆-20℃冷冻和室温融化，反复冻融8次后，于4℃下4000r/min离心15min，收取上清液；

（4）将上清液置于透析袋内，用无热源的等体积无菌生理盐水在0～4℃环境下透析36～48h，收集透析外液，用直径为0.22μm的滤膜过滤除菌，加入冷冻保护剂，混匀，即得到高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子溶液，分装，-20℃保存。

步骤（1）中抗原免疫过程为：将高致病性猪繁殖与呼吸综合症活毒疫苗用生理盐水稀释后，肌肉注射给2头3月龄健康猪，间隔2周免疫一次，首次注射2头份/头，第2～4次免疫4头份/头；第四次免疫10天后，前腔静脉采血，分离血清，经ELISA检测抗PRRSV抗体水平为阳性即合格。

高致病性猪繁殖与呼吸综合症活毒疫苗为JXA1-R毒株。高致病性猪繁殖与呼吸综合症活疫苗（JXA1-R毒株）安全性高，副作用小，抗体产生较快，抗体转阳率高，免疫效果好。

步骤（4）中透析袋孔径为7.0kD。

步骤（4）中采用蔗糖作为冷冻保护剂，特异性转移因子溶液中蔗糖的质量浓度为3.4%。加入蔗糖保护剂对本发明的转移因子起到良好的保护作用，可以抑制在贮藏期内多肽的变性，从而保证转移因子的生物学活性。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

1.本发明的转移因子能够特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗的免疫效果，改善或增强猪的免疫功能和抗感染能力，具有预防和治疗猪繁殖与呼吸综合症，降低发病率和死亡率的作用。

2.本发明的转移因子采用活毒疫苗抗原免疫过的猪脾脏提取，抗原诱导的免疫应答反应全面，免疫效果明显高于灭活疫苗，转移因子的组成成分更加全面，为进一步研发PRRS疫苗免疫增强剂及免疫治疗制剂提供实验依据。

3.采用透析的方法进行转移因子的提取，制备方法更加便捷，成本低廉，能够有效阻止相关成分的丢失。

4.采用蔗糖作为冷冻保护剂能够阻止转移因子结构的改变，对冷冻及贮藏期内生物大分子的聚集和伸展，保证转移因子的生物学活性起显著作用。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明PRRSV-STF氨基酸组成的高效液相色谱分析图；

图2是本发明PRRSV-STF对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性的影响示意图；

图3是本发明PRRSV-STF对小鼠外周血淋巴细胞增殖活性影响示意图；

图4是本发明PRRSV-STF对PRRS活疫苗免疫猪外周血淋巴细胞的增殖活性影响示意图。

具体实施方式

以下实施例中，高致病性PRRS活疫苗（JXA1-R株）为吉林省元亨生物技术有限公司生产。3月龄健康猪（杜洛克×长白×大约克夏三元杂交），均购自河北保定某规模化猪场，所购猪均没有接种过PRRS疫苗。

实施例1

（1）将高致病性PRRS活疫苗（JXA1-R毒株）疫苗用生理盐水稀释后，肌肉注射给2头3月龄健康猪，间隔2周免疫一次，首次注射2头份/头，第2～4次免疫4头份/头；第四次免疫10天后，前腔静脉采血，分离血清，经ELISA检测抗PRRSV抗体水平为阳性即合格。无菌采用经过猪繁殖与呼吸综合症抗原免疫的猪的脾脏，去除脾脏的被膜和结缔组织，用生理盐水冲洗，称重，剪碎；

（2）按照其重量加入1.5倍的无菌生理盐水，用高速组织捣碎机2500r/min绞碎，制成匀浆；

（4）将上清液置于孔径为7.0kD透析袋内，用无热源的等体积无菌生理盐水在0～4℃环境下透析40h，收集透析外液，用直径为0.22μm的滤膜过滤除菌，加入蔗糖作为冷冻保护剂，混匀，即得到高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子溶液，分装，-20℃保存。特异性转移因子溶液中蔗糖的质量浓度为3.4%。

实施例2

（2）按照其重量加入3倍的无菌生理盐水，用高速组织捣碎机2500r/min绞碎，制成匀浆；

（4）将上清液置于孔径为7.0kD透析袋内，用无热源的等体积无菌生理盐水在0～4℃环境下透析48h，收集透析外液，用直径为0.22μm的滤膜过滤除菌，加入蔗糖作为冷冻保护剂，混匀，即得到高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子溶液，分装，-20℃保存。特异性转移因子溶液中蔗糖的质量浓度为3.4%。

实施例3

（2）按照其重量加入2倍的无菌生理盐水，用高速组织捣碎机2500r/min绞碎，制成匀浆；

（4）将上清液置于孔径为7.0kD透析袋内，用无热源的等体积无菌生理盐水在0～4℃环境下透析36h，收集透析外液，用直径为0.22μm的滤膜过滤除菌，加入蔗糖作为冷冻保护剂，混匀，即得到高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子溶液，分装，-20℃保存。特异性转移因子溶液中蔗糖的质量浓度为3.4%。

对本发明的转移因子PRRS-STF进行性能检测：

1.理化性质的检测

经检测，STF呈淡黄色的澄清液体，有微弱的腥味，pH值为6.44。与20%磺基水杨酸反应无沉淀生成，与茚三酮反应溶液呈蓝紫色，生理盐水对照显示茚三酮的颜色（淡黄色）；与硝酸和钼酸铵反应有黄色沉淀生成，生理盐水对照无沉淀生成；紫外分光光度计测定的OD_260nm和OD_280nm的平均值分别为0.43和0.155，两者的比值（OD₂₆₀/OD₂₈₀）为2.77，核酸的含量为21.5mg/mL。上述结果表明，PRRSV-STF溶液内不含蛋白质，而含有核酸和氨基酸，与TF的理化性质相符。

2.PRRS-STF中氨基酸种类及其含量的测定取1mL样品加入9mL6.0mol/L的盐酸，110℃下水解14h，冷却至室温；取水解液5mL真空抽干，再加入0.1mol/L的盐酸1.0mL溶解后，再经过氨基酸衍生后，用高效液相色谱仪（Agilent1200）检测STF中的氨基酸组成及其含量。

经高效液相色谱仪（Agilent1200）分析得知，PRRSV-STF含有18种水解氨基酸（见图1，其中1～18分别为天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸、牛磺酸），经计算得出18中氨基酸的含量（见表1）。其中谷氨酸的含量最高，为0.642mg/mL，其次为非蛋白氨基酸—牛磺酸，含量为0.298mg/mL，此后依次为甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸等，每mL中含氨基酸总量为3.479mg。

表1高致病性PRRSV-STF的氨基酸种类及其含量

该STF中含有高浓度的牛磺酸，其余17种均为蛋白合成必需氨基酸，与相关文献报道的相似。虽然牛磺酸为非蛋白氨基酸，不参与蛋白的生物合成，但与胱氨酸、半胱氨酸的代谢密切相关，能够提高机体非特异性免疫力。本实验中制备的STF中牛磺酸的含量仅次于谷氨酸，其很可能在改善PRRSV感染机体免疫功能或免疫效果方面发挥着较重要的作用。

3.免疫活性检测

3.1STF对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

取BALB/c小鼠6只，随机分为试验组和空白组，3只/组。试验组每只小鼠腹腔注射3.5mgPRRSV-STF；空白组每只小鼠腹腔注射等体积的生理盐水。每隔24h注射一次，连续注射5次。最后一次注射24h后，每只小鼠注射6%可溶性淀粉肉汤2mL；24h后注射1%鸡红细胞悬液，0.2mL/只；轻柔小鼠腹部10min。4h后腹腔注射生理盐水3mL，轻柔小鼠腹部。30min后断颈处死小鼠，吸取腹腔液体，均匀滴于载玻片上，将其放于湿盒中，37℃孵育1h。取出载玻片，甲醇固定30min，姬姆萨染色30min。显微镜下观察巨噬细胞吞噬红细胞的活性，计算吞噬百分率。吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数／200个巨噬细胞。

经计算，注射PRRSV-STF组的小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率为54.48%，对照组的吞噬率为39.72%（见图2）。由图2可知：两组间差异极显著（P＜0.01），表明PRRSV-STF能够增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性。

3.2STF对小鼠外周血淋巴细胞增殖活性的影响

随机取3只6～8周龄BALB/c小鼠，摘除眼球采血，置于抗凝管内，分离小鼠外周血淋巴细胞（peripheralbloodlymphocyte,PBLC），用适量含10%小牛血清无酚红的RPMI1640细胞培养液悬浮、混匀。经1%台盼蓝染色检测PBLC活性在95%以上，并将细胞浓度调至4×10⁶个/mL；将细胞悬液加到96孔细胞培养板孔内，100mL/孔，每个样品重复3个孔，分别用STF（2.78mg/mL/孔）和ConA（终浓度为5mg/mL/孔）刺激，同时每个样品设立3个不刺激孔作为阴性对照。混匀后，于37℃，5%CO₂培养箱中，培养48h；每孔加入10mL浓度为5mg/mL的MTT溶液，轻轻振荡混匀，继续于37℃，5%CO₂培养箱中，培养4h；每孔中加入100mL10%SDS-盐酸，混匀后于37℃作用30min；测定OD₅₇₀nm光密度值，计算各组淋巴细胞的刺激指数（stimulatingindex,SI），分析各组淋巴细胞的增殖能力。SI=（刺激孔OD值－营养液对照孔的OD值）/（不刺激的阴性对照孔的OD值－营养液对照孔的OD值）。

用PRRSV-STF和ConA分别刺激小鼠PBLC48h后，通过MTT法检测各组淋巴细胞增殖活性（见图3）。由图3可知：PRRSV-STF处理组PBLC增殖的SI显著高于ConA处理组和空白对照组的SI（P＜0.05），表明PRRSV-STF能够显著刺激小鼠PBLC增殖。

3.3PRRS疫苗—STF免疫猪外周血淋巴细胞（PBLC）增殖试验

随机将9只4w健康仔猪随机分为A、B、C组，每组3只。A组：每头猪左侧颈部肌肉注射1头份PRRS疫苗，同时右侧颈部肌肉注射1mLSTF；B组：每头猪注射1头份的PRRSV疫苗与1mL的STF混合液；C组：每头猪注射2头份的PRRSV疫苗。免疫后20d，经前腔静脉采血，分离外周血淋巴细胞，用STF（终浓度为2.78mg/mL）刺激细胞48h后，通过MTT法检测各组淋巴细胞增殖活性，结果如图4所示（图4中，A组为PRRSV疫苗与STF分开注射；B组为PRRSV疫苗与STF混合液注射；C组为PRRSV疫苗单独免疫），有图4可知PRRSV弱毒疫苗和STF（与疫苗分开或混合）组的PBLC刺激指数分别为2.83±0.32和2.96±0.38，均显著高于单独接种疫苗组的SI（P＜0.05），两个免疫加注射STF组间没有显著差异（P＞0.05）。该结果表明，STF无论与PRRSV弱毒疫苗分开或混合注射，均能特异性提高免疫猪PBLC的增殖活性。（此步骤中试验操作步骤及SI计算方法同3.2）。

本发明从PRRSV活疫苗多次强化免疫猪的脾脏制备了PRRSV-STF，通过体内外实验证明该STF不仅能够非特异性增强小鼠的细胞免疫功能（增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性，提高小鼠外周血淋巴细胞转化能力），而且可以显著提高PRRS疫苗免疫猪外周血淋巴细胞转化能力，表明PRRS-STF能够提高机体的特异性细胞免疫功能，改善PRRS疫苗的免疫效果。本发明为STF的进一步研发提供了重要实验材料与科学依据。

Claims

1.一种高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法，其特征在于其包括下述步骤：

（1）无菌采取经过高致病性猪繁殖与呼吸综合症活毒疫苗JXA1-R毒株免疫猪的脾脏，去除脾脏的被膜和结缔组织，用生理盐水冲洗，称重，剪碎；

（4）将上清液置于孔径为7.0kD的透析袋内，用无热源的等体积无菌生理盐水在0～4℃环境下透析36～48h，收集透析外液，用直径为0.22μm的滤膜过滤除菌，加入冷冻保护剂，混匀，即得到高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子溶液，分装，-20℃保存。

2.根据权利要求１所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法，其特征在于步骤（1）中抗原免疫过程为：将高致病性猪繁殖与呼吸综合症活毒疫苗用生理盐水稀释后，肌肉注射给2头3月龄健康猪，间隔2周免疫一次，首次注射2头份/头，第2～4次免疫4头份/头；第四次免疫10天后，前腔静脉采血，分离血清，经ELISA检测抗PRRSV抗体水平为阳性即合格。

3.根据权利要求１所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法，其特征在于步骤（4）中采用蔗糖作为冷冻保护剂，特异性转移因子溶液中蔗糖的质量浓度为3.4%。