CN115850516B - 鱼类蛋白自组装纳米抗原及其制备的疫苗与应用 - Google Patents

鱼类蛋白自组装纳米抗原及其制备的疫苗与应用 Download PDF

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王高学
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Abstract

本发明公开了鱼类蛋白自组装纳米抗原及其制备的疫苗与应用。本发明所提供的包含融合蛋白的纳米抗原，所述融合蛋白由斑马鱼铁蛋白H亚基和抗原蛋白连接得到；所述斑马鱼铁蛋白H亚基的N端和所述抗原蛋白的C端通过连接肽连接得到；所述抗原蛋白选自鲤春病毒血症抗原蛋白、草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白或鲈鱼弹状病毒抗原蛋白。发明以鱼类自身铁蛋白和抗原蛋白序列进行串联后经大肠杆菌原核表达，制备得到表面展示抗原蛋白的纳米球状粒子，通过浸泡方式可引起鱼体产生广泛中和性抗体，提高了免疫效力，可有效预防鲤春病毒血症、草鱼出血病、鲈鱼弹状病毒病等水产疾病。本发明疫苗制备方法安全、简便，适合进行快速大规模生产。

Description

鱼类蛋白自组装纳米抗原及其制备的疫苗与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别地涉及鱼类蛋白自组装纳米抗原及其制备的疫苗与应用。
背景技术
近年来，我国已成为世界上最大的水产品生产国和消费国，2020年全国水产养殖产量已达5224.2万吨。人们对水产品的需求量处于逐年增长态势，直接推动了水产养殖业的快速发展，极大地促进了水产养殖业经济发展。而水产病毒性疾病是水产养殖业危害最大的一类疾病，具有发病急、传播快、治疗难、死亡率高和危害大等特点。水产病毒性疾病具有宿主感染范围广、发病急和死亡率高等特点，可以感染几乎所有的鲤科鱼类，患病幼鱼的死亡率在90％以上。因此，水产病害防控已成为制约水产养殖业持续健康发展的关键问题。
疫苗已成为水生动物疾病防治领域研究与开发的主流产品，也是确保水产养殖绿色发展的必然选择。我国自1969年成功制备草鱼土法疫苗以来，历经多年发展，目前已在多种水产病原的土法疫苗、活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗制备上取得了一些突破，并于2011年成功获批了首个渔用疫苗(草鱼出血病活疫苗)国家一类新兽药证书。但是，目前渔用疫苗在大规模产业化应用方面仍然存在一些理论和技术瓶颈，特别是在免疫途径和免疫效果方面。其中，注射免疫保护效果最好，但由于操作技术和生产成本等原因，其难以满足大规模产业化要求；浸浴和口服免疫虽然操作技术简单、生产成本低，但存在体表皮肤和肠道屏障限制作用、酶解失活、免疫保护率低等一系列难以克服的技术问题，大量研究表明纳米材料作为渔用疫苗的载体可有效提高疫苗的免疫保护效果。
近年来，铁蛋白(Ferritin)作为一种纳米材料在多个领域得到应用。铁蛋白是一种广泛存在于生物体中的笼状蛋白，其蛋白外壳由24个铁蛋白亚基自组装而成，其中每三个亚基组成一个三聚体亚单位。铁蛋白的N末端伸向外表面，易于进行基因修饰，融合蛋白多肽。高度有序重复抗原在微生物体表面以5-10nm间隔分布时易于诱导其产生强烈的T细胞依赖的抗体反应。铁蛋白非常稳定，能够耐受高温(70-80℃)和多种变性剂而不被影响天然蛋白结构。铁蛋白对pH敏感，在pH 2.0的酸性条件下蛋白壳发生解体，而当pH恢复到生理条件(pH 7.0)时，解体的蛋白亚基又能重新组装成完整的铁蛋白。近年来对铁蛋白的研究主要集中在：(1)通过对铁蛋白内表面的修饰使铁蛋白壳内包裹上特定药物或者促进纳米材料的合成；(2)通过对铁蛋白外表面的修饰使其与PEG或抗体连接以扩展新的功能；(3)通过铁蛋白外表面或亚基间接触面的修饰控制铁蛋白的自组装。
发明内容
铁蛋白纳米颗粒展示抗原，能够显著地增强抗原的免疫原性，引起更强的体液、细胞免疫反应，因此本发明以鱼类的铁蛋白H亚基作为抗原的载体。
本发明的一个目的是提供一种包含融合蛋白的纳米抗原。
本发明所提供的包含融合蛋白的纳米抗原，所述融合蛋白由斑马鱼铁蛋白H亚基和抗原蛋白连接得到；所述斑马鱼铁蛋白H亚基的N端和所述抗原蛋白的C端通过连接肽连接得到；所述抗原蛋白选自鲤春病毒血症抗原蛋白、草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白或鲈鱼弹状病毒抗原蛋白。
所述鱼类自身铁蛋白为斑马鱼铁蛋白H亚基，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQID NO：6所示。
所述鲤春病毒血症抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
所述融合蛋白为含鲤春病毒血症抗原蛋白和斑马鱼铁蛋白的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
所述草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
所述融合蛋白为含草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白和斑马鱼铁蛋白的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
所述鲈鱼弹状病毒抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。
所述融合蛋白为含鲈鱼弹状病毒抗原蛋白和斑马鱼铁蛋白的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
所述的包含融合蛋白的纳米抗原在制备预防水产疾病的疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明以鱼类自身铁蛋白和抗原蛋白序列串联大肠杆菌原核进行表达，制备得到表面展示抗原蛋白的纳米球状粒子，通过浸泡方式可引起鱼体产生广泛中和性抗体，提高了免疫效力，可有效预防鲤春病毒血症、草鱼出血病、鲈鱼弹状病毒病等水产疾病。本发明疫苗制备方法安全、简便，适合进行快速大规模生产。
附图说明
为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例，特别是参考附图来描述本发明，其中：
图1为SVCV-G-DH蛋白表达结果：M：蛋白marker；1：pET32a空载蛋白；2：纯化后SVCV-G-DH蛋白。
图2为GCRV-VP4-DH蛋白表达结果：M：蛋白marker；1：pET32a空载蛋白；2：纯化后GCRV-VP4-DH蛋白。
图3为MSRV-G-DH蛋白表达结果：M：蛋白marker；1：pET32a空载蛋白；2：纯化后MSRV-G-DH蛋白。
图4为SVCV-G-DH蛋白Westernblot表达结果。
图5为GCRV-VP4-DH蛋白Westernblot表达结果。
图6为MSRV-G-DH蛋白Westernblot表达结果。
图7为SVCV-G-DH蛋白疫苗的透射电镜观察结果。
图8为蛋白自组装浸泡疫苗免疫后的酶活水平变化。数据结果表示为平均值±标准误。**P<0.01，*P<0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1、蛋白自组装浸泡疫苗的制备
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1病毒毒株、菌株和载体
pET-32a(+)载体购于武汉淼灵生物科技有限公司。大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)菌株为北京康为世纪生物科技有限公司产品。pET32a-SVCV-G-DH(BL21(DE3)菌株(含鲤春病毒血症抗原蛋白和斑马鱼铁蛋白H亚基序列)为武汉金开瑞生物有限公司合成产品。
1.1.2铁蛋白基因序列和抗原蛋白基因序列：通过分析得到的共有序列送至武汉金开瑞生物有限公司合成，并克隆到pET-32a(+)载体上。
1.1.3试剂
显色剂DAB、BCA蛋白含量测定试剂盒为北京康为世纪生物科技有限公司产品。蛋白Marker购自天根生化科技(北京)有限公司。鼠源组氨酸单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自Abcam公司。其他常规试剂为国产，分析纯。
1.1.4试验仪器
ALC-1100.2电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，上海特成机械设备有限公司；H1650-W型台式高速微量离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；SY-360型超声波提取器，上海宁商超声仪器有限公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术(上海)有限公司；超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；DYCZ-24DN型迷你双垂直电泳仪、WD-9413A型凝胶成像分析系统购自北京市六一仪器厂；Thermo Multiskan MK3酶标仪，美国热电赛默飞世尔科技公司；伯乐PCR仪，美国伯乐公司；透射电镜FEI Tecnai F20，美国FEI公司。
1.2试验方法
1.2.1含鲤春病毒血症抗原蛋白基因序列和斑马鱼铁蛋白H亚基基因序列的合成(SVCV-G-DH)
斑马鱼铁蛋白H亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，斑马鱼铁蛋白H亚基基因如SEQ ID NO：2所示；鲤春病毒血症抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，鲤春病毒血症抗原蛋白基因序列如SEQ ID NO：4所示。
为了使含鲤春病毒血症抗原蛋白基因序列与铁蛋白更好地融合表达，在二者之间由一段连接肽基因序列(linker序列)连接。连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：5)，连接肽基因序列(linker序列)为GGTGGTGGTGGCAGCGGTGGCGGTGGCAGT(SEQ ID NO：6)。
含鲤春病毒血症抗原蛋白和斑马鱼铁蛋白的融合蛋白(SVCV-G-DH)的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，含鲤春病毒血症抗原蛋白和斑马鱼铁蛋白的融合蛋白(SVCV-G-DH)基因序列如SEQ ID NO：8所示，其中GGATCC为酶切位点BamH I，CTCGAG为酶切位点Xho I。
1.2.2含鲤春病毒血症抗原蛋白和斑马鱼铁蛋白的质粒构建
通过分析得到的共有序列送至武汉金开瑞生物有限公司合成，并克隆到pET-32a(+)载体上。将得到的重组质粒命名为pET32a-SVCV-G-DH。
将鉴定正确的重组质粒pET32a-SVCV-G-DH转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到含pET32a-SVCV-G-DH重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。
1.2.3SVCV-G-DH蛋白诱导表达
将含pET32a-SVCV-G-DH重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)，37℃振荡培养1h，涂于LB平板(含氨苄青霉素)培养，37℃过夜，挑取单菌落于LB液体培养基(含氨苄青霉素)，37℃振荡培养，过夜，从中另取1％菌液于新培养基中扩大培养，至OD600为0.6时加入终浓度为0.6mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，诱导培养4-6h，离心，弃上清，用1×PBS洗离心沉淀物2次，加入等体积样品缓冲液，混匀，煮沸5min，用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。取纯化的蛋白泳道转硝酸纤维素膜，以鼠源组氨酸单克隆抗体为一抗，以羊抗鼠IgG为二抗进行孵育，洗涤后以DAB显色，进行Western Blot分析。
1.2.4SVCV-G-DH蛋白的纯化
大量收集诱导表达的菌液，于50mL离心管中12,000r/min、4℃离心10min，收集沉淀，以超声破碎缓冲液重悬沉淀，冰浴超声40min，12,000r/min离心20min，取沉淀，用去离子水清洗，加入含8mol/L尿素的变性液溶解，于12,000r/min、4℃条件离心10min，取上清，分别于含有6.0、4.0、2.0、1.0mol/L尿素的PBS中透析，最后于1×PBS中透析过夜。通过His标签的镍柱试剂盒对蛋白进行纯化，收集纯化后的蛋白液体，冷冻后抽制成冻干粉以便保存。使用时以无菌水溶解，用BCA蛋白含量测定试剂盒测定蛋白浓度。
1.2.5SVCV-G-DH蛋白疫苗的形貌观察
将复性好的SVCV-G-DH融合蛋白送往中国科学院动物所电镜实验平台进行透射电镜观察(图7)。从图7可见，自组装蛋白疫苗为直径约20nm，大小较为均一的球状纳米颗粒。负染：取透析复性好的蛋白样品，进行稀释后，将样品按顺序滴于塑料膜上，用镊子夹取铜网，将带有碳支持膜的一面放置于样品液滴上，待铜网膜吸附蛋白3-5min后，沿铜网边缘用吸水纸吸走多余水分，并用灭菌水冲洗，吸水纸吸走多余水分。之后将铜网置于醋酸铀染液上染色5min，最后将铜网置于超净台晾干，准备在透射电镜下观察。
采用与上述相同方法，合成草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白基因序列和斑马鱼铁蛋白H亚基基因序列(GCRV-VP4-DH)：
斑马鱼铁蛋白H亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，斑马鱼铁蛋白H亚基基因如SEQ ID NO：2所示；草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白基因序列如SEQ ID NO：10所示。
为了使草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白基因序列与铁蛋白更好地融合表达，在二者之间由一段连接肽基因序列(linker序列)连接。连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：5)，连接肽基因序列(linker序列)为GGTGGTGGTGGCAGCGGTGGCGGTGGCAGT(SEQ ID NO：6)。
含草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白和斑马鱼铁蛋白的融合蛋白(GCRV-VP4-DH)的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，含草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白和斑马鱼铁蛋白的融合蛋白(GCRV-VP4-DH)基因序列如SEQ ID NO：12所示，其中GGATCC为酶切位点BamHI，CTCGAG为酶切位点XhoⅠ。
采用与上述相同方法，合成鲈鱼弹状病毒抗原蛋白基因序列和斑马鱼铁蛋白H亚基基因序列(MSRV-G-DH)：
斑马鱼铁蛋白H亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，斑马鱼铁蛋白H亚基基因如SEQ ID NO：2所示；鲈鱼弹状病毒抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，鲈鱼弹状病毒抗原蛋白基因序列如SEQ ID NO：14所示。
为了使含鲈鱼弹状病毒抗原蛋白基因序列与铁蛋白更好地融合表达，在二者之间由一段连接肽基因序列(linker序列)连接。连接肽氨基酸序列为GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：5)，连接肽基因序列(linker序列)为GGTGGTGGTGGCAGCGGTGGCGGTGGCAGT(SEQ ID NO：6)。
含鲈鱼弹状病毒抗原蛋白和斑马鱼铁蛋白的融合蛋白(MSRV-G-DH)的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，含鲈鱼弹状病毒抗原蛋白和斑马鱼铁蛋白的融合蛋白(MSRV-G-DH)基因序列如SEQ ID NO：16所示，其中GGATCC为酶切位点BamHI，CTCGAG为酶切位点XhoⅠ。
2结果与分析
2.1SVCV-G-DH蛋白的表达及检测结果
重组表达质粒pET32a-SVCV-G-DH在大肠杆菌BL21中获得表达。在诱导4h后，经SDS-PAGE电泳，表达的融合蛋白(SVCV-G-DH)相对分子质量约为53kDa(图1)，与预期结果相符。经BandScan软件分析，蛋白的最高表达量占细菌总蛋白的17.4％；Western Blot分析结果表明，在53KDa处有一明显的识别条带(图4)，表明产物蛋白能与抗His单克隆抗体识别，证实其具有良好的抗原反应性。
2.2GCRV-VP4-DH蛋白的表达及检测结果
重组表达质粒pET32a-GCRV-VP4-DH在大肠杆菌BL21中获得表达。在诱导4h后，经SDS-PAGE电泳，表达的融合蛋白(GCRV-VP4-DH)相对分子质量约为57kDa(图2)，与预期结果相符。Western Blot分析结果表明，在57KDa处有一明显的识别条带(图5)，表明产物蛋白能与抗His单克隆抗体识别，证实其具有良好的抗原反应性。
2.3MSRV-G-DH蛋白的表达及检测结果
重组表达质粒pET32a-MSRV-G-DH在大肠杆菌BL21中获得表达。在诱导4h后，经SDS-PAGE电泳，表达的融合蛋白(MSRV-G-DH)相对分子质量约为55kDa(图3)，与预期结果相符。Western Blot分析结果表明，在55KDa处有一明显的识别条带(图6)，表明产物蛋白能与抗His单克隆抗体识别，证实其具有良好的抗原反应性。
免疫所用的疫苗即为自组装后蛋白：鲤春病毒血症疫苗SVCV-G-DH、草鱼呼肠孤病毒疫苗GCRV-VP4-DH、鲈鱼弹状病毒疫苗MSRV-G-DH。组装过程：纯化后的蛋白在PH为中性的水(缓冲液也可以)中即可自行自组装形成球状纳米粒子。
实施例2、自组装铁蛋白载体免注射疫苗对水产疾病的预防效果试验
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物
斑马鱼(平均体重：0.4±0.2g)约500尾，购自陕西省西安市花鸟鱼虫市场；草鱼(平均体重：1.0±0.2g)约500尾，购陕西省水产总站新民国家级家鱼良种养殖场；鲈鱼(平均体重：1.8±0.5g)约500尾，购福建省福州市五都水产良种养殖场。
1.1.2病毒、菌种和试剂
鲤春病毒血症病毒(SVCV)，II型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)和鲈鱼弹状病毒(MSRV)为本实验室分离并保存。本实验室最早的鲤春病毒为现盐城工学院海洋与生物工程学院李强教授惠赠，文献如下：《鲤春病毒血症病毒G蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备》，2014，张家林，李强，叶仕根，李华，大连海洋大学学报，29(5):454-458。本实验室发表的关于该SVCV的最早文献为Lei Liu,Xiao Tu,Yu-Feng Shen,Wei-Chao Chen,Bin Zhu*,Gao-XueWang*.The replication of spring viraemia of carp virus can be regulated byreactive oxygen species andNF-KB pathway.Fish&Shellfish Immunology 67(2017),211-217.
记载过GCRV的非专利文献为：Qiu De-Kui,Zhao Zhao,MaRui,Guo Zi-Rao,JiaYi-Jun,Zhang Chen,Wang Gao-Xue,Zhu Bin*.Antigen epitope screening of grasscarp reovirus and its protectively immunity assessment for grasscarp.Aquaculture.2020,515:734550.
记载过MSRV的非专利文献为：Guo Zi-Rao,Zhao Zhao,Zhang Chen,Jia Yi-Jun,Qiu De-Kui,Zhu Bin*,Wang Gao-Xue*.Carbon nanotubes-loaded subunit vaccine canincrease protective immunity against rhabdovirus infections of largemouthbass(Micropterus Salmoides).Fish&Shellfish Immunology.
鲤春病毒血症疫苗SVCV-G-DH，草鱼呼肠孤病毒疫苗GCRV-VP4-DH、鲈鱼弹状病毒疫苗MSRV-G-DH由实施例1的方法制备(免疫所用的即为自组装后蛋白)，并由本实验室保存；NaCl，国药集团化学试剂有限公司；鼠源组氨酸单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自Abcam公司；96孔酶标板，美国康宁公司；Elisa检测试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司。
1.1.3试验仪器
冷冻低温离心机，美国Thermo公司；超低温冰箱，美国Thermo公司；Classic超纯水仪，威立雅水处理技术(上海)有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；组织捣碎匀浆机，金坛市城东新瑞仪器厂；Thermo Multiskan MK3酶标仪，美国热电赛默飞世尔科技公司。
1.2试验方法
将本实验室制备的疫苗用蒸馏水溶解稀释成悬浊液，分别以1，10，20mg/L的浓度进行浸泡免疫，浸泡时间为6h，每个浓度各100尾鱼。免疫后分别放入5m3大小养殖池内并增氧，每个养殖池放养100尾，水温控制在27-28℃。在免疫后第14，21，28，49，56和70天于每个浓度处理组随机采集10尾鱼用于抗体效价测定。采用剪断鱼脊柱处死的方法，采集鱼的血液，将血液在室温下静置2h，放入4℃冰箱过夜。第二天，以5,000g的速度于低温冷冻离心机中离心15min(血清离心一般是低转速1,000g左右)，取上层血清。抗体检测采用酶联免疫吸附法：以纯化的疫苗为抗原，上述采样血清为抗体，鼠源组氨酸单克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为二抗，一抗和二抗的稀释比例为1:1000。显色反应采用DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒进行处理。显色后通过Thermo Multiskan MK3酶标仪(MolecularDevices Corp.,PaloAlto，CA)测定在波长为450nm条件下的吸光度。
取上述免疫28天后鱼的血清用于免疫相关生理指标的测定。每个浓度处理组采样5尾鱼，3个平行。超氧化物歧化酶活性(Superoxide dismutase SOD)，酸性磷酸酶活性(Acidphosphatase activity，ACP)和碱性磷酸酶活性(Alkaline phosphatase activity，AKP)采用相应的检测试剂盒进行测定。
免疫28天后，从上述各组试验鱼中随机取30尾置于新鱼缸中，进行攻毒试验。除此之外，攻毒试验期间控制鱼缸中的水温为22±0.5℃，其他养殖条件不变。攻毒的方式为注射，注射部位为鱼的腹腔，每尾鱼均注射10μL 5.0×104TCID50/mL的SVCV病毒液或1.0×102TCID50/mL的GCRV病毒液或2.0×106TCID50/mL的MSRV病毒液。定期对试验鱼进行观察，并及时记录发病情况，对死亡的鱼及时保存并进行病毒检测。免疫保护力的计算公式为：相对保护率＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100％。
2结果与分析
由表1-3可以看出，免疫后的斑马鱼、草鱼和鲈鱼的抗体效价会随着时间的增长而显著升高，呈现一定的剂量效应关系。免疫效价在21到28天左右会达到峰值水平，第49天开始下降，但仍处于较强的水平。同时，在相同浓度或剂量情况下，蛋白自组装浸泡疫苗免疫组的血清水平要高于纯疫苗免疫处理组。
表1 SVCV-G-DH疫苗免疫斑马鱼抗体效价检测结果
表2 GCRV-VP4-DH疫苗免疫草鱼抗体效价检测结果
表3 MSRV-G-DH疫苗免疫鲈鱼抗体效价检测结果
从图8可以看出，相对于对照组，不同浓度的蛋白自组装浸泡疫苗分别免疫以后的斑马鱼、草鱼和鲈鱼的超氧化物歧化酶，酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性显著提高，并且随着疫苗浓度的升高，酶活水平也逐渐提高，呈现一定的剂量效应关系。同时，在相同免疫疫苗浓度情况下，蛋白自组装浸泡疫苗免疫组的血清水平要高于纯疫苗免疫处理组。
从表4-6可知，用鲤春病毒血症病毒、呼肠孤病毒和鲈鱼弹状病毒分别对相应的鱼进行攻毒后，疫苗的免疫浓度越高，鱼体的保护率也越高，同时，在相同免疫疫苗浓度情况下，蛋白自组装浸泡疫苗免疫组的血清水平要高于纯疫苗免疫处理组。蛋白自组装浸泡疫苗免疫后斑马鱼的保护率最高为63.33％；免疫后草鱼的保护率最高为93.33％；免疫后鲈鱼的保护率最高为76.67％。
表4 SVCV-G-DH疫苗免疫斑马鱼攻毒结果
表5 GCRV-VP4-DH疫苗免疫草鱼攻毒结果
表6 MSRV-G-DH疫苗免疫鲈鱼攻毒结果
经过70天的养殖，养殖的池塘均没有发生相应的上述三种水产病毒性疾病。蛋白自组装浸泡疫苗在水产病毒性疾病的预防方面具有广阔的应用前景。
上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。

Claims (2)

1.一种由融合蛋白组成的纳米抗原，其特征在于，所述融合蛋白由斑马鱼铁蛋白H亚基与抗原蛋白通过连接肽连接得到；
所述融合蛋白由斑马鱼铁蛋白H亚基与鲤春病毒血症抗原蛋白连接得到，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
或所述融合蛋白由斑马鱼铁蛋白H亚基与草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白连接得到，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；
或所述融合蛋白由斑马鱼铁蛋白H亚基与鲈鱼弹状病毒抗原蛋白连接得到，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
2.权利要求1所述的纳米抗原在制备预防水产疾病的疫苗中的应用，其特征在于，所述水产疾病由鲤鱼春季病毒血症病毒，或草鱼呼肠孤病毒，或鲈鱼弹状病毒引起。
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