CN114380921A

CN114380921A - 基于人铁蛋白的鸭坦布苏病毒e蛋白的纳米疫苗、抗原及其应用

Info

Publication number: CN114380921A
Application number: CN202210060703.8A
Authority: CN
Inventors: 侯绍华; 李松励; 阴雅洁; 王昭华; 梁瑞英
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2022-01-19
Filing date: 2022-01-19
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2042-01-19
Also published as: CN114380921B

Abstract

本发明公开了基于人铁蛋白的鸭坦布苏病毒E蛋白的纳米疫苗、抗原及其应用，该疫苗由密码子优化后的鸭坦布苏病毒E3结构蛋白与自组装铁蛋白纳米颗粒亚基经linker连接而成，采用原核表达系统表达，获得的重组蛋白可通过Ferritin自组装作用形成二十四聚体纳米抗原。该亚单位疫苗可克服E蛋白免疫原性不足的缺点，能显著的提高宿主感染鸭坦布苏对病毒后产生的的中和抗体的水平，产生的抗体具有强力阻挡病毒入侵靶细胞的能力，同时获得的新型融合蛋白在试剂盒和抗鸭坦布苏病毒药物制备中均可以得到应用。

Description

基于人铁蛋白的鸭坦布苏病毒E蛋白的纳米疫苗、抗原及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。具体涉及到一种基于人铁蛋白的鸭坦布苏病毒E蛋白亚单位疫苗，属于鸭坦布苏病疫苗的制备和应用领域。

背景技术

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus，DTMUV)引起的一种传染性疾病，其特征表现为病鸭采食量及产蛋量大幅下降，并伴有严重的神经功能障碍。鸭群感染后几乎全部发病，死亡率为5％-15％不等，DTMUV感染会导致鸭群免疫力下降，容易继发细菌性疾病，造成混合感染，严重危害我国水禽养殖。据报道，DTMUV还可以感染小鼠，人神经细胞系和肝细胞系均具有高度易感性。因此，DTMUV作为一种潜在的人畜共患病原体，对人类健康也造成一定的威胁。

DTMUV囊膜(E)蛋白位于病毒颗粒的外表面，由501个氨基酸编码，在病毒与受体结合进入细胞的过程中起重要作用。完整的E蛋白由两个反向平行排列的单体组成，每个单体包含三种结构域——结构域Ⅰ(DⅠ)、结构域Ⅱ(DⅡ)和结构域Ⅲ(DⅢ)。结构域I被称为中心结构域，具有血清学或生物活性的表位；结构域II有一个亲水区域，包含中和作用和血凝作用的表位；结构域III参与受体结合作用，是免疫球蛋白的结合区域，同样具有高度的保守性，是黄病毒E蛋白的最主要抗原区域，也是黄病毒的特异抗原表位最多的区域。因此，E蛋白是开发新型疫苗、治疗性抗体和诊断技术的关键靶点。

传统的DTMUV疫苗多为减毒活疫苗，包括天然减毒株和基因重组弱毒株等。应用减毒株疫苗的最大缺陷是减毒株在易感群体中有恢复毒力的风险。因此，生产安全、高效及廉价的基因工程疫苗已成为新的需求。近年来，纳米生物学被认为是纳米技术中最有潜力的领域之一，铁蛋白是最为常见的纳米颗粒，广泛应用于多个领域。铁蛋白纳米颗粒具有纳米尺寸的笼状结构的蛋白质外壳，性质稳定，能够耐受高温和多种变性剂且保持天然蛋白结构。本发明中应用的人铁蛋白，已用于流感病毒、HIV-1和EB病毒等纳米疫苗的研发，两种甲型流感铁蛋白疫苗在临床实验中，已经被证明具有较好的安全性和较高的免疫原性。

鉴于此，目前急需提出一种新的鸭坦布苏病毒病疫苗、抗原等来解决上述存在的现状问题。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明旨在提供基于人铁蛋白的鸭坦布苏病毒E蛋白的纳米疫苗、抗原及其应用，其安全性、有效性、可靠性得到显著提高。

本发明技术方案的思路为：由24个亚基自组装而成的铁蛋白纳米粒子是一个理想的抗原呈递和疫苗开发平台。应用铁蛋白纳米粒子开发的鸭坦布苏病毒病疫苗，能够显著地增强抗原的免疫原性，该安全、高效并且廉价的鸭坦布苏病毒病疫苗，对于鸭坦布苏病毒病的防治将具有重要的意义，同时，本发明通过E蛋白-Ferritin融合蛋白免疫雏鸭，证实了产生的抗体具有可强力阻挡鸭坦布苏病毒入侵靶细胞的能力。验证了本发明的融合蛋白在生物体内能产生抗体。

较为具体地，本发明第一方面提供了一种鸭坦布苏病毒新型融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

进一步的，所述融合蛋白由鸭坦布苏病毒病毒衣壳蛋白和铁蛋白亚基所组成。

进一步的，所述鸭坦布苏病毒病毒衣壳蛋白为鸭坦布苏病毒病毒E蛋白的EⅢ片段。

进一步的，所述铁蛋白亚基来源于哺乳动物。

进一步的，所述融合蛋白是将鸭坦布苏病毒病毒衣壳蛋白和铁蛋白亚基的N端通过柔性Linker连接得到融合蛋白。

进一步的，当所述Linker为GSG时所得融和蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

较为具体地，本发明第二方面提供了一种鸭坦布苏病毒新型融合蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:5。

较为具体地，本发明第三方面提供了一种鸭坦布苏病毒亚单位疫苗，所述疫苗的抗原为权利要求1所述的鸭坦布苏病毒新型融合蛋白。

较为具体地，本发明第四方面提供了一种鸭坦布苏病毒亚单位疫苗抗原的制备方法，包括以下步骤：

S1：优化鸭坦布苏病毒病毒衣壳蛋白，也就是大肠杆菌密码子优化，获得氨基酸序列和编码基因的核苷酸序列；

S2：优化铁蛋白亚基，也就是大肠杆菌密码子优化，获得氨基酸序列和编码基因的核苷酸序列；

S3：将步骤S1和S2分别在获得的氨基酸序列通过柔性Linker串联所示氨基酸对应的核苷酸序列的3’端加上翻译终止密码子，获得融合蛋白氨基酸序列；

S4：克隆表达，筛选正确的重组子，然后转化原核表达系统进行表达，收集并纯化所表达的抗原。

进一步的，所述步骤S1中优化得到的鸭坦布苏病毒病毒衣壳蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

进一步的，所述步骤S1中优化得到的铁蛋白亚基的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

进一步的，所述步骤S3中得到的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

较为具体地，本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求4-7任一项所制备的抗原。

进一步的，所述试剂盒中含有所述抗原，或者编码所述抗原的DNA分子，或者表达所述抗原的重组载体/表达盒/转基因细胞系/重组菌。

较为具体地，本发明第六方面提供了一种如权利要求4-7任一项所制备的抗原在制备抗鸭坦布苏病毒药物中的应用。：

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明利用原核表达系统大肠杆菌表达重组蛋白疫苗，疫苗制备过程不涉及到活的有害病毒，相比传统的制备鸭坦布苏病毒疫苗方法操作更加安全、简便，适合进行快速大规模生产。

2、本发明以DTMUV的衣壳蛋白为抗原片段，并通过Ferritin自组装作用形成二十四聚体纳米抗原，该方案可克服E蛋白单体免疫原性不足的缺点，所得疫苗能显著的提高宿主针对病毒的中和抗体的水平，产生的抗体具有强力阻挡病毒入侵靶细胞的能力。

附图说明

图1为E-Fe融合蛋白结构示意图。

图2为表达E-Fe融合蛋白的质粒结构示意图。

图3为E-Fe融合蛋白经superdex 200pg 10/600纯化后的还原性PAGE胶图。

图4为E-Fe电镜拍摄图。

图5为鸭血清中抗体水平结果图。

图6为鸭器官病理组织学变化(HE染色)结果图。

具体实施方式

为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

实施例1：构建DTMUV抗原(E-Fe)

鸭坦布苏病毒抗原通过以下方法制备所得：如图1所示，在SEQ ID NO:1与SEQ IDNO:3通过柔性Linker串联所示氨基酸对应的核苷酸序列的3’端加上翻译终止密码子，该编码基因优化后进行人工合成，将合成的基因通过无缝克隆的方法插入原核表达质粒pBV220(BamH I)酶切位点之间，质粒质谱如图2所示。重组质粒转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，筛选和PCR鉴定出阳性克隆。经测序验证后用于纳米抗原蛋白的表达。将pBV220-E3-Fe质粒转化至大肠杆菌表达感受态细胞Transetta(DE3)内，同时用pBV220空载体同样转入Transetta(DE3)作为对照，放置在37℃恒温培养箱中培养过夜。用白色枪头挑取单个菌落置于5mL A+LB中30℃恒温震荡培养箱培养8h～12h。取出30μL放入新的3mL A+LB，30℃震荡培养2h～3h，使OD值在0.6～0.8之间，转至42℃分别诱导3h、6h、9h，并设置30℃未诱导组作为未诱导对照。诱导完成后12000g离心2min，弃上清取沉淀，置于-20℃保存。在沉淀悬浮液中加入10μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer，混合均匀后煮沸10min使蛋白变性，12000g离心1min，取10μL上清加入梳孔中。电压80V跑30min，将蛋白在浓缩胶被压缩成一条直线，将电压调至120V跑90min，使溴酚蓝全部跑入电泳液中停止。将蛋白胶浸入考马斯亮蓝染色液中，水平摇床上染色30min。将染色液置换为脱色液，脱色至蛋白胶变为透明且蛋白条带清晰。

实施例2：E-Fe纳米抗原纯化

将保存的菌液取出100μL接种到100mL氨苄LB液体培养基中，30℃恒温震荡培养箱培养8h～12h做为大量诱导的母液。接种50mL母液于1L氨苄LB液体培养基中，30℃恒温震荡培养至OD值在0.6～0.8之间，转移至42℃200rpm诱导培养6h。9000g离心3min，弃去上清留沉淀，用50mL ddH2O重悬菌体，移至100mL烧杯中再放入冰盒中，使用超声破碎仪裂解菌体，超声程序为：功率为50％，超声50min，超声开5S，停5S。超声完毕后9000g离心30min，弃上清。用玻璃棒轻轻擦去白色包涵体上黄色粘稠的细菌碎片。

(1)将包涵体洗涤液Washing buffer预冷，加入20mL washing buffer和20μL DTT溶液，重悬包涵体，9000g离心10min，重复洗涤3次。

(2)将包涵体重悬液Resuspention buffer预冷，用20mL resuspention buffer和20μL DTT溶液再次重悬包涵体，取20μL，煮10min，点胶5μL做SDS-PAGE分析。将重悬的包涵体移入50mL离心管，9000g离心10min，弃去上清，称取包涵体重量。

(3)将包涵体变性液Dissolution buffer预冷，加至包涵体中使包涵体终浓度为30mg/ml，加入1/100DTT溶液。移入100mL烧杯中，4℃于磁力搅拌器上搅拌12h。9000g离心5min，上清-20℃保存。

(4)将包涵体复性液Refolding buffer预冷，经0.22μm滤膜过滤除去杂质，加入0.7653g GSH和0.1532g GSSG，置于磁力搅拌器上搅拌溶解。(5)磁力搅拌器调至合适转速，组合1mL注射器针头和5mL针管，抽取5mL包涵体变性液，固定在复性液上方，取出推柄使变性液逐滴缓慢滴入复性液中，4℃搅拌复性8h。连续滴加3次。

(6)组装浓缩杯并在杯底部加入30kDa滤膜，倒入复性液，拧紧杯盖，置于磁力搅拌器上，连接氮气罐并使压力维持在0.1MPa浓缩蛋白液。

(7)当浓缩杯中蛋白液约剩20mL时，加入60mL分子筛缓冲液换液，继续浓缩至10mL。

(8)将浓缩后的蛋白样品转移至50mL离心管中，9000g离心5min，置于冰中保存备用。

实施例3：疫苗制造、半成品以及成品检验

该疫苗由密码子优化后的鸭坦布苏病毒E3结构蛋白与自组装铁蛋白纳米颗粒亚基经linker连接而成，采用原核表达系统表达，获得的重组蛋白可通过Ferritin自组装作用形成二十四聚体纳米抗原。该亚单位疫苗可克服E蛋白免疫原性不足的缺点，能显著的提高宿主感染鸭坦布苏对病毒后产生的的中和抗体的水平，产生的抗体具有强力阻挡病毒入侵靶细胞的能力。

取800μg纯化并浓缩的E3-Fe蛋白。再按水相比油相体积比3:7的比例添加ISA70VG，将蛋白逐滴加入ISA 70VG，同时用匀浆机在冰上研磨10min，制备完成的油乳剂蛋白浓度为400μg/mL。

抗原纳米颗粒质量检验：

(1)将乳剂4000g离心25min，观察是否为均一不分层的的油乳状。

(2)将制备好的乳剂滴两滴于水中，观察第二滴是否不分散而呈聚合在一起的油滴状。

(3)无菌检验：取一滴乳剂疫苗划线接种到普通营养琼脂培养皿，37℃培养24h，观察细菌生长情况。

(4)安全性检验：将乳化后的纳米颗粒通过颈部皮下注射接种于7日龄雏鸭，观察注射部位是否发炎等。雏鸭的精神状态和活动状况是否出现异常。

实施例4：E-Fe亚单位疫苗免疫应答反应的检测

首先将16只7日龄北京鸭分成2组，每组8只。给药部位为颈背部皮下，每次注射蛋白量均为80μg/只。然后对7日龄的北京鸭进行分组免疫。免疫策略如表1所示，通过颈部皮下注射的方式，每只雏鸭分别在第0天，第2周(14天)，接受2次疫苗免疫。二免后第14天，对雏鸭进行颈静脉采血。鸭血清在静置一段时间待血清析出后，通过4℃，2800rpm离心15分钟获得。

表1免疫策略

抗原\对照	抗原含量	动物数量
			E-Fe	80μg	8
PBS	800μL	8

实施例5：抗体检测

如图5所示，使用鸭坦布苏病毒ELISA抗体检测试剂盒检测血清中的抗体，将收集的鸭血清稀释10倍后加入抗原包被板孔中，按DTMUV ELISA抗体检测试剂盒说明书进行鸭血清抗体检测，最后置酶标仪上测定各孔OD450值，如表3所示。

阻断率(PI)＝(1-样品孔平均OD450值/阴性对照孔平均OD450值)×100％

当PI≥18.4％，样品判为阳性；当PI≤12.6％，样品判为阳性；在其中间时复检一次，如结果仍为PI＜18.4％，判为阴性。将E-Fe纳米抗原免疫北京鸭后可即检测到血清中DTMUV抗体，检验显示E3-Fe蛋白免疫组北京鸭阻断率阳性率为100％(8/8)，抗体水平高于对照组，且组间差异显著(p<0.001)。

二免后14d，将0.2mL DTMUV病毒液经腿部肌肉分别感染E3-Fe蛋白免疫组和对照组(PBS免疫组)，观察每组鸭的发病情况，攻毒后2d无菌采集血浆检测毒血症计算发病数量，并统计10d内各组鸭的死亡数量。攻毒后10d，处死并剖检鸭子，观察脑、心脏、肝脏和脾脏病变，并用4％多聚甲醛固定保存，制作病理切片观察比较。

E-Fe组鸭发病数量为4只，攻毒保护率约为50％；对照组全部发病，保护率为0％。攻毒试验对照组(PBS组)的8只北京鸭在攻毒后均出现临床症状，死亡率为25％，而免疫组无死亡情况发生，如表2所示。

攻毒后第10d处死各组鸭子，剖检观察其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑病变，制作并观察病理切片。各器官病理切片观察可见，

对照组：

(1)心肌细胞颗粒变性(图6A1)；

(2)肝脏病理切片观察可见(图6B1)：肝脏局灶性肝细胞坏死，淋巴细胞浸润(箭头Ba)，肝脏局灶性淤血(箭头Bb)；

(3)脾脏淤血(箭头Ca)，脾白髓结构不清，淋巴细胞减少(图6C1)；

(4)肺脏病理切片观察可见(图6D1)：肺小叶间隔有大量淋巴细胞浸润(箭头Da)，肺房上皮细胞脱落，大量淋巴细胞浸润(箭头Db)，三级支气管腔中有坏死脱落的肺泡上皮细胞(箭头Dc)，肺毛细血管壁淤血(箭头Dd)；

(5)肾脏可见(图E1)：肾小管变性坏死、大量淋巴细胞浸润(箭头Ea)，出血淤血(箭头Eb)；

(6)脑血管淤血(图6F1)。

免疫组：各器官无明显病变(图6中各个图片2)。

表2攻毒鸭发病和死亡数量

表3鸭坦布苏病毒ELISA抗体检测OD450

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 基于人铁蛋白的鸭坦布苏病毒E蛋白的纳米疫苗、抗原及其应用

<141> 2022-01-18

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 194

<212> PRT

<213> 鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus)

<400> 1

Met Val Ser Asp Val Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Met Gly Glu

1 5 10 15

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20 25 30

Phe Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly

35 40 45

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Arg Ile Val Gln Lys Glu Asn Val Gln Phe Glu Val Ala Val Phe Ile

65 70 75 80

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Ser Leu Lys His Ala Ala Arg Phe Val Ile Thr Pro Lys Ser Pro Val

100 105 110

Tyr Thr Ala Glu Met Glu Asp Tyr Gly Thr Val Thr Leu Glu Cys Glu

115 120 125

Pro Arg Ser Gly Val Asp Met Gly Gln Phe Tyr Val Phe Thr Met Asn

130 135 140

Thr Lys Ser Trp Leu Val Asn Arg Asp Trp Phe His Asp Leu Asn Leu

145 150 155 160

Pro Trp Thr Gly Ser Ser Ala Gly Thr Trp Gln Asn Lys Glu Ser Leu

165 170 175

Ile Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala Leu

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Ala Ser

<210> 2

<211> 582

<212> DNA

<213> 鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus)

<400> 2

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<210> 3

<211> 182

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr

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His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile

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Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly

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Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln

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Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His

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Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala

130 135 140

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Asp Ser Asp Asn Glu Ser

180

<210> 4

<211> 549

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

actaccgcga gcacgagcca agtgcgtcag aactatcatc aagatagcga agcggcgatt 60

aaccgtcaga ttaacctgga actgtatgcg agctatgtgt atctgagcat gagctattat 120

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gaatgcgcgc tgcatctgga aaaaaacgtg aatcagagcc tgctggaact gcataaactg 360

gcgaccgata aaaacgatcc gcatctgtgc gattttattg aaacccatta tctgaacgaa 420

caagtgaaag cgattaaaga actgggcgat catgtgacca acctgcgcaa aatgggcgcg 480

ccggagagcg gcttggctga atatctgttt gataaacata ccctgggcga tagcgataac 540

gaaagctaa 549

<210> 5

<211> 391

<212> PRT

<213> 人工合成序列()

<400> 5

Met Val Ser Asp Val Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Met Gly Glu

1 5 10 15

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Ser Ile Gln Thr Cys Ala Lys Phe Asp Cys Thr Lys Lys Ala Glu Gly

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<210> 6

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工合成序列()

<400> 6

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aaagcgacct atgcggaata tatttgcaaa aaagattttg tggatcgcgg ctggggcaac 120

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Claims

1.一种鸭坦布苏病毒新型融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:5。

2.根据权利要求1所述的一种鸭坦布苏病毒新型融合蛋白的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

3.一种鸭坦布苏病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原为权利要求1所述的鸭坦布苏病毒新型融合蛋白。

4.一种鸭坦布苏病毒亚单位疫苗抗原的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：优化鸭坦布苏病毒病毒衣壳蛋白，获得氨基酸序列和编码基因的核苷酸序列；

S2：优化铁蛋白亚基，获得氨基酸序列和编码基因的核苷酸序列；

5.根据权利要求4所示的一种鸭坦布苏病毒亚单位疫苗抗原的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中优化得到的鸭坦布苏病毒病毒衣壳蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

6.根据权利要求5所示的一种鸭坦布苏病毒亚单位疫苗抗原的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中优化得到的铁蛋白亚基的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

7.根据权利要求6所示的一种鸭坦布苏病毒亚单位疫苗抗原的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中得到的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求4-7任一项所制备的抗原。

9.根据权利要求8所示的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有所述抗原，或者编码所述抗原的DNA分子，或者表达所述抗原的重组载体/表达盒/转基因细胞系/重组菌。

10.一种如权利要求4-7任一项所制备的抗原在制备抗鸭坦布苏病毒药物中的应用。